JPH07103156B2 - 再生骨髄から同定された骨形成成長ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 骨髄切除後に原始骨（primary bone）の小柱が血餅に代
わって髄腔を満たす骨形成相があることはよく知られて
いる。この小柱は次に破骨細胞の吸収を受けて正常な再
生骨髄が生じる。髄腔に於て局在的に骨形成反応がある
だけでなく皮質骨で骨形成の刺激があり、離れた骨格部
位で骨及び軟骨形成が増大する。脛骨髄の切除後癒合の
骨形成相で下顎骨顆についての観察は増大した骨形成の
骨芽細胞の数及び活性共に増加を生じることを示唆し
た。血液循環に放出された後末梢骨形成応答を仲介する
因子が再生骨髄によって局在的に生産されることは提案
されている。バブ（Bab）I.等（1988年）内分泌学第123
巻、345頁、バブ.I.等（1985年）Calcif Tissue Int 第
37巻、551頁。

本発明は再生骨髄が骨形成細胞に作用する成長因子活性
を生じることを確立する。また本発明は、再生骨髄から
同定された（ｉ）骨芽細胞に刺激作用を有し、（ii）生
体内骨形成を促進する新規な骨形成成長ポリペプチドを
提供する。

本発明の新規な骨形成成長ポリペプチドはヒストンH4、
102個のアミノ酸タンパク質及びヒストンH4のフラグメ
ントと配列相同性を有する。カイネ（Kayne）P.S.等、
（1988年）細胞第55巻、27〜39頁、カルチェンホ（Khar
chenho）E.P.等（1987年）Biull.Eksp.Biol.Med.第103
巻（４）、418〜420頁。しかしながらこれらの文献には
本発明の範囲内のポリペプチドを開示しておらず、本発
明のポリペプチドの生物特性はいずれも開示していな
い。

本発明は骨芽細胞に刺激作用を有し（ii）生体内骨形成
を促進する新しく分離した生化学的に純粋なポリペプチ
ド（又はポリペプチド群）を提供する。このポリペプチ
ドは再生骨髄から同定された。本発明はまたポリペプチ
ドを再生骨髄から分離する方法及び骨形成を増大させる
ためにポリペプチドを使用する方法を提供する。本発明
の新規なポリペプチドはスクリーニング手段として及び
骨欠損、骨喪失や骨形成低下を含む病気の予防（preven
tion,prophylaxis）や治療（therapy,treatment）又は
増大した骨形成の恩恵を受ける他の症状に医薬組成物と
して有用である。

骨形成成長ポリペプチド（“OGP"）は再生骨髄から同定
され骨芽細胞に刺激作用し、生体内で骨形成する生化学
的に純粋なポリペプチドである。本明細書で用いられる
OGPは天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、全同族
体、イソ型タンパク質又は遺伝的変異体及び他の全変異
体を含むものとする。OGPの分子量は約500〜2600好適に
は約1000〜1600更に好適には約1525の範囲にある。

OGPは再生（又は癒合）骨髄調整培地（HBMCM）から異な
る３段階で精製し、段階１及び2Aは部分純粋であり、段
階2Bは明らかに均一であった。

本発明は骨形成の有効な促進剤として14−残基ポリペプ
チドを同定する。天然OGPを分離し、切除後骨髄再生中
のラット脛骨から得た骨形成組織によって調整した培地
（HBMCM）から均一性に精製した。精製方法はサイズ排
除クロマトグラフィー、ヘパリン−セファロークロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ク
ロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーからなり、
クロマトグラフィー選択画分は生物活性を示した。

マイトジェン活性（mitogenic activity）の証明に従
い、精製ポリペプチドOGPをアミノ酸配列の自動エドマ
ン分解にかけた。同一配列の合成ポリペプチドは固相ペ
プチド合成によって調製した。合成ポリペプチドOGP（s
OGP）を試験し、骨芽細胞に刺激作用を有することが判
明した。約200〜250gの成体ラットに毎日静脈注射する
と、sOGPは約1pg/ラット／日から約１μg/ラット／日ま
での用量で骨形成を促進した（鉱質付着率として測
定）。

データはOGPが同定された配列の１本のポリペプチドで
あるがOGPの同族体イソ型又は遺伝的変異体の可能性が
いかなる細胞条件にも存在することを示唆する。本発明
はOGPのそのような同族体、イソ型又は遺伝的変異体の
全てを包含するが但し、各々は骨芽細胞に作用し、生体
内で骨形成する。詳細にはOGPの同族体であるポリペプ
チドは表Ａに示されるアミノ酸配列に関して少なくとも
約40％好適には約60％更に好適には少なくとも約75％保
存されたアミノ酸配列を有するものを包含する。

OGPの他の変異体が本発明の範囲内に包含されることは
当業者に理解されるであろう。特にこれは保護性アミノ
酸置換基でのみ分離又は合成OGPと異なるいかなる変異
体をも包含する。このような多くの保存性アミノ酸置換
基はテイラー（Taylor）.W.R.J.Mol.Biol.第188巻、233
頁（1986年）でセットとして述べられている。本出願に
於てOGP又はそのフラグメントは保存性アミノ酸置換、
欠損あるいは他のプロセスによるいずれにせよアミノ酸
配列のそのような変異を包含するが、但し精製後のポリ
ペプチドは骨芽細胞に刺激作用及び生体内骨形成を示
す。OGPのフラグメントはわずか６個以上のアミノ酸の
配列を有する小さなペプチドであり、該配列は表Ａに開
示されるものである。

OGPより大きなポリペプチドも該ポリペプチドが骨芽細
胞に刺激作用を有し、生体内で骨形成するとき本発明の
範囲内に包含され、表Ａに示される一部アミノ酸配列又
はその保存性置換体（conservative substitutions）を
含む。

OGPのアミノ酸配列は次の通りである。

表Ａ Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gl
y-Gly 多くの利用がOGPのアミノ酸配列で作ることができるこ
とは当業者に容易に明らかになるであろう。例えばオリ
ゴヌクレオチドプローブはアミノ酸配列から構成されOG
PをエンコードするcDNAクローンをふるい分けるために
使用することができる。OGPcDNA（ｓ）を含むこれらの
クローンはmRNAを転写するために使用することができ次
に翻訳表現することができる。OGPによるこの研究は遺
伝子工学によって大量のOGPを生産するために又はOGPの
遺伝学を研究して骨形成に於ける細胞の役割を知るため
に使用することができる。

また合成ポリペプチドはOGPの薬理学的性質を改良する
ために生成することができる。これらの合成ペプチドは
メリフィールド（Merrifield）（“固相ペプチド合
成”、酵素学の進歩、第32巻、221〜296頁、1969年）G.
バーナイ（Barnay）及びR.B.メリフィールド“固相ペプ
チド合成”ペプチド第２巻、E.グロス及びJ.メレンホー
ル（Merenhole）編集（1980年）によって開発された固
相ペプチド合成手法によって生成することができる。こ
の方法はカルボキシル末端を有するペプチドを固体支持
体に共有結合させる方法に基づく。望ましいペプチド配
列はカルボキシルからアミノ末端に向かって成長するペ
プチド鎖に１本のアミノ酸を逐次カップリングすること
によって調製される。カップリングは典型的には保護し
た別の潜在的反応基を有してもよい樹脂に結合するアミ
ノ酸のカルボキシル基を活性化することによって達成さ
れる。成長ポリペプチド鎖にアミノ酸を付加した後、ま
た鎖を延長する前に保護基が典型的には除去される。各
アミノ酸がほとんど同じ一連の反応によって結合するた
めに、合成に於て緻密な手順の必要性は最小限となる。
溶解度はペプチドが固体支持体に結合するため合成中主
要な問題ではない。この方法は迅速であり簡単に利用す
ることができる。１回の合成がアミノ末端付近で多方向
に枝分かれしてアミノ末端領域でのみ異なっている多く
の類似体を生成するのでアミノ末端置換基を有する多く
の類似体の合成には非常に便利である。

またアミノ酸配列は骨芽細胞に刺激作用を示し、生体内
で骨形成を示す非ペプチド分の確認のためにスクリーン
又は手段として使用することができるポリペプチドを生
成するために用いることができる。

本発明のポリペプチドはまた骨粗鬆症（又はあらゆる病
因のオステオペニア（osteo−penia））、骨折修復、骨
欠損又は挫傷の癒合、骨内インプラント及び骨補充又は
骨形成の促進を必要とする他の症状の場合に骨形成の促
進に有用である。

本発明のポリペプチドは骨形成の整復並びに上で述べた
他の症状を含む病気の治療又は予防に医薬組成物中に含
めることができる。

本発明のポリペプチドの予防又は治療投与量の程度は勿
論患者の種類（年齢、性別等）治療される症状の種類又
は程度及び本発明の個々のポリペプチドとその投与経路
で異なる。一般に骨形成を促進する用途には日用量は哺
乳動物の体重1kg当り約4pg〜５μｇの範囲にある。

本発明のポリペプチドの有効な投薬量を哺乳動物特にヒ
トに与えるために適当ないかなる投与経路も使用するこ
とができる。例えば口、直腸、局所、非経口、眼、鼻、
舌下、バッカル、静脈内等からの投与を使用することが
できる。投薬形は錠剤、トローチ剤、分散液剤、懸濁液
剤、液剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏、エアロゾル
剤等を含む。該投薬形はまた特にこの目的に設計された
遅放出性充填器具又はこの方式で更に作用させるために
改良した他の形のインプラントを含む。

本発明の医薬組成物は有効成分として本発明のポリペプ
チド又はその医薬的に使用し得る塩を包含し、また医薬
的に使用し得る担体及び任意に他の治療成分も含むこと
ができる。“医薬的に使用し得る塩”という用語は無機
塩基及び有機塩基を含む医薬的に使用し得る無毒性の塩
基から調製した塩を意味する。組成物は口、直腸、眼、
肺、鼻、舌下、皮膚、局所からの投与又は非経口（皮
下、粘膜下、筋肉内、静脈内及び動脈内を含む）投与に
適した組成物を含むが、いかなる場合でも最適な経路は
治療される症状の種類や程度及び有効成分の種類に依存
する。これらは単位投薬形態として、製薬上よく知られ
たいかなる方法によっても調製できることが便利であ
る。

吸入法によって投与するには、本発明のポリペプチドを
エアロゾルの形体で圧力容器又は噴霧器から供給するか
あるいは適当な器具で粉体として吸入されるようなカー
トリッジとして供給するのが便利である。１回に一定量
を吸入（MDI）するエアロゾルの場合の吸入法に好適な
供給系は過フッ化炭化水素推進薬の懸濁液又は溶液とし
て処方することができる。

適当な局所処方は経皮手段、エアロゾル剤、クリーム
剤、軟膏、ローション剤、微粉末散剤等を含む。

実際の使用では本発明のポリペプチドを有効成分として
通常の医薬配合手段により医薬担体と緊密に混和して混
合することができる。担体は投与、例えば経口又は非経
口（静脈内、動脈内を含む）に望ましい調製形態により
種々の形を用いることができる。組成物を経口投薬形に
調製するために経口液状製剤例えば懸濁液剤、エリキシ
ル剤、液剤の場合には水、グリコール類、油類、アルコ
ール類、香味剤、防腐剤、着色剤等、経口固形製剤、例
えば散剤カプセル剤、錠剤の場合にはデンプン、乳糖、
微晶性セルロース、賦形剤、顆粒剤、滑沢剤、結合剤、
崩壊剤のような通常のいかなる医薬媒体も使用すること
ができる。投与が簡単なため、錠剤及びカプセル剤が最
も都合の良い経口投薬単位形であり、この場合、固形の
医薬担体を使用することは明らかである。所望により錠
剤は常法により糖衣又は腸溶皮とすることができる。

上で示した一般の投薬形のほかに本発明のポリペプチド
は制御された放出手段及び／又は供給器具によって投与
することができる。

経口投与に適した本発明の医薬組成物は分離している単
位、例えば各々所定量の有効成分を含むカプセル剤、オ
ブラート包、又は錠剤として粉末又は顆粒剤として又は
水溶液、水分散液、非水媒体溶液又は分散液、水中油型
エマルジョン、油中水型エマルジョンとして供給され
る。このような組成物はいかなる製薬法によって調製し
てもよいが、必ず有効成分と１種以上の必要成分を構成
する担体とを混ぜる行程が含まれる。一般に本組成物
は、有効成分と液体担体又は微粉固体担体又は液体、固
体両担体とを均一に密接に混合し、必要に応じて混合物
を所望の形体に成形することによって調製される。例え
ば錠剤は適宜１種以上の所要成分と共に圧縮又は型には
めて成形することによって調製することができる。圧縮
錠剤は粉体又は粉体等、自由流動性の有効成分を任意の
結合剤、滑沢剤、不活性賦形剤、表面活性剤又は分散性
薬剤と混合し、適当な機械で圧縮成形することによって
調製される。型による錠剤は、粉状の本化合物を不活性
の液状賦形剤で湿らせた混合物を適当な機械で成型する
ことによって得られる。

以下実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例に限定されるものではない。

実施例１（段階１精製） 材料 アルカリ性ホスファターゼ活性のアッセイ用試薬、コラ
ゲナーゼＩ型トリプシン、ダイズトリプシン阻害因子‐
アガロース（STI）、BGJ培地（フィットン‐ジャクソン
修飾）ビタミンＣ、ウシ膵臓インシュリン及びヒト血清
アルブミンはシグマケミカル社から購入した。（セント
ルイスMO）、Ｆ−10（Ham）培地（栄養素混合物）、ウ
シ胎児血清（FCS）、ダルベッコPBS及びペニシリン−ス
トレプトマイシン溶液はギブコ（Gibco）（チャグリン
フォールス、OH）から入手した。［メチル−³H］チミ
ジン（［³H］TdR）（5mCi/ミリモル）はヌクレア リサ
ーチセンタ（ネゲブ、イスラエル）から入手した。セフ
ァデックスＧ−25、セファデックスＧ−75及びヘパリン
−セファロースCL−6Bはファーマシア（アップサラ、ス
ウェーデン）から購入した。ミリポア膜はシュライチャ
ー アンド シュエル（Schleicher＆Schuell）（ダッ
セル、西独）から入手した。血小板由来成長因子（PDG
F）はバイオメディカルテクノロジーズ（ストロウトン
（Stroughton）、MA）から、ヒト組換え体インターロイ
キンＩ−ａ（ILI）はシストロン（パインブルック（pin
e Brook,NJ）から購入した。他の薬品はすべて分析用で
あり、メルクAGが（ダルムスタット（Darmstadt）、西
独）から購入した。組織培養皿はヌンク（ロスキルデ、
デンマーク）から入手した。PDGFに対するウサギポリク
ローナル抗血清はDr.C.H.ヘルジン（アップサラ大学、
スウェーデン）より提供された。

方法 癒合骨髄調整培地（HBMCM）の調製 前述のヘブライ大学（サブラ、イスラエル）血統の各々
400gの雄ラットの肢から脛骨髄を切除した。Bab,I.等
（1985年）、Calcif Tissue Int第37巻、551頁、簡単に
言えば骨幹に直径2mmの穴を隣接面の増殖プレートの大
きさ内であけた。次にその穴に挿入し、強力吸引装置に
取り付けたポリエチレンカニューレを用いて骨髄腔から
組織を除去した。処理した骨を10日後に切開し、骨幹を
縦に分解して骨髄腔にさらした。次に癒合組織を皮質の
骨内膜部から除き、１％（容量／容量）ペニシリン−ス
トレプトマイシンで補足した血清を含まないＦ−10培地
の十分量で洗浄し、同じ培地（１肢からの組織／培地1m
l）で５％CO₂−空気中37℃に於て24時間温置した。次に
培地を集め、25,000xgで30分間遠心分離し、上清を0.45
mm孔サイズミリポア膜により過した。この調製物を粗
HBMCMと呼びそのタンパク質含有量は３〜8mg/mlであっ
た。コールドチミジン、組織培地の成分、及び他の低分
子量混入物を除去するために粗HBMCMを5mM酢酸アンモニ
ウムで平衡にしたセファデックスＧ−25カラムでゲル
過にかけた。標準実験ではタンパク質6mg又は35mgを各
々PD−10又は2.6×70cmカラムに注いだ。画分を5mM酢酸
アンモニウムで溶離し、無効量のタンパク質を含むもの
をプールし、凍結乾燥し、−70℃で貯蔵した。以後の実
験では試料を解凍し、PBSに溶解した。

骨芽細胞に対する成長促進活性の監視 骨芽細胞ラットの骨肉腫細胞（ROS17/2）の培養液でDNA
合成についての作用を調べることによって成長因子活性
（GFA）を監視した。ROS−17/2の貯蔵培養液を10％FCS
を含むＦ−10培地に維持した。異なる調製物のマイトジ
エン作用を研究するために融合培養液をトリプシン処理
し、２×10⁴細胞をＦ−10培地中２cm²培養ウェル（16mm
マルチウェル皿）に接種し、CO₂−空気中37℃で温置し
た。まず６時間の間に培地を２％FCSで補足して細胞の
足場を増加させた。次にこれをPBS中タンパク質溶液と
して加えた試験調製物を含む血清を含まない培地で18時
間温置した。DNA合成率を決定するために培養液に温置
時間の最後の２時間に［³H］TdR1.5mCi/ウェルをパルス
した。このパルスは氷冷却10％（重量／容量）トリクロ
ロ酢酸で２回エタノール−エーテル（3:1、容量／容
量）で洗浄して停止した。細胞層を乾燥した後、トリク
ロロ酢酸不溶物質を0.2M NaOHに溶解し、全放射能を液
体シンチレーション分光測定で算出した。データは成長
因子単位（GFU）として表わした。ROS細胞の増殖が血清
依存性であるため、1Uは一定の実験に於て10％FCSの作
用の1/2と定義した。細胞数は試験調製物に48時間さら
に姉妹培養液で求めた。これはトリプシン処理後、固定
量血球計数器を用いて行なわれた。データは１培養ウェ
ル当りの細胞数として表わした。

HBMCMからGFAの部分精製 加熱効果 タンパク質0.5〜1.0mgを含むHBMCMの1mlアリコートを室
温に放置するか又は56℃に30〜60分間加熱した。また同
様の試料を10分間煮沸に対するGFAの安定性を試験し
た。GFAは煮沸操作に安定であることがわかった（表
１）ので煮沸工程を変性及び25,000xgで45分間遠心分離
して外来性タンパク質を除去するために用いた。

アフィニティークロマトグラフィー ヘパリン−セファロースカラム（0.9×2.5cm床容量）を
製造業者の指示書に従い調製しPBSを充填し、室温に於
て流速0.6ml/分でポンプで送った。0.15MNaCl（PBS）で
平衡状態にあることを示したヘパリン−セファロースバ
ッチ式を用いる予備実験ではGFAが不溶基質に非結合の
ままであった。従ってPBS中煮沸HBMCM30mgを含む2ml試
料をカラムに充填し、PBS24mlで床を洗浄して溶離し
た。溶出液を5mM酢酸アンモニウムに対して24時間透析
し、タンパク質を算定し凍結乾燥した。

ゲル過 次にHBMCM由来因子を精製するために、ヘパリン−セフ
ァロースカラムから回収したタンパク質0.5〜6.0mg/ml
を5mM酢酸アンモニウム1mlに溶解し、同溶液で平衡にし
た1.2×54cmセファデックスＧ−75カラムに注いだ。タ
ンパク質試料を室温で5mM酢酸アンモニウムを用いて流
速0.65ml/分で溶離した。画分1.3mlをタンパク質に対し
て算出し、凍結乾燥した。

トリプシン消化 HBMCM由来因子のタンパク質性を確認するためにヘパリ
ン−セファロース工程後のHBMCMの1mlアリコートをトリ
プシン（トリプシン/HBMCM比1:20重量／重量）と25℃で
温置した。反応を停止して30分後にこの混合液をSTIの
カラム（0.4×1cm）に注いだ。対照は反応混合液にトリ
プシンを存在させないで同様に処理した試料からなるも
のとした。

他の細胞及び器官培養液 HBMCM由来因子の骨形成細胞に対する特異性を研究する
ために、活性調製物を骨芽細胞及び非骨芽細胞胎児ラッ
ト頭蓋冠細胞（FRC細胞）及び非骨形成ラット骨肉腫細
胞（ROS25/1）についてマイトジエン効果を試験した。
培養液をCO₂‐空気中37℃で均一に維持した。全ての実
験に於て試験調製物をPBS中タンパク質溶液として培養
液に加えた。

ROS細胞 ROS25/1細胞を上述したROS17/2細胞と同じプロトコール
を用いて培養試験した。

FRC細胞 21日目のラット胎児の骨壁から得た細胞を一次培養で使
用した。５個の細胞集団をルベン（Luben）等（1976
年）内分泌学第99巻、526頁に記載される方法に従いコ
ラゲナーゼとトリプシンで逐次消化して分離した。集団
１〜２及び３〜５からの細胞をプールし、各々非骨芽細
胞及び骨芽細胞を示した。16mmマルチウェル皿に１ウェ
ル当り３×10⁴細胞で細胞を接種し、10％FCSで補足した
Ｆ−10培地で24時間増殖させた。次に培地を１％FCSの
ものに置き換え、24時間後に調製物及び［³H］TdR1.5mC
i/ウェルを加えた。［³H］TdRのDNAへの取り込みと細胞
数を更に24時間後上述の通り算出した。

胎児マウス長骨 これをソスコルネ（Soscolne）等（1986年）骨第７巻、
41頁に記載される通り行なった。簡単に言えば16日目の
胎児から橈骨及び尺骨を取り除き筋肉及び軟質組織から
分けた。次にこれをビタミンC150mg/mlとヒト血清アル
ブミン4mg/mlで補足した化学的に規定された培地（BGJ,
フィットン−ジャクソン修飾）で培養した。リン酸濃度
を1mMに調節した。個々の骨の原基痕跡の全骨及び骨幹
長を培養開始時に及び48時間後に透過光を用いた解剖顕
微鏡下で直接測定した。全骨あるいは骨幹の延長はこれ
らの測定値の差として計算し、結果は成長因子で処理し
た骨と化学的に規定された培地のみで増殖させた対照間
の比として表わした（T/C比） アルカリ性ホスファターゼ活性 このアッセイのためにROS17/2細胞の培養液から培地を
除去し、細胞をPBSで洗浄し蒸留水にかき集め音波処理
した。酵素活性をアシトン（Ashton）等（1984年）Colc
if Tissue Int第36巻、83頁に記載される通り基質とし
てリン酸ｐ−ニトロフェニルを用いて検定した。結果は
１分／姉妹培養液で計数した10⁶細胞当り放出されたｐ
−ニトロフェノールのミクロモルとして表わした。

タンパク含有量 ブラドフォード（Bradford）（1976年）Anal.Biochem.
第72巻、248頁の方法に従い、タンパク質を定量した。

IL1活性の算定 バラク（Barak）等（1986年）、J.Biol.Response Modif
ies第５巻、362頁に記載される胸腺細胞増殖アッセイを
用いてIL1活性を算定した。

PDGFに対するアッセイ 抗−PDGF抗体中和実験をPDGFに対してウサギで調製した
ポリクロナール抗血清を用いて行なった。PDGF又はHBMC
M由来調製物をROS17/2細胞に抗体を存在させてあるいは
存在させずに加えて［³H］TdR取り込みについて効果を
試験した。

結果 ROS17/2の数及びアルカリ性ホスファターゼ活性につい
て粗HBMCMの作用を確立した。最高稀釈度の粗HBMCM（1:
200）では細胞数が75％減少し、酵素活性が２倍以上増
加した。低稀釈度1:100〜1:10では細胞の数が未処理培
養液に比べて約２倍以上増加し、アルカリ性ホスファタ
ーゼ活性は用量依存性低下を示した。

粗HBMCMをセファデックスＧ−25カラムによるゲル過
にかけたとき約80％の添加タンパク質が無効量（void v
olume）の画分に回収された。マイトジエン活性のほと
んど全て（94％）を含むこれらの画分がカラムから溶離
した。

HBMCMからGFAの部分精製 GFAについて加熱効果 HBMCM由来GFAについての加熱効果を表１に要約する。GF
Uは成長因子単位である。IUは同じ実験で10％FCSの効果
の1/2として定義した。

アフィニティークロマトグラフィー 煮沸HBMCMをヘパリン−セファロースカラムに充填する
と適用したタンパク質の20％がPBSによって溶離され残
りのタンパク質は結合したままであった。PBSによって
溶離された画分に回収されたマイトジエン活性は比活性
が13倍増加した（表２）。またヘパリン−セファロース
工程後GFAの促進は用量応答関係で示されROS17/2細胞の
効果は50ng/ウェルで明らかであった。DNA合成率のピー
ク刺激は0.5μg/ウェルであり、その後低下した。また
ヘパリン−セファロースを用いて得られた調製物は骨芽
細胞FRCに著しいマイトジエン効果があった。ヘパリン
−セファロースカラムから回収した物質をトリプシン消
化にかけたとき、HBMCM由来GFAが95％以上阻害された
（表３）。

セファデックスG75によるゲル過 ROS17/2細胞のDNAへの［³H］TdR取り込みの促進によっ
て表わされたセファデックスG75がカラムからGFAの溶離
状況が確立された。ほとんどのタンパク質及びいくらか
のマイトジエン活性がカラムの無効量近くまで溶離し
た。３本の大きなピークの活性は画分19〜38で溶離し
た。分子量マーカーの溶離位置に基づき、３本のピーク
の分子量推定量は35,000、19,000及び10,000以下であっ
た。

他の細胞及び器官培養液のHBMCM由来調製物の効果 非骨芽細胞ROS25/1細胞はROS17/2細胞と同じ腫瘍から得
たが後者と異なり、これらは骨芽細胞表現型を示さなか
った。特にヘパリン−セファロース工程後に得られたも
のは、ROS17/2細胞に促進したと同じ濃度のROS25/1細胞
培養液でいくらかマイトジエン応答をもたらした。しか
しながら、ROS25/1細胞応答の強さはROS17/2細胞に比較
してかなり小さかった。またHBMCM由来調製物は、非骨
芽細胞FRC細胞（集団１〜２）のDNA合成率について効果
は明らかではなかった。

煮沸HBMCMを胎児橈骨と尺骨の器官培養に加えたとき、
骨幹及び全骨の両延長の増加によって示される増殖の著
しい用量依存性促進があった。ピーク効果は８μg/mlタ
ンパク質濃度で見られた。この濃度に於て骨幹及び全骨
の長さの増加は成長因子を含まない対照の各々約200％
及び250％であった。骨幹と全原基痕跡間の延長の大き
さの差は軟骨性骨端の増殖促進から生じた。煮沸HBMCM
のピーク効果は正のインシュリン対照のほぼ２倍であっ
た。

IL1活性に対する胸腺細胞増殖アッセイ 表４はIL1調製物と異なり、煮沸HBMCMではなくヘパリン
−セファロース工程後に得られた誘導体でもないPHAを
含む培地中で［³H］TdRの胸腺細胞のDNAへの取り込みを
刺激したことを示し、HBMCM由来成長因子がIL1と似てい
ないことを示唆した。

PDGF含有量 ポリクローナル抗−PDGF抗体をROS17/2細胞に加えるとP
DGF−刺激複製を阻害したが煮沸HBMCMとヘパリン−セフ
ァロース工程後に得られた調製物の中間用量で生じたマ
イトジエン効果を減少しなかった。これらの条件下でHB
MCM由来調製物にPDGFの有為量を存在させると抗血清で
試験したときROS細胞増殖の促進が低下するはずであ
る。

実施例２（工程2A精製） 材料及び方法 材料 Ｆ−10（HAM）培地（栄養素混合物）、ウシ胎児血清（F
CS）、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（PBS）及びペニ
シリン−ストレプトマイシン溶液はギブコ（チャグリン
フォールス、OH）から入手した。［メチル−³H］チミジ
ン（［³H］TdR）（５μCi/ミリモル）はヌクレアリサー
チセンター（ネゲブ、イスラエル）から入手した。ヘパ
リン−セファロースCL−6Bはファーマシア（アップサ
ラ、スウェーデン）から購入した。アルカリ性フォスフ
ァターゼアッセイに対する試薬はシグマ（セントルイ
ス、MO）からSDS−PAGEに対する薬品はバイオ−ラド
（リッチモンド、CA）から入手した。形質転換成長因子
β１（TGFβ１）及びβ２（TGFβ２）はＲ＆ｂシステム
ス（ミネアポリス、MN）から入手した。インシュリン様
成長因子Ｉ（IGF−Ｉ）はメルク シャープ アンド
ドーム リサーチ ラボラトリース、ラーウェイ、NJか
ら入手した。他の全ての薬品は分析用であり、メルクAG
（ダルムスタット、西独）から購入した。ラット骨肉腫
（ROS）細胞はDrs.G.A及びS.B.ロダン（メルク シャー
プ アンド ドーム リサーチ ラボラトリース、ウエ
ストポイントPA）から入手した。組織培養皿はヌンク
（ロスキルデ、デンマーク）から入手した。

癒合骨髄調整培地（HBMCM）の調製 前述のハブ、I.等（1988年）内分泌学第123巻、345頁に
より癒合骨髄から調整培地を調製した。簡単に言えば切
除して10日後にラット脛骨の髄腔から組織を分離し、１
％（容量／容量）ペニシリン−ストレプトマイシンで補
足した血清を含まないＦ−10培地中で５％CO₂‐空気中3
7℃で24時間温置した。次に培地を集め、10分間煮沸
し、25,000xgで30分間遠心分離し、0.45μｍ孔サイズミ
リポア膜により過した。

細胞培養液 骨形成ROS17/2細胞の培養液中でDNA合成の効果を試験す
ることによって成長因子活性（GFA）を監視した。要す
るにHBMCM由来調製物及び他の成長因子を血清を含まな
いＦ−10培地中ROS細胞を含む２cm²培養ウェル（16mmマ
ルチウェル皿）に加えた。22時間後、培養液に［³H］Td
R,2μCi/mlをパルスした。２時間後、トリクロロ酢酸不
溶物質の全放射能を液体シンチレーション分光測定で定
量し、データを未処理培養液又は成長因子単位（GFU）
の％として表わした。１単位は一定の実験に於て10％ウ
シ胎児血清効果の1/2として定義した。HBMCM誘導体の骨
形成細胞に対する特異性を算出するために上述のROS17/
2細胞と同じプロトコールを用いて非骨形成ROS25/1細胞
の培養液中で試験した。

アフィニティークロマトグラフィー ヘパリン−セファロースカラム（0.9×25cm床容量）を
製造業者の指示書に従い調製し、PBSで充填し、室温に
於て流速0.5ml/分でポンプで送った。PBS中煮沸HBMCM28
mgを含む2ml試料をカラムに充填し、２段階で溶離し
た。まずヘパリン−セファロース床をPBSで200分間イン
クラチカルに洗浄した。次にリン酸緩衝液pH7.2中0.15
〜1.35M NaClの２段階線状勾配をカラムよりポンプで送
った。勾配速度は段階Ｉ及びII中各々0.015M/分及び0.0
05M/分であった。画分2mlを集め5mM酢酸アンモニウムに
対して24時間透析し、タンパク質を算出し、凍結乾燥し
た。

不活性化実験 約10GFUを含むヘパリン−セファロースピーク活性画分
の試料を水に溶解し、（ａ）5mMジチオスレイトール（D
TT）（ｂ）0.1M HCl（ｃ）PBS対照と37℃で90分間反応
させた。反応は冷所で5mM酢酸アンモニウムを５時間透
析して停止した。

ゲル電気泳動 SDS−PAGEはレムリ、ネイチュア第227巻、680頁（1970
年）に従って1.5mm厚さの10〜18％勾配で行なった。

アルカリ性ホスファターゼ活性 このアッセイのために２％FBSで補足したＦ−10培地でR
OS17/2細胞を48時間増殖させた。最後の24時間の間にこ
の細胞を煮沸あるいは非煮沸調整培地10μg/ml又はヘパ
リン−セファロースピーク活性画分２μg/mlで攻撃し
た。次に培地を培養液から取り除き細胞をPBSで洗浄
し、蒸留水にかき集め音波処理した。酵素活性を基質と
してリン酸ｐ−ニトロフェノールを用いて検定した。こ
の結果は１分／姉妹培養液で計数した10⁶細胞当り放出
されたｐ−ニトロフェニルのミクロモルとして表わし
た。

タンパク質含有量 タンパク質をブラドフォード、Anal.Biochem.第72巻、2
48頁（1976年）の方法に従い定量した。

結果 ROS17/2細胞のDNAへの［³H］TdR取り込みの促進によっ
て表わされるヘパリン−セファロースカラムからGFAの
溶離状況を得た。

３つの大きなピーク、活性、AI,AII及びAIIIはカラムを
PBSでイソクラチカルに洗浄したとき溶離した（表
５）。調製物Ａ−Ｉ及び特にＡ−IIはDTTによる低下及
びHClによる酸性化にかなり安定であった（表６）。

次にＡ−Ｉ及びＡ−IIの両方が還元及び非還元ゲルにつ
いて同様に見えた場合還元に対する耐性をゲル電気泳動
によって確認した。Ａ−IIはゲレの先端近くに移動する
成分及び60〜75KDの2.3の追加成分を含有した。カラム
をNaCl濃度勾配を用いてポンプで送ったときＢ−Ｉ、Ｂ
−II及びＢ−IIIを示す各GFAピークは各々0.3、0.75、
1.2M塩で分割した。調製物Ｂ−IIは還元により不活性化
され（表６）、還元ゲルについて若干55〜80KDバンドを
示した。またＢ−Ｉ及びＢ−IIは各々14及び33KDバンド
を含有した。調製物Ａ−III及びＢ−IIIに回収されたタ
ンパク質の量は不活性化及び電気泳動実験の試験に不十
分であった。

煮沸前の調整培地はROS細胞アルカリ性ホスファターゼ
に影響を及ぼさなかた。調整物Ａ−II、Ｂ−II及びＢ−
IIIは酵素活性をほとんど２倍に刺激した。しかしなが
ら、HBMCMを試験したとき最も高い促進効果が見られた
（300％）。

非骨形成ROS25/1細胞はROS17/2と同じ腫瘍から得られて
いるが後者と異なり骨形成表現型を表わさない。調製物
Ａ−IIはROS25/1細胞のDNAに［³H］TdRの取り込みを刺
激しなかった。Ａ−Ｉはいくらか刺激を示したがROS17/
2細胞の効果の40％だけであった。Ｂ−Ｉは両細胞の種
類で同様の効果を示した。

討論 骨形成相では再生骨髄は骨形成細胞に成長促進活性を生
じる。本結果はHBMCM中の活性がヘパリン−セファロー
スアフィニティークロマトグラフィーによって分離可能
な少なくとも６種の独立した活性に分けられることを示
す。同様に脱石灰化した骨基質から得た成長因子活性は
ヘパリン−セファロースにより分離可能でもあるいくつ
かタンパク質性の種類からなることは証明されている。
HBMCMでの複数のピークは異なった“担体”タンパク質
を有する因子のタンパク質分解又は集合に理論的には起
因するが、これは（ａ）培地を調整次に処理している間
にプロティナーゼ阻害因子の介在物がヘパリン−セファ
ロースからの溶離状況を変えなかったこと、及び（ｂ）
安定性及び標的細胞作用に関して個々のGFAピークの特
性が明らかに異なることのためありそうもない。

実施例３（段階2B:OGPの精製及びアミノ酸配列） 材料 Ｆ−10（HAM）培地（栄養素混合物）及びカナマイシン
スルフェートはグランドアイランド バイオロジカル
（グランドアイランド、NY）から入手した。ウシ胎児血
清（FBS）はハゼルトン/KCバイオロジカルス（レネタK
S）から入手した。［メチル−³H］チミジン（［³H］Td
R）（6.7Ci/ミリモル）はニューイングランド ヌクレ
ア（ボストン、Ma）から購入した。トランス−エポキシ
−スクシニル−ロイシル−アミド（４−グアニジノ）ブ
タン（E64）、ロイペプチン及びペプスタチンはシグマ
ケミカル社（セントルイス、MO）から入手した。ヘパリ
ン−セファロースCL−6B及びセファデックスG25はファ
ーマシア（アップサラ、スウェーデン）から入手した。
組織培養皿はコスター（ケンブリッジ、Ma）の生成物で
ある。

方法 HBMCMからGFAの部分精製 HBMCMを上述の通り（実施例１及び２）調製し、バブI.
等（1988年）内分泌学第123巻、345頁で報告されたプロ
トコールを変更して煮沸及びヘパリン−セファロースク
ロマトグラフィーにより部分精製した。HBMCMを10分間
煮沸し、次に冷却した遠心機で25,000xgに於て45分間遠
心分離した。上清を集め次のプロティナーゼ阻害因子25
μM E64、25μM ロイペプチン及び５μＭペプスタチン
で補足した。また同じプロティナーゼ阻害因子の混合液
をヘパリン−セファロース、ゲル過及びイオン交換工
程（以下参照）から順次回収した調製物に加えた。

アフィニティークロマトグラフィー ヘパリン−セファロースカラム（1.6×24cm床容量）を
製造業者の指示書に従って調製し、リン酸緩衝食塩水
（PBS）で平衡にし、４℃に於て流速0.5ml/分でポンプ
で送った。タンパク質100mgを含む煮沸HBMCMをカラムに
通過させた。次にこのカラムをPBS50mlで洗浄した。次
に回収された調整培地及びPBSをプールし、凍結乾燥し
た。一部処理したGFAを精製に十分な量で蓄積するため
にヘパリン−セファロース工程を繰り返して行なった。

骨形成細胞に於けるGFAの監視 これはペニシリン−ストレプトマイシンをカナマイシン
−スルフェートに置き換えたほかは上述した通り（実施
例１）、骨芽細胞ROS17/2細胞で行なった。この結果はG
FU又はPBS対照の％として表わした。

イオン交換クロマトグラフィー 塩、コールドチミジン及び組織培地の他の成分を除去す
るために、ヘパリン−セファロースカラムから回収した
調製物を少量の水に溶解し、予め充填されたセファデッ
クスG25カラム（PD−10）に通過させた。酢酸アンモニ
ウム（5mM）をカラム平衡及び溶離のために用いた。複
数カラムからの無効量を集め、ROS17/2細胞でGFAを示す
画分をプールし、凍結乾燥した。

イオン交換クロマトグラフィーのために、50mM酢酸ナト
リウム緩衝液（SAB）、pH＝5.0を凍結乾燥物質1ml/1.65
mgタンパク質に加えた。この混合液を10.000xgで15分間
遠心分離し、混合液中タンパク質約85％を含む沈降物を
捨てた。タンパク質0.4〜7.0mgを含む上清試料をウオー
ターズ650 アドバンスド プロテイン ピュリフィケー
ション システム（ミリポア コーポレーション、ミル
フォード、MA）を用いるモノ−S HR 5/5ファーストプロ
テイン液体クロマトグラフィー（FPLC）カチオン交換カ
ラム（ファーマシア、アップサフ、スウェーデン）によ
りクロマトグラフィー処理した。このカラムは３段階で
ｉ開始SABを用いてイソクラチカルに３分iiSAB中０〜1.
0M NaClを用いて30分線状勾配iiiSAB中1.0M NaClを用い
て７分、流速1ml/分でポンプで送った。画分1mlを集
め、タンパク質約30ngを含む試料をGFAに対して検定し
た。各画分の結果はタンパク質を充填せずに同じ操作で
カラムから得られた対応する画分からなるペアの対照試
料の％として表わした。

逆相クロマトグラフィー GFAを示す複数のイオン交換実験からの画分をプール
し、推定全タンパク質含有量18μｇを含む3.2mlをCl/C8
ProRPCHR5/2FPLC逆相カラム（ファーマシア、アップサ
ラ、スウェーデン）に充填した。このカラムを0.1％ト
リフルオロアセテート（TFA）を含む０〜100％アセトニ
トリル勾配を用いて流速0.5ml/分で溶離した。各々0.5m
lの画分を集め、スピードバク（Speedvac）コンセント
レーター（サバント（Savant）、ファーミングデイル
（Farmingdale）NY）で乾燥した。これの前に各画分の1
0μｌアリコートを別々に乾燥しPBSに再溶解し、GFAを
検定した。

アミノ酸配列決定 GFAを示す逆相カラムから回収された画分をプールし、
タンパク質〜30ngを含む試料をオンラインPTH分析計、
モデル120Aを備えた気相プロテイン シークエンサーモ
デル470Aでアミノ酸配列決定用の自動エドマン分解にか
けた（アプライド バイオシステムス社、ホスターシテ
ィー、CA）。

タンパク質含有量 上述の通りタンパク質を定量した（実施例１）。

結果 逆相クロマトグラフィー 逆相クロマトグラフィーの溶離を第１図に示す。タンパ
ク質を２本の小さなピーク（溶離時間27分、36分）及び
１本の大きなピーク（溶離時間45分）で回収した。〜27
％アセトニトリルに対応する溶離時間19〜22分後にGFA
の大きなピークを回収した。

マイトジエン有効画分で回収したタンパク質のアミノ酸
配列（溶離時間19〜22分、第２図）は14残基ペプチド、
分子量1523を示した。この調製物中他の混入ペプチドの
存在は証明されなかった。配列は表Ａに示される。

実施例４ 合成OGPの生物活性 材料 ｔ−Boc−Gly OCH₂−Pam樹脂、Ｎ−Boc保護アミノ酸誘
導体、N,Nジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）、ジイソプロ
ピルエチルアミン（DIEA）、トリフルオロ酢酸（TF
A）、N,Nジメチルホルムアミド（DMF）及びジクロロメ
タン（DCM）はアプライド バイオシステムス社（ホス
ターシティー、CA）から入手した。フッ化水素（HF）は
マテソン（Matheson）（セカクス、NJ）、ｐ−クレゾー
ルはアルドリッヒ ケミカル社（ミルウォーキー、W
I）、セファデックスG15Fはファーマシア（アップサ
ラ、スウェーデン）から購入した。Ｆ−10（HAM）培地
（栄養素混合物）及びカナマイシンスルフェートはグラ
ンド アイランド バイオロジカル（グランドアイラン
ド、NY）から入手し、ウシ胎児血清（FBS）はポリサイ
エンシズ社（ウオーリントン、PA）から入手した。体重
240〜260gの雄のスプラグ−ダウレイラットはタコニッ
クファーム、NYから入手した。アクロマイシン（テトラ
サイクリン塩酸塩）はレダリー（Lederle）（パールリ
バー、NY）、テラマイシン（オキシテトラサイクリン）
はローリッジ−ファイザー（Roerig-Pfizer）（ニュー
ヨーク、NY）から入手した。メチルメタアクリレート包
埋樹脂成分はフィッシャー サイエンティフィック（フ
ェアローン、NJ）の生成物である。

方法 合成OGP（sOGP）の調製 sOGPはアプライド バイオシステムスモデル430A自動ペ
プチドシンセサイザー（アプライド バイオシステムス
社、ホスターシティーCA）を用いてメリフィールド（19
69年）Adv.Enzymol.第32巻、221頁の固相法によって合
成した。この合成は0.5ミリモルのｔ−Boc−Gly−OCH₂
−Pam樹脂（１％架橋、0.78ミリモル/g）で行なった。
アミノ酸誘導体はｔ−ブチルオキシカルボニル（Boc）
基でα−アミノ官能基を保護した。側鎖の保護はArg（T
os）、Lys（２−Cl−Ｚ）、Tyr（２−Br−Ｚ）及びThr
（Ｏ−Bzl）とした。Arg及びGlnのBoc保護誘導体のカッ
プリングはコニグ（Konig）Ｗ、及びゲイガー（Geige
r）Ｒ（1970年）、Chem.Ber.第103巻、788頁のDCC−HOB
T法による。他の全てのアミノ酸誘導体はハゲマイア（H
agemaier）Ｈ及びフランクＨ（1972年）、ホップ−セイ
ラーのZ.Physiol.Chem.第353巻、1973年のDCC仲介プレ
フォーム シンメトリカル アンド ヒドリド法により
結合した。各アミノ酸残基のカップリングは２回繰り返
した。閉塞アミノ末端はDCM中60％TFAで処理して脱保護
した。側鎖を脱保護し、ペプチドはHF方法を用いて樹脂
（樹脂結合ペプチド2.7g）から分離し、この場合アニソ
ール4mlと液体HF36mlの混合液を０℃で75分間用いた。
粗合成ペプチドは50％（容量／容量）酢酸水溶液で溶離
されるセファデックスG15F3×35cmカラムにより部分精
製した。次にプレパク1000モジュール（ミリポア コー
ポレーション、ミルホード、MA）を備えたウオーターズ
デルタプレプ3000高圧液体クロマトグラフィー装置に
より精製を達成した。カートリッジは0.1％TFAを含む５
〜33.5％アセトニトリル勾配を用いて流速100ml/分のポ
ンプで送った。

骨についてsOGPの生体内効果 PBS中sOGP溶液を尾静脈より毎日、８日間で100μl/日／
ラットをラットに投与した。対照動物にはPBS単独又は
逆配列sOGPを有するペプチドを投与した。これらのラッ
トにテトラサイクリンで２回、２日と８日に6mgアクロ
マイシン及びテラマイシン（水中）を各々筋肉注射して
標識した。これらのラットの頸部を脱臼して犠牲にし、
脛骨を分離し、70％エタノールで固定した。次にこの標
本を脱水し、メチルメタクリレートに包埋し、脱石灰化
されてなく染色されていない切片10μｍを蛍光顕微鏡に
かけた。マギスカン相互作用像アナライザー（ジョイス
−レブル（Joyce-Loebl）、ガテスヘッド（Gateshead）
UK）に接続したSITビデオカメラ（デージーMTI、ミシガ
ンシティー、IN）を備えたミクロホト エピフルオレッ
セント ミクロスコープ（ニコン、日本）の480nmフル
オレセインフィルターを用いて蛍光像を記録した。皮質
−骨内膜面及び隣接骨幹端小柱面の測定は×550倍のア
ナライザースクリーンで行なった。二重標識の分離は10
個の顕微鏡視野の二重標識全ゾーン中ライン中央の間の
複数測定値の平均として測定した。鉱質付着率（MAR）
は標識間の時間の１日当りのミクロメーターとして示し
た。

結果 sOGPを８匹に静脈注射すると脛骨の皮質−骨内膜及び骨
幹端小柱両面はMARの増加を示した（第２図）。有効用
量範囲は0.1〜30ng/ラット／日であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は陽イオン交換クロマトグラフィーによって得ら
れたGFAのC1/C8逆相クロマトグラフィーを示す。実線は
ROS17/2細胞培養液に於けるDNA合成率を示す。データは
３回の培養からの平均計数／分である。ピーク領域の全
画分並びに他の全データ点は平均のSD＜10％であった。
点線はタンパク質含有量を示す。 第２図はラット脛骨の皮質骨内膜（ａ）及び骨幹端小柱
（ｂ）面の鉱質付着率（MAR）についてsOGPの効果を示
す。データは４匹（100pgと300py群）又は５匹（他の
群）のラットの１匹当り１脛骨の測定値平均±SDであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/14 14/51 Ｇ０１Ｎ 33/68 (72)発明者 ジヨン ダブリユ．ジヤコブス アメリカ合衆国，18901 ペンシルヴアニ ア，ドイレスタウン，ウエスト コート ストリート 298 (72)発明者 ダン ガジト イスラエル国 92546，イエルサレム，ハ ′パルマツク ストリート 64 (72)発明者 イタイ エー．バブ イスラエル国 92546，イエルサレム，ハ ′パルマツク ストリート 36 (56)参考文献 特開 昭59−190919（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−85300（ＪＰ，Ａ) 米国特許4455256（ＵＳ，Ａ) 「Ｃ．Ｒ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＳＥＲ. Ｄ」Ｖｏｌ．271，Ｎｏ．13，Ｐ．1131〜 1133，1970

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】骨芽細胞に刺激作用し、生体内で骨形成
   し、以下のアミノ酸配列： Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gl
   y-Gly を有する生化学的に純粋な骨形成成長ポリペプチド。
2. 【請求項２】再生骨髄に見い出される請求項１記載のポ
   リペプチド。
3. 【請求項３】再生骨髄から生化学デブリを含まないポリ
   ペプチドを分離することを特徴とする請求項１記載の骨
   形成成長ポリペプチドの製造方法。
4. 【請求項４】骨形成増大用医薬組成物の調製に請求項１
   記載のポリペプチドを使用する方法。
5. 【請求項５】骨芽細胞に刺激作用し、生体内で骨形成す
   る分子の同定方法であって、 （ａ）該分子を請求項１記載のポリペプチドと接触さ
   せ、 （ｂ）骨芽細胞に対する作用及び生体内骨形成を、該分
   子を存在させない場合の作用と比較して、測定すること
   を特徴とする方法。
6. 【請求項６】治療上有効な量の請求項１記載のポリペプ
   チド及び医薬的に使用し得る担体からなる骨形成増大用
   医薬組成物。