JPH07145197A

JPH07145197A - Ｅｔｓ転写因子

Info

Publication number: JPH07145197A
Application number: JP5295393A
Authority: JP
Inventors: Toshio Hirano; 俊夫平野; Koichi Nakajima; 弘一中嶋
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1993-11-25
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 1995-06-06

Abstract

(57)【要約】【目的】遺伝子の転写活性を促進する新規なＥＴＳ転
写因子を提供することにある。【構成】Ｅｔｓファミリー転写因子群の塩基配列をも
とに、よく保存されている部位をプライマーとして使用
し、ＨｅｐＧ２細胞より調製したｍＲＮＡをもとに合成
したｃＤＮＡをもとにＰＣＲ反応を利用し遺伝子増幅を
行う。ＰＣＲ産物の塩基配列を解析し、新規なＥＴＳ転
写因子を得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＲａｓにより活性化され
る新規なＥＴＳ転写因子、それをコードするＤＮＡおよ
び該ＥＴＳ転写因子に対する抗体に関するもので医学の
分野で利用される。

【０００２】

【従来の技術】癌遺伝子Ｅｔｓはトリの赤芽球症を起こ
すレトロウイルスＥ26に見い出されたものである（Nun
n, M.F., et al., Nature, 306, 391, 1983）。Ｅｔｓ
癌原遺伝子をクローニングする過程で多くの遺伝子がＥ
ｔｓと類似した塩基配列をもつことがわかり、Ｅｔｓフ
ァミリーと呼ばれ、Ｅｔｓ-1、ＧＡＢＰα、ＰＵ１、Ｐ
ＥＡ-3など十数種類のものが知られている。これらＥｔ
ｓ遺伝子は、それぞれ発現される組織が異なっているこ
とから組織特異的な機能をもつことが予想され、またヒ
トの特定の腫瘍に見い出される染色体転座の切断部位近
傍に座位することから、これら腫瘍の発症メカニズムと
の関連性に強い関心が払われた（Rao, V.N.et al., Sci
ence, 244, 66, 1989）。

【０００３】その後の研究によって、モロニイマウス肉
腫ウイルスの転写活性を調節する機能を有すること（Gu
nther, C.V. et al., Genes Development, 4, 667, 199
0 ）、Ｔリンパ球抗原受容体を構成するα鎖遺伝子のエ
ンハンサー領域に Ets-1が特異的に結合して、転写を活
性化することが見い出され（Leiden, J.M., Science,25
0, 814, 1990 ）、新しい転写因子として注目された。

【０００４】Ｅｔｓファミリー蛋白質のアミノ酸配列の
特徴は、ｍｙｂ癌遺伝子産物と同じく、トリプトファン
クラスターが存在し、この領域はＥＴＳドメインと呼ば
れＤＮＡ結合部位であることがわかっている。このドメ
インを介し、ＩＬ-2エンハンサー、ポリオーマウイルス
エンハンサー、ＨＴＬＶ-1などが保存するＧＧＡＡ／Ｔ
コアモチーフを認識する。このようにＥｔｓファミリー
は細胞の外からのシグナル、またｆｍｓやｓｒｃなどの
癌遺伝子のシグナルに応じて、多くの遺伝子の転写活性
を促進し細胞の機能に深く関与していることがわかって
きたが、これらＥｔｓファミリーの役割については、い
まだ不明の点が多い。

【０００５】ファイブロブラストをｖ−ｒａｆやｃ−Ｈ
ａ−ｒａｓでトランスフォームすると、ポリオーマウイ
ルスエンハンサーのＥｔｓ結合部位、ＰＥＡ３エレメン
トに結合する蛋白質（Ｅｔｓファミリーと考えられる）
が増加することが知られていた。この蛋白質は蛋白合成
阻害剤存在下においても増加が観察されることから、ｒ
ａｓの下流に位置するｒａｆ−１ Kinase か、またはそ
の下流のＭＡＰ Kinase により直接または間接的にリン
酸化され、活性されたものであろうと考えられた。新規
なＥｔｓ転写因子の解明は、細胞のシグナル伝達機構解
明の道を開くことから、癌細胞の増殖メカニズムを理解
する上でもさらなる解明が望まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明はＲａｓにより
活性化される新規なＥＴＳ転写因子、該転写因子をコー
ドするＤＮＡおよび抗体の提供を目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記現状に鑑み、本発明
者らは新規なＥＴＳ転写因子を探究すべく鋭意研究を行
った。まずこれまで知られているＥｔｓファミリー転写
因子の構造を解析し、よく保存されている塩基配列部位
をプライマーとして選択する。ｍＲＮＡより合成した単
鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、得られた
ＰＣＲ産物の塩基配列を構造解析の結果、公知のＥｔｓ
ファミリーの他に新規なＥＴＳ転写因子（以下、ＰＥＡ
３βと称す）を確認し、本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列を含
有してなる新規なＥＴＳ転写因子ＰＥＡ３β、配列番号
２記載のＰＥＡ３βをコードするＤＮＡを含有してなる
ＤＮＡおよびＰＥＡ３βを抗原とする抗体、に関するも
のである。

【０００８】本発明のＰＥＡ３βはＨａ−ＲａｓやＲａ
ｆ−１により活性の増大がみられることから、上記のＲ
ａｓまたはＲａｓの下流因子で活性化されるＥｔｓファ
ミリーのひとつであり、ＭＡＰ Kinase の基質となりう
る部位が３ケ所、転写活性化部位のプロリンに富む領域
に存在する。Ｅｔｓファミリー転写因子のなかで、広汎
な組織に発現し、かつＲａｓ、Ｒａｆで活性化される因
子はなく、本発明により初めて見い出されたものであ
り、癌細胞の増殖メカニズムの解明、ポリオーマウイル
スのトランスフォームメカニズム解明上重要である。

【０００９】本発明の構成は次の通りである。ＰＥＡ３
βをコードするｃＤＮＡは、例えば、（１）Ｅｔｓファ
ミリー転写因子を産生する細胞からｍＲＮＡを分離し、
（２）該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを合成し、（３）
Ｅｔｓファミリー転写因子群のｃＤＮＡ構造からよく保
存された部分をプライマーとして選択し、上記単鎖ｃＤ
ＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行う、（４）得られた
ＰＣＲ産物を適切なプラスミドに組み込み、それで宿主
を形質転換し、（５）得られたコロニーのＤＮＡ解析を
行って、新規なＥｔｓ転写因子をコードするＤＮＡを選
択し、（６）これをもとに、ヒトｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより全長のＰＥＡ３βｃＤ
ＮＡを含むクローンを得ることができる。

【００１０】ｍＲＮＡ調製用原料としては、Ｅｔｓファ
ミリー転写因子を産生している細胞、例えばヒト肝細胞
変異株ＨｅｐＧ２を使用することができる。ＨｅｐＧ２
からＲＮＡを調製する方法としてはグアニジンチオシア
ネート法（Chirgwin J.M. etal., Biochemistry, 18, 5
294, 1979）などが挙げられる。抽出したＲＮＡをオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてｍＲＮＡを調製す
ることができる。このようにして得られたｍＲＮＡを鋳
型とし、逆転写酵素を用いて、例えばグブラーらの方法
（Gubler, U. at el., Gene, 25, 263, 1983）を用いて
単鎖ｃＤＮＡを合成する。次にＥｔｓファミリー転写因
子群のｃＤＮＡ配列をもとに、よく保存されているＤＮ
Ａ配列部位をプライマーとして選択し、先に得た一本鎖
ｃＤＮＡとプライマーをセットしてＰＣＲ法による遺伝
子増幅を行う。

【００１１】選択されるプライマーとしては、Ｅｔｓフ
ァミリー間でよく保存されている部分であればいずれで
も使用可能であるが、ＥｔｓのＤＮＡ結合ドメインがよ
く保存されている。そのなかで、さらによく保存されて
いる部分の塩基配列をもとにＰＣＲ用プライマーを作製
することが好ましく、さらに好ましくは、５’プライマー（アミノ酸QLWQFLに対応） CGGATCCA (A/G) CT (A/G) TGGCA (G/A) TT (T/C) (T/C)
T ３’プライマー（アミノ酸MNY D/E T/K L/M に対応） GGAATTCA (G/T) C (T/G) T (C/A/G) TC (G/A) TA (G/A)
TTCAT が挙げられる。

【００１２】得られたＰＣＲ産物を適当なベクター、例
えばpBluescript IIに組み込み、これで宿主大腸菌をト
ランスフォームすることによりＰＣＲ産物の部分ライブ
ラリーを得ることができる。ＰＣＲ産物を組込むベクタ
ーとしては大腸菌由来のもの、枯草菌由来のものおよび
ファージなど、宿主細胞内に保持されて複製、増幅され
るものであれば、いずれも用いることができる。プラス
ミドに組み込む方法としては、例えば Maniatis T らの
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
p239, 1982 に記載の方法などが挙げられる。このよう
にして得られたプラスミドは適当な宿主、例えば大腸菌
に導入する方法としては塩化カルシウム法あるいは塩化
カルシウム／塩化ルビジウム法（Molecular Cloning, C
old Spring Harbor Laboratory, p249, 1982）などが挙
げられる。

【００１３】得られたＰＣＲ産物の部分ライブラリーは
Ｅｔｓファミリー因子群を保持するものであるゆえ、例
えば得られた大腸菌コロニーそれぞれについてプラスミ
ドを単離し、塩基配列を解析することにより、公知のＥ
ｔｓファミリー因子かまたは新規な因子であるかを確認
することができる。塩基配列の解析はマキサムギルバー
ト法（Maxam A.M. and Gilbert W., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74, 560、1977）、あるいはジデオキシ法（M
essing J. et al., Nucl. Acids Res., 9, 309, 1981
）などが挙げられる。

【００１４】新規な塩基配列を有するクローンについ
て、この段階では全長の塩基を保有してないが、全構造
解析はこのクローンをもとにしてヒトｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングすることにより解析することがで
きる。ヒトｃＤＮＡライブラリーはＥｔｓファミリー転
写因子群を産生している組織または細胞、例えばヒト胎
盤ｃＤＮＡライブラリー、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２ｃＤ
ＮＡライブラリーなどを使用することができる。

【００１５】ＨｅｐＧ２のｃＤＮＡライブラリーの作製
は常法に準ずればよく、例えば上記の方法でＨｅｐＧ２
よりｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮ
Ａ、次いで二本鎖ＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡをフ
ァージベクターとしてλｇｔ11にHyunthの方法（DNA Cl
oning, A Practical Approach, 1, 49, 1985）などの方
法により組み込む。次いで、このファージベクターを増
殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて
導入し、ＨｅｐＧ２λｇｔ11ライブラリーを得ることが
できる。

【００１６】前記の方法で得られた、新規Ｅｔｓ転写因
子部分塩基を保有するクローンからｃＤＮＡを分離し、
それをプローブとして、ヒトｃＤＮＡライブラリーをコ
ロニーハイブリダイゼーション法（Gene, 10, 63, 198
0）またはプラークハイブリダイゼーション法（Scienc
e, 196, 180, 1977 ）などの方法により、目的とする新
規Ｅｔｓ転写因子ＰＥＡ３βのｃＤＮＡクローンを釣り
上げることができる。これらクローンの塩基配列を前記
と同様の方法により解析し、さらに必要があれば、塩基
配列の決定されたｃＤＮＡの一部を合成し、それをプラ
イマーとして用い、プライマーエクステンション法（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 731, 1979 ）などの方
法によって新しくｃＤＮＡを合成、前記と同様の方法に
より組換ｃＤＮＡのクローニング、塩基配列の解析によ
り新規Ｅｔｓ転写因子の全長ｃＤＮＡを決定確認するこ
とができる。本発明のＰＥＡ３βのｃＤＮＡ配列は配列
番号２に、アミノ酸配列は配列番号１に示した。

【００１７】520 個のアミノ酸からなる本発明のＰＥＡ
３βの構造的特徴は下記のとうりである。Ｅｔｓファミ
リ−転写因子群との構造を比較すると、マウスＥＲ８
１、マウスＰＥＡ３及びヒトＥＦ−１とそれぞれ５９
％、４８％、４８％のホモロジ−を有する。ＰＥＡ３β
のＥＴＳドメインは配列番号１記載のアミノ酸番号 364
-448位に相当し、ＥＲ８１及びＰＥＡ３と９６％のホモ
ロジ−を有する。プロリンに富む領域はアミノ酸番号 1
27-269位にあり、酸性領域（ 36-67位）とともに転写活
性に関与するものと予想される。組織での本因子の発現
について、ヒトのほとんどの組織において 4.0 kb のｍ
ＲＮＡの発現が確認された。

【００１８】本発明のＰＥＡ３βｃＤＮＡは配列番号２
記載の塩基配列に限定されず、配列番号１記載のアミノ
酸をコードするものであればよく、部分的削除、アミノ
酸の交換体、部分的追加なども本発明に含まれる。ま
た、これら塩基配列に基づくアンチセンス体も含まれる
ことは言うまでもない。アミノ酸配列に関しても同様で
ある。

【００１９】新規ＰＥＡ３β組換発現ベクターとその形
質転換体上記記載の方法により得られたＰＥＡ３βｃＤＮＡを適
切なベクターに組み込み、該ベクターを適切な宿主細胞
に移入することにより形質転換体を得ることができる。
これを常法により培養し培養物よりＰＥＡ３βを大量に
生産することができる。ＰＥＡ３βをコードするｃＤＮ
ＡをＰＥＡ３βの発現に適したベクターのプロモーター
下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法に
より再結合して組換発現ベクターを作成することができ
る。使用できるベクターとしては、大腸菌由来のプラス
ミドｐＢＲ322 、ｐＵＣ18、枯草菌由来のプラスミドｐ
ＵＢ110、酵母由来のプラスミドｐＳＨ15、バクテリオ
ファージλｇｔ10、λｇｔ11あるいはＳＶ40などが挙げ
られるが、宿主内で複製、増幅可能なベクターであれば
特に限定されない。プロモーターおよびターミネーター
に関してもＰＥＡ３βをコードする塩基配列の発現に用
いられる宿主に対応したものであれば特に限定されず、
宿主に応じて適切な組み合わせも可能である。

【００２０】このようにして得られた組換発現ベクター
はコンビテント細胞法（J. Mol. Biol., 53, 154, 197
0）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75,1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 22
1, 551, 1983 ）、インビトロパッケージング法（Proc.
Natl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975 ）、ウイルス
ベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に
導入し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸
菌、枯草菌、酵母および動物細胞などが用いられ、得ら
れた形質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養
される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行わ
れ、必要に応じて通気、撹拌が行われる。培養物からの
ＰＥＡ３βの分離・精製は公知の分離・精製法を適宜組
み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法として
は塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過法、電気泳動法、イ
オン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラ
フィー、逆相高速液体クロマトグラフィなどが挙げられ
る。

【００２１】抗体の作成についてＰＥＡ３βを抗原として抗体を作成するポリクローナル
抗体は常法に従い例えばマウス、モルモット、ウサギ等
の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し十
分に免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離し抗Ｐ
ＥＡ３β抗体を作製する。なお、市販のアジュバンドも
使用できる。モノクローナル抗体は公知の方法により作
製しえる。たとえば、ＰＥＡ３βで免疫したマウスの脾
細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により
得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培
養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水から抗
ＰＥＡ３βモノクローナル抗体を調製することができ
る。抗原とするＰＥＡ３βは全アミノ酸構造を有する必
要はなく、部分構造を有するペプチドであってもよく、
またグルタチオントランスフェラ−ゼなどとの融合蛋白
質でもよい。調製法は生物学的手法、化学合成手法いず
れでもよい。これら抗体はヒト生体試料中のＰＥＡ３β
の同定や定量を可能とし、癌を含む疾患の診断への利用
が期待される。ＰＥＡ３βの免疫学的測定法は、公知の
方法に準ずればよく、たとえば蛍光抗体法、受身凝集反
応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施でき
る。

【００２２】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００２３】実施例１（１）ｍＲＮＡの調製１．５×１０⁸ 個のＨｅｐＧ２細胞より Invitrogen 社
の Fast Track mRNAisolation kit を用いて polyA RNA
約 10 μg を得た。

【００２４】（２）部分ＰＥＡ３βｃＤＮＡの合成部分ＰＥＡ３βｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により合成し
た。Ｅｔｓファミリー転写因子においてはＥｔｓＤＮ
Ａ結合ドメインがよく保存されており、その中でさらに
よく保存されている部分の塩基配列をもとに下記のプラ
イマーを合成し使用した。５’プライマー（アミノ酸QLWQFLに対応） CGGATCCA (A/G) CT (A/G) TGGCA (G/A) TT (T/C) (T/C)
T ３’プライマー（アミノ酸MNY D/E T/K L/M に対応） GGAATTCA (G/T) C (T/G) T (C/A/G) TC (G/A) TA (G/A)
TTCAT 方法は 0.1μg のヒト肝ｍＲＮＡとＰＣＲバッファー、
ｄＮＴＰｓ、ＤＴＴそして 25 pmolのオリゴｄＴを合わ
せ、65℃、５分インキュベーションし、その後ＲＮＡsi
n 40 unit, Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ（moloney murine leuke
mia virus-reverse transcriptase ：ＢＲＬ）200 unit
を加え全量25μl とし42℃90分インキュベーションす
る。次いでこの反応物にＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ
ｓ，100 pmolの３’オリゴヌクレオチドプライマー、10
0 pmolの５’オリゴヌクレオチドプライマーをさらに加
えて全量 100μl としＰＣＲを行う。ＰＣＲの条件は
aneal温度37℃で 30 秒、extention 温度72℃で２分、d
enature温度94℃で１分を30サイクルを行い、ＤＮＡを
増幅し、ＰＣＲプロダクトを得た。このＰＣＲ産物を３
％ Nu sieve GTG ゲルにて電気泳動を行い、約 170-200
bp のバンドを切り取り、その一部（１／１０）をテン
プレ−トとして再びＰＣＲを行った。

【００２５】（３）ｐＢＳＫIIへの組み込みと形質転換上記の２回目のＰＣＲプロダクトを、フェノ−ル／クロ
ロホルムで蛋白質を除き、エタノ−ル沈殿した後、制限
酵素 EcoRI, BamHI で切断した。この EcoRI /BamHI フ
ラグメントを低融点アガロ−スで分離し、あらかじめ E
coRI, BamHI で開裂、BAP 処理した pBluescriptII SK
(+)ベクタ−とＴ４ ligase を用いて結合させた。この
プラスミドで大腸菌 E. coli XL-1 Blueを形質転換し
て、約 300個のクローンを得た。これらクローンをジデ
オキシ法（ファルマシア、Ｔ７ sequencing kit ）にて
塩基配列を決定したところ、公知のＥｔｓファミリー転
写因子ＧＡＢＰα、Ｅｔｓ−２の他に、新しい塩基配列
を有するクローンを確認した。この塩基配列は配列番号
２記載のＰＥＡ３βｃＤＮＡの1105-1266 位に相当する
ものであった。

【００２６】（４）ＰＥＡ３βｃＤＮＡクローンの同定・プローブの作製上記の新規の塩基配列を有するクローンをBam Ｈ１、Hi
nd IIIで開裂し、 1.2％アガロースゲルよりＤＮＡ断片
を回収した。このＤＮＡ断片を常法に従い、Klenow enz
yme を用いてα−³²Ｐ−ｄＣＴＰを導入しプローブとし
て使用した。・ｃＤＮＡクローンの同定ＨｅｐＧ２ｃＤＮＡライブラリーよりファージＤＮＡを
トランスファーしたフィルターを作製し（約 3.5×10⁵
クローン）、上記プローブを用いてＤＮＡハイブリダイ
ゼーション法によりスクリーニングしたところ、２つの
陽性クローンを得た。この２つのｃＤＮＡの塩基配列を
決定し、ＰＥＡ３β全ｃＤＮＡを確認した。ＰＥＡ３β
全ｃＤＮＡ配列は配列番号２に示す。このｃＤＮＡを組
み込んだ pBluescript II ＳＫ（＋）により形質転換さ
れたEscherichia coli XL-1 PEA3βは工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成５年１１月２５日付で委託され
ている（委託番号FERM P-13982）。

【００２７】実施例２ｃＤＮＡのＣＯＳ７細胞による発現ｐｃＤベクター（Okayama, H. and P. Berg., Mol. Cel
l. Biol., 3, 280, 1983）はＳＶ40ウイルスのＤＮＡ複
製開始点と初期プロモーターを持ち、このプロモーター
下流にｃＤＮＡを組み込み、ＳＶ40の T antigenを産生
する細胞株ＣＯＳ７（Y. Glutzman, Cell., 23, 175, 1
981 ）に導入すると、この組換えプラスミドの増幅が起
こり、一過性にｃＤＮＡの強い発現が起こる。Full-Len
gth ｃＤＮＡを含むクローンであるｐＢＳＰＥＡ３βよ
りコーディング領域すべてを含む Bam HI-Xho I 断片を
切り出し、Xho I ＋Hind III で開裂したｐｃＤＶ₁ ベ
クター（F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
74, 5463, 1977）とＤＮＡリガーゼと結合してｐｃＤＰ
ＥＡ３βを作製した。この操作によりｃＤＮＡがプロモ
ーター下流に正しい向きに組み込まれた。ｐｃＤＰＥＡ
３βのプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥＡＥ−dextren
法（T. Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82,
68, 1985）により、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし
た形質転換細胞は約１日後よりその培養細胞中にＰＥＡ
３βを産生した。

【００２８】

【発明の効果】本発明の新規ＥＴＳ転写因子ＰＥＡ３β
はｒａｓにより活性化される性質をもつ特異性のある因
子である。癌細胞の増殖メカニズムの解明、ポリオ−マ
ウイルスのトランスフォ−ムメカニズム解明の研究の試
薬として有用である。また該因子の抗体を用いることに
より組織での発現の有無の検定、さらに該因子塩基配列
をもとにしたプロ−ブを持ちいる遺伝子解析への利用
は、臨床の場において診断薬としての応用が期待され
る。

【００２９】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ｈｕｍａｎ細胞の種類：肝臓細胞セルライン：ＨｅｐＧ２配列 Met Asp Gly Phe Tyr Asp Gln Gln Val Pro Phe Met Val Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Arg Ser Glu Glu Cys Arg Gly Arg Pro Val Ile Asp Arg Lys Arg 20 25 30 Lys Phe Leu Asp Thr Asp Leu Ala His Asp Ser Glu Glu Leu Phe Gln 35 40 45 Asp Leu Ser Gln Leu Gln Glu Ala Trp Leu Ala Glu Ala Gln Val Pro 50 55 60 Asp Asp Glu Gln Phe Val Pro Asp Phe Gln Ser Asp Asn Leu Val Leu 65 70 75 80 His Ala Pro Pro Pro Thr Lys Ile Lys Arg Glu Leu His Ser Pro Ser 85 90 95 Ser Glu Leu Ser Ser Cys Ser His Glu Gln Ala Phe Gly Ala Asn Tyr 100 105 110 Gly Glu Lys Cys Leu Tyr Asn Tyr Cys Ala Tyr Asp Arg Lys Pro Pro 115 120 125 Ser Gly Phe Lys Pro Leu Thr Pro Pro Thr Thr Pro Leu Ser Pro Thr 130 135 140 His Gln Asn Pro Leu Phe Pro Pro Pro Gln Ala Thr Leu Pro Thr Ser 145 150 155 160 Gly His Ala Pro Ala Ala Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Pro Ala Pro 165 170 175 Ala Pro His Ser Leu Pro Glu Pro Gly Pro Gln Gln Gln Thr Phe Ala 180 185 190 Val Pro Arg Pro Pro His Gln Pro Leu Gln Met Pro Lys Met Met Pro 195 200 205 Glu Asn Gln Tyr Pro Ser Glu Gln Arg Phe Gln Arg Gln Leu Ser Glu 210 215 220 Pro Cys His Pro Phe Pro Pro Gln Pro Gly Val Pro Gly Asp Asn Arg 225 230 235 240 Pro Ser Tyr His Arg Gln Met Ser Glu Pro Ile Val Pro Ala Ala Pro 245 250 255 Pro Pro Pro Gln Gly Phe Lys Gln Glu Tyr His Asp Pro Leu Tyr Glu 260 265 270 His Gly Val Pro Gly Met Pro Gly Pro Pro Ala His Gly Phe Gln Ser 275 280 285 Pro Met Gly Ile Lys Gln Glu Pro Arg Asp Tyr Cys Val Asp Ser Glu 290 295 300 Val Pro Asn Cys Gln Ser Ser Tyr Met Arg Gly Gly Tyr Phe Ser Ser 305 310 315 320 Ser His Glu Gly Phe Ser Tyr Glu Lys Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp 325 330 335 Asp Thr Cys Val Val Pro Glu Arg Leu Glu Gly Lys Val Lys Gln Glu 340 345 350 Pro Thr Met Tyr Arg Glu Gly Pro Pro Tyr Gln Arg Arg Gly Ser Leu 355 360 365 Gln Leu Trp Gln Phe Leu Val Thr Leu Leu Asp Asp Pro Ala Asn Ala 370 375 380 His Phe Ile Ala Trp Thr Gly Arg Gly Met Glu Phe Lys Leu Ile Glu 385 390 395 400 Pro Glu Glu Val Ala Arg Arg Trp Gly Ile Gln Lys Asn Arg Pro Ala 405 410 415 Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Glu Lys 420 425 430 Gly Ile Met Gln Lys Val Ala Gly Glu Arg Tyr Val Tyr Lys Phe Val 435 440 445 Cys Asp Pro Asp Ala Leu Phe Ser Met Ala Phe Pro Asp Asn Gln Arg 450 455 460 Pro Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Cys His Leu Ser Glu Glu Asp Thr 465 470 475 480 Leu Pro Leu Thr His Phe Glu Asp Ser Pro Ala Tyr Leu Leu Asp Met 485 490 495 Asp Arg Cys Ser Ser Leu Pro Tyr Ala Glu Val Leu Leu Thr Lys Phe 500 505 510 Leu Ser Gly Gly Val Ala Lys Pro 515 520 。

【００３０】配列番号：２配列の長さ：１８００配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ起源生物名：ｈｕｍａｎ細胞の種類：肝臓細胞セルライン：ＨｅｐＧ２配列 ATG GAC GGC TTT TAT GAT CAG CAA GTC CCT TTT ATG GTC CCA GGG AAA 48 Met Asp Gly Phe Tyr Asp Gln Gln Val Pro Phe Met Val Pro Gly Lys 1 5 10 15 TCT CGA TCT GAG GAA TGC AGA GGG CGG CCT GTG ATT GAC AGA AAG AGG 96 Ser Arg Ser Glu Glu Cys Arg Gly Arg Pro Val Ile Asp Arg Lys Arg 20 25 30 AAG TTT TTG GAC ACA GAT CTG GCT CAC GAT TCT GAA GAG CTA TTT CAG 144 Lys Phe Leu Asp Thr Asp Leu Ala His Asp Ser Glu Glu Leu Phe Gln 35 40 45 GAT CTC AGT CAA CTT CAA GAG GCT TGG TTA GCT GAA GCA CAA GTT CCT 192 Asp Leu Ser Gln Leu Gln Glu Ala Trp Leu Ala Glu Ala Gln Val Pro 50 55 60 GAT GAT GAA CAG TTT GTC CCA GAT TTT CAG TCT GAT AAC CTG GTG CTT 240 Asp Asp Glu Gln Phe Val Pro Asp Phe Gln Ser Asp Asn Leu Val Leu 65 70 75 80 CAT GCC CCA CTC CCA ACC AAG ATC AAA CGG GAG CTG CAC AGC CCC TCC 288 His Ala Pro Pro Pro Thr Lys Ile Lys Arg Glu Leu His Ser Pro Ser 85 90 95 TCT GAG CTG TCG TCT TGT AGC CAT GAG CAG GCT TTT GGT GCT AAC TAT 336 Ser Glu Leu Ser Ser Cys Ser His Glu Gln Ala Phe Gly Ala Asn Tyr 100 105 110 GGA GAA AAG TGC CTC TAC AAC TAT TGT GCC TAT GAT AGG AAC CCT CCC 384 Gly Glu Lys Cys Leu Tyr Asn Tyr Cys Ala Tyr Asp Arg Lys Pro Pro 115 120 125 TCT GGG TTC AAG CCA TTA ACC CCT CCT ACA ACC CCC CTC TCA CCC ACC 432 Ser Gly Phe Lys Pro Leu Thr Pro Pro Thr Thr Pro Leu Ser Pro Thr 130 135 140 CAT CAG AAT CCC CTA TTT CCC CCA CCT CAG GCA ACT CTG CCC ACC TCA 480 His Gln Asn Pro Leu Phe Pro Pro Pro Gln Ala Thr Leu Pro Thr Ser 145 150 155 160 GGG CAT GCC CCT GCA GCT GGC CCA GTT CAA GGT GTG GGC CCC GCC CCC 528 Gly His Ala Pro Ala Ala Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Pro Ala Pro 165 170 175 GCC CCC CAT TCG CTT CCA GAG CCT GGA CCA CAG CAG CAA ACA TTT GCG 576 Ala Pro His Ser Leu Pro Glu Pro Gly Pro Gln Gln Gln Thr Phe Ala 180 185 190 GTC CCC CGA CCA CCA CAT CAG CCC CTG CAG ATG CCA AAG ATG ATG CCT 624 Val Pro Arg Pro Pro His Gln Pro Leu Gln Met Pro Lys Met Met Pro 195 200 205 GAA AAC CAG TAT CCA TCA GAA CAG AGA TTT CAG AGA CAA CTG TCT GAA 672 Glu Asn Gln Tyr Pro Ser Glu Gln Arg Phe Gln Arg Gln Leu Ser Glu 210 215 220 CCC TGC CAC CCC TTC CCT CCT CAG CCA GGA GTT CCT GGA GAT AAT CGC 720 Pro Cys His Pro Phe Pro Pro Gln Pro Gly Val Pro Gly Asp Asn Arg 225 230 235 240 CCC AGT TAC CAT CGG CAA ATG TCA GAA CCT ATT GTC CCT GCA GCT CCC 768 Pro Ser Tyr His Arg Gln Met Ser Glu Pro Ile Val Pro Ala Ala Pro 245 250 255 CCG CCC CCT CAG GGA TTC AAA CAA GAA TAC CAT GAC CCA CTC TAT GAA 816 Pro Pro Pro Gln Gly Phe Lys Gln Glu Tyr His Asp Pro Leu Tyr Glu 260 265 270 CAT GGG GTC CCG GGC ATG CCA GGG CCC CCA GCA CAC GGG TTC CAG TCA 864 His Gly Val Pro Gly Met Pro Gly Pro Pro Ala His Gly Phe Gln Ser 275 280 285 CCA ATG GGA ATC AAG CAG GAG CCT CGG GAT TAC TGC GTC GAT TCA GAA 912 Pro Met Gly Ile Lys Gln Glu Pro Arg Asp Tyr Cys Val Asp Ser Glu 290 295 300 GTG CCT AAC TGC CAG TCA TCC TAC ATG AGA GGG GGT TAT TTC TCC AGC 960 Val Pro Asn Cys Gln Ser Ser Tyr Met Arg Gly Gly Tyr Phe Ser Ser 305 310 315 320 AGC CAT GAA GGT TTT TCA TAT GAA AAA GAT CCC CGA TTA TAC TTT GAC 1008 Ser His Glu Gly Phe Ser Tyr Glu Lys Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp 325 330 335 GAC ACT TGT GTT GTG CCT GAG AGA CTG GAA GGC AAA GTC AAA CAG GAG 1056 Asp Thr Cys Val Val Pro Glu Arg Leu Glu Gly Lys Val Lys Gln Glu 340 345 350 CCT ACC ATG TAT CGA GAG GGG CCC CCT TAC CAG AGG CGA GGT TCC CTT 1104 Pro Thr Met Tyr Arg Glu Gly Pro Pro Tyr Gln Arg Arg Gly Ser Leu 355 360 365 CAG CTG TGG CAG TTC CTG GTC ACC CTT CTT GAT GAC CCA GCC AAT GCC 1152 Gln Leu Trp Gln Phe Leu Val Thr Leu Leu Asp Asp Pro Ala Asn Ala 370 375 380 CAC TTC ATT GCC TGG ACA GGT CGA GGC ATG GAG TTC AAG CTG ATA GAA 1200 His Phe Ile Ala Trp Thr Gly Arg Gly Met Glu Phe Lys Leu Ile Glu 385 390 395 400 CCG GAA GAG GTT GCT CGG CGC TGG GGC ATC CAG AAG AAC CGG CCA GCC 1248 Pro Glu Glu Val Ala Arg Arg Trp Gly Ile Gln Lys Asn Arg Pro Ala 405 410 415 ATG AAC TAT GAC AAG CTG AGC CGC TCT CTC CGC TAT TAC TAT GAA AAG 1296 Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Glu Lys 420 425 430 GGC ATC ATG CAG AAG GTG GCT GGA GAG CGA TAC GTC TAC AAA TTT GTC 1344 Gly Ile Met Gln Lys Val Ala Gly Glu Arg Tyr Val Tyr Lys Phe Val 435 440 445 TGT GAC CCA GAT GCC CTC TTC TCC ATG GCT TTC CCG GAT AAC CAG CGT 1392 Cys Asp Pro Asp Ala Leu Phe Ser Met Ala Phe Pro Asp Asn Gln Arg 450 455 460 CCG TTC CTG AAG GCA GAG TCC GAG TGC CAC CTC AGC GAG GAG GAC ACC 1440 Pro Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Cys His Leu Ser Glu Glu Asp Thr 465 470 475 480 CTG CCG CTG ACC CAC TTT GAA GAC AGC CCC GCT TAC CTC CTG GAC ATG 1488 Leu Pro Leu Thr His Phe Glu Asp Ser Pro Ala Tyr Leu Leu Asp Met 485 490 495 GAC CGC TGC ACC AGC CTC CCC TAT GCC GAA GTT TTG CTT ACT AAG TTT 1536 Asp Arg Cys Ser Ser Leu Pro Tyr Ala Glu Val Leu Leu Thr Lys Phe 500 505 510 CTG AGT GGC GGA GTG GCC AAA CCC TAGAGCTAGC AGTTCCCATT CAGGCAAACA 1590 Leu Ser Gly Gly Val Ala Lys Pro 515 520 AGGGCAGTGG TTTTGTTTGT GTTTTTGGTT GTTCCTAAAG CTTGCCCTTT GAGTATTATC 1650 TGGAGAACCC AAGCTGTCTC TGGATTGGCA CCCTTAAAGA CAGATACATT GGCTGGGGAG 1710 TGGGAACAGG GAGGGGCAGA AAACCACCAA AACNAGTGCC TCAACTCTTG ATTCTGATGA 1770 GGTTTCTGGG AAGAGATCAA AATGGAGTCT １８
００

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/574 Ｚ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表わされるアミノ酸配列を
含有してなるＥＴＳ転写因子
【請求項２】請求項１記載のＥＴＳ転写因子をコ−ド
する、配列番号２記載の塩基配列を含有しているＥＴＳ
転写因子ｃＤＮＡ
【請求項３】請求項１記載のＥＴＳ転写因子、または
その部分ペプチドを抗原とする抗体