JPH0675508B2

JPH0675508B2 - ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉｉｉ▼ａ

Info

Publication number: JPH0675508B2
Application number: JP60271127A
Authority: JP
Inventors: 洋滝口; 時雄谷
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1985-04-05
Filing date: 1985-12-02
Publication date: 1994-09-28
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: JPS6229976A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒト・膵臓エラスターゼIIIA、それをコード
する塩基配列を含有するDNA、それで形質転換せしめた
宿主および該宿主を用いるヒト・膵臓エラスターゼIIIA
の製造法に関する。

エラスターゼは、セリン・プロテアーゼの１種であり、
繊維状の不溶性蛋白質であるエラスチンを加水分解する
酵素である。エラスチンは、硬蛋白質の１種で、高等動
物の結合組織、腱、大動脈外皮、頸索を構成しており、
ペプシン、トリプシンによりわずかに分解される。

Balo′らは、、動脈硬化症の研究途上で、血管壁のエラ
スチン繊維の分解を認め、1949年、その分解酵素の存在
を推定した〔Balo′,J.and Banga,I.:Schweiz Z.Patho
l.Bacteriol.,12,350（1949）〕。つづいて、Bangaは、
1952年、エラスチンを特異的に分解する酵素を、膵臓の
なかに発見し、結晶状に取り出し、エラスターゼと命名
した〔Banga,I.:Acta Physiol.Acad.Sci.Hung.,3,317
（1952）〕。

エラスターゼは、ヒト、猿、猫、兎等ほとんどの動物の
膵臓に存在することが確認されており、その含量はヒト
が3.1mg/膵臓ｇ、牛が2.2mg/g、ラツトが10.2mg/g程度
である。ヒトのエラスターゼ活性と、年令との関係が認
められており、男40才以上、女60才以上では膵臓および
血漿中のエラスターゼ活性が著しく低下していた〔Loev
en,W.A.,and Maureen M.Baldwin.:Gerontologia,17,170
（1971）〕。

動脈硬化症の患者の場合、膵臓のエラスターゼの活性
は、健常人のそれより著しく低下しているか、または、
消失していた〔Balo′,J.,and Banga,I.:Nature,178,31
0（1956）〕。なお、エラスターゼはエラスチンを酵素
的に分解するだけでなく、その生合成をも促進すること
が、その後の研究で明らかとなつてきた。

ラツト、兎などを用いて、エラスターゼの薬理作用が研
究されており、以下のような効果が明らかとなつた。

１）動脈壁への脂質およびカルシウムの沈着抑制作用２）動脈壁のコレステロールおよびカルシウムの除去作
用３）変性エラスチンに対する選択的分解作用４）動脈壁弾力線維の新生促進作用５）血清脂質低下作用６）リポ蛋白代謝改善作用以上の研究をもとに行つた臨床研究において、エラスタ
ーゼを経口投与した結果、以下のような効果が明らかと
なつた。

１）動脈壁の弾力性・伸展性の回復作用２）血清脂質異常の改善作用３）リポ蛋白代謝の改善作用上記の研究には、ブタの膵臓より抽出精製したエラスタ
ーゼが用いられた。しかし、ブタエラスターゼをヒトに
投与した場合、それはヒトにとつて異種タンパク質であ
るから、抗体産生が生じ、患者への再度の投与はアナフ
イラキシーをおこす危険性がある（特開昭59−1118
0）。従つてヒトに投与する場合は、ヒトエラスターゼ
を用いるのが好ましい。しかし、ヒトエラスターゼを十
分量入手することは極めて困難であつた。そこで、本発
明者らは組換えDNA技術を用いて、ヒトの膵臓のエラス
ターゼIIIA遺伝子をクローニングし、得られた組換えDN
A分子を宿主に移入して、ヒト・膵臓エラスターゼIIIA
遺伝子を発現せしめ、目的とするエラスターゼIIIAを得
ることのできる技術の開発研究を行つた結果、本発明を
完成するにいたつた。

現在、２種のヒト・膵臓エラスターゼの存在は、すで
に、知られているが、その特性付けは、いまだ十分には
おこなわれておらず、そのうちの１種のアミノ酸配列
は、そのプロ部分の12個および本体のわずか４個が明ら
かにされている〔C.Largman et al;Biochim.Biophys.Ac
ta,623,208（1980）〕のみで、その構造は、現在までま
つたく不明であつた。ところが、本発明者により、その
アミノ酸配列のすべておよびそのDNA配列のすべてが明
らかにされるに至つた。本発明により明らかとなつたア
ミノ酸配列は、上述の如く、わずかに明らかにされたア
ミノ酸配列とは異なり、本発明がまつたくの新規物質に
係るものであることが明らかである。

すなわち、本発明は、ヒト・膵臓エラスターゼIIIAをコ
ードする塩基配列を含有するDNA、該DNAを用いて形質転
換せしめた宿主、および該DNAで形質転換せしめた宿主
を培養することによるヒト・膵臓エラスターゼIIIAの製
造法を提供するものである。

本発明は一般式（Ｎ）−Val Val His Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Tyr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser Arg Asp Leu Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asn Leu Ala Val Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Phe Val His Pro Leu Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Lys Thr Pro Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln Gln Ala Arg Leu Pro Val Val Asp Tyr Lys His Cys Ser Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Thr Val Lys Lys Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Tyr Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Val Ser Ala Phe Gly Cys Asn Phe Ile Trp Lys Pro Thr Val Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala Ser His−（Ｃ）（Ｉ）で表わされるアミノ酸配列で示される、ヒト・膵臓エラ
スターゼIIIAに関する。そして式中、（Ｎ）−末端には
水素原子、Met、あるいはプロおよびプレ部分として Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Val Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser His Ser Ser Ser Arg の一部または全部を有していてもよい。

特に、一般式（５′）−GTT GTC CAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AGT GGA AGC TTC TAC CAC ACG TGT GGC GGT AGC CTC ATC GCC CCC GAT TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TCG AGG GAT CTG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGT GAG TAC AAC CTT GCT GTG AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CCC ATC AAC TCT GAG GAG CTG TTT GTG CAT CCA CTC TGG AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC GCC CTC ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAT GCC GTC CAG CTC GCC TCA CTC CCT CCC GCT GGT GAC ATC CTT CCC AAC AAG ACA CCC TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC CGT CTC TAT ACC AAT GGG CCA CTC CCA GAC AAG CTG CAG CAG GCC CGG CTG CCC GTG GTG GAC TAT AAG CAC TGC TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC ACC GTG AAG AAA ACC ATG GTG TGT GCT GGA GGG TAC ATC CGC TCC GGC TGC AAC GGT GAC TCT GGA GGA CCC CTC AAC TGC CCC ACA GAG GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAC GGT GTG ACC AGC TTT GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC TTC ATC TGG AAG CCC ACG GTG TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATC GAC TGG ATT GAG GAG ACC ATA GCA AGC CAC−Ｘ（３′）（II）（式中、ＸはTAA,TGAまたはTAGを示す）で表わされる塩
基配列またはそれと同効の塩基配列を含有するDNAであ
る。

上記DNA（II）は、その５′末端にATG、または、
（５′）−ATG ATGCTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TCT CAC TCT TCC AGC CGC−（３′）の一部または全部を有していてもよい。

DNA（II）の５′末端にATGを有するときには、下記のポ
リペプチド（III）（Ｎ）−Val Val His Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser Arg Asp Leu Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asn Leu Ala Val Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Phe Val His Pro Leu Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Lys Thr Pro Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln Gln Ala Arg Leu Pro Val Val Asp Tyr Lys His Cys Ser Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Thr Val Lys Lys Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Tyr Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Val Ser Ala Phe Gly Cys Asn Phe Ile Trp Lys Pro Thr Val Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala Ser His−（Ｃ）に加えて、（III）のＮ末端にMetを有するポリペプチド
をコードする。

DNA（II）の５′末端に（５′）−ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TCT CAC TCT TCC AGC CGC−（３′）を有するときには、ポリペプチド（III）に加えて（II
I）のＮ末端に（Ｎ）−Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Val Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser His Ser Ser Ser Arg−（Ｃ）を有するポリペプチドをコードする。

式（II）で表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基
配列を含有する本発明のDNAは、たとえば以下に示す(イ)
〜(ニ)のステツプにより製造することができる。

(イ)ヒトの膵臓より、mRNAを分離する。

(ロ)このmRNAおよび逆転写酵素を用いてcDNAバンクを作
製する。

(ハ)作製したcDNAバンクから、たとえば、ブタエラスタ
ーゼIcDNAをプローブに用い、目的とするヒトエラスタ
ーゼIIIAをコードするcDNAを含有するプラスミドを単離
する。

(ニ)このプラスミドから目的とするクローン化DNAを切り
出す。

膵臓のRNA抽出にあたつては、グアニジン・チオシアネ
ート・ホツト・フエノール法、グアニジン・チオシアネ
ート・塩化セシウム法なども採用しうるがグアニジン・
チオシアネート−グアニジン・塩酸法が以下の点で、上
述２法より優れている。（１）操作が簡単である。
（２）抽出・回収率が高い。（３）比較的大量の臓器か
らの抽出が可能である。（４）DNAが混入してこない。
（５）RNAの分解が少ない。

真核細胞の細胞質に存在するmRNAの多くは、その３′末
端にポリＡ配列をもつことが知られているので、この特
徴を利用して、オリゴ（dT）セルロースのカラムにmRNA
を吸着せしめて、つぎに、これを溶出して精製する。

得られたmRNAを鋳型として、逆転写酵素を用いて相補的
二重鎖DNAを合成するが、その方法としてはS1ヌクレア
ーゼ法〔Efstratiadis,A.et al.:Cell,7,279（197
6）〕、Land法〔Land,H.et al.:Nucleic Acids Res.,9,
2251（1981）〕、Okayama−Berg法〔Okayama,H.and P.B
erg:Mol.Cell.Biol.,2,161（1982）〕、O.Joon Yoo法
〔O.Joon Yoo,et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,1049
（1982）〕など採用しうるが、本発明の目的には、Okay
ama−Berg法が好適であつた。

つぎに、得られた組換えプラスミドを大腸菌、たとえば
RR1株に導入して形質転換させる。テトラサイクリン耐
性あるいはアンピシリン耐性を、指標として、組換え体
を選択することができる。

得られた組換え体のなかから、エラスターゼIIIAをコー
ドするDNAを含有するクローンを選択するためには、32P
でラベルしたブタエラスターゼＩ（特開昭60−207583）
cDNAをプローブに用いるコロニーハイブリダイゼーシヨ
ン法を用いた。

選択されたクローンに含有される塩基配列の決定は、フ
アージM13を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止
の方法〔Messing,J.ら:Nucleic Acids Res.,9,309（198
1）〕およびMaxam−Gilbert法〔Maxam,A.M.and Gilber
t,W.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,560（1977）〕で実施
しうるが、本発明ではジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止の方法を採用し、ヒト・膵臓のエラスターゼIIIAを完
全にコードするDNAを有するクローンを決定した。

つぎに、得られたクローンからエラスターゼIIIA遺伝子
をきり出し、これを適当な発現ベクターにつないで、適
当な宿主に導入して発現せしめることができる。

プロモーターとしては、大腸菌においてはトリプトフア
ン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモータ
ー、トリプトフアン・ラクトース（tac）プロモータ
ー、リポプロテイン（lpp）プロモーター、バクテリオ
フアージ由来のラムダ（λ）P_Lプロモーター、ポリペプ
チド鎖伸長因子Tu（tufB）プロモーターなどを使用しう
る。

宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母などの
微生物のほか、動物細胞を採用しうる。

本発明のDNAを大腸菌の宿主に、形質転換、導入する方
法としては、Hanahanの方法〔Hanahan,D.:J.Mol.Biol.,
166,557（1983）〕、塩化カルシウム法〔Dagert,M.and
S.D.Ehrlich:Gene,6,23（1979）〕、低pH法〔高木康敬
編著：遺伝子操作マニユアル,p.49,講談社サイエンテイ
フイク（1982）〕等を採用しうる。本発明においては、
Hanahanの方法が好適であつた。

このようにして得た宿主（組換え体）を、公知の培地で
培養し、培養物の中に、一般式（Ｎ）−Val Val His Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser Arg Asp Leu Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asn Leu Ala Val Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Phe Val His Pro Leu Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Lys Thr Pro Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln Gln Ala Arg Leu Pro Val Val Asp Tyr Lys His Cys Ser Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Thr Val Lys Lys Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Tyr Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Val Ser Ala Phe Gly Cys Asn Phe Ile Trp Lys Pro Thr Val Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala Ser His−（Ｃ）で表わされるペプチドまたはその同効物質を生成蓄積せ
しめ、これを採取することにより本発明の目的を達する
ことができる。

培地としては、グルコース、カザミノ酸などからなる培
地、例えば、M9培地〔Miller,J.:Experiments in Molec
ular Genetics,431〜433（Cold Spring Harbor Lab.,Ne
w York（1972））〕が挙げられる。

組換え体の培養は、通常、15〜43°Ｃで、３〜24時間行
い、必要に応じて、通気や攪拌を加えることができる。
なお、動物細胞を宿主とする場合には、３〜10日間の培
養を必要とする。

培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、例えば遠心分
離等で集める。宿主として、枯草菌、酵母、動物細胞な
どを用いる場合、ベクターの選択によつては、生産され
たエラスターゼIIIAは細胞外に出て、上澄液に含まれ
る。

一方、大腸菌を宿主とした場合、生産されたエラスター
ゼIIIAは、不溶性の蛋白として、その細胞内のinclusio
n bodyに含まれる場合が多い。この場合は、菌体を破壊
して遠心分離することにより、生産されたエラスターゼ
IIIAは沈澱物として得られる。

菌体の破壊の方法としては、超音波処理、リゾチーム処
理、凍結融解処理等を採用することができる。該上澄液
または沈澱物からのエラスターゼの単離は、通常知られ
ている蛋白質の精製方法により実施しうる。

本発明により製造されるエラスターゼIIIAは、ヒト膵臓
より抽出精製したエラスターゼと同等の生物学的活性を
示し、これと同様の目的に、同様の用法により使用する
ことができる。

以下に実施例を挙げて本発明により具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例（１）ヒト膵臓よりのmRNAの分離 5.5gのヒト膵臓（剖検試料）をグアニジンチオシアネー
ト溶液（4Mのグアニジンチオシアネート,1％のサルコシ
ル,20mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）,25mMのクエ
ン酸ナトリウム（pH7.0）,100mMの２−メルカプトエタ
ノール,0.1％のアンチフオームＡ）中でポリトロンによ
つて破壊、変性した後、遠心して上澄を得た。これに0.
025倍量の1M酢酸および0.75倍量のエタノールを加え、
−20℃で数時間冷却した後、遠心処理によつて沈澱を得
た。次にこの沈澱をグアニジンハイドロクロライド溶液
（7.5Mのグアニジンハイドロクロライド,25mMのクエン
酸ナトリウム（pH7.0）,5mMのジチオスレイトール（DT
T））に懸濁し、0.025倍量の1M酢酸および0.5倍量のエ
タノールを加え、−20℃で数時間冷却した後、遠心処理
を行つた。ここで得られた沈澱をグアニジンハイドロク
ロライド溶液に再懸濁し、酢酸、エタノールを加え、−
20℃に冷却した後、遠心処理で沈澱を集めた。次に、こ
の沈澱をエタノールで数回洗い、混在しているグアニジ
ンハイドロクロライドを除き、蒸留水に溶かした後にエ
タノールでRNAを沈澱させた。遠心分離により沈澱を集
め、53.9mgのRNAを得た。

こうして得たRNAを高塩溶液（0.5MのNaCl,20mMのTris-H
Cl（pH7.5）,1mMのEDTA,0.1％のドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS））中でオリゴ（dT）セルロースカラムに吸着
させた後、ポリ（Ａ）を含むmRNAを溶出溶液（10mMのTr
is-HCl（pH7.5）,1mMのEDTA,0.05％のSDS）で溶出さ
せ、255μｇのmRNAを得た。

（２）cDNAバンクの作製 cDNAバンクの作製は、Okayama−Berg法に従つて行つ
た。すなわち、５μｇのmRNA及び24ユニツトの逆転写酵
素を20μｌの反応液〔50mMのTris-HClpH8.3、8mMのMgCl
₂、30mMのKCl、0.3mMのDTT、2mMのdATP、2mMのdGTP、2m
MのdCTP、2mMのdTTP、10μCiのα‐32P-dCTP、1.4μｇ
のベクター・プライマーDNA（PL-Phar-maciaより購
入）〕中で、42℃、60分反応させた。

２μｌの0.25M EDTAと１μｌの10％SDSを加えて反応を
止めた後、20μｌのフエノール・クロロフオルムで除蛋
白を行つた。遠心した後、水層をとり、20μｌの4M酢酸
アンモニウムと80μｌのエタノールを加え、−70℃、15
分間冷却した。次いで、遠心して沈澱を集め75％エタノ
ールで沈澱を洗つた後、減圧乾燥した。

沈澱を15μｌのターミナルトランスフエラーゼ反応液
（140mMのカコジル酸カリウム、30mMのTris-HCl pH6.
8、1mMの塩化コバルト、0.5mMのDTT、0.2μｇのpolyA、
100mMのdCTP）に溶かした。

37℃で３分間反応液をあたためた後、18ユニツトのター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを加
え、５分間反応させた。次に、１μｌの0.25M EDTA及び
0.5μｌの10％SDSを加え反応をとめた後、フエノール・
クロロフオルムで除蛋白を行つた。反応液を遠心後、水
層をとり、15μｌの4M酢酸アンモニウム、60μｌのエタ
ノールを加えよく混合した。−70℃に15分間おいた後、
遠心して沈澱を集めた。

沈澱を10μｌの制限酵素用緩衝液（50mMのNaCl、10mMの
Tris-HCl pH7.5、10mMのMgCl₂、1mMのDDT）に溶かし、
2.5ユニツトの制限酵素HindIIIを加え、37℃で約１時間
消化した。つぎに、フエノール・クロロフオルムで除蛋
白後、エタノール沈澱を行つた。−70℃で15分間冷却し
た後、遠心によつて沈澱を集め、10μｌのTE（10mMのTr
is-HCl pH7.5、1mMのEDTA）に溶かした。

次に、上記試料の１μｌをオリゴdG付きリンカー（PL-P
harmaciaより購入）10ngを加えた反応液（10mMのTris-H
Cl pH7.5、1mMのEDTA、100mMのNaCl）に加え、65℃で５
分間加熱し、次いで42℃で30分間保温した。

氷中で反応液を冷却した後、10μｌの10倍リガーゼ緩衝
液（10mMのATP、660mMのTris-HCl pH7.5、66mMのMgC
l₂、100mMのDTT）、78μｌの蒸留水、８ユニツトのT4DN
Aリガーゼを加え、12℃で一晩保温した。

次に、10μｌの1MのKCl、１ユニットのリボヌクレアー
ゼＨ、33ユニツトのDNAポリメラーゼＩ、４ユニツトのT
4DNAリガーゼ、0.5μｌのヌクレオチド溶液（20mMのdAT
P、20mMのdGTP、20mMのdCTP、20mMのdTTP）、0.1μｌの
50μg/μｌ牛血清アルブミン（BSA）を加え、12℃で１
時間、ついで25℃で１時間保温した。

この反応液を、５倍に希釈した後、ただちにHanahanの
方法〔HanahanD.:J.Mol.Biol.,166,557（1983）〕によ
つて、大腸菌RR1株を形質転換し、ヒト膵臓cDNAバンク
を作製した。

（３）ヒト膵臓エラスターゼIIIAcDNAを含有する組換え
菌の分離上述のヒト膵臓cDNAバンクのうち4700株の組換え菌のDN
Aを、Grunstein.M.and Hongness,D.S.の方法（Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA,72,3961（1975）〕によつてニトロセ
ルロースフイルター上に固着した。

一方、ブタ膵臓エラスターゼIcDNA断片を制限酵素Pst1
によつて切り出し、ニツクトランスレーシヨン法〔Rigb
y,P.W.et al.J.Mol.Biol.,113,237（1977）〕によつて3
2Pで標識した。このDNA断片をプローブとして、40％の
ホルムアミド、５倍濃度の0.15M塩化ナトリウムおよび
0.015Mクエン酸ナトリウム溶液（SSC）、0.1％BSA、0.1
％フイコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.5％のSD
S、10mMのリン酸ナトリウム、100μg/mlのサケ精子DNA
の溶液中で、35℃にて、フイルター上に固着させたDNA
と会合させた。その後、オートラジオグラフイーを行
い、上記プローブと反応する７株の菌株を得た。

これらの菌株のうちの１株に含有される組み換えプラス
ミドに挿入されているcDNAをCL2と命名した。

（４）CL2のコードするアミノ酸配列とエラスターゼIII
A CL2には、270アミノ酸をコードしうる唯一のオープンリ
ーデイングフレームが存在していた。その塩基配列から
確定したアミノ酸配列は、トリプシン、キモトリプシン
とは30％程度の相同性しか示さないが、ブタ膵臓エラス
ターゼＩとは57％の高い相同性を示した。また、トリプ
シン、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼに共通し
て見出される活性中心付近のアミノ酸配列（Gly-Asp-Se
r-Gly-Gly-Pro）が、同一の領域に存在していた。ま
た、セリンプロテアーゼに特徴的な電荷リレーに関与す
る45番目のヒスチジン残基、95番目のアスパラギン酸残
基、189番目のセリン残基も存在していた。

さらに、エラスターゼにおいて基質と結合するポケツト
を形成するカルボキシル末端付近のアミノ酸配列は、CL
2がコードするそれとブタエラスターゼＩとの間でよく
似ており、その基質結合ポケツトに特徴的な211番目の
バリン残基、223番目のトレオニン残基がCL2がコードす
るアミノ酸配列にも存在していた。第１表にCL2の塩基
配列およびそれがコードするアミノ酸配列を示す。

CL2によつてコードされる蛋白質のアミノ酸組成は、Lar
gmanらによつて報告されているヒト膵臓エラスターゼＩ
のアミノ酸組成〔Largman.C.et al.Biochemistry 15,24
91（1976）〕と一見類似しているが、詳細な点において
は明らかに異なり、また分子量も異なつていた。

また、そのアミノ酸配列により計算した等電点は7.5〜
7.8であつた。この値は、Scheele,G.らによつて報告さ
れているヒト膵臓プロエラスターゼＩの等電点7.6（Sch
eele,G.et al.Gastroenterology 80,461（1981）〕と同
様な値を示した。

CL2によつてコードされるヒト・プレプロエラスターゼI
IIAは、Ｎ末から28番目のアルギニン残基のＣ末側がト
リプシンにより切断され、活性型のヒト・エラスターゼ
IIIAが生じる。

CL2は、ヒトエラスターゼIIIAmRNAから逆転写酵素によ
つて合成された完全長のcDNAであるので、このcDNA配列
を適当な発現ベクターに移すことで、大腸菌、枯草菌、
酵母、動物細胞などを宿主として、ヒト膵臓エラスター
ゼIIIAを大量生産できる。

（５）動物細胞を用いたヒト膵臓エラスターゼIIIAの生
産発現プラスミドpSV2−CL2の構築動物細胞を宿主にしてヒトエラスターゼIIIAcDNAを発現
させるため、図１に示す手順によつてcDNAと発現用ベク
ターとを連結した。発現用ベクターには、SV40のプロモ
ーター、エンハンサー、ポリＡシグナル、small T anti
gen遺伝子の介在配列（イントロン）を含むpSV2プラス
ミドを使用した。

ベクターとcDNAが転写方向に関して順の向きに連結した
クローンを、各種の制限酵素の切断パターンにより選択
し、動物細胞（COS1細胞）ヘリン酸カルシウム法により
導入（トランスフエクシヨン）した。

COS1細胞への発現プラスミドpSV2−CL2の導入リン酸カルシウム法によるトランスフエクシヨンはGrah
amとVan Der Ebの方法に従つた〔Virology 52,456（197
3）〕。

トランスフエクシヨンに使用するCOS1細胞は直径10cmの
シヤーレに１×10⁶細胞をまき、10％牛胎児血清を含む
ダルベツコ変法イーグル培地で一晩培養した。次に、30
0μｇのpSV2−CL2プラスミドを12.55mlの滅菌蒸留水に
懸濁し、0.75mlの2.5MCaCl₂を加えよく混合した後に、
ビペツトを用いて溶液中に泡をたてながら、1.5mlの10
×HeBS溶液（210mMのHEPES、1.37MのNaCl、4.7mMのKC
l、10.6mMのNa₂HPO₄、55.5mMのブドウ糖pH7.05）を滴下
してDNAとリン酸カルシウムの沈殿を形成させた。30分
間室温で放置して沈殿を熟成させた後、この1mlを、予
じめ10％牛胎児血清を含む新鮮な培培に置換したCOS1細
胞へシヤーレ１枚あたりに加えつづいてこれを37℃、５
％CO₂存在下にて12時間培養した後、培養液を捨て、牛
胎児血清を含まない新しいダルベツコ変法イーグル培地
に置換し、更に37℃、５％CO₂存在下にて、48時間培養
した。なお、ここで得られた、トランスフエクシヨンし
たCOS1細胞は、ヒトエラスターゼIIIAmRNAが発現してい
ることの確認、及び培養上清中のエラスターゼ活性の測
定に供される。

COS1細胞からのmRNA抽出トランスフエクシヨンしたCOS1細胞中に発現プラスミド
から転写されたヒトエラスターゼIIIAmRNAが存在してい
ることを確認するため、以下のように、COS1細胞からmR
NAを抽出してノーザンブロツトハイブリダイゼーシヨ
ンをおこなつた。

48時間培養後のCOS1細胞に、シヤーレ１枚あたり、1ml
のグアニジンチオシアネート溶液（4Mのグアニジンチオ
シアネート、１％のサルコシル、20mMのエチレンジアミ
ン四酢酸、25mMのクエン酸ナトリウム（pH7.0）、100mM
の２−メルカプトエタノール、0.1％のアンチフオーム
Ａ）を加え、細胞を融解した。次に、この溶液を、21ゲ
ージの注射針に数回通して高分子DNAを低分子化した
後、5.7Mの塩化セシウム、0.1Mのエチレンジアミン四酢
酸溶液の上に重層し、日立RPS40スウイングローターを
用いて、30000rpm、20℃、17時間遠心した。ここで得ら
れたRNA沈殿を少量のエタノールで洗い、300μｌの蒸留
水に溶解した。ここでは、約10⁸個のCOS1細胞より810μ
ｇの全RNAが分離された。

次に、分離した全RNAをAvivとLederの方法〔Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 69,1408（1972）〕に従つてオリゴdTセル
ロースカラムにかけ、数μｇのmRNAを精製した。精製し
たmRNAの半量を使用してThomasの方法〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA77,5201（1980）〕を用いてノーザンブロツト
ハイブリダイゼーシヨンをおこなつた。プローブには、
ニツクトランスレーシヨン法〔Rigby,P.W.et al.J.Mol.
Biol.113,237（1977）〕によつて³²P標識したヒトエラ
スターゼIIIAcDNAを用いた。ハイブリダイゼーシヨンの
結果、pSV2−CL2をトランスフエクシヨンしたCOS1細胞
のmRNAのみにプローブとハイブリダイズする大きさ1.8k
bの強いバンドと、大きさ1.0kbの弱いバンドが検出され
た。pSV2−CL2が転写された場合、ベクターに含まれる
ポリＡシグナルで転写が終結すると1.8kbの大きさのmRN
Aが生じ、cDNAに含まれるポリＡシグナルで転写が終結
すると1.0kbのmRNAが生じると推定される。ノーザンブ
ロツトハイブリダイゼーシヨンによつて得られた結果は
それらの推定値と一致した。したがつて、COS1細胞中で
pSV2−CL2はSV40のプロモーターを使用して多量に発現
し、転写された大部分のmRNAはcDNAに含まれているポリ
Ａシグナルでは終結せずにベクターに含まれているポリ
Ａシグナルで終結していることが明らかとなつた。

培地上清中のエラスターゼ活性 pSV2に組み込んだヒトエラスターゼIIIAcDNAはシグナル
ペプチド領域を保持しているので、発現されるエラスタ
ーゼは培地中へプロエラスターゼとして分泌されること
が期待される。そこで、48時間培養後の培養液中のエラ
スターゼ活性を測定した。エラスターゼ活性の測定は、
Biethらの合成基質を用いた方法〔Front.Matrix.Biol.
6,1（1978）〕に従つた。

1mlの培養上清に200μｌの1MのTris-HCl（pH8.5）と50
μｌの10mg/mlのトリプシンを加え、25℃で15分間保温
することによつてプロエラスターゼの活性化処理を行つ
た後、50μｌのダイズトリプシンインヒビター溶液（10
mg/ml）および10.4μｌのＮ−メチルピロリドンに溶解
した125mMスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−
Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド（Suc−Ala−Ala−A
la−pNA）を加えた。この反応液を37℃に１時間保温し
た後、その410nmの吸光度を測定した。

pSV2−CL2をトランスフエクシヨンしたCOS1細胞の培養
液を用いてエラスターゼ活性を測定した結果、OD₄₁₀値
は0.21を示し、培養液中にその活性が認められた。しか
しながら、その合成基質に対する分解活性は、ブタエラ
スターゼIcDNAをpSV2ベクターに連結した発現プラスミ
ドpSV2−PEL1をトランスフエクシヨンしたCOS1細胞の培
養上清の分解活性に比較して、5.2％であつた（第２
表）。なお、Largmanらがヒト膵臓より精製したヒトエ
ラスターゼの合成基質Suc−Ala−Ala−Ala−−pNAに対
する分解活性もブタエラスターゼに比較して3.5％程度
であると報告されている〔Largman,C.et al.Biochemist
ry 15,2491（1976）〕。従つて、ブタエラスターゼに対
しては非常に鋭敏な基質であるSuc−Ala−Ala−Ala−pN
Aは、ヒトエラスターゼの活性を測定する基質として
は、鋭敏な基質ではない。

pSV2−CL2をCOS1細胞へ導入した本実施例においては、
ヒトエラスターゼIIIAの生産は短期的（transient expr
ession）であるが、pSV2−CL2プラスミドに適当な選択
マーカー（例えばneo遺伝子、dihydrofolate reductase
遺伝子など）を連結してCHO細胞等に導入すれば長期間
にわたりヒトエラスターゼIIIAを生産可能な細胞株を得
ることができる。

（６）枯草菌を用いたヒト膵臓エラスターゼIIIAの生産発現ベクターの構築発現ベクターの構築法は図２に示した。すなわち、ヒト
エラスターゼIIIAのcDNAがクローン化されているプラス
ミドを、制限酵素HindIIIとBglIIで切断し、ヒトエラス
ターゼIIIAcDNAの一部を含む712塩基対のDNA断片をアガ
ロースゲル電気泳動によつて単離した。本DNA断片に、
枯草菌α−アミラーゼのシグナルペプチドの一部ならび
にエラスターゼIIIAのアミノ末端側の24個のアミノ酸を
コードする、93塩基対からなる、合成オリゴヌクレオチ
ド（図３）をT4DNAリガーゼにて結合させた後、アガロ
ースゲル電気泳動にて、805塩基対のDNA断片を分離し
た。

一方、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子がクローニングさ
れているプラスミドpTUB228（K.Ohmura,T.Shiroza,K.Na
kamura,A.Nakamura,K.Yamane,K.Yoda,M.Yamasaki,and
G.Tamura:J.Biochem.95,87〜93（1984））を制限酵素Hi
ndIIIで切断して、α−アミラーゼのプロモーターおよ
びシグナルペプチドの一部を含む428塩基対のDNA断片、
および複製開始点を含む5100塩基対のDNA断片を、それ
ぞれ1.2％のアガロースゲル電気泳動にて単離した。428
塩基対のDNA断片はさらに制限酵素HpaIIにて、また、51
00塩基対のDNA断片は制限酵素BclIにて切断したる後、
1.2％のアガロースゲル電気泳動にてそれぞれ385塩基
対、および4173塩基対のDNA断片を単離した。上記の３
種のDNA断片をT4DNAリガーゼにて結合させたのち、常法
により枯草菌207−25株（ｍ₆₃hsrM recE4 amyE07 aro
I906 leuA8 lys21;Marburg株由来）のプロトプラスト中
に取り込ませ、再生を行つたのち、カナマイシン10μg/
ml含有培地にて培養し、本培地上にて生育可能な形質転
換株を得た。目的の組み換え体は、図３に示す93塩基対
のDNAをプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーシ
ヨン法にて得られた陽性のクローンよりプラスミドを分
離し、そのDNAの塩基配列を調べる事により、採取し
た。こうして取得したクローンの１つをpHEXO10と命名
した。

生産物の確認前述のエラスターゼIIIAの発現ベクター、pHEXO10を導
入した枯草菌207−25株は、50μg/mlのカナマイシンを
含むLG培地１（１あたり,Bacto Tryptone（Difco）
10g,Bacto Yeast Extract（Difco）5g,NaCl 5g,Glucose
2g,pH7.0）にて、35℃で48時間往復振とう培養した。

培養終了後、培養液は４℃に冷却したのち、3000×G/5
分の遠心分離にて菌体を除いた後、55％飽和となるよう
に硫酸アンモニウムを加え、４℃で12時間攪伴した。本
操作によつて生じた不溶物を8000×G/20分の遠心操作に
て沈澱させたのち、上清を除き、沈澱物を20mlの50mM T
ris-HCl（pH8.0）に溶解した。本溶液を、500mlの50mMT
ris-HCl（pH8.0）に対して16時間透析し、不溶性物質を
8000×G/20分の遠心分離にて除いた。この透析内液を粗
エラスターゼIIIA液として以下の検定に用いた。

試料のエラスターゼ活性は、下記の方法にて測定した。
すなわち、合成基質Ｎ−carbobenzoxy−Ｌ−alanine−ｐ−nitrophenyl est
er（Sigma）を50mM Tris-HCl（pH8.0）に溶解して0.1mM
溶液とする。この基質液0.25mlに対して、エラスターゼ
IIIA試料液0.25mlを添加し、37℃にて30分間反応させた
のち、410nmの吸光度を測定した。同時に、試料液にエ
ラスターゼの阻害剤であるエラスタチナールもしくはα
−１−アンチトリプシンを終濃度0.1mg/mlとなるように
加えて、その活性に対する阻害度を測定した。プロモー
ター部と正しく結合したプラスミドを導入した207−25
株では、その吸光度が、対照液と比較して、0.32上昇
し、エラスターゼ活性を検出しえた。本エラスターゼ活
性は上述の２種の阻害剤によつて抑えられることも同時
に確認された。

なお、本実施例にて使用した制限酵素や他の酵素の反応
は、酵素購入時に添付されている説明書に記載された緩
衝液および反応条件に従つた。

（７）大腸菌を用いたヒト膵臓エラスターゼIIIAの生産ヒトエラスターゼIIIAのcDNA,CL2を制限酵素EcoRI及びB
glIIで切断し、ヒト・エラスターゼIIIAのcDNAを含む12
15bpのDNA断片を分離した。こを制限酵素Fnu4HIで部分
切断し、つづいてS1ヌクレアーゼで処理して、１本鎖部
分を平滑末端として788bpのDNA断片を得た。別に、プラ
スミドPUC8を制限酵素SmaIで切断し、ホスフアターゼ処
理して、ラクトースオペロンのプロモーター、オペレー
ター領域と、β−ガラクトシダーゼの一部を含むDNA断
片を分離した。

上記二種類のDNA断片をT4DNA リガーゼを含む30μｌの
溶液（66mMのTris-HCl（pH7.6）,6.6mMのMgCl₂,10mMのD
TT,1mMのATP,2.5ユニツトのT4DNAリガーゼ）中で６℃、
72時間保温し、両DNA断片を連結させた（図４）。

こうして構築したヒトエラスターゼ発現プラスミドをpH
EX002と命名した。各種大腸菌をpHEX002にて形質転換し
て、ヒトエラスターゼを生産しうる菌株を得た。

この方法によつて発現されるヒトエラスターゼは、下記
の如く成熟ヒトエラスターゼのＮ末端に８個のβ−ガラ
クトシダーゼ由来のアミノ酸が結合した融合蛋白にな
る。

ヒトエラスターゼ発現プラスミドpHEX002中のエラスタ
ーゼ遺伝子の５′末端付近のDNA塩基配列とアミノ酸配
列を下に示す。

以上のようにして得たエラスターゼ発現プラスミドを含
む菌株を、2XTY−アンピシリン培地（1.6％のバクトト
リプトン、１％のイーストエキストラクト、0.5％のNaC
l、50μg/mlのアンピシリン）に接種し、37℃、15時間
培養した。培養後、培養液を遠心して菌体を集め、2.4
×10⁸細胞相当量の菌体を15μｌのSDS溶液（２％のSD
S、５％の２−メルカプトエタノール、10％のグリセリ
ン、60mMのTris-HCl（pH6.8））に懸濁し、100℃３分間
加熱した後、Laemmliらの方法〔Nature,227680（197
0）〕に従つてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
し、生産されている蛋白を解析した。

結果は図５に示すごとく、YA21株において最も多量にエ
ラスターゼ融合蛋白が生産されていた。エラスターゼ融
合蛋白の生産高はYA21株が生産している全蛋白の33％に
相当していた。X984株においても比較的多量のエラスタ
ーゼ融合蛋白が生産されていたが、生産高はYA21株の半
分以下（全菌体蛋白の14％）であつた。その他２株の大
腸菌（HB101株およびMC4100株）におけるエラスターゼ
融合蛋白の生産量は著しく低かった。

エラスターゼ融合蛋白は菌体内でinclusionbodyを形成
しているので比較的容易に精製することができた。すな
わち、YA21/pHEX002の培養液１より、inclusion body
を形成している菌体が6.5g得られた。得られた菌体6.5g
を、Lysozyme0.2mg/mlおよびデオキシコール酸1mg/mlを
含む50mMのトリス−HCl緩衝液（pH8.0）中で処理して溶
菌させた。未破壊の菌体を、低速遠心分離（1500xg,10
分間）にて除いた後、高速遠心分離（11000xg,20分間）
にてinclusion bodyを沈澱として得た。このinclusion
bodyにはまだ菌体断片が多量に含まれているので、トラ
イトンＸ−100を5mg/mlを含む50mMトリス−HCl緩衝液に
懸濁した後、高速遠心分離（11000xg,20分間）により洗
浄した。洗浄後、inclusion bodyは少量のトリス−HCl
緩衝液中に懸濁して４℃で保存した。

この様にして精製することにより370mgのinclusion bod
yが得られ、これは約58％のエラスターゼIIIA融合蛋白
を含有している。またYA21/pHEX002で生産されたinclus
ion bodyがエラスターゼ融合蛋白であることは、immuno
−blotting法にて確認した。

上述のように大腸菌にて生産されたエラスターゼの大部
分は、inclusion bodyとなり菌体の不溶性画分に存在し
ているが、一部は可溶性であり、酵素活性をも保持した
状態で存在している。本酵素活性の検出は以下のように
して行つた。

エラスターゼIIIA発現プラスミドを導入した大腸菌X984
株を2XTY−アンピシリン培地１にて37℃で15時間振と
う培養した。培養終了後、菌体を3000XG/5分の遠心分離
にて集め、20mlの緩衝液Ａ（50mM Tris-HCl,1mM EDTA,5
0mM NaClpH8.0）に懸濁し、リゾチームを10mg加えたの
ち５℃で20分間保温した。

その後、デオキシコール酸を最終濃度1mg/mlとなるよう
に加え、20℃に加温し、さらにデオキシリボヌクレアー
ゼを最終濃度0.1mg/mlとなるように加えたのちポリトロ
ンホモジエナイザー処理にて菌体を破砕した。こうして
得た溶菌液を80000XG/40分の遠心分離にかけ、菌体断片
を除いたのち、セフアデツクスＧ−75カラムクロマトグ
ラフイーにかけた。エラスターゼ活性画分はさらに抗体
アフイニテイークロマトグラフイーにて精製した。その
後、0.1mg/mlとなるようにトリプシンを加えて25℃で５
分間保温し、次いで0.1mg/mlとなるようにダイズトリプ
シンインヒビターを加えてプロエラスターゼを活性化し
たものを粗エラスターゼIIIA試料液として以下の検定に
用いた。

試料のエラスターゼ活性は、下記の方法にて測定した。
すなわち、合成基質Ｎ−carbobenzoxy−Ｌ−alanine−ｐ−nitrophenyl est
er（Sigma）を50mM Tris-HCl（pH8.0）に溶解して0.1mM
溶液とする。この基質液0.25mlに対して、エラスターゼ
試料液0.25mlを添加し、37℃にて30分間反応させたの
ち、410nmの吸光度を測定したところ、その吸光度が0.4
1上昇し、エラスターゼ活性を検出しえた。同時に、試
料液に、エラスターゼの阻害剤であるエラスタチナール
もしくはα−１−アンチトリプシンを、終濃度0.1mg/ml
となるように加えたところ、その活性が、これらにより
阻害されることも確認した。

（８）酵母を用いたヒト膵臓エラスターゼIIIAの生産酵母を宿主とする場合も大腸菌、枯草菌および動物細胞
の場合と同様に、ヒト膵臓エラスターゼIIIAのcDNAを、
常法にて、適当なる発現ベクターに連結して、宿主細胞
に移入し、それを発現させることができ、その培養物中
にエラスターゼ活性の存在を確認することができた。

「組換えDNA実験指針」に記載されているS.cereisiaeを
宿主とすることができるが、具体的には同S288C株など
が好適であつた。一方、ベクターとしては、YEp13など
が好適であつた。また、プロモーターとしては、アルコ
ール脱水素酵素遺伝子をコードするADH1遺伝子などが好
適であつた。

【図面の簡単な説明】

図１はpSV2−CL2プラスミド構築の手順を示す。pSV2−
βグロビンはpSV2ベクターにβ−グロビンのcDNAが挿入
されているプラスミドであり、pCL2はOkayama−Bergベ
クターにヒトエラスターゼIIIAcDNAが挿入されているプ
ラスミドである。平滑末端化等の反応は“モレキユラー
クローニング”〔Maniatis,T.et al.（ed）“Molecular
cloning"Cold Spring Harbor Lab（1982）〕に記載の
方法に従つた。太矢印はSV40由来のプロモーターを示
し、細矢印は転写の方向を示す。ＨはHindIII、ＢはBg1
II、ＳはSauIIIAを示す。図２はpHEXO10のプラスミド構築の手順を示す。pTUB228
は、枯草菌の複製開始点をもつたベクターに、枯草菌の
α−アミラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミドである。
黒く塗りつぶした領域はヒト・エラスターゼIIIAcDNAを
示す。図３は枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のシグナルペプチド
領域および成熟ヒト・エラスターゼIIIAのアミノ末端側
に対応するcDNAを含む93塩基対の合成DNAを示す。図４はpHEX002のプラスミド構築の手順を示す。黒く塗
りつぶした領域はヒト・エラスターゼIIIAcDNAを示す。図５はpHEX002を導入した各種大腸菌におけるヒトエラ
スターゼIIIAの生産性を示す。図５はpHEX002を導入した各種大腸菌におけるヒトエラ
スターゼIIIAの生産性を示す。図中の矢印はヒトエラスターゼIIIA融合蛋白を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 // Ａ６１Ｋ 37/547 ＡＢＸ 8314−4ＣＣ１２Ｎ 9/66 9359−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｎ）−Val Val His Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser Arg Asp Leu Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asn Leu Ala Val Lys Glu Gly Pro Glu Glu Val Ile Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Phe Val His Pro Leu Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Lys Thr Pro Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln Gln Ala Arg Leu Pro Val Val Asp Tyr Lys His Cys Ser Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Thr Val Lys Lys Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Tyr Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Val Ser Ala Phe Gly Cys Asn Phe Ile Trp Lys Pro Thr Val Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala Ser His−（Ｃ）で表されるヒト・膵臓エラスターゼIIIAをコードするDN
A。
【請求項２】（Ｎ）−末端が水素原子、Met、あるいは
プレおよびプロ部分として Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu LeuVal Ala Val
Ala Ser Gly Tyr Gly ProPro Ser Ser His Ser Ser Se
r Arg の一部または全部を有するヒト・膵臓エラスターゼIIIA
をコードする特許請求の範囲第１項記載のDNA。
【請求項３】一般式（５′）−GTT GTC CAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AGT GGA AGC TTC TAC CAC ACG TGT GGC GGT AGC CTC ATC GCC CCC GAT TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TCG AGG GAT CTG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGT GAG TAC AAC CTT GCT GTG AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CCC ATC AAC TCT GAG GAG CTG TTT GTG CAT CCA CTC TGG AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC GCC CTC ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAT GCC GTC CAG CTC GCC TCA CTC CCT CCC GCT GGT GAC ATC CTT CCC AAC AAG ACA CCC TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC CGT CTC TAT ACC AAT GGG CCA CTC CCA GAC AAG CTG CAG CAG GCC CGG CTG CCC GTG GTG GAC TAT AAG CAC TGC TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC ACC GTG AAG AAA ACC ATG GTG TGT GCT GGA GGG TAC ATC CGC TCC GGC TGC AAC GGT GAC TCT GGA GGA CCC CTC AAC TGC CCC ACA GAG GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAC GGT GTG ACC AGC TTT GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC TTC ATC TGG AAG CCC ACG GTG TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATC GAC TGG ATT GAG GAG ACC ATA GCA AGC CAC−Ｘ（３′）（式中、ＸはTAA,TGAまたはTAGを示す。）で表される塩
基配列を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１
項または第２項記載のDNA。
【請求項４】５′末端にATG、あるいは（５′）−ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TCT CAC TCT TCC AGC CGC−（３′）の一部または全部を有することを特徴とする特許請求の
範囲第３項記載のDNA。
【請求項５】以下に記述した（イ）〜（ニ）を含むこと
を特徴とする一般式（５′）−GTT GTC CAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AGT GGA AGC TTC TAC CAC ACG TGT GGC GGT AGC CTC ATC GCC CCC GAT TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TCG AGG GAT CTG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGT GAG TAC AAC CTT GCT GTG AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CCC ATC AAC TCT GAG GAG CTG TTT GTG CAT CCA CTC TGG AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC GCC CTC ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAT GCC GTC CAG CTC GCC TCA CTC CCT CCC GCT GGT GAC ATC CTT CCC AAC AAG ACA CCC TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC CGT CTC TAT ACC AAT GGG CCA CTC CCA GAC AAG CTG CAG CAG GCC CGG CTG CCC GTG GTG GAC TAT AAG CAC TGC TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC ACC GTG AAG AAA ACC ATG GTG TGT GCT GGA GGG TAC ATC CGC TCC GGC TGC AAC GGT GAC TCT GGA GGA CCC CTC AAC TGC CCC ACA GAG GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAC GGT GTG ACC AGC TTT GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC TTC ATC TGG AAG CCC ACG GTG TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATC GAC TGG ATT GAG GAG ACC ATA GCA AGC CAC−Ｘ（３′）（式中、ＸはTAA,TGAまたはTAGを示す。）で表される塩
基配列を含有するDNAの製造法。（イ）ヒトの膵臓より、mRNAを分離する。（ロ）このmRNAおよび逆転写酵素を用いてcDNAバンクを
作製する。（ハ）作製したcDNAバンクからプローブを用いてヒトエ
ラスターゼIIIAをコードするcDNAを含有するプラスミド
を単離する。（ニ）このプラスミドから目的とするクローン化DNAを
切り出す。
【請求項６】５′末端にATG、あるいは（５′）−ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TCT CAC TCT TCC AGC CGC−（３′）の一部または全部を有することを特徴とする特許請求の
範囲第５項記載のDNAの製造法。
【請求項７】一般式（５′）−GTT GTC CAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AGT GGA AGC TTC TAC CAC ACG TGT GGC GGT AGC CTC ATC GCC CCC GAT TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TCG AGG GAT CTG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGT GAG TAC AAC CTT GCT GTG AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CCC ATC AAC TCT GAG GAG CTG TTT GTG CAT CCA CTC TGG AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC GCC CTC ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAT GCC GTC CAG CTC GCC TCA CTC CCT CCC GCT GGT GAC ATC CTT CCC AAC AAG ACA CCC TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC CGT CTC TAT ACC AAT GGG CCA CTC CCA GAC AAG CTG CAG CAG GCC CGG CTG CCC GTG GTG GAC TAT AAG CAC TGC TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC ACC GTG AAG AAA ACC ATG GTG TGT GCT GGA GGG TAC ATC CGC TCC GGC TGC AAC GGT GAC TCT GGA GGA CCC CTC AAC TGC CCC ACA GAG GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAC GGT GTG ACC AGC TTT GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC TTC ATC TGG AAG CCC ACG GTG TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATC GAC TGG ATT GAG GAG ACC ATA GCA AGC CAC−Ｘ（３′）（式中、ＸはTAA,TGAまたはTAGを示す。）で表される塩
基配列を含有するDNAで形質転換せしめた宿主。
【請求項８】５′末端にATG、あるいは（５′）−ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TCT CAC TCT TCC AGC CGC−（３′）の一部または全部を有することを特徴とする特許請求の
範囲第７項記載のDNAで形質転換せしめた宿主。
【請求項９】大腸菌、枯草菌、酵母または動物細胞であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の宿主。