JPH07508102A - アッセイ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 アッセイ 本発明はイムノアッセイに関する。

生体から得られた体液のサンプル、および固体サンプルたとえ１ｆ細胞もしく（ ヨ組織についての、様々な生物体とくに細菌、ウィルス、寄生体およびイ也の病 原性（感染性）生物体の存在の検査は定常的に行われている。検査は主（こ２つ の観点から実施される。一つは１個体における疾患の診断、疾患の経過のモニタ １ノングおよび／または処置のモニタリングの目的での体液サンブノしおよび固 体サンプルの検査である。この種の検査は「臨床」検査と呼ばれること力（多シ ）、臨床検査室では通常、多くの様々な生物体についての検査が行われて１する ０本明細書て用０られる［病原体Ｊの語は疾患の原因となる生物体を意味する。

もう一種類の主要な検査は、病原体に汚染されていなし１血液および血液製品の 供給を維持するための、供血のスクリーニングである。各国の規制機関は試験力 く行われるべき病原体を特定している。大部分の国ては、ＨＩＶ、Ｃ型Ｈｆ炎（ シトーＡ非−Ｂ肝炎）、Ｂ型肝炎および梅毒に対するスクリーニング（よ必須と なってし）る、一部の国ではさらに、ＨＴＬＶに対する試験の要求もある。大部 分の国（こおいてＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２両者に対する試験が必須である。

臓器移植を受けるもしくは受けた患者、または免疫学的に脆弱化している患者へ の輸血（こ用（１られる血液では、一般にＣＭＶ　（サイトメガロウィルス）の 存在（二関しても試験される。血液の供給に脅威をもたらす新しい病原体および 既知の病原体の新しいサブタイプが発見されるのに応じて、供血の試験に必須と される要求（まそれらの病原体へと拡大していくことになる。

血液のスクリーニングに最も広く用いられている試験は、イムノア・ソセイであ る。大部分の血中のウィルス病原体に関しては、抗原の存在につ０て血液を試験 する場合にゼ・要な感度を得ることは、抗体の存在について試験する場合よりも 困難である、一般に、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶおよびＣＭＶに対する試験は抗 体試験である。Ｂ型肝炎に対しては２つの試験がある。すなわちＢ型肝炎表面抗 原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗原アッセイおよびＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）に対 する抗体試験である。現在、ＨＢｓＡｇ試験が大部分の国で必須である。Ｂ型肝 炎コア抗体についての試験は一部の国で必須であるが、今後さらに多くの国に導 入されるものと思われる５梅毒に対しては抗体試験および抗原試験の両者がある 。

血液スクリーニングは大規模に行われ血液の貯蔵寿命が比較的短いため結果が迅 速に得られることがとくに重要である１時間および経費の両者を節約するために 、単一の試験で２種以上の病原体を検出できるアッセイが提案されている。

同じ病原体の２つのサブタイプ、とくにＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２（ＨＩＶ− １＋２）、またＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−Ｉ［（ＨＴＬＶ−Ｉ＋Ｉ［）を測 定するための抗体アッセイが市販されている。しかしながら、同種のサブタイプ の間にはかなりの交差反応性を認めることが多く、たとえば、ＨＩＶ−１とＨＩ Ｖ−２の間の免疫学的交差反応性の程度は、初期に市販されたＨＩＶ−１試験で は実際に、ＨＩＶ−２−含有血液の著しい大集団を検出していたほどであること に留意すべきである。したがって、ＥＰ−Ａ−０４８４７８７にも述べられてい るように、同じウィルスの２つのサブタイプに対する抗体アッセイを提供するの と実質的に免疫学的交差反応を示さない完全に異なる２つの病原体に対する抗体 アッセイを提供するのとの間には極めて著しい技術的な差があるのである。ここ では、　［コンビネーションアッセイ」の語は、サンプルに対する１回の検査で 実質的に免疫学的交差反応を示さない２種類以上の病原生物体を検出または測定 するためのアッセイを意味して用いられる。ここでは「異なる病原体」の語は、 実質的に免疫学的交差反応を示さない病原体を指して用いられる。

ＥＰ−Ａ−０４８４７８７には、供血中に存在する可能性があるウィルス病原体 （血中ウィルス病原体）についてのコンビネーション抗体アッセイとくにＨＩＶ とＨＣＶ　（Ｃ型肝炎ウィルス）についてのコンビネーションアッセイが提案さ れている。提案された不均一相アッセイは、関連抗体を捕獲する固体表面にコー トされた多種ペプチドを使用するものである。得られた抗原−抗体複合体をつい で検出できる。

このようなコンビネーションアッセイ、また現在市販されているＨＩＶ−１＋２ およびＨＴＬＶ−１＋ＩＩコンビネーシヨン血液アツセイの主要な欠点は、固体 表面上に複数の抗原を共コーティングすることの要求である。抗原（ペプチドお よび／または蛋白質）を均一にコーティングしなければならないだけでなく、エ ピトープが抗体結合に利用されるようにコーティングしなければならない、さら １こ、各種抗原の間に相互作用があってはならない、抗原が満足できる状態にコ ーティングされたことを保証するために実施しなければならない品質管理試験は 。

その試験自体の経費および不合格品の経費の両者によるコストを付加することに なる。多種の抗原をコーティングするほど１問題は悪化し、コストは増大する。

検出される抗原が１つ付加されると、少なくとも１種の固定化抗原の付加が必要 になる。一部の病原体では、多種の抗体の検出を可能にする必要がある。たとえ ばＨＣＶの場合、現在市販されているアッセイは、４種の異なる抗原から構成さ れている。コンビネーションＨＩＶ−１＋２／　ＨＣＶアッセイでは、少なくと も６種類の抗原か要求される。

実際の製造における共コーティングの問題に加えて、必要な特異性を得ることも 困難である１強い抗原性を存する極めて高純度の抗原が必要になる（ＥＰ−Ａ− ０４８４７８７参照）。

抗体／抗原コンビネーションアッセイはＨＩＶおよびＢ型肝炎表面抗原について 提案されている。たとえばＥＰ−Ａ−０２８６２６４は、ＨＩＶ抗体に結合可能 なペプチドでの固相のコーティングおよびＨＢｓＡｇに特異的な抗体での固相の コーティングを提案している。２つの固相は異なっていてもよく、また、ペプチ ドと抗体は同一の固相上にコーティングされてもよい、ＷＯ９１／１０７４７に はＥＰ−Ａ−０２８６２６４に記載されたタイプのアッセイに対する改良が提案 されていて、これはコーティングおよびＨＩＶ抗体の検出に用いられるペプチド の性質、ならびに検出系の性質における改良である。

しかしながら、ＥＰ−Ａ−０２８６２６４に開示された原理に基づく唯一の市販 ＨＩＶおよびＨＢｓＡｇコンビネーションアッセイでは、共コーティングに伴う 様々な問題が、ＨＩＶペプチドを微小チューブの内部表面に、チューブと組合わ せて用いられるビーズ上に抗−ＨＢｓＡｇ抗体をコーティングすることによって 回避されていることに留意すべきである。しかも、サンプルをチューブ内のビー ズと接触させたのちにビーズを除去して、ビーズおよびチューブ上で別個に検出 工程を行うことから、現在の認識では真のコンビネーションアッセイとはいえな い、したがって７検出に用いられる標識抗体と標識抗原の間の相互作用に関する 問題の可能性および形成された免疫複合体の検出時における検出系（標識）の間 の問題の可能性は回避されている。

本発明においては、コンビネーション抗体アッセイのため固体表面上に多種の抗 原を共コーティングすることの問題およびそれによって生じる結果は、免疫グロ ブリン捕獲フォーマットを用いることによって単純かつ優雅に克服される。

免疫グロブリン捕獲フォーマットそれ自体は、何年も前から知られている。それ は、１９７９年に、　Ｄｕｅｒｍｅｙｅｒ、　Ｗ、らにより、Ａ型肝炎に対する 特異的１ｇＭ抗体のＥＬＩＳＡでの検出について、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍ ｅｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４：２５−３２に記載されていた。ヒトから 得られたサンプルについて記載されたアッセイの原理は。

固相たとえばマイクロタイタープレートのウェルを抗−ヒトＩｇＭでコーティン グし、サンプルをコーティングしたウェルに添加してインキユベートシ、ウェル を洗浄し、ついで抗原をウェルに加えてインキユベートシ、最後に結合した抗原 を酵素標識抗体を用いて検出するものである。この論文の著者は、たとえば風疹 。

単純ヘルペス、ＣＭＶ、ＥＢＶ、Ｉ−キソプラズマ、Ｂ型肝炎コア抗原または他 の抗原のような個々のＩｇＭ抗体に対するアッセイへの使用を提案している。

血中の単一の病原体の検出に免疫グロブリン捕獲技術を用いるアッセイ、たとえ ば風疹アッセイおよびＡ型肝炎アッセイは数年前から使用されている。

ＷＯ３８１０７６８０には、血液以外の体液中、とくに唾液および尿中の抗体の 測定に対する免疫グロブリン捕獲技術の応用が開示されている。市販されている 唾液および床用のＨＩＶ−１＋２アツセイは、記載のＩｇＧ捕獲技術を用いてい る。

この技術は１９７９年から利用可能であったにもかかわらず、抗体を捕獲するた めに抗原を用いるアッセイは多数市販されているのに比べて、この技術を用いる アッセイは極めて限られた数しか市販されていないという事実によっても明らか なように１本技術分野には免疫グロブリン捕獲技術に対しては一般的な偏見があ るものと考えられる。とくに、この技術は実際上特異性の点または感度の点で。

効果的に作動しないであろうという一般的な認識があるものと考えられる。

免疫グロブリン捕獲技術にはかなりのレベルの望ましくない相互作用が期待され 　これが感度の不足を招くと考えられているものと思われる。たとえば多数の抗 体の検出のための抗体捕獲アッセイについて述べているＷＯ３９／１２２３１に は、抗原と免疫グロブリンＦｃ領域の間の非免疫学的蛋白質−蛋白質相互作用に よって生じる特異性の欠如に関する懸念が示さね、固体表面上にコーティングさ れた抗体は抗−Ｆｃ抗体である免疫グロブリン捕獲アッセイが提案されてしする ９すなわち、免疫グロブリンはＦｃ領域に特異的に捕獲さね、この場合、これは 非特異的蛋白質−蛋白質相互作用には利用されない。

感度も、たとえば免疫グロブリは選択的に捕獲されず、したがって検討する特異 的抗体種の濃縮は起こらず、免疫グロブリンン捕獲アッセイで問題となる可能性 が考えられる。その特異的抗体種が、絶対的な意味でまたは血清サンプル中に存 在する池の種との比較的な意味の両者で、極めて少量しか存在しないとすると。

検討する抗体の検出は困難で信頼できず、とくにそのアッセイは感度を欠くこと が期待される。

予期に反して、驚くべきことに１本発明者らは、免疫グロブリン捕獲技術を用い て、検討するサンプル中の２種以上の異なる病原体が優れた感度および特異性で 同時に検出できることを見出したのである。

本発明は、単一の試験サンプル中の２種以上の異なる病原体に対する抗体の測定 における免疫グロブリン捕獲技術の使用を提供する。

すなわち１本発明は、液体試験サンプル中の２種以上の異なる病原体に対する特 異的抗体を測定する方法において。

（ｉ）サンプルを、■または２以上のクラスの免疫グロブリンに対する抗体が固 定化された固相と接触させて、サンプル中に存在するｌまたは２以上の各クラス の免疫グロブリンを固相上に捕獲させ。

（ｉｉ）サンプルからの免疫グロブリンがその上に捕獲されている固相を、検討 する病原体の１つに特異的な抗体に対してそれぞれが選択的に結合できる２種以 上の異なる抗原であって、それぞれが直接または間接的に検出可能なシグナルを 提供する手段を与えられている抗原と同時にまたは順次接触させ、ついで。

（ｉｉｉ　）固相上に形成して得られた免疫グロブリン−抗原複合体を測定する ことからなる方法を提供する。

固定化される抗体はＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡに向けられた抗体でもよく。

また異なるクラスの免疫グロブリンに対する抗体の混合物を用いることもできる 。

抗−ＩｇＧ抗体および抗−ＩｇＭ抗体の混合物がとくに好ましい。

本発明のアッセイ、　［コンビネーションアッセイＪは、抗体の捕獲のために。

ユニバーサルな固相を使用するので、無限の可転性を有する。ユーザーは検討す るサンプル中のどの抗体したがってどの病原体を検出するかを、単に検出に適当 な抗原試薬を用いることによって選択できる。これは、抗体を捕獲するために抗 原を用い、検討する抗体のそれぞれの組合わせに対して異なる抗原でコーティン グされた固相を必要とする慣用のアッセイとは全く対照的である。

ユニバーサルな固相の使用の可転性は、多種病原体のアッセイとくに血液スクリ ーニングアッセイおよび臨床アッセイの製造業者およびユーザーの両者にとって 大きな利点である。上に指摘したように、ユニバーサルな抗体コーティング固相 、たとえばコーティングされたビーズまたはコーティングされたマイクロタイタ ープレートのウェルは、任意の特定の抗体アッセイの選択性が検出に用いられる 抗原試薬の組合わせによって決定されるので、病原体の任意の全ての組合わせの 抗体検査に使用することができる。

この可転性は、ユニバーサルな抗体コーティング固相が、血液のスクリーニング であってもまたは臨床検査であっても、全てのコンビネーション抗体アッセイに 使用できることから、アッセイの製造業者に有利である。現時点では、供血の抗 体検査についての必須の要求は国によって異なっている。したがって、地域が異 なると、異なる抗原でコーティングされた固相が必要になる。全ての地域に対し てユニバーサルな抗体コーティング固相の提供により、製造コストは有意に低下 する。臨床検査の場合にも、それぞれの全ての異なるコンビネーション抗体アッ セイについて、異なる抗原でコーティングされた固相が必要になる。この場合も 、ユニバーサルな抗体コーティング固相の提供により、製造コストは有意に低下 する。

製造業者に対してさらに有利な点は、固相上にコーティングする成分の数が減少 し、したがって製造コストが低下することである。抗体を捕獲するために抗原を 使用するアッセイでは、２種の病原体という最低の場合でも、コンビネーション 抗体アッセイに多種の抗原が要求される。たとえばコンビネーションＨＣＶ／Ｈ ＩＶ−１＋２アッセイには、少なくとも６種類の異なる抗原が必要である。検出 する病原体が増えれば、さらに多くの抗原を固相にコーティングしなければなら ない、しかしながら２本発明によれば、付加的な病原体を検出するためにさらに 抗体を固相に固定化する必要はない、抗−１ｇＧ単独が存在すれば多種の病原体 の検出が可能である、しかもコーティングに用いられる抗体は、効率的なコーテ ィングとくに多種抗原コーティングに必要な高純度の抗原に比べて一般的に安価 である。

本発明のコンビネーションアッセイの可転性はまた。たとえば、病原体の任意の 特定の組合わせの試験が単に適当な抗原試薬の組合わせを用いて実施できるので 、ユーザーにも有利である。これは、病原体の任意所望の組合わせの試験がただ １つのユニバーサルな抗体コーティング固相を購入し保存しておけば可能なこと から、臨床検査にはとくに有用である。

スクリーニングの目的では汚染生物体の性質を知る必要はない、血液スクリーニ ングの場合には、血液サンプルが禁じられた病原体のどの抗体に陽性であっても 、その血液は輸血または血液製品たとえば血漿もしくは第■因子の製造には不適 当であって、廃棄しなければならないからである。

特定の国の規制によって規定された全ての血中ウィルス抗体について、１回のア ッセイで供血サンプルを検査できることは、大きな進歩であり、血液バンクに時 間および経費の両者で、極めて実質的な節減を提供するものである０時間の節減 は、技術者の時間の節減およびさらにそれによる経費の節減に重要であるのみな らず、全血の比較的短い貯蔵寿命の点からも重要である。

本発明の免疫グロブリン捕獲アッセイは優れた特異性および感度を有する１本発 明者らは、関心抗体の混合物を含有するサンプルについて、それぞれが１つの抗 体種のみを含む相当する血清または血漿サンプルについて得られた結果の実質的 に合計である結果を得ている０本発明のコンビネーションアッセイにおいて。

異なる生物体に向けられた複数個の抗体のそれぞれが、あたかも１つの抗体種の みが存在するかのように反応することは全く予期しうるものではなかったのであ る。検出される多数の抗体種に関する相加効果の観察は予期に反するものである が、大きな実際上の利点をもたらすものである。慣用のアッセイフォーマット。

たとえばマイクロタイタープレートを用いて実施できる本発明のアッセイがそれ 程高感度であることも予期し得ないものであった。

本発明のアッセイは、ＩｇＧアッセイ、１ｇＭアッセイ、または特殊な目的では ＩｇＡアッセイとすることもできる。また、異なるクラスの免疫グロブリンに対 する抗体の混合物を固相のコーティングに使用することもできる。抗−ＩｇＧお よび抗−１ｇＭ抗体の混合物を使用するのがと（に好ましい。

抗体捕獲のためにコーティングされた抗原を使用するアッセイに比較した場合の 本発明のアッセイのさらに重要な利点は、固定化された抗−１ｇＭを用いること により、初期感染の信頼できる検出が可能になることである。これは、血液スク リーニングおよび臨床検査の両者において重要である。

ＩｇＭは、感染に応答して産生される最初の免疫グロブリンのクラスである。

感染後最初の数週間には特異的ＩｇＭ抗体のレベルが上昇し、ついで少し遅れて 特異的１ｇＧが産生ずる。ＩｇＧ抗体の応答は持続性を示し、何年も、さらには 生涯続くこともある。理論的には、ＩｇＭは、関心抗体が抗原でコーティングさ れた表面上に捕獲され、捕獲抗体をたとえば標識抗−ＩｇＭ抗体を用いて検出す る慣用のアッセイで検出することができる。しかしながら、実際上は、このよう な１ｇＭアッセイは一般に、ＩｇＭが［粘着性」で、すなわちＩｇＭは捕獲用の 抗原に非特異的に結合する傾向があることから、特異性を欠くものである。抗原 −ＩｇＭ複合体の検出に用いられる標識抗−１ｇＭ抗体は、特異的抗原−１ｇＭ 複合体と非特異的に結合したＩｇＭとを識別できない、この理由から、固定化抗 原を用いる慣用のアッセイでは一般に、抗−ＩｇＧ抗体を検出に使用し、結局ア ッセイはＩｇＧのみについて行われる。

本発明のアッセイにおいては、抗−１ｇＭ抗体を固相上にコーティングできる。

これらの抗体はついで、サンプルから１２Ｍ免疫グロブリンを特異的に捕獲し。

捕獲されたＩｇＭは標識抗原によって特異的に検出される０本発明者らは、驚く べきことに、この系は「粘着性」を示さず、ＩｇＭ抗体の検出には慣用の抗原− 捕獲アッセイの場合の特異性の問題はないことを見出したのである。上述のよう に、固相のコーティングには、抗−ＩｇＧ抗体および抗−ＩｇＭ抗体の混合物を 使用することがとくに好ましい、固相上に抗−ＩｇＭ抗体が存在するとサンプル 中に存在する初期抗体の検出が保証され　また抗−ＩｇＧ抗体の存在により持続 性の抗体の検出が保証される。

固相上に固定化される抗体はポリクローナル抗体、たとえばすべての免疫グロブ リンのクラスに対する抗体を含むポリクローナル抗−ヒト抗体とすることができ る。また、特定のクラスの免疫グロブリンに向けられたポリクローナル杭木たと えばポリクローナル抗−ＩｇＧおよびポリクローナル抗−１ｇＭ抗体を使用する こともできる。ポリクローナル抗体はたとえばアフィニティークロマトグラフィ ーによって精製できる。所望により、モノクローナル抗体も使用できる。抗−免 疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡそれぞれの免疫グロブリンγ。

μおよびα鎖に特異的である。

固相のコーティングに用いられるポリクローナルおよびモノクローナル抗体はそ れ自体既知の方法で製造できる。様々な抗−免疫グロブリン、たとえばウサギ１ ヒツジおよびヤギポリクローナル抗−１ｇＧおよび抗−１ｇＭ免疫グロブリン。

ならびにマウスモノクローナル抗−１ｇＧおよび抗−１ｇＭ免疫グロブリンが市 販されている。異なる抗体の混合物をコーティングに用いる場合には、混合物中 の異なる抗体の比率は所望により変動させることができる９本発明はヒトからの サンプルの検討に限定されるものではなく、獣医学的応用も可能である。したが って、コーティングに用いられる抗体は、検討されるサンプルが得られる種の免 疫グロブリンに対するものとしなければならない、ヒトからのサンプルの場合に は、たとえば、コーティングする抗体は抗−ヒト抗体でなければならない。

上述のように１本発明のアッセイのとくに存利な特徴は、検討する病原体の数ま たは性質とは無関係に、ユニバーサルな抗体コーティング固相手段を使用するこ とである。コーティング抗体として用いられる抗体は！または２以上のクラスの 免疫グロブリン、とくにＩｇＧおよびＴｇＭに対する抗体であり、サンプルから のそれぞれのクラスの免疫グロブリンはそれが示す割合で捕獲される。特異的な 抗原の特定の組合わせを選択することにより、アッセイのユーザーは任意の組合 わせの病原体について検査することができる。抗原試薬は予め混合して提供する こともできるし、またユーザーが個別の抗原試薬を任意所望の組合わせで使用す ることもできる０個々に用いる場合には、捕獲された免疫グロブリンをもつ固体 表面に同時にまたは任意の順序で順次、抗原試薬を接触させる。試薬の所望の混 合物を１工程で添加する方が一般的に便利である。

本発明のアッセイに用いられる抗原は、検討する抗体と選択的に相互作用する任 意の抗原性実体とすることができる。たとえば、抗原は、ペプチドもしくはポリ ペプチドでも１合成もしくは組換え抗原でも、また培養細胞からたとえばウィル ス溶解物から精製した抗原でもよい、場合によっては、たとえばＨＣＶでは。

特定の生物体の２箇所以上の抗原性領域からなる組換え融合ポリペプチドを用い ることがとくに有用である。

抗原はそれ自体、直接または間接的に、免疫グロブリン−抗原複合体の検出を可 能にする検出可能なシグナルを提供できる手段によって標識することができる。

標識された抗原は［抗原接合体」と呼ばれる。

検出可能なシグナルは光学的、放射性もしくは物理化学的シグナルであり、抗原 を直接たとえば染料１着色粒子、放射源！を子活性種５磁気共鳴種もしくは蛍光 原で標識することにより、または抗原を間接的に任意の種類の測定可能な変化を 起こさせることができる酵素自体で標識することによって提供される。別法とし て、シグナルは、抗原接合体が関与する凝集、回折効果または複屈折効果による ものでもよい。

他の実施態様においては、検出可能なシグナルを間接的に提供できる手段は抗原 に結合する抗体から構成される。抗原に関し上述したように、抗体（Ａｂｌ）に は直接または間接的な標識手段を提供することができる（単−抗体検出系）。

またそれは、Ａｂｌに結合し、それ自体、抗原に関連して上述したように直接ま たは間接的に標識されるさらに池の抗体（Ａｂ２）を用いて標識することができ る（二重抗体検出系）、捕獲された抗体−抗原複合体の検出のための単一または 二重抗体系は、適当な抗原接合体の製造が困難な場合にとくに有用である。一部 の抗原接合体は、たとえば、市販には不十分な安定性しか示さず、また一部の抗 原は接合により抗原性を失うことがある。

単−抗体検出系は洗浄およびインキュベーション工程が少なくてすむという利点 がある反面、検出される各抗原毎に抗体接合体（標識抗体Ａｂ＋）を製造する必 要があるという欠点がある。二重抗体検出系にはＡｂｌおよびＡｂ２の適当な選 択により、以下に述べるように全ての捕獲された抗体の検出に１つの抗体接合体 （標識抗体Ａｂ２）の使用力呵能になるという利点がある。各抗体（Ａｂｌ）が 同一動物種において励起された場合には、第二の抗体（Ａｂ２）は抗一種抗体と することができるからである。たとえば、各抗体Ａｂｌがヒツジ抗体である場合 には、標識した抗−ヒツジ抗体をＡｂ２として使用できる。全ての被検物質の検 出に１つの抗体接合体のみが必要というユーザーへの利点は、とくに自動化シス テムを使用する場合、余分のインキュベーション工程および余分の洗浄工程が必 要という欠点を十分に補うものである。１つの抗体接合体のみが必要という利点 は、製造業者にもさらに他の有意な利益を与える。

抗原または抗体接合体にとくに好ましい標識系は、酵素標識系とくに抗原または 抗体が適当な基質の存在下において検出可能な色の変化を触媒する酵素に接合さ れた系である。このフォーマット、酵素連結イムノアッセイまたはＥＬＩＳＡは 、市販品に広範囲に用いられていて、たとえばマイクロタイタープレート、専売 品の「ビーズ」もしくはｒｌＭＸ」　（商標）システム、または中空ロッドもし くはピペットチップを使用するこのようなアッセイの実施には自動化装置が使用 可能で、また得られた結果の処理にはコンピューターソフトの使用が可能である ６用いられる酵素系はそれ自体よく知られていて、たとえばＥＬＩＳＡ　ａｎｄ 　０ｔｈｅｒＳｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｔｈｅｏｒ ｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ”　Ｋｅｍ■獅凵 @Ｄ、Ｍ。

＆　Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ　Ｓ、　Ｊ、　ＩＩを参照されたい。

輿望的な酵素系の例には、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ。

ウレアーゼまたはペルオキシダーゼたとえば西洋ワサビペルオキシダーゼを用い る系がある。

抗体を捕獲される固相はたとえば、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウ ェルもしくはカップであり、また他の形態たとえば、中空ではないもしくは中空 のロッドもしくはピペット、またはたとえば直径０．　１μｍ〜５ｍｍの粒子（ このような粒子は、それらが作られている材料とは無関係に、　「ラテックス」 粒子と呼ばれることが多い）とすることができる。

固相はプラスチックまたはポリマー材料製、たとえばニトロセルロース、ポリビ ニルクロリド、ポリスチレン、ポリアミド、ポリビニリデンフルオリドまたは他 のポリマー製とすることができる１粒子はさらに、天然のポリマー、たとえばラ テックスまたは蛋白質製とすることができる。マイクロタイタープレートおよび ビーズは血液スクリーニングおよび臨床検査の両者に広範囲に用いられ、市販品 を広く入手できる。

使用できる他の固相には、たとえば多孔恍繊維性または吸湿性材料、たとえばナ イロン、ポリビニルクロリドもしくは他の合成ポリマー、天然ポリマーたとえば セルロース、天然ポリマーの誘導体たとえばセルロースアセテートもしくはニト ロセルロース、またはガラス繊維製の膜、シートおよびストリップが包含される ０紙たとえばジアゾ化ペーパーも使用できる。たとえば繊維性または吸湿性材料 のたとえば上述の材料のフィルムおよびコーティングも固相として使用すること ができる。

固相の上述の例は例示のためだけに挙げたものであり２本発明はこのような固相 の使用に限定されるものではない１本発明は、イムノアッセイにおける使用に適 した任意の固相上で実施できる。

固相たとえば膜、シート、ストリップ、フィルムまたはコーティングは、多重の または、より一般的には、単一のサンプルの測定用デバイスに装填される、ここ で用いられる「アッセイデバイス」の語は、固相、一般的には層状の固相。

たとえば膜、シート、ストリップ、コーティング、フィルムまたは他の層状手段 であって、その上に免疫グロブリンの１または２以上のクラスに対する抗体が固 定化される固相から構成されるイムノアッセイを実施するための手段を意味する 。

固定化された抗体は好ましくは、ここでは「抗原捕獲域」と呼ばれる一定の領域 に存在する。

アッセイデバイスは強固な支持体または収納部内に固相を導入し、これはまたア ッセイの実施に必要な一部または全部の試薬から構成される。サンプルは一般的 に、予め定められたサンプル適用域でアッセイデバイスに、たとえばサンプルを その領域に注入もしくは滴下するかまたはデバイスの関連部分をサンプル中に浸 漬させることによって適用される。サンプル適用域が抗体捕獲域と異なる部位に ある場合には、デバイスは一般に、サンプル中の抗体が抗体捕獲域に移動するよ うに配置される。必要な試薬はついで、所定の適用城に適当な順序で適用される 。この領域はサンプル適用域と同じでも同じでなくてもよい、この場合も、試薬 適用域が抗体捕獲域とは異なる部位にあるならば、デバイスは一般に、試薬が抗 体捕獲域に移動するように配置される。ここで、形成された抗原−抗体複合体が 検出される。イムノアッセイに必要な全部または一部の試薬は、液体または乾燥 形態でデバイス中に導入される。この場合、デバイスは一般に、デバイスの操作 時に自動的にまたはデバイスのユーザーによって行われて起こるデバイスの異な る部位間の相互作用で、各種試薬が互いに、実施されるイムノアッセイの場合に 正しい順序で接触するように配置される。

広範囲のアッセイデバイスがイムノアッセイの文献に記載されている０Ｍデバイ スの例は米国特許４．６２３，４６１号および４，６９３，９８４号に記載され ている。それらの設計および作動速度によって、一部のアッセイデバイスは「デ ィツプスティック」と呼ばわ、また一部のデバイスは「迅速アッセイ」デバイス と呼ばれる。　「迅速アッセイ」デバイスは一般に、サンプルの適用から１０分 以内に結果を与える（通常のマイクロタイタープレートまたはビーズアッセイは インキュベーション工程を必要とし、一般に、結果を与えるまでに少なくとも１ 時面を要する）、シたがって、アッセイデバイスは、マイクロタイターまたはビ ーズフォーマットアッセイよりも高価になるが、たとえば結果が迅速に必要な場 合、たとえば緊急手術の場合の臨床検査において特定の用途がある。

アッセイデバイスは、高性能の検査室設備を必要とせず、検査室の設備が全くな くても使用できるという特殊な利点がある。したがって、これらはたとえば。

緊急病棟で、医師の手術に際し、薬局で、また場合によっては家庭での検査に。

「現場」検査として使用できる、これらは、検査室設備がほとんどない地域でと くに有用である。

上述のように１本発明のコンビネーションアッセイは供血のスクリーニングにと くに有用である。すなわち、アッセイは、ＨＩＶたとえばＨＩＶ−１，ＨｒＶ− ２およびＨＩＶサブタイプたとえばＨＩＶ−１サブタ・ｒブＯ；ＨＣＶ；Ｂ型肝 炎（コア抗原に対する抗体）；ＨＴＬＶたとえばＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ− １［：ＣＭＶ；ＥＢＶ（エプスタイン−パールウィルス）；ならびに所望により 梅毒から選ばれる少なくとも２種類のウィルスに対する抗体の検査に使用できる 。

、！＝　＜　ｉ：ＨＩ　Ｖたトエば）ＩＩＶ−１＋２　；ＨＣＶ、ＨＴＬＶたと 、？−１ｆＨＴＬＶ−Ｉ＋［；およびＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）；たとえばＨＩＶ とＨＣ’Ｊ：ＨＩＶとＨＴＬＶ；ＨＴＬＶとＨＣＶ；ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢ ｃ　：ＨＩＶ、ＨＣＶ。

ＨＴＬＶおよびＨＢｃから選ばれる２種以上の組合わせが好ましい、梅毒を上記 いずれかの組合わせに包含させることもできる０重要な組合わせは特定の国の規 制によって影響されることになろう、場合によっては、供血は他の病原体たとえ ば風疹についても検査することができる。

さらに、血液スクリーニングに対する要求は、新たな病原体（新しい生物および 既知生物の新しいサブタイプ）の発見に従って再検討されそれらの病原体をカバ ーするために必須のアッセイが拡大される。たとえば、現在では、大部分の国で ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の両者の検査が要求されている。最近のＨｒＶ−１ サブタイプ０の発見が、このサブタイプも検出しなければならないとの要求を招 いている。すなわち、検出すべき病原体の組合わせが今後拡大することはほとん ど確実であろう１本発明はこのような病原体の組合わせのアッセイも包含する。

チューブ／ビーズ２成分系を使用すれば、さらに可転性を導入できる。たとえば 、チューブおよびビーズをサンプルと接触させたのち、ビーズを分離して１また は２以上の異なる種の病原体に対する抗原（単数または複数）と接触させ、また チューブは異なる抗原または抗原の組合わせと接触させることができる。

チューブ／ビーズ２成分アッセイフォーマットの他の変形では、■または２以上 のクラスの抗−免疫グロブリンを一方の成分上に固定化し、抗−Ｂ型肝炎表面抗 原（抗−ＨＢｓＡｇ）を他方の成分上に固定化するフォーマット、たとえば。

抗−１ｇＧおよび所望により抗−１ｇＭを小チューブの内面に抗−ＨＢｓＡｇを ビーズ上にまたはその逆にコーティングするフナ−マットがある。ビーズおよび チューフハついで一部１：、ＨＢｓＡｇ／多種抗体を組合わせたアッセイにおい て。

と＜ｌ：ＨＢｓＡｇ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、および所望によりＢ型肝炎（：ｆｆ７） 。

ＨＴＬＶ、および梅毒から選ばれるさらにｌまたは２以上の別の被検物質のアッ セイに使用することができる。

ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と特異的に相互作用するペプチドおよびポリペプチ ドはよく知られていて、たとえば、ＥＰ−Ａ−０３０７１４８に記載されている ９本発明者らは１合成ＨＩＶペプチドのシスティン残基のスルフヒドリル基を遮 断剤で遮断すること（ＥＰ−Ａ−０３０７１４９参照）がとくに有用であり。

得られた標識ペプチドとくに酵素標識ペプチドはアッセイにおいて相当する非遮 断ペプチドよりも高い抗原性を有することを見出した。

Ｂ型肝炎コア抗体の検出に用いられる抗原はコア抗原である。各種Ｂ型肝炎七ロ タイブのＤＮＡおよび予測される蛋白質配列は、たとえば、　Ｏｎｏら（１９８ ３）。

Ｎｕｃｌ、Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．１７４７に報告されていて、この報告 された配列から合成および組換え両者の適当なペプチドおよびポリペプチドコア 抗原を誘導できる。

Ｃ型肝炎は現時点では、１つの免疫学的に優性なエピトープをもつことは明らか にされていないので、２領域以上に対する抗体を試験することが好ましい、たと えば、抗原として、２以上のエピトープ、たとえばＣＢ−Ａ−２，２３９，２４ ５に記載されているような、たとえば少なくとも１つの構造領域および少なくと も１つの非構造領域からのアミノ酸配列から構成される融合蛋白質を用いること が有利である。コアおよびエンベロープ領域からの抗原は好ましい構造抗原であ る。非構造抗原は、たとえば、ＮＳ３．ＮＳ４およびＮＳ５領域から選択するこ とができる。

ＨＴＬＶ抗原は、たとえば、ｐ２１ｅもしくはｇｐ４６組換え蛋白質、またはｐ ２１ｅもしくはｇｐ４６から誘導されるペプチドとすることができる（たとえば 、米国特許第４，７４３．６７８号参照）、ｖ４製ｐ２４ｅはＣａｍｂｒｉｄｇ ｅＢｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　１６００　Ｅａｓｔ　Ｇｕｄｅ 　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＩＪＤ　２０８５０−５R００．　ＵＳＡ か ら、ｇｐ４６はＲｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉ　Ｋｅｎｄａｌ 　５ｑｕａｒｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ　７００゜Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａ　０ ２１３９．　ＵＳＡから入手できる。

ＣＭＶ抗体の検出には、精製された培養ＣＭＶコア蛋白質たとえばｐ６６、また はウェスタンプロットで優性な組換えｐｐｔｓｏを使用できる。ＦＢＶ抗体の検 出には、カプシドまたは初期抗原を使用できる。梅毒抗体の検出には精製梅毒ス ピロヘータ抗原を使用できる。

本発明のコンビネーションアッセイは、臨床診断において、数種の病原体の予備 的スクリーニング試験に使用できる。試験が陽性であれば、ついで各病原体につ いて別個の試験を行うことができる。結果が陰性であれば、さらに検討は必要な い、全体として２時間および経費は節減される。このような組合わせの例には。

多くの国で行われている妊婦のいわゆるｒＴＯＲｃＨ」スクリーニングに用いら れる組合わせがある。検討する病原体の組合わせは血液スクリーニングの要求と 同様に国によって変動するが、一般的には風疹、ト牛ソプラズマ底　ＣＭＶおよ びヘルペスから選択される。固定化された抗−１ｇＧおよび抗−１ｇＭの混合物 を用いることは、最近の感染が検出される保証があるのでとくに有利である。

アッセイデバイスフォーマット、とくに［迅速アッセイＪフォーマットで提供さ れる本発明のコンビネーションアッセイは、スクリーニング結果が緊急を要する 場合、たとえば緊急手術の場合にとくに有用である。たとえば２以上の異なる血 中ウィルス病原体、たとえば上述のように、たとえばＨＩＶ−１＋２とＨＢｃに ついての迅速アッセイは、特殊な注意が必要かどうかの情報を外科医に与えるこ とになる。

関心病原体が組合わされたアッセイデバイスは、たとえば、医師の手術に際して 診断を補助する［現場」検査に有用であり、臨床検査室の試験および外科への再 来の回避の両者で、全体として時間および経費を節減することができる。さらに アッセイデバイスは、検査室設備がすぐに利用できない場合に、たとえば僻地ま たは開発途上国での検査に有用である。病原体の組合わせの例としてはＣＭＶお よびＨＩＶ、ＴＢおよびＨＪＶがある。

ユニバーサルな抗体コーティング固相の、複数の抗原の検出のための使用の可転 性は、臨床検査にはまた別の様式で活用できる。臨床検査においては、その目的 は一般に、サンプル中に病原体を同定することである。現在では、多数のサンプ ルを、慣用のマイクロタイタープレートまたはビーズフォーマットを用いて各種 の病原体の存在について試験しなければならない場合、各サンプルのアリコート を準備して、異なる病原体それぞれについての一連のアッセイを行うのが通例で ある。これは、慣用のアッセイが病原体特異的抗体を捕獲するために、抗原でコ ーティングされた手段を使用しているからである。したがって、各病原体毎に。

異なる抗原でコーティングされた手段、一般的にはビーズまたはマイクロタイタ ープレートのいずれかを用いる必要がある。これでは、特定のサンプルについて の結果を得るための時間が増大し、各種検査の全てを実施する間に、サンプルの アリコートが間違えて配置されたり取り違えられたりする危険も生じる。

しかも、抗原でコーティングされた手段は一般に他の試薬、たとえば陽性および 陰性対照、洗浄溶液および希釈液とともにキットの形態で提供される。したがっ て、ユーザーは多数の異なるキットを持っていなければならない。

本発明のアッセイを用いれば、ユニバーサルな抗体コーティング手段、たとえば マイクロタイタープレートを、複数個の病原体それぞれの同時のただし別個の測 定に、単に適当な抗原試薬を用いるだけで使用することができる。一連の異なる サンプルについて同時に、一部は１つの病原体を一部は他の病原体を検査するこ とができる。単一のサンプルのアリコートを異なる病原体について同時にただし 別個に試験すること、たとえば各アリコートをマイクロタイタープレートの別個 のウェルで異なる病原体について試験することはとくに有利である。これは。

時間と経費の節減を生じ、またサンプルの紛失または取り違えによる失敗の危険 も減少させる。

したがって１本発明はまた。液体試験サンプル中の２ｆ１１以上の異なる病原体 に対する特異的抗体を同時にただし別個に測定する方法において。

（ｉ）各サンプルを、たとえば１または２以上のクラスの免疫グロブリンに対す る抗体が固定化された固相からなる各ユニットを単一のモジュールとした複数個 のユニットの１つと接触させて、各サンプル中に存在するｌまたは２以上の各ク ラスの免疫グロブリンを固相上に捕獲させ、この場合固定化された抗体はそのモ ジュール中の全てのユニットにおいて同一のクラスまたはクラス群であり。

（ｉｉ）サンプルと既に接触させた各ユニットを、検討する病原体の１つに特異 的な抗体に対して選択的に結合できる抗原であって、それぞれが直接または間接 的に検出可能なシグナルを提供する手段を与えられている抗原と接触させ、つい で。

（山）固相上に得られた免疫グロブリン−抗原複合体を測定すること。

からなる方法を提供する。

使用される異なるユニットの数、したがって使用される抗原の数は、検討する病 原体の数に依存することになる。各ユニットは、たとえばマイクロタイタープレ ートのウェルの１つ、またはビーズを含有する容器とすることができる。

別法として、各ユニットは、とくにアッセイデバイスとして提供される場合には 、！Ｉ、ストリップ、シート、フィルムまたはコーティング上の定められた領域 とすることもできる。検討するサンプルからの成分の捕獲のために予め定められ た領域を存するデバイスはそれ自体既知である。最も簡単な形態では１本発明の 同時にただし別個に行われるアッセイのためのアッセイストリップデバイスは。

たとえば、ここでは抗体捕獲領域と呼ばれる。ストリップの幅員を横切る捕獲免 疫グロブリンのバンドを有する吸湿性材料のストリップから構成することができ る。バンドは捕獲免疫グロブリンでコーティングされていない領域によってセク ションに分離されていることが好ましい、各セクションの固定化された免疫グロ ブリンはユニット抗体捕獲領域と考えることができる。

同時にただし別個に行われるアッセイ用のアッセイデバイスは、たとえばコンビ ネーションアッセイとの関連で上述した通りである。

異なる病原体について同時にただし別個に行われるアッセイ用の本発明のアッセ イデバイスの可転性は、！２遺業者およびユーザーの両者にとって大きな利点を 提供する。主要な利点は、定められた抗体捕獲領域が多数設けられた１個のデバ イスがサンプル中の多数の異なる抗体の同時試験用の複数個の抗原試薬とともに 供給できることである。前の場合と同様に、製造業者には、全ての被検物質につ いて１つのデバイスだけを作ればよいという利点がある。ユーザーにも、必要な のは１つのデバイスだけという利点があり、またさらに、測定される被検物質の 組合わせを自由に選択できるという利点がある。

いてのアッセイは、サンプル中の任意の特定の病原体の組合わせの検討のために 実施することができる。たとえば、肝炎に罹患している患者からのサンプルは。

Ａ型肝炎、Ｂ盟肝炎抗−コア抗体およびＨＣＶについて同時に検査することがで きる。非特異的尿道炎の患者からのサンプルは淋病、クラミジアおよびカンジダ について検査することができる。

本発明の同時にただし別個に行われるアッセイの変形では、同じクラスまたはク ラス群の固定化抗体を存する各ユニットに代えて、１または２以上のユニット上 には異なるクラスの免疫グロブリンを固定化してもよい、たとえば、２種類のの ような２−ユニットセットを用いて長期間にわたり実施される特定の抗体の一連 の同時アッセイは、初期感染の検出と疾患の経過の追跡に、たとえば、ＨＩＶま たはＨＣＶのとくに血清転換の追跡に有用である。３種類のユニットのセット。

１つには抗−ＩｇＧを固定化し、１つには抗−１ｇＭを固定化し、第三のユニッ トには抗−ＩｇＡが固定化されているセットは新生児がＨＩＶに感染しているか どうかの決定にとくに有用である。新生児の血液は新生児自身の抗体と母体から の抗体の両者をもっていて、したがって、慣用の試験を用いては、感染の指標で ある新生児が自分のＨＩＶ抗体をもっていることの決定は困難である。

２クラス以上の抗体が使用される他の例には、多くの国で妊婦に行われているい わゆるｒＴＯＲｃＨ」試験の場合がある。病原体は風疹、トキソプラズマ症、Ｃ ＭＶおよびヘルペスから選択される。この組合わせは組によって変動する。風疹 の検査には、危険の可能性が高い最近の感染を検出するために、１ｇＭアッセイ を包含させなければならない、したがって、風疹を含むｒＴＯＲｃＨ」ア・ツセ イには、用いられるセット中の少なくとも１つのユニットは抗−１ｇＭコーティ ングが施されていなければならない。

異なるクラスの免疫グロブリンに対する抗体が固定化された２種類以上のユニッ トからなるモジュールはそれ自体２本発明の部分である。したがって１本発明は 、異なる病原体の同時のただし別個のアッセイにおいて用いられる２種類以上の ユニットからなるモジュールであって、ユらットは免疫グロブリンに対する固定 化抗体から構成され少なくともその１つのユニットには、他のユニットにおいて 固定化された免疫グロブリンとは異なるクラスの免疫グロブリンに向けられた抗 体が固定化されたとえば、１つのユニットは固定化された抗−１ｇＭを存し、１ または２以上のユニットは固定化された抗−ＩｇＧを有するモジュールを提供す る。他の実施悪様においては、モジュールは３つのユニットからなり、１つのユ ニットは固定化された抗−ＩｇＧを有し、１つのユニットは固定化された抗−１ ｇＭを有し、第三のユニットは固定化された抗−ＩｇＡを有する。

２以上のユニットからなるモジュールは、アッセイデバイス中に、たとえば２以 上の抗体捕獲域、たとえばＩｇＧ捕獲域および１ｇＭ捕獲域の配置として提供さ れる。このようなアッセイデバイスは異なる病原体についての同時のただし別個 のアッセイに、たとえば上述の任意の特定の用途のために使用できる。

別法として、モジュールはユニットの２以上のセット（各セットは同一のユニッ トからなる）から構成されていてもよい、異なるユニットの一連のセットがモジ ュールとして提供される。たとえば、ユニットのセットは、マイクロウェルのス トリップとして提供されてもよい、このようなストリップは、ユニットの２以上 のセットからなるモジュールに、所望のように組立てることができる。たとえば 、モジュールをマイクロウェルの２つのストリップから構成し、１つには抗−Ｉ ｇＧをコーティングし、１つには抗−ＩｇＭをコーティングすることができる。

抗−ＩｇＡでコーティングされた第三のストリップを添加することもできる。マ イクロウェルのストリップ、すなわちユニットのセットは、所望により、慣用の マイクロタイタープレートの形態に組立てることができる。たとえば、プレート には抗−１ｇＭと抗−ＩｇＧでコーティングされたマイクロウェルの列またはカ ラムが交互に、たとえば血清転換の追跡のために、配置されてもよい、この場合 も、とくにマイクロウェルのストリップまたはユニットの同様のセットでは、製 造経費の利点と使用の可転性の利点がある。

とくに指摘のない限り、以下の記述は本発明のコンビネーションアッセイおよび 同時のただし別個のアッセイの両者に適用される。

臨床検査では、液体の試験サンプルは任意の体液であってよく、たとえば血庇血 漿、血清、唾液、尿、脳を髄液、乳汁、リンパ液または涙液である。また、たと えば細胞または組織の固体サンプルは検査用の液体の形態、たとえば組織滲出液 とすることができる。

血液スクリーニングでは（これはコンビネーションアッセイとして行うのが有利 である）、関心病原体はいわゆる血中ウィルス病原体（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎および Ｃ型肝炎、また所望によりＨＴＬＶ、ＣＭＶおよびＥＢＶ）、また梅毒である。

臨床検査では、はるかに広範囲の病原体が関連し、上述の生物体および他のウィ ルス、細菌ならびに他の種類の病原生物体が包含される。非限定的な例を示せば 以下の通りである。

風疹、麻疹、ヘルペス（単純および陰部）、クラミジア、淋病、Ａ型肝炎、水痘 、流行性耳下腺炎、ヒトパルボウイルス、結核菌、癩菌、トリ結核菌、黄色ブド ウ球菌、単球症リステリア、炭厄菌（抗原／トキシン）、放線菌類（たとえばス トレプトマイシス、ノカルジア、ロードコツカス）、チフス菌、エルシニアエン テロコリフィ力、ヘリコバクターピロリ、キャンピロバクタージェジュニ、馬鼻 痘菌、緑膿菌、レジオネラニューモニアおよび同属菌種、野兎病菌、プルセラメ リテンシス、肺炎マイコプラズマ、レブトスピラインテロガンス、ボレリア属菌 種、梅毒トレポネーマ、カンジダアルビカン、ならびに原虫類病原体によって引 き起こされる疾患たとえばアメーバ症、バベシア症、シャーガス病、リーシュマ ニア症、マラリアおよびトキソプラズマ症の病原体固定化される抗−免疫グロブ リンは２以上のクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡからの２種以上と することができる。上述のように、ＩｇＧは血清中に最も豊富な免疫グロブリン であるｉｇＭは感染に応答して最初に産生される免疫グロブリンであり、したが ってＩｇＧよりも早い感染の指標を提供する。

血液（血漿または血清）検査には、一般的に、アッセイの目的に応じて、ＩｇＧ または１ｇＭ単独が用いられ、または抗−ＩｇＧおよび抗−１ｇＭの混合物がコ ンビネーションアッセイの１ユニツト中に用いられるか、もしくは抗−ＩｇＧお よび抗−１ｇＭは同時のただし別個のアッセイの別個のユニット中に提供される 。

唾液のアッセイでも、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭを捕獲することが好ましい。

尿のアッセイでは、抗−ＩｇＧの使用が好ましく、所望により、ＩｇＭおよび／ またはＩｇＡを組合わせることができる。

２成分ビーズ／チューブフォーマットを用いる本発明のアッセイの形態では。

１または２クラスの抗−免疫グロブリンをプラスチックチューブの内面上に固定 化し、１または２の異なるクラスの抗−免疫グロブリンを、チューブ内で使用さ れるビーズ上に固定化することによって９本発明のアッセイの適合性をさらに上 昇させることができる。たとえば抗−ＩｇＧを２成分の一方の上にコーティング し、他方の上に抗−ＴｇＭをコーティングすることができる。

さらに、コンビネーションビーズ／チューブフォーマットを用いて、チューブお よびビーズをサンプルと接触させたのち、ビーズを分離して１つの抗原と接触さ せ、チューブは他の抗原と接触させると、単一のサンプルに対して２抗体アッセ イを行うことが可能になる。

血液スクリーニングと臨床検査の両者について以上記載したが、使用したアッセ イの原理、また使用した材料の種類には違いはない、血液スクリーニングでは。

特定の国の規制機関によって被検物質は特定の範囲に限定されその検査は単に同 一の検査が多数行われるという理由で、臨床検査よりも完全に自動化される傾向 にある。しかしながら２本明細書を通じて、とくに指摘がない限り、全ての記載 は本発明のアッセイに一般的に関連するものであり、アッセイデバイスで行われ るアッセイならびに、たとえば、マイクロタイタープレートおよびビーズ上で行 われるアッセイが包含される。

本発明のアッセイは、慣用の様式で行うことができる（たとえば”ＥＬＩＳＡ　 ａｎｄＯｔｈｅｒ　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　［ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｔｈ ｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔ刀高jｅｎｉ ｅｎＹ。

Ｄ、　＆Ｌ　＆　Ｃｈａｔ　Ｉａｃｏｍｂｅ、　Ｓ、　Ｊ、編参照）、免疫グロ ブ’）　ンＩ；を固１に、　たとえば、　固ｍを免疫グロブリンの適当な濃度お よびｐＨ１たとえば、７〜１１の範囲とくに９〜ｌＯのｐＨの溶液と接触させる ことによって、固定化させることができる。緩衝剤、たとえば炭酸ナトリウム／ 炭酸水素ナトリウム緩衝剤の使用が好ましい、上に指摘したように、適当な免疫 グロブリン製品は市販品を入手可能で、市販抗体溶液の適当な希釈度は、たとえ ば、Ｉ　：２００−１　：４０００ｖ／ｖである。

標識された抗原試薬（接合体）は任意の様々な方法により製造できる（たとえば 、　ｌ（６ｍｅ１ｙ　＆Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ前出参照）、抗原−酵素接合体 が一般的に使用される。

サンプルは希釈することができる。たとえば、血液または血漿サンプルは１中Ｉ 　ｖ／ｖに希釈され、たとえば５０μｍのサンプルがマイクロウェル中５０μｍ の希釈液に添加される。用いられるサンプル希釈液には、捕獲されるｌまたは２ 以上のクラスのヒト免疫グロブリンを含有してはならないことに留意すべきであ る。

、マイクロタイタープレートまたはビーズフォーマットアッセイにおいては、サ ンプルはついで一般に固相とインキュベートされる。インキュベーションの温度 および時間は相互に依存し、低い温度では長い時間が必要になる１通常のインキ ュベーション条件は３７°Ｃ１時間である。インキュベーション後、プレートま たはビーズは、抗原試薬とのインキュベーション（接合）に先立って、完全に洗 浄しなければならない、接合段階の通常のインキュベーション条件は３７℃で３ ０分である。接合体とのインキュベーション後、さらに洗浄工程を行い、ＥＩｊ ＳＡの場合はついて酵素の基質とのインキュベーションを行う、この場合も、３ ７℃で３０分か通常のインキュベーション条件である。停止溶液は一般に、イン キュベーションの終了時に添加される。ＥＬＩＳＡの場合、結果は一般に、各ユ ニットの吸収を分光光度計で読み取ることによって得られる。他の標識系が用い られる場合には、それに応して方法が改変され、たとえば放射イムノアッセイま たは蛍光イムノアッセイの場合には、結果は放射標識または蛍光抗原接合体との インキュベーション後に得られる１着色粒子の場合には、陽性または陰性の結果 は肉眼で測定することも可能である。

検査室の外部で用いられるアッセイデバイスの場合には、最小限の反応工程で。

陽性または陰性の結果は肉眼での測定が可能なことから、標識としては着色粒子 がとくに好ましい、もっと高感度のアッセイには、ＥＩｊＳＡ系が使用できる。

本発明はまた。

（ａ）ｌもしくは２以上のクラスの免疫グロブリンに対する抗体、とくに抗−Ｉ ｇＧおよび抗−１ｇＭ抗体の混合物が固定化された固相、とくにプラスチックビ ーズまたはマイクロタイタープレート。

（ｂ）検討する病原体の１つに特異的な抗体にそれぞれが選択的に結合できる２ 以上の抗原試薬であって、それぞれの抗原が直接または間接的に検出可能なシグ ナルを提供できる手段を与えられている抗原試薬、ならびに所望により、以下の １または２以Ｌ （Ｃ）陽性および陰性対照、洗浄溶液ならびに電釈液。

からなるキットを提供する。

キットはそのままで提供されてもよ（、また抗体でコーティングされた成分およ び抗原試薬成分は別個に提供されてもよい。

本発明はまた。抗−ＩｇＧおよび抗−１ｇＭ抗体の混合物が固定化された。イム ノアッセイ用に適当な固相を提供する。抗体の混合物にはさらに抗−ＩｇＡ抗体 が付加されていてもよい、抗体はとくに抗−ヒト抗体である。固相は、たとえば 、上述の任意の固相、たとえばマイクロタイタープレートおよびビーズであり。

またアッセイデバイスに用いるのに適した固相も包含される。

いずれも本明細書で用いられる「検出」および［測定」の飴は、病原体に対する 定性的、定量的および半一定量的アッセイを意味する。

異なるサンプル中の複数個の病原体に対する抗体の測定（［コンビネーションア ッセイ」）または同一サンプルのアリコート中の複数個の異なる抗体の同時のた だし別個の測定のための免疫グロブリン捕獲フォーマットの使用は１時間および 経費の両者で有利である。多数の病原体が１ユニツト内でまたは一連の平行ユニ ット内で単に抗原試薬の選択によって測定できるフォーマットの潜在的な可転性 は以前に評価されたことはなかった。全ての抗体アッセイにユニバーサルな抗体 コーティング手段、たとえば抗体コーティングマイクロタイタープレート、抗体 コーティングビーズおよびアッセイデバイスにおける固定化抗体の使用が可能で あることの極めて実用的で経済的な利点は、過小評価すべきではない。

本発明が病原体の検出に限定されるものではないことも、もちろん、理解すべき である０本発明は、抗原の性質が何であれそれが抗体たとえば非病原体関連抗体 を励起するものであれ、任意の関心抗体の検出に適用できる。このような抗体が 励起される状態の例には、自己免疫疾患およびアレルギー、たとえば非臓器特異 的自己免疫疾患たとえば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトデスおよびリウマ チ熱、および臓器特異性自己免疫疾患および何らかの自己免疫の関連が考慮され る疾患たとえば甲状腺の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧丸多発性播種性硬化症 □アフタ性潰瘍、悪性貧血および潰瘍性大腸炎が包含される。必要な全ては関心 抗体に特異的に結合できる実体である。

したがって１本明細書の教示は、病原体に対する抗体に関してと同様に、非病原 体関連抗体の検出にも当てはまるものであり９本発明はこのような実施態様の全 てを包含するものであることを理解すべきである。

本発明は、ヒトおよび動物の病原体の検出および測定に使用することが可能で。

ヒトへの応用および獣医学的応用の両者を見出したものであり１食肉業における 応用も包含する。

以下の非限定的実施例は本発明を例示するものである。

以下に記載するアッセイに以下の試薬を使用した。

ｌ、固相：ポリクローナル抗−ヒトＩ　ｇＧ　（ＤＡＫのおよびポリクローナル 抗−ヒトＩ　ｇＭ　（ＤＡＫＯ）の混合物でコーティングされた９６−ウェルマ イクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）　、　Ｎｕｎｃの製品は、Ｌ汀ｅ　Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＯＢｏｘ　３５゜Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒｏａｄ、　 Ａｂｂｏｔｔｓ　Ｉｎｃｈ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｓｔａｔｅ、　Ｐａ１ｓ ｌｅｙ、　Ｒｅｎｆｒ■翌唐■奄窒■B ＴＡ３４ＥＦ、５ｃｏｔ−１ａｎｄ、　ＤＡＫＯの製品はＤＡＫｏ、　１６　Ｍ ａｎｏｒ　Ｃｏｕｒｔｙａｒｄ、Ｈｕｇｊｅｎｄｅｎ　Ａｖ■獅浮■B ）ｉｉｇｈ　Ｗｙｃｏｍｂｅ、　Ｂｕｃｋｓ　ＲＰ３５ＲＥ、　Ｅｎｇｌａｎｄ から入手できる。

２、　ＨＲＰ　（西洋ワサビベルオキソダーゼ）に接合した。ＨＩＶ−１のＣＢ Ｌ−１アイソレートからのコアおよびエンベロープ抗原［５ａｔｔｅｎｔａｕ、 　Ｑ、　Ｊ、ら。

（１９８６）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．１１２０１からなるＨＩＶ−１組換 え蛋白質（ＨＩＶ−１接合体） ３、）（ＲＰに接合したｇｐ３６エンベローブ抗原からなるＨＩＶ−２ペプチド （ＨＩＶ−２接合体） ４、ＨＲＰに接合した肝炎コア抗原 ５、陽性サンプル： ａ）ＨＩＶ−１，内部対照Ｎｏ、４０３４　、　ＨＩＶ−１陰性血清で希釈ｂ） ＨＩＶ−２，内部対１１ｕｏ、９１／＋７４　、　ＨＩ　Ｖ−２陰性血清で！釈 ｃ）ＨＢｃ陰性血清で希釈した抗−ＨＢｃコア陽性サンプル６、陰性サンプル： 供血から得られた正常ヒト血清互生 １００μｍの希釈サンプル（サンプルｌＯμｍとサンプル希釈液９０μｍ）をマ イクロタイタープレートのウェルに加え、加湿条件下に３７°Ｃで６０分間イン キュベートした。ついでウェルを洗浄溶液で５回完全に洗浄した。各洗浄工程は 各ウェルの内容物の吸引による除去、洗浄溶液（Ｔ＊ｅｅｎ含有グリシンホウ酸 塩緩衝液）によるウェルの充填および３０秒間の浸漬を包含する。最終洗浄工程 後に。

ウェルの内容物を除去し、ペーパータオルまたはティッシュ上で軽く叩いて乾燥 させた。ウシ血清アルブミンおよび界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液中関連接 合体（単数または複数）の操作濃度溶液５０μｍを、以下に記載するように単一 でまたは組合わせでウェルに加え、プレートを加湿条件下に３７℃で３０分間イ ンキュベートした。上述のようにさらに洗浄工程を行ったのち、　ＴＭＢ　（３ ゜３’、５．　５’−テトラメチルベンチジン）および過酸化水素を含む基質溶 液１００μｌを各ウェルに加え、プレートを加湿条件下に３７°Ｃで３０分間イ ンキユベートシ、ついで２Ｍ硫酸５０μｍを用いて反応を停止させた。ウェルの 吸収を対照波長として６９０ｎｍを用いて４５０ｎｍで記録した。

例１ それぞれ関心抗体（抗−ＨＩＶ−１，抗−ＨＩＶ−２および抗−ＨＢＣ）（７） １種を含有する陽性サンプルを希釈し、上述のＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２およびＨ Ｂｃ接合体を以下の表に示すように単独でまたは様々な組合わせで用い上述のプ ロトコールに従って試験した。ＨＩＶ−１サンプルはＩ／　４０．Ｉ／　８０゜ １／１６０および１／３２０の希釈系列とした。ＨＩＶ−２サンプルの場合は。

１／　３２．１／　６４．１／　１２８および１／２５６に希釈した。多数の異 なるＨＢｃ−陽性サンプルは１／２に希釈した。

（ｉ）ＨＩＶ−１陽性サンプルは希釈度を増大させて、以下の接合体：ＨＩＶ− １；　ＨＩＶ−１＋ＨＴＶ−２；　ＨＴＶ−１＋ＨＢｃ；　ＨＩＶ−１＋ＨＩＶ −２＋ＨＢｃでそれぞれ試験した。結果は表１に示す。

希釈度の　＞３　２．８９７　＞３　）３増大　２．θ亘５　１．９０５　２． ０＋１　１．８４７１．２８２　１．１４８　１．２１４　１．１２９　・０． ６９４　０．６６３　０．６９５　０．６７２０．４１　０．３７８　０．４１ ２　０．３７８０．２３２　０．２３０　０．２８２　０．２３５陰性　０．０ ５８　０．０６＋　０．０６８　０．０７６接合体　ＨＩＶ−Ｉ　ＨＩＶ−１＋ 　ＨＩＶ−１＋　ＨＩＶ−１＋ＨＩＶ−２ＨＩＶ−２ＨＩＶ−２＋ Ｂｃ （ｉｉ）ＨＩＶ−２陽性サンプルは希釈度を増大させて、以下の接合体：ＨＩＶ −２：　ＨＩＶ−２＋ＨＩＶ−１；　ＨＩＶ−２＋ＨＢｃ：　ＨＩＶ−１＋ＨＩ Ｖ−２＋ＨＢＣでそれぞれ試験した。結果は表２に示す。

表２ サンプル→　ＨＩＶ−２ＨＩＶ−２ＨＩＶ−２ＨＩＶ−２希釈度の　０．０９９ 　１．０４５　１．００９　１．００２増大　０．５８８　０．６３５　０．６ １９　０．６１９０．３８６　０．３９７　０．３８６　０．３８３０．２３２ 　０．２５２　０．２４９　０．２５１０、＋５８　０．１６７　０．１７１　 ０．１８３０．１１１　０．１２４　０．１２６　０．１３５陰性　０．０５３ 　０．０６０　０．０６１　０．０７２陰性　０．０５３　０．０６２　０．０ ６３　０．０７５接合体　ＨＩＶ−２８ＩＶ−２＋　ＨＩＶ−２＋　ＨＩＶ−２ ＋ＨＩＶ−Ｉ　ＨＩＶ−Ｉ　ＨＩＶ−１＋（由）６つの異なるＨＢｃ陽性サンプ ルをそれぞれ以下の接合体：ＨＢｃ；ＨＢｃ＋ＨＩＶ−１；　ＨＢｃ＋ＨＩＶ− ２：　ＨＢｃ＋ＨＩＶ−１＋ＨＩＶ−２で試験した。結果は表３に示す。

０．９５６　１．０７２　０．９７０　０．９２６０．９８０　１．０７３　０ ．９８６　０．９１３０．９９４　１．０５３　０．９６６　０．０３２１．０ ７２　１．１８９　１．０５８　１．０３０１．０６２　１．１７７　１．０６ ６　１．０２５１．０５８　１．１５６　１．０６２　１．００５陰性　０．０ ５６　０．０７０　０．０６１　０．０７４陰性　０．０６０　０．０６９　０ ．０６３　０．０７３接合体　ＨＢ　ｃ　ＨＢ　ｃ　＋　ＨＢ　ｃ　＋　ＨＢ　 ｃ　＋ＨＩＶ−Ｉ　ＨＩＶ−２ＨＩＶ−１＋ 表１〜３に掲げた結果は各種抗原接合体が、単独で用いた場合と同様に１組合わ せでも効率的に各抗体を検出できることを明瞭に示している。２つの接合体また は３つの接合体を用いた場合でも、殆ど干渉は認められない、２つまたは３つの 接合体を用いた場合に陰性サンプルでわずかなバックグランドの上昇が見られた のみである。

例２ ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２およびＨＢｃ抗体を含有する一連のサンプルＡ−Ｄを。

元の単一サンプルを表４に示すように希釈して調製した。

Ａ　Ｉ／４０　１／３２　１／２ Ｂ　１／８０　１／６４　１／２ ＣＩ／１６０　１／１２Ｂ　＋／２ Ｄ　Ｉ／３２０　１／２５６　１／２ サンプルＡ−Ｄを以下＜７）接合体：ＨＩＶ−１；ＨＩＶ−２；ＨＢｃ　；ＨＴ Ｖ−１＋ＨＩＶ−２；ＨＩＶ−１＋ＨＢｃ　；ＨＩＶ−２＋ＨＢｃ　；ＨＩＶ− １＋ＨＩＶ−２＋ＨＢｃを用いてそれぞれ試験した。結果は表５に示す。

表５ Ａ　１．３＋４　０．９６１　０．３６１　１．６０２　１．４１５　１．１８ ５　１．６８９Ｂ　０．８４０’　０．６１９　０．３８６　＋、２３２　１． ０７５　０．８４８　１．４８２ＣＯ，５１９０，３６８０，４０＋　０．８０ ４　０．８０３　０．６５０　１．１０２Ｄ　Ｏ，２９８０，２１６０，４０２ ０，４６５０，６＋４　０．５２６　０．８２８−ｖｅ’　０．０６２　０．０ ４９　０．０５２　０．０５９　０．０５９　０．０５４　０．０６８−ｖｅ　 Ｏ，０５５０，０４９０，０５００，０５４０，０５７０，０５２０，０６４− ｖｅ　Ｏ，０５４０，０４７０，０４９０，０５４０，０５７０，０５１０，０ ６２−ｖｅ　Ｏ，０５３０，０４６０，０５００，０５２０，０５７０，０５２ ０，０６３接合体　Ｈ［Ｖ−Ｉ　ＨＩＶ−２ＨＢｃ　Ｈ［Ｖ−Ｉ　ＨＩＶ−１） １１Ｖ−２ＨＩＶ−ＩＨＩＶ−２＋１（Ｂｃ　＋ＨＢｃ　ＨＩＶ−２これらの結 果は、それぞれの抗体が他の抗体の存在下にも選択的に検出できること、すなわ ち非関連抗体の存在は関連抗体の検出に影響しないことを明瞭に示している。さ らに、低希釈度で得られた結果は３つの特異的抗体の存在を定性的に例示し、希 釈度がさらに大きくなると得られた結果は実質的に相加性である。

得られた結果は、２種の病原体に対する抗体を検出する場合でも特異性か損われ ることはなく、またフンビネーションアッセイの感度は著しく高いことを示して いる。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＮ、ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＧＥ、ＨＵ、ＪＰ、 ＫＧ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＬＶ、ＭＤ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、 Ｎｏ。

ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、　ＲＵ、ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＩ、　ＳＫ、ＴＪ、ＴＴ 、ＵＡ、ＵＳ、ＵＺ、ＶＮ（７２）発明者　ベックフォード、ウルスズライギリ ス国ディーエイ１５エルアール ケント、ダートフォード、テンプル　ヒル、セントラル　ロード（番地なし）、 ミュレックス　ダイアグノスティックス　リミテッド　気付

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体試験サンプル中の２種以上の異なる病原体に対する特異的抗体を測定す る方法において， （ｉ）サンプルを，１または２以上のクラスの免疫グロブリンに対する抗体が固 定化された固相と接触させて，サンプル中に存在する１または２以上の各クラス の免疫グロブリンを固相上に捕獲させ，（ｉｉ）サンプルからの免疫グロブリン がその上に捕獲されている固相を，検討する病原体の１つに特異的な抗体に対し てそれぞれが選択的に結合できる２種以上の異なる抗原であって，それぞれが検 出可能なシグナルを直接または間接的に提供する手段を与えられている抗原とと 同時にまたは順次接触させ，ついで，（ｉｉｉ）固相上に形成して得られた免疫 グロブリン−抗原複合体を測定することからなる方法 ２．固定化される抗体は抗−ＩｇＧ，抗−ＩｇＭもしくは抗−ＩｇＡ抗体，また はそれらの２種以上の混合物である「請求項１」に記載の方法３．抗−ＩｇＧお よび抗−ＩｇＭの混合物が固相上に固定化される「請求項１」に記載の方法 ４．固定化される抗体はアフィニティ−精製ポリクローナルまたはモノクローナ ル抗体である「請求項１〜３」のいずれかに記載の方法５．各抗原は検出可能な シグナルを提供できる手段によって直接標識されている「請求項１〜４」のいず れかに記載の方法６．抗原に検出可能なシグナルを提供できる手段は，（ｉ）そ の抗原に結合できて，それ自体が検出可能なシグナルを提供できる手段を与える 抗体Ａｂｌからなるか， （ｉｉ）その抗原に結合できる抗体Ａｂｌ，および抗体Ａｂｌに結合可能でかつ 検出可能なシグナルを提供できる手段を与える第二の抗体Ａｂ２からなる，「請 求項１〜４」のいずれかに記載の方法 ７．検討するサンプルは供血サンプルである「請求項１〜６」のいずれかに記載 の方法 ８．検討する２種以上の病原体はＨＩＶ，Ｂ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス ，ＨＴＬＶ，サイトメガロウイルス，エプスタインバールウイルスおよび梅毒か ら選ばれる「請求項１〜７」のいずれかに記載の方法９．検討する２種以上の病 原体は，風疹，麻疹，ヘルペス（単純および陰部），クラミジア，淋疾，Ａ型肝 炎，水痘，流行性耳下腺炎，ヒトパルボウイルス，結核菌，癩菌，トリ結核菌， 黄色プドウ球菌，単球症リステリア，炭疽菌（抗原／トキシン），放線菌類，チ フス菌，エルシニアエンテロコリフィカ，ヘリコバクターピロリ，キャンピロバ クタージェジュニ，馬鼻疽菌，緑膿菌，レジオネラニューモニアおよび同属菌種 ，野兎病菌，プルセラメリテンシス，肺炎マイコプラズマ，レプトスピラインテ ロガンス，ボレリア属菌種，梅毒トレポネーマ，カンジダアルビカン，ならびに 原虫類病原体によって引き起こされる疾患の病原体から選ばれる「請求項１〜７ 」のいずれかに記載の方法１０．検討する２種以上の病原体は風疹，トキソプラ ズマ症，サイトメガロウイルスおよびヘルペスウイルスから選ばれる「請求項１ 〜８」のいずれかに記載の方法 １１．液体試験サンプル中の２種以上の異なる病原体に対する特異的抗体を同時 にただし別個に測定する方法において，（ｉ）各サンプルを，１または２以上の クラスの免疫グロブリンに対する抗体が固定化された固相からなる各ユニットを 単一のモジュールとした複数個のユニットの１つと接触させて，各サンプル中に 存在する１または２以上の各クラスの免疫グロブリンを固相上に捕獲させ，この 場合固定化された抗体はそのモジュール中の全てのユニットにおいて同一のクラ スまたはクラス群であり，（ｉｉ）サンプルと既に接触させたモジュールの各ユ ニットを，検討する病原体の１つに特異的な抗体に対して選択的に結合できる抗 原であって，それぞれが検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する手段 を与えられている抗原と接触させ，ついで， （ｉｉｉ）固相上に得られた免疫グロブリン−抗原複合体を測定すること，から なる方法 １２．少なくとも１つのユニットは抗−ＩｇＧ抗体が固定化された固相からなり ，少なくとも１つのユニットは抗−ＩｇＭ抗体が固定化された固相からなり，所 望により少なくとも１つのユニットは抗−ＩｇＡ抗体が固定化された固相からな る「請求項１１」に記載の方法 １３．検討するサンプルは単一サンプルのアリコートである「請求項１１または １２」に記載の方法 １４．固相は，ビーズ，マイクロタイタープレートのウエルもしくはカップ，中 空でないもしくは中空のロッドもしくはピペット，または粒子からなり，または ，多孔性，繊維性または吸湿性材料の膜，シート，ストリップ，フィルムまたは コーティングからなり，所望によりアッセイデバイス中に導入されている「請求 項１〜１３」のいずれかに記載の方法１５．異なる病原体の同時のただし別個の アッセイにおいて用いられる２以上のユニットからなるモジュールであって，ユ ニットは免疫グロブリンに対する固定化抗体から構成され，少なくともその１つ のユニットには，他のユニットに固定化された免疫グロブリンとは異なるクラス の免疫グロブリンに対する抗体が固定化されているモジュール １６．１つのユニットは固定化された抗−ＩｇＭを有し１または２以上のユニッ トは固定化された抗−ＩｇＧを有する「請求項１５」に記載のモジュール１７． ３つのユニットからなり，１つのユニットは固定化された抗−ＩｇＧを有し，１ つのユニットは固定化された抗−ＩｇＭを有し，第三のユニットは固定化された 抗−ＩｇＡを有する「請求項１５」に記載のモジュール１８．抗−ＩｇＧおよび 抗−ＩｇＭ抗体の混合物が固定化されているイムノアッセイにおける使用に適当 な固相 １９．抗−ＩｇＡ抗体も固定化されている「請求項１８」に記載の固相２０．ビ ーズ，マイクロタイタープレートのウエルもしくはカップ，中空でないもしくは 中空のロッドもしくはピペット，または粒子からなり，または，多孔性，繊維性 または吸湿性材料の膜，シート，ストリップ，フィルムまたはコーティングから なり，所望によりアッセイデバイス中に導入されている「請求項１８または１９ 」に記載の固相 ２１．液体試験サンプル中の２種以上の異なる病原体に対する特異的抗体を測定 する方法において， （ｉ）サンプルを，１または２以上のクラスの免疫グロブリンに対する抗体が固 定化された固相と接触させて，サンプル中に存在する１または２以上の各クラス の免疫グロブリンを固相上に捕獲させ，（ｉｉ）サンプルからの免疫グロブリン がその上に捕獲されている固相を，検討する病原体の１つに特異的な抗体に対し てそれぞれが選択的に結合できる２種以上の異なる抗原であって，それぞれが検 出可能なシグナルを直接または間接的に提供する手段を与えられている抗原とと 同時にまたは順次接触させ，ついで，（ｉｉｉ）固相上に形成して得られた免疫 グロブリン−抗原複合体を測定することからなる方法 ２２．液体試験サンプル中の２種以上の異なる病原体に対する特異的抗体を同時 にただし別個に測定する方法において，（ｉ）各サンプルを，１または２以上の クラスの免疫グロブリンに対する抗体が固定化された固相からなる各ユニットを 単一のモジュールとした複数個のユニットの１つと接触させて，各サンプル中に 存在する１または２以上の各クラスの免疫グロブリンを固相上に捕獲させ，この 場合固定化された抗体はそのモジュール中の全てのユニットにおいて同一のクラ スまたはクラス群であり，（ｉｉｉ）サンプルと既に接触させたモジュールの各 ユニットを，検討する病原体の１つに特異的な抗体に対して選択的に結合できる 抗原であって，それぞれが検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する手 段を与えられている抗原と接触させ，ついで， （ｉｉｉ）固相上に得られた免疫グロブリン−抗原複合体を測定すること，から なる方法 ２３．検討する抗体は非病原体関連抗体である「請求項２１または２２」に記載 の方法 ２４．検討する抗体は自己免疫抗体もしくはアレルギーに関連する抗体である「 請求項２１または２２」に記載の方法２５．「請求項２〜６，１１および１２」 のいずれかにおいて定義されたパラメーターを有する「請求項２１〜２４」のい ずれかに記載の方法