JPH07102147B2 - ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作により発現さ
れるヒト血清アルブミンの着色抑制方法に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】アルブミ
ン、特にヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ともい
う。）は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は
肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する
責を負う。また、種々の血清分子のキャリアーとしての
機能を持っている。

【０００３】ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与
され、例えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻
し、それにより外傷に関連するいくつかの症状を改善さ
せるために、ＨＳＡの頻回投与が行われる。また、低蛋
白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者にもＨＳＡに
よる治療を必要とすることがある。このように、ＨＳＡ
を投与する基本的な治療上の意義は、外科手術、ショッ
ク、火傷、浮腫を起こす低蛋白血症におけるがごとく、
血管からの液体の損失がある様な状態を治療する点に存
する。

【０００４】現在、ＨＳＡは、主として血液の分画によ
って製造されているが、この製造法は不経済であり、且
つ血液の供給量に限度があるという問題点がある。ま
た、この方法によって製造されたＨＳＡは、血液由来で
あるため、肝炎ウイルスのように好ましくない物質を含
んでいることがある。従って、ＨＳＡの原料として血液
の代替品を開発することが有益となろう。

【０００５】このような実情下に、遺伝子操作の技術に
よりＨＳＡを大量に得、それを高度精製する方法が確立
されつつある。かくして経済的にＨＳＡを製造すること
ができ、しかもこのようにして得られたＨＳＡは肝炎ウ
イルスのように好ましくない物質を含んでいない。

【０００６】ところが、遺伝子操作においては、宿主で
ある微生物を培養する際、さらにはＨＳＡを精製する際
に、原料中のある種の着色成分あるいは微生物が分泌す
る物質が夾雑してくるため、これがＨＳＡと結合するこ
とによりＨＳＡそのものが着色してしまうものと思われ
る。しかもこれらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡ
の精製方法では充分に除去することはできない。

【０００７】従って、本発明の目的は、遺伝子操作によ
りＨＳＡを得るに際して、培地成分または菌体分泌物に
起因するＨＳＡの着色抑制方法を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる目
的を達成するために種々研究を重ねた結果、遺伝子操作
によりＨＳＡを得るに際して、培養、あるいは当該ＨＳ
Ａの精製工程を特定のアミン化合物の存在下に行うこと
により、遺伝子操作を経て菌体外に産生されるＨＳＡと
着色原因物質とが結合あるいは反応してＨＳＡの着色が
抑制されることを見出し、本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明は培養工程または精製工程
を、特定のアミン化合物の存在下に行うことを特徴とす
る遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブミンの着
色抑制方法に関する。

【００１０】本発明は、遺伝子操作によってＨＳＡを調
製する場合のＨＳＡの着色抑制方法に係わるものであ
り、当該ＨＳＡは遺伝子操作を経てＨＳＡを発現する菌
体（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、麹、動物細胞等）
を培養し、菌体外発現（分泌発現）により産生させる。

【００１１】（ｉ）遺伝子操作によるＨＳＡ産生性宿主
の調製 本発明において用いられるＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子
操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、既
に公知文献記載のものの他今後開発されるものであって
も本発明の目的を達成しえる限り適宜利用することがで
きる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とさ
れた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞
などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主とし
て、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロ
マイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)
〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス
（Pichia pastoris ）〕が使用されることが好ましい。
また、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。
さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリスＧＴ
Ｓ１１５株（his 4)等が好適に用いられる。

【００１２】これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およ
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ
産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法として
は、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方
法（特開昭５８−５６６８４、同５８−９０５１５号公
報）、新規なヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法
（特開昭６２−２９９８５号公報、特開平１−９８４８
６号公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１
−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列
を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換
えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３−７２
８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３
−５３８７７号公報）、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法、変異型ＡＯＸ₂ プロモーターを用いる
方法（特願平３−６３５９８、同３−６３５９９号）、
枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号
公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４
８７、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号公
報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０
４２９０号公報）等が例示される。

【００１３】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ₁ プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培
地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタ
ノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能
な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度として
は、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工
培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１
５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。

【００１４】また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すな
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他にフェッドバッチ培養により、高濃度の
グルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対する
高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方
法（特願平１−２１９５６１号）、培地中に脂肪酸を添
加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−８１７
１９号）等が例示される。さらにＨＳＡの分離採取方法
としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱処
理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１８
８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭
からなる群より選ばれた少なくとも一を用いてＨＳＡと
着色成分を分離することによる着色抑制方法（特開平４
−５４１９８号公報）等が例示される。

【００１５】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。

【００１６】培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前
培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例
えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前
培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間
は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では
３７℃程度が好ましい。

【００１７】かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液ま
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離、精製手段によ
り採取される。

【００１８】（ii）ＨＳＡと着色原因物質との結合また
は反応を抑制する工程 ＨＳＡの着色を抑制する工程は、培養工程中、（培養後
の）精製工程中、またはライン工程（インライン）中に
組み込まれ、培養液、培養上清、粗精製画分、精製画分
等のＨＳＡ含有水溶液中にて行われる。

【００１９】本発明においては、下記特定の化合物の存
在下に上記の処理を行うことによって、培養により発現
されるＨＳＡおよび着色原因物質の両者が互いに結合あ
るいは反応することを抑制する。従って、菌体外発現に
おいては、当該抑制工程は、培養工程中から行うことが
望ましい。着色を抑制するための化合物は、アミン化合
物である。当該アミン化合物としては、アルキルアミン
類、ジアミン類、グアニジン類、ベンズアミジン類、塩
基性アミノ酸、アミノフェニル酢酸が挙げられる。アル
キルアミン類としては炭素数１〜６のものが好ましく、
例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミ
ン、イソプロピルアミン、ブチルアミン等が挙げられ
る。ジアミン類としては、アルキレンジアミン（特に炭
素数１〜６のもの、例えば、メチレンジアミン、エチレ
ンジアミン、プロピレンジアミン等）、Ｎ，Ｎ−ジアル
キルアルキレンジアミン（特にアルキル、アルキレンお
のおの炭素数１〜６のもの、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル
エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン
等）が例示される。グアニジン類としては、グアニジ
ン、アミノグアニジン、フェニルグアニジン等が挙げら
れる。ベンズアミジン類としては、ベンズアミジン、ｐ
−アミノベンズアミジン等が挙げられる。塩基性アミノ
酸としては、リジン、アルギニン等が挙げられる。

【００２０】当該培養工程における着色抑制の処理条件
は、好適には次の通りである。 pH条件：pH４〜９（好適にはpH５〜７）。 アミン化合物の添加量：０．０１〜１０ｗ／ｖ％（好ま
しくは０．１〜１ｗ／ｖ％）。

【００２１】本発明における着色抑制の処理は、ＨＳＡ
の精製工程においておこなってもよい。精製工程として
は、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離
法、透析等の公知の方法が採用される。 当該精製工程における着色抑制の処理条件は、好適には
次の通りである。 pH条件：pH４〜９（好適にはpH５〜７）。 アミン化合物の添加量：０．０１〜１０ｗ／ｖ％（好ま
しくは０．１〜１ｗ／ｖ％）。

【００２２】

【発明の効果】本発明方法により、遺伝子操作により発
現されるＨＳＡの着色の程度が、未処理の場合の１／２
〜１／１０程度に抑えられる。また、ＨＳＡの回収率も
よく、ＨＳＡ本来の性質も全く変化しない。本発明方法
は、培養中または精製工程中に着色抑制物質を添加する
方法であるので、簡便で工業的に効率よく行える。従っ
て、本発明方法により処理されたＨＳＡは、血漿由来の
ＨＳＡと同様に、臨床上有用な医薬品として利用するこ
とができる。

【００２３】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

【００２４】実施例１〜７ (1) 使用菌株：Saccharomyces cerevisiae ＴＭＳ33−
１ｈ４株 特開平３−７２８８９号公報に準じて作成したTMS-33-1
株のヒスチジン要求復帰変異株TMS-33-1h4株を次の要領
で取得した。即ち、TMS-33-1株を非選択培地にて一晩成
育させた後、集菌し、十分洗浄後、選択プレート（即
ち、ヒスチジンを含まない培地からなるプレート）に塗
布する。選択プレートを３０℃にて培養し、生育したヒ
スチジン要求復帰変異候補株よりTMS-33-1h4株を取得し
た。 (2) 培地 ＹＮＢ培地：バクト−イーストナイトロジェンベース
(DIFCO製）６．７ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し除菌
濾過したものと、グルコース（半井化学）２０ｇを蒸留
水に溶解して、９００ｍｌとした後に、オートクレーブ
したものとを混合した。 グルコース−酢酸アンモニウム系合成培地：表１に記
載の組成。

【００２５】

【表１】

【００２６】(3) 培養方法 （前培養）TMS-33-1h4株の適当量を、ＹＮＢ培地を含む
バッフル付き三角フラスコに植菌し、３０℃にて24時間
振盪培養した。 （本培養）前培養液を遠心集菌後、10ｍｌの滅菌水に懸
濁し、グルコース−酢酸アンモニウム系合成培地１００
ｍｌ当たり菌体懸濁液１ｍｌを植菌した。１００ｍｌの
培養液をそれぞれバッフル付き３００ｍｌ容三角フラス
コに分注し、３０℃、125rpm で７０時間振盪培養を行
なった。その際、表２に記載の各種アミン化合物を添加
し、またはコントロールとして無添加の状態で培養を行
なった。

【００２７】(4) 試験例 (培養液中に添加した各種アミ
ン化合物のＨＳＡの着色に及ぼす影響) [i] 培養上清の精製および濃縮 培養終了後、各々の培養液をサンプリングし、15,000rp
m 、５分間遠心して得られた上清の一部を、ＨＳＡ濃度
測定に供した。残部の培養上清（約１００ｍｌ）にブル
ーセルロファイン（生理食塩水で十分洗浄したもの：生
化学工業製）をフィルターケーキとして１ｇ添加し、室
温で２時間アルブミンを吸着させた。アルブミンを吸着
させたブルーセルロファインを、ミニカラムに移し、生
理食塩水で洗浄後３ｍｌの３M チオシアン酸ナトリウム
で溶出を行った。この溶出液を濃縮器〔セントリコン30
(30K) アミコン製〕で濃縮したものを測定用のサンプル
とした。 [ii] ＨＳＡ量の測定 培養上清を用いて逆受身ヒツジ赤血球凝集反応（ＲＰＨ
Ａ）により培養上清中のＨＳＡ濃度を測定し、それより
ＨＳＡ量を求めた。ＨＳＡ量は、標準ＨＳＡ（Miles
製) をコントロールとし、そのＨＳＡ量を１としたとき
の割合で示した。 [iii] 着色度の比較 精製濃縮検体の波長280nm 、350 nmおよび405nm におけ
る吸光度を測定し、350 nmと280nm との比および405 nm
と280nm との比を求め、これらの値を着色度の指標とし
た。 以上の結果を表２に示す。

【００２８】

【表２】

【００２９】実施例８ (1) 使用菌株：実施例１〜７で使用したものと同様であ
る。

【００３０】(2) 培地 バッチ培養用培地：表３に記載の組成。 フィード培養用培地：表４に記載の組成。

【００３１】

【表３】

【００３２】

【表４】

【００３３】(3) 培養方法 （前培養）グリセロール凍結ストック菌株１ｍｌ(OD₅₄₀
=10)をＹＮＢ培地を含むバッフル付き三角フラスコに植
菌し、３０℃にて２４時間振盪培養した。遠心集菌後、
滅菌水に懸濁して４Ｌのバッチ（回分）培養用培地に植
菌した。 （本培養）１０Ｌ容ミニジャーファーメンターを用いて
通気攪拌培養した。通気を１vvmに設定し、攪拌速度は
溶存酸素濃度が１０ppm 以上となるように制御した。pH
は２８％アンモニア水を添加することによりpH５．８に
定値制御した。消泡は消泡剤（アデカノール，旭電化工
業製）を必要に応じて少量添加することで実施した。ま
た、比増殖速度が０．１２となるように制御用プログラ
ムにより流加（フィード）培地４Ｌを添加した。 （培養制御用プログラム）プログラムを用いて培養中の
流加用培地の流加速度を制御した。本プログラムは通
常、比増殖速度が０．１２（１／hr) となるようにフィ
ード培地の流加量を決定するが、培養制御中に溶存酸素
濃度が２以下になった時点で、比増殖速度の設定を０に
して定速度流加培養を行うようにしたものである。 （アミン化合物）アミノグアニジン（和光純薬製、特
級）の濃度が０．６ｗ／ｖ％となるように、バッチ（回
分）培地及びフィード（流加）培地に加えた。また、コ
ントロールとしてアミノグアニジンを添加せずに培養を
行なった。

【００３４】(4) 試験例 （アミン化合物添加のＨＳＡ
産生、着色に及ぼす影響) [i] 菌体濃度の測定 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で適
当に希釈したのち分光光度計（島津製、ＵＶ２４０型）
を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、予め求め
ておいた検量線より乾燥菌体重量を求めた。前述と同様
にしてＨＳＡ濃度の測定および着色度の比較を行なっ
た。但し、サンプル中のＨＳＡ濃度をmg／L で表示し
た。以上の結果を表５に示す。

【００３５】

【表５】

【００３６】０．６ｗ／ｖ％のアミノグアニジン添加条
件下でも培養は順調に推移し、培養７２〜７５時間で菌
体量は１２０ｇ−ＤＣＷ／Ｌ、ＨＳＡ産生量８００mg／
Ｌに達した。すなわち、アミノグアニジンを０．６ｗ／
ｖ％添加しても通常の培養と同様に培養を行うことが可
能であり、しかも得られたＨＳＡの着色度は、通常のも
のの約１／５程度に抑えられた。

【００３７】実施例９〜１１ (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に、ＡＯＸ₁ プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ₁
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。

【００３８】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０⁷ cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％（寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニー
の有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布し
た２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２
０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株
はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すな
わち、このプレートではコロニーが生じるということは
メタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が
得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つ
を適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。

【００３９】(2) 培地 前培養用培地 Bacto-Yeast Nitrogen Base (Difco社) ６．７ｇを水に
溶解し１００mlとした後、除菌濾過した１０×ＹＮＢ、
オートクレーブ滅菌した２０％グルコースおよび滅菌水
を１：１：８（ｖ）に混合して使用した。 本培地用培地 メタノールおよびグリセロールを炭素源とした培地（表
６）に各種アミン化合物を添加し、本培養用培地とした
（ｐＨ６．０）。

【００４０】

【表６】

【００４１】(3) 培養方法 前培養 ２０％グリセロール凍結保存バイアルより１mlを、１０
０mlのＹＮＢブロースに植菌し、バッフル付き３００ml
容三角フラスコ中で３０℃、２４時間振盪培養した。 本培養 前培養液１００mlを遠心集菌後、１０mlの滅菌水に懸濁
し、本培養液５０ml当たり菌体懸濁液０．５mlを植菌し
た。５０mlの培養液をそれぞれバッフル付き３００ml容
三角フラスコに分注し、３０℃で125rpm下120 時間振盪
培養した。

【００４２】各種アミン化合物によるＨＳＡの着色に及
ぼす影響を実施例１〜７と同様な方法で調べた。結果を
表７に示す。

【００４３】

【表７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 竹島 一哉 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 上出 佳永子 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−275695（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−262487（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルキルアミン類、アルキレンジアミン
   およびＮ，Ｎ−ジアルキルアルキレンジアミンよりなる
   ジアミン類、アミノグアニジンおよびフェニルグアニジ
   ンよりなるグアニジン類、ベンズアミジン類、塩基性ア
   ミノ酸、ならびにアミノフェニル酢酸から選ばれたアミ
   ン化合物０．０１〜１０ｗ／ｖ％の存在下に培養工程ま
   たは精製工程を行うことを特徴とする遺伝子操作により
   発現されるヒト血清アルブミンの着色抑制方法。