JPH0698794A - ヒトガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）の前
駆体中のフランキング領域ＧＲＰ（３１−９８）に対す
る抗体。 【効果】 本発明の抗体はＧＲＰ前駆体に対して高い親
和性を有し、しかもＧＲＰ前駆体は活性ＧＲＰに比べて
血中で極めて安定であるため、本発明の抗体を用いて患
者の血中のＧＲＰ前駆体を検出又は測定することによ
り、高い信頼性をもって肺癌、特に肺小細胞癌の診断を
行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明ヒトガストリン放出ペプチ
ド(gastrin-releasing peptide; GRP)前駆体に対する抗
体、及び癌診断薬としてのその使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌細胞は、正常細胞と共通する多くの物
質とともに、癌細胞に特異的な物質を産生することが知
られている。この物質を測定することにより、癌細胞や
癌患者の特性を診断する方法が可能となっている。癌細
胞から特異的に産生する物質には、癌遺伝子産物及び、
増殖因子があり、細胞のがん化・増殖・進展に寄与して
いる。また、がん胎児性蛋白質やホルモン、酵素などの
産生も細胞のがん化の特性として考えられている。従っ
て癌細胞を規定するこれらの物質、いわゆる腫瘍マーカ
ーのいずれかを感度の良い系で測定することができれ
ば、癌の診断が可能となる。

【０００３】１９６８年、超微形態学的に肺小細胞癌に
神経内分泌顆粒の存在を認めて以来、肺小細胞癌は神経
内分泌細胞に由来するとの説が主張され、現在ではAPUD
(amine precursor uptake and decarboxylation)系腫瘍
に含まれており、他の上皮腫瘍である非小細胞癌と区別
されてきた。肺小細胞癌は、細胞生物学的検討からも神
経内分泌系腫瘍の特徴を示し、セロトニン、ＡＣＴＨ、
カルシトニン、ＧＲＰなどのペプチドホルモン産生が知
られ、さらにＡＰＵＤ系の細胞または腫瘍に特徴的なL-
dopa decarboxylase活性の高いこと、神経細胞に特異的
なneuron specific enolase(NSE), creatine kinaseBB
(CK-BB)活性が高いことが報告されている。

【０００４】肺小細胞癌の多様な生物学的特徴を指標と
したモノクローナル抗体を利用した表面抗原の解析は、
１９８１年のＭｉｎｎａ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４．１
２４６−１２４８）らの報告にはじまり多くの研究者に
より開発がおこなわれてきた。これまで腫瘍マーカーと
して実際に利用されてきたものにはＣＥＡ，ＡＦＰ，Ｃ
Ａ１２５などの癌胎児性抗原、ＮＳＥ，Ｌ−ＤＤＣ，Ｃ
Ｋ−ＢＢなどの酵素類、ＡＣＴＨ，ＡＤＨなどのホルモ
ン関連物質などの測定系がある。しかしながら、これら
の測定系を用いた癌患者血清の陽性率は、せいぜい５０
〜６０％であり、また陰性の中に癌をもつ場合も多い。

【０００５】肺小細胞癌の腫瘍マーカーのひとつとして
従来からＧＲＰが知られている。ＧＲＰは、１９７８年
ＭｃＤｏｎａｌｄらがブタの胃から抽出した２７個のア
ミノ酸からなるペプチドで、胃酸の分泌、粋外分泌、各
種ホルモンの分泌刺激などの作用を有するものである。
また、ｍＲＮＡのａｌｔｅｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉ
ｎｇによりＣ−末端構造の異なる３種類の前駆体蛋白質
が存在する。近年、肺小細胞癌におけるオートクリン増
殖因子としてのＧＲＰの産生が見い出されるに及び腫瘍
マーカーとして注目されている。

【０００６】肺小細胞癌患者では、約８０％の症例で血
中ＧＲＰ濃度が高値を呈している。かつ、早期の症例で
も同頻度で上昇しており、このＧＲＰをマーカーとした
肺癌の診断は、きわめて有効な診断薬となりえることが
期待される。しかしながら従来のＧＲＰを測定する方法
は、活性ペプチドであるＧＲＰ（１−２７）に対する抗
体を利用して測定する系であり、その感度の低さから実
用的なものではない。これまでＧＲＰ（１−２７）の抗
体を用いた血中濃度測定が困難であったことの大きな理
由の一つに、ＧＲＰ（１−２７）の血中での不安定さが
予想される。

【０００７】Ｈｏｌｓｔ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏ
ｌ．，７，１８３１−１８３８（１９８９））らは、Ｇ
ＲＰ前駆体のＣ端フランキングペプチドの一部分である
４２〜５３番目までの合成ペプチドに対するポリクロー
ナル抗体によるＲＩＡの系を開発し、ＧＲＰ前駆体蛋白
質が肺小細胞癌での有力な診断マーカーとなりうること
を示した。しかしながらその感度の低さから実用的な診
断薬としては、陽性率が不十分である。これは、用いた
抗原蛋白質が、前駆体ＧＲＰの一部分であり、従って得
られる抗体の感度及び特異性が低いからである。また、
感度の低さは、大量のサンプルからの抽出操作を必要と
し臨床応用には容易なものではなく実用に至っていな
い。血中に存在するＧＲＰ前駆体蛋白質は分子量８００
０〜１００００からなる大分子である。従って、前駆体
ＧＲＰの一部分であるＧＲＰ（４３−５２）を抗原とし
て作製した抗体を用いた系では、感度及び特異性に限界
がある。

【０００８】正常細胞では、蛋白質は、粗面小胞体で産
生された後、ゴルジ装置で濃縮を受けることにより、分
泌顆粒を形成し、顆粒内にパックされ、いわゆるregula
tedpathway により細胞外へ分泌される。分泌顆粒の中
には、蛋白質分解酵素があり、このようなregulated pa
thway を経由する際に前駆体は、適切なプロセッシング
を受けることができる。一方、がん細胞では、粗面小胞
体が著しく発達して、分泌顆粒は少なく、ＧＲＰを産生
分泌する場合、分泌顆粒を経由するregulatedpathway
ではなく粗面小胞体から蛋白質分解酵素の作用を受けず
に前駆体がそのまま細胞外へ分泌するconstitutive pat
hwayを通るものが多い。従って、がん患者の血中には、
活性ペプチドであるＧＲＰ（１−２７）の他に、前駆体
ＧＲＰ、及びフランキングペプチドなどが存在する。

【０００９】ＧＲＰ（１−２７）に比較し、活性部位を
含まないＧＲＰ前駆体のフランキングペプチドは血中で
安定で高濃度存在することが期待される。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ＧＲ
Ｐ前駆体中の今まで抗原として用いられていない領域を
抗原とし、高感度に肺癌を診断することができる新規な
抗体、及び該抗体を含んで成る肺癌診断薬を提供しよう
とするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため種々検討した結果、ＧＲＰ前駆体中の
ＧＲＰ活性部位ではなく、且つ３種類のＧＲＰ前駆体の
共通領域であるアミノ酸番号３１位のＳｅｒから９８位
のＡｓｐまでのアミノ酸配列を有するペプチドを抗原と
する抗体がＧＲＰ前駆体と特異的且つ高い親和性を有し
肺癌の診断のために有用であることを見出し、本発明を
完成した。

【００１２】従って本発明は、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列を有するペプチドを抗原とし、ヒトＧＲＰ前駆
体と反応する抗体を提供する。本発明はまた、ヒトＧＲ
Ｐ前駆体との免疫複合体の解離定数Ｋｄが３×１０^-8〜
５×１０^-7Ｍである、ヒトＧＲＰに対するモノクローナ
ル抗体を提供する。本発明はまた、前記抗体を含んで成
る肺癌診断薬を提供する。

【００１３】本発明はさらに、前記のモノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマを提供する。本発明はさら
に、ヒトＧＲＰ前駆体抗原の製造方法であって、配列番
号：１に示すアミノ酸配列をコードする領域を含む発現
ベクターにより形質転換された宿主を培養し、培養物か
らヒトＧＲＰ前駆体抗原を採取することを特徴とする方
法を提供する。

【００１４】

【具体的な説明】

（１）抗原蛋白質及びその製造方法 ＧＲＰの生体内産生過程では、ｍＲＮＡのaltenative s
plicing によって、３種のＧＲＰメッセンジャーＲＮＡ
が生成され、活性部位を含む９８番目までアミノ酸配列
は共通であるが、Ｃ−末端構造の異なる３種の前駆体蛋
白質が生成される。本発明において使用するＧＲＰ前駆
体抗原は、前記３種類の前駆体蛋白質に共通であり、且
つＧＲＰの活性領域を含まない、アミノ酸番号３１のＳ
ｅｒからアミノ酸番号９８のＡｓｐまでのアミノ酸配列
を有するペプチドである。なお、本発明で用いるアミノ
酸の番号は成熟ＧＲＰのＮ−末端アミノ酸Ｖａｌを１位
として数えたものである。従って、成熟ＧＲＰはＧＲＰ
（１−２７）として表わされ、本発明の抗原ペプチドは
ＧＲＰ（３１−９８）として表わされる。

【００１５】本発明のＧＲＰ前駆体抗原ＧＲＰ（３１−
９８）のアミノ酸配列及び、それをコードする塩基配列
の１例を配列表の配列番号１に示す。本抗原蛋白質は、
ペプチド合成または、遺伝子工学的手法により製造する
ことができる。アミノ酸の数が４０を超えると化学合成
が困難になるので遺伝子工学的手法により合成すること
が好ましい。

【００１６】遺伝子工学的手法による本発明の抗原蛋白
質の合成は、ポリペプチドをコードする領域を含み、宿
主、例えば大腸菌で該抗原蛋白質を発現することができ
る発現ベクターで宿主、例えば大腸菌を形質転換し、該
形質転換株を培養し、その培養物から上記抗原蛋白質を
回収することにより行うことができる。上記発現ベクタ
ーにおいて、本発明のポリペプチドをコードする領域
は、本発明のポリペプチドをコードするものであればい
かなる塩基配列を有していてもよいが、発現がスムーズ
になるよう大腸菌の使用頻度の高いコドンを使い、パリ
ンドロームなどの配列を避けることが望ましい。

【００１７】ＧＲＰ（３１−９８）のアミノ酸をコード
する塩基配列としては配列番号：１に示す配列が望まし
い。上記本発明のポリペプチドコード領域の上流には使
用する宿主、例えば大腸菌での転写効率を高めるための
プロモーター、例えばトリプトファンプロモーターが存
在する。プロモーターの直下流に前記本発明のポリペプ
チドコード領域が位置してもよいが、後述の実施例で示
すように、宿主が本来生産するタンパク質、例えば大腸
菌ＴｒｐＥタンパク質をコードする領域の下流に上記領
域が位置していても良い。後者の場合には、本発明のポ
リペプチドは融合タンパク質の形態として得られる。

【００１８】この発明の発現ベクターは、通常の発現ベ
クターと同様、抗生物質耐性のような適当な選択マーカ
ー及び宿主、例えば大腸菌内で複製するための開始点を
有す。さらに、上記本発明のポリペプチドコード領域の
下流には翻訳終結コドンが存在する。この様な発現ベク
ターを作製するための材料として、例えばｐＵＣ９，ｐ
ＢＲ３２２その他の市販のベクターを利用することがで
きる。

【００１９】上記発現ベクターは、上記した本発明のポ
リペプチドコード領域を例えばホスホアミダイト法等の
公知の合成法により作製し、さらに宿主、例えば大腸菌
内で発現する公知の発現ベクターにクローニングするこ
とにより作製することできる。後述の実施例では、大腸
菌トリプトファンプロモーターを有し、大腸菌でＴｒｐ
Ｅ及びＴＧＦ−α（特願昭６３−２８９０８号記載）に
ＧＲＰコード領域をクローニングした。

【００２０】上記発現ベクターを用いた形質転換は常法
に従って行なうことができる。また、宿主、例えば大腸
菌の培養条件も従来と同様に行なうことができる。上記
ベクターで形質転換された宿主、例えば大腸菌により産
生された本発明のポリペプチドは、菌体を遠心分離等で
集め、周知のリゾチーム処理及び又は超音波処理等で菌
体を破壊し、これをゲルろ過クロマトグラフィー等にか
けることにより分離精製する事ができる。分離精製の具
体的条件は後述の実施例に詳細する。 （２）抗体の製造 マウス、例えばＢａｌｂ／Ｃマウス等の腹腔あるいは皮
内に、本抗原を単独であるいはＢＳＡ，ＫＬＨ等のハプ
テンを結合させた抗原として、フロイント完全アジュバ
ントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇
した頃合いをみて、追加免疫として本抗原をマウス尾静
脈に投与し、その後、脾臓を取り出し、適当なマウス骨
髄細胞と融合する。本方法は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓ
ｔｅｉｎの方法（Nature 256,495-497 1975)に従って行
なうことができる。

【００２１】上記により得られたハイブリドーマ細胞株
を適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対し、特
異的な反応を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株
を選択し、クローン化する。そして、産生されたモノク
ローナル抗体をカラムクロマト等の方法により回収す
る。ポリクローナル抗体の製造においては、例えばモル
モット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の動物へ、フットパッ
ト、あるいは筋肉内、皮下へ、本抗原単独、あるいはウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘ
モシアニン（ＫＬＨ）等のハプテンを結合させた抗原を
フロイント完全アジュバントと混合して、定期的に免疫
する。血中の抗体価の上昇をみて、全血採取を行い、ポ
リクローナル抗体をカラムクロマト等の方法により回収
する。

【００２２】得られたモノクローナル抗体、又はポリク
ローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法又は他の免疫測定法
を行い、血中のＧＲＰ前駆体を測定可能することができ
る。

【００２３】

【実施例】以下、この発明を実施例に基づいてより具体
的に説明するが、この発明は下記実施例に限定されるも
のではない。実施例１．ＧＲＰ（３１−９８）の作製 （１）クローニングベクターの構築 図１に示す通り、ＧＲＰ遺伝子を約６０塩基対から成る
ＤＮＡフラグメントに分割し、それぞれをホスホアミダ
イト法により合成した。

【００２４】 ────────────────────────────── フラグメント 配列番号 フラグメント 配列番号 ───────────── ─────────────── Ｈ１ ２ Ｌ１ ６ Ｈ２ ３ Ｌ２ ７ Ｈ３ ４ Ｌ３ ８ Ｈ４ ５ Ｌ４ ９ ────────────────────────────── 合成したフラグメントを逆層クロマトグラフィーにより
精製し、Ｔ４リガーゼによる酵素反応によりＧＲＰ遺伝
子を得た。

【００２５】得られた遺伝子の５′−及び３′−末端は
それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ部位及びＳａｌＩ部位を持
ち、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化したクローニングベ
クターｐＵＣ９に挿入した。これを用い大腸菌ＪＭ１０
７株を形質転換し、４０μｇ／mlのアンピシリン、ＩＰ
ＴＧ及びＸ−ｇａｌ存在下、Ｌ培地にて一晩培養し、候
補株を得た。

【００２６】得られた候補株よりプラスミドを抽出した
後、サンガー法により挿入遺伝子の塩基配列を調べ、設
計した通りの遺伝子配列を持つことを確認した。この目
的とするＧＲＰを含むクローニングベクターを持つ菌を
ｐＵＣ−ＧＲＰ（３１−９８）／ＪＭ１０７と命名し
た。

【００２７】（２）発現ベクターの構築（図２） ｐＵＣ−ＧＲＰ（３１−９８）／ＪＭ１０７株より制限
酵素ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化し、約２２０塩基対の
ＧＲＰ遺伝子断片を抽出し、別途、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＳａｌＩで消化した発現ベクターｐＡＴ−ＴｒｐＥ
−ＴＧＦ−αの大断片とＴ４リガーゼを用いて結合し
た。これを用い大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、４０
０μｇ／mlのアンピシリン存在下、Ｌ培地にて一晩培養
し、候補株を得、これをｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＧＲＰ（３
１−９８）／ＨＢ１０１株とした。

【００２８】（３）発現蛋白質の精製 構築した発現ベクターを含む上記ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｇ
ＲＰ（３１−９８）／ＨＢ１０１株について培養を行な
い組換えタンパク質の発現を調べた。ｐＡＴ−ＴｒｐＥ
−ＧＲＰ（３１−９８）／ＨＢ１０１を４０μｇ／mlの
アンピシリンを含む３２mlのＬ培地中で一夜培養した
後、３．２１の０．５％カザミノ酸を含むＭ９培地に接
種し、３７度で培養し、６００nmにおける吸光度が０．
４になるまで培養したところでインドールアクリル酸を
最終濃度３０μｇ／mlになるように加え、さらに２０時
間培養を継続した後、遠心分離により１０ｇの菌体を集
めた。集めた菌体を２mg／mlのリゾチーム、２mM ＥＤ
ＴＡ及び１００mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を含
む溶液中に懸濁し、０度、３０分間放置した。さらに超
音波処理を行ない菌体を粉砕した後、遠心操作により不
溶性画分である沈殿を得た。

【００２９】得られた不溶性画分に８Ｍ尿素溶液を加え
可溶化し、遠心分離により上清を集め、ＤＥＡＥトヨパ
ール（ＴＯＳＯ社製）カラムクロマトグラフィーにより
分離精製した（溶出液：Ａ：２０mMトリス塩酸／６Ｍ尿
素（pH８．０）Ｂ：０．５ＭＮａＣｌ／溶出液Ａ（pH
８．０）、グラジエント濃度：ＡからＢを直線勾配／３
００分、カラム：φ１．６×４０cm、流速１ml／分）。
溶出画分を集め、透析、凍結乾燥を行ない、臭化シアン
によりＴｒｐＥ部分を切断、除去した。これは、７０％
ギ酸中にタンパク質濃度が１％になるように発現組成物
を加え、臭化シアンを１００当量加え、３７度で２４時
間放置することにより行なった。

【００３０】さらに透析、凍結乾燥後、逆層ＨＰＬＣ
（溶出液；Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸／水、Ｂ：６
０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸／水）
により精製を行ない、３０mgのＧＲＰのタンパク質を得
た。このものの純度は逆層カラムクロマトグラフィー及
びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により単
一のものであることを確認した。またペプチドシーケン
サーによるアミノ酸配列決定により目的とするＧＲＰ配
列を有していることを確認した。

【００３１】実施例２．ポリクローナル抗体の作製 得られたＧＲＰ（３１−９８）をキャリアー蛋白質とし
てＫＬＨに結合し、ウサギＮＺＷ種に最初、１５０μｇ
を接種し、２週間後に１００μｇ、さらに２週間後に１
００μｇ、６日後に８５μｇ、１２日後に８０μｇ、１
２日後に６０μｇを接種した。抗体価の上昇を確認し全
採血した。

【００３２】実施例３．モノクローナル抗体の作製 ＧＲＰ（３１−９８）をキャリアー蛋白質としてＫＬＨ
に結合し、マウスｂａｌｂ／ｃ系に最初、５０μｇを接
種し、３週間後に５０μｇ、さらに３週間後に５０μ
ｇ、４週間後に５０μｇ、４週間後に３０μｇ、を接種
した。免疫したマウスから得た脾細胞（１×１０⁸ cell
s ／ml）にあらかじめ培養しておいたマウスミエローマ
細胞（Ｐ３Ｕ１）１×１０⁷ cells ／mlを１０対１の割
合で混合し、５分間、３７℃でインキュベートした。

【００３３】次に５０％ポリエチレングリコール１５０
０を加えた後、ＲＰＭＩ１６４０を加えた。遠心後、２
０％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有ＨＡＴ培地を加え、３．
３×１０⁵ cells ／mlに調整し、９６穴マイクロプレー
トに１００μｌずつ分注した。その後、１０〜１４日間
３７℃で培養した。ＧＲＰ（３１−９８）１００ng／ml
をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて、各穴
に先の培養上清を１００μｌ加え、２時間反応後、ペル
オキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンγ抗体と１
時間３０分反応させた後、ＴＭＢＺ溶液で発色させた。
波長４５０nmで吸光度を測定し、吸光度値０．３以上の
クローンを陽性とし、モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを得た。プリスタン等で処理したマウス腹腔にハ
イブリドーマ細胞を移植し、腹水中に産生されてくるモ
ノクローナル抗体を取得した。あるいは、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでハイブリドーマ細胞を培養して、その上清中に産
生されるモノクローナル抗体を取得した。

【００３４】モノクローナル抗体の精製は通常の方法に
より、硫安沈殿を行い、リン酸緩衝液等により透析後Ｐ
ｒｏｔｅｉｎＡを結合させたセファロースカラムにより
ＩｇＧフラクションを得た。上記のようにして作製した
モノクローナル抗体とＧＲＰ（３１−９８）抗原との親
和性を次のようにして求めた。ＧＲＰ（３１−９８）を
飽和固相化したマイクロプレートに、ＧＲＰ（３１−９
８）に対するモノクローナル抗体（１０μｇ／ml）を０
〜０．３μｇ／mlまで希釈した溶液２０μｌを加え反応
させた。結合した抗体を酵素標識した抗マウスＩｇＧで
検出した。

【００３５】得られた吸光度と加えた抗体量の関係か
ら、結合抗体量Ｂを求め、加えた抗体量から結合抗体量
を引いた値を遊離抗体量Ｆとした。結合抗体量Ｂを分子
量１５万としてモル濃度で表し、これに対しＢ／Ｆをス
キャッチャード・プロットする。この直線の傾きから結
合定数Ｋ_a ＝３×１０⁹ 〜２×１０¹⁰／Ｍと成った。こ
れより解離定数Ｋｄ＝１／Ｋａとなり、Ｋｄ＝３×１０
^-8〜５×１０^-7／Ｍであった。

【００３６】実施例４．血中ＧＲＰの測定（図３） ＧＲＰ（３１−９８）に対するモノクローナル抗体（２
５μｇ／ml）をＥＬＩＳＡ用プレートに通常の方法によ
り一定時間コーティングした後、ＧＲＰ（３１−９８）
標準又は肺小細胞癌患者血清２００μｌを添加し、その
後ペルオキシダーゼにより標識したＧＲＰ（３１−９
８）に対するポリクローナル抗体２００μｌを一定時間
反応させた。洗浄後、３３′５５′テトラメチルベンチ
ジン（ＴＭＢＺ）溶液を加え発色させ、その吸光度を４
５０nm波長により測定し、検量線を作成した後、血中の
ＧＲＰ前駆体濃度をその検量線から求めた。

【００３７】実施例５．血中ＧＲＰの安定性比較（図
４） 作製したＧＲＰ（３１−９８）、及び従来のＧＲＰ（１
−２７）に対する抗体を用いて血中成分中でのＧＲＰ
（１−２７）及びＧＲＰ（３１−９８）の安定性を比較
検討した。ヒトより採取した血清、血漿、及びアプロチ
ニンを含む血漿中にＧＲＰ（１−２７）又はＧＲＰ（３
１−９８）を少量加え、０時間、１時間後、６時間後
に、ＧＲＰ濃度を測定し、開始時間を１００％として残
存活性を百分率で求めた。

【００３８】図４から明らかな通り、活性ペプチドＧＲ
Ｐ（１−２７）は血清又は血漿の存在下で分解・消失し
たが、ＧＲＰ（３１−９８）は、血清及び血漿中で長時
間安定であった。

【００３９】実施例６．モノクローナル抗体の作製 前記の方法により得たＧＲＰ（３１−９８）をキャリア
ー蛋白質として、サイログロブリンに結合し、リン酸緩
衝液（pH７．４）（ＰＢＳ（−））に溶解し、１．０mg
／mlとし、等量のフロインド完全アジュバンドと混和
し、懸濁させた。得られた懸濁液の前記ＧＲＰ（３１−
９８）０．０１〜０．０５mg含有分を４〜６週令のＢＡ
ＬＢ／Ｃ系マウスに腹腔内投与した。約１２週間後、免
疫化動物に前記と同じ濃度のＧＲＰ（３１−９８）のＰ
ＢＳ（−）溶液０．０１〜０．０３mg含有分を尾静脈内
に投与し、投与３日後、免疫動物より無菌的に脾臓を摘
出した。

【００４０】次に、メッシュを用いて脾臓を個々の細胞
にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、８−
アザグアニン存在下で数日間培養し、復帰突然変異体を
完全に除いた、対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｐ３×
６３Ａｇ８〔Nature 256, 495-497 (1975)〕を前記と同
様に洗浄後、その１．１×１０⁷ 個と、前記脾臓細胞
１．４×１０⁸ 個とを、混合した。２００×ｇ，５分遠
心後、上清除去し、３７℃に保温した５０％ＰＥＧ４０
００（Ｍｅｒｃｋ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地１mlを
加え、細胞融合させた。

【００４１】融合した細胞は遠心によってＰＥＧを除い
た後、９６穴マイクロプレートを用いて、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジン（以下ＨＡＴと略す）
を含む、１５％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有ＲＰＭＩ−１
６４０培地中で１〜２週間培養してハイブリドーマのみ
を増殖させた。その後ＨＡＴを含まない培地中で成育さ
せ、約２週間後、目的の抗体を産生するクローンを以下
に示すＥＬＩＳＡ法により検索し、所望の反応特異性を
有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを得た。

【００４２】ＥＬＩＳＡ法を次の様にして行った。ＧＲ
Ｐ（３１−９８）を、リン酸緩衝液pH７．４（ＰＢＳ）
に溶解し、濃度１μｇ／mlとしたものを、９６穴マイク
ロプレートの各ウエルに５０μｌずつ分注し、４℃で一
晩、もしくは室温１時間以上で吸着させた。吸着後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（−）（Ｔ−Ｐ
ＢＳ）で３回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を１
ウエル２００μｌずつ分注し、室温で１時間処理した。
１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を除き、ハイブリドーマ培
養上清、また粗製または精製モノクローナル抗体等を各
々５０μｌずつウエルに加え、室温で１時間反応させ
た。

【００４３】反応後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、１％Ｂ
ＳＡ，１％ポリビニルピロリドン、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０含有ＰＢＳ（−）で５０００倍に希釈した酵素
標識抗マウスＩｑＧｔＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を１
ウエルにつき５０μｌ加え、室温で３０分間反応させ
た。未反応抗体をＴ−ＰＢＳで４回洗浄することにより
除き、オルトフェニレンジアミン溶液（和光純薬）を１
ウエルに５０μｌずつ加え、反応させ、室温２０分後、
２Ｎ硫酸溶液で反応を停止させ、波長４９２nmにおける
吸光度を測定した。

【００４４】得られたハイブリドーマをｐｒｏＧＲＰ−
１Ｅ２，ｐｒｏＧＲＰ−２Ｂ１０，ｐｒｏＧＲＰ−２０
Ｄ２，ｐｒｏＧＲＰ−３Ｈ１、ｐｒｏＧＲＰ−３Ｇ２及
びｐｒｏＧＲＰ−４０９と命名し、この内ハイブリドー
マｐｒｏＣＲＰ−２Ｂ１０及びｐｒｏＧＲＰ−３Ｇ２は
それぞれ微工研条寄第４１１０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
１１０）及び微工研条寄第４１０９号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−４１０９）として工業技術院微生物工業技術研究所に
ブダペスト条約に基き１９９２年１２月９日に寄託され
た。またハイブリドーマｐｒｏＧＲＰ−２０Ｄ２は、
「抗ｐｒｏＧＲＰモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ（２０Ｄ２）」と命名され微工研条寄第４１８４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４１８４）として工業技術院微生物工業
技術研究所にブダペスト条約に基き１９９３年２月１０
日に寄託された。

【００４５】ウサギ抗マウスＩｇ各イソタイプ抗体（Ｚ
ｙｍｅｄ社）を用いた二重免疫拡散法により、これらの
ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体のイソタ
イプは、ＧＲＰ−１Ｅ２，ＧＲＰ−２Ｂ１０及びＧＲＰ
−３Ｇ２がＩｇＧ１，ＧＲＰ−２０Ｄ２はＩｇＧ２ａ，
ＧＲＰ−３Ｈ１はＩｇＭであることが明らかとなった。
なお、ｐｒｏＧＲＰとはＧＲＰ前駆体を意図する。

【００４６】実施例７．実施例６の方法により得たハイ
ブリドーマｐｒｏＧＲＰ−２Ｂ１０，ｐｒｏＧＲＰ−１
Ｅ２，ｐｒｏＧＲＰ−２０Ｄ２，ｐｒｏＧＲＰ−３Ｈ１
及びｐｒｏＧＲＰ−４Ｃ９をマウスの腹水に接種し、そ
の腹水から、プロテインＡカラム、ゲルろ過カラム又は
プロテインＧカラムを用いて純度９０％以上に精製し
て、それぞれモノクローナル抗体ＧＲＰ−２Ｂ１０，Ｇ
ＲＰ−１Ｅ２，ＧＲＰ−２０Ｄ２，ＧＲＰ−３Ｈ１及び
ＧＲＰ−４Ｃ９を得た。

【００４７】ＥＬＩＳＡ法を次の様にして行った。ＧＲ
Ｐ（３１−９８）を、リン酸緩衝液pH７．４（ＰＢＳ）
に溶解し、濃度１μｇ／mlとしたものを、９６穴マイク
ロプレートの各ウエルに５０μｌずつ分注し、４℃で一
晩、もしくは室温１時間以上で吸着させた。吸着後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（−）（Ｔ−Ｐ
ＢＳ）で３回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を１
ウエル２００μｌずつ分注し、室温で１時間処理した。
１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を除き、ハイブリドーマ培
養上清、また、粗製または精製モノクローナル抗体等を
各々５０μｌずつウエルに加え、室温で１時間反応させ
た。

【００４８】反応後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、１％Ｂ
ＳＡ，１％ポリビニルピロリドン、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０含有ＰＢＳ（−）で５０００倍に希釈した酵素
標識抗マウスＩｑＧｔＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を１
ウエルにつき５０μｌ加え、室温で３０分間反応させ
た。未反応抗体をＴ−ＰＢＳで４回洗浄することにより
除き、オルトフェニレンジアミン溶液（和光純薬）を１
ウエルに５０μｌずつ加え、反応させ、室温２０分後、
２Ｎ硫酸溶液で反応を停止させ、波長４９２nmにおける
吸光度を測定した。その結果を図５に示した。このよう
に、ｐｒｏＧＲＰと反応性が最も高いのがＧＲＰ−３Ｇ
２であり、続いてＧＲＰ−２Ｂ１０，ＧＲＰ−１Ｅ２，
ＧＲＰ−２０Ｄ２，ＧＲＰ−３Ｈ１、そしてＧＲＰ−４
Ｃ９の順であった。

【００４９】実施例８．ポリクローナル抗体の作製 前記の方法により得たＧＲＰ（３１−９８）をキャリア
ー蛋白質として、サイログロブリンに結合し、リン酸緩
衝液pH７．４（ＰＢＳ（−））に溶解し、１．０mg／ml
とし、等量のフロインド完全アジュバンドと混和し、懸
濁させた。得られた懸濁液の前記ＧＲＰ（３１−９８）
０．１mg含有分を８週令（１．５〜２．０kg）のウサギ
Ｋｂｌ：ＪＷ系、雌に皮下投与し、１０日毎にＧＲＰ
（３１−９８）０．０７mg含有分を６回投与した後、高
い抗体価を認めたウサギの採血をすることによりポリク
ローナル抗体を得た。

【００５０】ラビット抗ｐｒｏＧＲＰポリクローナル抗
体と、前述のモノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２及びＧ
ＲＰ−２Ｂ１０を用いてサンドウイッチＥＬＩＳＡ（ｅ
ｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
を構築した。その測定方法を、次に記す。

【００５１】ＧＲＰ−３Ｇ２及びＧＲＰ−２Ｂ１０各々
７μｇ／ml、計１４μｇ／mlになるようにＰＢＳで希釈
し、その１００μｌをウエルに加え、４℃で一晩放置し
てコートした。ＰＢＳで２回ウエルを洗浄した後、０．
５％カゼイン／ＰＢＳを３５０μｌをウエルに加え室温
で２時間インキュベートして、その後ＰＢＳで２回ウエ
ルを洗浄した。検体希釈液（１％ＢＳＡ、１％ＰＶＰ、
０．０５％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１
０ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌを含んだ０．１Ｍ
燐酸緩衝液、pH７．１）を５０μｌ／ウエル添加してか
ら、試料５０μｌを添加し、３７℃で２時間反応させた
後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳで５回洗浄し
た。

【００５２】その後、標識抗体希釈液で、ペルオキシダ
ーゼで標識したラビット抗ｐｒｏＧＲＰ抗体を５μｇ／
mlになるように希釈したものを１００μｌ／ウエル添加
して、室温で１時間インキュベートした。次に、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳで５回洗浄して、基質溶
液（ＯＰＤ溶液）を１００μｌ加えて、室温で３０分間
反応させ２Ｎ硫酸１００μｌを加えて反応を停止させ
た。試料中ｐｒｏＧＲＰ（３１−９８）の濃度を変化さ
せた時の結果を図６に示す。検出限界は、約３pg／ml、
測定範囲は、１０−８００pg／mlと考えられる。

【００５３】また、同時に高ｐｒｏＧＲＰ値を示すと思
われる患者血清を健常人血清で希釈した場合の希釈直線
を示す。これらの２本の直線は、ほぼ平行な関係にあ
り、組み換え体ｐｒｏＧＲＰ（３１−９８）の反応性は
血清中のｐｒｏＧＲＰと同様な反応性を示していると思
われた。

【００５４】

【表１】

【００５５】次に、健常人血清７列、小細胞癌患者血清
５例を測定した結果を表１に示す。このように、健常人
は、最高値で３９pg／mlであり、小細胞癌患者血清で
は、１４３pg／ml以上をとり、最高値で１８．３ng／ml
を示していた。以上のように、健常人と小細胞癌患者の
血清中ｐｒｏＧＲＰ値には、大きな差が認められｐｒｏ
ＧＲＰは小細胞癌マーカーとして極めて有効であると思
われ、この測定系の有用性も大きなものと思われる。

【００５６】

【発明の効果】本発明の、ガストリン放出ペプチド（Ｇ
ＲＰ）の前駆体中の不活性領域ＧＲＰ（３１−９８）に
対する抗体は、ＧＲＰ前駆体に対して高い親和性を有
し、しかもＧＲＰ前駆体は活性ＧＲＰに比べて血中で極
めて安定であるため、本発明の抗体を用いて患者の血中
のＧＲＰ前駆体を検出又は測定することにより、高い信
頼性をもって肺癌、特に肺小細胞癌の診断を行うことが
できる。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGT ACT GGT GAG AGC TCT TCT GTT TCT GAA CGT GGA TCC CTT AAG 45 Ser Thr Gly Glu Ser Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ser Leu Lys 5 10 15 CAG CAG CTT CGC GAA TAC ATC CGT TGG GAA GAA GCT GCT CGT AAC 90 Gln Gln Leu Arg Glu Tyr Ile Arg Trp Glu Glu Ala Ala Arg Asn 20 25 30 CTG CTA GGC CTG ATC GAA GCT AAA GAA AAC CGT AAC CAC CAG CCG 135 Leu Leu Gly Leu Ile Glu Ala Lys Glu Asn Arg Asn His Gln Pro 35 40 45 CCG CAG CCG AAA GCT TTA GGT AAC CAG CAG CCG TCT TGG GAC TCT 180 Pro Gln Pro Lys Ala Leu Gly Asn Gln Gln Pro Ser Trp Asp Ser 50 55 60 GAA GAC TCT TCG AAC TTT AAA GAC 204 Glu Asp Ser Ser Asn Phe Lys Asp 65

【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCATGAG TACTGGTGAG AGCTCTTCTG TTTCTGAACG TGGATCC 47

【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTAAGCAGC AGCTTCGCGA ATACATCCGT TGGGAAGAAG CTGCTCGTAA 50 CCTG 54

【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTAGGCCTGA TCGAAGCTAA AGAAAACCGT AACCACCAGC CGCCGCAGCC 50 GAAA 54

【００６１】配列番号：５ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCTTTAGGTA ACCAGCAGCC GTCTTGGGAC TCTGAAGACT CTTCGAACTT 50 TAAAGACTAA TAAG 64

【００６２】配列番号：６ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTAAGGGAT CCACGTTCAG AAACAGAAGA GCTCTCACCA GTACTCATG 49

【００６３】配列番号：７ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCTAGCAGG TTACGAGCAG CTTCTTCCCA ACGGATGTAT TCGCGAAGCT 50 GCTG 54

【００６４】配列番号：８ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAAGCTTTC GGCTGCGGCG GCTGGTGGTT ACGGTTTTCT TTAGCTTCGA TCAG 54

【００６５】配列番号：９ 配列の長さ：６２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGACTTATT AGTCTTTAAA GTTCGAAGAG TCTTCAGAGT CCCAAGACGG 50 CTGCTGGTTA CC 62

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＧＲＰ（３１−９８）をコードするＤＮ
Ａの塩基配列及び該ＤＮＡを合成するためのオリゴヌク
レオチドを示す。

【図２】図２はＧＲＰ（３１−９８）を製造するための
発現プラスミドｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＧＲＰ（３１−９
８）の作製過程を示す。

【図３】図３は本発明の抗−ＧＲＰ（３１−９８）抗体
を用いて肺小細胞癌患者の血清中のＧＲＰ前駆体の量を
測定した例を示す。

【図４】図４は、ＧＲＰ（１−２７）に比べてＧＲＰ
（３１−９８）が血清又は血漿中で安定であることを示
すグラフである。

【図５】図５は、ｐｒｏＧＲＰに対する本発明の種々の
モノクローナル抗体の親和性を示すグラフである。

【図６】図６は、一次抗体として本発明のモノクローナ
ル抗体３Ｇ２及び２Ｂ１０の混合物を用い、二次抗体と
してラビット抗ｐｒｏＧＲＰポリクローナル抗体を用い
るＥＬＩＳＡにおける標準曲線の１例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 15/16 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有す
   るペプチドを抗原とし、ヒトガストリン放出ペプチド
   （ＧＲＰ）前駆体と反応する抗体。
2. 【請求項２】 ヒトＧＲＰ前駆体との免疫複合体の解離
   定数Ｋｄが３×１０ ^-8〜５×１０^-7Ｍである、ヒトＧＲ
   Ｐ前駆体に対するモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のモノクローナル
   抗体を生産するハイブリドーマ細胞。
4. 【請求項４】 請求項１〜２のいずれか１項に記載の抗
   体を含んで成る肺癌診断薬。
5. 【請求項５】 ヒトＧＲＰ前駆体抗原の製造方法であっ
   て、配列番号：１のアミノ酸配列をコードする領域を含
   む発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、培
   養物からヒトＧＲＰ前駆体抗原を採取することを特徴と
   する方法。