JPH07163368A - 組換えｄｎａとその組換えｄｎａを含む形質転換体 - Google Patents
組換えｄｎａとその組換えｄｎａを含む形質転換体Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 有用ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現
を人為的に制御できる複製可能な組換えＤＮＡとその組
換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入してなる形
質転換体を提供することにある。 【構成】 ＩＦＮ−αプロモータを連結したプラスミド
ベクターと、ＩＦＮ−α以外のポリペプチドをコードす
るＤＮＡとを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡと、そ
の組換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入してな
る形質転換体を構成とする。
を人為的に制御できる複製可能な組換えＤＮＡとその組
換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入してなる形
質転換体を提供することにある。 【構成】 ＩＦＮ−αプロモータを連結したプラスミド
ベクターと、ＩＦＮ−α以外のポリペプチドをコードす
るＤＮＡとを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡと、そ
の組換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入してな
る形質転換体を構成とする。
Description
【０００１】
【発明の利用分野】この発明は、新規な組換えＤＮＡと
それを含む形質転換体に関するものであり、詳細には、
有用ポリペプチドの発現を人為的に制御し得る組換えＤ
ＮＡと、その組換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に
導入してなる形質転換体に関するものである。
それを含む形質転換体に関するものであり、詳細には、
有用ポリペプチドの発現を人為的に制御し得る組換えＤ
ＮＡと、その組換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に
導入してなる形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術における近年の発達に
は目覚しいものがある。今日では、生体内にごく微量存
在するポリペプチドであっても、組換えＤＮＡ技術を応
用することにより、比較的容易に所望量を製造できるよ
うになってきた。インシュリンやインターフェロン（以
下、「ＩＦＮ」と略記する。）はその典型であり、現
在、それ以外にも多種多様の組換え型ポリペプチドが医
薬品として実用化されていたり臨床試験されている。
は目覚しいものがある。今日では、生体内にごく微量存
在するポリペプチドであっても、組換えＤＮＡ技術を応
用することにより、比較的容易に所望量を製造できるよ
うになってきた。インシュリンやインターフェロン（以
下、「ＩＦＮ」と略記する。）はその典型であり、現
在、それ以外にも多種多様の組換え型ポリペプチドが医
薬品として実用化されていたり臨床試験されている。
【０００３】組換え型ポリペプチドは、通常、ポリペプ
チドをコードするＤＮＡを大腸菌などの宿主微生物に導
入して形質転換体となし、この形質転換体を培養し、そ
の培養物を精製して製造される。この方法は、組換えＤ
ＮＡを入念に構築することにより、比較的容易に高効率
の形質転換体が得られる利点があるものの、微生物がポ
リペプチドをグリコシレートする能力を本来的に欠失し
ていることから、糖鎖を有するポリペプチドは製造でき
ないという欠点がある。ここ数年間の研究により、ある
種のリンホカインやサイトカインにおいては、糖鎖の有
無がその薬効や副作用に重大な影響を及ぼし得ることが
判ってきた。微生物とは違って、哺乳動物由来の宿主細
胞ではグリコシレーションが生理的に起こることから、
最近、斯界においては微生物に代わる宿主としてヒトを
始めとする哺乳動物由来の細胞が見直されつつある。
チドをコードするＤＮＡを大腸菌などの宿主微生物に導
入して形質転換体となし、この形質転換体を培養し、そ
の培養物を精製して製造される。この方法は、組換えＤ
ＮＡを入念に構築することにより、比較的容易に高効率
の形質転換体が得られる利点があるものの、微生物がポ
リペプチドをグリコシレートする能力を本来的に欠失し
ていることから、糖鎖を有するポリペプチドは製造でき
ないという欠点がある。ここ数年間の研究により、ある
種のリンホカインやサイトカインにおいては、糖鎖の有
無がその薬効や副作用に重大な影響を及ぼし得ることが
判ってきた。微生物とは違って、哺乳動物由来の宿主細
胞ではグリコシレーションが生理的に起こることから、
最近、斯界においては微生物に代わる宿主としてヒトを
始めとする哺乳動物由来の細胞が見直されつつある。
【０００４】ところで、宿主に導入したＤＮＡを効率良
く発現させるには、ＤＮＡに強力なプロモータを連結す
る必要がある。これまでにも多種多様のプロモータが考
案されてきており、これらは構成的に発現するものと、
外部刺激により誘導的に発現するものとに大別すること
ができる。一般に、形質転換体においては、宿主に依っ
て、発現したポリペプチドにより障害を起こし、結果的
にＤＮＡの発現効率が低下したり、場合に依っては、全
く発現しなかったり、宿主が死滅することすらある。こ
のことから、ＤＮＡの発現を外部刺激により制御できる
後者のプロモータを使用するのが望ましい。
く発現させるには、ＤＮＡに強力なプロモータを連結す
る必要がある。これまでにも多種多様のプロモータが考
案されてきており、これらは構成的に発現するものと、
外部刺激により誘導的に発現するものとに大別すること
ができる。一般に、形質転換体においては、宿主に依っ
て、発現したポリペプチドにより障害を起こし、結果的
にＤＮＡの発現効率が低下したり、場合に依っては、全
く発現しなかったり、宿主が死滅することすらある。こ
のことから、ＤＮＡの発現を外部刺激により制御できる
後者のプロモータを使用するのが望ましい。
【０００５】外部刺激により誘導的に発現するプロモー
タとしては、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモータ、メタ
ロチオネインプロモータ、熱ショック蛋白質プロモータ
などが知られている。これらプロモータはＤＮＡの発現
を人為的に制御可能ならしめる点で優れているが、全般
的に発現能力が低いうえに、ステロイドホルモン、重金
属、加熱などによる外部刺激を必要とするという問題が
ある。ステロイドホルモンや重金属は生体内においてそ
れぞれ独特の生物作用や毒性を示すことが多く、ヒトへ
の投与を前提とする組換え型ポリペプチドの製造には使
い辛い。加熱による発現誘導は斯かる物質を製造系に加
えない点で優れているが、熱ショック蛋白質プロモータ
の研究は端緒についたばかりであり、未だ、必要にして
充分な発現能力を持つプロモータすら開発されていない
のが現状である。
タとしては、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモータ、メタ
ロチオネインプロモータ、熱ショック蛋白質プロモータ
などが知られている。これらプロモータはＤＮＡの発現
を人為的に制御可能ならしめる点で優れているが、全般
的に発現能力が低いうえに、ステロイドホルモン、重金
属、加熱などによる外部刺激を必要とするという問題が
ある。ステロイドホルモンや重金属は生体内においてそ
れぞれ独特の生物作用や毒性を示すことが多く、ヒトへ
の投与を前提とする組換え型ポリペプチドの製造には使
い辛い。加熱による発現誘導は斯かる物質を製造系に加
えない点で優れているが、熱ショック蛋白質プロモータ
の研究は端緒についたばかりであり、未だ、必要にして
充分な発現能力を持つプロモータすら開発されていない
のが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の目的は、有用ポリペプチドをコードするＤＮＡ
の発現を人為的に制御できる複製可能な組換えＤＮＡを
提供することにある。
の発明の目的は、有用ポリペプチドをコードするＤＮＡ
の発現を人為的に制御できる複製可能な組換えＤＮＡを
提供することにある。
【０００７】この発明のさらに別の目的は、この組換え
ＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入してなる形質転
換体を提供することにある。
ＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入してなる形質転
換体を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を、インターフェロン−αプロモータ（以下、「Ｉ
ＦＮ−αプロモータ」と略記する。）を連結したプラス
ミドベクターと、インターフェロン−α（以下、「ＩＦ
Ｎ−α」と略記する。）以外のポリペプチドをコードす
るＤＮＡとを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより
解決するものである。
課題を、インターフェロン−αプロモータ（以下、「Ｉ
ＦＮ−αプロモータ」と略記する。）を連結したプラス
ミドベクターと、インターフェロン−α（以下、「ＩＦ
Ｎ−α」と略記する。）以外のポリペプチドをコードす
るＤＮＡとを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより
解決するものである。
【０００９】この発明は、前記第二の課題を、上記複製
可能な組換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入し
てなる形質転換体により解決するものである。
可能な組換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入し
てなる形質転換体により解決するものである。
【００１０】
【作用】この発明の組換えＤＮＡは、哺乳動物由来の適
宜宿主細胞に導入して形質転換体とし、その形質転換体
をＩＦＮ−α誘導剤で刺激しながら培養すると、所期の
ポリペプチドを発現する。
宜宿主細胞に導入して形質転換体とし、その形質転換体
をＩＦＮ−α誘導剤で刺激しながら培養すると、所期の
ポリペプチドを発現する。
【００１１】この発明による形質転換体は、ＩＦＮ−α
誘導剤で刺激しながら培養すると、所期のポリペプチド
を産生する。
誘導剤で刺激しながら培養すると、所期のポリペプチド
を産生する。
【００１２】以下、実験例、実施例などに基づきこの発
明を説明するに、この発明の組換えＤＮＡはＩＦＮ−α
プロモータを連結したプラスミドベクターと、ＩＦＮ−
α以外のポリペプチドをコードするＤＮＡとを含んでな
るものである。
明を説明するに、この発明の組換えＤＮＡはＩＦＮ−α
プロモータを連結したプラスミドベクターと、ＩＦＮ−
α以外のポリペプチドをコードするＤＮＡとを含んでな
るものである。
【００１３】ＩＦＮ−αプロモータとは、本来、哺乳動
物の細胞にあって、ＩＦＮ−αをコードするＤＮＡの発
現をプロモートするＤＮＡを意味している。これまで
に、起源の相違する幾つかのＩＦＮ−αプロモータが知
られており、例えば、ヒト由来のＩＦＮ−αプロモータ
（以下、「ＨｕＩＦＮ−αプロモータ」と略記する。）
には、ＨｕＩＦＮ−α２プロモータやＨｕＩＦＮ−α８
プロモータを始めとする２０種類前後のプロモータが存
在する。マウスやラットなどの動物にも類似のプロモー
タが存在し、これらはこの発明においてＨｕＩＦＮ−α
プロモータと同様に使用可能ではあるが、医薬品に配合
してヒトに投与することを前提とするポリペプチドを製
造する場合には、本来、ヒトの体内に存在するＨｕＩＦ
Ｎ−αプロモータを使用するのが望ましい。下記の化２
に、ＨｕＩＦＮ−α２プロモータ（以下、「ｈＩＦＰ」
と略記する。）の５′末端よりの塩基配列を示す。
物の細胞にあって、ＩＦＮ−αをコードするＤＮＡの発
現をプロモートするＤＮＡを意味している。これまで
に、起源の相違する幾つかのＩＦＮ−αプロモータが知
られており、例えば、ヒト由来のＩＦＮ−αプロモータ
（以下、「ＨｕＩＦＮ−αプロモータ」と略記する。）
には、ＨｕＩＦＮ−α２プロモータやＨｕＩＦＮ−α８
プロモータを始めとする２０種類前後のプロモータが存
在する。マウスやラットなどの動物にも類似のプロモー
タが存在し、これらはこの発明においてＨｕＩＦＮ−α
プロモータと同様に使用可能ではあるが、医薬品に配合
してヒトに投与することを前提とするポリペプチドを製
造する場合には、本来、ヒトの体内に存在するＨｕＩＦ
Ｎ−αプロモータを使用するのが望ましい。下記の化２
に、ＨｕＩＦＮ−α２プロモータ（以下、「ｈＩＦＰ」
と略記する。）の５′末端よりの塩基配列を示す。
【００１４】
【化２】
【００１５】ＩＦＮ−αプロモータは、斯界における通
常一般の方法により、哺乳動物の細胞から得ることがで
きる。例えば、白血球やリンパ芽球様細胞などのＩＦＮ
−α産生細胞からゲノムＤＮＡを採取し、精製後、ＰＣ
Ｒ法によりＩＦＮ−αプロモータ領域を含む塩基配列の
プライマーの存在下で遺伝子増幅する。そして、得られ
たＤＮＡ断片を適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡと
なし、大腸菌などの適宜宿主内で増殖させ、培養物から
組換えＤＮＡを採取する。この組換えＤＮＡを適宜制限
酵素で切断すれば、ＩＦＮ−αプロモータ領域を含むＤ
ＮＡ断片が得られる。この発明で使用するプラスミドベ
クターは斯かるＩＦＮ−αプロモータを連結してなるも
のであり、通常、制限酵素とＤＮＡリガーゼを併用して
前述のようなＤＮＡ断片をＩＦＮ−α以外のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡや薬剤耐性遺伝子などと適宜連結
することにより人為的に創製される。
常一般の方法により、哺乳動物の細胞から得ることがで
きる。例えば、白血球やリンパ芽球様細胞などのＩＦＮ
−α産生細胞からゲノムＤＮＡを採取し、精製後、ＰＣ
Ｒ法によりＩＦＮ−αプロモータ領域を含む塩基配列の
プライマーの存在下で遺伝子増幅する。そして、得られ
たＤＮＡ断片を適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡと
なし、大腸菌などの適宜宿主内で増殖させ、培養物から
組換えＤＮＡを採取する。この組換えＤＮＡを適宜制限
酵素で切断すれば、ＩＦＮ−αプロモータ領域を含むＤ
ＮＡ断片が得られる。この発明で使用するプラスミドベ
クターは斯かるＩＦＮ−αプロモータを連結してなるも
のであり、通常、制限酵素とＤＮＡリガーゼを併用して
前述のようなＤＮＡ断片をＩＦＮ−α以外のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡや薬剤耐性遺伝子などと適宜連結
することにより人為的に創製される。
【００１６】この発明で用いるプラスミドベクターは、
組換えＤＮＡや形質転換体をクローニングするための適
宜薬剤耐性遺伝子や、形質転換体の発現効率を高めるた
めの適宜エンハンサーの挿入を妨げない。個々の薬剤耐
性遺伝子としては、例えば、蛋白質合成阻害剤の一種で
あるＧ−４１８への耐性を与えるネオマイシン・アミノ
グリコシド・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（以
下、「ＮｅｏＲ遺伝子」と略記する。）、核酸合成阻害
剤の一種であるメトトレキセートへの耐性を与えるジヒ
ドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（以下、「ｄｈｆｒ遺伝
子」と略記する。）、アンピシリンへの耐性を与えるβ
−ラクタマーゼ遺伝子（以下、「ＡｍｐＲ」と略記す
る。）などが挙げられる。エンハンサーにはＳＶ４０エ
ンハンサー（以下、「ＳＶＥ」と略記する。）が好適で
あり、前記プラスミドベクターｐｈＩＦＰ１はこれら薬
剤耐性形質やエンハンサーをすべて具備しており、この
発明を実施するうえで極めて有用である。なお、プラス
ミドベクターの適所に開始コドンや終止コドンを適宜挿
入し得ることは言うまでもない。
組換えＤＮＡや形質転換体をクローニングするための適
宜薬剤耐性遺伝子や、形質転換体の発現効率を高めるた
めの適宜エンハンサーの挿入を妨げない。個々の薬剤耐
性遺伝子としては、例えば、蛋白質合成阻害剤の一種で
あるＧ−４１８への耐性を与えるネオマイシン・アミノ
グリコシド・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（以
下、「ＮｅｏＲ遺伝子」と略記する。）、核酸合成阻害
剤の一種であるメトトレキセートへの耐性を与えるジヒ
ドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（以下、「ｄｈｆｒ遺伝
子」と略記する。）、アンピシリンへの耐性を与えるβ
−ラクタマーゼ遺伝子（以下、「ＡｍｐＲ」と略記す
る。）などが挙げられる。エンハンサーにはＳＶ４０エ
ンハンサー（以下、「ＳＶＥ」と略記する。）が好適で
あり、前記プラスミドベクターｐｈＩＦＰ１はこれら薬
剤耐性形質やエンハンサーをすべて具備しており、この
発明を実施するうえで極めて有用である。なお、プラス
ミドベクターの適所に開始コドンや終止コドンを適宜挿
入し得ることは言うまでもない。
【００１７】次に、プラスミドベクターに挿入されるＩ
ＦＮ−α以外のポリペプチドをコードするＤＮＡについ
て説明するに、この発明でいうポリペプチドとはＩＦＮ
−α以外のポリペプチド一般を意味し、分子中における
糖鎖の有無がその生物作用や副作用に実質的な影響をも
たらすものも対象となり得る。個々のポリペプチドとし
ては、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子、マクロ
ファージ遊走阻止因子、マクロファージ活性化因子、マ
クロファージ走化性因子、コロニー形成因子、幼若化因
子、インターロイキン２、インターロイキン３、好中球
走化性因子及び白血球遊走阻止因子などのサイトカイ
ン、エリスロポエチン、インシュリン、ソマトスタチ
ン、成長ホルモンなどのポリペプチド、さらには、組織
プラスミノーゲン・アクチベータなどの酵素がその対象
となる。このうちの多くのポリペプチドは、本来、糖鎖
を結合した形態で産生されており、その一部において
は、糖鎖の有無がその生物作用や副作用に実質的な影響
を及ぼすことが知られている。この発明の形質転換体が
産生するＨｕＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子、ヒトエリスロ
ポエチン（以下、「ｈＥＰＯ」と略記する。）などには
有意の糖鎖が結合しており、医薬品に配合してヒトに投
与すると、重篤な副作用を惹起することなく顕著な治療
・予防効果を発揮する。
ＦＮ−α以外のポリペプチドをコードするＤＮＡについ
て説明するに、この発明でいうポリペプチドとはＩＦＮ
−α以外のポリペプチド一般を意味し、分子中における
糖鎖の有無がその生物作用や副作用に実質的な影響をも
たらすものも対象となり得る。個々のポリペプチドとし
ては、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子、マクロ
ファージ遊走阻止因子、マクロファージ活性化因子、マ
クロファージ走化性因子、コロニー形成因子、幼若化因
子、インターロイキン２、インターロイキン３、好中球
走化性因子及び白血球遊走阻止因子などのサイトカイ
ン、エリスロポエチン、インシュリン、ソマトスタチ
ン、成長ホルモンなどのポリペプチド、さらには、組織
プラスミノーゲン・アクチベータなどの酵素がその対象
となる。このうちの多くのポリペプチドは、本来、糖鎖
を結合した形態で産生されており、その一部において
は、糖鎖の有無がその生物作用や副作用に実質的な影響
を及ぼすことが知られている。この発明の形質転換体が
産生するＨｕＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子、ヒトエリスロ
ポエチン（以下、「ｈＥＰＯ」と略記する。）などには
有意の糖鎖が結合しており、医薬品に配合してヒトに投
与すると、重篤な副作用を惹起することなく顕著な治療
・予防効果を発揮する。
【００１８】この発明でいうポリペプチドは、上記のご
ときものである。したがって、この発明でいうＩＦＮ−
α以外のポリペプチドをコードするＤＮＡとは斯かるポ
リペプチド又はその相同変異体をコードするＤＮＡ若し
くはＤＮＡ断片ということになり、通常、ｃＤＮＡの形
態で使用される。ｃＤＮＡは一般に所望量を入手するの
が容易であり、且つ、特別な前処理をすることなくプラ
スミドベクターに挿入できる利点がある。斯かるｃＤＮ
Ａを制限酵素とＤＮＡリガーゼを併用してプラスミドベ
クターに挿入すれば、この発明による組換えＤＮＡが得
られる。この発明による組換えＤＮＡは複製可能であ
り、大腸菌などの微生物を利用して増殖させることによ
り、容易に所望量を得ることができる。
ときものである。したがって、この発明でいうＩＦＮ−
α以外のポリペプチドをコードするＤＮＡとは斯かるポ
リペプチド又はその相同変異体をコードするＤＮＡ若し
くはＤＮＡ断片ということになり、通常、ｃＤＮＡの形
態で使用される。ｃＤＮＡは一般に所望量を入手するの
が容易であり、且つ、特別な前処理をすることなくプラ
スミドベクターに挿入できる利点がある。斯かるｃＤＮ
Ａを制限酵素とＤＮＡリガーゼを併用してプラスミドベ
クターに挿入すれば、この発明による組換えＤＮＡが得
られる。この発明による組換えＤＮＡは複製可能であ
り、大腸菌などの微生物を利用して増殖させることによ
り、容易に所望量を得ることができる。
【００１９】この発明の形質転換体は、前記で説明した
ような組換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入し
てなるものである。宿主細胞には通常一般のものが使用
でき、この発明による組換えＤＮＡを導入でき、且つ、
得られる形質転換体が外部刺激に応じて所期のポリペプ
チドを産生するかぎり、宿主細胞の出所・由来を限定し
ない。一般的な宿主細胞としては、例えば、血球細胞胚
幹細胞、リンパ球、線維芽細胞、卵母細胞及びそれらの
変異細胞などがあり、目的とするポリペプチドと使用す
る組換えＤＮＡの性質・性状等を勘案して適宜選択すれ
ばよい。ただし、ポリペプチドの用途に依っては宿主細
胞の由来を限定せざるを得ないことがあり、例えば、医
薬品に配合してヒトに投与することを前提にするポリペ
プチドの場合には、ヒト由来の宿主細胞を使うのが望ま
しい。個々の宿主細胞としては、例えば、チャイニーズ
・ハムスター由来のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６
１）、急性リンパ芽球性白血病由来のＢＡＬＬ−１細胞
（ＪＣＲＢ００３５７８）やバーキットリンパ腫由来の
ナマルバ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４３２）が挙げら
れ、このうち、ＢＡＬＬ−１細胞を始めとするリンパ芽
球様細胞は高発現効率の形質転換体が容易に得られ、増
殖も容易なことから、大量の有用ポリペプチドを製造す
るのに最適な宿主である。これら宿主細胞にこの発明に
よる組換えＤＮＡを導入するには、例えば、ＤＥＡＥ−
デキストラン法、燐酸カルシウム共沈澱法、エレクトロ
ポレーション、リポフェクション、大腸菌とのプラトプ
ラスト融合、マイクロインジェクション、感染性ウイル
スベクターなど斯界における通常一般の方法が採用でき
る。
ような組換えＤＮＡを哺乳動物由来の宿主細胞に導入し
てなるものである。宿主細胞には通常一般のものが使用
でき、この発明による組換えＤＮＡを導入でき、且つ、
得られる形質転換体が外部刺激に応じて所期のポリペプ
チドを産生するかぎり、宿主細胞の出所・由来を限定し
ない。一般的な宿主細胞としては、例えば、血球細胞胚
幹細胞、リンパ球、線維芽細胞、卵母細胞及びそれらの
変異細胞などがあり、目的とするポリペプチドと使用す
る組換えＤＮＡの性質・性状等を勘案して適宜選択すれ
ばよい。ただし、ポリペプチドの用途に依っては宿主細
胞の由来を限定せざるを得ないことがあり、例えば、医
薬品に配合してヒトに投与することを前提にするポリペ
プチドの場合には、ヒト由来の宿主細胞を使うのが望ま
しい。個々の宿主細胞としては、例えば、チャイニーズ
・ハムスター由来のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６
１）、急性リンパ芽球性白血病由来のＢＡＬＬ−１細胞
（ＪＣＲＢ００３５７８）やバーキットリンパ腫由来の
ナマルバ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４３２）が挙げら
れ、このうち、ＢＡＬＬ−１細胞を始めとするリンパ芽
球様細胞は高発現効率の形質転換体が容易に得られ、増
殖も容易なことから、大量の有用ポリペプチドを製造す
るのに最適な宿主である。これら宿主細胞にこの発明に
よる組換えＤＮＡを導入するには、例えば、ＤＥＡＥ−
デキストラン法、燐酸カルシウム共沈澱法、エレクトロ
ポレーション、リポフェクション、大腸菌とのプラトプ
ラスト融合、マイクロインジェクション、感染性ウイル
スベクターなど斯界における通常一般の方法が採用でき
る。
【００２０】次に、この発明による形質転換体の使用方
法について説明するに、所望するポリペプチドの量にも
依るが、当該形質転換体を使ってポリペプチドを製造す
るには、先ず、形質転換体を増殖させて必要量の形質転
換体を取得し、次に、増殖した形質転換体をＩＦＮ−α
誘導剤で刺激しながら培養してポリペプチドを産生させ
る。
法について説明するに、所望するポリペプチドの量にも
依るが、当該形質転換体を使ってポリペプチドを製造す
るには、先ず、形質転換体を増殖させて必要量の形質転
換体を取得し、次に、増殖した形質転換体をＩＦＮ−α
誘導剤で刺激しながら培養してポリペプチドを産生させ
る。
【００２１】この発明による形質転換体は、斯界におけ
る通常一般の方法により増殖させることができる。例え
ば、培養培地に形質転換体を細胞密度約１×１０5乃至
１×１０7個／ｍｌになるように浮遊させ、必要に応じ
て培養培地を新鮮なものと取換えながら、通常一般の方
法により３７℃前後で約１日乃至１週間培養すると、形
質転換体が約２乃至２００倍に増殖する。リンパ芽球様
細胞を宿主とする形質転換体の増殖は遥かに容易であ
り、例えば、必要に応じてウサギ由来の抗胸腺抗体を注
射して免疫反応を減弱させておいたマウス、ヌードマウ
ス、ヌードラット、ハムスターなどの囓歯類の新生児に
形質転換体を動物１匹当たり約１×１０6乃至１×１０9
個皮下或は腹腔内などに移植する。そして、動物を通常
一般の方法により約２乃至１０週間飼育すると、体内に
形質転換体により腫瘍塊が生じる。この腫瘍塊を採取
し、適宜分散媒中で分散・洗浄後ポリペプチドの製造に
供する。このようにして形質転換体をヒト以外の温血動
物を利用して生体内で増殖させるときには、約２乃至１
０，０００倍の形質転換体を容易に取得することができ
る。なお、ヒト以外の温血動物を利用する増殖方法は、
特公昭５６−５４１５８号公報に詳述されている。
る通常一般の方法により増殖させることができる。例え
ば、培養培地に形質転換体を細胞密度約１×１０5乃至
１×１０7個／ｍｌになるように浮遊させ、必要に応じ
て培養培地を新鮮なものと取換えながら、通常一般の方
法により３７℃前後で約１日乃至１週間培養すると、形
質転換体が約２乃至２００倍に増殖する。リンパ芽球様
細胞を宿主とする形質転換体の増殖は遥かに容易であ
り、例えば、必要に応じてウサギ由来の抗胸腺抗体を注
射して免疫反応を減弱させておいたマウス、ヌードマウ
ス、ヌードラット、ハムスターなどの囓歯類の新生児に
形質転換体を動物１匹当たり約１×１０6乃至１×１０9
個皮下或は腹腔内などに移植する。そして、動物を通常
一般の方法により約２乃至１０週間飼育すると、体内に
形質転換体により腫瘍塊が生じる。この腫瘍塊を採取
し、適宜分散媒中で分散・洗浄後ポリペプチドの製造に
供する。このようにして形質転換体をヒト以外の温血動
物を利用して生体内で増殖させるときには、約２乃至１
０，０００倍の形質転換体を容易に取得することができ
る。なお、ヒト以外の温血動物を利用する増殖方法は、
特公昭５６−５４１５８号公報に詳述されている。
【００２２】このようにして得られた形質転換体は、Ｉ
ＦＮ−α誘導剤で刺激しながら培養すると、細胞内外に
ポリペプチドを産生する。ＩＦＮ−α誘導剤については
特に限定がなく、通常、センダイウイルス、ニューカッ
スル病ウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスや
二本鎖ＲＮＡなどが使用される。ポリペプチドにも依る
が、斯かる誘導剤の存在下で、通常、約３５乃至３７℃
で約１０乃至２０時間培養すると、形質転換体内外にポ
リペプチドが産生する。このとき、適量のＩＦＮ−αを
ＩＦＮ−α誘導剤と同時若しくは逐次作用させると、形
質転換体によるポリペプチドの産生量が著増することが
ある。ポリペプチドや宿主細胞の種類にも依るが、培養
培地に加えるＩＦＮ−α誘導剤の量は、通常、ウイルス
性誘導剤で約０．１乃至５０，０００赤血球凝集単位／
ｍｌ、望ましくは、約１０乃至５００赤血球凝集単位／
ｍｌ、二本鎖ＲＮＡで約１乃至１００μｇ／ｍｌ、望ま
しくは、約１０乃至５０μｇ／ｍｌの範囲にある。ＩＦ
Ｎ−α誘導剤と併用するＩＦＮ−αの量は、通常、約
０．１乃至１０，０００ＩＵ／ｍｌ、望ましくは、約１
００乃至１，０００ＩＵ／ｍｌの範囲にある。ＩＦＮ−
αの量がこれより少ないと効果が現われ難く、一方、こ
の範囲を上回ると、後の精製に影響を及ぼすことがあ
る。このことから、上記範囲をもって最良とした。
ＦＮ−α誘導剤で刺激しながら培養すると、細胞内外に
ポリペプチドを産生する。ＩＦＮ−α誘導剤については
特に限定がなく、通常、センダイウイルス、ニューカッ
スル病ウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスや
二本鎖ＲＮＡなどが使用される。ポリペプチドにも依る
が、斯かる誘導剤の存在下で、通常、約３５乃至３７℃
で約１０乃至２０時間培養すると、形質転換体内外にポ
リペプチドが産生する。このとき、適量のＩＦＮ−αを
ＩＦＮ−α誘導剤と同時若しくは逐次作用させると、形
質転換体によるポリペプチドの産生量が著増することが
ある。ポリペプチドや宿主細胞の種類にも依るが、培養
培地に加えるＩＦＮ−α誘導剤の量は、通常、ウイルス
性誘導剤で約０．１乃至５０，０００赤血球凝集単位／
ｍｌ、望ましくは、約１０乃至５００赤血球凝集単位／
ｍｌ、二本鎖ＲＮＡで約１乃至１００μｇ／ｍｌ、望ま
しくは、約１０乃至５０μｇ／ｍｌの範囲にある。ＩＦ
Ｎ−α誘導剤と併用するＩＦＮ−αの量は、通常、約
０．１乃至１０，０００ＩＵ／ｍｌ、望ましくは、約１
００乃至１，０００ＩＵ／ｍｌの範囲にある。ＩＦＮ−
αの量がこれより少ないと効果が現われ難く、一方、こ
の範囲を上回ると、後の精製に影響を及ぼすことがあ
る。このことから、上記範囲をもって最良とした。
【００２３】産生したポリペプチドは、斯界における通
常一般の方法で精製することができる。例えば、遠心分
離により培養物から形質転換体を除去して得られる培養
上清に硫酸アンモニウムを加えて塩析し、得られる粗ポ
リペプチドを含む沈殿物を、例えば、濃縮、塩析、透
析、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、電気泳動、等電点電気泳動、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの精製方法を適宜組合せて精製す
ればよい。ポリペプチドがＩＦＮや腫瘍壊死因子の場合
には、モノクローナル抗体をリガンドとするアフィニテ
ィークロマトグラフィーが有用であり、最高純度のポリ
ペプチドを最少限の労力とコストで得ることができる。
常一般の方法で精製することができる。例えば、遠心分
離により培養物から形質転換体を除去して得られる培養
上清に硫酸アンモニウムを加えて塩析し、得られる粗ポ
リペプチドを含む沈殿物を、例えば、濃縮、塩析、透
析、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、電気泳動、等電点電気泳動、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの精製方法を適宜組合せて精製す
ればよい。ポリペプチドがＩＦＮや腫瘍壊死因子の場合
には、モノクローナル抗体をリガンドとするアフィニテ
ィークロマトグラフィーが有用であり、最高純度のポリ
ペプチドを最少限の労力とコストで得ることができる。
【００２４】斯くして得られたポリペプチドには、宿主
内におけるＤＮＡ発現後の修飾により有意の糖鎖が付加
されている。このことから、この発明は組換えＤＮＡ技
術により、天然型ポリペプチドにより近い性質・性状の
ポリペプチドを与えるものといえる。
内におけるＤＮＡ発現後の修飾により有意の糖鎖が付加
されている。このことから、この発明は組換えＤＮＡ技
術により、天然型ポリペプチドにより近い性質・性状の
ポリペプチドを与えるものといえる。
【００２５】以下、２〜３の実施例に基づき、この発明
による組換えＤＮＡ及び形質転換体を具体的に説明す
る。なお、以下の実施例で用いた手法自体は斯界におけ
る普通一般のものであり、例えば、サムブルック等『モ
レキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュ
アル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・
ハーバー社発行やアウスベル等『カレント・プロトコー
ルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー』、１９９０
年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社発行などにも
詳述されている。
による組換えＤＮＡ及び形質転換体を具体的に説明す
る。なお、以下の実施例で用いた手法自体は斯界におけ
る普通一般のものであり、例えば、サムブルック等『モ
レキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュ
アル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・
ハーバー社発行やアウスベル等『カレント・プロトコー
ルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー』、１９９０
年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社発行などにも
詳述されている。
【００２６】
【実施例１ ｈＥＰＯをコードするＤＮＡを含む組換え
ＤＮＡ】本例では、ＩＦＮ−α以外のポリペプチドとし
てｈＥＰＯをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡの１
例を示す。本例の組換えＤＮＡは、ｈＥＰＯをコードす
るｃＤＮＡをプラスミドベクターｐｈＩＦＰ１に挿入し
て創製したものであり、ヒトリンパ芽球様細胞を始めと
する哺乳動物由来の宿主細胞に容易に導入でき、外部刺
激に応答して高い発現効率を発揮するものである。
ＤＮＡ】本例では、ＩＦＮ−α以外のポリペプチドとし
てｈＥＰＯをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡの１
例を示す。本例の組換えＤＮＡは、ｈＥＰＯをコードす
るｃＤＮＡをプラスミドベクターｐｈＩＦＰ１に挿入し
て創製したものであり、ヒトリンパ芽球様細胞を始めと
する哺乳動物由来の宿主細胞に容易に導入でき、外部刺
激に応答して高い発現効率を発揮するものである。
【００２７】
【実施例１−１ プラスミドベクターｐｈＩＦＰ１の調
製】プラスミドベクターｐｈＩＦＰ１は、ｈＩＦＰ領域
を含む５０８塩基対からなるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ Ｄ
ＮＡ断片、ヒトβ−グロビンイントロン領域を含む８４
０塩基対からなるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片、Ｓ
Ｖ４０ウイルス由来のポリアデニル化シグナル領域（以
下、「ｐｏｌｙ（Ａ）領域」と略記する。）を含む３２
０塩基対からなるＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片、
Ｍ１３ファージの複製開始点（以下、「Ｍ１３」と略記
する。）含む４６７塩基対からなるＢａｍＨＩ−Ｐｖｕ
ＩＩ ＤＮＡ断片、ＮｅｏＲ遺伝子を含む１，４８７塩
基対からなるＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片、大
腸菌における複製開始点（以下、「ＯＲＩ」と略記す
る。）とＡｍｐＲ遺伝子を含む２，２３０塩基対からな
るＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片、ｄｈｆｒ遺伝
子を含む１，９０７塩基対からなるＢａｍＨＩ−Ｐｖｕ
ＩＩ ＤＮＡ断片、２７７塩基対からなるＮｒｕＩ−Ｎ
ｄｅＩ ＤＮＡ断片、２１４塩基対からなるＮｄｅＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片及びＳＶＥ遺伝子が３個直
列に連結した６８４塩基対からなるＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片をこの順序で連結して創製したも
のである。図１にプラスミドベクターｐｈＩＦＰ１の構
造を示す。以下、これらＤＮＡ断片の調製例について説
明する。
製】プラスミドベクターｐｈＩＦＰ１は、ｈＩＦＰ領域
を含む５０８塩基対からなるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ Ｄ
ＮＡ断片、ヒトβ−グロビンイントロン領域を含む８４
０塩基対からなるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片、Ｓ
Ｖ４０ウイルス由来のポリアデニル化シグナル領域（以
下、「ｐｏｌｙ（Ａ）領域」と略記する。）を含む３２
０塩基対からなるＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片、
Ｍ１３ファージの複製開始点（以下、「Ｍ１３」と略記
する。）含む４６７塩基対からなるＢａｍＨＩ−Ｐｖｕ
ＩＩ ＤＮＡ断片、ＮｅｏＲ遺伝子を含む１，４８７塩
基対からなるＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片、大
腸菌における複製開始点（以下、「ＯＲＩ」と略記す
る。）とＡｍｐＲ遺伝子を含む２，２３０塩基対からな
るＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片、ｄｈｆｒ遺伝
子を含む１，９０７塩基対からなるＢａｍＨＩ−Ｐｖｕ
ＩＩ ＤＮＡ断片、２７７塩基対からなるＮｒｕＩ−Ｎ
ｄｅＩ ＤＮＡ断片、２１４塩基対からなるＮｄｅＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片及びＳＶＥ遺伝子が３個直
列に連結した６８４塩基対からなるＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片をこの順序で連結して創製したも
のである。図１にプラスミドベクターｐｈＩＦＰ１の構
造を示す。以下、これらＤＮＡ断片の調製例について説
明する。
【００２８】
【実施例１−１（ａ） ｈＩＦＰ領域を含むＤＮＡ断片
の調製】常法により増殖させたＢＡＬＬ−１細胞を約１
×１０8個とり、冷ＰＢＳで洗浄後、冷ＴＮＥ100中、穏
やかに撹拌しながらプロテイナーゼＫ及びＳＤＳを作用
させた。反応物を５０℃で１５時間インキュベートした
後、フェノール／クロロホルム混液で洗浄し、ＴＥ液に
対して透析後、透析内液にリボヌクレアーゼを適量加
え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、適
量のＳＤＳとプロテイナーゼＫを加え、３７℃でさらに
３時間インキュベートし、フェノール／クロロホルム混
液で洗浄し、ｎ−ブタノールで濃縮後、ＴＥ液に対して
透析して精製ゲノムＤＮＡを得た。
の調製】常法により増殖させたＢＡＬＬ−１細胞を約１
×１０8個とり、冷ＰＢＳで洗浄後、冷ＴＮＥ100中、穏
やかに撹拌しながらプロテイナーゼＫ及びＳＤＳを作用
させた。反応物を５０℃で１５時間インキュベートした
後、フェノール／クロロホルム混液で洗浄し、ＴＥ液に
対して透析後、透析内液にリボヌクレアーゼを適量加
え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、適
量のＳＤＳとプロテイナーゼＫを加え、３７℃でさらに
３時間インキュベートし、フェノール／クロロホルム混
液で洗浄し、ｎ−ブタノールで濃縮後、ＴＥ液に対して
透析して精製ゲノムＤＮＡを得た。
【００２９】別途、常法により、化２に示すｈＩＦＰ遺
伝子を含む塩基配列の下記表１又は表２に示すプライマ
ー１及びプライマー２を化学合成し、これらプライマー
の存在下で精製ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法により遺伝子増
幅することにより、ｈＩＦＰ領域を含む約５００塩基対
からなるＤＮＡ断片を得た。常法により、このＤＮＡ断
片にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを作用させて両末端を平
滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限酵
素ＨｉｎｃＩＩで処理しておいたプラスミドベクターｐ
ＵＣ１８（ＡＴＣＣ ３７２５３）に挿入した。得られ
た組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＨＢ
１０１株（ＡＴＣＣ ３３６９４）に導入し、その後、
大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培
養物を遠心分離して菌体を採取し、通常一般方法により
組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡの一部をとり、
挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法により
調べたところ、化２に示す塩基配列を含んでいた。その
後、組換えＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで
消化し、精製することにより、ｈＩＦＰ領域を含む５０
８個の塩基対からなるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断
片を得た。
伝子を含む塩基配列の下記表１又は表２に示すプライマ
ー１及びプライマー２を化学合成し、これらプライマー
の存在下で精製ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法により遺伝子増
幅することにより、ｈＩＦＰ領域を含む約５００塩基対
からなるＤＮＡ断片を得た。常法により、このＤＮＡ断
片にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを作用させて両末端を平
滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限酵
素ＨｉｎｃＩＩで処理しておいたプラスミドベクターｐ
ＵＣ１８（ＡＴＣＣ ３７２５３）に挿入した。得られ
た組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＨＢ
１０１株（ＡＴＣＣ ３３６９４）に導入し、その後、
大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培
養物を遠心分離して菌体を採取し、通常一般方法により
組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡの一部をとり、
挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法により
調べたところ、化２に示す塩基配列を含んでいた。その
後、組換えＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで
消化し、精製することにより、ｈＩＦＰ領域を含む５０
８個の塩基対からなるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断
片を得た。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
【実施例１−１（ｂ） ヒトβ−グロビンイントロン領
域を含むＤＮＡ断片の調製】エス・エル・セイン等が
『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー』、第８７
巻、第３９２４〜３９２８頁（１９９０年）に報告して
いるヒトβ−グロビンイントロンの塩基配列に基づき、
そのＢ領域を挟みこむ下記の表３又は表４に示す塩基配
列のプライマー３及びプライマー４を化学合成した。次
いで、実施例１−１（ａ）で得たＢＡＬＬ−１細胞由来
の精製ゲノムＤＮＡの一部をとり、これをプライマー３
及びプライマー４を用いた以外は実験例１−１（ａ）と
同様に遺伝子増幅してヒトβ−グロビンイントロン領域
を含む約８５０塩基対のＤＮＡ断片を得た。常法によ
り、ＤＮＡ断片の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで
平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限
酵素ＨｉｎｃＩＩで切断しておいたストラタジーン・ク
ローニング・システム社製プラスミドベクター『ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）』に挿入して組換えＤＮ
Ａとなし、これを実験例１−１（ａ）と同様にして大腸
菌ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた後、分離・精製し
た。組換えＤＮＡの一部をとり、挿入したＤＮＡ断片の
塩基配列をジデオキシ法により分析したところ、セイン
等が報告している塩基配列を含んでいた。その後、組換
えＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩで消化し、精
製することにより、ヒトβ−グロビンイントロン領域を
含む８４０塩基対からなるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ
断片を得た。
域を含むＤＮＡ断片の調製】エス・エル・セイン等が
『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー』、第８７
巻、第３９２４〜３９２８頁（１９９０年）に報告して
いるヒトβ−グロビンイントロンの塩基配列に基づき、
そのＢ領域を挟みこむ下記の表３又は表４に示す塩基配
列のプライマー３及びプライマー４を化学合成した。次
いで、実施例１−１（ａ）で得たＢＡＬＬ−１細胞由来
の精製ゲノムＤＮＡの一部をとり、これをプライマー３
及びプライマー４を用いた以外は実験例１−１（ａ）と
同様に遺伝子増幅してヒトβ−グロビンイントロン領域
を含む約８５０塩基対のＤＮＡ断片を得た。常法によ
り、ＤＮＡ断片の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで
平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限
酵素ＨｉｎｃＩＩで切断しておいたストラタジーン・ク
ローニング・システム社製プラスミドベクター『ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）』に挿入して組換えＤＮ
Ａとなし、これを実験例１−１（ａ）と同様にして大腸
菌ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた後、分離・精製し
た。組換えＤＮＡの一部をとり、挿入したＤＮＡ断片の
塩基配列をジデオキシ法により分析したところ、セイン
等が報告している塩基配列を含んでいた。その後、組換
えＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩで消化し、精
製することにより、ヒトβ−グロビンイントロン領域を
含む８４０塩基対からなるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ
断片を得た。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
【実施例１−１（ｃ） ｐｏｌｙ（Ａ）遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片の調製】プラスミドベクターｐＳＶ２ｎｅｏ
（ＡＴＣＣ ３７１４９）を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩで消
化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより下記の表５に示す塩
基配列のＢｇｌ ＩＩリンカーを連結後、制限酵素Ｂａ
ｍＨ Ｉで消化し、精製することにより、ｐｏｌｙ
（Ａ）遺伝子を含む３２０塩基対からなるＸｈｏＩ−Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片を得た。
ＮＡ断片の調製】プラスミドベクターｐＳＶ２ｎｅｏ
（ＡＴＣＣ ３７１４９）を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩで消
化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより下記の表５に示す塩
基配列のＢｇｌ ＩＩリンカーを連結後、制限酵素Ｂａ
ｍＨ Ｉで消化し、精製することにより、ｐｏｌｙ
（Ａ）遺伝子を含む３２０塩基対からなるＸｈｏＩ−Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片を得た。
【００３６】
【表５】
【００３７】
【実施例１−１（ｄ） Ｍ１３を含むＤＮＡ断片の調
製】常法により、宝酒造製ファージベクター『Ｍ１３ｍ
ｐ１８』から調製したＨｇｉＡＩ−ＰｖｕＩＩ ＤＮＡ
断片にＴ４ ＤＮＡリガーゼにより下記の表６に示す塩
基配列のＨｇｉＡＩリンカーを連結後、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで消化し、精製することにより、Ｍ１３を含む４６
７塩基対からなるＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩＤＮＡ断片を
得た。
製】常法により、宝酒造製ファージベクター『Ｍ１３ｍ
ｐ１８』から調製したＨｇｉＡＩ−ＰｖｕＩＩ ＤＮＡ
断片にＴ４ ＤＮＡリガーゼにより下記の表６に示す塩
基配列のＨｇｉＡＩリンカーを連結後、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで消化し、精製することにより、Ｍ１３を含む４６
７塩基対からなるＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩＤＮＡ断片を
得た。
【００３８】
【表６】
【００３９】
【実施例１−１（ｅ） ＮｅｏＲ遺伝子を含むＤＮＡ断
片の調製】常法により、プラスミドベクターｐＳＶ２ｎ
ｅｏを制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、精
製することにより、ＮｅｏＲ遺伝子を含む１，４８７塩
基対からなるＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を得
た。
片の調製】常法により、プラスミドベクターｐＳＶ２ｎ
ｅｏを制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、精
製することにより、ＮｅｏＲ遺伝子を含む１，４８７塩
基対からなるＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を得
た。
【００４０】
【実施例１−１（ｆ） ＯＲＩとＡｍｐＲ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の調製】常法により、プラスミドベクターｐ
ＵＣ９（ＡＴＣＣ ３７２５２）を制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＳｓｐＩで消化して得られるＢａｍＨＩ−ＳｓｐＩ
ＤＮＡ断片にＴ４ ＤＮＡリガーゼにより下記の表７
に示す塩基配列のＳｓｐＩリンカーを連結後、制限酵素
ＢｇｌＩＩで消化し、精製することにより、ＯＲＩとＡ
ｍｐＲ遺伝子を含む２，２３０塩基対からなるＢａｍＨ
Ｉ−ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片を得た。
ＤＮＡ断片の調製】常法により、プラスミドベクターｐ
ＵＣ９（ＡＴＣＣ ３７２５２）を制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＳｓｐＩで消化して得られるＢａｍＨＩ−ＳｓｐＩ
ＤＮＡ断片にＴ４ ＤＮＡリガーゼにより下記の表７
に示す塩基配列のＳｓｐＩリンカーを連結後、制限酵素
ＢｇｌＩＩで消化し、精製することにより、ＯＲＩとＡ
ｍｐＲ遺伝子を含む２，２３０塩基対からなるＢａｍＨ
Ｉ−ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片を得た。
【００４１】
【表７】
【００４２】
【実施例１−１（ｇ） ｄｈｆｒ遺伝子を含むＤＮＡ断
片の調製】常法により、プラスミドベクターｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＰｖｕＩＩで消化し、精製することにより、ｄｈ
ｆｒ遺伝子を含む１，９０７塩基対からなるＢａｍＨＩ
−ＰｖｕＩＩ ＤＮＡ断片を得た。
片の調製】常法により、プラスミドベクターｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＰｖｕＩＩで消化し、精製することにより、ｄｈ
ｆｒ遺伝子を含む１，９０７塩基対からなるＢａｍＨＩ
−ＰｖｕＩＩ ＤＮＡ断片を得た。
【００４３】
【実施例１−１（ｈ） ＮｒｕＩ−ＮｄｅＩ ＤＮＡ断
片の調製】マイケル・ボシャート等が『セル』、第４１
巻、第５２１〜５３０頁（１９８５年）に報告している
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）エンハンサーの
塩基配列に基づき、下記の表８又は表９に示す塩基配列
のプライマー５及びプライマー６を化学合成した。
片の調製】マイケル・ボシャート等が『セル』、第４１
巻、第５２１〜５３０頁（１９８５年）に報告している
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）エンハンサーの
塩基配列に基づき、下記の表８又は表９に示す塩基配列
のプライマー５及びプライマー６を化学合成した。
【００４４】
【表８】
【００４５】
【表９】
【００４６】別途、常法により、ＨＣＭＶ ＡＤ−１６
９株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８０７）のＤＮＡを採取・精製
し、プライマー５及びプライマー６の存在下でＰＣＲ法
により遺伝子増幅し、得られた約２８０塩基対からなる
ＤＮＡ断片の両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化
した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限酵素Ｈ
ｉｎｃ ＩＩで切断しておいたプラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８（ＡＴＣＣ３７２５３）に挿入した。得られた組
換えＤＮＡを実験例１−１（ａ）と同様にして大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に導入し、増殖させた後、精製・採取し、制
限酵素ＮｒｕＩ及びＮｄｅＩで消化し、精製することに
より、ＨＣＭＶ遺伝子を含む２７７塩基対からなるＮｒ
ｕＩ−ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片を得た。
９株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８０７）のＤＮＡを採取・精製
し、プライマー５及びプライマー６の存在下でＰＣＲ法
により遺伝子増幅し、得られた約２８０塩基対からなる
ＤＮＡ断片の両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化
した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限酵素Ｈ
ｉｎｃ ＩＩで切断しておいたプラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８（ＡＴＣＣ３７２５３）に挿入した。得られた組
換えＤＮＡを実験例１−１（ａ）と同様にして大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に導入し、増殖させた後、精製・採取し、制
限酵素ＮｒｕＩ及びＮｄｅＩで消化し、精製することに
より、ＨＣＭＶ遺伝子を含む２７７塩基対からなるＮｒ
ｕＩ−ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片を得た。
【００４７】
【実施例１−１（ｉ） ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ Ｄ
ＮＡ断片の調製】常法により、プラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８を制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、精製することにより、２１４塩基対からなるＮｄｅ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を得た。
ＮＡ断片の調製】常法により、プラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８を制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、精製することにより、２１４塩基対からなるＮｄｅ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を得た。
【００４８】
【実施例１−１（ｊ） ＳＶＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片
の調製】常法により、ＳＶ４０ Ａ２８９５株（ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−３０５）を増殖させ、ＤＮＡを採取・精製し
た。別途、ザルツマン等が『ザ・パポーバビリデス』、
１９８６年、プレナム・プレス社発行、第２７〜９８頁
に報告している塩基配列に基づき、ＳＶＥ領域を挾み込
む下記の表１０及び表１１に示す塩基配列のプライマー
７及びプライマー８を化学合成した。これらプライマー
７及びプライマー８の存在下でＳＶ４０の精製ＤＮＡを
ＰＣＲ法により遺伝子増幅し、得られた約１９０塩基対
からなるＤＮＡ断片の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼで平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め
制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断しておいたプラスミドベク
ターｐＵＣ１８に挿入して組換えＤＮＡとなし、これを
大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた後、採取・精
製し、ＳＶＥ領域をコードする配向方向の相違する２種
類のプラスミドベクター『ｐＨＳＶＥＢ』及び『ｐＨＳ
ＶＢＥ』を得た。これらプラスミドベクターの一部をと
り、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法に
より調べたところ、ザルツマン等が報告している塩基配
列を含んでいた。
の調製】常法により、ＳＶ４０ Ａ２８９５株（ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−３０５）を増殖させ、ＤＮＡを採取・精製し
た。別途、ザルツマン等が『ザ・パポーバビリデス』、
１９８６年、プレナム・プレス社発行、第２７〜９８頁
に報告している塩基配列に基づき、ＳＶＥ領域を挾み込
む下記の表１０及び表１１に示す塩基配列のプライマー
７及びプライマー８を化学合成した。これらプライマー
７及びプライマー８の存在下でＳＶ４０の精製ＤＮＡを
ＰＣＲ法により遺伝子増幅し、得られた約１９０塩基対
からなるＤＮＡ断片の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼで平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め
制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断しておいたプラスミドベク
ターｐＵＣ１８に挿入して組換えＤＮＡとなし、これを
大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた後、採取・精
製し、ＳＶＥ領域をコードする配向方向の相違する２種
類のプラスミドベクター『ｐＨＳＶＥＢ』及び『ｐＨＳ
ＶＢＥ』を得た。これらプラスミドベクターの一部をと
り、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法に
より調べたところ、ザルツマン等が報告している塩基配
列を含んでいた。
【００４９】
【表１０】
【００５０】
【表１１】
【００５１】その後、上記２種類の組換えＤＮＡをそれ
ぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、
精製した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予めＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１
８に挿入した。得られたＳＶ４０エンハンサーが２個直
列に連結した組換えＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
消化し、Ｔ４リガーゼにより、予め制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断しておいたプラスミドベクーｐＨＳＶＥＢに
挿入して組換えＤＮＡとなし、これを大腸菌ＨＢ１０１
株に導入し、増殖させた後、採取・精製し、制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで不完全消化し、精製する
ことにより、ＳＶＥが３個直列に連結した６８４塩基対
からなるＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を得
た。
ぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、
精製した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予めＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１
８に挿入した。得られたＳＶ４０エンハンサーが２個直
列に連結した組換えＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
消化し、Ｔ４リガーゼにより、予め制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断しておいたプラスミドベクーｐＨＳＶＥＢに
挿入して組換えＤＮＡとなし、これを大腸菌ＨＢ１０１
株に導入し、増殖させた後、採取・精製し、制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで不完全消化し、精製する
ことにより、ＳＶＥが３個直列に連結した６８４塩基対
からなるＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を得
た。
【００５２】
【実施例１−２ ｈＥＰＯをコードするＤＮＡを含む組
換えＤＮＡの調製】常法により、ヒト腎癌細胞ＡＣＨＮ
株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１１）を増殖させ、増殖細胞
からｍＲＮＡを採取・精製した。別途、ケネス・ジェー
コブス等が『ネーチャー』、第３１３巻、第８０６〜８
１０頁（１９８５年）に報告しているｈＥＰＯの塩基配
列に基づき、ｈＥＰＯをコードするｃＤＮＡ領域を挾み
込む下記の表１２又は表１３に示す塩基配列のプライマ
ー９及びプライマー１０を化学合成し、これらプライマ
ーの存在下で精製ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝
子増幅することにより、約６００塩基対からなるｃＤＮ
Ａを得た。ｃＤＮＡの両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼで平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め
制限酵素ＳｍａＩで切断しておいたプラスミドベクター
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）に挿入して組換え
ＤＮＡとなし、これをコンピテントセル法により大腸菌
ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた後、採取・精製し
た。組換えＤＮＡの一部をとり、挿入したＤＮＡ断片の
塩基配列をジデオキシ法により調べたところ、ジェーコ
ブス等が報告している塩基配列を含んでいた。
換えＤＮＡの調製】常法により、ヒト腎癌細胞ＡＣＨＮ
株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１１）を増殖させ、増殖細胞
からｍＲＮＡを採取・精製した。別途、ケネス・ジェー
コブス等が『ネーチャー』、第３１３巻、第８０６〜８
１０頁（１９８５年）に報告しているｈＥＰＯの塩基配
列に基づき、ｈＥＰＯをコードするｃＤＮＡ領域を挾み
込む下記の表１２又は表１３に示す塩基配列のプライマ
ー９及びプライマー１０を化学合成し、これらプライマ
ーの存在下で精製ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝
子増幅することにより、約６００塩基対からなるｃＤＮ
Ａを得た。ｃＤＮＡの両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼで平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め
制限酵素ＳｍａＩで切断しておいたプラスミドベクター
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）に挿入して組換え
ＤＮＡとなし、これをコンピテントセル法により大腸菌
ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた後、採取・精製し
た。組換えＤＮＡの一部をとり、挿入したＤＮＡ断片の
塩基配列をジデオキシ法により調べたところ、ジェーコ
ブス等が報告している塩基配列を含んでいた。
【００５３】
【表１２】
【００５４】
【表１３】
【００５５】上記で得た組換えＤＮＡを常法により制限
酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、消化物から採取・
精製したｈＥＰＯをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断
片を実施例１−１で調製したｐｈＩＦＰ１におけるＨｕ
ＩＦＮ−α２プロモータ下流のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ認識
部位に挿入した。このようにして得られた組換えＤＮＡ
を『ｐＩＦＰｈＥＰＯ』と命名した。
酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、消化物から採取・
精製したｈＥＰＯをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断
片を実施例１−１で調製したｐｈＩＦＰ１におけるＨｕ
ＩＦＮ−α２プロモータ下流のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ認識
部位に挿入した。このようにして得られた組換えＤＮＡ
を『ｐＩＦＰｈＥＰＯ』と命名した。
【００５６】
【実施例２ ｈＥＰＯをコードするＤＮＡを含む形質転
換体の調製】バイラド社製エレクトロポレーション装置
『ジーン・パルサー』を使用し、実施例１−２で調製し
た組換えＤＮＡ『ｐＩＦＰｈＥＰＯ』を２５μＦ、４５
０ボルトの条件でＢＡＬＬ−１細胞に導入した。細胞を
５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で７２時間培養し
た後、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＧ−４
１８ １ｍｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ
７．２）に細胞密度約４×１０5個／ｍｌになるように
浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で約１
カ月間培養後、生育細胞を採取・クローン化した。
換体の調製】バイラド社製エレクトロポレーション装置
『ジーン・パルサー』を使用し、実施例１−２で調製し
た組換えＤＮＡ『ｐＩＦＰｈＥＰＯ』を２５μＦ、４５
０ボルトの条件でＢＡＬＬ−１細胞に導入した。細胞を
５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で７２時間培養し
た後、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＧ−４
１８ １ｍｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ
７．２）に細胞密度約４×１０5個／ｍｌになるように
浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で約１
カ月間培養後、生育細胞を採取・クローン化した。
【００５７】得られた形質転換体を１０％（ｖ／ｖ）仔
ウシ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．
２）に細胞密度約４×１０5個／ｍｌになるように浮遊
させ、培養培地に株式会社林原生物化学研究所製ＩＦＮ
−α（ＢＡＬＬ−１）を１００ＩＵ／ｍｌを加え、３７
℃で３時間インキュベートした後、培養培地にセンダイ
ウイルスを５０ＨＡ／ｍｌ加え、同じ温度でさらに１５
時間培養した。
ウシ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．
２）に細胞密度約４×１０5個／ｍｌになるように浮遊
させ、培養培地に株式会社林原生物化学研究所製ＩＦＮ
−α（ＢＡＬＬ−１）を１００ＩＵ／ｍｌを加え、３７
℃で３時間インキュベートした後、培養培地にセンダイ
ウイルスを５０ＨＡ／ｍｌ加え、同じ温度でさらに１５
時間培養した。
【００５８】得られた培養物のｈＥＰＯ活性を測定した
ところ、発現が最も高い形質転換体ＢＥ−９１２で形質
転換体４×１０5個当たり、約３０ＵのｈＥＰＯ産生が
認められた。対照として、同じ形質転換体をセンダイウ
イルスの非存在下で同様に培養したところ、ｈＥＰＯ産
生は認められなかった。このことは、本例の形質転換体
が、ＩＦＮ−α誘導剤による外部刺激により、その発現
を人為的に制御可能であることを裏付けている。
ところ、発現が最も高い形質転換体ＢＥ−９１２で形質
転換体４×１０5個当たり、約３０ＵのｈＥＰＯ産生が
認められた。対照として、同じ形質転換体をセンダイウ
イルスの非存在下で同様に培養したところ、ｈＥＰＯ産
生は認められなかった。このことは、本例の形質転換体
が、ＩＦＮ−α誘導剤による外部刺激により、その発現
を人為的に制御可能であることを裏付けている。
【００５９】なお、この発明を通じて、ｈＥＰＯ活性
は、ゲラルド・クリスタルが『エキスペリメンタル・ヘ
マトロジー』、第１１巻、第７号、第６４９〜６６０頁
（１９８３年）に報告しているフェニルヒドラジンを投
与して貧血を誘導したマウスの脾臓細胞における3Ｈ−
チミジン取り込み量を指標とする方法に準じて測定し、
国際単位（Ｕ）に較正して表示した。標準物質には、和
光純薬工業社製の人尿由来ｈＥＰＯを使用した。
は、ゲラルド・クリスタルが『エキスペリメンタル・ヘ
マトロジー』、第１１巻、第７号、第６４９〜６６０頁
（１９８３年）に報告しているフェニルヒドラジンを投
与して貧血を誘導したマウスの脾臓細胞における3Ｈ−
チミジン取り込み量を指標とする方法に準じて測定し、
国際単位（Ｕ）に較正して表示した。標準物質には、和
光純薬工業社製の人尿由来ｈＥＰＯを使用した。
【００６０】
【実施例３ ＨｕＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを含む
組換えＤＮＡの調製】健常者から末梢血を採取し、常法
にしたがってリンパ球を分離した。リンパ球を１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に血球密度２．５×１０6個／ｍｌに
なるように浮遊させ、レンチルレクチンを１０μｇ／ｍ
ｌ加えた後、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で４
８時間インキュベートした。常法により、遠心分離によ
り培養物から回収した血球からｍＲＮＡを採取・精製
し、実施例１−２と同様にしてＲＴ−ＰＣＲ法によりＨ
ｕＩＦＮ−γをコードするｃＤＮＡを増幅し、実施例１
−２と同様にしてプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ（−）に挿入して組換えＤＮＡとなし、こ
れを大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた。
組換えＤＮＡの調製】健常者から末梢血を採取し、常法
にしたがってリンパ球を分離した。リンパ球を１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に血球密度２．５×１０6個／ｍｌに
なるように浮遊させ、レンチルレクチンを１０μｇ／ｍ
ｌ加えた後、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で４
８時間インキュベートした。常法により、遠心分離によ
り培養物から回収した血球からｍＲＮＡを採取・精製
し、実施例１−２と同様にしてＲＴ−ＰＣＲ法によりＨ
ｕＩＦＮ−γをコードするｃＤＮＡを増幅し、実施例１
−２と同様にしてプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ（−）に挿入して組換えＤＮＡとなし、こ
れを大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた。
【００６１】別途、リック・デリンク等が『ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ』、第１０巻、第３６０５〜３
６１５頁（１９８２年）に報告しているＨｕＩＦＮ−γ
をコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づき、下記の表１
４、表１５又は表１６に示す塩基配列のプローブ１、プ
ローブ２及びプローブ３を化学合成し、常法により32Ｐ
で標識した。これらプローブを使用し、ハイブリダイゼ
ーション法により前記大腸菌からＨｕＩＦＮ−γをコー
ドするｃＤＮＡを含むクローンを選択し、常法により増
殖させた後、組換えＤＮＡを採取・精製した。組換えＤ
ＮＡの一部をとり、挿入したＤＮＡ断片の塩基配列をジ
デオキシ法により調べたところ、デリンク等が報告して
いる塩基配列を含んでいた。
ク・アシッズ・リサーチ』、第１０巻、第３６０５〜３
６１５頁（１９８２年）に報告しているＨｕＩＦＮ−γ
をコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づき、下記の表１
４、表１５又は表１６に示す塩基配列のプローブ１、プ
ローブ２及びプローブ３を化学合成し、常法により32Ｐ
で標識した。これらプローブを使用し、ハイブリダイゼ
ーション法により前記大腸菌からＨｕＩＦＮ−γをコー
ドするｃＤＮＡを含むクローンを選択し、常法により増
殖させた後、組換えＤＮＡを採取・精製した。組換えＤ
ＮＡの一部をとり、挿入したＤＮＡ断片の塩基配列をジ
デオキシ法により調べたところ、デリンク等が報告して
いる塩基配列を含んでいた。
【００６２】
【表１４】
【００６３】
【表１５】
【００６４】
【表１６】
【００６５】その後、常法により、上記組換えＤＮＡを
制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、消化物からＨ
ｕＩＦＮ−γをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を
採取・精製し、実施例１−１で構築したプラスミドベク
ターｐｈＩＦＰ１のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ認識部位間に挿
入することにより、ＨｕＩＦＮ−αプロモータの下流に
ＨｕＩＦＮ−γをコードするｃＤＮＡが連結した組換え
ＤＮＡ『ｐＩＦＰｈＩＦＧ』を得た。
制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、消化物からＨ
ｕＩＦＮ−γをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を
採取・精製し、実施例１−１で構築したプラスミドベク
ターｐｈＩＦＰ１のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ認識部位間に挿
入することにより、ＨｕＩＦＮ−αプロモータの下流に
ＨｕＩＦＮ−γをコードするｃＤＮＡが連結した組換え
ＤＮＡ『ｐＩＦＰｈＩＦＧ』を得た。
【００６６】
【実施例４ ＨｕＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを含む
形質転換体の調製】実施例３で得た組換えＤＮＡ『ｐＩ
ＦＰｈＩＦＧ』を実施例２と同様、エレクトロポレーシ
ョン法によりＢＡＬＬ−１細胞に導入した。形質転換体
を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１
６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、５％ＣＯ2イン
キュベータ中、３７℃で７２時間培養後、培養物から形
質転換体を採取し、新鮮な同じ培養培地で洗浄した。次
に、形質転換体をＧ−４１８を１ｍｇ／ｍｌ含む１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に細胞密度約４×１０5個／ｍｌにな
るように浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７
℃で約１カ月間培養後、生育細胞を採取クローン化し
た。
形質転換体の調製】実施例３で得た組換えＤＮＡ『ｐＩ
ＦＰｈＩＦＧ』を実施例２と同様、エレクトロポレーシ
ョン法によりＢＡＬＬ−１細胞に導入した。形質転換体
を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１
６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、５％ＣＯ2イン
キュベータ中、３７℃で７２時間培養後、培養物から形
質転換体を採取し、新鮮な同じ培養培地で洗浄した。次
に、形質転換体をＧ−４１８を１ｍｇ／ｍｌ含む１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に細胞密度約４×１０5個／ｍｌにな
るように浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７
℃で約１カ月間培養後、生育細胞を採取クローン化し
た。
【００６７】このようにして得た４０種類の形質転換体
につき、それぞれ別個に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清
を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞
密度約４×１０5個／ｍｌになるように浮遊させ、培養
培地にＩＦＮ−α（ＢＡＬＬ−１）を１００ＩＵ／ｍｌ
加え、３７℃で１５時間培養後、培養培地にセンダイウ
イルスを約５０ＨＡ／ｍｌ加え、同じ温度でさらに１５
時間培養した。培養物の抗ウイルス活性を調べたとこ
ろ、発現効率が最も高い形質転換体『ＢＩＧ−７１３』
で、形質転換体４×１０5個当たり、約６，０００ＩＵ
のＨｕＩＦＮ−γ産生が認められた。対照として、同じ
形質転換体をセンダイウイルスの非存在下で同様に培養
したところ、ＨｕＩＦＮ−γ産生は認められなかった。
このことは、本件の形質転換体が、ＩＦＮ−α誘導剤に
よる外部刺激により、その発現を人為的に制御可能であ
ることを裏付けている。
につき、それぞれ別個に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清
を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞
密度約４×１０5個／ｍｌになるように浮遊させ、培養
培地にＩＦＮ−α（ＢＡＬＬ−１）を１００ＩＵ／ｍｌ
加え、３７℃で１５時間培養後、培養培地にセンダイウ
イルスを約５０ＨＡ／ｍｌ加え、同じ温度でさらに１５
時間培養した。培養物の抗ウイルス活性を調べたとこ
ろ、発現効率が最も高い形質転換体『ＢＩＧ−７１３』
で、形質転換体４×１０5個当たり、約６，０００ＩＵ
のＨｕＩＦＮ−γ産生が認められた。対照として、同じ
形質転換体をセンダイウイルスの非存在下で同様に培養
したところ、ＨｕＩＦＮ−γ産生は認められなかった。
このことは、本件の形質転換体が、ＩＦＮ−α誘導剤に
よる外部刺激により、その発現を人為的に制御可能であ
ることを裏付けている。
【００６８】なお、この発明を通じて、ＨｕＩＦＮ−γ
の活性は、モノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体及びモ
ノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−β抗体の存在下、シンドビ
スウイルスによるヒト羊膜細胞ＦＬ株の変性を指標とす
る色素取り込み法により測定し、国際単位（ＩＵ）に較
正して表示した。標準品には、アメリカ合衆国国立衛生
研究所から入手したＨｕＩＦＮ−γ標準品（ＮＩＨ Ｇ
ａ２３−９０１−５３０）を使用した。
の活性は、モノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体及びモ
ノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−β抗体の存在下、シンドビ
スウイルスによるヒト羊膜細胞ＦＬ株の変性を指標とす
る色素取り込み法により測定し、国際単位（ＩＵ）に較
正して表示した。標準品には、アメリカ合衆国国立衛生
研究所から入手したＨｕＩＦＮ−γ標準品（ＮＩＨ Ｇ
ａ２３−９０１−５３０）を使用した。
【００６９】以下、上記実施例で調製した形質転換体を
使用するｈＥＰＯとＨｕＩＦＮ−γの参考製造例につい
て説明する。
使用するｈＥＰＯとＨｕＩＦＮ−γの参考製造例につい
て説明する。
【００７０】
【参考例１ 形質転換体によるｈＥＰＯの製造】１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に実施例１−２で得た形質転換体ＢＥ
−９１２を細胞密度約５×１０6個／ｍｌになるように
浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で１８
時間培養した。遠心分離により培養物から採取した細胞
を新鮮な同一培地で洗浄し、新鮮な同じ培養培地に細胞
密度５×１０6個／ｍｌになるように浮遊させ、ＩＦＮ
−α（ＢＡＬＬ−１）を１００ＩＵ／ｍｌ加え、５％Ｃ
Ｏ2インキュベータ中、３７℃で３時間インキュベート
した後、ニューカッスル病ウイルスを５０ＨＡ／ｍｌ加
え、同じ温度でさらに１８時間培養した。培養物のＥＰ
Ｏ活性を測定したところ、約４００Ｕ／ｍｌのｈＥＰＯ
産生が認められた。
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に実施例１−２で得た形質転換体ＢＥ
−９１２を細胞密度約５×１０6個／ｍｌになるように
浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で１８
時間培養した。遠心分離により培養物から採取した細胞
を新鮮な同一培地で洗浄し、新鮮な同じ培養培地に細胞
密度５×１０6個／ｍｌになるように浮遊させ、ＩＦＮ
−α（ＢＡＬＬ−１）を１００ＩＵ／ｍｌ加え、５％Ｃ
Ｏ2インキュベータ中、３７℃で３時間インキュベート
した後、ニューカッスル病ウイルスを５０ＨＡ／ｍｌ加
え、同じ温度でさらに１８時間培養した。培養物のＥＰ
Ｏ活性を測定したところ、約４００Ｕ／ｍｌのｈＥＰＯ
産生が認められた。
【００７１】その後、常法により、培養物から形質転換
体を除去し、濃縮した後、培養物に含まれるｈＥＰＯを
イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト
・カラムクマロトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラ
フィーにより比活性約１×１０5Ｕ／ｍｇ蛋白質にまで
精製した。精製ｈＥＰＯの一部をとり、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動後、ゲル上で過沃素酸シ
ッフ試薬を作用させたところ、ＥＰＯ活性を有するバン
ドが赤色に染色された。このことは、産生したｈＥＰＯ
に有意の糖鎖が結合していることを示している。
体を除去し、濃縮した後、培養物に含まれるｈＥＰＯを
イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト
・カラムクマロトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラ
フィーにより比活性約１×１０5Ｕ／ｍｇ蛋白質にまで
精製した。精製ｈＥＰＯの一部をとり、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動後、ゲル上で過沃素酸シ
ッフ試薬を作用させたところ、ＥＰＯ活性を有するバン
ドが赤色に染色された。このことは、産生したｈＥＰＯ
に有意の糖鎖が結合していることを示している。
【００７２】
【参考例２ 形質転換体によるｈＥＰＯの製造】１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に実施例１−２で得た形質転換体ＢＥ
−９１２を細胞密度約５×１０6個／ｍｌになるように
浮遊させ、参考例１と同様にして増殖させた。次いで、
形質転換体を生理食塩水に浮遊させ、常法により免疫抑
制したハムスター新生児の大腿部皮下に約１×１０7個
／匹の割合で注射移植し、その後、通常の方法によりハ
ムスターを４週間飼育した。常法により、皮下に生じた
腫瘍塊（平均約１５ｇ／匹）を摘出し、分散させ、得ら
れた細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）で洗浄
した後、新鮮な同じ培養培地に細胞密度約５×１０6個
／ｍｌになるように浮遊させ、ＩＦＮ−α（ＢＡＬＬ−
１）を１００ＩＵ／ｍｌ加え、５％ＣＯ2インキュベー
タ中、３７℃で３時間インキュベートした後、培養培地
にセンダイウイルスを５０ＨＡ／ｍｌ加え、同じ温度で
さらに１８時間インキュベートした。培養物のＥＰＯ活
性を測定したところ、約６００Ｕ／ｍｌのｈＥＰＯ産生
が認められた。
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に実施例１−２で得た形質転換体ＢＥ
−９１２を細胞密度約５×１０6個／ｍｌになるように
浮遊させ、参考例１と同様にして増殖させた。次いで、
形質転換体を生理食塩水に浮遊させ、常法により免疫抑
制したハムスター新生児の大腿部皮下に約１×１０7個
／匹の割合で注射移植し、その後、通常の方法によりハ
ムスターを４週間飼育した。常法により、皮下に生じた
腫瘍塊（平均約１５ｇ／匹）を摘出し、分散させ、得ら
れた細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）で洗浄
した後、新鮮な同じ培養培地に細胞密度約５×１０6個
／ｍｌになるように浮遊させ、ＩＦＮ−α（ＢＡＬＬ−
１）を１００ＩＵ／ｍｌ加え、５％ＣＯ2インキュベー
タ中、３７℃で３時間インキュベートした後、培養培地
にセンダイウイルスを５０ＨＡ／ｍｌ加え、同じ温度で
さらに１８時間インキュベートした。培養物のＥＰＯ活
性を測定したところ、約６００Ｕ／ｍｌのｈＥＰＯ産生
が認められた。
【００７３】
【参考例３ 形質転換体によるＨｕＩＦＮ−γの製造】
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６
４０培地（ｐＨ７．２）に実施例４で得た形質転換体Ｂ
ＩＧ−７１３を細胞密度約４×１０4個／ｍｌになるよ
うに浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で
１５時間培養して増殖させた。遠心分離により培養物か
ら採取した細胞を生理食塩水で洗浄し、血清無含有のＲ
ＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約５×１
０6個／ｍｌになるように浮遊させ、培養培地にＩＦＮ
−α（ＢＡＬＬ−１）を１００ＩＵ／ｍｌ加え、５％Ｃ
Ｏ2インキュベータ中、３７℃で３時間インキュベート
した後、培養培地にセンダイウイルスを１００ＨＡ／ｍ
ｌ加え、同じ温度でさらに１８時間インキュベートし
た。培養物の抗ウイルス活性を測定したところ、約８
０，０００ＩＵ／ｍｌのＨｕＩＦＮ−γ産生が認められ
た。
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６
４０培地（ｐＨ７．２）に実施例４で得た形質転換体Ｂ
ＩＧ−７１３を細胞密度約４×１０4個／ｍｌになるよ
うに浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で
１５時間培養して増殖させた。遠心分離により培養物か
ら採取した細胞を生理食塩水で洗浄し、血清無含有のＲ
ＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約５×１
０6個／ｍｌになるように浮遊させ、培養培地にＩＦＮ
−α（ＢＡＬＬ−１）を１００ＩＵ／ｍｌ加え、５％Ｃ
Ｏ2インキュベータ中、３７℃で３時間インキュベート
した後、培養培地にセンダイウイルスを１００ＨＡ／ｍ
ｌ加え、同じ温度でさらに１８時間インキュベートし
た。培養物の抗ウイルス活性を測定したところ、約８
０，０００ＩＵ／ｍｌのＨｕＩＦＮ−γ産生が認められ
た。
【００７４】その後、常法により、培養物から形質転換
体を除去し、濃縮した後、培養物に含まれるＨｕＩＦＮ
−γを抗ＨｕＩＦＮ−γ抗体カラムクロマトグラフィー
により比活性約１×１０7ＩＵ／ｍｇ蛋白質にまで精製
した。精製ＨｕＩＦＮ−γの一部をとり、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動後、ゲル上で過沃素酸
シッフ試薬を作用させたところ、抗ウイルス活性を有す
るバンドが赤色に染色された。このことは、産生したＨ
ｕＩＦＮ−γに有意の糖鎖が結合していることを示して
いる。
体を除去し、濃縮した後、培養物に含まれるＨｕＩＦＮ
−γを抗ＨｕＩＦＮ−γ抗体カラムクロマトグラフィー
により比活性約１×１０7ＩＵ／ｍｇ蛋白質にまで精製
した。精製ＨｕＩＦＮ−γの一部をとり、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動後、ゲル上で過沃素酸
シッフ試薬を作用させたところ、抗ウイルス活性を有す
るバンドが赤色に染色された。このことは、産生したＨ
ｕＩＦＮ−γに有意の糖鎖が結合していることを示して
いる。
【００７５】
【参考例４ 形質転換体によるＨｕＩＦＮ−γの製造】
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６
４０培地（ｐＨ７．２）に実施例４で得た形質転換体Ｂ
ＩＧ−７１３を細胞密度約４×１０4個／ｍｌになるよ
うに浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で
１５時間培養して増殖させた。遠心分離により培養物か
ら採取した細胞を生理食塩水で洗浄後、血清無含有のＲ
ＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、ヌード
マウスの大腿部皮下に約１×１０7個／匹の割合で注射
移植した。その後、ヌードマウスを通常一般の方法で５
週間飼育し、皮下に生じた腫瘍塊（平均約１２ｇ／匹）
を摘出し、分散させた。
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６
４０培地（ｐＨ７．２）に実施例４で得た形質転換体Ｂ
ＩＧ−７１３を細胞密度約４×１０4個／ｍｌになるよ
うに浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で
１５時間培養して増殖させた。遠心分離により培養物か
ら採取した細胞を生理食塩水で洗浄後、血清無含有のＲ
ＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、ヌード
マウスの大腿部皮下に約１×１０7個／匹の割合で注射
移植した。その後、ヌードマウスを通常一般の方法で５
週間飼育し、皮下に生じた腫瘍塊（平均約１２ｇ／匹）
を摘出し、分散させた。
【００７６】このようにして得た形質転換体をセンダイ
ウイルスに代えてニューカッスル病ウイルスを使用した
以外は参考例３と同様に処理したところ、約１００，０
００ＩＵ／ｍｌのＨｕＩＦＮ−γが産生した。
ウイルスに代えてニューカッスル病ウイルスを使用した
以外は参考例３と同様に処理したところ、約１００，０
００ＩＵ／ｍｌのＨｕＩＦＮ−γが産生した。
【００７７】
【発明の効果】叙上のとおり、この発明はＩＦＮ−αプ
ロモータを利用する新規な組換えＤＮＡと形質転換体を
提供するものである。
ロモータを利用する新規な組換えＤＮＡと形質転換体を
提供するものである。
【００７８】この発明の組換えＤＮＡを導入した形質転
換体は、ＩＦＮ−α誘導剤による外部刺激の有無によ
り、ポリペプチドの産生を人為的に制御することができ
る。これにより、この発明の形質転換体は、ＩＦＮ−α
誘導剤の非存在下で培養することにより、自ら産生した
ポリペプチドにより障害を起こしたり、死滅することな
く、最大限に増殖することができる。そして、増殖した
形質転換体を適宜ＩＦＮ−α誘導剤の存在下で培養すれ
ば、導入したＤＮＡが最大限に発現して、所期のポリペ
プチドを産生する。斯くして、この発明によるときに
は、従来の組換えＤＮＡや形質転換体では製造困難であ
ったポリペプチドであっても、所望量を容易に製造でき
ることとなる。
換体は、ＩＦＮ−α誘導剤による外部刺激の有無によ
り、ポリペプチドの産生を人為的に制御することができ
る。これにより、この発明の形質転換体は、ＩＦＮ−α
誘導剤の非存在下で培養することにより、自ら産生した
ポリペプチドにより障害を起こしたり、死滅することな
く、最大限に増殖することができる。そして、増殖した
形質転換体を適宜ＩＦＮ−α誘導剤の存在下で培養すれ
ば、導入したＤＮＡが最大限に発現して、所期のポリペ
プチドを産生する。斯くして、この発明によるときに
は、従来の組換えＤＮＡや形質転換体では製造困難であ
ったポリペプチドであっても、所望量を容易に製造でき
ることとなる。
【００７９】さらに、この発明は、ＩＦＮ−αプロモー
タ自体が極めて強力なことに加えて、通常一般のＩＦＮ
−α誘導剤が医薬品の製造過程に支障なく使用でき、し
かも、それらはポリペプチドの精製過程で容易に除去で
きることから、安全なポリペプチドを効率的に所望量を
製造できる特徴がある。殊に、目的とするポリペプチド
が、元来、糖鎖が付加した形態で産生されるものである
場合には、従来の組換えＤＮＡ技術では容易に得られな
い、顕著な薬効のポリペプチドを容易に製造できること
となる。そして、ＨｕＩＦＮ−αプロモータを使用する
形質転換体が産生するポリペプチドは、ＨｕＩＦＮ−α
プロモータが、本来、ヒトの体内に存在するものである
ことから、ヒトに投与することを前提とする医薬品に副
作用等の懸念なく安全に配合使用できる。
タ自体が極めて強力なことに加えて、通常一般のＩＦＮ
−α誘導剤が医薬品の製造過程に支障なく使用でき、し
かも、それらはポリペプチドの精製過程で容易に除去で
きることから、安全なポリペプチドを効率的に所望量を
製造できる特徴がある。殊に、目的とするポリペプチド
が、元来、糖鎖が付加した形態で産生されるものである
場合には、従来の組換えＤＮＡ技術では容易に得られな
い、顕著な薬効のポリペプチドを容易に製造できること
となる。そして、ＨｕＩＦＮ−αプロモータを使用する
形質転換体が産生するポリペプチドは、ＨｕＩＦＮ−α
プロモータが、本来、ヒトの体内に存在するものである
ことから、ヒトに投与することを前提とする医薬品に副
作用等の懸念なく安全に配合使用できる。
【００８０】この発明は斯くも顕著な作用効果を発揮す
る発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義の
ある発明といえる。
る発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義の
ある発明といえる。
【図１】プラスミドベクターｐｈＩＦＰ１の構造を示す
図である。
図である。
ｈＩＦＰ ＨｕＩＦＮ−α２プロモータ ｐｏｌｙ（Ａ） ＳＶ４０のポリアデル化シグナ
ル遺伝子 Ｍ１３ Ｍ１３ファージの複製開始点 ＮｅｏＲ ネオマイシン・アミノグリコシ
ド・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子 ＯＲＩ 大腸菌の複製開始点 ＡｍｐＲ β−ラクタマーゼ遺伝子 ｄｈｆｒ ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝
子 ＳＶＥ３ ＳＶＥが３個直列に連結した遺
伝子
ル遺伝子 Ｍ１３ Ｍ１３ファージの複製開始点 ＮｅｏＲ ネオマイシン・アミノグリコシ
ド・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子 ＯＲＩ 大腸菌の複製開始点 ＡｍｐＲ β−ラクタマーゼ遺伝子 ｄｈｆｒ ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝
子 ＳＶＥ３ ＳＶＥが３個直列に連結した遺
伝子
【手続補正書】
【提出日】平成６年７月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】この発明で用いるプラスミドベクターは、
組換えＤＮＡや形質転換体をクローニングするための適
宜薬剤耐性遺伝子や、形質転換体の発現効率を高めるた
めの適宜エンハンサーの挿入を妨げない。個々の薬剤耐
性遺伝子としては、例えば、蛋白質合成阻害剤の一種で
あるＧ−４１８への耐性を与えるネオマイシン・アミノ
グリコシド・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（以
下、「ＮｅｏＲ遺伝子」と略記する。）、核酸合成阻害
剤の一種であるメトトレキセートへの耐性を与えるジヒ
ドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（以下、「ｄｈｆｒ遺伝
子」と略記する。）、アンピシリンへの耐性を与えるβ
−ラクタマーゼ遺伝子（以下、「ＡｍｐＲ」と略記す
る。）などが挙げられる。エンハンサーにはＳＶ４０エ
ンハンサー（以下、「ＳＶＥ」と略記する。）が好適で
あり、後記プラスミドベクターｐｈＩＦＰ１はこれら薬
剤耐性形質やエンハンサーをすべて具備しており、この
発明を実施するうえで極めて有用である。なお、プラス
ミドベクターの適所に開始コドンや終止コドンを適宜挿
入し得ることは言うまでもない。
組換えＤＮＡや形質転換体をクローニングするための適
宜薬剤耐性遺伝子や、形質転換体の発現効率を高めるた
めの適宜エンハンサーの挿入を妨げない。個々の薬剤耐
性遺伝子としては、例えば、蛋白質合成阻害剤の一種で
あるＧ−４１８への耐性を与えるネオマイシン・アミノ
グリコシド・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（以
下、「ＮｅｏＲ遺伝子」と略記する。）、核酸合成阻害
剤の一種であるメトトレキセートへの耐性を与えるジヒ
ドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（以下、「ｄｈｆｒ遺伝
子」と略記する。）、アンピシリンへの耐性を与えるβ
−ラクタマーゼ遺伝子（以下、「ＡｍｐＲ」と略記す
る。）などが挙げられる。エンハンサーにはＳＶ４０エ
ンハンサー（以下、「ＳＶＥ」と略記する。）が好適で
あり、後記プラスミドベクターｐｈＩＦＰ１はこれら薬
剤耐性形質やエンハンサーをすべて具備しており、この
発明を実施するうえで極めて有用である。なお、プラス
ミドベクターの適所に開始コドンや終止コドンを適宜挿
入し得ることは言うまでもない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】次に、プラスミドベクターに挿入されるＩ
ＦＮ−α以外のポリペプチドをコードするＤＮＡについ
て説明するに、この発明でいうポリペプチドとはＩＦＮ
−α以外のポリペプチド一般を意味し、分子中における
糖鎖の有無がその生物作用や副作用に実質的な影響をも
たらすものも対象となり得る。個々のポリペプチドとし
ては、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子、マクロ
ファージ遊走阻止因子、マクロファージ活性化因子、マ
クロファージ走化性因子、コロニー形成因子、幼若化因
子、インターロイキン２、インターロイキン３、好中球
走化性因子及び白血球遊走阻止因子などのサイトカイ
ン、エリスロポエチン、インシュリン、ソマトスタチ
ン、成長ホルモンなどのペプチドホルモン、さらには、
組織プラスミノーゲン・アクチベータなどの酵素がその
対象となる。このうちの多くのポリペプチドは、本来、
糖鎖を結合した形態で産生されており、その一部におい
ては、糖鎖の有無がその生物作用や副作用に実質的な影
響を及ぼすことが知られている。この発明の形質転換体
が産生するＨｕＩＮＦ−γ、腫瘍壊死因子、ヒトエリス
ロポエチン（以下、「ｈＥＰＯ」と略記する。）などに
は有意の糖鎖が結合しており、医薬品に配合してヒトに
投与すると、重篤な副作用を惹起することなく顕著な治
療・予防効果を発揮する。
ＦＮ−α以外のポリペプチドをコードするＤＮＡについ
て説明するに、この発明でいうポリペプチドとはＩＦＮ
−α以外のポリペプチド一般を意味し、分子中における
糖鎖の有無がその生物作用や副作用に実質的な影響をも
たらすものも対象となり得る。個々のポリペプチドとし
ては、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子、マクロ
ファージ遊走阻止因子、マクロファージ活性化因子、マ
クロファージ走化性因子、コロニー形成因子、幼若化因
子、インターロイキン２、インターロイキン３、好中球
走化性因子及び白血球遊走阻止因子などのサイトカイ
ン、エリスロポエチン、インシュリン、ソマトスタチ
ン、成長ホルモンなどのペプチドホルモン、さらには、
組織プラスミノーゲン・アクチベータなどの酵素がその
対象となる。このうちの多くのポリペプチドは、本来、
糖鎖を結合した形態で産生されており、その一部におい
ては、糖鎖の有無がその生物作用や副作用に実質的な影
響を及ぼすことが知られている。この発明の形質転換体
が産生するＨｕＩＮＦ−γ、腫瘍壊死因子、ヒトエリス
ロポエチン（以下、「ｈＥＰＯ」と略記する。）などに
は有意の糖鎖が結合しており、医薬品に配合してヒトに
投与すると、重篤な副作用を惹起することなく顕著な治
療・予防効果を発揮する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】産生したポリペプチドは、斯界における通
常一般の方法で精製することができる。例えば、遠心分
離により培養物から形質転換体を除去して得られる培養
上清に硫酸アンモニウムを加えて塩析し、得られる粗ポ
リペプチドを含む沈澱物を、例えば、濃縮、塩析、透
析、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、アフィニティ
ークロマトグラフィーなどの精製方法を適宜組合せて精
製すればよい。ポリペプチドがＩＦＮや腫瘍壊死因子の
場合には、モノクローナル抗体をリガンドとするアフィ
ニティークロマトグラフィーが有用であり、最高純度の
ポリペプチドを最少限の労力とコストで得ることができ
る。
常一般の方法で精製することができる。例えば、遠心分
離により培養物から形質転換体を除去して得られる培養
上清に硫酸アンモニウムを加えて塩析し、得られる粗ポ
リペプチドを含む沈澱物を、例えば、濃縮、塩析、透
析、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、アフィニティ
ークロマトグラフィーなどの精製方法を適宜組合せて精
製すればよい。ポリペプチドがＩＦＮや腫瘍壊死因子の
場合には、モノクローナル抗体をリガンドとするアフィ
ニティークロマトグラフィーが有用であり、最高純度の
ポリペプチドを最少限の労力とコストで得ることができ
る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】別途、常法により、化２に示すｈＩＦＰ遺
伝子を含む塩基配列の下記表１又は表２に示すプライマ
ー１及びプライマー２を化学合成し、これらプライマー
の存在下で精製ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法により遺伝子増
幅することにより、ｈＩＦＰ領域を含む約５００塩基対
からなるＤＮＡ断片を得た。常法により、このＤＮＡ断
片にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを作用させて両末端を平
滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限酵
素ＨｉｎｃＩＩで処理しておいたプラスミドベクターｐ
ＵＣ１８（ＡＴＣＣ ３７２５３）に挿入した。得られ
た組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＨＢ
１０１株（ＡＴＣＣ ３３６９４）に導入し、その後、
大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培
養物を遠心分離して菌体を採取し、通常一般の方法によ
り組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡの一部をと
り、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法に
より調べたところ、化２に示す塩基配列を含んでいた。
その後、組換えＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔ
Ｉで消化し、精製することにより、ｈＩＦＰ領域を含む
５０８個の塩基対からなるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ ＤＮ
Ａ断片を得た。
伝子を含む塩基配列の下記表１又は表２に示すプライマ
ー１及びプライマー２を化学合成し、これらプライマー
の存在下で精製ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法により遺伝子増
幅することにより、ｈＩＦＰ領域を含む約５００塩基対
からなるＤＮＡ断片を得た。常法により、このＤＮＡ断
片にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを作用させて両末端を平
滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限酵
素ＨｉｎｃＩＩで処理しておいたプラスミドベクターｐ
ＵＣ１８（ＡＴＣＣ ３７２５３）に挿入した。得られ
た組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＨＢ
１０１株（ＡＴＣＣ ３３６９４）に導入し、その後、
大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培
養物を遠心分離して菌体を採取し、通常一般の方法によ
り組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡの一部をと
り、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法に
より調べたところ、化２に示す塩基配列を含んでいた。
その後、組換えＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔ
Ｉで消化し、精製することにより、ｈＩＦＰ領域を含む
５０８個の塩基対からなるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ ＤＮ
Ａ断片を得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】
【実施例１−１（ｂ） ヒトβ−グロビンイントロン領
域を含むＤＮＡ断片の調製】エル・エス・セイン等が
『プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー』、第８７
巻、第３９２４〜３９２８頁（１９９０年）に報告して
いるヒトβ−グロビンイントロンの塩基配列に基づき、
そのＢ領域を挟みこむ下記の表３又は表４に示す塩基配
列のプライマー３及びプライマー４を化学合成した。次
いで、実施例１−１（ａ）で得たＢＡＬＬ−１細胞由来
の精製ゲノムＤＮＡの一部をとり、これをプライマー３
及びプライマー４を用いた以外は実施例１−１（ａ）と
同様に遺伝子増幅してヒトβ−グロビンイントロン領域
を含む約８５０塩基対のＤＮＡ断片を得た。常法によ
り、ＤＮＡ断片の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで
平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限
酵素ＨｉｎｃＩＩで切断しておいたストラタジーン・ク
ローニング・システムズ製プラスミドベクター『ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）』に挿入して組換えＤＮ
Ａとなし、これを実施例１−１（ａ）と同様にして大腸
菌ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた後、分離・精製し
た。組換えＤＮＡの一部をとり、挿入したＤＮＡ断片の
塩基配列をジデオキシ法により分析したところ、セイン
等が報告している塩基配列を含んでいた。その後、組換
えＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩで消化し、精
製することにより、ヒトβ−グロビンイントロン領域を
含む８４０塩基対からなるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ
断片を得た。
域を含むＤＮＡ断片の調製】エル・エス・セイン等が
『プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー』、第８７
巻、第３９２４〜３９２８頁（１９９０年）に報告して
いるヒトβ−グロビンイントロンの塩基配列に基づき、
そのＢ領域を挟みこむ下記の表３又は表４に示す塩基配
列のプライマー３及びプライマー４を化学合成した。次
いで、実施例１−１（ａ）で得たＢＡＬＬ−１細胞由来
の精製ゲノムＤＮＡの一部をとり、これをプライマー３
及びプライマー４を用いた以外は実施例１−１（ａ）と
同様に遺伝子増幅してヒトβ−グロビンイントロン領域
を含む約８５０塩基対のＤＮＡ断片を得た。常法によ
り、ＤＮＡ断片の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで
平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限
酵素ＨｉｎｃＩＩで切断しておいたストラタジーン・ク
ローニング・システムズ製プラスミドベクター『ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）』に挿入して組換えＤＮ
Ａとなし、これを実施例１−１（ａ）と同様にして大腸
菌ＨＢ１０１株に導入し、増殖させた後、分離・精製し
た。組換えＤＮＡの一部をとり、挿入したＤＮＡ断片の
塩基配列をジデオキシ法により分析したところ、セイン
等が報告している塩基配列を含んでいた。その後、組換
えＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩで消化し、精
製することにより、ヒトβ−グロビンイントロン領域を
含む８４０塩基対からなるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ
断片を得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】
【表５】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】別途、常法により、ＨＣＭＶ ＡＤ−１６
９株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８０７）のＤＮＡを採取・精製
し、プライマー５及びプライマー６の存在下でＰＣＲ法
により遺伝子増幅し、得られた約２８０塩基対からなる
ＤＮＡ断片の両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化
した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限酵素Ｈ
ｉｎｃＩＩで切断しておいたプラスミドベクターｐＵＣ
１８（ＡＴＣＣ ３７２５３）に挿入した。得られた組
換えＤＮＡを実施例１−１（ａ）と同様にして大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に導入し、増殖させた後、採取・精製し、制
限酵素ＮｒｕＩ及びＮｄｅＩで消化し、精製することに
より、ＨＣＭＶ遺伝子を含む２７７塩基対からなるＮｒ
ｕＩ−ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片を得た。
９株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８０７）のＤＮＡを採取・精製
し、プライマー５及びプライマー６の存在下でＰＣＲ法
により遺伝子増幅し、得られた約２８０塩基対からなる
ＤＮＡ断片の両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化
した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、予め制限酵素Ｈ
ｉｎｃＩＩで切断しておいたプラスミドベクターｐＵＣ
１８（ＡＴＣＣ ３７２５３）に挿入した。得られた組
換えＤＮＡを実施例１−１（ａ）と同様にして大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に導入し、増殖させた後、採取・精製し、制
限酵素ＮｒｕＩ及びＮｄｅＩで消化し、精製することに
より、ＨＣＭＶ遺伝子を含む２７７塩基対からなるＮｒ
ｕＩ−ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片を得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６６】
【実施例４ ＨｕＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを含む
形質転換体の調製】実施例３で得た組換えＤＮＡ『ｐＩ
ＦＰｈＩＦＧ』を実施例２と同様、エレクトロポレーシ
ョン法によりＢＡＬＬ−１細胞に導入した。形質転換体
を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１
６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、５％ＣＯ2イン
キュベータ中、３７℃で７２時間培養後、培養物から形
質転換体を採取し、新鮮な同じ培養培地で洗浄した。次
に、形質転換体をＧ−４１８を１ｍｇ／ｍｌ含む１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に細胞密度約４×１０5個／ｍｌにな
るように浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７
℃で約１カ月間培養後、生育細胞を採取し、クローン化
した。
形質転換体の調製】実施例３で得た組換えＤＮＡ『ｐＩ
ＦＰｈＩＦＧ』を実施例２と同様、エレクトロポレーシ
ョン法によりＢＡＬＬ−１細胞に導入した。形質転換体
を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１
６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、５％ＣＯ2イン
キュベータ中、３７℃で７２時間培養後、培養物から形
質転換体を採取し、新鮮な同じ培養培地で洗浄した。次
に、形質転換体をＧ−４１８を１ｍｇ／ｍｌ含む１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）に細胞密度約４×１０5個／ｍｌにな
るように浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７
℃で約１カ月間培養後、生育細胞を採取し、クローン化
した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６７】このようにして得た４０種類の形質転換体
につき、それぞれ別個に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清
を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞
密度約４×１０5個／ｍｌになるように浮遊させ、培養
培地にＩＦＮ−α（ＢＡＬＬ−１）をそれぞれ１００Ｉ
Ｕ／ｍｌ加え、３７℃で１５時間培養後、培養培地にセ
ンダイウイルスを約５０ＨＡ／ｍｌ加え、同じ温度でさ
らに１５時間培養した。培養物の抗ウイルス活性を調べ
たところ、発現効率が最も高い形質転換体『ＢＩＧ−７
１３』で、形質転換体４×１０5個当たり、約６，００
０ＩＵのＨｕＩＦＮ−γ産生が認められた。対照とし
て、同じ形質転換体をセンダイウイルスの非存在下で同
様に培養したところ、ＨｕＩＦＮ−γ産生は認められな
かった。このことは、本例の形質転換体が、ＩＦＮ−α
誘導剤による外部刺激により、その発現を人為的に制御
可能であることを裏付けている。
につき、それぞれ別個に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清
を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞
密度約４×１０5個／ｍｌになるように浮遊させ、培養
培地にＩＦＮ−α（ＢＡＬＬ−１）をそれぞれ１００Ｉ
Ｕ／ｍｌ加え、３７℃で１５時間培養後、培養培地にセ
ンダイウイルスを約５０ＨＡ／ｍｌ加え、同じ温度でさ
らに１５時間培養した。培養物の抗ウイルス活性を調べ
たところ、発現効率が最も高い形質転換体『ＢＩＧ−７
１３』で、形質転換体４×１０5個当たり、約６，００
０ＩＵのＨｕＩＦＮ−γ産生が認められた。対照とし
て、同じ形質転換体をセンダイウイルスの非存在下で同
様に培養したところ、ＨｕＩＦＮ−γ産生は認められな
かった。このことは、本例の形質転換体が、ＩＦＮ−α
誘導剤による外部刺激により、その発現を人為的に制御
可能であることを裏付けている。
Claims (13)
- 【請求項１】 インターフェロン−αプロモータを連結
したプラスミドベクターと、インターフェロン−α以外
のポリペプチドをコードするＤＮＡとを含んでなる複製
可能な組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 インターフェロン−αプロモータがヒト
インターフェロン−αプロモータである請求項１に記載
の複製可能な組換えＤＮＡ。 - 【請求項３】 インターフェロン−αプロモータが下記
の化１に示す塩基配列を有する請求項１又は２に記載の
複製可能な組換えＤＮＡ。 【化１】 - 【請求項４】 プラスミドベクターがＧ−４１８耐性遺
伝子、メトトレキセート耐性遺伝子及びアンピシリン耐
性遺伝子からなる群より選ばれる２種以上の薬剤耐性遺
伝子を連結する請求項１、２又は３に記載の複製可能な
組換えＤＮＡ。 - 【請求項５】 プラスミドベクターがｐｈＩＦＰ１であ
る請求項１、２、３又は４に記載の複製可能な組換えＤ
ＮＡ。 - 【請求項６】 ＤＮＡがヒトエリスロポエチン又はヒト
インターフェロン−γをコードする請求項１、２、３、
４又は５に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項１の組換えＤＮＡを哺乳動物由来
の宿主細胞に導入してなる形質転換体。 - 【請求項８】 インターフェロン−αプロモータがヒト
インターフェロン−αプロモータである請求項７に記載
の形質転換体。 - 【請求項９】 インターフェロン−αプロモータが化１
に示す塩基配列を有する請求項７又は８に記載の形質転
換体。 - 【請求項１０】 プラスミドベクターがＧ−４１８耐性
遺伝子、メトトレキセート耐性遺伝子及びアンピシリン
耐性遺伝子からなる群より選ばれる２種以上の薬剤耐性
遺伝子を連結する請求項７、８又は９に記載の形質転換
体。 - 【請求項１１】 組換えＤＮＡにおけるプラスミドベク
ターがｐｈＩＦＰ１である請求項７、８、９又は１０に
記載の形質転換体。 - 【請求項１２】 ＤＮＡがヒトエリスロポエチン又はヒ
トインターフェロン−γをコードする請求項７、８、
９、１０又は１１に記載の形質転換体。 - 【請求項１３】 宿主細胞がヒトリンパ芽球様細胞であ
る請求項７、８、９、１０、１１又は１２に記載の形質
転換体。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5342237A JPH07163368A (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | 組換えｄｎａとその組換えｄｎａを含む形質転換体 |
| CA002137120A CA2137120A1 (en) | 1993-12-15 | 1994-12-01 | Recombinant dna and transformant containing the same |
| EP94309279A EP0658627B1 (en) | 1993-12-15 | 1994-12-13 | Recombinant DNA with interferon-alpha promoter |
| DE69432340T DE69432340T2 (de) | 1993-12-15 | 1994-12-13 | Rekombinante DNS mit dem Interferon-alpha Promotor |
| US08/828,511 US5731193A (en) | 1993-12-15 | 1997-03-31 | Recombinant DNA and transformant containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5342237A JPH07163368A (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | 組換えｄｎａとその組換えｄｎａを含む形質転換体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163368A true JPH07163368A (ja) | 1995-06-27 |
Family
ID=18352181
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5342237A Pending JPH07163368A (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | 組換えｄｎａとその組換えｄｎａを含む形質転換体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5731193A (ja) |
| EP (1) | EP0658627B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07163368A (ja) |
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