JPH07504650A - 細胞外マトリックスの蓄積を防止するためのトランスフォーミング増殖因子βの阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

細胞外マトリックスの蓄積を防止するためのトランスフォーミング増殖因子βの 阻害 ｌ胛亘背１ 本発明は、一般に増殖因子に関し、特に過剰な細胞外マトリックスの生産におけ るトランスフォーミング増殖因子βの影響に関する。 種々の病変は、細胞外マトリックス物質の有害な蓄積に特徴がある。例え・ば、 進行性の糸球体の病気において、細胞外マトリックスが、糸球体間質中に、また は糸球体基底膜に沿って蓄積し、その結果、末期の病気および尿毒症を引き起こ す。同様に、成人または急性呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）は、肺でのマトリック ス物質の蓄積をも含み、一方、肝硬変は、肝臓中の搬痕によって証明される有毒 なマトリックスの蓄積に特徴がある。 糖尿病は、現在、進行性の腎不全が最も一般的な原因であり、これも細胞外マト リックス成分の有害な蓄積によって特徴がある状態になる。インスリンの導入は 、糖尿病の治療を革新し、劇的に患者の生存期間を長くした。しかしながら、イ ンスリンは糖尿病性ネフロパシーのような重度の合併症には効果がなかった。血 液中のグルコースの厳密なコントロール、高血圧の治療、および飲食物のタンパ ク質の制限は、腎臓機能が消失する速度を遅らせ得るが、末期段階の病気へ着実 に進行する。 糖尿病性ネフロパシーの中心となる病理学的特徴は、糸球体中の細胞外マトリッ クスの蓄積である。細胞外マトリックスの蓄積の原因となる糖尿病環境における 因子は、十分に理解されていない。 細胞外マトリックスは、プロテオグリカン、糖タンパク質、およびコラーゲンの 混合物で、集合した複雑な超構造を形成する。様々な免疫学的な、血液力学的な 、および毒性の因子が、実験的に糸球体病を誘起するために用いられたが、これ らの因子のどれもが、細胞外マトリックス成分の合成または分解に直接的な影響 を示さなかった。それ故、急性の細胞傷害と糸球体の細胞外マトリックスの構築 との間には、別の介在過程があるようである。 従って、腎臓病のような病理学的段階におけるマトリックス成分の有害な蓄積を 調節する因子を決定する必要がある。 さらに、不適切なマトリックスの蓄積を含む病理学的状態を防止、制限、または 治療するための因子を制御する必要がある。本発明は、これらの必要性を満足し 、さらに、関連する有利点も提供する。 １１亘１１ 本発明は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の活性を抑制する薬 剤と組織を接触させることによって、組織中に細胞外マトリックス成分の蓄積を 阻害する方法を提供する。 同様に、本発明は、また同化を促進し、繊維症および脈管形成を誘導するペプチ ド増殖因子である、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の活性を抑 制する薬剤を提供することによって、細胞外マトリックス成分の蓄積に特徴があ る病変の進行を防止または治療する方法を提供する。薬剤は、例えば、抗ＴＧＦ −β抗体、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有 するペプチド、デコリン、またはバイグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）のような機 能的に等しいものであり得る。治療され得る病変には、糸球体腎炎、ＡＲＤＳ、 肝硬変、線維症性ガン、肺の線維症、動脈硬化症、後部心筋梗塞、心臓性線維症 、血管形成後再狭窄、腎臓間質性線維症、廠痕および、糖尿病性ネフロパシーの ような糖尿病関連病変を含む、様々な線維症性の病気が含まれる。 本発明は、さらに、細胞外マトリックス成分の過度の蓄積に特徴がある組織病変 、特に糖尿病性ネフロバシーの存在を検出する方法に関する。この方法は、組織 中のＴＧＦ−βのレベルを測定し、次いでこのレベルを正常細胞中のＴＧＦ−β のレベルと比較することによって、行われる。 本発明は、さらに、インスリンおよびＴＧＦ−βの活性を抑制する薬剤を投与す ることによって糖尿病を治療する方法を提供する。また、そのような薬剤を含む 、本発明の方法に有用な組成物も提供される。 （以下余白） 図面の簡単な説明 図１は、ｍＲＮＡの７−ザンブロ／ティングの結果を示す。このｍＲＮＡは、う ／トの糸球体がら単離され、（Ａ　）ＴＧＦ−β１、（Ｂ）パイグリカン、およ び（Ｃ）グリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）　（これは う７・ト糸球体中で本質的に発現し、た酵素）に対するｃＤＮＡプローブとハイ ブリダイズされた。コントロールラット（ＣＬ　インスリンで治療したコントロ ールラノ）（ＣＩ）、糖尿病う、・ト（Ｄ）、および糖尿病を誘起してから１５ 週間後にインスリンで治療した糖尿病ラット（ＤＩ）がら単離した糸球体から調 製した。分子量マーカーを左側に示す。 図２は、コントロールラットおよび糖尿病ラットの糸球体中に、−フィブロネタ 千ノ、ソイプロ不りヂュ／ＥＤＡ＋（図２Ａ）、およびテ不インン（図２Ｂ）の 交互に結合した形の定量を示す。＊印は、同じ時点にお１ｊる正常コントロール （Ｃ）と比較した、糖尿病ラット（Ｄ）、およびインスリンで治療

【、た糖尿病 ラット（ＤＩ）に一ついて、ｐぐ０．０１を示す。インスリンで治療した正常コ ントロールラット（ＣＩ）を比較のために含む。インスリンで治療（、なかった 糖尿病動物は、３７週間以降は生存しながった。従って、４０週間目のデータは 無い。値は平均上標準偏差である。 図３は、抗ＴＧＦ−β１抗体で染色した糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を示す 。（Ａ）正常コントロールラットの糸球体の染色。（Ｂ）糖尿病を誘導した１５ 週間後にインスリンで治療しなかった糖尿病ラットからの糸球体の染色は、ＴＧ Ｆ−βｌに対して陽性の細胞数の著しい増加を示す。陽性の細胞を糸球体の糸球 体間質および上皮細胞として同定した。糖尿病の糸球体では、コントロールラッ トからの糸球体と比較して、糸球体１個当りに著しく陽性の細胞があり、それは 参３２±１対２５±１（値は、平均±標準偏差、ｏｐ＜０．０１）であった。写 真を６０秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。倍率ｘ　５００゜図４は、 抗フィブロネクチンＥＤＡ十抗体で染色した糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を 示す。（Ａ　）４０週間インスリンで治療し、た、正常コントロールラットの糸 球体が、かすかに染色されたことを示す。（Ｂ）４０週間インスリンで治療した 、糖尿病のラットからの糸球体の染色は、著しく染色が増加することを示す。写 真を６０秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×５００゜ 図５は、抗ＴＧＦ−β１抗体で染色したヒト糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を 示す。（Ａ）正常な腎臓からの糸球体のかすかな染色、および（Ｂ）最小の病状 変化を有する患者の腎臓からの糸球体のかすかな染色。（ＣおよびＤ）進行した 糖尿病の糸球体硬化症の徴候である、重症のマトリックス蓄積のみられる２人の 患者からの糸球体は、免疫反応性のＴＧＦ−β１タンパク質で鮮やかに染色され ることを示す。マトリックスの蓄積が少ない初期の糖尿病の腎症の他の症例では 、染色パターンは、進行したヒトの疾患のこうした場合にみられるパターンと、 図３Ｂに示した、発病１５週の糖尿病ラットにみられるパターンとの中間であり 、それは、ＴＧＦ−β１染色パターンが疾患の重篤さで連続していることを示唆 し、最初は個々の細胞の染色を示し、そして後に細胞毎の染色が曖昧になる程度 まで増加する。（Ｄ）この顕微鏡写真は、糸球体を包む上皮嚢（ポーマン嚢）に おける染色を示す。写真を６０秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。＠率 ｘ５００ａ 図６は、抗フィブロネクチンＥＤＡ十抗体で染色したヒト糸球体の免疫蛍光を示 す。（Ａ）正常な腎臓がらの糸球体、および（Ｂ）最小の病状変化を有する患者 からの糸球体は、ゎずかに染色される。（ＣおよびＤ）一方、糖尿病の糸球体硬 化症の２人の患者は、異常糸球体内およびその周りの嚢（ポーマン嚢）で強い染 色を示した。写真を６０秒の同じ露光時間、同−条件図７は、　ＴＧＦ−β１． ２．３の活性の、組換えヒトデコリンによる中和を示す。増殖阻害を測定するミ ンクの肺細胞アッセイを、イソ型のＴＧＦ−βの活性を中和する組換えデフリン の能力をアッセイするために使用した。［３Ｈ］チミジンの取り込みを、Ｙａｍ ａｇｕｃｈｉら、ＬＬＬＬＩＪ　３４６：２８１　（１９９Ｇ＞（これは本明細 書中に参考として援用されている）に記載のように、ＴＧＦ−βの存在、および デフリン（０）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　（・）の濃度の増加で決 定した。データは、ＴＧＦ−βｌで誘導した増殖阻害の中和のパーセントを表す 。〔２Ｈ１チミジンの取り込みが、ＴＧＦ−βおよびデフリンのどちらにも無い 場合を、１００％と定義する（ＴＧＦ−β１およ、びＴＧＦ−７３３ニツイテは １２５．０ＯＯｅｐｓ；　ＴＧＦ−Ｒ２については１０７．０００ｃρ■）。Ｔ ＧＦ−βには取り込みが存在するが、デフリンには存在しない場合を、０％と定 義する（丁ＧＦ−β１については５７．０００ｃｐｗ；　ＴＧＦ−β２１こつい ては７ｇ、ＯＯＯｃｐｍ；　ＴＧＰ−Ｒ３については５９．０ＯＯｃｐｌ）。そ れぞれの点は二連の試料からの結果の平均を表す。 図８は、デフリンで治療した糸球体腎炎のラットの糸球体におけるフィブロネク チンの堆積を示す。（Ａ）リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、蛋白アルブミン （Ｏｖ＾）、アグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）　（八〇Ｃ）、またはウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）、または様々な量のデフリンを６回注射した、正常コントロ ールラット、およびコントロール糸球体腎炎ラットからの糸球体中のフィブロネ クチン染色の定量。デフリンを４回または６回注射して治療したラットは、同じ 治療を行っ、た疾患コントロールラットまたはデフリンで治療しなかった疾患コ ントロールラットあるいはデフリンを２回注射して治療した疾患コントロールし く少なかった（ｐ　＜０．０１）。（Ｂ）抗フィブロネクチン抗体で染色した、 糸球体腎炎ラットからの糸球体の免疫蛍光の顕微鏡写真。ラットをデフリン注射 で治療しなかった（ＮＤ）　（すなわちＰＢＳのみ）、または２日間デフリン注 射で治療した（２Ｄ）、４日間デフリン注射で治療した（４Ｄ）または６日間デ フリン注射で治療した（６Ｄ）。いずれの動物の場合も、糸球体の数の平均の最 大標準誤差は、低い糸球体間の変数を示す０，１６であった。 例示した糸球体のマトリックス数は：　ＮＤ、　３．５；　２０．３．５；　４ Ｄ、　２．Ｑ；　ｓｏ、　２．０である。写真を４０秒の露光時間、同一条件下 で撮影した。倍率×５００゜ 図９は、デフリンで治療した糸球体腎炎ラットの糸球体中の、ＥＤ＾◆フィブロ ネクチン、およびテネイシンの蓄積を示す。 （Ａ）糸球体におけるＥＤ＾＋フィブロネクチン染色の定量。符号は、図８Ａに 記載の通りである。デフリンの注射を４回または６回したラットは、他の全ての 糸球体腎炎群と比較して、ＥＤＡ◆フィブロネクチンの堆積から有意に保護され ていた（ｐｒ。 、Ｏｌ）。（Ｂ）抗ＥＤＡフィブロネクチン抗体で染色した糸球体腎炎ラットか らの糸球体の免疫蛍光の顕微鏡写真。符号は、図８Ｂに記載の通りである。いず れの動物の場合も、糸球体の数の平均の最大標準誤差は、低い糸球体間の変数を 示す０．１１であった。例示した糸球体の最大数は：　ＮＤ、　４．０；　２Ｄ 、　ｉｓ；　４Ｄ。 ｔ、ｏ；　６Ｄ、　１．５である。写真を６０秒の露光時間、同一条件下で撮影 した。倍率Ｘ５０００抗テネイシン抗体で染色した、糸球体腎炎う・１トからの 糸球体の、免疫蛍光の顕微鏡写真もまた、得た。ラットをデフリンを４回または ６回注射して治療したところ、ラットは、デフリンで治療しなかったラットまた はデフリンを２回注射して治療したラットが有するよりも少ないテネイシンを糸 球体中に有していた。ＥＤＡ＋フィブロネクチンおよびテネイシンはどちらも、 デフリンで治療しなかったう・１トまたはデフリンを２回注射して治療したラッ トの腎炎の糸球体において、著しく増加していた。 （以下余白） Ｒ１目しｌｌＪ」１咀 本発明は、トランスフ矛−ミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の活性を抑制する薬 剤と組織とを接触させることによって、組織中の細胞外マトリックス成分の蓄積 を阻害する方法を提供する。本発明はまた、細胞外マトリックスが産生ずるＴＧ Ｆ−βの活性を抑制するのに有効な量の薬剤と組織とを接触させることによって 、組織中の細胞外マトリックスの蓄積に特徴がある病変を治療する方法を提供す る。薬剤は、抗ＴＧＦ−β抗体、ＰＤＧＦ、またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含 有するペプチドであり得る。好ましくは、この゛ようなＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｇｐ を含有するペプチドは、４と５０との間のアミノ酸の長さである。 薬剤はまた、デフリン、デフリン類似体、またはデフリンとｍ能的に同等なもの であり得る。本明細書中で用いる「デフリン」は、［ｒｕｓｉｕｓおよびＲＬＩ ＯＩＩ！ｂＬＩ％　ｍ　１１３：）６３８（１９１１６）中のプロテオグリカン に帰属される構造的特徴を実質的に有するプロテオグリカンを指す。ヒト線維芽 細胞デコリンは、［ｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔ＋、上述に示されるア ミノ酸配列を実質的に有する。「デフリン」は、天然の組成物、および、デフリ ンフラグメントのような実質的に機能的特徴を保持しているデフリン改変物の両 方を指す。デフリンコアタンパク質は、もはや、実質的にグリコサミノグリカン で置換されてな（、そしてデフリンの定義に含まれないデフリンを指す。酵素処 理、突然変異、または、グリコサミノグリカン鎖をコアタンパク質に結合できな い細胞中で、組換えデコリンを産生するような他の手段によって、グリコサミノ グリカンを含まないデフリンを得られ得る。 デフリンと機能的に同等なものとしては、デフリンの機能的特徴を保持するデフ リン改変物、および、パイグリカンおよびフィブロモジュリンのようなデフリン と同族で、例えばデフリンと類似の機能的活性を有する分子を含む。改変物は、 例えば、デフリンファタンパク質の機能的活性を妨げない１つまたはそれ以上の 側鎖を含み得る。 上記の薬剤に加えて、本発明は、そのような薬剤の同族体および類似物の使用を 包含することを意図する。本明細書中で、同族体とは、上記薬剤と実質的に類似 の構造を有する分子であり、類似物とは、構造的類似にかかわらず実質的に生物 学的類似性を有する分子である。 機能的な同等物、同族体、または類似物が、本発明の目的に対して機能するかど うかは、当業者であれば、それを本明細書中で提供される実施例に置き換えるこ とによって容易に決定し得る。 接触は、インビトロまたはインビボにおいて行われ得る。 インビトロでの接触では、細胞を有効な量の薬剤と共にインキュベートし得る。 インビボでの接触では、薬剤を単独または担体と共に投与し得る。投与方法は、 当業者にはよく知られており、静脈内注射または筋肉的注射を含むが、これらに 限定されない。薬剤を、連続的または断続的に投与し得る。 有効な量は、病変および治療する固体に依存して変わる。 本発明の方法は、哺乳動物、最も好ましくはヒトの治療または防護に有用である 。 本発明は、さらに、組織中のＴＧＦ−βのレベルを測定し、そして組織中のＴＧ Ｆ−βのレベルを正常組織中のＴＧＦ−βのレベルと比較することによって、細 胞外マトリックス成分の過度の蓄積に特徴がある組織の種々の病変の存在を検出 する方法に関する。組織中のＴＧＦ−βレベルの上昇は、そのような病変を示す 。また、組織中のフィブロネクチンＥＤＡ＋および／またはテネイシンの検出は 、非直接的に、ＴＧＦ−βの過度や活性を示す。 本発明の方法で治療し得る病変は、細胞外マトリックスの蓄積に特徴がある。こ れらの病気は、一般に線維症性の病気であり、例えば、糸球体腎炎、成人または 急性呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、および肝硬変を含む。また、類線維履、線維 腫、線維腺腫、および線維肉腫を含む、例えば、胸、子宮、または膵臓の線維症 性ガン、ならびに、線維細胞の病気、線維硬化症、および線維症も含まれる。さ らに、本方法は、肺線維症、動脈硬化症、後部心筋梗塞、心臓性線維症、および 血管形成後書狭窄のような線維症状態、ならびに腎臓間質性線維症の治療に用い られ得る。本方法はまた、ケロイド性廠痕のような過度の廠痕形成、および外傷 、火傷、または外科手術による搬痕の治療または防止にも用いられ得る。本方法 はまた、糖尿病性腎臓病のような糖尿病関連の病変を防止または阻害するのにも 用いられ得る。しかしながら、これらの病変は、単なる代表例にすぎず、当業者 であれば、本方法が細胞外マトリックスの蓄積に関連するあらゆる病変に有用で あることは容易に理解される。 増殖因子の多様性は、細胞外マトリックス産生において役割を担っていることが 示唆された。しかしながら、マトリックス成分の病理学的蓄積におけるそれらの 影響は明らかでなかった。本発明は、病理学的にマトリックスの蓄積をしやすい 組織は、特にブＯｆ　ｉグリカンを合成するという発見に基づ＜１．ＴＧＦ−β と反応する抗体のような、ＴＧＦ−βの活性を阻害する薬剤は、プロテオグリカ ン産生に対するＴＧＦ−βの刺激効果をプロ、りする４二、！：が見いだされた 。、二の点で、ＴＧＦ−βはヂストした増殖因子の中では独特であり、したがっ て、このＴ　（’ｉ　Ｆ−βの特異的効果を操作する、−とは、種々の病変にお けるマトリックス成分の不適切で望ましくない蓄積を制御または治療する」二で 有用である。 ＴＧＦ−βは、組繊の（８害後の修復および再生を調節するのに重要な役割を担 っている多機能性サイトカインである。ＴＧＦ−βの３つのイソ型、ＴＧＦ−β １．２、および３が、哺乳動物で発現され、現在までインビトロで類似の特性を 示す。血小板は、高濃度のＴＧＦ−βを含有し、そして、傷害部位での脱顆粒に おいてＴＧＦ−βを周囲の組織に放出する。続いて、ＴＧＦ−βは、（１）単球 、好中球、および線維芽細胞の化学吸引、（２）ＴＧＦ−β産生の自動誘導、な らびに、インターロイキン１　（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子、および他のサイト カインを分泌する単球の刺激、（３）脈管形成および細胞増殖の誘導、（４）効 力のある免疫抑制剤および過酸化物放出のインヒビターとして作用することによ る炎症および細胞毒性の制御、および、（５）細胞外マトリックスの増加した堆 積を含む、治療を促進する一連のイベントを開始する。 細胞外マトリックスに対するＴＧＦ−βの効果は、その機能的活性の重要な特徴 である。Ｅｄｗａｒｄら、訪皿６：１８９９（１９ｇ？）およびＬａ１ｈｏら、 Ｊ、Ｂｊｏ　、Ｃｈｓｍ、　２ｔｉ２：１７４６７（１９ｇ？）に記載されてい るように、ＴＧＦ−βは、フィブロネクチン、コラーゲン、およびプロテオグリ カンのような個々のマトリ・ツクス成分の合成を刺激し、同時に、プロテアーゼ の合成を減少させ、プロテアーゼインヒビターのレベルを増加させることによっ てマトリックスの分解をブロックする。ＴＧＦ−βはまた、インテグリンの発現 を増加させ、そして、ＩｇｎｏｔｚおよびＭａｓｓａｇｕｅ、　江ｕ５１：１８ ９（１９８７）に報告されているように、マトリックスへの接着を促進し得るよ うな方法で細胞表面上のインテグリンの相対割合を変化させる。 ＴＧＦ−βの成熟形態は、それぞれが１１２アミノ酸の２つの同様の鎖からなる 。ＴＧＦ−βは、種々の病変で見られる細胞外マトリックスの増加した合成の原 因である。ＴＧＦ−βのアミノ酸配列を次に示す： （以下余白） Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｇｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　 Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＣｙｓＣｙｓ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇ ｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ工ｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｙ　ＴｒｐＬｙｓ　Ｔｒｐ工ｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａａｎ　Ｐｈａ　Ｃｙｓ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｐ ｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ工ｌｅ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈ ｒ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＶａｌ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ 　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ 　ＡｌａＰｒｏ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ＴｙｒＴｙｒ　Ｖａｌ　Ｇ ｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓ ｅｒ　Ａｓｎ　Ｍａｔ工１ｅＶａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ 　Ｓｅｒ特定の腎臓病変は、細胞外マトリックス成分の増加した蓄積に特徴があ る。例えば、糸球体間質細胞は、腎糸球体を構成する１つの細胞タイプである。 正常な糸球体では、糸球体間質細胞は、細胞外マトリックスで囲まれている。高 細胞質を伴うまたは伴わない糸球体間質マトリックス量の増加は、糸球体腎炎の 多くの形態および糖尿病性ネフロパシーにおける、最も初期の組織学的知見であ る。培養糸球体間質細胞は、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、 エンタフチン、トロンポスポンジン、およびコラーゲン！型、ＩＩＩ型、ＩＶ型 、およびＶ型を含む、数種のマトリックス成分を分泌することが知られている。 しかしながら、糸球体間質マトリックスの正確な組成および超分子的構築は、そ の合成アセンブリおよび分解を制御する因子と同様に知られていない。 糸球体間質マ）　ＩＪフックス組成を制御する因子を研究するために、培養中の 糸球体間質細胞を、ＩＬ−１、ＰＤＧＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびＴＧ Ｆ−βで処理した。培地の分析は、ＴＧＦ−βはプロテオグリカンとして同定さ れるパイグリカンおよびデフリンの２つの成分の量を増加させることを示した。 Ｐ　ＤＧ　Ｆ。 ＩＬ−１、およびＴＮＦは、コントロールを越える顕著な効果を示さなかった。 糸球体間質細胞への特定の免疫学的傷害によって、糸球体腎炎を誘起し得る。糸 球体細胞傷害を伴う動物から単離した糸球体は、パイグリカンおよびデフリンの 産生の増加を示す。 さらに、培養した腎炎糸球体からの馴化培地は、正常糸球体間質細胞のパイグリ カンおよびデフリンの合成を刺激する。 同等の刺激効果を、外因性のＴＣＰ−βの添加によって引き起こされ得る。さら に、抗ＴＧＦ−β抗血清のようなＴＧＰ−βの効果をブロックする薬剤は、外因 性のＴＧＦ−βの刺激効果をブロックする。モノクローナル抗体またはポリクロ ーナル抗体、ＰＤＧＦ、　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するペプチド、デフリ ン、あるいはそれと機能的に同等なものを含む、このような薬剤を、有害なマト リックスプロテオグリカン合成を特異的に制御または治療するのに用い得る。従 って、このような薬剤を、例えば、搬痕形成のような細胞外マトリックス蓄積に 関連するあらゆる状態を防止すること、または、組織をＴＧＦ−β活性を抑制す る薬剤と接触させることによって組織中の細胞外マトリックスの蓄積を特徴とす る病変を治療することに用い得る。 ＴＧＦ−βにおけるデフリンの効果を、糸球体腎炎モデルを用いて研究した。デ フリンは、ＴＧＦ−βの本来の調節剤であるようなので、このモデルにおいてイ ンビボで活性であるべきであり、もしそうであるなら、ＴＧＦ−βの作用に拮抗 させて治療的に用いるための理想的な分子である。組換えヒトデコリンおよびつ ７組織から精製したデフリンの静脈内投与を用いて、糸球体腎炎のラットの腎臓 における、プロテオグリカンがマトリックス蓄積を抑制する能力をテストした。 糸球体中に存在するフィブロネクチンの量を用いて、糸球体腎炎における、デフ リンのマトリックス堆積をブロックする能力を定量的に評価した。フィブロネク チンは、ラットおよびヒトの正常な糸球体間質マトリックスに豊富に存在するタ ンパク質であり、そして、ヒトでは糸球体間質増殖性糸球体腎炎に伴って大きく 増加する。　Ｃｏｕｒｔｏｙら、　Ｊ、Ｃｅ　１．Ｂｉｏｌ、８７：６９１（１ ９８０）、Ｃｏｕｒｔｏｙら、　Ｊ、ｉｓｔｏｃｈｅｍ、ｃ　ｔｏｃｈｅｍ、３ ０：８７４（１９１１２）、Ｏｏｍｕｒａら、ヱ’ｒｃｈｏｖｓ　ｒｃｈ’ｖ、 　ａｔｈｏｌ、Ａｎａｔ、４１５：１５１（１９８９）、　Ｂｏｒｄｅｒ、Ｋ皿 匹り立ム３４：４１９（１９８ｇ）。マトリックスのマーカーとして染色したフ ィブロネクチンを用いることにより、ラット糸球体腎炎モデルにおいて７日まで に起こる急性マトリックス構築を、デフリンが顕著に防止することが見いだされ た。εＤＡ＋フィブロネクチンおよびテネイシンは、ＴＧＦ−β活性およびマト リックス蓄積に対するより特異的なマーカーを提供した。なぜなら、これらのタ ンパク質は、正常な成熟ラット腎臓ではほとんど検出できないからであり、そし て、それらはＴＣＰ−βによって強く誘起されるからである。両方のマーカーと も、腎炎糸球体中で増加し、そして両方ともデフリンの注射によって抑制された 。結局、マ）　ＩＪフックス築に対する効果が、事実上治療的であったというこ とが、本明細書中に参照として援用されているＧｉｎｓｂｅｒｇら、Ｎ、Ｅｎ　 １．Ｊ、Ｍｅｄ、　３０９：１５４３（１９８３）に記載されているように、ヒ トの糸球体損傷の指標として広く用いられるタンパク尿が平行して減少すること によって示された。 急性糸球体間質増殖性糸球体腎炎をもまた、動物モデルにおいて、全体参照とし て援用されている米国特許出願系０７７４１６．６５６号に記載の抗胸腺細胞血 清ラットに注射することによって誘起した。傷害糸球体は、正常糸球体よりも、 ＴＧＦ−β園ＲＮＡを多く発現し、より多くのＴＧＦ−βタンパク質を合成し、 そしてより多くのフィブロネクチンおよびプロテオグリカンを分泌することが見 いだされた。ＴＣＰ−βの活性を中和し得る抗血清の腎炎ラットへの注射は、糸 球体によるマトリックス成分の産生を抑制し、そして糸球体間質マトリックスの 構築を防止した。 糖尿病性ネフロバシー（すなわち糖尿病性腎臓病）の進行は、最も頻繁に起こる 重度の糖尿病合併症であり、インスリンでの治療にもかかわらず約半分の患者で 最終的に起こる。 糖尿病性ネフロパシーの顕著な組織学的特徴は、結果として毛細管閉塞および硬 化症を伴う、糸球体の糸球体間質領域における細胞外マトリックスの膨張である 。糸球体間質マトリックスの膨張は、タンパク尿、高血圧、および腎不全の臨床 的徴候と強く相関している。 細胞外マトリックスの蓄積が病的になる、糸球体腎炎と糖尿病性ネフロパシーと のマトリックス異常の類似性は、ＴＧＦ−βが糖尿病性腎臓病に関わっている可 能性を示唆した。本発明によって、ストレプトシトシンの注射によって糖尿病に なったうｙトの糸球体が、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡおよびＴＧＦ−β１タンパク質 の発現の著しい増加を含むことが示される。糸球体はまた、細胞外マトリックス タンパク質の択一的にスプライシングされた形態である、フィブロネクチンおよ びテネイシンの堆積の増加を示した。これらの成分は両方とも、ＴＧＦ−βによ って誘導されることが知られている。これらの結果は、ＴＧＦ−βはまた、糖尿 病性°ネフロパシーの進行に寄与していることを示している。 本発明に関係する研究において、インスリン欠乏を生じるなったラットの腎臓を 試験した。ストレプトシトシンモデルは、両方とも本明細書中で参照として援用 されている、Ｖｅｌａｓｑｕｅｚら、ＦＡＳＥＢ　４：２８５０（１９９０）お よびＭａｕｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　２５：８５０（１９７６）に記載されて いるように、動物が、ヒトの糖尿病性ネフロバシーに似た腎臓病を進行させるの で広く用いられている。ラットを、処置を受けていない群、または、実施例Ｉ＋ に記載のように毎日・インスリンの注射で血中のグルコースを減少させる処置を 受けた群に分けた。正常で年齢のそろった雄ラットをコントロールとして用い、 これらも処置を受けない群または糖尿病う、トと同じインスリン養生法で処置さ れた群に分けた。糖尿病におけるＴＧＦ−βの発現を評価するために、糖尿病ラ ットおよびコントロールラットの糸球体中の、ＴＧＦ−β　１ＲＮＡおよびＴＧ Ｆ−β１タンパク質のレベルを試験した。 ■ＲＮＡ分析は、コントロールに比べて糖尿病ラットの糸球体中のＴＧＦ−β１ 　ｍＲＮＡレベルが上昇していることを示した（図ＩＡ）。 ＴＧＦ−β１　ｍＲＮＡのレベルは、糖尿病の徴候後の時間と共に増加し、表１ に示すように、未処置の糖尿病ラットではインスリンを投与されたラットに比較 してより高かった。 表１ ＴＧＦ−β１　ｍＲＮＡのＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対する比１週　１．０　１．０ 　１．２　１．２６週　１．０　１．０　２．１　１．６１５週　１．０　１． １　３．４　１．９八゛イク″リカンａＲＮＡのＧＡＰＤ）Ｉ　＋＊ＲＮＡに対 する比１週−１，０１，０１，１１，２ ６週　１．０　１．１　１．９　１．３１５週　１．０　１．０　２．３　１． ６新しく合成されたＴＧＦ−β１を認識すると考えられる抗体を用いた糸球体の 染色では、コントロールよりも糖尿病ラットの細胞の方が著しく陽性を示したく 図３Ａおよび３Ｂを参照）。 ＴＧＦ−β１陽性細胞は、単球／マクロファージまたはリンパ球のマーカーでは 染色されなかったが、糸球体間質および／または上皮細胞に特徴的な染色パター ンを示した。 糖尿病ラットの糸球体中に発現するＴＧＦ−βは、細胞外マトリックス産生を刺 激する活性があるかどうか研究するため、そのような糸球体を、フィブロネクチ ン（フィブロネクチンＥＤＡ＋）およびテネイシンの択一的にスプライシングさ れた形態ヲ検出する抗体で染色した。これらのマトリックス成分は、Ｂｏｒｄｅ ｒら、■ｉヨ１ｎｔ、３７：６８９（１９９０）およびＮａｋａ渇ｕｒａら、口 ０υｕ−１Ｌ４１：１２１３（１９９２）に記載されるように、ＴＧＦ−βによ って誘導される。マトリックス成分はまた、組織修復部位に現れるｏ　ｒａｎｇ ら、ＬＬＬ９Ｌ工■Ｌ２６６：１５５９８（１９９１）およびＰｅａｒｓ。 ｎら、ＥＭＢＯＪ、７：２９７７（１９８８）。また、フィブロネクチンＥＤＡ ＋およびテ不イシンは両方とも、光学顕微鏡検査によると腎臓組織学的に正常で ある時期である、高血糖症進行後６週間もの早期に糖尿病う、）の糸球体中で顕 著に増加し、そして時間と共に蓄積し続けることが見いだされた（図ＩＡおよび ＺＢ）。 Ｎｅｒｌｉｃｈおよび５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ、　Ａｙｓ　Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、１ ３９：８８９（１９９１）に記載されているように、間質性コラーゲンＩＩＩ型 は、糖尿病性ネフロバソーに伴ってヒトの硬化性の糸球体中で見いだされるが、 正常なヒトまたはラット糸球体中では見いだされナイ。 ＩＩＩ型コラーゲンを、６．１５、および４０週時の糖尿病ラットの糸球体中に 堆積しているのを見いだした。ＴＧＦ−βを、正常なラットの糸球体間質細胞ま たは上皮細胞の培養物に加えると、ＴＧＦ−βと結合してその活性を中和し得る プロテオグリカンである、デフリンおよびパイグリカンの産生を誘導することが 知られている。ラットデコリンｍＲＮＡとは異なるラフトパイグリカンは、対応 するヒトｃＤＮＡプローブと交差ハイブリダイズするので、パイグリカンｍＲＮ Ａレベルをテストした。バイグリカンｄＮＡレベルの上昇を、図ＩＢおよび表１ に示すように、糖尿病ラノ１−の糸球体において検出した。これらの結果は、Ｔ ＧＦ−βが積極的にそして特異的に糖尿病ラットの糸球体におけるマトリックス 成分の産生を誘導しているということをさらに示す。 表１は、糸球体でのＴＧＦ−β１　ｍＲＮＡおよびパイグリカン■ＲＮＡの発現 を示す。図１に記載のように、ノーインブロッティング分析を、各群の動物から 単離した糸球体から調製したＲＮＡを用いて行った。３つの時点で、各実験群を 、２つの独立した実験を行うために用いる２つの等しい群に分けた。フィルムを 、レーザー密度計を用いてスキャンした。定量的比較をするために、ＴＧＦ−β １およびパイグリカンｍＲＮＡと、同じレーン中のコントロールのグリセルアル デヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）　ｗＲＮＡバンドとの密度 比を算出した。続いて、結果を、正常コントロール動物（Ｃ）の比を１．０とし たときの比の相対変化として表した。値は、２つの実験の平均である。 これらの結果は、糖尿病糸球体中のマトリックスの拡大と傷のような組織損傷後 の修復過程との間で類似していることをさらに示す。両方の過程においても、細 胞外マトリックスの局所的産生の増加に関連するＴＧＦ−β　ｍＲＮＡおよびＴ ＧＦ−βタンパク質の初期の発現がある。ＴＧＦ−βによって誘導されるマトリ ックス成分である、フィブロネクチンＥＤＡ＋およびテネイシンが、傷の治療中 および糖尿病糸球体中に優先的に発現される。ＩＩＩ型コラーゲンは、正常な糸 球体中では見いだされないが、糖尿病糸球体中および治療している傷に現れる。 傷の修復の重要な特徴は、過度の鍛痕を避けるために過程を終わらせる必要性で ある。 糖尿病患者では、腎臓への波及は、Ｋｎｏｖｌｅｓ、　Ｋｉｄ工堕＝上旧工銘戊 旧工１：５２（１９７４）；Ｄｏｒｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３３：２７１ （１９８４）；およびＭａｕｅｒら、Ｊ、Ｃ、ｎｖｅｓｔ、　７４：１１４３（ １９８４）に記載されているように糖尿病発病の１０年から２０年後に起こり、 糸球体が細胞外マトリックスによって機能しなくなるまで進行する。糖尿病のス トレプトシトシンモデルでは、光学顕微鏡で糸球体異常が見えるようになるには 、６力月またはそれ以上必要であり、ヒトでは２０年またはそれ以上に相当する 期間が必要である。従って、糖尿病の患者および実験動物における糸球体硬化症 は、組織修復過程の調節または終結の慢性的不全を示唆し、おそら＜　ＴＧＦ− βの持続した活性を包含している。糖尿病における、組織修復への刺激は、イン スリン治療にもかかわらず起こる慢性的な関連性のない高血糖症であるようであ る。 高血糖症は、腎臓での血行力学的変化およびグリコジル化タンパク質の血中レベ ルの上昇ような、多くの器官特異的および全身的変化を引き起こすことが知られ ている。 従って、本発明はさらに、糖尿病患者のＴＧＦ−βの活性を阻害することによっ て糖尿病性ネフロバシーを防止する方法に関する。ＴＧＦ−β活性の阻害は、例 えば、糖尿病腎臓組織を、抗ＴＧＰ−β抗血清、ＰＤＧＦ、　Ａｒｇ−Ｇｌｙ− Ａｓｐを含有するペプチド、デフリン、またはそれと機能的に同等なもののよう なＴＧＦ−βの効果をブロックする有効量の薬剤と接触させることによって成し 遂げられる。 さらに本発明は、有効量のインスリン、および、上述のようなＴＧＦ−βの効果 をブロックする有効量の薬剤を投与することによって、糖尿病を治療する方法を 提供する。 本発明の方法に有用な組成物もまた提供される。このような組成物は、ＴＧＦ− βの活性を抑制する薬剤を含み、上述の薬剤および担体を含有する。本発明の１ つの実施態様では、組成物は薬学的組成物である。薬学的に受容可能な担体には 、例えば、ヒアルロン酸および水溶液（重炭酸酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、リン ゲル液および所望によって５％デキストロース、またはヒト血清アルブミンを補 給した生理食塩水など）が含まれる。当業者に知られる他の担体もまた考慮され る。 薬学的組成物はまた、細胞外マ）　＋７ツクスの蓄積に特徴があるかまたは関連 する種々の病変の防止または治療に有用な他の薬剤を含有し得る。例えば、糖尿 病の場合、薬学的組成物は任意にインスリンを含み得る。 糖尿病ラットで得られた結果とヒト糖尿病性ネフロパシーとの関連を示すために 、６症例の糖尿病性糸球体硬化症（糖尿病性ネフロバシーの末期）、３症例の正 常コントロール、ならびに３症例の最小の病状変化および３症例の薄幕底膜疾患 からなる６症例の疾患コントロールを試験した。コントロールの病気は、タンパ ク尿および／または血尿を引き起こすが、これまでにほとんど糸球体硬化症にな らないことが知られている糸球体障害であるため、それらを選んだ。糖尿病性糸 球体硬化症の６症例のすべての糸球体が、図５および６に示す２症例のように、 ＴＧＦ−β１およびフィブロネクチンＥＤＡ＋に対して強（陽性であった。組織 の量が限られているため、研究をこれら２つのマーカーに限った。これとは対照 的に、正常および病気の各コントロールは陰性またはほんのわずかな染色を示し たく図５および６）。 これらの知見は、糖尿病性ネフロバシー中の糸球体マトリックスの膨張と実験的 糸球体腎炎との間の類似、および、病気と傷のような組織損傷に統（修復過程と の間の連結を確立する。両方とも、細胞外マトリ、クスの局所的産生の増加に関 連するＴＧＦ−β　ｍＲＮＡおよびＴＧＦ−βタンパク質の早い発現がある。Ｔ ＧＦ−β、フィブロネクチンＥＤＡ＋、およびテネイシンによって誘導されるマ トリックス成分は、治療している傷、および、この研究で示されるような糖尿病 ラット糸球体中で優先的に発現される。傷の修復の重要な特徴は、過度の廠痕を 避けるために、この過程を終結させる必要性である。糖尿病患者の糸球体硬化症 の進行は、ＴＧＦ−βの持続した活性を生じる、組織修復過程の調節または終結 の慢性的不全を示唆し、そして、ＴＧＦ−βの発現が一時的で、そして病気が元 に戻り得る糸球体腎炎モデルにおける本発明者らの知見と対照をなす。糖尿病患 者では、腎臓への波及は、糖尿病発病の１０年またはそれ以上の後に起こり、糸 球体が細胞外マトリックスによって機能しなくなるまで進行する。糖尿病のスト レプトシトシンモデルでは、糸球体異常が見えるようになるまでに、数カ月が必 要であり、ヒトでは１０年またはそれ以上の期間が必要である。 （以下余白） 以下の実施例は例示を意図するものであって、本発明を限定するものではない。 実施例　■ ７・′　日　および７、　（こよって！　されるマトリックスに・　る　の、、 ｆ Ａ、　および ブタのＴＧＦ−β１を、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、　（Ｍｉｎｎｅａ ｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手した。ヒト血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）およ び組換えヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）　、アルファおよびベータを、 Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、　（Ｂｅｄｆｏｒ ｄ、ＭＡ）から入手０ａｋｓ、　ＣＡ）から入手した。ヤギ抗ヒトＩ型コラーゲ ン抗体、およびヤギ抗ヒトＩＩＩ型コラーゲン抗体を、５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ、　（Ｂｉｒｍｉｎｇ ｈａｍ、ＡＬ）から購入した０　ウサギ抗マウスフィブロネクチン、およびコラ ーゲン１型、コラーゲン１型Ｉ型、コラーゲン１型、およびコラーゲン１型、お よび抗ラットラミニン抗体は、すでに述べている。簡潔に言えば、ウサギポリク ローナル抗体を、完全フロインドアジュバントに乳化した各精製タンパク質をニ ューシーラントウサギに皮下注射することにより生成した。最初の免疫感作の３ 週間後に、不完全フロインドアジュバントに乳化した精製タンパク質を連続して １週間ごとに筋肉内注射した。２回目の注射を、耳の動脈からの５０ｍ１の血液 と共に行った。血液を凝結し、血清を遠心分離によって集めた。ラットに対する モノクローナル抗体Ｔｈｙ−１を、Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（ Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　Ｎ、　Ｙ、　）から人手し、そしてヤギ抗ヒト第Ｖｌｌ＋ 因子を、Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔ。 ｒｙ　Ｉｎｃ、　（Ｋａｎｋｏｋｅｅ、ＩＬ）から入手した。 ウサギ抗うットＦｘｌＡ抗体を、Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎの方法に従って、Ｓｐｒａ ｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腎臓から調製したＦＸ　ＩＡで免疫感作すること によって生成した。簡潔に言えば、ウサギを、超遠心分離によって単離した、腎 臓近位尿細管の刷子線内に富化した調製物によって、上記のように免疫感作した 。ＦＩＴＣおよび標識したアルカリホスファターゼ、または抗ウサギＩｇＧおよ び抗ヤギＩｇＧを、Ｃａｐｐｅｌ　（Ｍｅｌｖｅｒｎ、ＰＡ）から入手した。 Ｂ、！１ｕｌｌ 糸球体上皮細胞および糸球体間質細胞を、６から８週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａ ｖｌｅｙラットから得た、未処理の糸球体の外植部分（ｏｕｔｇｒｏｖｔｈ）か ら得た。糸球体間質細胞の単離および培養を、以下のように行った。 雄Ｓｐｒａｇｕｅ／Ｄａｗｌｅｙラット（１００ｇ−１４０ｇ、単離物につき２ 匹のラットを使用）を、ケタミン（Ｌｏｎｇ／ラットｌｏｏｇ）およびＲｏｗｐ ｕｓ　（０，５＋ａｇ／ラット）を用いて麻酔し、モしてベタジン（ｂｅｔａｄ ｉｎｅ）を用いて滅菌した。腎臓を外科的に露出させ、リン酸緩衝化生理食塩水 を用いて潅流した。次いで、腎臓を取り出し、滅菌し水冷したＰＢＳ中に入れた 。 腎臓を２等分し、そして皮質を外科的に除去した。残存組織を外科用メスを用い て１１ＩＩ３小片に刻んだ。次いで、刻んだ腎臓組織をＰＢＳで連続して洗浄し て、一連のふるい（１４９メツシユおよび１０５メツ／ユ）にかけた。次いで、 １０５メツ／二のふるいにかけた物質を、７４メツシユのふるい上に集めた。こ れは糸球体画分を表す。 この両分を臨床用遠心分離機で１０分間遠心分離し、そしてベレットを２０％の ラン胎児血清、０．６６単位／ｍｌのインスリン、および抗生物質を含有するＲ ＰＭＩ　１６４０培地（Ｃｅ１ｌ−Ｇｒｏ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　 Ｃ，）中に再懸濁した。糸球体を腎臓２個相当分、Ｔ７５（７５ｃ＋ｅ”）フラ スコ中の１２ｍ１の培地中に入れた。糸球体間質細胞を約３週間培養した後接着 した糸球体から培養した。新鮮な培地をこの培養期間中、３−４日毎に添加する 。 上皮細胞を単離するために、未処理の糸球体をＶｉｔｒｏｇｅｎ”（Ｃｏｌｌａ ｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）でコートしたフ ラスコ中に入れた。増殖培地は、２０％の加熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ） （Ｉ（ｙｅｉｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）　、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０ ０μｇ／ｌのストレプトマイシン、０．６６０／ａｔのインスリンおよび３００ ＩＩｇ／ｍｌのし一グルタミンで補足したＲＰＭＩ　１６４０　（Ｃｅｌｌ−Ｇ ｒｏ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，）であった。７日後、外植細胞を０ ．０２５％のトリプシンー０．５ＭのＥＤＴＡ　（Ｆｏｌｖ　Ｌａｂｓ、ＭｃＬ ｅａｎ、ＶＡ）で分離した◇　この物質を３０−メノンユスクリーンを通すこと により、糸球体の破片を除去した。間接バンニング技法を用いることにより、非 常に富化した上皮細胞集合体を生成した。とりわけ、糸球体を上記のように単離 し、そして０．１５ＩＩ＋ｇ／ｍｌのラットの尾部コラーゲンＩ型で前もってコ ートした組織培養皿上にプレートした。皿を室温で１時間コートし、次いでＰＢ Ｓで２回洗浄した。 １週間培養後、細胞の外植部分（主として上皮細胞）および糸球体を、０．０５ ％のトリプ／ンー０．５３ｏＭのＥＤＴＡを用いてトリプシン処理を行った。細 胞懸濁液を３０メツシユを通して、糸球体小片を除去した。残存細胞懸濁液を、 Ｔｈｙ　１抗原に対するモノクローナル抗体であらかじめコートした皿上にプレ ートした。糸球体間質細胞は抗原を発現するが、上皮細胞は抗原を発現せず、従 って懸濁液中に残るので、糸球体間質細胞のみがＴｈｙ　１抗体に結合する。こ の手順により、糸球体間質細胞を優先して取り出した。プレートを４°Ｃで２４ 時間抗体（約１ｏｏμｇ／ｍｌ）でコートした。細胞を抗Ｔｈｙ　１抗体でコー トした皿上で、３７°Ｃで１時間インキュベートした。結合していない細胞を集 めて、再びプレートした。糸球体間質細胞を、マウス抗Ｔｈｙ−１抗体で４℃で １２時間前もってコートした、ａｏｘ　１５ｍｍのポリスチレンプレートに添加 した。接着していない細胞を取り出し、そしてラミニン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔ ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）で前もってコートした ら一ウェルプレートに入れた。 糸球体上皮細胞を、以下により同定した：ｌ）特性ボリゴナル形態学；　２　） 　ＦＸＩＡ　Ｏｌｅｙｍａｎｎ抗原）に対する抗体での均一染色：３）プロマイ シンのアミノヌクレオシドに対する感度：４）抗Ｔｂｙ−１あるいは抗第Ｖｌｌ ＋因子抗体で染色されないこと。近位尿細管細胞による糸球体上皮細胞の汚染を 、アルカリホスファターゼ染色により検査し、そして２％未満の細胞がアルカリ ホスファターゼ陽性であった。それに対して、糸球体間質細胞を以下により同定 した：１）典型的星状外観；２）抗Ｔｈｙ−１抗体での均一染色；３）抗ＦＸＩ Ａ、または抗第Ｙｌ１１因子抗体で染色されないこと；および４）プロマイシン のアミノヌクレオシドに対する感度がないこと。 Ｃ１支１或腹肚盗】 通常のプレート、またはラミニンでコートした６ウエルの多ウェルプレートに、 糸球体上皮細胞および糸球体間質細胞を、ｌウェル当り５　Ｘ　１０５個の細胞 の濃度で添加し、そして無血清ＲＰＭＩ　１６４０培地中で２４時間培養して、 細胞増殖を停止した。 接着していない細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することにより 、除去した。血清および抗生物質を含有していないＲＰＭＩ　１６４０を３５Ｓ 硫酸塩標識の低硫酸塩培地として、および）５３メチオニン標識のメチオニン（ Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ、ＭｃＬｅａｎ、ＶＡ）を含有しないＲＰＭＩ　１６４０と して添加した。増殖因子を４８時間、以下の濃度で、培地に添加した：　ＴＧＦ −β（２５％ｇ／ｓｌ）、ＰＤＧＦ（２Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１α（５Ｕ／ｍｌ） 、ＩＬ−１β（５ＬＩ／＋１）およびＴＮＦ（５００Ｕ／ｍｌ）。本実験終了１ ８時間前に、タンパク質を標識するために３５８メチオニン（１００μＣ４／ｍ ｌ）を、またはプロテオグリカンを標識するために３５３硫酸塩（２００μＣ４ ／＋ｅｌ）を、培養物に添加した。 アイソトープをＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍ Ａ）から購入した。馴化培地、および細胞層を、上記のように採取し、処理した 。細胞増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込みにより試験した。ラミニンでコートし た１２ウエルのプレートに、２×１０５／ウエルの濃度で、細胞を添加した。２ ４時間後、無血清培地内で、１０μＣ４／＋＊ｌの３Ｈ−チミジン溶液２５μｌ を、それぞれのウェルに添加した。２４時間インキュベーシプンを行った。培養 培地を捨て、細胞層を５％のＴＣＡ溶液で２回洗浄し、そして６ＮのＩＩｃＩ溶 液７００μｌで１５分間インキュベートした。３Ｈ−チミジンの取り込みを、液 体シンチレーシコンカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ。 １ｒｖｉｎｅ、　ＣＡ）中のそれぞれの細胞層をカウントすることにより測定し 、モしてＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ 、　ＩＬ）によって測定した、それぞれの細胞層のタンパク質含量を用いて、較 正した。 Ｄ、マトリックス　の石 マトリックス糖タンパク質を免疫沈降によって同定し、そしてプロテオグリカン を酵素での消化によって同定した。抗血清１００μｍを、馴化培地ＳＯＯμｌに 、または増殖因子を添加した、あるいはしなかった重複ウェルから収集した細胞 抽出液３００μｍに添加することにより、免疫沈降を行った。重複ウェル中で、 細胞を分離し、そして細胞数の均一性を確認するためにカウントした。予め免疫 を有する血清を、並行したコントロール実験において用いた。試料をウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）で前もってコートした４ｍｌのコニカルチコープ内で混合し ながら、４℃で一晩インキユベートした。プロティンＡセファロースビーズ（Ｓ ｉｇｍａ、　５ＩＬｏｕｉｓ、　ＭＯ）を２２℃で６０分間、新鮮なＲＰＭＩと 前もってインキュベートした。抗原−抗体複合体を沈降するために、懸濁したプ ロティンＡセファロース５０μｍを、試料に添加し、そして４°Ｃで１２０分間 混合した。試料を２０００Ｘ　Ｇで１０分間、遠心分離し、そして上澄み液を除 去した。 ベレットを、０．５Ｍ　ＮａＣ！、０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ｐＨ７ ，４）を含有する、水冷したＰＢＳｌｍｌで１０回洗浄した。最終的に、ベレッ トを水冷したＰＢＳで洗浄し、新しいチューブに移し、再度遠心分離し、そして ３回ＰＢＳで洗浄した。ベレットを、３％のＳＤＳ。 および１０％のβメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　 ＭＯ）を含有する５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液４０μｌ中に溶解し、５分間煮 沸した。 グリコサミノグリカン分解酵素での消化を、ＴＧＦ−βによって調節したプロテ オグリカンの型を決定するために用いた。 生合成標識を行った後、馴化培地上で消化を行った。培地のアリコート２５μｍ を、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはフンドロイチナーゼＡＣの１００ミリ単位 （両者は１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ酢酸カルシウ ム、２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ中）あるいはヘパリナーゼＩ＋　１００ミリ単位（５ ０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１αＭ塩化カルシウム、５０１Ｍ 酢酸カルシウム中）と混合した。全ての試料に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭベン ズアミジン、１００μｇ／ｍｌ　ダイズトリブシンインヒビター、１０Ｍｇ／ｍ ｌ　ロイペプチン、および１０Ｍｇ／ｍｌアンチパインも、添加した。全ての物 質は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｃ＋＋＋１ｃａｌ　Ｃｏ。 （Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）より入手した。フンドロイチナーゼを含有する混 合物を、３７℃で１．５時間インキュベートした。インキュベーション終了時に 、試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥのために調製した。 大きなプロテオグリカンを、ゲル濾過によって特徴付けした。セファロースＣＬ −６８カラムからの、３５Ｓ硫酸塩で標識した画分を、蒸留水で透析し、凍結乾 燥した。試料を、上記のプロテアーゼインヒビターを含有する、０．１Ｍ酢酸ナ トリウム、０、ＩＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ７，３）　２　ｍｌに溶解した。次いで、 コンドロイチナーゼＡＢＣ溶液（１，２５単位／ａｌ）　０．２＋＊ｌを、試料 １．８ｉ１に添加し、３７℃で２４時間消化を行った。次いで、試料をＣＬ−６ Ｂカラム上で分画し、蒸留水で透析し、凍結乾燥し、そして低ｐＨ（１，０）条 件下で亜硝酸で処理した。亜硝酸処理後、試料をＣＬ−６Ｂカラム上で再度クロ マトグラフィーを行った。 ＴＧＦ−βによって誘導される、プロテオグリカン生成の増加を定量するために 、馴化培地３ＩｌｌをセファロースＣＬ−６Ｂカラム（１，３ｘ　１００　ａｍ ）にのせた。カラムを、４Ｍ尿素、０．１５Ｍ　ＮａＣＬ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 　ＨＣＩ（ｐＨ７，２）、０．１％（ｖ／Ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で、 流速２０１７時間で溶出し、そして３　ｍｌ／チューブの画分を収集した。それ ぞれの溶出画分の放射活性を、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ　２８００液体シンチレー ／ヨンカウンターによって測定した。 Ｅ、１気瓜ｌ広 試料を、以下の実施例１１に記載のように、フルオログラフィー、およびデンン トメトリーによる５ＤＳ−ＰＡＧＥによって、分析した。 Ｆ、ｕ 前述の研究結果によって、ＴＧＦ−βは、上皮細胞によるパイグリカン、フィブ ロネクチン、およびＩＶ型コラーゲンの生成を調節する一方、培養した糸球体間 質細胞により生成するプロテオグリカンに、ＴＧＦ−βのみが作用する、という ことが示される。従って、ＴＧＦ−βによって調節された上皮細胞による、マト リ１クス生成の生合成プロフィルは、糸球体間質細胞による場合と異なる。より 具体的には、これらの結果から、糸球体中のＴＧＦ−βが放出されることによっ て糸球体間質マトリックスが、蓄積し、そして糸球体底膜を形成する、マトリッ クス分子の生成において増加することが、証明される。この結果を表２に要約す る。 （以下余白） 表２ 立　の７、　による　タ マトリックスのＴＧＦ− プロテオグリカン パイグリカン　↑↑↑↑　↑　↑↑↑↑　０デコリン　↑↑↑↑　↑　↑　０ ネクチン　０　↑　↑↑↑↑　↑↑↑↑■型　０　０　ＮＰ　ＮＰ Ｉｌｌ型　０　０　ＮＰ　ＮＰ １ｖ型　０　０　↑↑↑　↑↑↑ Ｖｌ型　０　０　ＮＰ　ＮＰ 実施例１１ Ａ、ラットにおける　の　２ Ｖｅｌａｓｑｕｅｚら、巳ΣＪ４：２８５０　（１９９０）、およびＭａｕｅｒ ら、Ｄｉａ■工ｅｓ　２５：８５０　（１９７６）（これらは共に本明細書中に 参考とじて援用されている）に記載のように、６．５ｍｇ／体重１００ｇで、ク エン酸緩衝液中のストレプトシトシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ａｉｃａｌ　Ｃｏ 、、Ｓｔ。 Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を単回静脈内注射することにより、１５０グラムの体重の 雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙう、トに糖尿病を誘導した。血中のグルコース レベルが＞　３００ｍｇ／ｄＬである４８匹の糖尿病ラットを、２つの群に分け た。第１の糖尿病の群（Ｄ）には、治療を施さず、第２の群（Ｄｌ）には、毎日 ３．５ＵのＮＰＨインスｌノン（ＥｌｉＬｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ 、　ＩＮ）を皮下注射することにより治療した。４８匹の成熟した雄う・ノドを 、コントロールとして用ζ）、そしてインスリンを与えない群（Ｃ）に分割する か、また（ま糖尿病ラットと同様にインスリン摂取により治療した（ＣＩ）。 それぞれの群の血中グルコースレベルを、１０週間後、−晩絶食させた後の、８ ：００　ａ、ｍ、に測定し、モしてＢ／ｄＬでの値を表３に報告する。値は、平 均上標準偏差である０表３ グルコースレベル Ｄ　４５６±３８ ＤＩ　３２９±３１ （以下余白） １．６．ｌ５ｔｊよび４０週間後、それぞれの群の６匹のラットを、腎臓を切除 するために、１０ｍｇ／体重１００ｇのＬＭ塩塩酸ケタノンおよび０．５ｍｇ／ 体重１００ｇのキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）で麻酔した。 インスリンを投与しない糖尿病ラット（Ｄ）は、３７週間以降生存せず、従って ４０週間目の分析は欠けている。全ての技法の間中、腎臓はインサイチュで、冷 リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ１，４で潅流し、次いで切除した。皮 質の小片を、免疫学的試験のために取り出し、そして、Ｏｋｕｄａら、Ｊ、　Ｃ １１ｎＩｎｖｅｓｔ、　８６：４５３（１９９０）（これは本明細書中に参考と して援用されている）に記載のように、糸球体をｍＲＮＡ検出のために、残存組 織から単離した。マトリ／ラス成分を免疫蛍光法で数えた。 Ｂ、　ＲＮＡの−１および １％２−メルカプトエタノールおよび０．５％　ラウリルサルコシルを含む、グ アニジンインチオシアネート（ＧＩＴＣ）溶液（４Ｍ　ＧＩＴＣ：　ｏ、ｓ％ｖ ／ｖ　Ｎ−イソリルサルコシン、０．１％消泡剤Ａ１０、ＩＭβ−メルカプトエ タノール、２５ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，０））　３−４ｍ１中の単離糸 球体（８−９Ｘ１０’個の細胞）を溶解することにより、全ＲＮＡを調製した。 溶解物を、塩化セシウムの密度グラジエントクツンヨンて、１５０，０ＯＯＸ　 ｇで超遠心分離した。遠心分離後、チューブの底の層からＲＮＡを回収した。４ ０μｇのＲＮＡを、それぞれの時点の群毎にプールし、そして２．２Ｍホルムア ルデヒドおよび０．２Ｍ　ＭＯＰＳ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 、　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）ｐＨ７，０を含む、１％アガロースゲルで電気 泳動し、そして０゜２ミクロンのナイロンメンブレン（ＩｃＮ　Ｒａｄｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ。 、Ｉｒｖｉｎｅ、　ＣＡ）に、キャピラリープロッティングにより一晩トランス ファーする。 ＲＮＡ　（４０Ｐｇ）相当量を、２６０ｎｍでの吸光度に基づいてロードした。 メンブレンを、５ＸＳＳＣ（１リツトルの最終量に対して、２０ｘＳＳＣ：　１ ７５．３ｇ　ＮａＣ１，８８，２ｇクエン酸ナトリウム、ＩＯＮ　ＮａＯＨでｐ Ｈ７，０にする）、５×デンハート溶液（５ｏ×溶液＝５８フイコール、５ｇポ リビニルピロリドン、５ｇ　ＢＳＡ、　Ｈ２（０〜５００１１１）、５０ｍＭ　 ’Ｊ　７酸＋　トＩＪ　ラム（ｐＨ６，５）、０．１％ＳＤＳ、　２５０Ｐｇ／ ｍｌの音波処理による変性サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）、および５０％ホルムアミド）中で、３７ ℃で５時間プレハイブリダイズした。 マウスｃＤＮＡを得るために、マウスＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡからの旧ｎｃＩ＋ で消化したｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫＩビ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ 　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）に、Ｚ８０ｂｐのＰｖｕ　ＩＩフラグメントをサブクロ ーン化した。このマウスＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡは、［）ｒ、Ｒ，Ｄｅｒｙｎｃ ｋから得、そして、Ｄｅｒｙｎｃｋら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１ ：４３７７　（１９８６）（これは本明細書中に参考として援用されている）に 記載されている。成熟ＴＧＦ−β１の２９８−３９０位のアミノ酸をコードする 、挿入物の位置付けを決定し、そして、プラスミドを、塩化セシウムの濃度遠心 分離により精製し７た。この濃度遠心分離は、Ｋｏｎｄａｉａｈら・Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３＋１８３１３　（１９８８）（これは本明細書中に 参考として援用されている）に記載のように行われた。 マウスｃＤＮＡプローブ、う・ｙ　トＧＡＰＤＨｃＤＮＡプローブ（これはＤｒ 、　Ｍ、　Ｂ、　５ｐｏｒｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　 Ｈｅａｌｔｈ　（ＮＩＨ）より得た）、およびヒトバイグリカンｃＤＮＡプロー ブ（プラスミドｐ１６ＮこれはＤｒ、　Ｌ、　Ｗ、　Ｆｉｓｈｅｒ、　ＮＩＨよ り得た）を、ランダムプライマー法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ 、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）により３２Ｐ−ＣＴＰ　（シトシン三リ ン酸）で標識し、そして４２°Ｃで一晩ハイブリダイズした。メンブレンを、２ 　Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで、室温で５分間ずつ、３回洗浄し、そして０． ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳで、５０℃で１５分間ずつ３回洗浄した。標準法に よりオートラジオグラフィーを行った。フィルムをレーザーデンシトメーター（ Ｌ）ｆＢ、　Ｂｒｏｍｍａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてスキャンした。定量的な 比較のために、同じゲルレーン中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡバンドの濃度に対するＴ ＧＦ−β１およびパイグリカンｍＲＮＡバンドの濃度の比を算出した。次いで、 正常のコントロール動物（Ｃ）の比が、１．０であった場合の、比の相関的な変 化として、結果を表した。 この分析結果を図１に示し、そして表１に要約する。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡのレベ ルに対する比によって標準を決めた場合、インスリンで治療をしなかった糖尿病 ラット内に、ＴＧＦ−β１　ｍＲＮＡが３．４倍増加して、そして、パイグリカ ンｍＲＮＡが２．３倍増加する。インスリンで治療した糖尿病ラットは、ＴＧＦ −β１およびテネインン１ＲＮＡの増加がいっそう少ないことを示した。 （以下余白） Ｃ，［果旌糸塁碧」±」けるＴＧＦ−の糸球体組織を、液体窒素中で素早く凍結 し、アセトン中で固定し、そして成熟ＴＧＦ−β１の最初の３０個のアミノ酸に 対応する合成ペプチドに対して製造した抗体（５０Ｐｇ／＋１）で、４μｍの断 片を染色した。この抗体（抗ＬＣ）（Ｄｒｓ、　Ｋ、　Ｃ，Ｆｌａｎｄｅｒｓお よびＭ、　Ｂ、　５ｐｏｒｎ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏ ｆ　Ｈｅａｌｔｈから供与）で、細胞内ＴＧＦ−β１を染色する。抗ＬＣ抗体は 、Ｆｌａｎｄｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２７：７３９　（１９８８）中に公 表されており、その教示内容は本明細書中に参考として援用されている。ウサギ ＩｇＧまたは、またはりサミンローダミンロバＦ　（ａｂ”）２抗つサギＩｇＧ 　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌａｂ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖ ｅ、　ＰＡ）に対するフルオレセインイソチオンアネート複合抗血清（ｘ　５０ ０）を、１：３００の希釈で、２次抗体として用いた。 ＴＧＦ−β１陽性細胞を、フルオレセインおよびローダミン複合２欠抗体を用い た、２重染色免疫蛍光技法によって同定した。 この複合２次抗体は、ＥＤＩ　（単核細胞／マクロファージ）、０ｘ１９（リン パ球）、およびビメンチン、デスミン、およびα−平滑筋アクチン（Ｊａｃｋｓ ｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ）に対するモノクローナル抗体を 用いて１次染色されていた。コントロール群、および糖尿病群の６匹の動物それ ぞれから調製したコード部分で、不規則に選択した２０個の糸球体中のＴＧＦ− β１陽性細胞の数を、カウントした。 インスリンで治療しなかった糖尿病ラットからの糸球体（糖尿病を誘導してから １５週間後）を染色することにより、ＴＧＦ−β１陽性細胞数の著しい増加が示 された。糖尿病の糸球体では、コントロールラットからの糸球体と比較して、糸 球体１個当りに著しく陽性な細胞があり、それは＊３２±２対２５±１　（値は 、平均±［１偏差、＊ｐ＜０．００１）である。 免疫蛍光法のための組織を、上記のように調製した。ヒトフィブロネクチンＥＤ Ａ＋に対して調製した、マウスモノクローナル抗体は、Ｄｒ、　・Ｌ、　Ｚａｒ ｄｉ、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｏ　Ｎａｚｉｏｎａｌｅ　ｐｅｒ　ｌａ　Ｒｉｃｅｒｃ ａ　ｓｕｌ　Ｃａｎｅｒｏ、Ｉｔａｌｙ　より提供され、そしてＢａ１ｚａ　ら 、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２８：４２　（１９８８）、およびＳｅｋｉｇ ｕｉｃｈｉ　ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　２６０二５１０４−５１ １４　（１９８５）に記載されている。これらの開示内容は、共に本明細書中に 参考として援用されている。 ウサギ抗ヒトテ不インンを、Ｔｅ１ｉｏｓ　Ｐｈａｒ＋＊ａｃｅｕｔｉｃａｌｓ 　Ｉｎｃ。 （Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）より得た。Ｂｏｕｒｄｏｎ　ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ ｅｓ、４３：２７９６−２８０５　（１９８３Ｎこれらは本明細書中に参考とし て援用されている）に記載のように、テ不インンを、ヒト神経膠芽細胞腫Ｕ２５ １細胞から単離した。フルオレセインイソチオシアネート抗ウサギＩｇＧおよび う、トＦ（ａｂ’＞２抗マウスＩｇＧ　（これらは共にＪａｃｋｓｏｎ　Ｉｍ＋ ａｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌａｂ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　ＰＡから得られた）を 、２次抗体として用いた。 テネインンに対する免疫蛍光法（ＩＰ）染色において、４μｍの組織断片を、４ −５分間アセトンに浸した。乾燥せずに、固電化断片を、室温で約１０分間ＰＢ Ｓ（ｐＨ７，４＞に浸した。次いで、スライド上に水の小滴がほんの少しだけ残 っている状態まで、約５分間送風機を用いて、断片を緩やかに乾燥した。ウサギ ポリクローナル抗ヒトテネイシン抗体（Ｔｅｌｉｏｓ　Ｐｈａｒ＋＊ａｃｅｕｔ ｉｃａｔｓ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を、０．０１％のアジ化ナトリウム を含むＰＢＳで、１．１５から１＝２０までに希釈した。ＰＢＳ溶液約１０μｌ から１５μｌを、組織に添加し、そしてその後、湿った容器中で３７℃で約４５ 分間インキュベートした。次いで、直接その部分にＰＢＳをかけるのではなく、 スライドを傾けて、ＰＢＳを緩やかに流すようにして、ＰＢＳ洗浄する。次いで 、断片を振とうしながら室温で５分間ずつ３回ＰＢＳに浸した。次いで、断片を 送風機を用いて乾燥した。０．０１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで、１． ４００に希釈した、ＦＩＴＣ結合アフィニティー精製ロバｆ（ａｂ’＞２抗つサ ギＩｇＧ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　１ｍｍｕｎｏ、　Ｌａｂ、７１１−０９６−１３ ２．　＃１４６２０）を、スライドに添加した。上記のように、スライドをＰＢ Ｓで３回洗浄した。Ｂａｒｔｅｌｓ緩衝化グリセロール封入剤ＦＡ　（Ｂａｘｔ ｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、カバーガラスで組織を固定した。 上記手順に続き、フィブロネクチンＥＤＡ＋のＩＦ染色を行った０適切なマウス モノクローナル抗体抗ヒトフィブロネクチンＥＤＡを、１次抗体として用い、モ してＦ　ＩＴＣ結合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）、！ラット抗マウスＩｇＧ 　（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｌｍ１ｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、＃１６３８１） を０．０１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで１：３０に希釈したものを、２ 次抗体として用いた。 定量アッセイ結果を図２に示す。それぞれの実験群の６匹の動物から調製したコ ード部分から、不規則に選択した２０個の糸球体中の０から４の尺度（０；染色 されず、４＝最大に強く染色された）を用いて免疫蛍光注染色を数えた。それぞ れの時点で、糖尿病動物中に２種のマトリックス成分の堆積物が、著しく増加す る。 抗フィブロネクチンＥＤＡ十抗体で染色された糸球体の免疫蛍光クロマトグラフ によるコントロール糸球体および糖尿病糸球体におけるフィブロネクチンＥＤＡ 十の蓄積物の検出において、４０週間インスリンで治療した、正常のコントロー ルラットの糸球体は、はのかに染色されることを示したが、一方、４０週間イン スリンで治療をした、糖尿病のラットからの糸球体は、染色が目だって増強する ことを示す。 実施例Ｉｌ＋ ＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＰ　ペプチドでの ブロテオグ１カン４　の Ｈａｒｐｅｒら、　１ｄｎｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　２６：８７５　（ １９８４）（この開示内容は、本明細書中に参考として援用されている）の方法 に従って、４から６週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの未処理の糸球 体から、糸球体間質細胞を得た。使用した増殖培地は、２０％の熱不活性化ウシ 胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、　ＵＴ）、５００／ｌｌ１ ｌ　ベニ／リン、１００μｇ／＋１　ストレプトマイシン、０．６６υ／ｍｌ　 インスリン、および３００ｍｇ／ｍｌ　Ｌ−グルタミンで補足したＲＰＭＩ　１ ６４０（Ｃｅｌｌ−Ｇｒｏ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，）であった。１ ５日から２０日の開で、０．０２５％　トリプシン−０，５＋ａＭ　ＥＤＴＡ溶 １ｆｆｌ　（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ、ＭｃＬｅａｎ、　ＶＡ）で、１次培養物を分 離し、モして２　Ｘ　１０’個の細胞をフラスコに加えた。細胞は７日毎に継代 が代わり、そして全ての実験を３継代目と７継代目との間の細胞に対して行った 。 ラットの糸球体間質細胞は６−ウェルのマルチプレート中で、準集密（ｓｕｂｃ ｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで成長した。培養物を２４時間無血清にして、そして、 ０．３．０．１．０．０３．０．０１、または０．００３ｏ＋ｇ／ｓｌでのＧｌ ｙ−Ａ＋４−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ　（ＧＲＧＤＳＰ）、または、０ ．３μ１ｇ／＋１でのＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ　（Ｇ ＲＧＥＳＰ）と共（こＴＧＦ−β盲を２＆ｎｇ／ｍｌで添加した。　Ｐｉｅｒｓ ｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｊ、　Ｂｉ。 し一旦狛■工、２９２・１７９４−１７９８　（１９８７）（この開示内容は、 本明細書中に参考として援用されている）に記載のように、製造業者のプロトコ ルに従って、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｎｓ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎ ｔｈｅｓｉｚｅｒでペプチドを合成した。３０時間後、培養物を３５３硫酸塩で 代謝的に標識し、そして１８時間後、馴化培地を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光光 度法によって分析した。フルオログラムをレーザーデンントメーターでスキャン した。以下のものは、プロテオグリカッバンドの相対的な比重単位を表す。 これらのデータは、０ＲＣＤＳＰのより多い用量の用量反応効果により、コント ロールペプチドＧＲＧＥＳＰの効果無しでのＴＧＦ−β１−誘導プロテオグリカ ン生成が阻害されることを示す。 実施例ＩＶ 腎臓生検材料からの腎臓組織、または、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｔａｈ 　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒの糖尿病患者、または外科手術を行った患者か ら得た腎摘出試料を研究した。分析は、糖尿病性の腎症の６つの症例、最小の病 状変化の３つの症例、薄い基底膜疾患の３つの症例、および正常な腎臓３つを包 含していた。４つまたはそれ以上の糸球体が、それぞれの試料には存在し、そし て従来の臨床的尺度および病理学的尺度を用いて、最新の研究には加わっていな い医師によって、それぞれの症例の診断法が確立された。実験モデルについて実 施例１１に記載のように免疫蛍光性顕微鏡検査によって、凍結組織をＴＧＦ−β １タンパク質およびフィブロネクチンＥＤＡ＋の存在について研究した。ヒトお よび動物の研究は、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｂｏａｒｄｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｕｔａｈ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆＭｅ ｄｉｃｉｎｅによって承認された。 糖尿病性の糸球体硬化症の６つの症例を示す糸球体の全てが、図５および６に示 した２つの症例と同様に、ＴＧＦ−β１およびフィブロネクチンＥＤＡ＋に対し て強い陽性を示した。組織の定量限界のために、研究をこれら２つのマーカーに 限った。 それに対して、正常および疾患コントロールの糸球体はそれぞれ、陰性またはほ んの微量な染色を示しただけであった（図５および６）。 ′実施例Ｖ え　のヒトデコリンによるＴＧＦ−Ｂｌ　２　および３ユ五庄立生進 Ａ１区蓋 精製したヒトＴＧＦ−β１および２は、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｍｉｎｎｅ ａｌ）ｏｌｉｓ、　ＭＮ＞から得られ、そしてＴＧＦ−β３は、Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　１ｎｓｔｉＬｕｔｅｓ　ｏｆ　ＨｅａｌｔｈのＤｒｓ、　Ａ、　Ｒｏｂｅｒ ｔｓおよびＭ、　５ｐｏｒｎから供与された。 Ｙａ＋ｓａｇｕｃｈｉ　ら、（前出）（この開示内容は、本明細書中に参考とし て援用されている）に記載のように、チャイニーズハムスターの卵巣細胞系クロ ーン６２の培養培地から、組換え体ヒトデコリンを調製した。デフリンを、Ｑ− セファロース上でのイオン交換と、オクチル−セファロース上での疎水クロマト グラフィーとを組み合わせた、改変した手順によって精製した。 この手順は、Ｃｂｏ　ｉ　ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５４：２ｇ７ ６　（１９８９）に記載されており、その開示内容は、本明細書中に参考として 援用されている。オクチル−セファロースカラムから４Ｍ塩酸グアニジンによっ て溶出した後、調製物をＰＢＳ（ｐＨ７゜４）で透析し、そしてデフリン濃度を １ｍｇ当り０゜９ｍｇに調整した。 卵白アルブミンおよびウシ血清アルブミンを、Ｓｉｇｍａ（ＳＬ。 Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から得、そしてデフリン精製に使用した条件と同じ条件下 で調製した。 （以下余白） Ｂ、［１！！ 増殖阻害を測定するミンク肺細胞のアッセイを、イソ型のＴＧＦ−βの活性を中 和する組換えデフリンの効力をアッセイするのに使用した。［３Ｈ］チミジンの 取り込みをＹａｍａｇｕｃｈｉ　ら、（前出）に記載のように、ＴＧＦ−βの存 在、およびデフリン（０）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　（・）の濃度 の増加で決定した。 ＴＧＦ−βを、［３Ｈ］チミジンの取り込みを５０％阻害する濃度で添加した； これらの濃度は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３に対して、 それぞれ０．２ｎｇ／ｍｌ、　０．１ｎｇ／ｍｌおよび０．０５ｎｇ／＋ｌｌで あった。図７に示したデータは、ＴＧＦ−β１で誘導された増殖阻害を中和した パーセントを表す。［３Ｈ］チミジンの取り込みが、ＴＧＦ−βおよびデフリン のどちらにも無い場合を１００％と定義する（ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３ については１２ｓ、０００ｃｐ＋＊；　ＴＧＦ−β２については１０７．０００ ｃｐｉ）。ＴＧＦ−βには取り込みが存在するが、デフリンには存在しない場合 を、０％と定義する（ＴＧＦ−βｌについては５７．ＯＯＯｃｐｍ；　ＴＧＦ− β２については？８．０００ｃｐｍ　；　ＴＧＦ−β３については５９．０００ ｃｐｍ）。それぞれの点は、二連の試料からの結果の平均を表す。 図７に示したように、デフリンは３種のＴＧＦ−βのそれぞれの増殖阻害活性を 中和した。 Ｂｏｒｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３４６：３７１　（１９９０）に記載のように 、上記で糸球体腎炎を回復させるのに用いた抗ＴＧＦ−β１血清もまた、試験し た。この抗血清は、ＴＧＦ−β１を中和したが、ＴＧＰ−β２もＴＧＦ−β３も 中和しなかったくデータは示さず）。従って、デフリンは、抗ＴＧＦ−β１より も、ＴＧＦ−βに対する広い結合反応活性を有する。 実施例Ｖｌ えヒトデコリンの 組換えヒトデコリン、およびウシの組織から精製したデフリンの静脈内投与を、 糸球体腎炎のラストの腎臓中にマトリックスが蓄積するのを抑制する、プロテオ グリカンの能力を検査するのに用いた。糸球体中に存在するフィブロネクティン 量を、糸球体腎炎でのマトリックスの蓄積をブロックするデフリンの能力を評価 するために、定量的に用いた。 ０ｋｕｄａ、ら、（前出）に記載のように、抗胸腺細胞血清を静脈内注射するこ とによって、糸球体腎炎をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙラノ）（４−６週齢） に誘起した。同船のラットを正常コントロールとして使用した。組換えヒトデコ リン（これは、実施例Ｖ。 Ａ、に記載のように調製された）およびウシデフリンを、以下のプロトコルに従 った同定実験以外は、別々に試験した。 ８匹のラットを、それぞれ２匹ずつ４つの群に分け、モして抗胸腺細胞血清を注 射した。１時間後、ＰＢＳ　０．５＋ｌｌ中の組換えヒトデコリンまたはウシデ フリン０．４５＋ａｇを、あるいはコントロールとして０．５１のＰＢＳだけを 、１回静脈内注射することにより、治療を開始した（注射するためにラットを押 さえつけたが、麻酔はしなかった）。関節の軟骨から、４Ｍ塩酸グアニジンおよ びプロテアーゼインヒビターで２４時間抽出することにより、ウソデフリンを単 離した。次いで、実施例Ｖ、Ａ。 に記載のように精製した。以下のようにデフリンまたはＰＢＳを１日１回注射す ることで治療を続けた：デフリンを第１群には２日間、第２群には４日間、第３ 群には６日間投与した。 第４群にはＰＢＳのみを６日間投与した。第１群および第２群においてデフリン 投与を中止したとき、ＰＢＳを代わりに投与して、全ての動物に６日間注射を行 った。７日目に全ての治療を中止し、２４時間尿を採取し、その後動物を殺して 腎臓を取り出した。 上記プロトフールに従って、以下に示すコントロール調製物を試験した：８匹の う、）に抗胸腺細胞血清を注射し、それぞれ２匹ずつの群に分け、そして０．５ １１＋ｌのＰＢＳのみ、またはアグレカン、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミ ンを含むＰＢＳを、１日１回６日間注射した。アグレカンおよびデフリンの炭水 化物含量を決定し、そしてＰＢＳ中のアグレカンを、デフリンと同様の炭水化物 濃度で注射した。別の４匹のラットには、抗胸腺細胞血清の代わりにＰＢＳを１ 回注射し、正常なコントロールとして使用した。全ての動物を、上記のように２ ４時間尿を採取した後に殺し、そして尿タンパク質およびクレアチニンを、０ｋ ｕｄａ　ら（前出）に記載のように測定した。 全ての技法を行うために、腎臓をインサイチユで冷ＰＢＳで潅−流し、次いで切 除した。腎臓組織を、０ｋｕｄａ　ら（前出）（これは、本明細書中に参考とし て援用されている）に記載のように、光および免疫蛍光顕微鏡検査のために調製 した。 Ｂ、フィブロネクチン フルオレセインイソチオンアネート結合ヒツジ抗ヒトフィブロネクチンは、Ｂｉ ｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ、Ｉｎｃ、　（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）からのもの であった。フィブロネクチンに対する免疫蛍光染色を、それぞれの動物から調製 したコード部分で不規則に選択した２０個の糸球体において、０から４までの尺 度（０＝染色されず、４＝最大に濃（染色された）を用いて、組織起源を認識せ ずに数えた。群の間の相違を、０ｋｕｄａら（前出）に記載のし試験によって分 析した。 糸球体を、ＥＤＡ＋フィブロネクチンおよびテ不インンを検出する抗体で染色し た：これらのマトリックス成分はＴＧＦ−βによっテ比較的特異的に誘導される 。特別のドメインＡ　（ＥＤＡ＋）を含有するヒトフィブロネクチンに対してｍ ｌされたマウスモノクローナル抗体は、Ｄｒ、　Ｌ、　Ｚａｒｄｉ、Ｉｎ５ｔｉ ｔｕｔｏ　Ｎａｚｉｏｎａｌｅ　ｐｅｒ　ｌａ　Ｒ４ｃｅｒｃａ　ｓｕｌ　Ｃａ ｎｃｒｏ、Ｉｔａｌｙより提供された。　ウサギ抗ヒトテ不イシンを、Ｔｅ１ｉ ｏｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、（ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ） から得た。フルオレセインインチオンアネートで結合のラットＦ（ａｂ’）２抗 マウスＩｇＧおよびロバＦ（ａｂ’）２抗つサギＩｇＧを、２次抗体（Ｊａｃｋ ｓｏｎ　１ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、Ｗ６ｓＬ　Ｇｒｏｖｅ、　Ｐ Ａ）として角いた。マトリックスを数える技法、およびＥＤＡ＋フィブロネクチ ンおよびテ不イシン染色に対する統計学的分析方法は、上記のフィブロネクチン に対するものと同じである。 Ｄ、１ 図８は、組換えデフリン、またはウシデフリンを４日間あるいは６日間毎日注射 することで、フィブロネクチンの蓄積が、正常のうｙ）に見いだされるレベルと 太き（違わないレベルにまで抑制されることを示す。コントロール注射物は、緩 衝液だけ、異なるプロテオグリカン、および２種のタシパク質から成る。軟骨の プロテオグリカン、アグレガンを、デフリンのグリコサミノグリカン鎖をコント ロールする負に帯電した分子として用いた；アグレガンは、Ｙａ＋ｎａｇｕｃｈ ｉ　ら（前出デフリンのコアタンパク質に対するコントロールとして用いた。な ぜなら、これらのタンパク質の両者は、はとんど同じ分子サイズだからである。 血清アルブミンを、無関係なタンパク質コントロールとして用いた。図８は、プ ロテオグリカンおよびタンパク質コントロールが、緩衝液のみを注射した糸球体 腎炎うｙトとは、区別され得ないことを示す。疾患の早期にデフリンを２回注射 することも、フィブロネクチンの蓄積には、何ら効果が無かった。 図９に定量的に示したように、ＥＤＡ＋フィブロネクチンは、正常なラットの糸 球体に痕跡量存在するのみであり、テ不インンに対しても、同様の検出物が得ら れた。結果は、ＥＤＡ＋フィブロネクチンおよびテネインンの両者が、デフリン を全く注射しない、または２回注射して治療した、ラットの腎炎の糸球体中で、 非常に増加したことを示す。しかし、フィブロネクチン全体の場合のように、デ フリンを４回または６回注射することにより、ＴＧＦ−β活性のこれら２つのマ ーカーの堆積が、非常に減少した（図９）。過ヨウ素酸−ン・ノフで染色した、 同じ腎臓の断片の組織学的分析により、疾患中に生じる糸球体中の細胞外マトリ ックスおよび関連する糸球体腫脹の増加を防止するデフリンに匹敵する効果が示 された。 ４日間または６日間デフリンを投与することもまた、タンパク尿の進行を抑制し た。尿タンパク質濃度と尿のクリアチニン濃度との比を、タンパク尿を評価する のに用いた。なぜなら、この方法はＧｉｎｓｂｅｒｇら（前出）に記載のように 、タンパク質排出量に関する尿量の差の影響を、最小にするからである。正常ラ ット、疾患コントロールラット、低用量デフリン〈２回注射）で治療したう、ト 、および商用量デフリン（４回および６回注射）で治療したラットに対する平均 値はそれぞれ、０７．１５．２．１４．８、および２４であった（疾患コントロ ールに比較した高用量に対して、ｐ＜０．０１である）。 これらの結果は、デフリンが、腎炎ラットからの傷ついた糸球体中に、細胞外マ トリ、クスが堆積することを防止するのに、著しい効果をあげることを示す。糸 球体腎炎において細胞外マトリックスが蓄積することは、ＴＧＦ−βの過剰生成 が原因であることが、以前に示されている（Ｏｋｕｄａら（前出）　Ｂ。 ｒｄｅｒら、（１９９０）（前出））。このモデルにおけるマトリックスの蓄積 を、デフリンの注射により防止したことは、ＴＧＦ−βを抑制するデフリンのイ ンビボにおける活性を証明する。 本発明を、種々の実施態様に関して記載してきたが、本発明の主旨から逸脱する ことなく種々の改変を施すのは可能である、ということを理解すべきである。従 って、本発明は、以下の請求項の範囲によってのみ限定される。 ＣＣＩ　Ｄ　ＤＩ ＣＣＩ　Ｄ　ＤＩ ＣＣＩ　Ｄ　ＤＩ ｃ　ｃｉ　ｏ　ｏ＋ ＦＩＧ、２Ｂ テ”ｒリ−ｙ　！ｒ：ｌｉ　ＢＳＡ　（！ＬＣＪ　ｍｌ）ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８Ｂ −イ會と乙′・不１と ＦＩＧ、９Ｂ フロントページの続き （５１）　ｒｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１００ 　ＡＣＶ ＤＰ ３８／２２　Ａ　ＣＤ ３９／３９５　Ｄ　９２８４−４Ｃ ４５１００ＡＥＤ　８４１５−４Ｃ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。 ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ。 ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ， ＲＵ、ＳＤ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＸ ＤＰ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．組織中の細胞外マトリックスの蓄積に特徴がある病変を防止または治療する 方法であって、ＴＧＦ−βの細胞外マトリックス産生活性を抑制する薬剤と該組 織を接触させる工程を包含し、ここで該病変が、線維症性ガン、肺の線維症、動 脈硬化症、後部心筋梗塞、糸球体腎炎、心臓性線維症、血管形成後再狭窄、腎臓 間質性線維症、瘢痕、または糖尿病関連病変である、方法。
2. ２．前記病変が糖尿病関連病変である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記病変が糖尿病性ネフロパシーである、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記薬剤が抗ＴＧＦ−β抗体である、請求項２に記載の方法。
5. ５．前記薬剤が血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、請求項２に記載の方法 。
6. ６．前記薬剤がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドである、請求項２に記載の 方法。
7. ７．前記薬剤がデコリンである、請求項２に記載の方法。
8. ８．前記薬剤がバイグリカンである、請求項２に記載の方法。
9. ９．細胞外マトリックス成分の過度の蓄積に特徴がある組織の病変の存在を検出 する方法であって、以下の工程：（ａ）該組織中のＴＧＦ−βのレベルを検出す る工程；および（ｂ）該組織中のＴＧＦ−βのレベルと正常組織中のＴＧＦ−β のレベルを比較する工程を包含し、ここで該組織中のＴＧＦ−βのレベルの上昇 が該病変の指標となり、該病変が、線維症性ガン、肺の線維症、動脈硬化症、後 部心筋梗塞、糸球体腎炎、心臓性線維症、血管形成後再狭窄、腎臓間質性線維症 、瘢痕、または糖尿病関連病変である、 方法。
10. １０．前記病変が糖尿病関連病変である、請求項９に記載の方法。
11. １１．前記病変が糖尿病性ネフロパシーである、請求項１０に記載の方法。
12. １２．インスリン、および、ＴＧＦ−βの細胞外マトリックス産生活性を抑制す る薬剤を投与する工程を包含する、糖尿病の治療方法。
13. １３．前記薬剤が抗ＴＧＦ−β抗体である、請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記薬剤がＰＤＧＦである、請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記薬剤がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドである、請求項１２に記 載の方法。
16. １６．前記薬剤がデコリンである、請求項１２に記載の方法。
17. １７．前記薬剤がバイグリカンである、請求項１２に記載の方法。
18. １８．ＴＧＦ−βの細胞外マトリックス産生活性を抑制する薬剤を含有する組成 物。
19. １９．さらにインスリンを含有する、請求項１８に記載の組成物。
20. ２０．前記薬剤が抗ＴＧＦ−β抗体である、請求項１８に記載の組成物。
21. ２１．前記薬剤がＰＤＧＦである、請求項１８に記載の組成物。
22. ２２．前記薬剤がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドである、請求項１８に記 載の組成物。
23. ２３．前記薬剤がデコリンである、請求項１８に記載の組成物。
24. ２４．前記薬剤がバイグリカンである、請求項１８に記載の組成物。