JPH0698797A - Method for detecting nucleic acid - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、特定の配列を有する核
酸の検出法に関する。さらに詳細には、特定の塩基配列
を有する遺伝子の有無を核酸同士のハイブリダイゼーシ
ョン反応によって検出する方法において、所望のハイブ
リダイゼーション反応に競合するヌクレオチド鎖を当該
反応系から事前に除去して、検出感度を向上させる方法
に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid having a specific sequence. More specifically, in a method of detecting the presence or absence of a gene having a specific nucleotide sequence by a hybridization reaction between nucleic acids, a nucleotide chain that competes with a desired hybridization reaction is removed in advance from the reaction system to detect the detection sensitivity. On how to improve.
【０００２】[0002]
【従来の技術】特定の塩基配列を有する遺伝子の有無を
核酸同士のハイブリダイゼーション反応によって検出す
る方法は、近年遺伝子検出法として広く用いられている
方法である。すなわち、相補的な配列を有する核酸同士
のハイブリダイゼーション反応は、特異性・反応性が高
いことから、免疫反応と同様にリガンド−レセプター反
応として広く用いられている方法である。2. Description of the Related Art A method for detecting the presence or absence of a gene having a specific nucleotide sequence by a hybridization reaction between nucleic acids is a method widely used in recent years as a gene detection method. That is, the hybridization reaction between nucleic acids having complementary sequences has a high specificity / reactivity, and thus is a method widely used as a ligand-receptor reaction like an immune reaction.
【０００３】ところで、従来は核酸試料を変性させたま
まニトロセルロース膜、ナイロン膜等に当該核酸試料を
直接固定して、必要によりプレハイブリダイゼーション
した後に標識核酸プローブにより標的配列を検出する固
相法が広く用いられてきた。しかしながら、この方法に
よる場合、担体である前記膜の核酸結合量には限界があ
る。そして、さらに目的とする核酸以外の核酸が多量に
存在する場合には、所望のヌクレオチド鎖とプローブと
のハイブリダイゼーションが妨げられる場合がある。By the way, conventionally, the nucleic acid sample is directly immobilized on a nitrocellulose membrane, nylon membrane or the like while the nucleic acid sample is denatured, pre-hybridized if necessary, and then the target sequence is detected by a labeled nucleic acid probe. Has been widely used. However, according to this method, there is a limit to the amount of nucleic acid bound to the membrane as a carrier. When a large amount of nucleic acid other than the target nucleic acid is present, hybridization between the desired nucleotide chain and the probe may be hindered.
【０００４】かかる固相法の欠点を克服するための一手
段として、ハイブリダイゼーション反応を液相中で行う
所謂液相法が広く紹介されている( 特開昭61-195699 号
公報、同61-274699 号公報、同62-229068 号公報、特開
平1-104200号公報、同1-501339号公報等) 。この液相法
は、目的のヌクレオチド鎖も標識プローブも液相中に溶
解した状態で反応させる液／液反応であり反応速度が速
く、反応性にも優れている。また、さらに担体に捕捉プ
ローブを固定化して核酸試料中の目的とする核酸鎖のみ
を選択的に捕捉する方法も紹介されている( 特開昭60-1
88100 号公報、同60-188397 号公報、同61-264240 号公
報、同62-81564号公報) 。As one means for overcoming the drawbacks of the solid phase method, a so-called liquid phase method in which a hybridization reaction is carried out in a liquid phase has been widely introduced (Japanese Patent Laid-Open Nos. 61-195699 and 61-61). 274699, 62-229068, JP-A-1-104200, 1-501339, etc.). This liquid phase method is a liquid / liquid reaction in which the target nucleotide chain and the labeled probe are reacted in a state of being dissolved in the liquid phase, and the reaction rate is fast and the reactivity is excellent. Further, a method of immobilizing a capture probe on a carrier and selectively capturing only a target nucleic acid chain in a nucleic acid sample has also been introduced (JP-A-60-1).
88100, 60-188397, 61-264240, 62-81564).
【０００５】この液相法に伴う欠点として、核酸試料の
再会合に関する問題がある。すなわち、ハイブリダイゼ
ーション反応の試料となる核酸のうち、DNA は通常二本
鎖状態で安定であり、ハイブリダイゼーション反応に供
するために変性条件下で一本鎖にしても、ハイブリダイ
ゼーション条件下においては当該相補鎖同士が再びアニ
ールして二本鎖を形成し、これが所望するプローブとの
ハイブリダイゼーション反応に競合して検出の感度を低
下させる原因となる。さらに、ロタウイルス(Rotaviru
s) のRNA のように二本鎖で存在するRNA を検出する場
合も上記と同様の再会合の問題が生じる。A drawback associated with this liquid phase method is the problem of reassociation of nucleic acid samples. That is, among nucleic acids used as a sample for a hybridization reaction, DNA is usually stable in a double-stranded state, and even if it is single-stranded under denaturing conditions for use in the hybridization reaction, it is The complementary strands anneal again to form a double strand, which competes with the hybridization reaction with the desired probe and causes a decrease in detection sensitivity. In addition, Rotavirus (Rotaviru
When detecting double-stranded RNA such as the RNA of s), the same reassociation problem as described above occurs.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、主に
液相法におけるハイブリダイゼーション反応において、
上記の核酸試料の再会合の問題を除去した改良核酸検出
法の提供にある。DISCLOSURE OF INVENTION Problems to be Solved by the Invention An object of the present invention is mainly to carry out a hybridization reaction in a liquid phase method.
An object of the present invention is to provide an improved nucleic acid detection method that eliminates the above-mentioned problem of reassociation of nucleic acid samples.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題の
解決手段について鋭意検討した結果、所望のハイブリダ
イゼーション反応に競合するヌクレオチド鎖を当該反応
系から事前に除去して、検出感度を向上させることが可
能であることを見出し本発明を完成した。すなわち、本
願は以下の発明を要旨とするものである。 （１）核酸試料中の標的配列の存在をプローブとの核酸
ハイブリダイゼーション反応の有無により検出する方法
において、当該試料中の核酸を必要により二本鎖から一
本鎖に変性させた後、核酸試料として存在する標的配列
を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的な配列を
有する他方のヌクレオチド鎖が、当該一方のヌクレオチ
ド鎖に対比して実質的に少ないか、又は存在しない条件
下で上記核酸ハイブリダイゼーション反応を行うことを
特徴とする核酸の検出方法。 （２）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された核酸試料中の標的配列の存在をプロー
ブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する方法において、 一方のプライマーをリガンドで標識して、 増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターに増幅
物中のリガンドを吸着させ、 リガンド標識されたプライマー伸長物を除去して、 核酸試料中の標的配列の存在を、プローブとの核酸ハ
イブリダイゼーション反応により検出する（１）記載の
方法。 （３）（１）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去することを特徴とする核酸の検出方法。 （４）（３）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一方のみを分解
するエキソヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解で
あることを特徴とする核酸の検出方法。 （５）（３）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一方のヌクレオ
チド鎖にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性を与え
る手段を施した後、当該二本鎖核酸を当該エキソヌクレ
アーゼで処理して、他方のヌクレオチド鎖を分解して除
去することを特徴とする核酸の検出方法。 （６）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖の増幅
量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に対して低くする
ことを特徴とする、核酸試料中の標的配列の存在をプロ
ーブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により
検出する（１）記載の方法。 （７）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、さら
に一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なプライマーを
基に、当該一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なヌク
レオチド鎖を増幅させた核酸試料中の標的配列の存在を
核酸試料とプローブとのハイブリダイゼーション反応の
有無により検出する（１）記載の方法。 （８）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列を含むヌクレオチド鎖にエキソヌクレアーゼ反応に
対して抵抗性を与える手段を施した後、当該増幅物を当
該エキソヌクレアーゼで処理することを特徴とする
（５）記載の核酸の検出方法。 （９）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列を含まないヌクレオチド鎖を分解して除去する手段
が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレアー
ゼによるヌクレオチド鎖の分解であることを特徴とす
る、（４）記載の核酸の検出方法。 （10）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、 標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片
群のうち、少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を、上
記増幅反応に影響を及ぼさないリガンドで標識して、 当該増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターによっ
てリガンド標識された標的核酸配列と相補的配列を含む
オリゴヌクレオチド連結物を反応系から除去することを
特徴とする核酸の検出方法。 （11）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、標的配列と相補
的な配列を含むヌクレオチド鎖断片の添加量を、これに
対応するヌクレオチド鎖断片群の添加量と比較して相対
的に低くして、当該標的配列と相補的な配列を含むヌク
レオチド鎖断片の連結反応による生成量を低くすること
を特徴とする核酸の検出方法。 （12）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅させ、さらに増
幅された二本鎖断片の一方のヌクレオチド鎖のみに相補
的な塩基配列を有する二組以上のオリゴヌクレオチド断
片群を基に当該一方のヌクレオチド鎖を増幅して、この
当該一方のヌクレオチド鎖以外のヌクレオチド鎖の生成
量を相対的に低くして、試料核酸とプローブとのハイブ
リダイゼーション反応の有無により、核酸試料中に標的
配列が存在するか否かを検出することを特徴とする
（１）記載の核酸の検出方法。 （13）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、一方のヌクレオ
チド鎖の反応系における存在量を実質的に少なくする
か、又は当該ヌクレオチド鎖が存在しない条件にする手
段が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレア
ーゼによる分解であることを特徴とする核酸の検出方
法。 （14）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、一方のヌクレオ
チド鎖を反応系から除去する手段がエキソヌクレアーゼ
による反応であり、かつ反応系からの除去を企図しない
ヌクレオチド鎖の基となるオリゴヌクレオチド断片群の
一部又は全部にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性
を与える手段を施したことを特徴とする核酸の検出方
法。Means for Solving the Problems As a result of extensive studies on the means for solving the above problems, the present inventor removed nucleotide chains competing for a desired hybridization reaction from the reaction system in advance to improve the detection sensitivity. The present invention has been completed based on the finding that it is possible. That is, the subject matter of the present application is the following invention. (1) In a method for detecting the presence of a target sequence in a nucleic acid sample by the presence or absence of a nucleic acid hybridization reaction with a probe, the nucleic acid in the sample is denatured from double-stranded to single-stranded, and then the nucleic acid sample The other nucleotide chain having a complementary sequence to the one nucleotide chain having the target sequence present as A method for detecting a nucleic acid, which comprises performing a hybridization reaction. (2) A target sequence in a nucleic acid sample amplified by a gene amplification method characterized by extending a primer based on a primer having a nucleotide sequence complementary to a nucleotide chain and a complementary sequence to the complementary chain In the presence or absence of a nucleic acid hybridization reaction with a probe, one of the primers is labeled with a ligand to carry out an amplification reaction, and before or after denaturation from double-stranded to single-stranded. , The ligand in the amplified product is adsorbed to the receptor specific to the labeled ligand, the primer extension product labeled with the ligand is removed, and the presence of the target sequence in the nucleic acid sample is detected by the nucleic acid hybridization reaction with the probe. The method according to (1). (3) The method for detecting a nucleic acid according to (1), characterized in that the other nucleotide chain having a sequence complementary to one nucleotide chain having a target sequence present as a nucleic acid sample is decomposed and removed. A method for detecting nucleic acid. (4) In the method for detecting a nucleic acid according to (3), there is provided a means for decomposing and removing the other nucleotide chain having a sequence complementary to one nucleotide chain having a target sequence existing as a nucleic acid sample. A method for detecting a nucleic acid, which comprises degrading a nucleotide chain by an exonuclease that degrades only one of the double-stranded nucleic acids. (5) In the method for detecting a nucleic acid according to (3), there is provided a means for decomposing and removing the other nucleotide chain having a sequence complementary to one nucleotide chain having a target sequence present as a nucleic acid sample. A method for imparting resistance to an exonuclease reaction to one nucleotide chain of a double-stranded nucleic acid, treating the double-stranded nucleic acid with the exonuclease, and decomposing and removing the other nucleotide chain A method for detecting a nucleic acid, which comprises: (6) Based on a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide chain and its complementary strand, the primer is extended, and the two types of nucleotide chains amplified by the gene amplification method are characterized. Among them, the amount of amplification of a nucleotide chain having a base sequence complementary to the target sequence is lower than that of the nucleotide chain containing the target sequence. The method according to (1), wherein the detection is performed depending on the presence or absence of a hybridization reaction. (7) Based on a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide chain and a complementary sequence to the complementary chain, the primer is extended, and the two types of nucleotide chains amplified by the gene amplification method are characterized. Among them, based on a primer complementary to one of the nucleotide chains, the presence of the target sequence in the nucleic acid sample obtained by amplifying the nucleotide chain complementary to the one of the nucleotide chains is compared between the nucleic acid sample and the probe. The method according to (1), wherein the detection is performed depending on the presence or absence of a hybridization reaction. (8) Two types of nucleotide chains amplified by a gene amplification method characterized by extending a primer based on a primer having a nucleotide sequence complementary respectively to the nucleotide chain and its complementary strand. Among them, the method for detecting a nucleic acid according to (5), characterized in that the amplification product is treated with the exonuclease after the means for imparting resistance to the exonuclease reaction to the nucleotide chain containing the target sequence. (9) Based on a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide chain and a complementary sequence to the complementary strand, the primer is extended, and the two types of nucleotide chains amplified by the gene amplification method are characterized. Among them, the means for decomposing and removing the nucleotide chain not containing the target sequence is the decomposition of the nucleotide chain by an exonuclease that decomposes only one of the double-stranded nucleic acids, wherein the nucleic acid according to (4) Detection method. (10) After hybridizing to a corresponding nucleotide chain two or more sets of oligonucleotide fragments that are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and that are adjacent to each nucleotide chain in the annealed state Detecting whether a target sequence is present in a nucleic acid sample amplified by a gene amplification method characterized by ligating the oligonucleotide chain fragments to each other by detecting the presence or absence of a hybridization reaction between a sample nucleic acid and a probe. In the method for detecting a nucleic acid according to (1) above, at least one nucleotide chain fragment in the group of nucleotide chain fragments having a sequence complementary to the target sequence is labeled with a ligand that does not affect the amplification reaction, The amplification reaction was performed and labeled before or after denaturation from double-stranded to single-stranded. Detection methods of nucleic acid, characterized in that the removal of oligonucleotide ligation comprising the complementary sequence to the target nucleic acid sequence which is the ligand labeled by a specific receptor ligand from the reaction system. (11) After hybridizing to a corresponding nucleotide chain two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and which are adjacent to each nucleotide chain in the annealed state Detecting whether a target sequence is present in a nucleic acid sample amplified by a gene amplification method characterized by ligating the oligonucleotide chain fragments to each other by detecting the presence or absence of a hybridization reaction between a sample nucleic acid and a probe. In the method for detecting a nucleic acid according to (1), the addition amount of the nucleotide chain fragment containing a sequence complementary to the target sequence is made relatively lower than the addition amount of the corresponding nucleotide chain fragment group. , A nucleic acid characterized by lowering the amount produced by a ligation reaction of a nucleotide chain fragment containing a sequence complementary to the target sequence. Way out. (12) After hybridizing two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and which are adjacent to the respective nucleotide chains and annealed to the corresponding nucleotide chains , Two or more sets of oligonucleotides each having a base sequence complementary to only one nucleotide chain of a double-stranded fragment amplified by a method for amplifying a gene characterized by ligating the oligonucleotide chain fragments together. Amplifying the one nucleotide chain based on the nucleotide fragment group, the production amount of the nucleotide chain other than the one nucleotide chain is relatively low, depending on the presence or absence of the hybridization reaction between the sample nucleic acid and the probe, Detection of nucleic acid according to (1), which comprises detecting whether or not the target sequence is present in the nucleic acid sample Law. (13) After hybridizing two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide strands and their complementary strands and which are adjacent to the respective nucleotide strands and annealed to the corresponding nucleotide strands Detecting whether a target sequence is present in a nucleic acid sample amplified by a gene amplification method characterized by ligating the oligonucleotide chain fragments to each other by detecting the presence or absence of a hybridization reaction between a sample nucleic acid and a probe. In the method for detecting a nucleic acid according to (1), the means for substantially reducing the amount of one of the nucleotide chains present in the reaction system or for setting the condition in which the nucleotide chain does not exist is only one of the double-stranded nucleic acids. A method for detecting a nucleic acid, characterized in that it is a decomposition by an exonuclease that decomposes the enzyme. (14) After hybridizing to a corresponding nucleotide chain two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and which are annealed to the respective nucleotide chains and which are adjacent to each other Detecting whether or not a target sequence is present in a nucleic acid sample amplified by a gene amplification method characterized by ligating the oligonucleotide chain fragments to each other, by detecting the presence or absence of a hybridization reaction between a sample nucleic acid and a probe. In the method for detecting a nucleic acid according to (1) above, the means for removing one of the nucleotide chains from the reaction system is a reaction with an exonuclease, and an oligonucleotide fragment group serving as a group of nucleotide chains not intended to be removed from the reaction system Some or all of them are provided with a means to make them resistant to the exonuclease reaction. Detection methods of nucleic acid, characterized in that.
【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。 Ａ．本発明は核酸試料中の標的配列の存在をプローブと
の核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検出す
る方法において適用される。上記において、「核酸試
料」とは主にDNA のことを意味するものである。しかし
ながら、例えば前記のロタウイルスのように通常的に二
本鎖で存在するRNA の検出を企図する場合は、当該二本
鎖RNA を本発明における「核酸試料」として扱うことを
妨げるものではない。また、ここにいうDNA の種類は特
に限定されるものではなく、Genomic DNA とcDNAとにか
かわらず適用することができる。さらに、核由来のDNA
に限定されるものではなく、例えばミトコンドリアに由
来するDNA 、原核生物のDNA 、ウイルスのDNA 等にも適
用することができる。The present invention will be described in detail below. A. The present invention is applied in a method of detecting the presence of a target sequence in a nucleic acid sample by the presence or absence of a nucleic acid hybridization reaction with a probe. In the above, the “nucleic acid sample” mainly means DNA. However, when the detection of RNA that normally exists in a double-stranded form such as the rotavirus described above is intended, it does not prevent the double-stranded RNA from being treated as the “nucleic acid sample” in the present invention. The type of DNA mentioned here is not particularly limited, and it can be applied regardless of genomic DNA and cDNA. In addition, nuclear DNA
However, the present invention can be applied to, for example, mitochondrial DNA, prokaryotic DNA, viral DNA and the like.
【０００９】また、「プローブ」とは一本鎖核酸と相補
的な配列を有し、当該一本鎖核酸とハイブリダイズが可
能なDNA 若しくはRNA のヌクレオチド鎖のことをいい、
当該ハイブリダイズ反応が生じたか否かを識別するため
の標識が施されている。かかる標識は本発明においては
特に限定されるものではなく、通常公知の標識法によっ
て標識された上記ヌクレオチド鎖をハイブリダイズ反応
の有無の識別のために用いることができる。例えば、
3H、125I、32P 等の放射性同位元素による標識ヌクレオ
チド鎖や酵素、蛍光物質、発光物質、若しくはこれらを
含有する不溶性物質であるポリスチレンやアガロースゲ
ル等、各種の抗原やハプテン、ビオチン等による標識ヌ
クレオチド鎖をプローブとして用いることができる。な
お、ここに「相補的」とは、必ずしも当該ヌクレオチド
鎖の全ての塩基同士がアニール可能であることを必須と
することを意味するものではない。すなわち、ある反応
条件で非特異的なハイブリダイゼーション反応と標的核
酸とのハイブリダイゼーション反応を区別することがで
きる程度に相補的であることを意味する。The term "probe" refers to a nucleotide chain of DNA or RNA having a sequence complementary to a single-stranded nucleic acid and capable of hybridizing with the single-stranded nucleic acid,
A label is provided to identify whether or not the hybridization reaction has occurred. Such a label is not particularly limited in the present invention, and the above-mentioned nucleotide chain labeled by a commonly known labeling method can be used for identifying the presence or absence of a hybridization reaction. For example,
Labeled with radioisotopes such as 3 H, 125 I, 32 P, nucleotides, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, or insoluble substances containing these, such as polystyrene and agarose gel, various antigens, haptens, biotin, etc. Labeled nucleotide chains can be used as probes. The term "complementary" does not necessarily mean that all the bases of the nucleotide chain are capable of being annealed. That is, it means that they are complementary to the extent that a nonspecific hybridization reaction and a hybridization reaction with a target nucleic acid can be distinguished under certain reaction conditions.
【００１０】ここにいう核酸ハイブリダイゼーション反
応は、主に液相法による核酸ハイブリダイゼーション反
応を意味する。なお、この液相法による核酸ハイブリダ
イゼーションには、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等
の担体に捕捉プローブを固定して、当該捕捉プローブに
よって標的配列を有する核酸鎖を捕捉する方法（特開昭
60-188100 号公報、同60-188397 号公報、同61-264240
号公報、同62-81564号公報) も含まれる。The nucleic acid hybridization reaction here mainly means a nucleic acid hybridization reaction by a liquid phase method. For nucleic acid hybridization by the liquid phase method, a method of capturing a nucleic acid chain having a target sequence with the capture probe by immobilizing the capture probe on a carrier such as a nitrocellulose membrane or a nylon membrane (Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. Sho.
60-188100, 60-188397, 61-264240
No. 62-81564).
【００１１】また、この核酸ハイブリダイゼーション反
応を行う前に、標的配列を含むと考えられる遺伝子を予
め増幅させることができる。当該遺伝子増幅方法の代表
的態様の一つとして、ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対
してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基
にして、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とす
る遺伝子の増幅方法を挙げることができる。Further, before carrying out this nucleic acid hybridization reaction, a gene suspected of containing the target sequence can be amplified in advance. As one of the typical embodiments of the gene amplification method, a method for amplifying a gene, characterized in that the primer is extended based on a primer having a nucleotide sequence complementary to a nucleotide chain and a complementary base sequence to the complementary chain, respectively. Can be mentioned.
【００１２】かかる一の遺伝子増幅方法は、所謂PCR 法
として既に公知である( 特開昭62-281号公報) 。さら
に、他の上記遺伝子増幅方法の代表的態様の一つとし
て、ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補
的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニールし
た状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片群
を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた後、
当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させることを
特徴とする遺伝子の増幅方法を挙げることができる。One such gene amplification method is already known as a so-called PCR method (Japanese Patent Laid-Open No. 62-281). Furthermore, as one of other typical aspects of the above-mentioned gene amplification method, two or more sets of oligo-nucleotides which are complementary to each of the nucleotide chain and its complementary chain and which are adjacent to each nucleotide chain in an annealed state After hybridizing the nucleotide fragments to the corresponding nucleotide chains,
A method for amplifying a gene is characterized in that the oligonucleotide chain fragments are ligated to each other.
【００１３】かかる他の遺伝子増幅方法は、所謂LCR 法
として公知である( 特開平2-2934号公報、同2-23899 号
公報) 。なお、上記二種類の遺伝子増幅方法の態様をハ
イブリダイゼーション反応に応用することによって、
「核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌク
レオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌクレ
オチド鎖が、当該一方のヌクレオチド鎖に対比して実質
的に少ないか、又は存在しない条件下で上記核酸ハイブ
リダイゼーション反応を行う」という本発明の必須要件
を好適に満足させることが可能である。かかる点につい
ては後述する。 Ｂ．試料中の核酸を必要により二本鎖から一本鎖に変性
させた後に適用される方法である。Such another gene amplification method is known as a so-called LCR method (Japanese Patent Laid-Open Nos. 2-2934 and 2-23899). In addition, by applying the above two types of gene amplification methods to a hybridization reaction,
"Under the condition where the other nucleotide chain having a sequence complementary to the one nucleotide chain having the target sequence present as the nucleic acid sample is substantially less than the one nucleotide chain or does not exist" It is possible to preferably satisfy the essential requirement of the present invention "to perform the nucleic acid hybridization reaction". This point will be described later. B. This is a method applied after denaturing the nucleic acid in the sample from double-stranded to single-stranded if necessary.
【００１４】ここで、核酸試料を二本鎖から一本鎖にす
る変性の条件としては、例えば二本鎖DNA を熱変性させ
る場合には、80〜105 ℃で１〜20分間処理を行う。アル
カリ変性を行う場合には、0.2 〜１規定のNaOHの存在下
で１〜30分間処理して等量のHCl で中和する。酸変性を
行う場合には、例えば0.01〜１規定のHCl の存在下で１
〜30分間処理し、等量のNaOHで中和する。この他の方法
として、酵素的にヌクレオチド鎖の分解を行うこともで
きる。また、二本鎖RNA を変性させる場合には、熱若し
くは酸による変性手段を用いるのが好ましい。The conditions for denaturing the nucleic acid sample from double-stranded to single-stranded are, for example, when the double-stranded DNA is heat-denatured, the treatment is performed at 80 to 105 ° C. for 1 to 20 minutes. When alkali denaturation is carried out, it is treated in the presence of 0.2 to 1 N NaOH for 1 to 30 minutes and neutralized with an equal amount of HCl. When acid denaturation is performed, for example, in the presence of 0.01 to 1N HCl, 1
Treat for ~ 30 minutes and neutralize with an equal volume of NaOH. As another method, the nucleotide chain can be decomposed enzymatically. When denaturing the double-stranded RNA, it is preferable to use a denaturing means using heat or acid.
【００１５】なお、上記の酸若しくはアルカリによる変
性を行った後に、必ずしも変性系の中和を行う必要はな
い。「必要により」とは、核酸試料が常に二本鎖の状態
にあるとは限らないことを考慮するものである。すなわ
ち、核酸試料が当初より一本鎖の場合には、前記変性を
行う必要はない。 Ｃ．核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖が、当該一方のヌクレオチド鎖に対比して実
質的に少ないか、又は存在しない条件下で上記核酸ハイ
ブリダイゼーション反応を行うことを特徴とする核酸の
検出方法である。It is not always necessary to neutralize the modified system after the modification with the acid or alkali. “By necessity” takes into consideration that the nucleic acid sample is not always in a double-stranded state. That is, when the nucleic acid sample is single-stranded from the beginning, it is not necessary to perform the denaturation. C. The other nucleotide chain having a sequence complementary to the one nucleotide chain having the target sequence present as the nucleic acid sample is substantially less than the one nucleotide chain, or is not present under the conditions described above. A method for detecting a nucleic acid, which comprises performing a nucleic acid hybridization reaction.
【００１６】かかる核酸ハイブリダイゼーション反応系
において、ヌクレオチド鎖を実質的に少ないか、又は存
在しない条件にする手法としては、例えば以下の手法を
挙げることができる。ただし、これらの列挙した手法に
よって本発明の範囲が限定されるものではない。 (a) 核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去する。In such a nucleic acid hybridization reaction system, the following method can be mentioned as a method for making the condition that the number of nucleotide chains is substantially small or absent. However, the scope of the present invention is not limited by these listed methods. (a) Decompose and remove the other nucleotide chain having a sequence complementary to one nucleotide chain having the target sequence present as a nucleic acid sample.
【００１７】かかる分解・除去の手段としては、例えば
二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレアーゼに
よるヌクレオチド鎖の分解反応を挙げることができる。
このエキソヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解
は、ヌクレオチド鎖の5'末端からの分解であると、同3'
末端からの分解であるとを問わず試料となる二本鎖核酸
の両端から開始する。そして二本鎖の一方の鎖を分解
し、一本鎖となった時点で反応が停止するように条件を
設定するのが好ましい。なお、この場合用いるエキソヌ
クレアーゼ量は、所望のヌクレオチド鎖の分解反応が進
行する限りにおいて最小限度に止めるのが、経済的観点
からも、副反応の惹起を可能な限り防止するという観点
からも好ましい。またこの場合、標的とする核酸配列が
エキソヌクレアーゼにより分解されないように、標的と
する塩基配列からエキソヌクレアーゼにより分解される
側に十分な長さの核酸鎖長を持たせることで、「核酸試
料として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド
鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖
のみを分解して除去する」という所期の目的を達成する
ことができる。Examples of such decomposition / removal means include a nucleotide chain decomposition reaction by an exonuclease which decomposes only one of double-stranded nucleic acids.
Degradation of the nucleotide chain by this exonuclease is the same as that of the 3 '
It starts from both ends of the sample double-stranded nucleic acid regardless of whether the degradation is from the end. It is preferable to set conditions so that one of the double strands is decomposed and the reaction is stopped when the single strand is formed. The amount of exonuclease used in this case is preferably minimized as long as the decomposition reaction of the desired nucleotide chain proceeds, which is preferable from the economical viewpoint as well as from the viewpoint of preventing the initiation of side reactions as much as possible. . In this case, in order to prevent the target nucleic acid sequence from being decomposed by exonuclease, the nucleic acid chain having a sufficient length on the side to be decomposed by exonuclease from the target base sequence has a "nucleic acid sample". It is possible to achieve the intended purpose of decomposing and removing only the other nucleotide chain having the sequence complementary to the one nucleotide chain having the existing target sequence.
【００１８】このような目的を達成するためのエキソヌ
クレアーゼとしては、例えばエキソヌクレアーゼIII、B
a131 ヌクレアーゼ、λエキソヌクレアーゼ、T7ジーン
６エキソヌクレアーゼ等を挙げることができる。これら
のエキソヌクレアーゼのうち、T7ジーン６エキソヌクレ
アーゼは一本鎖を分解する副反応が起こらないという点
で好ましい。Examples of exonucleases for achieving such an object include exonuclease III and B
Examples include a131 nuclease, λ exonuclease, T7 gene 6 exonuclease and the like. Among these exonucleases, T7 gene 6 exonuclease is preferable because it does not cause a side reaction that decomposes single strands.
【００１９】ここで、「標的とする塩基配列からエキソ
ヌクレアーゼにより分解される側に十分な長さの核酸鎖
長」は、一般に特異的な配列を認識するためには15mer
の鎖長が必要であり、その長さの標的核酸を残存させる
には少なくとも検出を企図するヌクレオチド鎖と相補的
な関係を有するヌクレオチド鎖において、エキソヌクレ
アーゼが分解を開始する末端から標的配列に対して相補
的な関係を有する配列の前端までの核酸鎖長よりも15me
r 以上長いことが必要であり、100mer以上の鎖長を有す
ることが、エキソヌクレアーゼにより相補鎖が確実に分
解され、かつ標的配列が確実に残存するという点で好ま
しい。さらに、当該鎖長の上限は特に限定されないが、
分解に要するエキソヌクレアーゼ量を可能な限り少なく
するという点、及び反応時間の短縮を図るという点にお
いて、500mer程度以上は長くならないように設定するの
が好ましい。Here, the "nucleic acid chain length of a sufficient length on the side of the target nucleotide sequence to be decomposed by exonuclease" is generally 15 mer in order to recognize a specific sequence.
Chain length is required, and in order to leave the target nucleic acid of that length at least in the nucleotide chain having a complementary relationship with the nucleotide chain intended to be detected, the exonuclease starts degrading from the end to the target sequence. 15 me more than the length of the nucleic acid chain up to the front end of the complementary sequence
It is necessary that the length is r or more, and that the chain length is 100 mer or more is preferable in that the complementary chain is surely decomposed by the exonuclease and the target sequence surely remains. Further, the upper limit of the chain length is not particularly limited,
From the viewpoint of reducing the amount of exonuclease required for decomposition as much as possible and shortening the reaction time, it is preferable to set the length not to be longer than about 500 mer.
【００２０】例えば上記の設定に従って、前記PCR 法に
おける遺伝子増幅用のプライマーを調製して、これによ
り所望の二本鎖DNA を増幅・調製することができる。さ
らに前記LCR 法においては、ヌクレオチド鎖とその相補
鎖のそれぞれの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌク
レオチド鎖とアニールした状態で隣接する二組以上のオ
リゴヌクレオチド断片群を上記の設定に準じて用いるこ
とで所望の二本鎖DNAを増幅・調製することができる。
なお、上記の分解・除去手段はPCR 法とLCR 法に対して
のみ用いられる手段ではなく、他の遺伝子増幅方法、例
えば、特開平2-5864号公報、同2-268683号公報、同2-50
0565号公報、同2-501532号公報、同4-131099号公報、同
4-500759号公報、又は同4-501057号公報記載の方法に対
しても適用することができる。For example, according to the above-mentioned settings, a primer for gene amplification in the PCR method can be prepared, and thereby a desired double-stranded DNA can be amplified and prepared. Furthermore, in the above LCR method, two or more sets of oligonucleotide fragments that are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and that are adjacent to each nucleotide chain in the annealed state according to the above setting By using it, desired double-stranded DNA can be amplified and prepared.
The above-mentioned decomposition / removal means is not only used for the PCR method and the LCR method, but other gene amplification methods such as JP-A Nos. 2-5864, 2-268683 and 2-268683. 50
0565 publication, 2-501532 publication, 4-131099 publication,
It can also be applied to the method described in 4-500759 or 4-501057.
【００２１】さらにエキソヌクレアーゼの分解の形式、
すなわち3'末端からの分解であると5'末端からの分解で
あるとによらずに、二本鎖核酸の一方のヌクレオチド鎖
にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性を与える手段
を施した後、当該二本鎖核酸を当該エキソヌクレアーゼ
で処理することで、前記の「核酸試料として存在する標
的配列を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的な
配列を有する他方のヌクレオチド鎖のみを分解して除去
する」という所期の目的を達成することができる。Furthermore, the form of exonuclease degradation,
That is, regardless of whether it is the decomposition from the 3'end or the 5'end, after applying a means for imparting resistance to the exonuclease reaction on one nucleotide chain of the double-stranded nucleic acid, By treating the double-stranded nucleic acid with the exonuclease, only the other nucleotide chain having a sequence complementary to the one nucleotide chain having the target sequence existing as the nucleic acid sample is decomposed and removed. The intended purpose of "doing" can be achieved.
【００２２】ここで、二本鎖核酸の両方の鎖を同一方向
に分解するエキソヌクレアーゼとしては、例えばエキソ
ヌクレアーゼIII、Ba131 ヌクレアーゼ、λエキソヌク
レアーゼ、T7ジーン６エキソヌクレアーゼ等を挙げるこ
とができる。また、「エキソヌクレアーゼ反応に対して
抵抗性を与える手段」としては、例えばヌクレオチド鎖
中の塩基、糖、又はリン酸部分の修飾を挙げることがで
きる。かかる修飾は核酸試料として存在する標的配列の
増幅が行われる際、又は核酸ハイブリダイゼーションに
よる検出を行う際に、これらの反応の進行に障害を与え
たり検出の感度を低下させずに、エキソヌクレアーゼに
よる分解反応に対する抵抗性を所望のヌクレオチド鎖に
付与することができる限りにおいて限定されるものでは
ない。例えば、炭素数が１〜４のアルキルホスフェート
基、ホスホロチオエート基、メチルチオホスフェート基
等のリン酸結合部位修飾体；デオキシリボースの3'又は
5'部分に対して内位添加剤であるメチルチオホスフェー
ト、カルボジイミド、N-ヒドロキシベンジルトリアゾー
ル等を反応させて結合させた糖修飾体; 又は3',2'-ジデ
オキシ化した糖修飾体を挙げることができる。また、核
酸塩基を直接修飾して上記抵抗性を与えることができ
る。さらに、試料核酸をα構造DNA にしたり、アクリジ
ニウム等のインターカレーターを核酸試料に結合させて
上記抵抗性を当該核酸試料に与えることもできる。これ
らの修飾法は、修飾体の性質、修飾を企図する対象とな
る核酸の種類と形態及び／又は修飾を企図する時期に応
じた方法を選択することができる。なお、当該修飾の時
期は遺伝子増幅法に用いられるプライマー等のヌクレオ
チド鎖の合成の際であってもよいし、その合成後であっ
てもよい。さらに、増幅反応の後にヌクレオチド鎖を分
解・除去する手段を施す場合には、当該増幅反応の後で
あってもよい。Here, examples of the exonuclease that decomposes both strands of the double-stranded nucleic acid in the same direction include exonuclease III, Ba131 nuclease, λ exonuclease, and T7 gene 6 exonuclease. In addition, examples of the "means for imparting resistance to exonuclease reaction" include modification of the base, sugar, or phosphate moiety in the nucleotide chain. Such modification does not impair the progress of these reactions or decrease the sensitivity of detection when amplification of a target sequence existing as a nucleic acid sample is performed or when detection by nucleic acid hybridization is performed, and It is not limited as long as it can impart resistance to a decomposition reaction to a desired nucleotide chain. For example, a phosphoric acid binding site modification product such as an alkyl phosphate group having 1 to 4 carbon atoms, a phosphorothioate group, a methylthiophosphate group; 3'of deoxyribose or
A sugar-modified product obtained by reacting 5'moiety with methylthiophosphate, carbodiimide, N-hydroxybenzyltriazole, etc., which are internal additives, and bound thereto; or a 3 ', 2'-dideoxylated sugar-modified product You can In addition, the resistance can be imparted by directly modifying the nucleobase. Furthermore, the sample nucleic acid may be α-structured DNA, or an intercalator such as acridinium may be bound to the nucleic acid sample to impart the above resistance to the nucleic acid sample. These modification methods can be selected depending on the nature of the modified product, the type and form of the nucleic acid targeted for modification, and / or the timing at which modification is intended. The timing of the modification may be during the synthesis of a nucleotide chain such as a primer used in the gene amplification method, or after the synthesis. Further, when a means for decomposing / removing the nucleotide chain is provided after the amplification reaction, it may be after the amplification reaction.
【００２３】なお、核酸ハイブリダイゼーション反応の
前提として増幅反応を行わない場合には、例えば核酸試
料の特定の塩基配列に着目して当該箇所をII型の制限酵
素で切断した後、そこに直接修飾体を導入する方法；若
しくは修飾体を既に導入した合成リンカーを当該切断箇
所に導入する方法等を採ることができる。 (b) 核酸ハイブリダイズ反応の前提として、遺伝子の増
幅反応を行う場合においては、以下の手段を挙げること
ができる。When the amplification reaction is not performed as a precondition for the nucleic acid hybridization reaction, for example, focusing on a specific base sequence of a nucleic acid sample, the site is cleaved with a type II restriction enzyme and then directly modified. The method of introducing the body; or the method of introducing the synthetic linker into which the modified compound has already been introduced into the cleavage site can be employed. (b) In the case of carrying out a gene amplification reaction as a premise of a nucleic acid hybridization reaction, the following means can be mentioned.
【００２４】(i) ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対して
それぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された核酸試料中の標的配列の存
在をプローブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有
無により検出する方法において、 一方のプライマーをリガンドで標識して、 増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターに増幅
物中のリガンドを吸着させ、 リガンド標識されたプライマー伸長物を除去する方
法。(I) In a nucleic acid sample amplified by a gene amplification method characterized by extending a primer based on a primer having a nucleotide sequence complementary to a nucleotide chain and a complementary sequence to the complementary chain, respectively. In the method for detecting the presence of the target sequence of the nucleic acid by the presence or absence of the nucleic acid hybridization reaction with the probe, one primer is labeled with a ligand and an amplification reaction is performed before denaturation from double-stranded to single-stranded or denaturation. Then, the ligand in the amplified product is adsorbed to a receptor specific to the labeled ligand, and the primer extension product labeled with the ligand is removed.
【００２５】ここにいう遺伝子の増幅方法として代表的
なものに、前記PCR 法を挙げることができる。一方のプ
ライマーを標識する標識リガンドとしては、プライマー
としての機能を喪失しない程度に低分子で、かつ増幅反
応の進行に悪影響を与えない物質を選択する必要があ
る。かかるリガンドの標識は、当該リガンドの種類、標
識対象に応じた通常公知の方法で実行することができ
る。例えば、核酸を標識する場合には、特公平3-59914
号公報、同3-74239 号公報記載の方法に従い、プライマ
ー核酸にアミノ基を導入した後、NHS ビオチンと反応さ
せることで達成できる。なお、このプライマー核酸のア
ミノ基には、上記ビオチンの他、蛍光物質、発光物質、
ハプテン等を結合させることも容易にできる。かかる場
合、必要によりカルボジイミド等の架橋剤を用いること
ができる( 蛋白質・核酸・酵素・別冊31,p37(1987)) 。The PCR method can be mentioned as a typical method for amplifying a gene here. As the labeling ligand for labeling one of the primers, it is necessary to select a substance having a low molecular weight to the extent that the function as a primer is not lost and that does not adversely affect the progress of the amplification reaction. Labeling of such a ligand can be carried out by a generally known method depending on the type of the ligand and the labeling target. For example, in the case of labeling nucleic acid, Japanese Patent Publication No. 3-59914
This can be achieved by introducing an amino group into the primer nucleic acid and then reacting with NHS biotin according to the method described in JP-A No. 3-74239. In addition to the above biotin, the amino group of this primer nucleic acid contains a fluorescent substance, a luminescent substance,
It is also possible to easily bond a hapten or the like. In such a case, a crosslinking agent such as carbodiimide can be used if necessary (protein, nucleic acid, enzyme, separate volume 31, p37 (1987)).
【００２６】増幅反応は、選択する遺伝子増幅法の種類
に対応した反応を行う。例えば、PCR 法の場合には、耐
熱性DNA ポリメラーゼの存在下で複数回の熱サイクルを
繰り返して遺伝子の増幅を行う( 特開昭62-281号公報)
。核酸を二本鎖から一本鎖に変性させる手段として
は、前記の熱変性、アルカリ変性、酸変性等の変性手段
を用いることができる。The amplification reaction is a reaction corresponding to the type of gene amplification method selected. For example, in the case of the PCR method, a gene is amplified by repeating a plurality of thermal cycles in the presence of a thermostable DNA polymerase (Japanese Patent Laid-Open No. 62-281).
. As the means for denaturing the nucleic acid from double-stranded to single-stranded, the above-mentioned denaturing means such as heat denaturation, alkali denaturation, acid denaturation and the like can be used.
【００２７】リガンドに特異的なレセプターは、リガン
ドの種類によって異なる。例えばリガンドとしてホルモ
ン、例えばテストステロン、コルチゾール等のステロイ
ドホルモンやアセチルコリン等を用いる場合には、当該
ホルモンのレセプターや当該ホルモンに対する抗体を；
リガンドとしてジゴキシゲニンやジニトロフェノール等
のハプテンに対しては、それに対応する特異抗体を；リ
ガンドとして糖を用いる場合にはその特異的レクチン
を、例えばグルコースとコンナカバリンＡ、ガラクトー
スとアグルチニン等をレセプターとして用いることがで
きる。また、化学反応性物質としてソラレン、アクリジ
ン染料類、フェナントリジン類、フェナジン類、フロク
マリン類、フェノチアジン類、キノリン類等の光反応性
物質をリガンドとしておき、担体のカルボキシ基、アミ
ノ基、水酸基等と光照射によって反応・結合させること
もできる。さらにビオチンをリガンドとして、アビジン
若しくはストレプトアビジンをレセプターとして用いる
こともできる。なお、このビオチン−アビジン系は、ア
ルカリによる変性条件下でもリガンド−レセプター反応
を生じ得るという点で好ましい態様として挙げることが
できる。Receptors specific for ligands differ depending on the type of ligand. For example, when a hormone such as a steroid hormone such as testosterone or cortisol or acetylcholine is used as a ligand, a receptor for the hormone or an antibody against the hormone is used;
For haptens such as digoxigenin and dinitrophenol as ligands, use a specific antibody corresponding to them; if sugar is used as the ligand, use the specific lectin, for example, glucose and connakavalin A, galactose and agglutinin, etc. as receptors. You can Further, as a chemically reactive substance, a photoreactive substance such as psoralen, acridine dyes, phenanthridine, phenazine, furocumarine, phenothiazine, and quinoline is used as a ligand, and a carboxy group, an amino group, a hydroxyl group of a carrier, etc. It is also possible to react and combine by light irradiation. Further, biotin can be used as a ligand and avidin or streptavidin can be used as a receptor. The biotin-avidin system can be mentioned as a preferred embodiment in that it can cause a ligand-receptor reaction even under denaturing conditions with alkali.
【００２８】なお、前記レセプターは通常担体に結合さ
せて用いるものである。かかる結合担体としては、例え
ばナイロン膜、ニトロセルロース膜等の膜；ポリスチレ
ンラテックス、アガロース粒子、ポリアクリルアミド粒
子等の微粒子；マイクロプレート、試験管等を用いるこ
とができる。なおレセプターと担体をレセプターの性質
に応じた公知の物理的方法で結合させて、当該結合担体
を調製することができる。なお、イムノダイン（日本ボ
ール社製）、イモビロンP(ミリポア社製) 等、市販の吸
着担体膜をそのまま本発明に対して用いることができ
る。また、上記微粒子を用いる場合には、反応液中に当
該微粒子を添加し処理を行うことも、当該微粒子をカラ
ムに充填してこのカラムに反応液を通すことによって処
理することも可能である。このような微粒子を用いた結
合担体としては、例えばストレプトアビジンを結合した
ポリスチレンラテックス磁性ビーズ（ダイナール社製）
を挙げることができる。マイクロプレート又は試験管を
用いる場合は、これらの素材の物理的若しくは化学的性
質並びにレセプターの当該性質に応じた方法で結合担体
を用いることができる。なお、上記のいずれの結合担体
においても、核酸試料の捕捉の際の立体障害を防ぐため
に、必要に応じてスペーサーを介在させることができ
る。さらに、担体のカルボキシル基、アミノ基、水酸基
その他の官能基を適切な条件下でレセプターに共有結合
させることも可能である。例えば、アミノ基同士をグル
タルアルデヒドで架橋する方法や、カルボジイミドによ
るカルボキシル基とアミノ基の結合を行う方法を挙げる
こともできる( 蛋白質・核酸・酵素・別冊31,p46(198
7)) 。The receptor is usually used by being bound to a carrier. As such a binding carrier, for example, a membrane such as a nylon membrane or a nitrocellulose membrane; fine particles such as polystyrene latex, agarose particles, polyacrylamide particles; a microplate, a test tube or the like can be used. The binding carrier can be prepared by binding the receptor and the carrier by a known physical method depending on the properties of the receptor. In addition, commercially available adsorption carrier membranes such as Immunodyne (manufactured by Nippon Ball Co., Ltd.) and Immobilon P (manufactured by Millipore) can be used as they are for the present invention. When the above-mentioned fine particles are used, it is possible to add the fine particles to the reaction solution for treatment, or to fill the column with the fine particles and pass the reaction solution through the column. As the binding carrier using such fine particles, for example, polystyrene latex magnetic beads to which streptavidin is bound (manufactured by Dynal)
Can be mentioned. When using a microplate or a test tube, the binding carrier can be used by a method depending on the physical or chemical properties of these materials and the properties of the receptor. In addition, in any of the above-mentioned binding carriers, a spacer can be interposed, if necessary, in order to prevent steric hindrance when capturing the nucleic acid sample. Furthermore, it is also possible to covalently bond the carboxyl group, amino group, hydroxyl group and other functional groups of the carrier to the receptor under appropriate conditions. For example, a method of cross-linking amino groups with glutaraldehyde, or a method of binding a carboxyl group and an amino group with carbodiimide can be mentioned (protein, nucleic acid, enzyme, separate volume 31, p46 (198).
7)).
【００２９】上記の結合担体にリガンドで標識された遺
伝子増幅物を特異的に結合させ、次いで当該結合担体を
反応系から除去することによって所望する核酸ハイブリ
ダイゼーション条件を設定することができる。 (ii)ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補
的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニールし
た状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片群
を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた後、
当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させることを
特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料中に
標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブとの
ハイブリダイゼーション反応の有無により検出する核酸
の検出方法において、 標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片
群のうち、少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を、上
記増幅反応に影響を及ぼさないリガンドで標識して、 当該増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターによっ
てリガンド標識された標的核酸配列と相補的配列を含む
オリゴヌクレオチド連結物を反応系から除去する方法。A desired nucleic acid hybridization condition can be set by specifically binding a gene-amplified product labeled with a ligand to the above-mentioned binding carrier and then removing the binding carrier from the reaction system. (ii) after hybridizing to the corresponding nucleotide chain two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands, and which are adjacent to each nucleotide chain in the annealed state ,
Whether or not the target sequence is present in the nucleic acid sample amplified by the gene amplification method characterized by ligating the oligonucleotide chain fragments to each other is detected by the presence or absence of the hybridization reaction between the sample nucleic acid and the probe. In the method for detecting a nucleic acid, at least one nucleotide chain fragment in a group of nucleotide chain fragments having a sequence complementary to a target sequence is labeled with a ligand that does not affect the amplification reaction, and the amplification reaction is performed. Before or after denaturation from double-stranded to single-stranded, remove the oligonucleotide ligation containing the target nucleic acid sequence complementary to the ligand-labeled target nucleic acid sequence by the receptor specific for the labeled ligand from the reaction system. Method.
【００３０】ここにいう遺伝子の増幅方法として代表的
なものに、前記LCR 法を挙げることができる。標的配列
と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片群のうち、
少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を上記増幅反応に
影響を及ぼさないリガンドで標識する手段及び当該リガ
ンドの種類；増幅反応は、選択する遺伝子増幅法の種類
に対応した反応を行うこと；核酸を二本鎖から一本鎖に
変性させる手段；リガンドに特異的なレセプター；及び
リガンドに特異的なレセプターを結合させた吸着担体に
ついては前記(i) の場合と同様である。The LCR method can be mentioned as a typical method for amplifying a gene here. Of the group of nucleotide chain fragments having a sequence complementary to the target sequence,
Means for labeling at least one nucleotide chain fragment with a ligand that does not affect the amplification reaction and the type of the ligand; the amplification reaction should be a reaction corresponding to the type of gene amplification method selected; The means for denaturing the protein into a single chain; the ligand-specific receptor; and the adsorption carrier to which the ligand-specific receptor is bound are the same as those in (i) above.
【００３１】上記の結合担体にリガンドで標識された遺
伝子増幅物を特異的に結合させ、次いで当該結合担体を
反応系から除去することによって所望する核酸ハイブリ
ダイゼーション条件を設定することができる。 (iii) 前記(i) に示した「ヌクレオチド鎖とその相補鎖
に対してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマー
を基にして、当該プライマーを伸長せしめることを特徴
とする遺伝子の増幅方法」で増幅された二種類のヌクレ
オチド鎖のうち、標的配列と相補的な塩基配列を有する
ヌクレオチド鎖の増幅量を、標的配列を含むヌクレオチ
ド鎖に対して低くする方法。A desired nucleic acid hybridization condition can be set by specifically binding a gene amplification product labeled with a ligand to the above-mentioned binding carrier and then removing the binding carrier from the reaction system. (iii) In the "amplification method of a gene characterized by extending the primer based on a primer having a complementary nucleotide sequence to the nucleotide chain and its complementary strand" shown in (i) above A method of lowering the amplification amount of a nucleotide chain having a base sequence complementary to the target sequence out of the amplified two types of nucleotide chains with respect to the nucleotide chain containing the target sequence.
【００３２】かかる方法においては、増幅反応により標
的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖を生
成するために増幅反応系に添加するプライマー量を、標
的配列を含むヌクレオチド鎖を生成するために添加する
プライマー量に比較して、相対的に少なくすることで、
標的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖の
増幅量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に対して低く
する目的を達成することができる。In this method, the amount of primer added to the amplification reaction system to generate a nucleotide chain having a base sequence complementary to the target sequence by the amplification reaction is added to generate a nucleotide chain containing the target sequence. Compared to the amount of primer to
It is possible to achieve the purpose of lowering the amplification amount of a nucleotide chain having a base sequence complementary to the target sequence with respect to the nucleotide chain containing the target sequence.
【００３３】具体的には、前者のプライマー量を後者の
プライマー量と比較して、１／10以下、好ましくは１／
1000以下とすることで前記目的を達成することができ
る。なお、かかる手法は核酸配列のシーケンシング法と
して用いられている(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85,7652
-7656(1988))が、核酸ハイブリダイゼーションに用いら
れた例はない。 (iv)前記(ii)に示した「ヌクレオチド鎖とその相補鎖の
それぞれの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオ
チド鎖とアニールした状態で隣接する二組以上のオリゴ
ヌクレオチド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブ
リダイズさせた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士
を連結させることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅
された核酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料
核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応の有無
により検出する核酸の検出方法」において、標的配列と
相補的な配列を含むヌクレオチド鎖断片の添加量を、こ
れに対応するヌクレオチド鎖断片群の添加量と比較して
相対的に低くする方法。Specifically, the former primer amount is compared with the latter primer amount by 1/10 or less, preferably 1 /
The object can be achieved by setting the amount to 1000 or less. This method is used as a sequencing method for nucleic acid sequences (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85 , 7652).
-7656 (1988)) has never been used for nucleic acid hybridization. (iv) the above-mentioned (ii) `` corresponds to two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective chains of the nucleotide chain and its complementary chain and which are adjacent to each nucleotide chain in the annealed state After hybridizing to the nucleotide chain, whether or not the target sequence is present in the nucleic acid sample amplified by the method for amplifying a gene, which is characterized in that the oligonucleotide chain fragments are linked to each other, a sample nucleic acid and a probe are used. In the method for detecting a nucleic acid by detecting the presence or absence of a hybridization reaction, the amount of addition of a nucleotide chain fragment containing a sequence complementary to the target sequence is compared with the amount of addition of a corresponding group of nucleotide chain fragments. How to lower.
【００３４】かかる方法においては、前記(iii) の場合
と同様に増幅反応により標的配列と相補的な塩基配列を
有するヌクレオチド鎖を生成するために増幅反応系に添
加するオリゴヌクレオチド鎖断片群の量を、標的配列を
含むヌクレオチド鎖を生成するために添加するオリゴヌ
クレオチド鎖断片群の量に比較して、相対的に少なくす
ることで、標的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレ
オチド鎖の増幅量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に
対して低くする目的を達成することができる。In this method, as in the case of (iii) above, the amount of the oligonucleotide chain fragment group added to the amplification reaction system to generate a nucleotide chain having a base sequence complementary to the target sequence by the amplification reaction. Compared to the amount of the oligonucleotide chain fragment group added to generate a nucleotide chain containing the target sequence, by relatively reducing the amount of amplification of the nucleotide chain having a base sequence complementary to the target sequence. Can be achieved with respect to the nucleotide chain containing the target sequence.
【００３５】具体的には、前者のオリゴヌクレオチド鎖
断片群の量を後者のオリゴヌクレオチド鎖断片群の量と
比較して、１／10以下、好ましくは１／1000以下とする
ことで前記目的を達成することができる。 (v) ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相補
的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プラ
イマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅方
法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、さらに
一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なプライマーを基
に、当該一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なヌクレ
オチド鎖を増幅させる方法。Specifically, the amount of the former oligonucleotide chain fragment group is compared with the amount of the latter oligonucleotide chain fragment group to be 1/10 or less, preferably 1/1000 or less to achieve the above-mentioned object. Can be achieved. (v) based on a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide chain and its complementary strand, respectively, of the two types of nucleotide chains amplified by a gene amplification method characterized by extending the primer Among these, a method of amplifying a nucleotide chain complementary to the one nucleotide chain based on a primer complementary to the one nucleotide chain.
【００３６】すなわち、前記(i) に示した「ヌクレオチ
ド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相補的な塩基配列を
有するプライマーを基にして、当該プライマーを伸長せ
しめることを特徴とする遺伝子の増幅方法」で増幅され
た二種類のヌクレオチド鎖のうち、一方のヌクレオチド
鎖にのみ相補的な配列を有する第三のプライマーを用
い、当該第三のプライマーによる遺伝子の増幅反応を行
うことにより、容易に一本鎖の標的配列を含むヌクレオ
チド鎖を選択的に得ることができる。That is, the method for amplifying a gene, characterized in that the primer is extended based on a primer having a nucleotide sequence complementary to each of the nucleotide chain and its complementary chain shown in (i) above. Of the two types of nucleotide chains amplified in “1”, a third primer having a sequence complementary to only one of the nucleotide chains is used, and the amplification reaction of the gene by the third primer is performed to easily A nucleotide chain containing the target sequence of the full-chain can be selectively obtained.
【００３７】この場合、第一段階で使用したプライマー
が充分量存在すると他方のヌクレオチド鎖も同時に増幅
され二本鎖となることから、第三のプライマーの添加前
において、第一段階のプライマーが実質的に少ないか存
在しない状態にしておくことが必要である。かかる状態
にする方法としては、限外ろ過フィルター、例えばウル
トラフリー( ミリポア社製) を用いてプライマーを除去
する方法や、電気泳動やカラムによる分画精製によって
プライマーを除去する方法を挙げることができる。In this case, when the sufficient amount of the primer used in the first step is present, the other nucleotide chain is also amplified at the same time to be double-stranded, so that the primer in the first step is substantially added before the addition of the third primer. It is necessary to keep the number to a minimum or not exist. Examples of the method for making such a state include a method of removing a primer using an ultrafiltration filter, for example, Ultra Free (manufactured by Millipore), and a method of removing a primer by fractionation purification by electrophoresis or a column. .
【００３８】(vi)ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞ
れの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖
とアニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレ
オチド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイ
ズさせた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結
させることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅させ、
さらに増幅された二本鎖断片の一方のヌクレオチド鎖の
みに相補的な塩基配列を有する二組以上のオリゴヌクレ
オチド断片群を基に当該一方のヌクレオチド鎖を増幅す
る方法。(Vi) Hybridizing two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and which are adjacent to each nucleotide chain in the annealed state to the corresponding nucleotide chains. After that, it is amplified by a method for amplifying a gene, characterized in that the oligonucleotide chain fragments are ligated to each other,
A method for amplifying one nucleotide chain based on two or more sets of oligonucleotide fragments having a base sequence complementary to only one nucleotide chain of the amplified double-stranded fragment.
【００３９】すなわち、前記(ii)に示した「ヌクレオチ
ド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補的であり、かつ
それぞれのヌクレオチド鎖とアニールした状態で隣接す
る二組以上のオリゴヌクレオチド断片群を対応するヌク
レオチド鎖にハイブリダイズさせた後、当該オリゴヌク
レオチド鎖断片同士を連結させることを特徴とする遺伝
子の増幅方法で増幅された核酸試料中に標的配列が存在
するか否かを、試料核酸とプローブとのハイブリダイゼ
ーション反応の有無により検出する核酸の検出方法」に
おいて、増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、一
方のヌクレオチド鎖にのみ相補的な配列を有するオリゴ
ヌクレオチド断片群を用い、当該オリゴヌクレオチド群
による遺伝子の増幅反応を行うことにより、容易に一本
鎖の標的配列を含むヌクレオチド鎖を選択的に得ること
ができる。That is, the two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains of the nucleotide chain and its complementary chain and which are adjacent to each other in the annealed state with the respective nucleotide chains are shown in (ii) above. After hybridizing to the corresponding nucleotide chain, whether or not the target sequence is present in the nucleic acid sample amplified by the method for amplifying a gene, which is characterized by linking the oligonucleotide chain fragments, In the method for detecting a nucleic acid to be detected depending on the presence or absence of a hybridization reaction with a probe, among two types of amplified nucleotide chains, an oligonucleotide fragment group having a sequence complementary to only one nucleotide chain is used. Include a single-stranded target sequence easily by performing a gene amplification reaction with nucleotides Nucleotide chains can be obtained selectively.
【００４０】この場合、第一段階で使用したオリゴヌク
レオチド断片が充分量存在すると他方のヌクレオチド鎖
も同時に増幅され二本鎖となることから、第三のオリゴ
ヌクレオチド断片の添加前において、第一段階のオリゴ
ヌクレオチド断片が実質的に少ないか存在しない状態に
しておくことが必要である。かかる状態にする方法とし
ては、限外ろ過フィルター、例えばウルトラフリー( ミ
リポア社製) を用いてオリゴヌクレオチド断片を除去す
る方法や、電気泳動やカラムによる分画精製によってオ
リゴヌクレオチド断片を除去する方法を挙げることがで
きる。Ｄ．上記により、所望の核酸ハイブリダイゼーシ
ョンの条件を設定して、企図する核酸ハイブリダイゼー
ション反応を行う方法である。In this case, when the oligonucleotide fragment used in the first step is present in sufficient quantity, the other nucleotide chain is simultaneously amplified and becomes a double strand. Therefore, before the addition of the third oligonucleotide fragment, the first step is performed. It is necessary to keep substantially no or no oligonucleotide fragment. As a method for making such a state, an ultrafiltration filter, for example, a method of removing an oligonucleotide fragment using Ultrafree (Millipore), or a method of removing an oligonucleotide fragment by fractionation purification by electrophoresis or a column is used. Can be mentioned. D. According to the method described above, the desired nucleic acid hybridization conditions are set and the intended nucleic acid hybridization reaction is performed.
【００４１】かかる核酸ハイブリダイゼーション法とし
ては、液相で標識プローブを反応させた後、直接標識を
検出する方法（特開平2-503147号公報、同2-503268号公
報)；液相で標識プローブと捕捉可能な標識を施した捕
捉プローブを反応させた後、担体に結合した捕捉剤で当
該捕捉プローブを捕捉する液相サンドイッチ法( 特開昭
61-195699 号公報、同61-274699 号公報、同62-229068
号公報、特開平1-104200号公報、同1-501399号公報等)
；担体に直接結合した捕捉プローブと標識プローブを
用いる固相サンドイッチ法（特開昭60-188100 号公報、
同60-188397 号公報、同61-264240 号公報、同62-81564
号公報等) ；核酸試料を直接標識して、担体に結合した
捕捉剤で当該核酸試料を捕捉し、核酸試料に結合した標
識を測定する方法（特開昭62-265999 号公報) 等が用い
られる。As such a nucleic acid hybridization method, a method of reacting a labeled probe in a liquid phase and then directly detecting the label (Japanese Patent Laid-Open Nos. 2-503147 and 2-503268); a labeled probe in a liquid phase And a capture probe having a captureable label are reacted with each other, and then the capture probe is captured by a capture agent bound to a carrier.
61-195699, 61-274699, 62-229068
(Japanese Patent Laid-Open No. 1-104200, Japanese Patent Laid-Open No. 1-501399, etc.)
A solid-phase sandwich method using a capture probe and a labeled probe directly bound to a carrier (JP-A-60-188100,
60-188397 publication, 61-264240 publication, 62-81564
A method of directly labeling a nucleic acid sample, capturing the nucleic acid sample with a capture agent bound to a carrier, and measuring the label bound to the nucleic acid sample (JP-A-62-265999) is used. To be
【００４２】[0042]
【実施例】次に実施例によって本発明を具体的に説明す
るが、本発明の範囲がこれにより限定されるものではな
い。 （参考例１）各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI 社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。EXAMPLES Next, the present invention will be specifically described by way of examples, but the scope of the present invention is not limited thereby. Reference Example 1 Synthesis of Various Oligonucleotides Using the ABI DNA Synthesizer Model 391, various oligonucleotides having the following sequences were synthesized by the phosphoamidite method.
【００４３】合成の方法はABI 社マニュアルに従い、0.
2 μM スケールで実施した。各種のオリゴヌクレオチド
の脱保護は55℃のアンモニア水中で一夜行った。オリゴ
ヌクレオチドの精製はファルマシア社製FPLCで逆相カラ
ムにて実行した。 (1) 第１オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の271番目から292 番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する（配列番号１）。また5'
末端の５塩基は必要によりホスホチオエート基で結合し
た。 (2) 第２オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の622番目から642 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列を有する（配列番号２）。The synthesis method is according to the ABI company's manual.
Performed on a 2 μM scale. Deprotection of various oligonucleotides was carried out in ammonia water at 55 ° C overnight. Purification of the oligonucleotide was carried out by FPLC manufactured by Pharmacia on a reverse phase column. (1) First oligonucleotide: This oligonucleotide has a sequence homologous to the nucleotide sequence from the 271st position to the 292nd position of the cholera toxin gene (SEQ ID NO: 1). Again 5 '
The terminal 5 bases were linked with a phosphothioate group, if necessary. (2) Second oligonucleotide: This oligonucleotide has a sequence complementary to the 622nd to 642nd nucleotide sequences of the cholera toxin gene (SEQ ID NO: 2).
【００４４】必要により第２オリゴヌクレオチドの5'末
端にビオチンを導入した。すなわち、当該オリゴヌクレ
オチドの合成時N-MMT −ヘキサノールアミンリンカー
（ミリジェン社製）を用いて5'末端にアミノ基を導入
し、室温下、アンモニア水中で24時間放置して脱保護し
たのちN −ヒドロキシサクシニミジルビオチンを結合す
る方法（C.F.バーバラ（C.F.Barbara ）等：DNA ，第４
巻，327 頁(1985)) に従った。 (3) 第３オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の478番目から507 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列を有する（配列番号３）。5 ’末
端に32P-ATP 及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
32P 標識した。 (4) 第４オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の453番目から477 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列、その3'側に30塩基のオリゴdAを
有する（配列番号４）。 (5) 第５オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の430番目から452 番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する（配列番号５）。 (6) 第６及び6'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の451 番目から471 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第６オリゴヌクレ
オチド（配列番号６）及びその相補的な配列を有する第
6'オリゴヌクレオチド（配列番号７）を示す。 (7) 第７及び7'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の472 番目から492 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第７オリゴヌクレ
オチド（配列番号８）及びその相補的な配列を有する第
7'オリゴヌクレオチド（配列番号９）を示す。 (8) 第８及び8'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の493 番目から518 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第８オリゴヌクレ
オチド（配列番号10) 及びその相補的な配列を有する第
8'オリゴヌクレオチド（配列番号11) を示す。 （実施例１） 〔一本鎖核酸の調製〕プライマーとして参考例１に示し
た第１オリゴヌクレオチド及びリガンド標識プライマー
として同ビオチン標識第２オリゴヌクレオチドを各々40
pmole 、及び標的配列を含む核酸試料としてコレラの培
養菌から分離・部分精製したゲノム核酸１ngを、50μl
の下記の反応液に加えた。次に当該反応液を94℃に５分
間保った後、TthDNAポリメラーゼ（東洋紡績社製）を４
単位加え、さらにこれを94℃に１分間保った後、下記の
熱サイクルにて、PCR 法による遺伝子の増幅を行った。If necessary, biotin was introduced into the 5'end of the second oligonucleotide. That is, at the time of synthesizing the oligonucleotide, an amino group was introduced at the 5'end using an N-MMT-hexanolamine linker (manufactured by Milligen), and left at room temperature in ammonia water for 24 hours for deprotection and then N- Method for binding hydroxysuccinimidylbiotin (CFBarbara, etc .: DNA, 4th
Vol., P. 327 (1985)). (3) Third oligonucleotide: This oligonucleotide has a sequence complementary to the nucleotide sequence from the 478th position to the 507th position of the cholera toxin gene (SEQ ID NO: 3). Using 32 P-ATP and T4 polynucleotide kinase at the 5'end
32 P labeled. (4) Fourth oligonucleotide: This oligonucleotide has a sequence complementary to the nucleotide sequence from the 453rd position to the 477th position of the cholera toxin gene, and has oligo dA of 30 bases on the 3'side thereof (SEQ ID NO: 4). (5) Fifth oligonucleotide: This oligonucleotide has a sequence homologous to the nucleotide sequence from the 430th position to the 452nd position of the cholera toxin gene (SEQ ID NO: 5). (6) 6th and 6'oligonucleotides: This oligonucleotide comprises a 6th oligonucleotide (SEQ ID NO: 6) having a sequence homologous to the 451st to 471st nucleotide sequences of the cholera toxin gene and its complementary sequence. Have
6'oligonucleotide (SEQ ID NO: 7) is shown. (7) Seventh and 7'oligonucleotides: This oligonucleotide comprises a seventh oligonucleotide (SEQ ID NO: 8) having a sequence homologous to the nucleotide sequence from the 472nd to 492nd nucleotides of the cholera toxin gene and its complementary sequence. Have
7'oligonucleotide (SEQ ID NO: 9) is shown. (8) 8th and 8'oligonucleotides: This oligonucleotide comprises an 8th oligonucleotide (SEQ ID NO: 10) having a sequence homologous to the nucleotide sequence from the 493th to 518th nucleotides of the cholera toxin gene and its complementary sequence. Have
8'oligonucleotide (SEQ ID NO: 11) is shown. (Example 1) [ Preparation of single-stranded nucleic acid ] Each of the first oligonucleotide shown in Reference Example 1 as a primer and the same biotin-labeled second oligonucleotide as a ligand labeled primer was used as a primer.
50 μl of 1 ng of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cholera culture as a nucleic acid sample containing pmole and target sequence
Was added to the reaction solution below. Next, after keeping the reaction solution at 94 ° C. for 5 minutes, Tth DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was added to
After adding a unit and further maintaining this at 94 ° C. for 1 minute, the gene was amplified by the PCR method in the following thermal cycle.
【００４５】(反応液) 10mM Tris-HCl（pH8.9 ） 1.5mM MgCl2 80mM KCl 500μg ／ml BSA 0.1 ％ コール酸ナトリウム 0.1 ％ トリトンX100 0.2mM dATP，dGTP，dCTP，dTTP 変性 94℃ 60秒 アニール 58℃ 120秒 伸長反応 75℃ 90秒 (サイクル数) 30回 得られたPCR 増幅産物をそのまま段階希釈して、一方の
検出対象とした。(Reaction solution) 10 mM Tris-HCl (pH 8.9) 1.5 mM MgCl 2 80 mM KCl 500 μg / ml BSA 0.1% Sodium cholate 0.1% Triton X100 0.2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP denaturation 94 ° C. 60 seconds Annealing 58 ° C 120 seconds Extension reaction 75 ° C 90 seconds (cycle number) 30 times The PCR amplification product obtained was serially diluted as it was and used as one of the detection targets.
【００４６】そして、前記のPCR 増幅産物20μl にスト
レプトアビジン磁性ビーズ（ダイナル社製）を40μl 添
加し、これを室温で10分間攪拌した。次に磁石で磁性ビ
ーズを収集し、TE緩衝液で当該磁性ビーズを2 回洗浄し
た。さらに、0.3 規定のNaOHを100 μl を加えて10分間
放置した後、磁石で磁性ビーズを除き、この磁性ビーズ
処理試料を一本鎖化処理検出試料とした。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕前記
の検出対象であるPCR 増幅産物４μl に0.33規定のNaOH
16μl を加え、10分間放置し一方の検出試料とした。ま
た、PCR 反応後、上記磁性ビーズ処理した一本鎖化処理
検出試料20μｌを用いた。Then, 40 μl of streptavidin magnetic beads (manufactured by Dynal) was added to 20 μl of the above PCR amplification product, and this was stirred at room temperature for 10 minutes. Next, the magnetic beads were collected with a magnet, and the magnetic beads were washed twice with TE buffer. Furthermore, after adding 100 μl of 0.3 N NaOH and allowing it to stand for 10 minutes, the magnetic beads were removed with a magnet, and this magnetic bead-treated sample was used as a single-strand-treated detection sample. [ Liquid phase sandwich hybridization detection ] 0.33N NaOH was added to 4 μl of the PCR amplification product to be detected.
16 μl was added and left for 10 minutes to serve as one detection sample. In addition, after the PCR reaction, 20 μl of the detection sample for single-strand processing treated with the magnetic beads was used.
【００４７】各試料20μl 及び検出プローブとして32P
標識した第３オリゴヌクレオチド及び第４オリゴヌクレ
オチド各1nmoleをハイブリダイゼーション液（５×SSC
，0.5 ％BSA ，0.5 ％PVP ，１％SDS ）80μl に添加
し、これを50℃で２時間加温した。加温後、固定化捕捉
プローブとしてポリT 結合磁性ビーズ（ダイナビーズオ
リゴ（dT）25：ダイナル社製）を20μl を加え、さらに
１時間反応後、磁石で当該磁性ビーズを集め、50℃下で
その磁石を１×SSC で３回洗浄した。その後、磁性ビー
ズの放射活性をベックマンレディーソルブ液を用い液体
シンチレーション計数により測定した。 〔結果〕結果を表１に示す。20 μl of each sample and 32 P as a detection probe
1 nmole of each of the labeled 3rd oligonucleotide and 4th oligonucleotide was added to the hybridization solution (5 x SSC
, 0.5% BSA, 0.5% PVP, 1% SDS) 80 μl and heated at 50 ° C. for 2 hours. After heating, add 20 μl of poly-T binding magnetic beads (Dynabead Oligo (dT) 25: Dynal) as an immobilized capture probe, and after reacting for an additional 1 hour, collect the magnetic beads with a magnet and at 50 ° C. The magnet was washed 3 times with 1 × SSC. Then, the radioactivity of the magnetic beads was measured by liquid scintillation counting using Beckman Ready Solve solution. [ Results ] The results are shown in Table 1.
【００４８】[0048]
【表１】 [Table 1]
【００４９】PCR 反応後、一本鎖化処理した試料では検
出感度の上昇が認められた。 （実施例２）実施例１のPCR 産物５μl 、及び「増幅さ
れた二種類のヌクレオチド鎖のうち、さらに一方のヌク
レオチド鎖に対して相補的なヌクレオチド鎖」として、
第５オリゴヌクレオチド40nmole のみを用い、第１、第
２オリゴヌクレオチドを添加することなく、実施例１と
同様の熱サイクルを５回実施した。但しアニール温度は
63℃であった。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕PCR
増幅産物を94℃加熱した後、又は室温に一夜放置した
後、実施例１の液相サンドイッチハイブリダイゼーショ
ン検出と同様の操作を行った。After the PCR reaction, an increase in detection sensitivity was observed in the sample treated with single strands. (Example 2) 5 µl of the PCR product of Example 1 and "a nucleotide chain complementary to one of the amplified two types of nucleotide chains,"
A thermal cycle similar to that in Example 1 was performed 5 times using only the 5th oligonucleotide, 40 nmole, and without adding the first and second oligonucleotides. However, the annealing temperature
It was 63 ° C. [ Liquid phase sandwich hybridization detection ] PCR
After the amplified product was heated at 94 ° C. or left overnight at room temperature, the same operation as in the liquid phase sandwich hybridization detection of Example 1 was performed.
【００５０】その結果を表２に示す。The results are shown in Table 2.
【００５１】[0051]
【表２】 [Table 2]
【００５２】この結果、上記検出系においては増幅産物
を一夜放置した後でも測定は可能であった。 （実施例３） 〔試料核酸の調製〕参考例１の第５オリゴヌクレオチド
及び第２オリゴヌクレオチドをプライマーとして各々40
pmole を用いて実施例１と同様に遺伝子の増幅操作を行
った。As a result, in the above detection system, measurement was possible even after leaving the amplification product overnight. (Example 3) [ Preparation of sample nucleic acid ] Each of the fifth oligonucleotide and the second oligonucleotide of Reference Example 1 was used as a primer.
A gene amplification operation was carried out in the same manner as in Example 1 using pmole.
【００５３】 変性 94℃ 60秒 アニール 58℃ 120秒 伸長反応 75℃ 90秒 (サイクル数) 30回 増幅反応後、94℃で５分間の加熱を行った後、エキソヌ
クレアーゼIII（東洋紡績社製 )380 単位を添加して、3
7℃で30分間反応させた。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕上記
のエキソヌクレアーゼIII処理PCR 増幅産物10μl に0.6
規定のNaOHを10μl を加え、10分間放置し一本鎖核酸
試料とした。各試料20μl を用い、実施例１と同様の検
出を行った。また対照として、エキソヌクレアーゼIII
未処理のものも検出した。 〔結果〕結果を表３に示す。Denaturation 94 ° C. 60 seconds Annealing 58 ° C. 120 seconds Extension reaction 75 ° C. 90 seconds (number of cycles) 30 times After amplification reaction, heating at 94 ° C. for 5 minutes, exonuclease III (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) Add 380 units and add 3
The reaction was carried out at 7 ° C for 30 minutes. [ Detection of liquid-phase sandwich hybridization ] 0.6 μl of 10 μl of PCR amplification product treated with exonuclease III as described above
10 μl of normal NaOH was added and left for 10 minutes to prepare a single-stranded nucleic acid sample. The same detection as in Example 1 was carried out using 20 μl of each sample. Also, as a control, exonuclease III
Untreated ones were also detected. [ Results ] The results are shown in Table 3.
【００５４】[0054]
【表３】 [Table 3]
【００５５】増幅後、エキソヌクレアーゼIII処理した
試料において、検出感度の向上が認められた。 （実施例４）第６〜８オリゴヌクレオチド及び第6'〜8'
を用い、耐熱製DNA リガーゼを用いてコレラ核酸の増幅
を行った。オリゴヌクレオチド第６、７、7'、8'はその
5'末端をATP とホスホヌクレオチドキナーゼでリン酸化
した。またオリゴヌクレオチド第8'は3'末端の３塩基は
ホスホチオエート基で結合した。After amplification, the sample treated with exonuclease III was found to have improved detection sensitivity. (Example 4) 6th to 8th oligonucleotides and 6'to 8 '
Was used to amplify cholera nucleic acid using a heat-resistant DNA ligase. Oligonucleotides 6, 7, 7 ', 8'are
The 5'end was phosphorylated with ATP and phosphonucleotide kinase. Also, in the 8th oligonucleotide, 3 bases at the 3'end were linked with a phosphothioate group.
【００５６】コレラ核酸は実施例１と同じ精製核酸を１
ng用いた。増幅条件を以下に記載する。 (反応液) 20mM Tris-HCl（pH7.6 ） 5mM MgCl2 25mM KCl 100 μM NAD 10mM DTT 100pmole 各々のオリゴヌクレオチド ───────────────────────────────── 100μl (総液量) 当該反応液を94℃で５分間保った後、TthDNAリガーゼ(
東洋紡績社製) を40単位加え、さらに94℃で１分間保っ
た後、下記の熱サイクルにより遺伝子の増幅を行った。As the cholera nucleic acid, the same purified nucleic acid as in Example 1 was used.
ng was used. The amplification conditions are described below. (Reaction solution) 20mM Tris-HCl (pH7.6) 5mM MgCl 2 25mM KCl 100 μM NAD 10mM DTT 100pmole Each oligonucleotide ─────────────────────── ─────────── 100 μl (total volume) After keeping the reaction solution at 94 ℃ for 5 minutes, Tth DNA ligase (
40 units of Toyobo Co., Ltd.) was added, and the mixture was further kept at 94 ° C. for 1 minute, and then the gene was amplified by the following heat cycle.
【００５７】 変性 94℃ 30秒 アニール 58℃ 60秒 伸長反応 50℃ 180秒 (サイクル数) 30回 増幅反応後、94℃で５分間の加熱を行った後、エキソヌ
クレアーゼIIIを380単位を添加して37℃で30分間反応さ
せて、増幅された二本鎖核酸を一本鎖にした。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕上記
増幅産物10μl にO.6 規定のNaOH10μl を加え、10分間
放置し試料とした。また比較にエキソヌクレアーゼIII
未処理のものについても検討を行った。各試料20μl を
用い、実施例１と同様の検出を行った。 〔結果〕結果を表４に示す。Denaturation 94 ° C. 30 seconds Annealing 58 ° C. 60 seconds Extension reaction 50 ° C. 180 seconds (number of cycles) 30 times After amplification reaction, heating at 94 ° C. for 5 minutes, 380 units of exonuclease III was added. And allowed to react at 37 ° C. for 30 minutes to make the amplified double-stranded nucleic acid single-stranded. [ Detection of Liquid-Phase Sandwich Hybridization ] 10 μl of the above amplification product was added with 10 μl of O.6 normal NaOH and left for 10 minutes to prepare a sample. For comparison, Exonuclease III
The untreated one was also examined. The same detection as in Example 1 was carried out using 20 μl of each sample. [ Results ] The results are shown in Table 4.
【００５８】[0058]
【表４】 [Table 4]
【００５９】増幅後エキソヌクレアーゼIII処理した試
料では、検出感度の向上が認められた。 （実施例５） 〔試料核酸の調製〕参考例１の第１オリゴヌクレオチド
及び第２オリゴヌクレオチドをプライマーとして各々40
pmole を用いて実施例１と同様に増幅を行った。但し第
１オリゴヌクレオチドの5'末端はホスホヌクレオチドキ
ナーゼとATP で予めリン酸化した。In the sample treated with exonuclease III after amplification, improvement in detection sensitivity was observed. (Example 5) [ Preparation of sample nucleic acid ] Using each of the first oligonucleotide and the second oligonucleotide of Reference Example 1 as a primer, 40
Amplification was performed in the same manner as in Example 1 using pmole. However, the 5'end of the first oligonucleotide was pre-phosphorylated with phosphonucleotide kinase and ATP.
【００６０】 変性 94℃ 60秒 アニール 58℃ 120秒 伸長反応 75℃ 90秒 (サイクル数) 30回 増幅反応後、反応液10μl を以下の反応液90μl に加
え、94℃で５分間の加熱を行った後、λエキソヌクレア
ーゼ(BRL社製 )120 単位を添加して37℃で30分間反応さ
せ、増幅された二本鎖核酸を一本鎖にした。Denaturation 94 ° C. 60 seconds Annealing 58 ° C. 120 seconds Extension reaction 75 ° C. 90 seconds (number of cycles) 30 times After amplification reaction, 10 μl of the reaction solution is added to 90 μl of the following reaction solution and heated at 94 ° C. for 5 minutes After that, 120 units of λ exonuclease (manufactured by BRL) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to make the amplified double-stranded nucleic acid into a single strand.
【００６１】(反応液) 67mM グリシン-KOH(pH9.4) 2.5mM MgCl2 50μg ／ml BSA 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕上記
の増幅産物10μl に0.6 規定のNaOH10μl を加え、10分
間放置し試料とした。また対象としてλエキソヌクレア
ーゼ未処理のものも実施した。各試料20μl を用い、実
施例１と同様の検出を行った。 〔結果〕結果を表５に示す。(Reaction solution) 67 mM Glycine-KOH (pH 9.4) 2.5 mM MgCl 2 50 μg / ml BSA [ liquid phase sandwich hybridization detection ] 10 μl of the above amplification product was added with 10 μl of 0.6 N NaOH and left for 10 minutes to prepare a sample And In addition, λ exonuclease untreated was also used as a control. The same detection as in Example 1 was carried out using 20 μl of each sample. [ Results ] The results are shown in Table 5.
【００６２】[0062]
【表５】 [Table 5]
【００６３】増幅後、λエキソヌクレアーゼ処理した試
料では、検出感度の向上が認められた。After amplification, the sample treated with λ exonuclease was found to have improved detection sensitivity.
【００６４】[0064]
【発明の効果】本発明により、主に液相法におけるハイ
ブリダイゼーション反応において、核酸試料の再会合の
問題を除去した改良方法が提供される。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides an improved method which eliminates the problem of reassociation of a nucleic acid sample in a hybridization reaction mainly in a liquid phase method.
【００６５】[0065]
配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２２ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の２７１番目から２９２番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGTCAAACTA TATTGTCTGG TC 22 配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の６２２番目から６４２番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTCATCGAT GATCTTGGAG C 21 配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．３０ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７８番目から５０７番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTGTAATAT CTATCTCTGT AGCCCCTATT 30 配列番号：４ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２４ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５３番目から４７７番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 CGATGTAATT GTTCATCAAG CACCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 54 配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２３ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４３０番目から４５２番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGATGGTATC GAGTTCATTT TGG 23 配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５１番目から４７１番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGGGTGCTTG ATGAACAATT A 21 配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５１番目から４７１番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 TAATTGTTCA TCAAGCACCC C 21 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７２番目から４９２番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 CATCGTAATA GGGGCTACAG A 21 配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７２番目から４９２番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 TCTGTAGCCC CTATTACGAT G 21 配列番号：１０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２６ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４９３番目から５１８番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GATAGATATT ACAGTAACTT AGATAT 26 配列番号：１１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２６ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４９３番目から５１８番
目のヌクレオチドの配列と相補的配列を有する。 配列 ATATCTAAGT TACTGTAATA TCTATC 26SEQ ID NO: 1 Sequence length: 22 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1. ． 22 Sequencing method: S Other features: It has a sequence homologous to the nucleotide sequence from nucleotide 271 to nucleotide 292 of the cholera toxin gene. Sequence GGTCAAACTA TATTGTCTGG TC 22 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA primer Sequence characteristics Location: 1. ． 21 Sequencing method: S Other characteristics: It has a sequence complementary to the sequence of nucleotides 622 to 642 of the cholera toxin gene. Sequence ACTCATCGAT GATCTTGGAG C 21 SEQ ID NO: 3 Sequence length: 30 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1. ． 30 Method of sequence determination: S Other characteristics: It has a sequence complementary to the sequence of nucleotides 478 to 507 of the cholera toxin gene. Sequence ACTGTAATAT CTATCTCTGT AGCCCCTATT 30 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 54 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1. ． 24 Sequencing method: S Other characteristics: It has a sequence complementary to the sequence of nucleotides 453 to 477 of the cholera toxin gene. Sequence CGATGTAATT GTTCATCAAG CACCAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAA 54 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 23 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1. ． 23 Sequencing method: S Other features: It has a sequence homologous to the sequence of nucleotides 430 to 452 of the cholera toxin gene. Sequence GGATGGTATC GAGTTCATTT TGG 23 SEQ ID NO: 6 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1. ． 21 Sequencing method: S Other features: It has a sequence homologous to the sequence of nucleotides 451 to 471 of the cholera toxin gene. Sequence GGGGTGCTTG ATGAACAATT A 21 SEQ ID NO: 7 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1. ． 21 Sequencing method: S Other features: It has a sequence complementary to the sequence of nucleotides 451 to 471 of the cholera toxin gene. Sequence TAATTGTTCA TCAAGCACCC C 21 SEQ ID NO: 8 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1. ． 21 Sequencing method: S Other features: Having a sequence homologous to the sequence of nucleotides 472 to 492 of the cholera toxin gene. Sequence CATCGTAATA GGGGCTACAG A 21 SEQ ID NO: 9 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1. ． 21 Sequencing method: S Other features: It has a sequence complementary to the sequence of nucleotides 472 to 492 of the cholera toxin gene. Sequence TCTGTAGCCC CTATTACGAT G 21 SEQ ID NO: 10 Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1. ． 26 Sequencing method: S Other features: It has a sequence homologous to the sequence of nucleotides 493 to 518 of the cholera toxin gene. Sequence GATAGATATT ACAGTAACTT AGATAT 26 SEQ ID NO: 11 Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1. ． 26 Sequence-determined method: S Other characteristics: It has a sequence complementary to the sequence of nucleotides 493 to 518 of the cholera toxin gene. Sequence ATATCTAAGT TACTGTAATA TCTATC 26
Claims (14)
との核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検出
する方法において、当該試料中の核酸を必要により二本
鎖から一本鎖に変性させた後、核酸試料として存在する
標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的
な配列を有する他方のヌクレオチド鎖が、当該一方のヌ
クレオチド鎖に対比して実質的に少ないか、又は存在し
ない条件下で上記核酸ハイブリダイゼーション反応を行
うことを特徴とする核酸の検出方法。1. A method for detecting the presence of a target sequence in a nucleic acid sample by the presence or absence of a nucleic acid hybridization reaction with a probe, after denaturing the nucleic acid in the sample from double-stranded to single-stranded as necessary, The other nucleotide chain having a sequence complementary to the one nucleotide chain having the target sequence present as the nucleic acid sample is substantially less than the one nucleotide chain, or is not present under the conditions described above. A method for detecting a nucleic acid, which comprises performing a nucleic acid hybridization reaction.
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された核酸試料中の標的配列の存
在をプローブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有
無により検出する方法において、 一方のプライマーをリガンドで標識して、 増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターに増幅
物中のリガンドを吸着させ、 リガンド標識されたプライマー伸長物を除去して、 核酸試料中の標的配列の存在を、プローブとの核酸ハ
イブリダイゼーション反応により検出する請求項１記載
の方法。2. A nucleic acid sample amplified by a method for amplifying a gene, which comprises extending a primer based on a primer having a nucleotide sequence complementary to a nucleotide chain and a complementary nucleotide sequence to the complementary strand thereof, respectively. In the method for detecting the presence of a target sequence based on the presence or absence of a nucleic acid hybridization reaction with a probe, one primer is labeled with a ligand and an amplification reaction is performed before or after denaturation from double-stranded to single-stranded. Then, the ligand in the amplificate is adsorbed to the receptor specific to the labeled ligand, the primer extension product labeled with the ligand is removed, and the presence of the target sequence in the nucleic acid sample is detected by the nucleic acid hybridization reaction with the probe. The method according to claim 1, wherein
て、核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去することを特徴とする核酸の
検出方法。3. The method for detecting a nucleic acid according to claim 1, wherein the other nucleotide chain having a sequence complementary to one nucleotide chain having a target sequence present as a nucleic acid sample is decomposed and removed. A method for detecting a characteristic nucleic acid.
て、核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一
方のみを分解するエキソヌクレアーゼによるヌクレオチ
ド鎖の分解であることを特徴とする核酸の検出方法。4. The method for detecting a nucleic acid according to claim 3, wherein means for decomposing and removing the other nucleotide chain having a sequence complementary to one nucleotide chain having a target sequence present as a nucleic acid sample is provided. A method for detecting a nucleic acid, which comprises degrading a nucleotide chain with an exonuclease that degrades only one of double-stranded nucleic acids.
て、核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一
方のヌクレオチド鎖にエキソヌクレアーゼ反応に対して
抵抗性を与える手段を施した後、当該二本鎖核酸を当該
エキソヌクレアーゼで処理して、他方のヌクレオチド鎖
を分解して除去することを特徴とする核酸の検出方法。5. The method for detecting a nucleic acid according to claim 3, wherein means for decomposing and removing the other nucleotide chain having a sequence complementary to one nucleotide chain having the target sequence present as a nucleic acid sample is provided. , After applying a means for imparting resistance to an exonuclease reaction to one nucleotide chain of a double-stranded nucleic acid, treating the double-stranded nucleic acid with the exonuclease, and decomposing and removing the other nucleotide chain A method for detecting a nucleic acid, which comprises:
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖の
うち、標的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチ
ド鎖の増幅量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に対し
て低くすることを特徴とする、核酸試料中の標的配列の
存在をプローブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の
有無により検出する請求項１記載の方法。6. Two kinds of nucleotides amplified by a method for amplifying a gene, which comprises extending a primer based on a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide chain and a complementary nucleotide sequence to the complementary strand, respectively. Among the chains, the amount of amplification of a nucleotide chain having a base sequence complementary to the target sequence is lower than that of the nucleotide chain containing the target sequence, and the presence of the target sequence in the nucleic acid sample as a probe The method according to claim 1, wherein the detection is carried out by the presence or absence of a nucleic acid hybridization reaction.
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖の
うち、さらに一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なプ
ライマーを基に、当該一方のヌクレオチド鎖に対して相
補的なヌクレオチド鎖を増幅させた核酸試料中の標的配
列の存在を核酸試料とプローブとのハイブリダイゼーシ
ョン反応の有無により検出する請求項１記載の方法。7. Two kinds of nucleotides amplified by a method for amplifying a gene, which comprises extending a primer based on a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide chain and a complementary sequence to the complementary chain, respectively. The presence of a target sequence in a nucleic acid sample obtained by amplifying a nucleotide chain complementary to one nucleotide chain based on a primer complementary to one nucleotide chain among the chains The method according to claim 1, wherein the detection is carried out by the presence or absence of a hybridization reaction with.
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖の
うち、標的配列を含むヌクレオチド鎖にエキソヌクレア
ーゼ反応に対して抵抗性を与える手段を施した後、当該
増幅物を当該エキソヌクレアーゼで処理することを特徴
とする請求項５記載の核酸の検出方法。8. Two kinds of nucleotides amplified by a method for amplifying a gene, characterized in that the primer is extended based on a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide chain and a complementary sequence to the complementary chain. The nucleic acid chain according to claim 5, wherein the amplified product is treated with the exonuclease after the means for imparting resistance to the exonuclease reaction is applied to the nucleotide chain containing the target sequence among the chains. Method.
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖の
うち、標的配列を含まないヌクレオチド鎖を分解して除
去する手段が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソ
ヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解であることを
特徴とする、請求項４記載の核酸の検出方法。9. Two kinds of nucleotides amplified by a method for amplifying a gene, characterized in that the primer is extended based on a primer having a nucleotide sequence complementary to a nucleotide chain and a complementary sequence to the complementary chain. The means for decomposing and removing a nucleotide chain not containing a target sequence among the chains is decomposing the nucleotide chain by an exonuclease that decomposes only one of the double-stranded nucleic acids. Method for detecting nucleic acid.
れの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖
とアニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレ
オチド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイ
ズさせた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結
させることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された
核酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸と
プローブとのハイブリダイゼーション反応の有無により
検出する請求項１記載の核酸の検出方法において、 標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片
群のうち、少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を、上
記増幅反応に影響を及ぼさないリガンドで標識して、 当該増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターによっ
てリガンド標識された標的核酸配列と相補的配列を含む
オリゴヌクレオチド連結物を反応系から除去することを
特徴とする核酸の検出方法。10. A hybrid of two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to each of the nucleotide chain and its complementary strand and which are adjacent to each other in the state of being annealed with each nucleotide chain, to the corresponding nucleotide chain. After that, whether or not the target sequence is present in the nucleic acid sample amplified by the gene amplification method characterized in that the oligonucleotide chain fragments are ligated to each other is determined by the presence or absence of the hybridization reaction between the sample nucleic acid and the probe. The method for detecting a nucleic acid according to claim 1, wherein at least one nucleotide chain fragment in the group of nucleotide chain fragments having a sequence complementary to the target sequence is labeled with a ligand that does not affect the amplification reaction. Then, the amplification reaction is performed and before or after denaturation from double-stranded to single-stranded. A method for detecting nucleic acid, which comprises removing an oligonucleotide ligation product containing a target nucleic acid sequence complementary to a target nucleic acid sequence labeled by a ligand specific to the labeled ligand from the reaction system.
の鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖と
アニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズ
させた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結さ
せることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核
酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプ
ローブとのハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する請求項１記載の核酸の検出方法において、標的配
列と相補的な配列を含むヌクレオチド鎖断片の添加量
を、これに対応するヌクレオチド鎖断片群の添加量と比
較して相対的に低くして、当該標的配列と相補的な配列
を含むヌクレオチド鎖断片の連結反応による生成量を低
くすることを特徴とする核酸の検出方法。11. A set of two or more sets of oligonucleotide fragments, which are complementary to each of the nucleotide chain and its complementary chain and which are adjacent to each nucleotide chain in an annealed state, are hybridized to the corresponding nucleotide chain. After that, whether or not the target sequence is present in the nucleic acid sample amplified by the gene amplification method characterized in that the oligonucleotide chain fragments are ligated to each other is determined by the presence or absence of the hybridization reaction between the sample nucleic acid and the probe. The method for detecting a nucleic acid according to claim 1, wherein the addition amount of the nucleotide chain fragment containing a sequence complementary to the target sequence is relatively lower than the addition amount of the corresponding nucleotide chain fragment group. And lowering the amount produced by the ligation reaction of a nucleotide chain fragment containing a sequence complementary to the target sequence. Detection methods of nucleic acid.
の鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖と
アニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズ
させた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結さ
せることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅させ、さ
らに増幅された二本鎖断片の一方のヌクレオチド鎖のみ
に相補的な塩基配列を有する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を基に当該一方のヌクレオチド鎖を増幅し
て、この当該一方のヌクレオチド鎖以外のヌクレオチド
鎖の生成量を相対的に低くして、試料核酸とプローブと
のハイブリダイゼーション反応の有無により、核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを検出することを特徴と
する請求項１記載の核酸の検出方法。12. A group of two or more oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and which are adjacent to the respective nucleotide chains in an annealed state are hybridized to the corresponding nucleotide chains. And then amplified by a method for amplifying a gene characterized by ligating the oligonucleotide chain fragments to each other, and two or more pairs having a nucleotide sequence complementary to only one nucleotide chain of the amplified double-stranded fragment Presence or absence of a hybridization reaction between the sample nucleic acid and the probe by amplifying the one nucleotide chain based on the oligonucleotide fragment group of, and relatively reducing the production amount of the nucleotide chain other than the one nucleotide chain. The method according to claim 1, wherein the presence or absence of the target sequence in the nucleic acid sample is detected by The method of detection.
の鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖と
アニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズ
させた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結さ
せることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核
酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプ
ローブとのハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する請求項１記載の核酸の検出方法において、一方の
ヌクレオチド鎖の反応系における存在量を実質的に少な
くするか、又は当該ヌクレオチド鎖が存在しない条件に
する手段が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌ
クレアーゼによる分解であることを特徴とする核酸の検
出方法。13. Hybridizing to a corresponding nucleotide chain two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and which are adjacent to each nucleotide chain in an annealed state. After that, whether or not the target sequence is present in the nucleic acid sample amplified by the gene amplification method characterized in that the oligonucleotide chain fragments are ligated to each other is determined by the presence or absence of the hybridization reaction between the sample nucleic acid and the probe. The method for detecting a nucleic acid according to claim 1, wherein the amount of one of the nucleotide chains in the reaction system is substantially reduced, or the condition in which the nucleotide chain does not exist is a double-stranded nucleic acid. A method for detecting a nucleic acid, characterized in that it is a decomposition by an exonuclease that decomposes only one side.
の鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖と
アニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズ
させた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結さ
せることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核
酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプ
ローブとのハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する請求項１記載の核酸の検出方法において、一方の
ヌクレオチド鎖を反応系から除去する手段がエキソヌク
レアーゼによる反応であり、かつ反応系からの除去を企
図しないヌクレオチド鎖の基となるオリゴヌクレオチド
断片群の一部又は全部にエキソヌクレアーゼ反応に対し
て抵抗性を与える手段を施したことを特徴とする核酸の
検出方法。14. Two or more sets of oligonucleotide fragments which are complementary to the respective nucleotide chains and their complementary strands and which are adjacent to the respective nucleotide chains in an annealed state are hybridized to the corresponding nucleotide chains. After that, whether or not the target sequence is present in the nucleic acid sample amplified by the gene amplification method characterized in that the oligonucleotide chain fragments are ligated to each other is determined by the presence or absence of the hybridization reaction between the sample nucleic acid and the probe. The method for detecting a nucleic acid according to claim 1, wherein the means for removing one of the nucleotide chains from the reaction system is a reaction with an exonuclease, and the oligonucleotide is a group of nucleotide chains not intended to be removed from the reaction system. Hands that make some or all of the fragments resistant to exonuclease reactions Detection methods of nucleic acid, characterized in that subjected to.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4253037A JPH0698797A (en) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | Method for detecting nucleic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4253037A JPH0698797A (en) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | Method for detecting nucleic acid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698797A true JPH0698797A (en) | 1994-04-12 |
Family
ID=17245604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4253037A Pending JPH0698797A (en) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | Method for detecting nucleic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0698797A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004011643A1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleic acid probe immobilization support and method of detecting target nucleic acid using the same |
| US7618066B2 (en) | 2000-03-28 | 2009-11-17 | Giesecke & Devrient Gmbh | Photoengraved printed data carrier |
| JP2010166914A (en) * | 1996-10-08 | 2010-08-05 | Kreatech Biotechnology Bv | Method for labeling nucleotide, labeled nucleotide and useful intermediate |
-
1992
- 1992-09-22 JP JP4253037A patent/JPH0698797A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010166914A (en) * | 1996-10-08 | 2010-08-05 | Kreatech Biotechnology Bv | Method for labeling nucleotide, labeled nucleotide and useful intermediate |
| US7618066B2 (en) | 2000-03-28 | 2009-11-17 | Giesecke & Devrient Gmbh | Photoengraved printed data carrier |
| WO2004011643A1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleic acid probe immobilization support and method of detecting target nucleic acid using the same |
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