JPH0739399A - Ｄｎａ解析法 - Google Patents
Ｄｎａ解析法Info
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- JPH0739399A JPH0739399A JP5189624A JP18962493A JPH0739399A JP H0739399 A JPH0739399 A JP H0739399A JP 5189624 A JP5189624 A JP 5189624A JP 18962493 A JP18962493 A JP 18962493A JP H0739399 A JPH0739399 A JP H0739399A
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- JP
- Japan
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- sequence
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 長いＤＮＡ又はＤＮＡ断片の混合物を効率良
く解析するＤＮＡ解析法を提供する。 【構成】 試料１を制限酵素により切断して得たＤＮＡ
断片の末端に既知配列のオリゴマーを接続し、既知配列
に続いて数塩基の長さの範囲にある塩基種の全ての組合
せの配列を持つオリゴマー３を固体表面に固定したＤＮ
Ａプローブチップ４を用いて、オリゴマー３とＤＮＡ断
片との間にハイブリダイゼーションをおこさせる。ハイ
ブリダイゼーションの有無を検出し、この検出結果から
ＤＮＡ断片の末端配列を知り、ＤＮＡ断片を分画、又は
そのまま解析する。 【効果】 多数の異なる配列を持ったＤＮＡ断片を同時
に解析できる。
く解析するＤＮＡ解析法を提供する。 【構成】 試料１を制限酵素により切断して得たＤＮＡ
断片の末端に既知配列のオリゴマーを接続し、既知配列
に続いて数塩基の長さの範囲にある塩基種の全ての組合
せの配列を持つオリゴマー３を固体表面に固定したＤＮ
Ａプローブチップ４を用いて、オリゴマー３とＤＮＡ断
片との間にハイブリダイゼーションをおこさせる。ハイ
ブリダイゼーションの有無を検出し、この検出結果から
ＤＮＡ断片の末端配列を知り、ＤＮＡ断片を分画、又は
そのまま解析する。 【効果】 多数の異なる配列を持ったＤＮＡ断片を同時
に解析できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ塩基配列決定など
のＤＮＡ解析法に関するものである。
のＤＮＡ解析法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、大きなＤＮＡ（例えば、１０5〜
１０6（１００Ｋ〜１Ｍ）塩基長）の塩基配列決定に
は、まずＤＮＡを酵素を用いて切断し、プラスミドなど
のベクター中にクローニング手法を用いて目的断片を挿
入し、これを大腸菌に注入し寒天倍地で培養する。得ら
れたコロニーを分別することにより断片化した目的ＤＮ
Ａを分取していた。次いで分取したＤＮＡ断片を含むプ
ラスミドを用いてＤＮＡ塩基配列決定をコロニーごとに
行っていた。通常１回の塩基配列操作で決定できるＤＮ
Ａ塩基長は３００〜５００塩基であり、１Ｍ（１０6）
塩基の決定には２０００ケ以上のコロニーを解析する必
要がある。また、異なるコロニーを取ってきても同じＤ
ＮＡ断片を含むコロニーを取る可能性もあり、２０００
ケの数倍、即ち１万ケに近いコロニーを取り、解析する
必要がある。
１０6（１００Ｋ〜１Ｍ）塩基長）の塩基配列決定に
は、まずＤＮＡを酵素を用いて切断し、プラスミドなど
のベクター中にクローニング手法を用いて目的断片を挿
入し、これを大腸菌に注入し寒天倍地で培養する。得ら
れたコロニーを分別することにより断片化した目的ＤＮ
Ａを分取していた。次いで分取したＤＮＡ断片を含むプ
ラスミドを用いてＤＮＡ塩基配列決定をコロニーごとに
行っていた。通常１回の塩基配列操作で決定できるＤＮ
Ａ塩基長は３００〜５００塩基であり、１Ｍ（１０6）
塩基の決定には２０００ケ以上のコロニーを解析する必
要がある。また、異なるコロニーを取ってきても同じＤ
ＮＡ断片を含むコロニーを取る可能性もあり、２０００
ケの数倍、即ち１万ケに近いコロニーを取り、解析する
必要がある。
【０００３】また、長いＤＮＡの解析法としてプライマ
ーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ ｗａｌｋｉｎｇ）（サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５８巻、１７８７頁
−１７９１頁、１９９２年）が知られているが、この方
法はＤＮＡを端から４００塩基位ずつ決定していく方法
である。すなわち決定したＤＮＡ鎖の末端近傍の配列を
持つオリゴマーをプライマーとして用いて配列決定を順
次行う方法である。１Ｍ塩基のＤＮＡを解析しようとす
ると２５００回の配列解析を行う必要があり、１回の解
析に１日以上必要なので、全ての解析には数年を必要と
する。
ーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ ｗａｌｋｉｎｇ）（サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５８巻、１７８７頁
−１７９１頁、１９９２年）が知られているが、この方
法はＤＮＡを端から４００塩基位ずつ決定していく方法
である。すなわち決定したＤＮＡ鎖の末端近傍の配列を
持つオリゴマーをプライマーとして用いて配列決定を順
次行う方法である。１Ｍ塩基のＤＮＡを解析しようとす
ると２５００回の配列解析を行う必要があり、１回の解
析に１日以上必要なので、全ての解析には数年を必要と
する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このように大きなＤＮ
Ａの塩基配列決定は従来非常に手間と時間のかかるプロ
セスからなっていた。更に制限酵素による切断断片のサ
イズや種類によってはクローニング操作でベクター中に
挿入しにくいものも存在し、全塩基配列決定が困難とな
る場合もあり、新しい手法の開発が望まれていた。本発
明の目的は、長いＤＮＡあるいはＤＮＡ断片の混合物を
効率良く解析するＤＮＡ解析方法を提供することにあ
る。
Ａの塩基配列決定は従来非常に手間と時間のかかるプロ
セスからなっていた。更に制限酵素による切断断片のサ
イズや種類によってはクローニング操作でベクター中に
挿入しにくいものも存在し、全塩基配列決定が困難とな
る場合もあり、新しい手法の開発が望まれていた。本発
明の目的は、長いＤＮＡあるいはＤＮＡ断片の混合物を
効率良く解析するＤＮＡ解析方法を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明では上記目的を達
成するために、本発明のＤＮＡ解析方法は、(１)長いＤ
ＮＡを酵素などを用い、特定の配列部所で切断し、切断
部に既知配列を持ち蛍光などで標識されたＤＮＡを接合
するプロセス、(２)２本鎖ＤＮＡの少なくとも末端近傍
を一本鎖とするプロセス、(３)末端の既知配列に続く目
的ＤＮＡの配列を認識して、その配列の違いにより分離
するプロセス、(４)分離されたＤＮＡを分取して配列決
定するプロセス、の各プロセスを少なくとも有してい
る。
成するために、本発明のＤＮＡ解析方法は、(１)長いＤ
ＮＡを酵素などを用い、特定の配列部所で切断し、切断
部に既知配列を持ち蛍光などで標識されたＤＮＡを接合
するプロセス、(２)２本鎖ＤＮＡの少なくとも末端近傍
を一本鎖とするプロセス、(３)末端の既知配列に続く目
的ＤＮＡの配列を認識して、その配列の違いにより分離
するプロセス、(４)分離されたＤＮＡを分取して配列決
定するプロセス、の各プロセスを少なくとも有してい
る。
【０００６】配列の違いにより分離、分取するにはＤＮ
Ａ鎖が相補的な配列と相補結合（ハイブリダイズ）する
性質を利用する。ＤＮＡ切断部に結合した既知配列の一
部と切断認識部配列とそれに続く２〜６マー（２〜６個
の核酸が連がったオリゴマー）からなる配列に相補的な
種々の種類のＤＮＡオリゴマーをその種類別に固体表面
に固定し、目的ＤＮＡ断片をこれにハイブリダイズさせ
る。目的ＤＮＡは二本鎖状態なのでアルカリ変性させて
一本鎖としたり、エキソヌクレアーゼ IIIなどの酵素
を用いて二本鎖の３'末端から部分分解し、末端部を５'
端が突出した形の一本鎖としたり、λエクソヌクレアー
ゼを用い５'末端から分解し、末端部を３'端が突出した
形とした後、固体表面に固定された種々の種類のＤＮＡ
オリゴマーとハイブリダイズさせ、目的ＤＮＡを分離す
る。これら目的ＤＮＡを上記のＤＮＡオリゴマーの種類
ごとに分取して配列を決定するが、このプロセスは種々
の種類のＤＮＡ断片について同時に行う。要約すると、
試料を制限酵素により切断して得たＤＮＡ断片の末端に
既知配列のオリゴマーを接続し、既知配列に続いて数塩
基の長さの範囲にある塩基種の多くの（できれば全て
の）組合せの配列を持つオリゴマーを固体表面に固定し
たＤＮＡプローブチップを用いて、オリゴマーとＤＮＡ
断片との間にハイブリダイゼーションをおこさせる。ハ
イブリダイゼーションの有無を検出し、この検出結果か
らＤＮＡ断片の末端配列を知り、ＤＮＡ断片を分画、又
はそのまま解析する。この方法により、長いＤＮＡ又は
ＤＮＡ断片の混合物を効率良く解析するＤＮＡ解析法を
提供でき、多数の異なる配列を持ったＤＮＡ断片を同時
に解析できる。
Ａ鎖が相補的な配列と相補結合（ハイブリダイズ）する
性質を利用する。ＤＮＡ切断部に結合した既知配列の一
部と切断認識部配列とそれに続く２〜６マー（２〜６個
の核酸が連がったオリゴマー）からなる配列に相補的な
種々の種類のＤＮＡオリゴマーをその種類別に固体表面
に固定し、目的ＤＮＡ断片をこれにハイブリダイズさせ
る。目的ＤＮＡは二本鎖状態なのでアルカリ変性させて
一本鎖としたり、エキソヌクレアーゼ IIIなどの酵素
を用いて二本鎖の３'末端から部分分解し、末端部を５'
端が突出した形の一本鎖としたり、λエクソヌクレアー
ゼを用い５'末端から分解し、末端部を３'端が突出した
形とした後、固体表面に固定された種々の種類のＤＮＡ
オリゴマーとハイブリダイズさせ、目的ＤＮＡを分離す
る。これら目的ＤＮＡを上記のＤＮＡオリゴマーの種類
ごとに分取して配列を決定するが、このプロセスは種々
の種類のＤＮＡ断片について同時に行う。要約すると、
試料を制限酵素により切断して得たＤＮＡ断片の末端に
既知配列のオリゴマーを接続し、既知配列に続いて数塩
基の長さの範囲にある塩基種の多くの（できれば全て
の）組合せの配列を持つオリゴマーを固体表面に固定し
たＤＮＡプローブチップを用いて、オリゴマーとＤＮＡ
断片との間にハイブリダイゼーションをおこさせる。ハ
イブリダイゼーションの有無を検出し、この検出結果か
らＤＮＡ断片の末端配列を知り、ＤＮＡ断片を分画、又
はそのまま解析する。この方法により、長いＤＮＡ又は
ＤＮＡ断片の混合物を効率良く解析するＤＮＡ解析法を
提供でき、多数の異なる配列を持ったＤＮＡ断片を同時
に解析できる。
【０００７】
【作用】１Ｍ塩基にもなる長いＤＮＡをそのままいきな
り塩基配列決定することは困難である。そこで、特定の
配列を認識して切断する酵素で分断し、これらＤＮＡ断
片を分離して、解析を並行して行い短時間で解析するの
が本発明の主旨である。６塩基を認識する制限酵素を用
いた場合、切断されたＤＮＡ断片の塩基の数（塩基長）
は数百程度である。各ＤＮＡ断片の末端は固有の配列を
持っており、これを認識して相補配列とハイブリダイズ
させて分画することが可能であるが、安定な相補結合の
強さをもつハイブリダイズを行うには相補配列の長さと
して１０マー以上が必要である。１０マーからなるオリ
ゴマーの種類は４10種すなわち約１０6種も存在するの
で、これらオリゴマーの種類を全て作り用意することは
容易ではない。ＤＮＡ断片の種類は数百程度であること
から、これらを識別し保持するためのオリゴマーとして
は数千種のものがあればよい。すなわちオリゴマーの長
さが５〜６マーからなる全ての種類のＤＮＡを用いれば
識別可能である。上記の５〜６マーの配列に加えて制限
酵素切断部配列と末端に結合した既知配列の一部又は全
てを含むオリゴマー配列を用いることにより、上記した
程度の種類のＤＮＡを用いて、目的ＤＮＡとの間で充分
な安定度をもつ相補結合をするＤＮＡプローブを作るこ
とができる。これら種々の種類のＤＮＡプローブが固定
された固体表面に目的ＤＮＡ溶液を流すことにより、溶
液中のＤＮＡを相補結合したＤＮＡプローブの種類別に
保持、分画できる。分画されたＤＮＡは並行してシーケ
ンス反応を行い、解析できる。混合ＤＮＡ断片種の数が
数十の場合には識別用オリゴマーとして３〜４マーのも
のを用いてもよい。
り塩基配列決定することは困難である。そこで、特定の
配列を認識して切断する酵素で分断し、これらＤＮＡ断
片を分離して、解析を並行して行い短時間で解析するの
が本発明の主旨である。６塩基を認識する制限酵素を用
いた場合、切断されたＤＮＡ断片の塩基の数（塩基長）
は数百程度である。各ＤＮＡ断片の末端は固有の配列を
持っており、これを認識して相補配列とハイブリダイズ
させて分画することが可能であるが、安定な相補結合の
強さをもつハイブリダイズを行うには相補配列の長さと
して１０マー以上が必要である。１０マーからなるオリ
ゴマーの種類は４10種すなわち約１０6種も存在するの
で、これらオリゴマーの種類を全て作り用意することは
容易ではない。ＤＮＡ断片の種類は数百程度であること
から、これらを識別し保持するためのオリゴマーとして
は数千種のものがあればよい。すなわちオリゴマーの長
さが５〜６マーからなる全ての種類のＤＮＡを用いれば
識別可能である。上記の５〜６マーの配列に加えて制限
酵素切断部配列と末端に結合した既知配列の一部又は全
てを含むオリゴマー配列を用いることにより、上記した
程度の種類のＤＮＡを用いて、目的ＤＮＡとの間で充分
な安定度をもつ相補結合をするＤＮＡプローブを作るこ
とができる。これら種々の種類のＤＮＡプローブが固定
された固体表面に目的ＤＮＡ溶液を流すことにより、溶
液中のＤＮＡを相補結合したＤＮＡプローブの種類別に
保持、分画できる。分画されたＤＮＡは並行してシーケ
ンス反応を行い、解析できる。混合ＤＮＡ断片種の数が
数十の場合には識別用オリゴマーとして３〜４マーのも
のを用いてもよい。
【０００８】
【実施例】本発明の一実施例を図を用いて説明する。解
析しようとする２本鎖ＤＮＡ試料１としてλファージＤ
ＮＡ（４８Ｋｂ）を用いた例を説明する。λファージＤ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｇ↓ＡＡＴＴＣ：即ち、制
限酵素ＥｃｏＲＩは塩基配列ＧＡＡＴＴＣを識別し、Ｇ
とＡの間で切断する。以下、同様の意味の表現とす
る。）で切断し、分解物をエタノール沈殿により分取し
た後、５’突出端ＡＡＴＴを持ち２本鎖部分がＴＧＴＡ
ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ＊ＡＣＡＴＴＴＴＧＣ
ＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＴＡＡの配列をもつ２本鎖状オ
リゴマーを酵素、ライゲース（ｌｉｇａｓｅ）を用いて
切断部に結合させる。図１において２はＤＮＡ断片中の
未知配列部分であり、＊は蛍光体等の標識体を示す。即
ち、図１に示すように３'末端配列が＊ＡＣＡＴＴＴＴ
ＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＴＡＡＧ……のＤＮＡ断片
が生成する。λファージの場合、制限酵素ＥｃｏＲＩの
切断個所は５個所と少なく、ＢａｍＨ Ｉ（Ｇ↓ＧＡＴ
ＣＣ）、Ｂａｌ Ｉ（ＴＧＧ↓ＣＣＡ）、ＢｓｐＨ Ｉ
（Ｔ↓ＣＡＴＧＡ）などで同様に試料を切断し、ライン
ゲーションにより末端に既知配列をつける。この既知配
列の３’末端近傍には蛍光体、あるいはエレクトロルミ
ネッセンス試薬であるルテニウム鎖体などを標識してお
く。もちろん放射性標識などを用いてもよい。本実施例
では標識として、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（モレキュラープ
ローブ社商標、蛍光極大波長：約６１５ｎｍ）を用い
た。これら酵素切断とライゲーションプロセスの後、λ
ＤＮＡは４０弱の断片となる。これら反応生成物にエキ
ソヌクレアーゼを加え５’末端を分解し、３’末端突出
ＤＮＡ断片にした後、エタノール沈殿を用いてＤＮＡだ
けを分取し、１×ＴＢＥバッファー１０μｌ（マイクロ
リットル）中に保持する。
析しようとする２本鎖ＤＮＡ試料１としてλファージＤ
ＮＡ（４８Ｋｂ）を用いた例を説明する。λファージＤ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｇ↓ＡＡＴＴＣ：即ち、制
限酵素ＥｃｏＲＩは塩基配列ＧＡＡＴＴＣを識別し、Ｇ
とＡの間で切断する。以下、同様の意味の表現とす
る。）で切断し、分解物をエタノール沈殿により分取し
た後、５’突出端ＡＡＴＴを持ち２本鎖部分がＴＧＴＡ
ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ＊ＡＣＡＴＴＴＴＧＣ
ＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＴＡＡの配列をもつ２本鎖状オ
リゴマーを酵素、ライゲース（ｌｉｇａｓｅ）を用いて
切断部に結合させる。図１において２はＤＮＡ断片中の
未知配列部分であり、＊は蛍光体等の標識体を示す。即
ち、図１に示すように３'末端配列が＊ＡＣＡＴＴＴＴ
ＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＴＡＡＧ……のＤＮＡ断片
が生成する。λファージの場合、制限酵素ＥｃｏＲＩの
切断個所は５個所と少なく、ＢａｍＨ Ｉ（Ｇ↓ＧＡＴ
ＣＣ）、Ｂａｌ Ｉ（ＴＧＧ↓ＣＣＡ）、ＢｓｐＨ Ｉ
（Ｔ↓ＣＡＴＧＡ）などで同様に試料を切断し、ライン
ゲーションにより末端に既知配列をつける。この既知配
列の３’末端近傍には蛍光体、あるいはエレクトロルミ
ネッセンス試薬であるルテニウム鎖体などを標識してお
く。もちろん放射性標識などを用いてもよい。本実施例
では標識として、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（モレキュラープ
ローブ社商標、蛍光極大波長：約６１５ｎｍ）を用い
た。これら酵素切断とライゲーションプロセスの後、λ
ＤＮＡは４０弱の断片となる。これら反応生成物にエキ
ソヌクレアーゼを加え５’末端を分解し、３’末端突出
ＤＮＡ断片にした後、エタノール沈殿を用いてＤＮＡだ
けを分取し、１×ＴＢＥバッファー１０μｌ（マイクロ
リットル）中に保持する。
【０００９】６ｍｍ×１０ｍｍの大きさのガラス表面
に、文献（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２５１巻、
７６７頁−７７２頁、１９９１年）と同様の手法で、種
々の種類のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡオリゴマープロ
ーブ３）を０．１ｍｍピッチで結合させたプローブチッ
プ４を作製する。プローブチップ４には、全てで６００
０個の区画ができる。図２は本実施例で使用するＤＮＡ
プローブの構造を示し、ＤＮＡプローブは、切断酵素の
種類を識別する酵素認識配列５と、各ＤＮＡプローブ間
で一部を共通配列とするためのユニバーサルプライマー
部分６と、試料ＤＮＡ配列を分離認識する部分である配
列分離認識部分７とを有している。図２のように制限酵
素切断部（酵素認識配列部）５の配列４種（制限酵素の
数だけある）とそれに続く固有配列（配列分離認識部分
である固有配列認識部７）の部分（Ｘ’- -Ｘ’）の５
マーの全ての配列（４5＝１０２４）を含む１５マーの
オリゴマーを、プローブチップ４の各区画ごとに種類を
変えて結合する。固有配列認識部７の長さを５マーとし
たがこれは２〜６マーであればよい。固有配列認識部の
長さがあまり短いと多種サンプルが重複して１つの区画
にハイブリダイズしてしまう。逆に固有配列認識部７の
長さが多過ぎると、必要なオリゴマーの種類が増大する
ため、上記のプローブチップ作製が大変となる。
に、文献（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２５１巻、
７６７頁−７７２頁、１９９１年）と同様の手法で、種
々の種類のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡオリゴマープロ
ーブ３）を０．１ｍｍピッチで結合させたプローブチッ
プ４を作製する。プローブチップ４には、全てで６００
０個の区画ができる。図２は本実施例で使用するＤＮＡ
プローブの構造を示し、ＤＮＡプローブは、切断酵素の
種類を識別する酵素認識配列５と、各ＤＮＡプローブ間
で一部を共通配列とするためのユニバーサルプライマー
部分６と、試料ＤＮＡ配列を分離認識する部分である配
列分離認識部分７とを有している。図２のように制限酵
素切断部（酵素認識配列部）５の配列４種（制限酵素の
数だけある）とそれに続く固有配列（配列分離認識部分
である固有配列認識部７）の部分（Ｘ’- -Ｘ’）の５
マーの全ての配列（４5＝１０２４）を含む１５マーの
オリゴマーを、プローブチップ４の各区画ごとに種類を
変えて結合する。固有配列認識部７の長さを５マーとし
たがこれは２〜６マーであればよい。固有配列認識部の
長さがあまり短いと多種サンプルが重複して１つの区画
にハイブリダイズしてしまう。逆に固有配列認識部７の
長さが多過ぎると、必要なオリゴマーの種類が増大する
ため、上記のプローブチップ作製が大変となる。
【００１０】プローブチップ上にＤＮＡを含む液を注入
し、ＤＮＡ断片をプローブチップ上のオリゴマーにハイ
ブリダイズさせる。３７℃で約１時間放置し、充分にハ
イブリダイゼーション反応を進行させた後、バッファー
液で洗浄する。プローブチップ上のハイブリダイゼーシ
ョンの状態は図３に示す計測系で測定する。プローブチ
ップ１０をレーザー８（ＹＡＧレーザー、発振波長：５
３２ｎｍ、出力：１０ｍＷ）でコリメータレンズ９を通
して照射し、フィルター１３付きの高感度２次元カメラ
１１で、プローブチップ１０上の蛍光像を観測する。な
お、レーザー光を細くしぼり、プローブチップの領域を
走査するようなレーザー顕微鏡などを用いても同様の計
測が可能である。図４は観測された蛍光像の画像の一例
を模式的に示したもので、異なるＤＮＡプローブが分離
された各区画に固定されたプローブアレー１４の分離区
画のうち、目的ＤＮＡ断片がハイブリダイした区画１６
から蛍光が観測されるので、その区画位置から末端の塩
基配列を知ることができる。ハイブリダイゼーションの
生じた各区画のＤＮＡを分取して活用してもよい。各区
画からのＤＮＡの分取は、特願平４−４２８２９号の
「ポリヌクレオチド捕捉用チップ」で記載の発明に基づ
いて行うことができる。また多量に分取したいときには
ハイブリダイゼーションをおこした各区画にあるオリゴ
マーと同じ配列を表面に保持した磁気ビーズを順次試料
溜中に投入し、ハイブリダイズさせては分画する操作を
繰り返したり、図５に示すように、分離区画１５がアレ
ー状に配置され、種々の種類のＤＮＡオリゴマプローブ
のそれぞれを異なる分離区画に保持（異なる複数の分離
区画に同じ種類のＤＮＡオリゴマプローブが保持されて
もよい）されたシート（薄板からなる線状ＤＮＡプロー
ブアレー１７）を複数個用意し、複数の線状ＤＮＡプロ
ーブアレー１７の位置をそれらの分離区画の配置方向で
ずらして重ね合わせて配置して、特定ライン上に分取の
対象となるＤＮＡ断片に対応するプローブが固定された
分離区画（目的ＤＮＡを補足するＤＮＡプローブ区画１
９）が一列に並ぶようにしてＤＮＡ流路１８を形成し、
ＤＮＡ流路１８に試料ＤＮＡを含む液を流すことによ
り、複数の目的ＤＮＡを順次捕捉することで効率良く分
取する方法が可能である。また、細い棒の先端にＤＮＡ
オリゴマープローブを具備した種々のプローブ棒を用意
し、必要な配列をもつプローブ棒を選択して束ねて試料
液中につけ、ＤＮＡをハイブリダイズして分取してもよ
い。即ちシート状のプローブアレーの代わりにプローブ
毎に分離して扱えるプローブ媒体を用いてもよい。分取
の対象となるＤＮＡ断片に対応するプローブが固定され
た分離区画は、複数の線状ＤＮＡプローブアレー１７を
２次元に配列して構成される２次元チップを図３、図４
で説明したような装置によりあらかじめ解析、検査して
おく。このように末端配列の知られたＤＮＡを単離し得
ることができる。ＤＮＡの長さが１Ｋｂ〜２Ｋｂあるい
はそれ以下の時にはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃ
ｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により試料ＤＮＡを増幅
できるのでプローブチップ４、プローブチップ１０、プ
ローブアレー１４、１７から直接分画し増幅したり、プ
ローブチップ４、プローブチップ１０、プローブアレー
１４、１７等の上に分画領域を他と仕切る障壁を設けて
これ等の上で直接ＰＣＲ増幅してもよい。ＰＣＲ用プラ
イマーには既知配列を含む両末端に相補なオリゴマーを
使用できる。プローブチップ上のＤＮＡオリゴマーから
なるプローブが試料ＤＮＡの３’末端側にハイブリダイ
ズし、プローブオリゴマーの３’末端側から試料ＤＮＡ
鎖に沿って相補鎖合成できる時には、まず相補鎖をプロ
ーブチップ上に形成し、これを鋳型としてＰＣＲ増幅
し、利用することもできる。この場合相補鎖から合成さ
れた試料ＤＮＡと相同な鎖を熱離脱変性させて取り出
し、計測に用いる。
し、ＤＮＡ断片をプローブチップ上のオリゴマーにハイ
ブリダイズさせる。３７℃で約１時間放置し、充分にハ
イブリダイゼーション反応を進行させた後、バッファー
液で洗浄する。プローブチップ上のハイブリダイゼーシ
ョンの状態は図３に示す計測系で測定する。プローブチ
ップ１０をレーザー８（ＹＡＧレーザー、発振波長：５
３２ｎｍ、出力：１０ｍＷ）でコリメータレンズ９を通
して照射し、フィルター１３付きの高感度２次元カメラ
１１で、プローブチップ１０上の蛍光像を観測する。な
お、レーザー光を細くしぼり、プローブチップの領域を
走査するようなレーザー顕微鏡などを用いても同様の計
測が可能である。図４は観測された蛍光像の画像の一例
を模式的に示したもので、異なるＤＮＡプローブが分離
された各区画に固定されたプローブアレー１４の分離区
画のうち、目的ＤＮＡ断片がハイブリダイした区画１６
から蛍光が観測されるので、その区画位置から末端の塩
基配列を知ることができる。ハイブリダイゼーションの
生じた各区画のＤＮＡを分取して活用してもよい。各区
画からのＤＮＡの分取は、特願平４−４２８２９号の
「ポリヌクレオチド捕捉用チップ」で記載の発明に基づ
いて行うことができる。また多量に分取したいときには
ハイブリダイゼーションをおこした各区画にあるオリゴ
マーと同じ配列を表面に保持した磁気ビーズを順次試料
溜中に投入し、ハイブリダイズさせては分画する操作を
繰り返したり、図５に示すように、分離区画１５がアレ
ー状に配置され、種々の種類のＤＮＡオリゴマプローブ
のそれぞれを異なる分離区画に保持（異なる複数の分離
区画に同じ種類のＤＮＡオリゴマプローブが保持されて
もよい）されたシート（薄板からなる線状ＤＮＡプロー
ブアレー１７）を複数個用意し、複数の線状ＤＮＡプロ
ーブアレー１７の位置をそれらの分離区画の配置方向で
ずらして重ね合わせて配置して、特定ライン上に分取の
対象となるＤＮＡ断片に対応するプローブが固定された
分離区画（目的ＤＮＡを補足するＤＮＡプローブ区画１
９）が一列に並ぶようにしてＤＮＡ流路１８を形成し、
ＤＮＡ流路１８に試料ＤＮＡを含む液を流すことによ
り、複数の目的ＤＮＡを順次捕捉することで効率良く分
取する方法が可能である。また、細い棒の先端にＤＮＡ
オリゴマープローブを具備した種々のプローブ棒を用意
し、必要な配列をもつプローブ棒を選択して束ねて試料
液中につけ、ＤＮＡをハイブリダイズして分取してもよ
い。即ちシート状のプローブアレーの代わりにプローブ
毎に分離して扱えるプローブ媒体を用いてもよい。分取
の対象となるＤＮＡ断片に対応するプローブが固定され
た分離区画は、複数の線状ＤＮＡプローブアレー１７を
２次元に配列して構成される２次元チップを図３、図４
で説明したような装置によりあらかじめ解析、検査して
おく。このように末端配列の知られたＤＮＡを単離し得
ることができる。ＤＮＡの長さが１Ｋｂ〜２Ｋｂあるい
はそれ以下の時にはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃ
ｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により試料ＤＮＡを増幅
できるのでプローブチップ４、プローブチップ１０、プ
ローブアレー１４、１７から直接分画し増幅したり、プ
ローブチップ４、プローブチップ１０、プローブアレー
１４、１７等の上に分画領域を他と仕切る障壁を設けて
これ等の上で直接ＰＣＲ増幅してもよい。ＰＣＲ用プラ
イマーには既知配列を含む両末端に相補なオリゴマーを
使用できる。プローブチップ上のＤＮＡオリゴマーから
なるプローブが試料ＤＮＡの３’末端側にハイブリダイ
ズし、プローブオリゴマーの３’末端側から試料ＤＮＡ
鎖に沿って相補鎖合成できる時には、まず相補鎖をプロ
ーブチップ上に形成し、これを鋳型としてＰＣＲ増幅
し、利用することもできる。この場合相補鎖から合成さ
れた試料ＤＮＡと相同な鎖を熱離脱変性させて取り出
し、計測に用いる。
【００１１】このように分画して得られたＤＮＡ断片か
ら通常の方法に従って塩基配列決定用の反応を行い、ゲ
ル電気泳動あるいは他の方法により配列を決定する。配
列決定用のプライマーとして、ラインゲーションに用い
たオリゴマーとの共通配列部分を活用できるので多くの
種類を用意する必要が無い。配列決定反応及び配列決定
操作（ゲル電気泳動による）は一度に多数の試料に関し
て行えるので、本発明により長いＤＮＡを分断・分画す
ればこれら分画された試料に関する配列決定を一度に行
うことができる。制限酵素による試料の断片化はいくつ
かの組合せの異なる酵素で複数回行うと全ての配列を脱
落無く決定することができる。また、一度の配列決定で
は充分な長さまで決定できない場合には、読み取ったＤ
ＮＡ配列の終点近傍にハイブリダイズするプライマーを
合成して、更に長い方の部分の配列を決定すればよい。
ら通常の方法に従って塩基配列決定用の反応を行い、ゲ
ル電気泳動あるいは他の方法により配列を決定する。配
列決定用のプライマーとして、ラインゲーションに用い
たオリゴマーとの共通配列部分を活用できるので多くの
種類を用意する必要が無い。配列決定反応及び配列決定
操作（ゲル電気泳動による）は一度に多数の試料に関し
て行えるので、本発明により長いＤＮＡを分断・分画す
ればこれら分画された試料に関する配列決定を一度に行
うことができる。制限酵素による試料の断片化はいくつ
かの組合せの異なる酵素で複数回行うと全ての配列を脱
落無く決定することができる。また、一度の配列決定で
は充分な長さまで決定できない場合には、読み取ったＤ
ＮＡ配列の終点近傍にハイブリダイズするプライマーを
合成して、更に長い方の部分の配列を決定すればよい。
【００１２】上記で説明した実施例では酵素切断部配列
に続く５マーの塩基配列で目的ＤＮＡを選別分画した
が、目的ＤＮＡ断片の種類が少ないときは２〜４マーの
塩基配列で選別分画することもできる。断片の種類が多
い場合は、ゲル電気泳動などで１０種位ずつ大まかにグ
ループに分離した後、各グループについて選別のための
短い配列を持ったオリゴマープローブを使用して解析、
検査してもよい。
に続く５マーの塩基配列で目的ＤＮＡを選別分画した
が、目的ＤＮＡ断片の種類が少ないときは２〜４マーの
塩基配列で選別分画することもできる。断片の種類が多
い場合は、ゲル電気泳動などで１０種位ずつ大まかにグ
ループに分離した後、各グループについて選別のための
短い配列を持ったオリゴマープローブを使用して解析、
検査してもよい。
【００１３】上記の実施例では、エキソヌクレアーゼを
用いて１本鎖にしたＤＮＡをハイブリダイゼーションに
より確保したが、熱変性等で１本鎖にしてからハイブリ
ダイゼーションさせて目的とするＤＮＡを確保してもよ
い。さらに引き続き相補鎖合成反応、及び熱変性を行う
ことでガラス上に固定されたＤＮＡ断片を得て、これを
配列解析に活用してもよい。また、この状態で固体表面
に固定されたプライマー（ＤＮＡオリゴマープローブ）
とユニバーサルプライマーによるＰＣＲ増幅を行いコピ
ー数を増やして解析に用いてもよい。
用いて１本鎖にしたＤＮＡをハイブリダイゼーションに
より確保したが、熱変性等で１本鎖にしてからハイブリ
ダイゼーションさせて目的とするＤＮＡを確保してもよ
い。さらに引き続き相補鎖合成反応、及び熱変性を行う
ことでガラス上に固定されたＤＮＡ断片を得て、これを
配列解析に活用してもよい。また、この状態で固体表面
に固定されたプライマー（ＤＮＡオリゴマープローブ）
とユニバーサルプライマーによるＰＣＲ増幅を行いコピ
ー数を増やして解析に用いてもよい。
【００１４】
【発明の効果】以上説明したように本発明によれば長い
ＤＮＡを切断分割し、切断分割したＤＮＡの両末端の配
列を知り、これを利用して各断片を分画することができ
る。更に分画された断片を同時に解析することにより短
時間に長いＤＮＡの解析をすることができる。例えば、
１Ｍ塩基のＤＮＡを約５００個の平均鎖長２Ｋｂの断片
にわけて並行解析すると、末端配列サーチ、分画に２〜
３日、配列決定をゲルキャピラリーアレーとプライマー
ウォーキングを用いて行うと３〜４日で行えるので約１
週間で解析でき、従来より百倍近い速さで解析すること
ができる。
ＤＮＡを切断分割し、切断分割したＤＮＡの両末端の配
列を知り、これを利用して各断片を分画することができ
る。更に分画された断片を同時に解析することにより短
時間に長いＤＮＡの解析をすることができる。例えば、
１Ｍ塩基のＤＮＡを約５００個の平均鎖長２Ｋｂの断片
にわけて並行解析すると、末端配列サーチ、分画に２〜
３日、配列決定をゲルキャピラリーアレーとプライマー
ウォーキングを用いて行うと３〜４日で行えるので約１
週間で解析でき、従来より百倍近い速さで解析すること
ができる。
【図１】本発明によるＤＮＡ解析法を説明するフロー
図。
図。
【図２】本発明で使用するＤＮＡプローブの構造図。
【図３】本発明で使用するハイブリダイゼーション反応
の有無を計測するための装置の構成の一例を示す図。
の有無を計測するための装置の構成の一例を示す図。
【図４】チップ上にハイブリしたＤＮＡからの蛍光パタ
ーンの一例を示す図。
ーンの一例を示す図。
【図５】線状ＤＮＡプローブアレーを組合せた分画方法
を示す概念図。
を示す概念図。
１…解析しようとする２本鎖ＤＮＡ、２…ＤＮＡ断片中
の未知配列部分、３…ＤＮＡオリゴマープローブ、４…
プローブチップ、５…酵素認識配列部、６…ユニバーサ
ルプライマー部分、７…配列分離認識部分、８…レーザ
ー、９…コリメーターレンズ、１０…プローブチップ、
１１…高感度カメラ、１２…データ処理機、１３…フィ
ルター、１４…プローブアレー、１５…分離区画、１６
…ＤＮＡがハイブリダイズした区画、１７…線状ＤＮＡ
プローブアレー、１８…ＤＮＡ流路、１９…目的ＤＮＡ
を捕捉するＤＮＡプローブ区画。
の未知配列部分、３…ＤＮＡオリゴマープローブ、４…
プローブチップ、５…酵素認識配列部、６…ユニバーサ
ルプライマー部分、７…配列分離認識部分、８…レーザ
ー、９…コリメーターレンズ、１０…プローブチップ、
１１…高感度カメラ、１２…データ処理機、１３…フィ
ルター、１４…プローブアレー、１５…分離区画、１６
…ＤＮＡがハイブリダイズした区画、１７…線状ＤＮＡ
プローブアレー、１８…ＤＮＡ流路、１９…目的ＤＮＡ
を捕捉するＤＮＡプローブ区画。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内
Claims (9)
- 【請求項１】ＤＮＡ鎖を切断する切断プロセスと、前記
切断プロセスにおいて切断されたＤＮＡ断片の末端近傍
の塩基配列を識別し前記ＤＮＡ断片を分画する識別分画
プロセスと、前記識別分画プロセスにおいて識別分画さ
れた前記ＤＮＡ断片のそれぞれの塩基配列を決定するプ
ロセスとを有することＤＮＡ解析法。 - 【請求項２】前記識別分画プロセスにおいて、前記ＤＮ
Ａ断片の末端近傍の塩基配列の識別を、塩基配列の異な
る複数種類のオリゴマーを塩基配列毎に分離して固定し
たアレーセンサー上で行うことを特徴とする請求項１に
記載のＤＮＡ解析法。 - 【請求項３】前記識別分画プロセスにおいて、前記ＤＮ
Ａ断片の末端近傍の塩基配列の識別を、複数種類の塩基
配列を有するオリゴマーのそれぞれをライン状に固定し
ており可動可能な、複数種類の塩基配列の検出を行うた
めのラインセンサーを複数組合せてＤＮＡ断片を分画す
ることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ解析法。 - 【請求項４】前記切断プロセスにおいて切断されたＤＮ
Ａ鎖断片の末端に、蛍光体、エレクトロルミネッセンス
試薬、放射性標識のいずれかが結合された既知の塩基配
列を有するＤＮＡを結合するステップと、前記の既知の
塩基配列を有するＤＮＡの一部分及び前記ＤＮＡ断片の
末端部近傍と、前記アレーセンサー上のオリゴマーとの
間でハイブリダイゼーションを行うことで前記ＤＮＡ鎖
断片の末端部の塩基配列を識別して分画、解析を行なう
ことを特徴とする請求項２もしくは請求項３に記載のＤ
ＮＡ解析法。 - 【請求項５】前記切断プロセスにおいて切断されたＤＮ
Ａ鎖断片の末端に、蛍光体、エレクトロルミネッセンス
試薬、放射性標識のいずれかが結合された既知の塩基配
列を有するＤＮＡを結合するステップをさらに有するこ
とを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ解析法。 - 【請求項６】前記オリゴマーの配列が、前記の既知の塩
基配列を有する標識されたＤＮＡの少なくとも一部の配
列と、試料ＤＮＡ鎖の酵素により識別される酵素切断認
識部の配列と、それに続く酵素切断部近傍の少なくとも
２塩基の長さの塩基配列とを含む一連の塩基配列に対し
て相補的な塩基配列を有することを特長とする請求項４
に記載のＤＮＡ解析法。 - 【請求項７】ＤＮＡ試料から切断されたＤＮＡ断片の末
端部の塩基配列を識別し、前記末端部におけるＤＮＡの
ハイブリダイゼーションを利用して、前記ＤＮＡ断片を
分画するプロセスを含むことを特徴とするＤＮＡ解析
法。 - 【請求項８】２本鎖ＤＮＡ試料を制限酵素を用い一定の
塩基配列の部位で切断するプロセスと、既知の塩基配列
を有し蛍光体で標識されたＤＮＡオリゴマーを切断され
たＤＮＡの末端部位に接合するプロセスと、２本鎖ＤＮ
Ａの少なくとも末端近傍を一本鎖とするプロセスと、前
記末端部位の前記の既知の塩基配列に続くＤＮＡの塩基
配列を認識してその塩基配列の違いにより切断されたＤ
ＮＡ分離するプロセスと、分離されたＤＮＡを分取して
配列決定するプロセスとを少なくとも有することを特徴
とするＤＮＡ解析法。 - 【請求項９】ＤＮＡ試料を制限酵素により切断して得た
ＤＮＡ断片の末端に既知の塩基配列のオリゴマーを接続
し、前記の既知の塩基配列に続いて数塩基の長さの範囲
にある塩基種の組合せの配列を有する複数種のオリゴマ
ーを固体表面に固定したＤＮＡプローブチップを用い
て、前記オリゴマーと前記ＤＮＡ断片との間にハイブリ
ダイゼーションをおこさせ、ハイブリダイゼーションの
有無を検出し、この検出結果から前記ＤＮＡ断片の末端
の塩基配列を検出し、前記ＤＮＡ断片を前記ＤＮＡプロ
ーブチップ上で分画、又は解析することを特徴とするＤ
ＮＡ解析法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18962493A JP3951309B2 (ja) | 1993-07-30 | 1993-07-30 | Ｄｎａ解析法 |
| US08/263,663 US5650274A (en) | 1993-06-25 | 1994-06-22 | DNA analyzing method |
| EP99124555A EP0989193B1 (en) | 1993-06-25 | 1994-06-23 | DNA analyzing method |
| EP94109745A EP0630972B1 (en) | 1993-06-25 | 1994-06-23 | DNA analyzing method |
| DE69431317T DE69431317T2 (de) | 1993-06-25 | 1994-06-23 | DNS-Analyse Verfahren |
| DE69425697T DE69425697T2 (de) | 1993-06-25 | 1994-06-23 | DNS-Analyse Verfahren |
| US08/812,698 US5824481A (en) | 1993-06-25 | 1997-03-06 | DNA analyzing method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18962493A JP3951309B2 (ja) | 1993-07-30 | 1993-07-30 | Ｄｎａ解析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0739399A true JPH0739399A (ja) | 1995-02-10 |
| JP3951309B2 JP3951309B2 (ja) | 2007-08-01 |
Family
ID=16244414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18962493A Expired - Fee Related JP3951309B2 (ja) | 1993-06-25 | 1993-07-30 | Ｄｎａ解析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3951309B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009159965A (ja) * | 1997-12-15 | 2009-07-23 | Somalogic Inc | 診断用核酸リガンドバイオチップ |
-
1993
- 1993-07-30 JP JP18962493A patent/JP3951309B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009159965A (ja) * | 1997-12-15 | 2009-07-23 | Somalogic Inc | 診断用核酸リガンドバイオチップ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3951309B2 (ja) | 2007-08-01 |
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