JPH07508160A - Ｍｎ遺伝子およびｍｎ蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は医学遺伝子学の一般的領域に属し、生化学工学および免疫化学の分野に 属する。より詳細には、本発明は新規な遺伝子であるＭＮ遺伝子（該遺伝子はＭ Ｎ蛋白質をコードする細胞性遺伝子である）の同定に関する。本発明者らは、Ｍ Ｎ蛋白質が腫瘍形成に関与していることを発見した。患者の試料中からＭＮ抗原 、さらに該抗原に特異的な抗体を同定することは、癌の診断／予後の分析の基礎 を提供する。

発明の背景 珍しい特性を有する新規な疑似ウィルス体が、ヒト胸腺癌細胞と共培養したＨｅ Ｌａ細胞［ヒト子宮頚管腺癌由来の細胞系］内において、熱不安定性表面Ｇ蛋白 質を有する水痘性口内炎ウィルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　５ｕｒｆａｃｅ　ｖｉ ｒｕｓ、　ＶＳＶ）変異体を補足する能力により検出された（ザバダ（Ｚａｖａ ｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、、　２４０　：１２４（１９７２ ）　；ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｏｌ、、　２４　：３ ２７（１９７４）；　Ｊ、ザバダ（Ｚａｖａｄａ）、Ａｒｃｈ、　Ｖｉｏｌ、、 　５０　：１（１９７６）；　Ｊ、ザバダ（Ｚａｖａｄａ）　、Ｊ、　Ｇｅｎ、 　Ｖｉ。

１、、６３　：１５−２４（１９８２）；　Ｊ、ザバダ（Ｚａｖａｄａ）　、Ａ ｒｃｈ、　Ｖｉｏｌ、、　１１８　：１８９（１９９１）参照）。該疑似ウィル ス体は、おそらくヒト乳腺腫瘍（ｍａｍｍａｒｙ　ｔｕｍｏｒ　）から得られた ことからＭａＴｕと呼ばれる。

Ｍ　ａ　Ｔ　ｕを研究し、特性を明らかにすることに医学的に大きな興味がひか れた。

Ｍ　ａ　Ｔ　ｕは生細胞への全く新しい型の寄生分子と思われ、また、ヒト腫瘍 細胞由来の可能性があるからである。本明細書には、ＭＮ遺伝子およびＭＮタン パク質を発見するに至った、ＭａＴｕの生物学的および分子学的性質を記述して いる。

本発明者らは、ＭａＴｕが２つのコンポーネント、すなわち、外因性の輸送コン ポーネントＭＸ、および内因性の細胞性コンポーネントＭＮからなることを発見 した。本明細書に記載しているように、ＭＮコンポーネントは細胞性遺伝子とし て発見され、既知のＤＮＡ配列とは相同性（ホモロジー）がほとんどない。ＭＮ 遺伝子は試験した全てのを推動物の染色体ＤＮＡ内に存在することが見出されて おり、該遺伝子の発現は腫瘍形成性に強く関与していることが明らかになってい る。

本明細書に記述しているのは、バクテリアベクター内におけるＭＮ遺伝子のクロ ーニングと配列決定、およびＭＮ遺伝子にコードされた蛋白質の産生についてで ある。このように遺伝子工学的に処理されたＭＮ蛋白質は、他のＭＮＮ蛋白質／ ポリペプチド同様に、本発明に従い、ＭＮ特異的抗体を検出する血清学的分析に 使用することができる。さらに、ＭＮ抗原と反応するそのようなＭＮ蛋白質／ポ リペプチドと抗体は、本発明に従い、ＭＮ抗原を検出および／または定量する免 疫学的検定（イムノアッセイ）に使用することができる。このような分析は、腫 瘍性および／または前腫瘍性の疾患の診断および／または予後に利用される。

発明の概要 本明細書は、Ｍ　ａ　Ｔ　ｕの内因性コンポーネントである細胞性遺伝子、すな わち、ＭＮ遺伝子について開示している。イントロンを有しないと考えられる該 遺伝子の実質的な全ｃＤＮＡ配列は、第１Ａ図−第１Ｂ図［ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 、　：　１コニ示ス。

本発明は、該ＭＮ遺伝子、その断片およびそれに関係するｃＤＮＡに関し、これ らは、たとえば次のように有用である。１）生化学工学によりＭＮ蛋白質／ポリ ペプチドを産生。２）被検材料の細胞内のＭＮ遺伝子の存在を確認するための核 酸プローブの調製。３）適切なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの調 製。これは、たとえば、ＰＣＨに基づ（分析や核酸プローブの産生などに使用す る。４）ＭＮ蛋白質およびポリペプチド、ならびにそれらと相同あるいはほぼ相 同なポリペプチドの同定。５）各種の組織および細胞系に存在するＭＮ遺伝子か ら転写されたさまざまなｍＲＮＡの同定。６）ＭＮ遺伝子の突然変異の同定。

本発明はさらに、ＭＮ遺伝子またはその断片、あるいは関連するｃＤＮＡまたは その断片からなる、精製単離されたＤＮＡに関する。

さらに、本発明は、これまで未知であった蛋白質ＭＮ　（ＭＮ遺伝子によりコー ドされている）の発見に関する。ＭＮ蛋白質の発現は、高密度培養中において成 長細胞により誘導され、そのような発現は腫瘍形成性細胞と関与していることが 見出された。

ＭＮ蛋白質は、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でいくつかのヒト腫瘍細胞系に おいて産生されることがわかっている。たとえば、ＨｅＬａ（子宮頸管癌由来） 、Ｔ０ｎ（膀胱癌由来）およびＴ４７Ｄ　（乳腺癌由来）およびＳＫ−Ｍｅｌ　 １４７７（メラノーマ由来）などの細胞系、腫瘍形成性ハイブリッド細胞など。

また、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でいくつかのヒト癌細胞においても産生され る。たとえば、子宮頚部細胞、卵巣および子宮内膜癌細胞、さらに乳頭腫などの ようないくつかの良性腫瘍細胞など。ＭＮ蛋白質は、非腫瘍形成性ハイブリッド 細胞や正常組織の細胞においては見出されない。このことから、ＭＮ蛋白質は腫 瘍特異的であると考えられる。

ＨｅＬａ細胞系および腫瘍形成性ＨｅＬａ細胞と線維芽細胞とのハイブリッド（ Ｈ／Ｆ／Ｔ）細胞系においては、ＭＮ蛋白質は「双子（ｔｗｔｎ）　Ｊ蛋白質ｐ ５４１５８Ｎとして表現される。該蛋白質は、グリコジル化され、ジスルフィド 結合しているオリゴマーの形をとっている。還元性ゲルを用いた電気泳動によっ て測定すると、ＭＮ蛋白質は約４０Ｋｄから約７０Ｋｄの範囲の分子量を有して おり、好ましくは約４５Ｋｄから約６５Ｋｄの範囲、より好ましくは約４８Ｋｄ から約５８Ｋｄの範囲の分子量を有しているのがよい。非還元性のゲルにおいて は、オリゴマー型のＭＮ蛋白質は約１４５Ｋｄから約１６０Ｋｄの範囲の分子量 を有しており、好ましくは約１５０Ｋｄから約１５５Ｋｄの範囲、より好ましく は約１５２Ｋｄから約１５４Ｋｄの範囲の分子量を有しているのがよい。本発明 における好ましいＭＮ蛋白質の推定アミノ酸配列は第１Ａ図−第１Ｂ図に示す。

ＭＮ遺伝子とＭＮ蛋白質およびそれらにコードされた実質的に相補性のＭＮ遺伝 子とＭＮ蛋白質の発見により、ＭＮ蛋白質の発現が腫瘍形成性と関連しているこ とが見いだされた。この発見の結果、癌および前癌状態の診断／予後の方法が確 立された。を推動物、好ましくはホ乳類、より好ましくはヒトの細胞と組織抽出 物を含んだ患者の試料中からＭＮ抗原を検出および／または定量することにより 、腫瘍性疾患の発症や存在を同定ための方法や材料が提供される。そのようなＭ Ｎ抗原は体液中からも検出される。

ＭＮ蛋白質およびＭＮ遺伝子は、癌の診断／予後における腫瘍形成の分子メカニ ズムの解明の研究に利用されており、また、癌の免疫療法に応用され得る。

本発明は、広範な腫瘍性および／または前腫瘍性疾患の検出に有効である。腫瘍 性疾患の例としては、乳腺、膀胱、卵巣、子宮、子宮頚管、子宮内膜、偏平細胞 および腺偏平癌などの腫瘍９頭および首の癌：神経芽細胞腫および網膜芽腫など の中胚葉性腫瘍：骨肉腫およびユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’　ｓ　ｓａｒｃｏ ｍａ）などの肉腫、およびメラノーマが挙げられる。特に興味深いものとしては 、頭および首の癌、卵巣、子宮頚管、腟、子宮内膜および陰門の癌を含む婦人科 の癌：胃、結腸および食道の癌などの胃腸系の癌：膀胱および腎臓の癌などの尿 路系の癌；皮膚癌、肝臓癌、前立腺癌：肺癌および乳癌がある。中でも特に興味 があるのは、婦人科の癌；乳癌：尿路系の癌、ことに膀胱癌、肺癌；胃、結腸お よび食道の癌などの胃腸系の癌１および肝臓癌である。さらにとりわけ興味が強 いのは、婦人科の癌および乳癌である。婦人科の癌の中で特に関心があるのは子 宮頚管、子宮内膜および卵巣の癌であるが、子宮頚管偏平細胞腫瘍、腺偏平細胞 腫瘍、腺腫などを含む婦人科の癌と同様に、後形体子宮頸管組織やコンンローム などの婦人科の前癌状態も非常に興味深い。

本発明はさらに、ＭＮ遺伝子、その断片あるいは関連するｃＤＮＡを生化学的に 処理することに関する。たとえば、該遺伝子またはその断片、あるいは関連する ｃＤＮＡは適切な発現ベクターに組込まれ、宿主細胞がそのような発現ベクター に形質転換され、ＭＮ蛋白質／ポリペプチド、好ましくはＭＮ蛋白質がその中で 発現する。そのような組換え蛋白質あるいはポリペプチドは、グリコジル化され ているかまたはいないかであるが、好ましくはグリコジル化されているのがよく 、はぼ純粋の状態に精製され得る。本発明はさらに、合成的にあるいはその他の 生化学的手法で調製されたＭＮ蛋白質／ポリペプチドにも関する。

該ＭＮ蛋白質／ポリペプチドは、患者の試料中のＭＮ抗原を検出する分析、ある いはＭＮ特異的抗体を調べる血清学的検定に用いることができる。本発明のＭＮ 蛋白質／ポリペプチドは、血清学的に活性で、免疫原性があり、および／または 抗原性がある。該ＭＮ蛋白質／′ポリペプチドは、さらに、ＭＮ特異的抗体（ポ リクローナルおよび／またはモノクローナル）を産生させたり、Ｔ細胞免疫応答 を起こす免疫原として用いることもできる。

さらに本発明は、ＭＮ特異的抗体に関するものであり、該抗体は診断／予後に用 いられ、また、治療に用いることもできる。ＭＮ特異的抗体は次のような用途に 用いられる。たとえば、免疫蛍光顕微鏡や免疫組織化学染色による実験室での解 析、臨床サンプル中のＭＮ抗原の検出および／または定量のための免疫測定法の 構成分の一つとして、ＭＮ抗原を検出するイムノプロット法のプローブ：細胞内 のＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドの局在を示す金コロイドビーズを用い た免疫電子顕微鏡法：およびＭＮ遺伝子、その断片あるいは関連するｃＤＮＡを クローニングする遺伝子工学など。そのようなＭＮ特異的抗体は、たとえばイン ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での組織片を用いた診断および／または予後用のキ ットの構成材料として用いられる。そのような抗体はまた、たとえば、適切な放 射活性／予後に用いることができる。さらに、そのような抗体は、毒性因子およ び／まリペプチドのアフィニティー精製に使用することができる。

典型的なＭＮ特異的抗体であるモノクローナル抗体Ｍ７５を産生ずるハイブリド ーマは、１９９２年９月１７日にＡＴＣＣ番号ＨＢ　１１１２８としてＡＴＣＣ （＾ｃｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ−ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、米 国、メリーランド州、ロツクヴイル）に寄託された。このＭ７５抗体は、ＭＮ蛋 白質を発見、同定するために用いられたものであるか、ホルマリン固定された組 織サンプルから、ウェスタンプロット、ラジオイムノアッセイおよび免疫組織化 学的方法により、ＭＮ抗原を簡単に検出するために用いることができる。

本発明はさらに、へ１Ｎ蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有 する組換えＤＮＡ、ならびに、ＭＮ蛋白質またはポリペプチドをコードするのみ ならず非ＭＮ蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列をもコードする組換えＤ ＮＡに関する。該アミノ酸配列はヒトに免疫原性を有しないこと、およびヒト体 液中の抗体に一般的な反応性を有しないことが望ましい。そのようなりＮＡ配列 の例としては、β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドコード領域、およびグルタ チオンｓ−トランスフェラーゼをコードする配列とその断片などが挙げられる。

さらに、実質的に純粋であり、天然には存在しないそのような組換え融合タンパ ク質／ポリペプチドも本発明に含まれる。本発明の融合タンパク質の例としては ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮがある。

本発明は、また、腫瘍性疾患および／または前腫瘍性疾患の治療方法に関し、該 方法は、ＭＮ遺伝子から転写されたｍＲＮＡと実質的に相補的であるアンチセン ス核酸配列を投与することにより、ＭＮ遺伝子の発現を抑制することからなる。

アンチセンス核酸配列は、第１Ａ図−第１Ｂ図に示すように、ＭＮ　ｃＤＮＡの ５゛末端において実質上相補的なものであることが好ましい。このアンチセンス 核酸配列とは、オリゴヌクレオチドであることが好ましい。

本発明はまた、実質的に純粋な一つもしくはそれ以上のＭＮ蛋白質および／また はポリペプチドを免疫原量として十分に含むワクチンに関する。ＭＮ蛋白質およ び／またはポリペプチドは生理学的に許容性で非毒性の基剤に分散し、ＭＮ蛋白 質の発現と関係している腫瘍性疾患に対して、を推動物、好ましくはホ乳類、よ り好ましくはヒトに十分な免疫効果を上げる量を使用する。該蛋白質は、組換え 、合成あるいは他の生化学的手法によりつくられる。組換えＭＮ蛋白質としては 、ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮなどのような融合蛋白質が挙げられる。該ワクチンの特 徴的な使用法として、再発および／または転移の阻止がある。たとえば、ＭＮ関 与性腫瘍を外科的に切除した患者に腫瘍の再発を防ぐために該ワクチンを投与す ることができる。

本発明はさらに、ＭＮ遺伝子の核酸配列と実質的に相補的な核酸プローブに関す る。本発明における好ましい核酸プローブとは、その配列が、第１Ａ図−第１Ｂ 図に示すように、ＭＮ　ｃＤＮＡの配列に実質的に相補的なものである。本発明 に従う試験キット（テストキット）は、腫瘍性および／または前腫瘍性疾患の診 ＩＦｒ／予後に有効なプローブから構成されている。好ましい試験キットは、前 記プローブとＭＮ遺伝子またはＭＮ遺伝子のｍＲＮＡ産物とのハイブリダイゼー ションを視覚化などにより検出あるいは測定する手法により構成されている。

本発明に従うイムノアッセイは、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドおよび／またはＭＮ 特異的抗体からなる試験キットとして具体化される。そのような試験キットは、 固相状態であるが、それに限定されるわけではなく、液相状態であってもよく、 非増幅あるいはアビジン／ビオチン法などを用いて増幅した状態で、ＥＬＩＳＡ 法、粒子アッセイ、放射測定あるいは蛍光測定アッセイなどに基づくものである 。

略語表 本明細書内で使用する略語は以下の通りである。

ＡＡ　−アミノ酸 ＡＴＣＣ−アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ 　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）ｂｐ　−塩基対 ＢＳＡ　−ウシ血清アルブミン Ｃｉ　−キュリー ａｍ　−センチメーター ｃｐｍ　−カウント７分 Ｃ−末端　−カルボキシル末端 ℃　−摂氏 ＤＭＥＭ　−ダルベツコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｌｌ１ｏｄｉｆ ｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ）ＥＤＴＡ　−エチレンジアミン四酢酸 ＥＩＡ　−酵素免疫測定法、エンザイムイムノアッセイＥＬ　Ｉ　ＳＡ　−酵素 免疫吸着測定法Ｆ　−線維芽細胞 Ｆｅ２　−ウシ胎児血清 ＦＩＢＲ−線維芽細胞 ＦＩＴＣ−フルオレセインイソチオシアネートＨ−ＨｅＬａ細胞 ＨＥＦ　−ヒト胚線維芽細胞 ＨｅＬａ　Ｋ　−標準型ＨｅＬａ細胞 ＨｅＬａ　Ｓ　−スタンプリッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ）変異ＨｅＬａ細胞　 Ｄ９８／ＡＨ，２ Ｈ／Ｆ−Ｔ　−ハイブリッドＨｅＬａ線維芽細胞（腫瘍原性）、ＨｅＬａ細胞Ｄ ９８／ＡＨ，２由来 Ｈ／Ｆ−Ｎ　−ハイブリッドＨｅＬａ線維芽細胞（非腫瘍原性）　、ＨｅＬａ細 胞Ｄ９８／ＡＨ，２由来 ＨＧＰＲＴ−−ヒポキサンチングアニンフォスフ矛リボシルトランスフェラーゼ 欠損 ＨＲＰ　−西洋ワサビ（ホースラディツシュ）ペルオキシダーゼＩ　ＰＴＧ　− イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトーピラノサイドｋｂ　−キロベース ｋｄ　−キロダルトン Ｍ　−モル ｍＡ　−ミリアンペア ＭＡｂ　−モノクローナル抗体 ＭＥ　−メルカプトエタノール ＭＥＭ　−最少必須培地 ｍｇ　−ミリグラム ｍｌ　−ミリリットル ｍＭ　−ミリモル ＭＴＶ　−乳腺腫瘍ウィルス Ｎ　−規定濃度 ｎｇ　−ナノグラム Ｎ−末端　−アミノ末端 ＯＤＮ　−オリゴデオキシヌクレオチドＰＡＧＥ　−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動ＰＢＳ　−リン酸緩衝生理食塩水 ＰＥ５Ｔ　−プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）　、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ 　ａｃｉｄ）　、生理食塩水（ｓｅｒｉｎｅ）　、スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉ ｎｅ）の頭文字の組合せｐＩ　−等電点 ＲＩＰ　−放射性免疫沈降法 ＲＩＰＡ　−放射性免疫沈降測定法 ＳＡＣ−プロティンＡ（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ ｒｅｕｓ）由来）ＳＤＳ　−ドデシル硫酸ナトリウム ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動 ５ＳＰＥ　−ＮａＣ１（０，１８Ｍ）　、リン酸ナトリウム（０，０１Ｍ）　、 ＥＤＴＡ（０，ＯＯＩＭ） ＴＣＡ　−トリクロロ酢酸 ＴＣ培地　−組織培養培地 μＣｉ　−マイクロキュリー μｇ　−マイクログラム μｌ　−マイクロリットル μＭ　−マイクロモル ＶＳＶ　−水痘性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　５ｕｒｆａｃｅ　ｖｉ ｒｕｓ）Ｘ−ＭＬＶ　−異種マウス白血病ウィルス細胞系（セルライン） 本明細書に記述している実験例において使用した細胞系を以下に示す。

ＨｅＬａ　Ｋ　−標準型ＨｅＬａ細胞、異数倍数性、上皮様の細胞系、ヒト子宮 頚管腺腫より単離され（ゲイ（Ｇｅｙ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　１２： 　２６４（１９５２）、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎ ｅｃｏｌ、、　３８：　９４５−９４９（１９７１）参照）、Ｂ、コリシュ教授 （Ｋｏｒｙｃｈ）　（チャールス大学（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ）医学微生物学および免疫学研究所（Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　１ｌｅｄｉ ｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌｏｇｙ）　、チ ェコスロバキア、グラム）より入手。

ＨｅＬａ　Ｄ９８／ＡＨ，２（またはＨｅＬａ　Ｓ）　−変異ＨｅＬａクローン であり、ヒポキサンチングアニンフォスフ矛リボシルトランスフェラーゼ欠損（ ＨＧＰＲＴ−）　、エリツク　Ｊ、スタンプリッジ（Ｅｒｉｃ　Ｊ、　Ｓｔａｎ ｂｒｉｄｇｅ）　（カリフォルニア大学医学部微生物学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ ｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎ ｅ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　、米国、カリフ ォルニア州、アーヴアン）より供与され、スタンプリッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇ ｅ）らにより報告されている（と１ｅｎｃｅ、　２１５：　２５２−２５９　（ １９８２年１月１５日号））。ハイブリッド細胞Ｈ／Ｆ−Ｈの親株も同じ＜Ｅ、 Ｊ、　スタンプリッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｃ）から人手。

ＮＩＨ−３Ｔ３　−７ウス線維芽細胞系、アーロンソン（Ａａｒｏｎｓｏｎ）に より報告されティる（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２３７：　１７８（１９８７））。

Ｔ４７Ｄ　−ヒト乳腺癌由来の細胞系（ケイダー（Ｋｅｙｄａｒ）ら、Ｅｕｒ、 　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ。

１５：　６５９−６７０（１９７９））　。Ｊ、ケイダー（Ｋｅｙｄａｔ）　（ ハダツサー医科大学（Ｈａｄｄａｓａｈ　１ｌｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ）　 、イスラエル、エルサレム）より供与。

Ｔ２４　−膀胱癌由来の細胞系（ブベニク（Ｂｕｂｅｎｉｋ）ら、Ｉｎｔ、　Ｊ 、　Ｃａｎｃｅｒ、　１１ニア６５−７７３（１９７３））　、　Ｊ、ブベニク （Ｂｕｂｅｎｉｋ）　（チェコスロバキア科学アカデミー分子遺伝学研究所（Ｉ ｎｓｕｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｃｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｚｅ ｃｈｏｓｌｏｖａｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　、チェコス ロバキア、プラノ＼）より供与。

ＨＭＢ　２　−メラノーマ由来の細胞系（スヴエク（Ｓｖｅｃ）　ラ、独匹弁μ μ−廷６６５−６８＋　（１９８８））。

ＨＥＦ−ヒト胚線維芽細胞（ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ 　Ｂｉｏｌｏ　、　２４０：ＳＩＲＣ−ウサギ角膜由来の細胞系（対照およびＸ −ＭＬＶ感染）（ザバダ（Ｚａｖａｄａ）　ら、科：±」ム」烙：　２２１−２ ３１（１９７７））ベロ細胞（Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌｓ）　−アフリカミドリザル 由来の細胞系（ザパダ（Ｚａｖａｄａ）ら、１９７７年） ミエローマ細胞系Ｎ５−０　−モノクローナル抗体の産生において融合親細胞と して用いられるミエローマ細胞系（ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）とミルシュティン （Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、７３：　３− ４６（１９８１）　）ＳＫ−Ｍｅｌ　１４７７　−ヒトメラノーマ細胞系。Ｋ、 Ｅ、ヘルストロン（ｌｉｅｌｌｓｔｒｏｍ）　（フレッド・ハトキンス癌研究セ ンター腫瘍免疫部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ、　Ｆｒｅｄ　Ｈｕｔｃｂｉｎｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅ ｎｔｅｒ）　、、米国、ワシンg ン州、シアトル）より供与。

ＸＣ−ラット横絞筋肉腫由来の細胞であり、ラウス肉腫（Ｒｏｕｓ　５ａｒｃｏ ａ＋ａ）ウィルスによって誘導された誘導ラット肉腫（スヴオボダ（Ｓｖｏｂｏ ｄａ）　、Ｊ、　、国立癌センター研究所モノグラフ第１７巻（Ｎａｔｌ、　Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｍｏｎｏ　ｒａｐｈ　Ｎｏ、 　１７）より［鳥類腫瘍ウィルスに関する国際学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ａｖｉａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ） 　Ｊ　（Ｊ　、　Ｗ、ベアード（Ｂｅａｒｄ）編）　、ｐｐ、２７７−２９８（ １９６４年）。ジャン　スヴオボダ（Ｓｖｏｂｏｄａ）　（チェコスロノくキア 科学アカデミー分子遺伝学研究所（Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｚｅｃｈｏｇｌｏｖａｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏ ｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　、チェコスロノくキア、プラ／％）より供与。

Ｒａｔ　２−Ｔｋ−−チミジンキナーゼ欠損細胞系。Ｌ、クチノヴ７　（Ｋｕｔ ｉｎｏｖａ）　（血清およびワクチン研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　５ｅ ｒａ　ａｎｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）　、チェコスロバキア、プラム）より供与。

ＣＧＬＬ　−Ｈ／Ｆ−Ｎハイブリッド細胞（ＨｅＬａ　Ｄ９Ｂ／ＡＨ，２起源） ＣＣｌ２　−）（／Ｆ−Ｔ／１イブリッド細胞（ＨｅＬａ　Ｄ９８／ＡＨ，２起 源）ＣＣｌ２　−Ｈ／Ｆ−Ｔ／％イブリ・ノド細胞（ＨｅＬａ　Ｄ９８／ＡＨ， ２起源）ＣＣｌ２　−Ｈ／Ｆ−Ｔ／１イブリッド細胞（ＨｅＬａ　Ｄ９８／ＡＨ ，２起源）ヌクレオチドおよびアミノ酸配列記号 本明細書では、以下の記号をヌクレオチドを表す記号として使用する。

主要アミノ酸は２０個あり、それらのおのおのは３個の隣接するヌクレオチド（ 三つ組（トリプレット）コードまたはコドン）の異なる組合せによって特定され ており、さらに、特徴的な蛋白質を形成するため１こ特定の順番で結合される。

本明細書においては、該アミノ酸を表記するためｔこ、たとえ↓ｆ第１Ａ図−第 １Ｂ図に示すような３文字記号を使用する。それらを以下１こ示す。

アスパラギン　＾ｓｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ グルタミン酸　Ｇｌｕ 図面の簡単な説明 第１Ａ図−第１Ｂ図は、本明細書に記載しているようにＭＮ　ｃＤＮＡクローン から単離されたヌクレオチド配列およびｃＤＮＡによってコードされている推定 アミノ酸配列［それぞれＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：１および２］を表している。

シーフェンスデータはＥ〜ｊＢＬデータライブラリー（ＥＭＢＬ　Ｄａｔａ　Ｌ ｉｂｒａｒｙ）　（ドイツ、ハイデルベルグ）に送付済みであり、受入番号Ｘ　 ６６８３９として利用可能である。

第２Ａ図−第２Ｂ図は、ヒト線維芽細胞（Ｆ）　、ＨｅＬａ細胞（Ｈ）およびＨ ／Ｆ−へとＨ／　Ｆ　−Ｔハイブリッド細胞内におけるＭＮ特異的蛋白質および ＭＸ特異的蛋白質の発現をグラフに表したものであり、ＭＸ感染細胞およびＭＸ 非感染細胞における発現を対比させている。実施例５に操作と結果について詳し く記載している。

第３Ａ図−第３Ｂ図は、１２″’１−ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ蛋白質およびイロイ ロな抗体を用いた放射免疫沈降実験の結果をグラフ（こ表したものである（実施 例８に記述）。放射活性蛋白質（１５Ｘ　１０’ｃｐｍ／チューブ）（よ、次の 腹水ある０（ヨ血清およびＳＡＣと沈降した。（Ａ）ＭＡｂ　Ｍ２Ｓを含む腹水 ；　（Ｂ）ウサギ抗ＭａＴｕ血清：　（Ｃ）正常ウサギ血清；（Ｄ）ヒト血清Ｌ ８；（Ｅ）ヒト血清ＫＨ；（Ｆ）ヒト血清Ｍ７゜ 第４図は、ＭＮ抗原に対するラジオイムノア・ソセイの結果を示す（実施例８１ こ記述）。腹水（沈降が５０％の放射活性となるよう１こ希釈）（よ、次のもの と２時間反応させた。（Ａ）「コールド（ｃｏｌｄ）　Ｊ　（ラベルして０な０ ）蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ；あるいは以下の細胞の抽出物（Ｂ）ＨｅＬａ細 胞Ｘ；　（Ｃ）Ｒａｔ−２ＴＫ−；　（Ｄ）ＨｅＬａ　；　（Ｅ）う・ｙトＸＣ ；　（Ｆ）Ｔ２４および（Ｇ）ＨＥ　Ｆ、次に、（２５ＩでラベルしたｐＧＥＸ −３Ｘ−ＭＮｆｆｉ白質（２５ｘ　１０’ｃｐｍ／チューブ）を加え、さらに２ 時間インキュベートした。最後ｌこ、放射活性ＭＡｂｔｖｉ　７５をＳＡＣに吸 着させ、測定した。

本明細書に記述するように、ＭａＴｕは２コンポーネントシステムカ）らなって いる。叶プレックスの一つの部分である外因性ＭＨ！、透過性であり、蛋白質ｐ ５８Ｘを発現する。該蛋白質は、ヒトおよびさまざまな動物の天然の血清と反応 する細胞質抗原である。もう一つのコンポーネントであるＭＮ＋！、ヒト細胞ｌ こ内因するものである。

ＭＮは細胞性遺伝子であり、既知のＤＮＡ配列と（ヨ１ヨとんど相同性力（な０ ゜ＭＮは保存性であり、多くのを椎動物の染色体ＤＮＡ内で単一のコピー遺伝子 として存在している。本明細書には、ＭＮ　ｃＤＮＡのクローニングおよび配夕 １ｊ決定、また融合蛋白質（ＭＮ＋グルタチオン５−１−ランスフェラーゼのＣ 末端力１らなる：アフイニテイークロマトグラフイーにより容易（二精製できる ）の遺伝子工学的処理について記述している。

ＭＮはＨｅＬａ細胞において双子蛋白’Ｊｉｐ５４１５８Ｎとして表現され、細 胞表面および核内に局在している。ｐ５４１５８ＮＩこ反応するモノクローナル 抗体（ＭＡｂ　Ｍ２Ｓ）を用いたイムノプロ・ソ日こお０て５４ｋｄと５８ｋｄ の２本のノくンドが確認できる。これらの２本のバンドは、一種類の蛋白質に関 して、グリコジル化のパターンあるいはプロセッシングの過程が異なることによ るものかもしれない。（ｐ５４Ｎおよびｐ５８Ｎは、両方ともマンノースを含む オリゴ糖残基によりグリコジル化されているが、ｐ５８Ｎだけはグルコサミンも 含有している。）本明細書で使用する「双子蛋白質（ｔｗｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ ）　Ｊとはｐ５４１５８Ｎを指している。

ＭＮは、ＨｅＬａ細胞の急速成長する希薄培養中では出現しないが、細胞を高密 度培養中で維持することにより、あるいは、さらに効率的な手段として、細胞に ＭＸを感染させることにより誘導される。Ｉ）５４１５８ＮのみがＭａＴｕに感 染したＨｅＬａ細胞内で再生された水痘性口内炎ウィルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ 　５ｕｒｆａｃｅｖｉｒｕｓ、　ＶＳＶ）のピリオンに結合する。双子蛋白質ｐ ５４１５８Ｎはグリコジル化され、ジスルフィド結合で連結されたオリゴマーの 形をとっているのに対し、ｐ５８Ｎはグリコジル化されておらず、ジスルフィド 結合で連結されたオリゴマー形ではない。

ｖＳｖは、ＨｅＬａ細胞内でｐ５４１５８Ｎをピリオン中に集めるが、このこと は、該双子蛋白質がｖＳＶのＧ蛋白質変異型の相補性と、ＶＳＶ　（ＭａＴｕ） のプソイド型の形成に関与していることを示唆している。エンベロープを有する ウィルスのみが、感染性で機能的なプソイド型を形成するための表面糖蛋白質を 産生じ、ピリオンの細胞への吸着および侵入という特殊な機能を発揮することが できる（ザバダ（Ｚａｖａｄａ）　、Ｊ、　、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、 、６３：　１５−２４（１９８２））　ｏこのことはＭＮ遺伝子が疑似ウィルス の配列として行動することを示している。

エンベロープを有するウィルスの表面蛋白質は、ｖＳｖのプソイド型の形成に関 与しており、ＭＮ双子蛋白質１）５４１５８Ｎと同様に、グリコジル化されてい る。また、ＭＮ蛋白質は、オリゴマー（好ましくは三量体または四量体）の形成 においてはウィルスの糖蛋白質と類似している。そのようなオリゴマー形成にお いては、Ｓ−８結合（ジスルフィド結合）の関与は必須ではないが、ピリオンの 集積には必須である（フレイス（Ｋｒｅｉｓ）とロディッシュ（Ｌｏｄｉｓｈ） 　、　Ｃｅ１１．４６：９２９−９３７（１９８６））。ジスルフィド結合は２ −メルカプトエタノールを用いて還元することにより分裂する。

バストレコヴア（Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ）らにより報告されているように（ｎ 三出■弘」８７１６２０−６２６（１９９２））　、メルカプトエタノールを用 いて還元した後は、細胞抽出物あるいはｖＳｖ由来のｐ５４１５８Ｎはイムノプ ロットにおいて非常に類似している。還元を行わない場合、細胞抽出物のり　５ ４１５８　Ｎは１５０ｋｄ付近に複数のバンドとして現れ、このことは細胞が数 種の異なるオリゴマー（おそら＜ｐ５４　：　ｐｓｓの比率が異なる）を含んで いることを示唆している。しかし、ＶＳＶにおいては選択的にその中の一つ、分 子量約１５３ｋｄに集まっている。該オリゴマーは三量体もしくは四量体であり 、５４ｋｄおよび５８ｋｄの蛋白質からなっている。還元状態での■Ｓｖサンプ ルの分析において５４ｋｄと５８ｋｄのバンドの強さがほぼ同等であることから 、ｖＳｖピリオンにおいてはｐ５４　：　ｐ５８が等モル比であることが示され た。

ＭＮ蛋白質の発現は、腫瘍性疾患の診断／予後にみられる。ＭＮ双子蛋白質ｐ５ ４１５８　Ｎは、ＨｅＬａ細胞およびスタンプリッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ） の腫瘍形成性（Ｈ／Ｆ−Ｔ）ハイブリッド細胞において発現が確認されているが （スタンプリッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ）ら、Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇ ｅｎｅｔ、　７：　６９９−７１２（１９８１）およびスタンプリッジ（Ｓｔａ ｎｂｒｉｄｇｅ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１５：２５２−２５９（１９ｇ２） 　）　、線維芽細胞あるいは非腫瘍形成性（Ｈ／Ｆ−Ｎ）ハイブリッド細胞にお いては確認されていない（スタンプリッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ）ら、同上） 。ヒト卵巣、子宮内膜および子宮頸管癌、またいくつかの良性腫瘍（乳頭腫など ）を用いて行ったイムノプロットにおいてはＭＮ蛋白質が確認されるが、正常な 卵巣、子宮内膜、子宮あるいは胎盤の組織からは確認されない。ＭＸに感染した ＨｅＬａ細胞内では、微細構造の交替が顕著に行われており、このことは、細胞 表面でのおびただしい糸状体の形成およびミトコンドリアの増幅を意味している 。免疫金（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ）標識法を用いると、ｐ５４１５８Ｎは糸状体 の表面および核、特に核小体上で観察される。

すなわち、ＭＮ蛋白質は正常非腫瘍細胞では産生されていないことから、腫瘍特 異的であるといえる。

本明細書の実施例において、ＭＮおよびＭＸは二つの異なる存在であり、互いに 独立して存在することが示されている。外因性の透過性物質であるＭＸは、線維 芽細胞あるいは非腫瘍形成性（Ｈ／Ｆ−Ｎ）ハイブリッド細胞において増殖する が、これらの細胞はＭＮ関連蛋白質は発現しない（第２Ａ図−第２Ｂ図）。その ような細胞内ではＭＸはＭＮ蛋白質の産生を誘導しないのである。第２Ａ図−第 ２Ｂ図および実施例５と６に示されるように、ＭＸの非存在下でもＭＮ蛋白質は ＨｅＬａ細胞および他の腫瘍細胞内で産生５れる。しかしながら、ＭＸはＨｅＬ ａ細胞内におけるＭＮ蛋白質の強力な誘導剤である。非感染細胞内において、Ｍ ＸはＭＮ蛋白質の産生を濃度にして３０倍増加させた（下記の実施例５と８、実 施例８の表１参照）。

ＭＮ遺伝子−一クローニングおよび塩基配列決定第１Ａ図−第１Ｂ図は、本項に 記載されている方法に従って単離されたＭＮｃＤＮＡクローンの塩基配列を示し ている。遺伝子コドンの縮重から、一つのコドンが一つ以上のアミノ酸をコード しており（たとえば、ＴＴＡｌＴＴＧＳＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧは いずれもロイシン（ｌｅｕ）というアミノ酸をコードしている）、また、たとえ ば第１Ａ図−第１Ｂ図に示すように、一つのコドンが他のコドンと入れ替わるヌ クレオチド配列の多様性により、本発明と実質的に同等な蛋白質およびポリペプ チドが産生される。ＭＮ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および相補的な核酸配列 に関するそのような変形もすべて本発明の範ちゅうに含まれる。

さらに、本明細書に記述し、第１Ａ図−第１Ｂ図に示しているヌクレオチド配列 は、単離され、本明細書で説明しているｃＤＮＡヌクレオチド配列のうち、はっ きりした構造のみを表したものである。わずかに変更されたヌクレオチド配列が 見つかることもあろうし、また、たとえば、同様のエピトープを有する等の、実 質的に同等なＭＮ蛋白質およびポリペプチドをコードするように当該分野で知ら れた技術により変形することも可能である。そしてそのような蛋白質／ポリペプ チドは本発明の目的に適合する。ＭＮ蛋白ｌＩｔ／ポリペプチドと相同あるいは ほぼ相同な蛋白質／ポリペプチドをコードする合成核酸配列のように、同等なコ ドンを有するＤＮＡおよびＲＮＡは本発明の範ちゅうに含まれる。遺伝子コード の縮重がなければ、これらの核酸配列はやはり前記ｃＤＮＡヌクレオチド配列に ハイブリダイズする。本明細書で説明しているように、核酸配列が修飾されたり 変形される結果、ＭＮ配列およびその断片と実質的に同等の配列が作り出される 。

ＭＮ遺伝子を見つけるために、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞からλｇｔｌｌによるＣＤ ＮＡライブラリーを調製した。ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡはグアニジ ンチオシアネートＣｓＣ１法を用いて抽出し、ｍＲＮＡはオリゴｄＴセルロース を用いるアフィニティーにより分離した。ｃＤＮＡの合成およびｇｔｌｌへのそ のクローニングはアマジャム（＾ｍａｒｓｈａｍ）社のキ・ソトを用いて行った が、ｇｃｏＲｌ−ＮｏｔＩアダプターだけはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）社（米国、カリフォルトニア州、う・ホーラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）　）の ものを使用した。モノクローナル抗体Ｍ７５とアルカリフォスファターゼを縮合 したヤギ抗マウス抗体とを組み合わせたイムノスクリーニングにライブラリーを かけた。このイムノスクリーニング法１よ、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）とデイヴイス （Ｄａｖｉｓ）により報告されて（する（ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、　８０：１１９ ４−１１９８（１９８３））。３５０．０００のプラーク（全ライブラリーのお およそ半分にあたる）をスクリーニングし、１個のポジティブクローンを取り出 した。

ポジティブクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ　（ストラタジーン（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）社）の！■部位に組み込んでサブクローニングを行い、ｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＭＮを作った。Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ”’Ｆ−ット（ プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、米国、ウィスコンシン州、マデイソン）を使用 して、方向が反対で重なる２個の欠失を作り、Ｔ７シークエンス用キット（ファ ルマシア（Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｉａ）社、米国、ニューシャーシー州、ピスカタ ウエイ）を用いてジデオキシ法により配列を決定した。配列はｃＤＮＡクローン の一部を表しており、インサートの長さは１３９７ｂｐであった。本配列を第１ Ａ図−第１Ｂ図に示す（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１）。配列は、大きな１２９０ ｂｐのオープンリーディングフレームおよびポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を 含む１０７ｂｐの３°非翻訳領域からなっている。該配列のもう一つの特徴は、 ｍＲＮＡの不安定性に関与する領域（１３８９番目のＡＵＵＵＡ）が存在するこ とである。この領域は、ある種の腫瘍遺伝子およびＩルホカインのｍＲＮＡに特 異的なものである（ショウ（Ｓｈａｍ）とカーメン（Ｋａｍｅｎ）　、　Ｃｅ１ １．４６：　６５９−６６７（１９８６））　、　ＭＮクローンの大きさと対応 するｍＲＮＡのそれとをノーザンプロットにより比較すると（実施例１２）、こ のｃＤＮＡは、その配列の５゛末端から約１００ｂｐが欠損して（すること力（ わかった。

ＭＮ　ｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレームは、約４８ｋｄの推定 蛋白質をコードしている（第１Ａ図−第１Ｂ図、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２）。

推定翻訳アミノ酸（Ａ　Ａ）配列の分析では、既報の蛋白質の配列とは高い相同 性を示さなかった。

最も近い相同性が見られたのは、ＭＮ蛋白質およびいろいろな型の炭酸脱水素酵 素のＣ末端である（１７０−２００Ａ　Ａの重なりにおいて約３０−３５％）。

炭酸脱水素酵素の活性部位は、Ｚｎ２＋結合ドメインと同様に、ＭＮ蛋白質にお いてもよく保存されている。しかしながら、ＭＮ遺伝子は、ヒトゲノム由来の新 規な配列であることは明かである。

上述したように、ＭＮ遺伝子は既知の炭酸脱水素酵素といくらかの相同性を有す るが、いくつかの面でそれらとは異なっている。７個の炭酸脱水素酵素が報告さ れている（ドッジソン（Ｄｏｄｇｓｏｎ）ら（編）、炭酸脱水素酵素（Ｔｈｅ　 Ｃａｒｂｏｎｉｃ＾ｎｈｙｄｒａｓｅｓ）、（プレナムプレス（Ｐｌｅｎｕｍ　 Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨーク／ロンドン（１９９１年））。それらのおのおの は７個のイントロンを含んでいるが、ＭＮ遺伝子はイントロンを含まないようで ある。また、既知の炭酸脱水素酵素はすべておよそ３０ｋｄの蛋白質であり、こ れらはＭＮ遺伝子のｐ５４１５８Ｎ関連の産生物より小さい。さらに、炭酸脱水 素酵素はＭＮ関連蛋白質のようなオリゴマーを形成しない。

推定アミノ酸配列から、ＭＮ遺伝子の産生物は、３０３−３１３のアミノ酸位置 に一つの活性なＮ−グリコジル化部位を有する塩基性蛋白質（ｐ１９．０８）で あることが明かである。これらの事実は、ＨｅＬａ細胞由来のｐ５４１５８Ｎ蛋 白質が、Ｅｎｄｏ　ＨおよびＥｎｄｏ　Ｆによる分裂（おのおの約３ｋｄの欠損 を起こす）に感受性であることに対応している。親水性プロフィルは、アミノ酸 の親水性配列（３７１−３９５位）を示しており、これはプラズマ膜にかかる領 域を表していると考えられ、また、分裂シグナルも含むと考えられる。該プロフ ィルは、ｐ５４１５８Ｎ蛋白質が細胞膜に局在していることとよく一致する。Ｍ Ｎアミノ酸配列にはＰＥ５Ｔ領域は存在しないことから、ＭＮ遺伝子の産生物は 安定で永続性の蛋白質であることが示唆される（ロンヤース（Ｒｏｇｅｒｓ）ら 、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３４：　３６４−３６８（１９８６））。そのような特 性から、発明者らのｐ５４１５８Ｎの代謝ラベルが非効率的であったことを説明 できる。推定アミノ酸配列はさらにほかの特徴をも示す。すなわち、１０個の活 性リン酸化部位と７個のミリスチル化部位および３個の抗原決定因子を有する。

１）　５４　／　５８　Ｎ蛋白質の両方が一つの遺伝子によってコードされてい るか否かを確認するために、ＭＮ遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンス ０ＤＮｓを用いた。（このようなアンチセンス０ＤＮｓの使用法については、ス ティン（Ｓｔｅｉｎ）と：ｌ−エン（Ｃｏｈｅｎ）により総説されている（Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４８：　２６５９−２６６８（１９ｇｇ））。）これら の実験については実施例１１に詳述している。実験の結果、０ＤＮｓと共に培養 したＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞においてはｐ　５４１５８Ｎの合成がかなり阻害されて いることがわかり、一方、いろいろなＨｅＬａ細胞の蛋白質の産生量はほぼ同捏 度に保たれていた。さらに、イムノプロットにおいて重要な結果が得られた。す なわち、０ＤＮｓによる特異的阻害はＩ）５４１５８Ｎ蛋白質のの両方に影響を 与えていた（実施例１１）。これらのことから、ＭＮ遺伝子はＨｅＬａ細胞にお いて２５４１５８Ｎ蛋白質の両方をコードしていると結論づけられる。

クローニングされた遺伝子がｐ５４１５８Ｎ特異的蛋白賀をコードしているか否 かを確認するために、該遺伝子をバクテリア発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ　（フ ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社、スウェーデン、ウプサラ）にサブクロー ニングし、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＣ末端を有する融合蛋白質を 発現するように構築した。このサブクローニングは、本発明におけるＭＮ関連蛋 白質の遺伝子工学的手法の一つを示すものである。以下の記述は例示であり、如 何なる意味においても本発明を限定するものではない。

融合蛋白質　ＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮの産生上述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１１Ｎ 由来のｃＤＮＡ挿入体（インサート）は、プラスミドＤＮＡを煕で消化（切断（ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ）　）することにより切出した。該ｃ　ＤＮＡ挿入体は、平 滑末端を得るために８１ヌクレアーゼで処理し、ｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）の脱リン酸化したＳｍａＩ部位にクローニングした 。ＸＬＩ−Ｂｌｕｅの形質転換およびＩＰＧＴによる誘導の結果、融合蛋白質が 得られた。

融合蛋白質であるＭＮグルタチオンＳ−トランスフェラーゼは、グルタチオンＳ −セファロース４Ｂ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）を用いたアフィ ニティークロマトグラフィーにより精製した。１０％ゲルを用いた５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分離された２つの同様なサンプルから、２０ミリグラムの精製された 組換え蛋白質が得られた。一つのサンプル（Ａ）はクマンーブリリアントブルー で染色し、他方のサンプル（Ｂ）はハイボンドＣメンブレン（Ｉｌｙｂｏｎｄ　 Ｃｍｅｍｂｒａｎｅ）　（アマノヤム（Ａｍａｒｓｈａｍ）社、英国、パックス 、アリスバリー）にプロットした。このプロットは、１２５■でラベルしたＭＡ ｂ　Ｍ２Ｓを用いてオートラジオグラフィーにより展開した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析から興味深い結果が得られた。すなわち、異なる分子量を 有する一連の蛋白質のバンドが存在することである。本発明に従って産生された 別の融合蛋白質である、β−ガラクトシダーゼＭＮ（λ　ｇｔｌｌ溶原）におい ても同様なり５Ｄ−ＰＡＧＥパターンが得られた。ＭＮ配列内に９個のＡＧＧＡ ＧＧコドンタンデムが存在することによる翻訳エラーのために、これらのパター ンが現れたものと思われる。対応するｔＲＮＡが短いため、バクテリア遺伝子内 てこねらのコドンを使用することは絶対に避けられている。かくして、外来性ｍ ＲＮＡからのＡＧＧＡＧＧタンデムの翻訳の際に、＋１のリポソーム上でのフイ ムノブロソティングにおいて、同様なパターンが得られた。すなわち、染色され た５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で確認された全てのバンドは、ＭＮ特異的ＭＡｂＭ７ ５に反応し、このことは、全ての蛋白質のバンドがＭＮ特異的であることを示し ている。また、これらの結果から、ＭＡｂ　Ｍ２Ｓへの結合部位は、フレームノ ットの影響を受けないＭＮ蛋白質のＮ末端部分にあることが示された。

下記の実施例８に示すように、融合蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮは、ＭＮ特異的 抗体およびＭＮＮ原反ラジオイムノアッセイに使用した。

＼１Ｎ蛋白質および／′またｊオポリベプチト本明細書で用いている７ＭＮ蛋白 質および／またはポリペプチドｊ　（ＭＮ蛋白質／′ポリペプチド）とは、ＭＮ 遺伝子あるいはその断片によりコードされている蛋白質および／またはポリペプ チドを意味している。好ましいＭＮ蛋白質の例は、推定アミノ酸配列か第１Ａ図 −第１Ｂ図に示されているものである（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

２）。好ましいＭＮ蛋白質／′ポリペプチドは、第１Ａ図−第１Ｂ図に示すＭＮ 蛋白質と実質的に相同性を有する蛋白質／′ポリペプチドである。

「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によるアミノ酸の共有結合鎖のことであり 、本明細書では、５０あるいはそれ以下のアミノ酸から構成されるものと考えて いる。本明細書における「蛋白質」とは、５０より多くのアミノ酸から構成され るポリペプチドと定義される。

インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の腫瘍細胞から産生される蛋白質／ポリペプチドの 配列が細胞培養内の腫瘍細胞から産生される蛋白質／ポリペプチドのものと異な ることがある。すなわち、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドが、アミノ酸置換、伸張、 欠損、削除およびそれらの組合せ（これらに限定されるわけではないカリのよう なアミノ酸配列変化を有していても、それらはすべて本発明の範ちゅうに属する 。体液中に残存する蛋白質は蛋白質分解などの分解処理を受けることがある。す なわち、血清などの体液中にはかなりの削除が行われたＭＮ蛋白質およびＭＮポ リペプチドが見いだされる。本明細書で使用しているｒＭＮ抗原」とは、ＭＮ蛋 白質／ポリペプチドを包含している。

さらに、ＭＮ蛋白質およびポリペプチドのアミノ酸配列は、遺伝子工学によって 変化させることもできる。１個またはそれ以上のアミノ酸を削除したり置換する ことができる。そのようなアミノ酸の変化も、生物学的活性に有意の変化をもた らさず、本発明の範囲に含まれる蛋白質やポリペプチドを生じさせることができ る。

本発明のＭＮ蛋白質およびポリペプチドは、本発明の方法にしたがって、さまざ まな手段で調製できる。たとえば、組換え、合成、あるいはその他の生物学的手 法、すなわち、長い蛋白質およびポリペプチドを酵素および／または化学的に解 裂する等の方法が挙げられる。ＭＮ蛋白質を調製する好ましい方法は組換え法で ある。組換えによるＭＮ蛋白質の産生のために特に好ましい方法は、融合蛋白質 ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮに関して上述した方法である。

＼１Ｎ蛋白質およびポリペプチドの組換え産生第１Ａ図−第１Ｂ図に示すＭＮ蛋 白質およびその断片を調製する代表的な方法は、適切なＭＮ　ｃＤＮＡ断片を上 で例示したような適切な発現ベクターに挿入することである。本明細書に記載し ているように、単離されたＭＮ　ＤＮＡのクローニングには、広範な種類の宿主 −クローニングベクターの組合せを用いることができる。たとえば、有用なりロ ーニング媒体としては次のようなものを挙げることができる。染色体ＤＮＡ、非 染色体ＤＮＡ、合成のＤＮＡであって、たとえば、ｐＢＲ３２２等の各種の既知 のバクテリアプラスミド、その他の大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１）プラスミドおよび それらの誘導体、ならびに広い宿主範囲のプラスミド、たとえば、ＲＰ４やファ ージＤＮＡ　（たとえば、ＮＢ９８９等のλファージの多数の誘導体）、ファー ジＤＮＡの発現をコントロールする配列を有する修飾プラスミド等のプラスミド とファージＤＮＡの組合せから作られたベクターなど。プラスミドｐＧＥＸ−３ Ｘが好ましいクローニング媒体である。

宿主として有用な細胞は真核性でも原核性でもよく、次のようなものが例示され る。バクテリア宿主、たとえば、大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）とその他のバクテリア 株、酵母およびその他の菌類等、動物または植物の培養細胞等の動物あるいは植 物宿主、昆虫細胞およびその他の宿主。もちろん、全ての宿主が同じ効果を有す るわけではない。本明細書に記載されている原則を考慮しながら本発明の範囲か ら逸脱しないように、当業者によって宿主−クローニング媒体の組合せの選択が なされる。

組換えＤＮＡ分子を形成するため、選択されたＤＮＡ断片をクローニング媒体へ 挿入する特定部位の決定は、さまざまな因子に影響される。これらの因子として は、発現させる蛋白質およびポリペプチドのサイズと構造、所望する蛋白質およ びポリペプチドの宿主細胞の成分による内部酵素分解に対する感受性、宿主細胞 蛋白質によるコンタミネーション、開始および終了コドンの局在などの発現特性 、および当業者により知られているその他の因子などが挙げられる。

ＭＮ遺伝子、その断片あるいはＭＮ遺伝子由来のｃＤＮＡを含む組換え核酸分子 は宿主の形質転換に用いられるが、その形質転換により、宿主（形質転換体）に その構造蛋白質および断片を発現させ、かつ、ハイブリッドＤＮＡがコードして いる蛋白質およびポリペプチドを産生させる。組換え核酸分子はまた、ＭＮ核酸 およびその断片の源としてさらに組換え核酸分子を複製生産させるために宿主の 形質転換に用いられる。これらのそれぞれの使用に対する適切な宿主の選択は、 当該分野で知られている多くの因子により定められている。これらの因子として は、たとえば、選択したベクターとの適合性、共生産物の毒性、所望する蛋白質 およびポリペプチドの回収のしやすさ、発現特性、生物学的安全性およびコスト が挙げられる。

宿主細胞として大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１）などの原核細胞を用いる場合は、ＤＮ Ａを取り込むことのできるコンピテントな細胞は、指数増殖期の後に細胞を回収 （）−一ベスト）シ、続いて既知の手法であるＣａＣｌ２法で処理することによ り調製できる。宿主細胞のプロトプラストを作った後、形質転換を行うことがで きる。

宿主細胞として原核細胞を用いる場合には、リン酸カルシウム沈降法、エレクト ロボレーシラン、マイクロインジェクション等の従来からの機械的手法、赤血球 あるいはリポソームに封入したプラスミドの挿入、リゾフオスファチジルコリン 等の薬剤を用いた細胞処理、あるいはウィルスベクターの使用などの方法がとら れる。

蛋白質およびポリペプチドの産生量は３つの大きな因子に左右される。（１）細 胞内の遺伝子またはＤＮＡ配列のコピー数、（２）該遺伝子および配列が転写、 翻訳される効率、および（３）ｍＲＮＡの安定性。転写、翻訳（これらが共同し て発現を司る）の効率は、核酸配列、一般には所望のコード配列の前に位置して いる核酸配列に依存する。これらの核酸配列、すなわち発現コントロール配列は 、とりわけ、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが相互作用する位置（プ ロモーター配列）、および翻訳を開始するためにリポソームがｍＲＮＡ　（転写 産物）と結合し、相互作用する位置を定めている。そのような全ての発現コント ロール配列が同じ効果を発揮するわけではない。そのため、所望する蛋白質に特 異的なコード配列を近傍の核酸配列から切り出し、その代わりに既知の発現コン トロールベクターに融合して希望する高レベルの発現を得られるようにするのが よい。

上述の操作を行ってから、処理されたこの新しいＤＮＡ断片が多数のプラスミド またはバクテリオファージ誘導体に挿入され、細胞内で遺伝子または配列のコピ ー数を増し、さらに、発現蛋白質の収量を増加させる。

発現コントロール配列として数種のものが用いられる。これらの中には、オペレ ーター、プロモーター、大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ■）のラクトースオペロン（Ｉａｃ 系）のリポソーム結合および相互作用配列、大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ）のトリプ トファン合成系（ｔｒｐ系）に対応する配列、ｔｒｐとｌａｃプロモーターの融 合（ｌａｃ系）、λファージの主要オペレーターとプロモーター（ＯＬＰＬと０ ＲＰＲ）　、およびｆｄファージのコート蛋白質のコントロール領域などが含ま れる。これらの配列を含むＤＮＡ断片は、Ｉａｃあるいはｔｒｐオペロンを有す る形質導入ファージのＤＮＡ、またはλあるいはｆｄファージのＤＮＡから制限 酵素を用いた開裂により切出せる。つぎに、これらの断片を操作して、必須コン トロール配列が、コード配列の開始コドンの非常に近傍または並列に位置してい るようになった限定された分子集団を得る。

融合体は次に、適切な宿主の形質転換あるいはトランスフェクションのためのク ローニング媒体に挿入し、抗原産生量を測定する。そして、最も効率的な発現を する細胞を選択する。別の方法としては、開始コドンに接続されたｌａｃ、　ｔ ｒｐまたはλＰＬコントロール系を有するクローニング媒体を用い、ＭＮ蛋白質 およびポリペプチドをコードする配列を含む断片に融合し、それによって遺伝子 あるいは配列がクローニング媒体の開始コドンから正しく翻訳されるようにする こともできる。

本明細書で使用している「組換え核酸分子」とは、少なくとも２つの核酸配列か らなるハイブリッドヌクレオチド配列を指しており、ここで、第一の配列は、通 常、自然状態では第二の配列と共存していない。

本明細書で使用している「発現コントロール配列」とは、構造遺伝子と結合した 場合にその発現を制御または調整するヌクレオチド配列のことである。

ＭＮ蛋白質およびポリペプチドの合成および生物工学的発現本発明のＭＮ蛋白質 およびポリペプチドは組換え法のみでなく、合成およびその他の生物学的手法に よっても調製することができる。蛋白質またはポリペプチドの合成による産生は 、当該分野でよく知られた方法に従って所望するアミノ酸鎖を化学的に合成して いくことからなる。所望するポリペプチドまたは蛋白質を調製するためのその他 の生物学的手法の例としては、所望するアミノ酸配列を含む長いＭＮポリペプチ ドまたは蛋白質を選択的に蛋白分解することが挙げられる。

たとえば、長いポリペプチドまたは蛋白質を化学試薬または酵素で分解すること などである。

ペプチドの化学合成は従来技術であり、たとえば、メリフィールド（ｌｌｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ）固相合成法（メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　、Ｊ、 、＾ｍ、　Ｃｈｅｔ　Ｓｏｃ、、　８５：２１４９−２１５４（１９６３）、ケ ント（Ｋｅｎｔ）ら、「生物学および医学における合成ペプチド（Ｓｙｎｔｈｅ ｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ）　２９ページ」、アリター口（＾１ｉｔａｌｏ）ら編、エルセヴイール科学出 版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）社、１９８５ 年、およびハーグ（ｔｌａｕｇ）　、Ｊ、Ｄ、ｒペプチド合成および保護基戦略 （Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　Ｇｒ ｏｕｐ　Ｓｔｒａｔｅｇｙ）　Ｊ　、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏ狽■モ■獅盾 戟B Ｌ型毀胆竺■工５（１）＋　４０−４７　（１９８７年、１７２月号）などによ り実施される。

化学的ペプチド合成の方法には、市販の保護アミノ酸を用いる自動ペプチド合成 機の使用も含まれる。合成機としては、たとえばバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒ ｃｈ）社（米国、カリフォルニア州、サンラフ７エル）の９５００型および９６ ００型、アプライド　バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ）社（米国、カリフォルニア州、フォスターシティ−）の４３０型、ミリジエ ン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）社（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐ。

ｒｅ）社の子会社、米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード）の９０５０型 、およびデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）のＲＡＭＰ　（高速自動複数ペプチド合成機 ）（デュポンコンパス（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｃｏｍｐａｓｓ）社、米国、プラウエア 州、ウイルミントン）などがある。

核酸プローブおよび試験キット 本発明の核酸プローブは、第１Ａ図−第１図Ｂに示すＭＮ　ｃＤＮＡ配列または ＭＮ遺伝子配列と実質的に相補的な配列からなる。本明細書で使用する「実質的 に相補的」という語は、当該技術分野で広く理解されている意味と同じであり、 それゆえ、通常のハイブリダイゼーションの状態の意味で用いる。ハイブリダイ ゼーションの程度は、相補正の精度に応じて変わり得る。

前記プローブは、ＭＮ　ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの検出に使用でき、したが って、患者の細胞内のＭＮ遺伝子の存在や欠如、増殖、変異、あるいは遺伝子再 配列の試験に使用できる。たとえば、ＭＮ遺伝子の過剰発現は、本発明のプロー ブを使用したノーサンプロットにより検出できる。増幅、転座、逆位ならびに欠 失などの遺伝子変化は本発明のプローブを用いることにより検出でき、このとき 、該プローブは、細胞分裂中期の染色体の広がった状態でも開期の核のいずれの 状態であっても、患者の細胞由来の染色体とインサイチュ−（ｉｎ　５ｉｔｕ） 　／％イブリダイゼーションする。また、本発明のプローブを用いたササンプロ ットによってＭＮ遺伝子の増幅あるいは欠失を検出することもできる。該プロー ブを用いた制限酵素断片長条型（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）分析は、遺伝子変化、変異およ び欠失の検出として好ましい方法である。該プローブはまた、いろいろな組織由 来のＭＮ遺伝子から転写された各種のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするこ とにより、ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドならびにそれらと相同または ほぼ相同な蛋白質および／またはポリペプチドを検出するために用いられる。

このように、該プローブは診断／予後に有用である。該プローブは試験キットと して具体化でき、好ましくは、該プローブが適切なＭＮ遺伝子またはＭＮ　ｍＲ ＮＡターゲットとハイブリダイゼーションした時に、視覚化できる適切な手段を 伴っているのがよい。そのような試験のサンプルとしては、組織標本、体液なら びに組織および細胞の抽出物が挙げられる。

分析 本発明に従う分析は、を椎動物のサンプル、好ましくはホ乳類のサンプル、より 好ましくはヒトのサンプル中のＭＮ抗原またはＭＮ特異的抗体の検出および／ま たは定量である。そのようなサンプルとしては、組織標本、体液、組織抽出物お よび細胞抽出物が挙げられる。ＭＮ抗原は、イムノアッセイ、免疫組織学的染色 、免疫電子および走査顕微鏡観察、とりわけ、免疫全沈降（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌ ｄ）を用いる技術により検出できる。

ＭＮ抗原分析の好ましいサンプルは組織および／または細胞抽出物である（下記 の実施例７と８が代表的なものである）。しかし、ＭＮ抗原は体液、とりわけ、 血液、血清、プラズマ、精液、乳汁、唾液、涙、喀痰、粘液、尿、リンパ液、サ イドシル、腹水、温水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液、髄液からも検出 できる。試験前に大量の体液からＭＮ抗原を濃縮することが望ましい。分析に好 ましい体液は、試験する癌の型にもよるが、一般的に好ましい体液は、乳汁、温 水および腹水である。

血液、プラズマ、血清、リンパ液、粘液、涙、尿、髄液および唾液などの体液サ ンプル中の活性ＭＮ蛋白質／ポリペプチドにＭＮ特異的抗体は血清学的に結合す るが、そのような抗体は血液、プラズマおよび血清、好ましくは血清に普通にみ られる。ＭＮ特異的抗体の検出のための代表的な分析は、下記の実施例８に示す ものであり、その実施例では融合蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮを用いている。

ＭＮ抗原およびそれらと反応するＭＮ特異的抗体の検出および／または定量試験 の結果の相関から、患者の病状の好ましいプロファイルが示される。

本発明の分析は、診断および／または予後の両方、すなわち、診断／予後である 。本明細書で使用している「診断／予後」とは、臨床的状況に依存して以下の手 順のそれぞれ、または、それらの手順のいくつかが重複していることを意味する 。疾病の存在の判断、疾病の特性の判断、ある疾病と他の疾病との区別、病状の 帰結予想、患者の様子と症状から示される疾病からの回復の見込み、患者の病状 のモニタリング、疾病の再発に関する患者のモニタリング、および／または患者 に対する好ましい治療方法の決定など。本発明における診断／予後の方法はたと えば以下のような場合に有用である。腫瘍性および／または前腫瘍性疾患の存在 に対する集団のスクリーニング、腫瘍性疾患の進展の危険性の判断、腫瘍性およ び／または前腫瘍性疾患の存在の診断、腫瘍性疾患の患者の病状のモニタリング 、および／または腫瘍性疾患の経過に対する予後の判断など。

本発明は、広範な種類の腫瘍性疾患の存在のスクリーニングに有用である。たと えば、乳腺、尿路、卵巣、子宮、子宮頚管、子宮内膜、偏平細胞および腺偏平細 胞などの腫瘍１頭および首の癌、神経芽細胞腫および網膜芽種などの中胚葉性の 腫瘍：骨肉腫およびユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’　ｓ　ｓａｒｃｏｍａ）など の肉腫；あるいはメラノーマなどが含まれる。特に興味があるのは婦人科の癌で あり、この中には卵巣、子宮、子宮頚管、膣、陰門、子宮内膜癌が含まれるが、 中でもとりわけ興味があるのは卵巣、子宮頚管および子宮内膜の癌である。同様 に特に興味があるのは、胸、食道を含む胃、結腸、腎臓、前立線、肝臓、膀胱を 含む尿路系、肺、および頭と首の癌である。

本発明は、たとえば、宿主から取出した直後の細胞群を使用して、悪性腫瘍ある いは前悪性腫瘍性細胞の存在の可能性を推し量るための方法および構成物を提供 する。そのような分析は、腫瘍の発見、それらの増殖の計測および疾病の診断と 予後に役立つ。この分析はまた、癌の転移の存在の発見、ならびに、手術、癌の 化学療法および／または放射線療法の後、全ての腫瘍組織がなくなり“Ｃいるか 除去されているかを確認するのに役立つ。さらに、診断は、癌の化学療法および 腫瘍の再発をモニターするのに役立つ。

ＭＮ抗原または抗体の存在は、多くの既に確立された診断分析を用いて検出およ び／または定量することができる。当業者であれば、従来から存在する任意のイ ムノアッセイ法を適用して、ＭＮ抗原および／または抗体を検出および／または 定量することかできる。実施例８に本発明の好ましい診断方法であるラジオイム ノアッセイ法について詳しく述べている。もちろん、ＭＮ抗原およびＭＮ特異的 抗体の検出にはほかの多くの方式も利用可能である。たとえば、ウェスタンプロ ット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、 競合ＥＩＡ、二重抗体サンドイツチ法、その他診断研究において通常使用される 全ての分析法などがある。そのようなイムノアッセイにおける結果の解釈は、抗 体あるいは抗体の組合せは、ＭＮに関係のないサンプル中に存在する他の蛋白質 および蛋白質の断片とは交差反応し２ないという仮定に基づいている。

ＭＮ抗原検出の代表的な一つのＥＬＩＳＡ試験は、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに 対して作られた抗体あるいはＭＮ蛋白質を発現する細胞全体に対して作られた抗 体をコートしたマイクロタイタープレートに、組織あるいは細胞抽出物のような ’！’、ｆｌのサンプルを加える方法である。ある抗原が抗体と結合するように 一定時間インキユベートした後、プＩノートを洗浄し、酵素が連結している別の 抗ＭＮ抗体を加え、反応が生しるようにインキュベートシ、プレートを再洗浄す る。その後、マイクロタイタープレートに酵素基質を加え、酵素が基質に作用す るように一定時間インキユベートし、最終試料の吸光度を測定する。吸光度が大 きく変化することは陽性の結果を示している。

也者の体液、組織および／′または細胞中のＭＮ抗原の存在を検出および／また は定量するためにＭＮ蛋白質／ポリペプチドが使用できることもイムノアッセイ の分野の当業者には明かである。そのような実施態様の一つとして競合イムノア ッセイがあるか、この方法では、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドはラベルされ、ＭＮ 蛋白質／′ポリペプチドに特異的な抗体への該ラベル化ＭＮ蛋白質／ポリペプチ ドの結合に競合させるために体液を加える。そのような分析は実施例８に記載し ＣいるようなＭＮ抗原の検出および／′または定量に使用できる。

別の実施例としては、ＭＮ蛋白質またはポリペプチドに対するラベルされた抗体 を用いるイムノメトリック分析がある。そのような分析においては、抗原結合抗 体とコンプレックスを形成するラベル化抗体の量は、試料中のＭＮ抗原の量と直 接的に比例する。

ＭＮ特異的抗体を検出する代表的な分析は競合分析であり、この分析では、ラベ ルされたＭＮ蛋白質／ポリペプチドはサンプル中の抗体、たとえば、ＭＮ蛋白質 ／ポリペプチドをＬ２識するモノクローナル抗体と結合して沈降する。当業者で あれば、従来から存在する任意のイムノアッセイ方法を適用してＭＮ抗原の検出 および／または定量することができる。該抗体のＭＮ蛋白質／ポリペプチドとの 結合の検出は、当業者に知られた多くの方法、たとえば、ヒトにおいては抗ヒト ラベルＩｇＧの使用などにより行うことができる。

本発明に従い、を椎動物のサンプルからＭＮ抗原を検出および／または定量する イムノアッセイの方法の例は、以下のステップから構成されている。

ａ）ＭＮ抗原に結合する一組あるいはそれ以上の組の抗体（一つの抗体かあるい は複数の抗体）（そのうち−組はラベルされているかまたはその他の手法で検出 可能となっている）とを椎動物のサンプルをインキュベートする。

ｂ）λ４Ｎ抗原と該抗体からなる免疫コンプレックスが存在するかについて、イ ンキュベートしたサンプルを調べる。

本発明に従う別のイムノアッセイ法の例は競合イムノアッセイであり、を椎動物 す／プル中のＭＮ抗原を検出および／または定量するために使用され、以下のス テップから構成されている。

ａ）を椎動物のサンプルを一組あるいはそれ以上の組の抗体および一定量のラベ ルされたもしくは他の手段で認識できるようになっているＭＮ蛋白質／ポリペプ チドどインキュベートし、このとき、該ＭＮ蛋白質／ポリペプチドが抗体との結 合において、サンプル中に存在するＭＮ抗原と競合する。

ｂ）インキュベートしたサンプルを調べて、抗体に結合しているラベルした／検 出可能なＭＮ蛋白’Ｍ／ポリペプチドの量を測定する。

Ｃ）ステップｂ）の検査から、前記サンプル中に存在するＭＮ抗原および／また は前記サンプル中に存在するＭＮ抗原の量を決定する。

望ましい特性を有する抗体（生物学的に活性な抗体の断片を含む）が調製される と、特定の抗体抗原コンプレックスの形成を判定するための広範な免疫学的分析 法が可能である。多くの競合、非競合蛋白質結合分析に関して化学文献および特 許明細書に記述されており、そのような分析法の多くは購入可能である。血清中 の抗原の検出に適したイムノアッセイの例としては、以下の米国特許に記載され ているものが含まれる。米国特許第３．７９１．９３２号、第３．８１７．８３ ７号、第３．８３９．１５３号、第３．８５０．７５２号、第３．８５０．５７ ８号、第３．８５３．９８７号、第３．８６７、５１７号、第３．８７９゜２６ ２号、第３．９０１．６５４号、第３．９３５．０７４号、第３．９８４．５３ ３号、第３．９９６．３４５号、第４．Ｑ３４、０７４号、および第４．０９８ ．８７６号。

分析に用いれらる抗体は、ラベルされているかまたはラベルされていないもので ある。ラベルされていない抗体は凝集に用いられ、ラベルされた抗体は、多くの 種類のラベルを施すことにより、広範な分析に使用される。

適切な検出には、放射核、酵素、補酵素、発蛍光剤、化学発光剤、色素原、酵素 基質あるいは補助因子、酵素阻害剤、フリーラジカル、パーティクル、染料など のラベルを用いるものが挙げられる。そのようなラベル試薬は、既知のさまざま な分析、たとえば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫アッセイ、 蛍光免疫アッセイなどに用いられる。たとえば、米国特許第３．７６６、１６２ 号、第３，７９１、９３２号、第３．８１７．８３７号および第４．２３３．４ ０２号を参照をこと。

本発明の分析において有用な抗体を調製する方法を以下に示す。以下の例は、本 発明に従う代表的な分析について詳述したものである。

イムノアッセイ試験キット 今までに概要を示した分析は、ＭＮ抗原および／またはＭＮ特異的抗体（生物学 的に活性な抗体の断片を含む）を検出および／または定量する試験キットとして 具体化される。ＭＮ抗原を検出および／または定量する試験キットは、ＭＮ蛋白 質／ポリペプチドおよび／または、（ポリクローナルおよび／またはモノクロー ナルの）ＭＮ特異的抗体からなる。そのような診断／予後用の試験キットは、− 組またはそれ以上の組のポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体から 構成されており、サンドイツチ法の場合には、抗体がＭＮ抗原のエピトープを認 識し、−組は適切にラベルされているか、その他の手段により検出可能である。

ラベルされた（あるいは他の手段で検出可能な）ＭＮ蛋白質／ポリペプチドとサ ンプル中のＭＮ抗原との間で抗体に対する結合に関して競合がある分析方法の試 験キットは、ラベルされた蛋白質／ポリペプチドと抗体の量を組合わせて、最適 の感度と精度が得られるように構成されている。

ＭＮ特異的抗体検出のための試験キットは、ラベルされた／検出可能なＭＮ蛋白 質／ポリペプチドから構成されていることが好ましく、必要であれば、たとえば 、下記の実施例８に概要を示しているような好ましい分析を行うために、その他 の成分を含んでいてもよい。そのような試験キットは、その他の適切な手段を含 んで、従来からあるような分析に応用することもできる。

ＭＮ特異的抗体の調製 本明細書で使用している「抗体Ｊという語は、抗体全体を指すだけでなく、生物 学的に活性な抗体の断片、好ましくは抗原結合部位を有する断片をも指している 。そのような抗体は、従来からの手法および／または遺伝子工学により調製でき る。抗体の断片は、遺伝子操作により、好ましくは超可変額域を含む、短鎖およ び／または長鎖の可変領域（ｖｌＩとＶＬ）から調製されるのがよく、さらに好 ましくは、ｖｌＩ領域とＶｔ、領域の両方から調製されるのがよい。たとえば、 本明細書で使用している「抗体」という語は、ポリクローナルおよびモノクロー ナル抗体ならびにそれらの生物学的に活性な断片をも意味しており、とりわけ、 「−価」抗体（グレニ−（Ｇｌｅｎｎｉｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９５＋　７ １２（１９８２））　；共有結合性または非共有結合性凝集をするＦａｂ’　お よびＦ　（ａｂ’　）　２断片を含むＦａｂ蛋白質；好ましくは短鎖および長鎖 の可変領域（Ｖ　ＨとＶＬ領領域を含み、より好ましくは超可変額域（該ｖＨと ｖＬ領領域相補性決定領域（ＣＤＲｓ）としても知られている）を含む短鎖また は長鎖単独；Ｆｃ蛋白質；１以上の抗体と結合可能な「ハイブリッド」抗体、定 常−可変領域キメラ；異なる起源由来の長鎖および短鎖からなる「複合」免疫グ ロブリン；通常の組換え手法により、またはオリゴヌクレオチドの依存突然変異 誘発法（ダルバブイー−マクファーランド（Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａ ｎｄ）ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　７９：　６４０９（１９８２））により調 製された、特異性やその他の特性を改良した「改造」抗体などが含まれる。

治療および／またはイメージングに使用する抗体は、生物学的に活性な抗体の断 片であることが好ましく、より好ましくは遺伝子工学的に処理された断片がよく 、さらに好ましくはＶＨおよび／またはｖＬ領領域ら遺伝子工学的に処理された 断片がよく、さらにより好ましいのは、それらの超可変額域からなる断片である 。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作出する従来からの技術は、イムノ アッセイの分野では周知である。ＭＮ特異的抗体を産生ずるための免疫原には、 ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチド、好ましくは純粋で、ＭＸに感染した腫 瘍細胞系、たとえば、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞およびその他の免疫原が含まれる。

抗ペプチド抗体は、ヨーロッパ特許出願公開第４４．７１０号（１９８２年１月 ２７日公開）に記載されているような当該分野の従来法によっても作出される。

該方法を要約すると、第１Ａ図−第１Ｂ図に示すようなＭＮアミノ酸配列からペ プチドを選択し、化学的に合成し、適切な免疫原蛋白質に結合し、適切な動物、 通常はウサギあるいはマウスに注入し、ポリクローナルまたはモノクローナル抗 体を作らせることにより、抗ペプチド抗体が調製される。モノクローナル抗体は コーラーーミルシュテイン（ｌ［ｏｈｌｅｒ−１１ｉ１ｓｔｅｉｎ）法に従って 作出される。

従来のハイブリドーマ法だけでなく、新しい技術も本発明に従う抗体を産生ずる ために用いることができる。たとえば、クローン作成および抗体のＶ遺伝子の発 現にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用い、結合活性を有する断片をコード している抗体遺伝子の選択にファーンディスプレイ法を用いることにより、免疫 されたマウスおよびヒト由来のＰＣＲ増幅したＶ遺伝子の集団から抗体の断片を 単離することができた（マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ、　１０：　７７９　（１９９２年７月号）参照のこと。シャン（Ｃｈｉａｎ ｇ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　７（４）＋　３６０（１９８９）、ワ ード（ｌａｒｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４１：　５４４　（１９８９年１０月 １２日号）；マークス（ＭａｒｋＳ）ら、Ｊ、　ｌ１ｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　２ ２２：　５８１（１９９１）　；クラクソン（Ｃ１ａｃｋｓｏｎ）ら、Ｎａｔｕ ｒｅ。

組換え技術を用いた抗体（本明細書では生物学的に活性な抗体の断片を含む）の 調製法に関する記載は下記に見出される。米国特許第４．８１６．５６７号（１ ９８９年３月２８日付与）、ヨーロッパ特許出願公開番号（Ｅ　Ｐ）第３３８． ７４５号（１９８９年１０月２５日公開）、ＥＰ第３６８．６８４号（１９９０ 年６月１６日公開）、ＥＰ第２３９．４００号（１’９８７年９月３０ロ公開） 、ＷＯ第９０／１４４２４号（１９９０年１１月２９日公開）、Ｗｏ第９０／１ ４４３０号（１９９０年５月１６日公開）、ヒューセ（Ｈｕｓｅ）ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２４６：　１２７５　（ｆ９ｇ９年１２月８日号）；マークス（ｌｌ ａｒｋｓ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏ　、　１０：　７７９　（１９９２年７ 月号）：う・サストリー（Ｌａ　５ａｓｔｒｙ）ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、　８ ６：　５７２８　（１９８９年８月号）；シャン（Ｃｈｉａｎｇ）ら、ＢｉｏＴ ｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ、　７（４）：　３６０（１９８９）　；オーランディ（Ｏ ｒＩａｎｄｆ）ら、ＰＮＡＳ（ｔｌｓＡ）、　８６：　３８３３　（１９８９年 ５月号）；ワード（ｌａｒｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４１：５４４　（１９８ ９年１０月１２日号）；マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｊ、　ｌ１ｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、、　２２２：　５８１（１９９１）　：　７−ゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂ ｏｏｍ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１９（１５）：　４１ ３３（１９９１）。

モノクローナル抗体の調製 本発明の分析で使用するモノクローナル抗体は、当該分野において既知の方法に より得られる。たとえば、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）と　ミルシュティン（Ｍｉ ｌｓｔｅｉｎ）「モノクローナル抗体の調製二戦略および方法（Ｐｒｅｐａｒａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｓｔｒａｔ ｅｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）　Ｊ　（酵素学的方法：免疫化学 的手法（！ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　：　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ）　７３巻１−４６ページより）（ランゴー： ／　（Ｌａｎｇｏｎｅ）とヴ７ナティス（Ｖａｎａｔｉｓ）　１７、アカデミツ ク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）社（１９８１年）、および古典的 な参考として、ミルシュティン（Ｉｌｉ　１ｓｔｅｉｎ）とコーラ−（Ｋｏｈｌ ｅｒ）　、Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：　４９５−４９７（１９７５）がある。

本発明の代表的なハイブリドーマは、マウス細胞系の融合により調製されるが、 ヒト／ヒトハイブリドーマ（オルラン（Ｏｌｓｓｏｎ）　ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ ）、　７７：　５４２９（１９８０））およびヒト／マウスハイブリドーマ（シ ュローム（Ｓｃｈｌｏｍ）ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、７ヱ：　６８４１（１９８ ０）、シェアマン（Ｓｈｅａｒｍａｎ）ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４６ ：　９２８−９３５（１９９１）、ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ（Ｕ ＳＡ）、　８８：　４１８１−４１８５（１９９１））からも調製され得る。

そのようなヒト型のモノクローナル抗体は、治療およびイメージングに使用する のに好ましいモノクローナル抗体である。

本発明に用いるモノクローナル抗体は、適切なホ乳類、好ましくは誓歯類、より 好ましくはウサギまたはマウスに、適切な免疫原、たとえば、ＭａＴｕに感染し たＨｅＬａ細胞や、あるいは、必要であればキャリアー蛋白質をつけたＭＮ蛋白 質／ポリペプチドを用いて免疫することにより調製される。例として、ＭＡｂＭ ２Ｓを分泌するハイブリドーマＶｔ１−Ｍ２Ｓの作出について以下に記載してい る。ＭＡｂ　Ｍ２Ｓは、多くの実験室での診断試験、たとえば、培養腫瘍細胞、 臨床サンプルなどにおけるＭＮ蛋白質／ポリペプチドの同定に役立っている。Ｍ Ａｂ　Ｍ２Ｓを産生する方法により、ＭＡｂ　Ｍ１６（ＩｇＧ２Ｂのアイソタイ プ）およびＭＡｂ　ＭＢ２　（ＩｇＧ１のアイソタイプ）も産生された。

ＭＡｂ　Ｍ２Ｓ モノクローナル抗体Ｍ７５　（ＭＡｂ　Ｍ２Ｓ）は、マウスリンパ球ハイブリド ーマＶＵ−Ｍ２Ｓから産生されるが、該ハイブリドーマは、当初スロヴアク科学 アカデミーウィルス研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５ ｌｏｖａｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）のハイブリドーマコレ クション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）　（チェコス ロバキア、ブラティスラヴア）に寄託され、また、アメリカン・タイプ・カルチ ャー−コレクション（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ）　（米国、メリー゛ラノド州、ロツクヴイル）に１９９２年９月 １７日にＡＴＣＣ受入番号ＨＢ　１１１２８として寄託されたものである。

ハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５は、ガーハード（Ｇｅｒｈａｒｄ）　、Ｗ、によっ て記載されている方法（「懸濁液中での細胞融合および調整培地中でのハイブリ ッドの発芽後生育（Ｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　５ｕｓｐｅｎｓｉ ｏｎ　ａｎｄ　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｉｎ@ｃ。

ｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）　Ｊモノクローナル抗体・ハイブリドーマ 、生物学的分析の新社、米国、ニューヨーク））に従って産生される。Ｂ　Ａ　 Ｌ　Ｂ／ＣマウスをＭａＴＵに感染したＨｅＬａ細胞で免疫し、それらの牌細胞 をミエローマ細胞系Ｎ５−Ｏと融合した。ハイブリドーマの組織培養培地をモノ クローナル抗体のスクリーニングにかけた。用いた抗原は、ＭａＴｕに感染した ＨｅＬａ細胞の抽出物とウサギ抗Ｍ　ａ　Ｔ　ｕ血清の免疫沈降物であるｐ５８ 、および黄色ブドウ球菌（鉦鮒匠Ｅゲルにより分離した。モノクローナル抗体は 、プロティンＡ−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー（〕 〕ｈ−ロウＨａｒｌｏｔ）とレイン（Ｌｉｎｅ）、「抗体　実験室手順書（＾ｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｌ、ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ　：ｌ −ルドスプリングハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）社、米国 、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバ−１１９８８年）により、ＴＣ培 地から精製された。

本発明に従ってＭＮ蛋白質／ポリペプチドを同定するのに有用なモノクローナル 抗体は、従来からの任意の方法によってラベルすることができる。たとえば、西 洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のような酵素、蛍光化合物　１２５１など の放射活性同位体などである。本発明に従う好ましいラベルは＋２８１であり、 好ましい抗体ラベル化の方法は、クロラミン−Ｔ法（ハンター（ｌｌｕｎｔｅｒ ）　、Ｗ、　Ｈ。

、「ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　Ｊ実験免疫 学の手引（Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ）より、１４．１−１４．４０　（Ｄ、　Ｗ、ウニイア−（ｌｅｉｒ）編 、ブラックウェル（Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ）社、オックスフォード／ロノドン／エ ディンバラ／メルボルン、１９７８年）である。

ＭＡｂ　Ｈ４６０ モノクローナル抗体Ｈ４６０（ＭＡｂ　８４６０）は、ＭＡｂ　Ｍ２Ｓ　と同様 な方法によって調製された。ただし、マウスをＭａＴｕに感染していないＨｅＬ ａ細胞により免疫し、マウスの牌細胞ではなくリンパ球をミエローマ細胞系Ｎ５ −０の細胞と融合した点が異なる。ＭＡｂ　Ｈ４６０は、どんなヒト細胞ともほ ぼ同様に反応する。

ＭＮ特異的抗体の治療への応用 本発明のＭＮ特異的抗体、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗 体、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはＭＡｂ　Ｍ２Ｓは、腫瘍お よび／または前腫瘍性疾患の治療に用いることができ、単独あるいは化学療法剤 または毒性剤（たとえば、リシンＡ等）と組み合わせて用いることができる。

治療用としてより好ましいのは、本明細書に記載しているような生物学的に活性 な抗体の断片である。同様に、治療用として好ましいＭＮ特異的抗体は、ヒト型 モノクローナル抗体である。

ＭＮ特異的抗体は、好ましくは生理学的に許容性の非毒性液体基剤に分散された 形で、治療効果を発揮するのに十分な量が投与される。

さらに、本発明のＭＮ特異的抗体は、放射核などのイメージング剤と結合させた 場合には、イメージングに利用てきる。生物学的に活性な抗体の断片あるいはヒ ト型モノクローナル抗体がイメージング用としては好ましい。

たとえば、腫瘍部位や転移の位置などが患者の腫瘍組織から同定できる。適切に ラベルしたあるいはイメージング剤と結合させた抗体を生理学的に許容性のキャ リアーと共に患者に投与し、結合した抗体は、ラベルあるいはイメージング剤の 検出に適した方法、たとえば、シンチグラフィーなどにより検出される。

アンチセンスＭＮ核酸配列 本発明のＭＮ遺伝子は、腫瘍遺伝子と推定され、それによってコードされている 蛋白質は、腫瘍性蛋白質であると推定される。ＭＮ遺伝子から転写されたｍＲＮ Ａと実質的に相補性のアンチセンス核酸配列は、実施例１１のアンチセンスオリ ゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮＳ）に代表されるものであり、ＭＮ遺伝子の発 現を減少あるいは抑制するのに用いることができる（ザメクニツク（Ｚａｍｅｃ ｎｉｃｋ）、ｐ、ｃ、ｒイントロダクション・遺伝子情報解読のモジュレータ− としてのオリゴヌクレオチド塩基ハイブリダイゼーション（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ：　Ｏｌｉｇｏｎｉｃｌｅｏｔｉｄｃ　Ｂａ５ｅ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ ｉｏｎ　ａｓ　ａ　Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｅｓｓａｇ ｅ　Ｒｅａｄｏｕｔ）@Ｊ　１−６ ページ、癌およびＡＩＤＳへのアンチセンス核酸療法の予測（Ｐｒｏｓ　ｅｃｔ ｓ　ｆｏｒ　Ａｎｔｉｓｃｎｓｃ　Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄ　ＴｈＣｒａｐｙ 　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ＾ＩＤＳ　）より　（ライレイ−リス（Ｗｉ　Ｉ ｃｙ−Ｌｉｓｓ）社、米国、ニューヨーク州、ニューヨーク、１９９１年）、ウ ィックストーム（ｆｉｃｋｓｔｏｒｍ）　、Ｅ、ｒＨＬ−６０前骨髄球性白血病 細胞に対するアンチセンスＤＮＡ療法　末端配列の変化と標的配列への依存性（ Ａｎｔｉｓｃｎｓｃ　ＤＮＡ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＨＬ−６０Ｐｒｏｍ ｙｅｌｏｃｙｔｉｃ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｃｅ１ｌｓ：　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｄ ｉｆｆｅｒｅｎモ奄≠狽奄盾■ ａｎｄ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　Ｊ 　７−２４ページ、同上；レザマン（Ｌｅｓｅｒｍａｎ）ら、「腫瘍遺伝子の発 現に干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的化と細胞内分布（Ｔａｒｇ ｅｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　 Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｃｓ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｊ ｎｇ　ｗｊｔｈ　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）　Ｊ　２５−３４ ページ、同縺F ヨコヤマ（Ｙｏｋｏｙａｍａ）　、Ｋ「アンチセンスＲＮＡによる腫瘍原遺伝子 ｃ−ｍｙｃの転写制御（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ｃ−ｍｙｃ　Ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｂｙ＾ｎｔｊ　Tｅｎ ｓ ｃＲＮ＾）　ｊ　３５−５２ベーン、同上、ヴアンデンベルク（ｖａｎ　ｄｅｎ 　Ｂｅｒｇ）ら、「染色体の異常世代を抑制するアンチセンスｆｏｓオリゴデオ キシリボヌクレオチド（＾ｎｔｍａｌ＾ｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ）　Ｊ　６３−７ ０ページ、同上、メルコーラ（Ｍａｒｃｏｌａ）　、Ｄ、ｒアンソー（Ｔｓ’ｏ ）　、＾ｎｎ、　Ｒｅｐｏｒｔｓ　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、、　２３＋　２９５− ３０４（１９８８）　；スティン（Ｓｔｅｉｎ）とコーエン（Ｃｏｈｅｎ）　、 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｃｓ、、　４８：　２６５９−２６６８（１９８８）　；ステ ヴエンラン（Ｓｔｅｖｃｎｓｏｎ）とインヴアーセン（Ｉｎｖｅｒｓｅｎ）　、 Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　７０：　２６７３−２６８２（１９８９）　 ｌグツドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）　ｒオリゴヌクレオチドによる遺伝 子発現の抑制（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｂｙ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）　Ｊ　５３−７７y ージ、オリゴデオキシヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス抑制剤（牡■匹 ｃｏｘｙｎｕｃｌｃｏｔｉｄｃｓ：　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ）、　（コーエ■ （Ｃｏｈｅｎ）　、Ｊ、Ｓ、編、ＣＲＣプレス（ＣＩｉＣＰｒｅｓｓ）社、米国 、フロリダ州、ポカ・ラートン、１９８９年）、デルヴアン（Ｄｅｒｖａｎ）ら 、「三重らせん形成による二重らせんＤＮＡのオリゴヌクレオチドの認１ａ　（ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆＤｏｕｂｌｃ −ｈｃｌｉｃａｌ　ＤＮＡ　ｂｙ　Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｃｌｉｘ　Ｆｏｒｍａｔｉ ｏｎ）　Ｊ　１９７−２１０ページ、同上；ネソカーズ（Ｎｅｃｋｅｒｓ）　、 Ｌ、　Ｍ、ｒ細胞制御研究の道具としてのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオ チド、取込のメカニズムと腫瘍遺伝子機能の研究への応用（八ｎｔｉｓｅｎｓｅ 　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ　ｆｏｒ 　ＳｔｕｄｙｉｎｇＣｅｌｌ　Ｒｅ■浮撃≠狽■ ｏｎ：　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｌ１ｐｔａｋｅ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃ ａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｇ■獅■@Ｆｕｎｃｔ ｉ ｏｎ）　Ｊ　２１１−２３２ページ、同上：レイトナー（Ｌｅｉｔｎｅｒ）ら、 至（ＵＳＡ）、　８７：　３４３０−３４３４（１９９０）　；ベヴイラッカ（ Ｂｅｖｉ　１ａｃｑｕａ）ら、ＰＮＡＳ（ｔｌｓ＾）、　８５：　８３１−８３ ５（１９８８）@ｉ 口−り　（Ｌａｋｅ）ら、Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　ＩＨｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、、１４１：　２８２−２８８（１９８８）　；サリン（Ｓａｒｉｎ） 　ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、　８５：　７４４８−７４５１（１９８８）　；ア グラワル（Ａｇｒａｗａｌ）ら、「アンチセンスオリゴヌクレオチド・化学療法 およびＡＩＤＳへのアプローチの可能性（Ａｎｔｉｓｃｎｓｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕ ｃｌｃｏｔｉｄｅｓ：　Ａ　Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｆｏｒ　Ｃ ｈｅｍｏｔｈ■窒≠垂■ ａｎｄ　ＡＩＤＳ）　ｊ核酸療法に関する生化学全国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎ ｃｅ　ｏｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）　（１９ ９１年１月１３−P７日、 米国、フロリダ州、クリアウオターピーチ）、アームストロング（＾ｒＨｓｔｒ ｏｎｇ）、Ｌ、　、Ｂｃｒ、　Ｗｅｅｋ、　８８−８９ページ（１９９０年３月 ５日号）：ウニイントララブ（Ｗｅｔｎｔｒａｕｂ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ、　１： 　２２−２５（１９８５））　、そのようなアンチセンス核酸配列、好ましくは オリゴヌクレオチドは、ＭＮ　ｍＲＮＡ、特にリポソーム結合部位と翻訳開始点 の近傍でハイブリダイゼーションすることにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。

それゆえ、そのようなアンチセンス核酸配列を使用することは、癌の治療の一つ の方法と考えられる。

本発明に従う好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子特異的０ＤＮ ｓあるいはＭＮ　ｍＲＮＡの５゛末端に相補的なオリゴヌクレオチドである。

特に好ましいのは、下記の実施例１１に配列が示されているような、２９−ｍｅ ｒＯＤＮｌおよび１９−ｍｅｒ　０ＤＮ２である。これらのアンチセンス０ＤＮ Ｓは、ＭＮ遺伝子の発現を抑制する機能を有する多くのアンチセンス核酸配列の 中の代表的なものである。当業者であれば、第１Ａ図−第１Ｂ図の核酸配列から 適切なアンチセンス核酸配列、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを確 定することができる。

ワクチン 本発明のＭＮ蛋白質およびポリペプチドは、腫瘍性疾患に対して防御免疫を誘起 でき、腫瘍形成活性を弱める効果を有するようなワクチンに組込むことができる 。ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドは、合成あるいは組換えやその他の生 物学的手法により調製されて、単量体、または多量体型のＭＮ蛋白質の１または それ以上のエピトープに対応する、１またはそれ以上のアミノ酸配列から構成さ れるようにすることができる。つぎに、これらの蛋白質および／またはポリペプ チドは、防御免疫を誘起できるワクチンに組込まれる。そのようなポリペプチド の免疫原性を上げる方法は、多量体構造に組込むこと、キーホールリンベットヘ モシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）あるいはジフテリア毒素等の高免疫原性蛋白質キャリ アーに結合させること、およびアジュバントあるいはその他の免疫応答強化剤と 組み合わせて投与することを含む。

本発明に従うワクチンにおいて使用される好ましいＭＮ蛋白質／ポリペプチドは 、遺伝子工学的に処理されたＭＮ蛋白質である。好ましい組換えＭＮ蛋白質は、 本発明に従って産生された融合蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮである。

本発明のそのようなワクチンの好ましい使用例は、ＭＮ関与性−次癌が外科的に 切除された患者へ投与することである。ワクチンは患者の体内で能動免疫を誘起 し、再発あるいは転移を防ぐことができる。

さらに、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに対する抗体に対する抗イデイオタイプ抗体 もワクチンとして有用であり、同様に製剤化できる。

単量体、または多量体型のＭＮ蛋白質／ポリペプチドのエピトープに対応するア ミノ酸配列は、化学的合成、あるいは遺伝的に変更された微生物やそれらの培養 培地などの生物源を精製することによっても得られる（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ ）「合成ワクチン（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）　Ｊ　Ｓｃｉ、　 Ａｍ、、　２４８（２）：　６６−７４（１９８３）を参照）。蛋白質／ポリペ プチドは、他の蛋白質／ポリペプチド（他のタンパク質の断片を含む）と組合わ されて一つのアミノ酸を形成することがあり、たとえば、融合蛋白質として合成 される場合や、合成または生物由来の抗原性あるいは非抗原性の他のポリペプチ ドに結合する場合などがある。

”　ｒＭＮ蛋白質／ポリペプチドのエピトープに対応する」という言葉は、天然 に存在する蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列の変化が抗原性を与えるこ とがあり、腫瘍性疾患に対する防御免疫および／または抗腫瘍形成性効果を付与 することがあるという実際的な可能性を含むものとする。配列の変化の可能性と しては、アミノ酸の置換、伸長、欠失、削除、挿入およびこれらの組合せが挙げ られるが、これらに限定されるわけではない。そのような変形も本発明の範ちゅ うに含まれる。ただし、それらを含有する蛋白質またはポリペプチドが免疫原性 であり、そのような蛋白質またはポリペプチドによって分泌された抗体は、天然 に存在するＭＮ蛋白質またはポリペプチドと交差反応し、その分泌量は、ワクチ ンとして投与したときに防御免疫および／または抗腫瘍形成性活性を誘起するの に十分な量であるものとする。

そのようなワクチンの組成物は、生理学的に許容し得る基剤、たとえば、免疫的 に許容される希釈剤およびキャリアー、また、フロイントの完全アジュバント（ Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｂａｎｔ）　、サポニン、明 ばん等の通常用いられるアジュバントなどと組合せられる。投与は、免疫学的に 有効な量のＭＮ蛋白質またはポリペプチドで行うが、好ましい投与量ユニットは 、被投与体の体重１ｋｇあたり０゜０１から１０．θμｇの免疫学的に活性なＭ Ｎ蛋白質および／またはポリペプチドである。防御に有効な総投与量は、抗原量 として０．１から約１００μｇの範囲である。

投与経路、抗原量、投与の回数と頻度はすべて最適の条件で行うが、これらは当 該分野の通常の技術範囲の範ちゅうに含まれる。　。

以下の実施例は説明をするためのものであり、如何なる意味においても本発明を 限定するものではない。

材料および方法 次の材料および方法は、以下の実施例で使用するものである。

Ｍ　ａ　Ｔ　ｕ感染および非感染ＨｅＬａ細胞ＭａＴｕ剤（ザバダ（Ｚａｂａｄ ａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、、　２４０：１２４−１２５（１９ ７２）、ザバダ（Ｚａｂａｄａ）ら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　２４： 　３２７−３３７（１９７４））は、ｒＭａＴｕＪ細胞由来であり（ウィドメイ ア−（ｆｉｄｍａｉｅｒ）ら、Ａｒｃｈ、　Ｇｅｓｃｈｗｕｌｓｔｆｏｒｓｃｈ 、　４４：］−１０（１９７４））　、これは、マイトマイシンＣで処理したＭ 　ａ　Ｔ　ｕ細胞と共培養することにより、発明者らのＨｅＬａ細胞ストックに 移したものであり、これにより、対照とＭａＴｕ感染細胞を対比できるようなっ た。ＭａＴｕ細胞は、５μｇ／。

ｌのマイトマイシンＣ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社、米国、カ リフォルニア州、う・ホーラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）　）を含む培地で３７℃で３ 時間インキュベートした。

混合培養は、培地５ｍｌあたり、２Ｘ１０’個のマイトマイシンＣ処理細胞およ び４ｘ＋ｏ’個の新鮮感受性細胞とからなるようにした。３日後に最初の継代を 行い、さらに週に１−２回継代した。

対照のＨｅＬａ細胞は、ザバダ（Ｚａｂａｄａ）らの記載（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅ ｗ　Ｂｉｏｌ、、　２４０：１２４−１２５（１９７２））と同様に扱った。

血清 癌患者、各種の非腫瘍性症状に苦しむ患者および健康な女性からのヒト血清は、 大学院医学研究科産婦人科病院（Ｃ１ｉｎｉｃｓ　ｏｆ　０ｂｓｔｅｔｒｉｃｓ 　ａｎｄ　Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ 　１［ｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ）　（チェコスロバキア、ブラチスラヴア） から入手した。

ヒト血清ＫＨは、切除後１４力月の５０才の乳腺腫患者から得た。該血清は、４ ０１０：１２４−１２５（１９７２））されているＶＳＶ　（ＭａＴｕ）のプソ イド型に対する中和抗体を含有する２つの血清の内の一つである。血清Ｌ８は、 パンエツト病（Ｐａｇｅｔ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）の患者から得た。血清Ｍ７は 、健康な献血者から得た。

ウサギ抗ＭａＴｕ血清は、ＭａＴｕに感染した生存ＨｅＬａ細胞１０−５　Ｘ　 １０’個を３０日の間隔で３回ウサギに免疫することにより調製した。

ＲＩＰとＰＡＧＥ ＲＩＰとＰＡＧＥは基本的には、ザバダ（Ｚａｂａｄａ）とザバドヴ７　（Ｚａ ｂａｄｏｖａ）による記載（Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、、　１１８：　１８９− １９７（１９９１））に従って行ったが、本明細書に記載している実験において 異なる点は　［′’！］メチオニン（ＮＥＮ）　、１０μＣｉ／ｍｌのメチオニ ン非含有ＭＥＭ培地、２％のＦｅ２を添加した３％の完全ＭＥＭ培地を使用した 点である。細胞の全面ペトリ皿培養を、該培地で終夜インキュアー１６２４（１ ９７５））を用いた。インキュベーションおよび遠心分離はすべて０−４℃で行 った。単層細胞は、ＲＩＰＡ緩衝液（０，１４Ｍの塩化ナトリウム、？、５ａ＋ Ｉ［のリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　、１％のドライド：／Ｘ　−１００（Ｔｒ ｉｔｏｎ　Ｘ−１００）　、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭの フッ化フェニルメチルスルフォニルおよびトラシロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）か らなる）で抽出した。非特異反応を減少させるため、抗血清をウシ胎児血清（バ ーバシッド（Ｂａｒｂａｃｉｄ）ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、　７７＋　１６１７ −１６２１（１９８０））およびＳＡＣ処理した抗原抽出物に前吸着させた。

ＰＡＧＥ　（還元状態）には、１０％のＳＤＳゲルを用いた（レムリ（Ｌａｅｍ ｉｌｆ）、Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：　６８０−６８５（１９７０））　。対照 マーカー蛋白質としては、シグマキット（Ｓｉｇｍａ　Ｋｉｔ）　（製品番号Ｍ Ｙ−３ＩＩＳ−２００）を使用した。フルオログラフィーには、サリチル酸塩を 用いた（ヘーガードＱｌｅｅｇａａｒｄ）ら、Ｅｌｅｃｔｒｏ　ｈｏｒｅｓｉｓ 　５：　２６３−２６９（１９８４））。

へ５（ＵＳＡ）　７６：　４３５０−４３５４（１９７９））に従って行った。

蛋白質は、レムリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ）の電気泳動緩衝液を蒸留水で１・１０に 希釈し、メタノールやＳＤＳを含まない状態でゲルからニトロセルロース（シュ レイカー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｕｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１ １）社、ドイツ、ダッセル、０．４５μｍ多孔性）に移した。移送は１．７５Ｉ ＩＡ／Ｃｌ１１２で２時間半かけて行った。プロットは、１２ｅ″Ｉでラベルし たＭＡｂと共に展開し７、増感フィルターを使用してＸ線フィルムを一７０℃で 感光することによりオートラジオグラフィーを行った。

細胞培養の抽出物には少量のＭＮ抗原しか含まれていないため、０．５から１ｍ ｌの抽出物に５０μｌの１０％ＳＡＣ懸濁液（ＭＡｂ　Ｍ２Ｓが含まれている） を添加して濃縮した。本方法は、ヒトＩｇＧを含む臨床サンプルのＭＮ抗原の濃 縮にも使用できる。予備対照実験の結果から、そのような方法がＳＡＣ吸着Ｍ７ ５へのＭＮ抗原の結合に影響しないことが示されている。組織抽出物は、組織を モルタル、乳棒、砂（分析用グレード）と共に粉砕することにより得られた。こ のホモジネートに、ＲＩＰＡ緩衝液を当初の組織に対して１０・１（重量当りの 容量）の割合で加えた。抽出物は、エッペノドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心 分離に３分間かけ、清澄にした。

対照細胞、および上述の方法で調製されたモノクローナル抗体を含むＭ　ａ　Ｔ 　ｕ感染ＨｅＬａ細胞について、免疫蛍光実験を行った。該モノクローナル抗体 は、Ｍ　ａ　Ｔ　ｕ関連抗原に特異的である。モノクローナル抗体の存在確認に は、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧを用いた。細胞のギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）染色 から、対照とＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞にははっきりとした違いはないことが示 された。

ＭａＴｕ関連抗原に特異的であることが事前の試験で証明されているＭＡｂは、 免疫蛍光において二つの異なる反応性を示した。第一のグループを代表するＭＡ ｂ　Ｍ６７は、Ｍ　ａ　Ｔ　ｕ感染ＨｅＬａ細胞において顆粒状の細胞質蛍光反 応を示したが、これはアセトンで固定した細胞のみにみられ、生細胞は蛍光を示 さなかった。ＭＡｂ　Ｍ１６も同様の蛍光を示した。Ｍ６７およびＭ１６のいず れについても、対照のＨｅＬａ細胞においてご（弱い「バックグラウンド」蛍光 がみられた。

もう一つのＭＡｂであるＭ２Ｓは、生きたＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞において顆 粒状の膜蛍光反応を示し、アセトン固定細胞においては顆粒状の核蛍光反応を示 した。しかしながら、Ｍ２Ｓは、非感染ＨｅＬａ細胞においても、非常に弱いが 類似の蛍光を示すことがあった。増殖の条件に基づく関係が見いだされた。すな わち、Ｍ　ａ　Ｔ　ｕに非感染のＨｅＬａ細胞においては、細胞を高密度培養中 で数回継代して増殖したもののみがＭＡｂ　Ｍ２Ｓによる両方の型の蛍光を示し 、希薄培養中で増殖したものは示さない。

Ｎ４７５反応性の細胞表面抗原の量は、細胞蛍光測定法により測定し、その量は 、細胞培養の密度およびＭ　ａ　Ｔ　ｕの感染に依存していた。対照およびＭ　 ａ　Ｔ　ｕ感染ＨｅＬａ細胞は、高密度あるいは希薄培養中で１２日間増殖させ た。細胞は、ヴアーセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）　（ＥＤＴＡ）によって遊離させ、 ＭＡｂ　Ｍ２Ｓと共にあるいはＭＡｂなしでインキュベートし、続いてＦＩＴＣ 結合抗マウスＩｇＧと共にインキュベートした。蛍光の強さを測定した。

抗原結合ＭＡｂ　Ｍ２Ｓは、誘導性のものと思われる。すなわち、該抗体は、希 薄培養で増殖した対照のＨｅＬａ細胞にはなく、高密度培養でのＨｅＬａ細胞の 増殖あるいはＭ　ａ　Ｔ　ｕの感染によって誘起されることがわかった。これら 二つの因子は、付加的あるいは共働作用効果を有することがわかった。これらの 知見と本明細書に記載したその他の結果により、次のことが示唆される。すなわ ち、二つの異なる物質があり、その一つはＭ６７に反応する外因性、透過性のＭ Ｘ。

もう一つはＭＡｂ　Ｍ２Ｓにより検出される内因性、誘導性のＭＮである。

ＭＡｂ　Ｍ２Ｓが、非感染およびＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞の両方において同じ 蛋白質に反応するか否かを確かめ、さらに、該蛋白質の分子量をめるために、そ れらの細胞の抽出物をＰＡＧＥおよびイムノブロッティング（上述の方法による ）により分析した。高密度あるいは希薄培養中で１２日間増殖させた非感染およ びＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞を５ｃ＋ｏのペトリ皿にまき、すべての変異型につ いて細胞数が５×１０５個となるようにした。２日後に細胞をＲＩＰＡ緩衝液で 抽出しく上述）、２００μｌ／皿の量にした。抽出物は、６％のメルカプトエタ ノールを含有する２倍濃縮のレムリ（Ｌａｅｌｌｍｌｉ）のサンプル緩衝液と混 合し、５分間煮沸した。蛋白質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセル ロースにプロットした。プロットは　＋２５１でラベルしたＭＡｂ　Ｍ２Ｓを用 いて展開し、オートラジオグラフィーにかけた。　′ ＭＡｂ　Ｍ２Ｓは、５４ｋｄと５８ｋｄの２本のＭＮ特異的蛋白質のバンドと反 応し、この結果は高密度で増殖した非感染ＨｅＬａ細胞、ならびにＭ　ａ　Ｔ　 ｕ感染ＨｅＬａ細胞において同じであったことから、Ｍ２Ｓは、非感染およびＭ 　ａ　Ｔ　ｕ感染■］ｅＬａ細胞の両方で同じ蛋白質を認識していることが明ら かになった。細胞蛍光測定の結果と併せて考えると、抗原量は、細胞密度とＭ　 ａ　Ｔ　ｕの感染に依存しており、後者がより強力なｐ５４１５８Ｎの誘導因子 である。

Ｍ２Ｓでの結果とは対照的に、別のＭＡｂである、Ｍ６７は、外因性で透過性の 物質ＭＸに特異的と思われる。Ｍ６７においては、細胞が、高密度培養で増殖さ れたかあるいは希薄培養で増殖されたかに関係なく、対照のＨｅＬａ細胞では免 疫蛍光を示さなかった。この相違は　＋２ＪでラベルしたＭＡｂｓ　Ｍ６７およ び〜１７５を用いたラジオイムノアッセイ実験によってはっきり示された。

そのような実験においては、非感染およびＭ　ａ　Ｔ　ｕ感染ＨｅＬａ細胞を高 密度培養あるいは希薄培養で同時培養して増殖させた。培養細胞は、生きたもの （固定しない）か、固定したもの（メタノールで５分間処理後風乾）かである。

培養細胞は、！ｌ！″′ＩてラベルしたＭＡｂｓを６　Ｘ　１０１ｃｍ／皿加え たベトリ皿で２時間インキュベートした。その後、培養細胞をＰＢＳで４回洗浄 し、１ｍｌ／皿の２ＮＮａＯＨて溶解し、γカウンターで放射活性を測定した。

本例の簡単な放射活性法は、ペトリ皿の培養細胞に直接行うものである。ラジオ イムノアッセイの１６の変異型から、ＭＸおよびＭＮが細胞表面あるいは細胞内 に存在しているかが確認でき、これら二つの抗原の発現がＭ　ａ　Ｔ　ｕの感染 およびベトリ皿にまく前の細胞増殖の時の密度にどのように依存しているかが確 認された。生きた固定されていない細胞では、細胞表面の抗原のみがＭＡｂｓと 結合できる。これらの細胞においては、Ｍ６７は培養細胞の如何なる変異型とも 反応を示さなかったが、一方、Ｍ２Ｓは上述の実施例１および２の結果に示すよ うに反応した。

メタノールで細胞を固定することにより、細胞膜はＭＡｂｓを透過させるように なる。Ｍ６７は、事前の細胞密度に関係な（ＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞と反応す るが、対照のＨｅＬａ細胞には結合しない。メタノール固定された細胞内のＭＡ ｂ　Ｍ２Ｓにより、希薄培養由来の非感染ＨｅＬａ細胞には対応する抗原が存在 しないこと、さらに、該抗原は、高密度培養による増殖あるいはＭ　ａ　Ｔ　ｕ の感染により誘導されることが確認された。

非感染またはＭ　ａ　Ｔ　ｕ感染ＨｅＬａ細胞由来のＲＩＰＡ抽出物、あるいは 、対照またはＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞内で再産生された精製ｖＳｖ由来のＭａ Ｔｕ特異的蛋白質のイムノプロット分析を行うこと、抗原ｐ５８Ｘあるいはｐ５ ４１５８Ｎのちどの抗原が動物血清と放射免疫沈降するかということ、さらに、 ｖＳ■変異株の相補性およびプソイド型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）のピリオンの 形成に関与しているかということを調べた。方法の詳細については、バストレコ ヴア（Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ）らによる記載（ＶｉｒｏｌｏｇＹ、　１８７： 　６２０−６２６（１９９２））を参照のこと。

Ｍ　ａ　Ｔ　ｕ感染ＨｅＬａ細胞で免疫したウサギの血清は、ＭＡｂ　Ｍ６７お よびＭＡｂ　Ｍ７５反応性の蛋白質（ｐ５８ｘおよびｐ５４１５８Ｎの両方）の 両方と免疫沈降したのに対し、正常ウサギ、ヒツジあるいは白血病ウシの「自発 的（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ）　Ｊ血清は、Ｍ６７反応性蛋白質（ｐ　５　 ｓ　ｘ）とのみ免疫沈降した。一方、Ｍ　ａ　Ｔ　ｕ感染ＨｅＬａ細胞により産 生され、精製されたＶＳＶは、ｒ１５４１５８ＮのＭ７５反応性のバンドのみが 存在した。このことから、ＭＸとＭＮは、Ｍ　ａ　Ｔ　ｕの独立した構成成分で あると考えられ、ｖＳ■変異株に相補性であり、プソイド型のピリオンに集積さ れるのはり５４１５８Ｎである。

第２Ａ図に示し、下記の実施例５に述べているように、ＭＸ抗原は、Ｍ　ａ　Ｔ 　ｕ感染線維芽細胞内に存在することがわかっている。ザバダ（Ｚａｖａｄａ） とザバドバ（Ｚａｖａｄｏｖａ）は（１９９１年）、ＭＸ感染線維芽細胞由来の ｐ５Ｂのバンドは、ウサギ抗Ｍ　ａ　Ｔ　ｕ血清を用いたＲＩＰでは検出できな かったと報告している。該血清中には、ＳｉＸ抗原よりもＭＮ抗原に対する抗体 が多（含まれていた。この矛盾は、感染培養細胞内におけるＭＸの伝播が極端に 遅いことで説明できる。ザバダ（Ｚａｖａｄａ）とザバドバ（Ｚａｖａｄｏｖａ ）による報告は（１９９１年）、感染後６通口の線維芽細胞に関するものであり 、他方、後の試験は感染４力月後の線維芽細胞に関してである。イムノプロット の結果から、ＭＸは、まず、感染の４週間後にはＨ／Ｆ−Ｎハイブリッドおよび Ｈ／Ｆ−Ｔハイブリッドの両方から検出され、６週後にはＨｅＬａ細胞に検出さ れ、線維芽細胞においては感染１０週後になってようやく検出されることを発明 者らは見出した。

実施例５ ＭＮ特異的およびＭＸ特異的蛋白質の発現第２Ａ図−第２Ｂ図は、ヒト線維芽細 胞、ＨｅＬａ細胞およびＨ／Ｆ−Ｎハイブリッド細胞とＨ／Ｆ−Ｔハイブリッド 細胞内におけるＭＮ特異的およびＭＸ特異的蛋白質の発現をグラフとして示した ものであり、ＭＸ感染および非感染細胞での発現を対比している。細胞は、マイ トマイシンＣで処理したＭＸ感染ＨｅＬａ細胞と共培養することにより感染させ た。感染および非感染細胞は、高密度培養中で３回継代して増殖させた。感染４ 力月後に、感染細胞を非感染細胞と同時にベトリ皿で増殖し、高密度単相を形成 させた。

仝面ベトリ皿（５ｃｃ＋）培養した細胞にラジオイムノアッセイを直接行い、メ タノールで固定した（基本的には上記の実施例３と同様）。細胞の単層はメタノ ールで固定し、＋′ＩでラベルしたＭＡｂｓ　ＭＢ２　（外因性のＭＸ抗原特異 的）またはＭ２Ｓ（内因性ＭＮ抗原特異的）を６　Ｘ　１０’ｃｐｍ／皿加えて 処理した。結合放射活性を測定した。結果は第２Ａ図−第２Ｂ図に示す。

第２Ａ図は、試験した４つの細胞系すべて、すなわち、ヒト胚線維芽細胞、Ｈｅ Ｌａ細胞、およびＨ／Ｆ−ＮハイブリッドとＨ／Ｆ−Ｔハイブリッド細胞、にＭ Ｘが透過したことを示しており、同時に、対応する４つの非感染細胞系にはＭＸ が存在しないことを示している。第２Ｂ図は、ＭＸ感染および非感染ＨｅＬａ細 胞ならびにＨ／Ｆ−Ｔ細胞にはＭＮ抗原が存在するが、線維芽細胞には存在しな いことを示している。対照のＨ／Ｆ−ＮにはＭＮは全く検出されず、ＭａＴｕ感 染Ｈ／Ｆ−ＮにおいてＭＮ抗原のバックグラウンドを越えるわずかな増加が見ら れただけであった。このことから、ハイブリッドにおいては、ＭＮ抗原の発現が 腫瘍形成性と強く関係していることが明らかになった。

これらの結果は、イムノブロッティングにより得られた結果と一致する。ＭＮ特 異的双子蛋白質ｐ５４１５８Ｎは、イムノブロッティングによりＨｅＬａ細胞系 （標準型の両方、すなわちＨｅＬａ　Ｋ、およびスタンプリッジ（Ｓｔａｎｂｒ ｉｄｇｅ）突然変異ＨｅＬａ細胞、すなわちＤ９８／ＡＨ，２あるいはＨｅＬａ 　Ｓ）および腫瘍形成性Ｈ／Ｆ−Ｔにおいて検出されたが、線維芽細胞あるいは 非腫瘍形成性Ｈ／Ｆ−Ｎでは、放射活性を検出するために使用したフィルムをゆ っくりと長時間感光してもｐ５４１５８Ｎは検出されなかった。ＭＸのＨｅＬａ 細胞への感染により、り５４１５８Ｎ蛋白質の急激な濃度上昇がみられた。

ハイブリッド細胞Ｈ／Ｆ−ＮおよびＨ／Ｆ−Ｔは、エリツク　Ｊ、スタンプリッ ）　（Ｅｒｉｃ　Ｊ、　Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ）によって作出された（スタンプ リッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ）胞とヒト線維芽細胞との融合によって作られ、 ヌードマウスにおいては腫瘍形成性ではなかったが、形質転換細胞内のいくつか の特性、たとえば、軟寒天上での増殖など、を保持していた。

染色体１１を失ったハイブリッド由来の分離体（セグレガント）が腫瘍形成性で あることはまれである。これらの分離体における腫瘍形成性に関する最も妥当な 説明は、染色体１１が抑制遺伝子（抗腫瘍遺伝子）を有しており、これが未知の 腫瘍遺伝子の発現をブロックしているということである。該腫瘍遺伝子によって コードされている腫瘍蛋白質は、ヌードマウス内で腫瘍を形成するＨ／Ｆハイブ リッドの能力に対して重大な働きをする。ｐ５４１５８Ｎ蛋白質は、Ｈ／Ｆハイ ブリッドの腫瘍形成性に関連があり、推定腫瘍蛋白質の一つの候補である。

実施例５に示したように、Ｈ／Ｆハイブリッド細胞内の腫瘍形成性において、Ｍ Ｎ抗原が関与することから、その他のヒト腫瘍細胞培養および臨床標本内のＭＮ 抗原の存在を調べることにした。予備実験の結果から、その他のヒト腫瘍細胞培 養の抽出物内のＭＮ抗原の濃度はＨｅ　Ｌ　ａ細胞よりも低いことが示された。

このことから、オートラジオグラフィーにおいては、長時間の感光が必要である ことがわかった。これにより、上述の材料および方法：イムノブロッティングに 従う方法（ここでは、ＭＡｂ　Ｍ２Ｓを結合させたＳＡＣを用いて沈澱させるこ とにより、ＭＮ抗原を濃縮している）により、該方法の感度を増加させた。

細胞培養の抽出物内のＭＮ蛋白質のイムノプロットは、次のものから調製した。

（Ａ）ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞、（Ｂ）ヒト線維芽細胞、（Ｃ）Ｔ２４、（Ｄ）　 Ｔ４７Ｄ、（Ｅ）ＳＫ−Ｍｅｌ　１４７７、および（Ｆ）ＭＸ非感染ＨｅＬａ細 胞。

蛋白質は、３％のメルカプトエタノールを含むかまたは含まない状態（＋ＭＥま たはＯＭＥと表す）でサンプル緩衝液に加えて加熱した後、ＰＡＧＥにより分離 した。つまり、おのおのの抽出物に関し、＋ＭＥについて、次にＯＭＥについて 一回の泳動を行った。レーン（Ａ）（ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞由来の細胞培養抽出 物）については直接分析を行ったが（１０μｌ／レーン）、その他の抽出物（レ ーンＢ−Ｅ）由来の抗原については、５００μ】の抽出物をＭＡｂ　Ｍ２ＳとＳ ＡＣを用いて沈澱させることによりおのおの濃縮した。イムノプロットの結果、 ２つの他のヒト癌細胞系がＭＮ関連蛋白質を含有することが示された。すなわち 、Ｔ２４（膀胱癌：レーンＣ）と７４７Ｄ（乳腺癌；レーンＤ）である。これら の細胞は、ＭＡｂ　Ｍ２Ｓと反応し、還元状態では５４ｋｄと５６ｋｄの分子量 を含有し、非還元状態では約１５３ｋｄの分子量を有する蛋白質を含有している 。これらのバンドの強度は、ＨｅＬａ細胞由来のｐ５４１５８Ｎ双子蛋白質のそ れの少なくとも１０分の１以下である。

ヒトメラノーマ細胞由来の抽出物（ＳＫ−Ｍｅ　１　１４７７　；レーンＥ）の 還元状態では、おおよそ５２ｋｄの位置にごく弱いバンドが観察されたが、ヒト 線維芽細胞抽出物（レーンＢ）では、還元状態でも非還元状態でもそのようなバ ンドはみられなかった。

外科標本を含むヒト組織抽出物のイムノプロットをＭＸ感染ＨｅＬａ細胞由来の 細胞抽出物（レーンＡ）のそれと比較した。他のレーンの組織抽出物は次のもの から調製した。（Ｂ）満期の胎盤、（Ｃ）子宮体部、（Ｄ、　Ｍ）子宮内膜腺癌 、（Ｅ、　Ｎ）卵巣腺癌、（Ｆ、　Ｇ）　トロホブラスト、（Ｈ）正常卵巣、（ １）子宮筋腫、（Ｊ）乳頭腫、（Ｋ）正常乳腺、（Ｌ）高増殖性子宮内膜、（０ ）子宮頸管癌、および（Ｐ）メラノーマ。レーンＡ（１０μｍ／レーンで直接分 析した）を除くその他の全ての抽出物由来のＭＮ関連抗原は、上述のように、ま ず１ｍｌの抽出物から濃縮した。ＭＮ蛋白質は、子宮内膜（レーンＤとＭ）、卵 巣（レーンＥとＮ）および子宮頚管（レーン０）の癌について見つかった。これ らの抽出物においては、ＭＮ関連蛋白質は、約４８ｋｄから約５８ｋｄの間の分 子量を有する３本のバンドとして現れた。乳腺癌の組織抽出物中には別のＭＮ関 連蛋白質が存在しており、該蛋白質は、約４８ｋｄの一本のバンドとして現れた （レーンＪ）。

満期の胎盤（レーンＢ）、正常乳腺（レーンＫ）、高増殖性子宮内膜（レーンＬ ）、正常卵巣（レーンＨ）、および子宮筋腫（レーンＩ）からの抽出物では全く 何も現れてこなかった。トロホブラスト（レーンＦとＧ）およびメラノーマ（レ ーンＰ）からの抽出物においては、ごく弱いＭＮ関連のバンドが現れただけであ った。

ｐ５４１５８Ｎに関連する抗原は、いくつかの型のヒトの癌の臨床標本内では発 現するが、対応する器官の正常組織においては発現しないという所見から、ＭＮ 抗原の腫瘍形成性との関係がさらにはっきりしてきた。しかしながら、ヒト腫瘍 においては、腫瘍は成熟した分化後の細胞から生じるものではなく、分岐および 分化能を有するある種の基幹細胞から生じると考えられるので、正常細胞が本当 に適切な対照となるわけではないことに注意しなければならない。体内器官では 、そのような細胞はきわめて稀である。

試験した全てのを椎動物の染色体ＤＮＡにはＭＮ遺伝子が存在していたことから 、数種の動物種の正常組織由来および腫瘍由来の細胞系についてもＭＮ関連抗原 を調べた。ＭＮ関連抗原は、二つのラット細胞系から見つかった。一つは、ルイ ス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ）により誘起されたラ ット横絞筋肉腫由来のＸＣ細胞系であり、もう一つは、ラット２−Ｔｋ−細胞系 である。これら両方のラット細胞系の抽出物において、一本の蛋白質のバンドが プロット上に認められた。還元ゲルおよび非還元ゲルにより得られたプロットの 分子量は、それぞれ５３．５ｋｄおよび１５３ｋｄであった。

ＭＮ蛋白質のイムノプロットは、（Ａ）ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞、および（Ｂ）ラ ットＴＫ−細胞系（上述のように、３％のメルカプトエタノールを含む（＋ＭＥ ）かまたは３％のメルカプトエタノールを含まない（ＯＭＥ）状態でサンプル緩 衝液に加えて加熱した後、ＰＡＧＥにより分離した）から調製した。これら二つ の細胞系内のＭＮ抗原の濃度は、＋ＭＥおよびＯＭＥの泳動においてほぼ同じで あった。抽出物は直接分析した（４０μｌ／レーン）。

ＸＣ細胞のＭＮ関連蛋白質は、還元および非還元状態のいずれにおいてもラット ２−Ｔｋ−細胞のそれと同様のパターンを示したが、濃度は３０分の１であった 。

二つのラット細胞系（上述のイムノプロットおよび実施例４より）においてＭＮ 関連蛋白質ｐｓ３．５Ｎが発見されたことにより、モデル系の基礎が作られた。

ＭＮ抗原を濃縮し、高感度イムノプロット法を使用しても、試験した他の動物細 胞系にはいずれも検出できる量のＭＮ抗原は含まれていなかった。ＭＮを含有し ていなかった細胞は次のものである。ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞（アフリカミドリザ ル）；マウスＬ細胞；マウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞の正常型、サル白血病ウィルス 感染型あるいはハーヴエイ肉腫ウィルス（Ｈａｒｖｅｙ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉ ｒｕｓ）形質転換型、ＧＲ細胞（ＭＴＶにより誘起されたマウス乳腺腫細胞）； およびＮＭＧ細胞（正常マウス乳腺）。

グルタチオンＳトランスフェラーゼと融合させ、上述のように調製、精製した遺 伝子組換えＭＮ蛋白質、ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮを、クロラミンＴ法（ハンター（ Ｈｕｎｔｅｒ）ら、１９７８年）により１２５■でラベルした。精製した蛋白質 により、ＭＮ特異的抗体ならびにＭＮ抗原の定量ＲＩＡを行うことができた。抗 体の希釈および抗原の希釈はすべて、１％のウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を添加し たＲＩＰＡ緩衝液（１％のトライトンＸ−１，００（ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００ ）および０．１％のデオキシコール酸ナトリウムのＰＢＳ（ＩＪン酸緩衝生理食 塩水、ｐＨ７，２）溶液で行った。組織および細胞の抽出物は、１ｍＭのフッ化 フェニルメチルスルフォニルおよび１ｍｌあたり２００トリプシン阻害ユニツト のトラシロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）　（アプロチニン）を添加し、Ｆｅ２を含 まないＲＩＰＡ緩衝液で調製した。１２５■でラベルしたｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ 　（２，２７μＣｉ＃ｚｇのＴＣＡ沈降活性を有する蛋白質）は、使用前に１％ のＦｅ２を含むＲＩＰＡで希釈し、非特異結合放射活性をプロティンＡ固定黄色 ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）　（ＳＡＣ）の懸濁 液で吸着した。

ＭＮ特異的抗体に関するＲＩＡにおいては、ＭＡｂを含む腹水あるいは試験血清 を１２５Ｉでラベルした蛋白質と混合し、総量がｌｌ１ｌｌとなるようにして室 温で２時間反応させた。次に、５０μｌのＳＡＣの１０％懸濁液（ケスラー（Ｋ ｅｓｓｌｅｒ）ら、同上）を加え、得られた混合物を３０分インキュベートした 。最後に、ＳＡＣを沈澱させ、ＲＩＰＡで３回洗浄し、結合放射活性をγカウン ターで測定した。

ＭＮ抗原に対する抗体の滴定の結果を第３Ａ図−第３Ｂ図に示す。Ｍ７５ハイブ リドーマ細胞を含有するマウスの腹水（Ａ）は、１　：　１．４Ｘ１０−６希釈 において５０％終点を有することを示している。同時に、ＭＸ蛋白質（Ｍ２Ｏお よびＭ６７）に特異的なＭＡｂｓを含有する腹水は、１：２００希釈においても １２５■でラベルしたｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮとは沈降しなかった。正常ウサギ血 清（Ｃ）は、ＭＮ抗原とははっきりとは沈降しなかった（結果は示していない） 。生きたＭＸ感染ＨｅＬａ細胞で免疫したウサギから得られたウサギ抗Ｍ　ａ　 Ｔ　ｕ血清（Ｂ）は、１：２００に希釈したときに放射活性ＭＮ蛋白質と７％の 沈降を示した。実施例４（上述）に示すようなイムノプロットにより、ウサギ抗 ＭａＴｕ血清は、ＭＸおよびＭＮのいずれの蛋白質とも沈降を示した。

試験した１８０のヒト血清（９０の対照、および、乳房、卵巣、子宮頸管癌の患 者からの９０の血清）の中からただ一つだけが、放射活性ラベルされた組換えＭ Ｎ蛋白質と明かに沈降した。その血清Ｌ８（Ｄ）をイムノプロット（実施例４） で再試験したが、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞由来の１）５４１５８Ｎのいずれとも沈 降しなかった。さらに、ＫＨ（Ｅ）を含む６つの他のヒト血清もイムノプロット で反応しなかった。つまり、ＲＩＡでただ一つ反応したヒト血清Ｌ８は、遺伝子 組換え産物とのみ反応し、ＨｅＬａ細胞で発現した、生来のＩ）５４１５８Ｎと は反応しなかった。

ＭＮ抗原に対するＲＩＡにおいては、ＭＡｂ　Ｍ２Ｓの希釈液（事前の試験で５ ０％の最大沈降放射活性（＝１：１．４Ｘ１０−”希釈）を示した）を細胞抽出 物の希釈物と混合し、２時間反応させた。次に　＋２ＪでラベルしたｐＧＥＸ− ３Ｘ−ＭＮ　（２５ｘｌＯ’ｃｐｍ／チューブ）を加え、さらに２時間反応させ た。最後に、ＭＡｂ　Ｍ２Ｓに結合した放射活性をＳＡＣで沈降させ、上述のよ うに洗浄した。１００％の沈降（＝阻害なし）を、用いた希釈ＭＡｂによる最大 放射活性結合と見なした。試験に用いた細胞抽出物中のＭＮ抗原の濃度は、［コ ールド（ｃｏｌｄ）　ＪのｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮを標準として使用した阻害曲線 から計算した（第４図のＡ）。

放射活性ラベルしたｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ蛋白質とＭＡｂ　Ｍ２Ｓとの反応から 、細胞抽出物中のＭＮ抗原を直接的に定量することができた。第４図は、３％ｇ の「コールド」のｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ　（Ａ）が、「ホット（ｈｏｔ）　Ｊの ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮと５０％の沈降阻害を起こしたことを示すものである。同 量のＭＮ抗原が、ＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞（Ｂ）およびラット２−Ｔｋ−細胞 （Ｃ）から抽出した３　Ｘ　１０’ｎｇの蛋白質にも存在している。本実験のＲ ＩＡで測定した細胞抽出物中の蛋白質の濃度を下記の表１に示す。細胞抽出物中 のＭＮ抗原は、ある程度の異なる大きさであるということ、また、遺伝子操作さ れたＭＮ蛋白質は、さまざまな大きさの分子を含有するものであることから、計 算値は絶対的なものではないことに注意されたい。

表　１ 細胞抽出液中のＭＮ抗原の濃度 細胞種　ｎｇ　ＭＮ／ｍｇ　総蛋白質 Ｈｅ　Ｌ　ａ　＋ＭＸ　９３９．０ ラツト２−　Ｔ　ｋ　−１０６５，００ＨｅＬａ　２７．５０ ＨＥＦ　０．００ データは、第４図に示す結果に基づいて計算した。

実施例９ ｐ５８Ｘ蛋白質のおよその濃度は、Ｍ　ａ　Ｔ　ｕ感染ＨｅＬａ細胞の抽出物の ＲＩＰによりめることができ、ここで、該抽出物は　［３９Ｓ］メチオニンある いは［１４Ｃ］アミノ酸混合物で代謝的にラベルしたものである。これらの結果 を表２代謝的にラベルしたｐ５８Ｘ蛋白質の放射免疫沈降放　耐汗　性 ラベル　間隔　細胞種　総　量　ＭＡｂ　Ｍ１６＋ＳＡＣｐ５８Ｘ中（Ｄ％ｃｐ ｍｃＩ）ｍ　Ｘ　１０−６　との沈降Ｃｐｆｆｌ　Ｘ　ＩＱ−３沈澱１　沈澱２ 　（沈澱１＋２） Ａ　ＨｅＬａ　７．８５０　１１．４５５　７．６３１　０ＨｃＬａ＋ＭＸ　９ ．３３７　９３．７９７　１２．１１７　０．８９１１Ｒ３メチオニンー−一一 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−一一−−−−−Ｂ　［１ｅＬａ　６． ２７０　７．２９９　５．９４７　０ＨｅＬａ＋ＭＸ　６．４６９　６７．０９ ９　７．３４６　０．９３５Ａ　ＨｅＬａ　４．２２３　６．４２３　４．１６ ８　０ｆｌｅＬａ＋ＩＩＸ　３．５７７　２９．２８０　４．９３６　０．７０ ５１４Ｃアミノ酸　□ Ｂ　ＨｅＬａ　３．２６６　４．９１５　３．８０５　０［１ｅＬａ＋ＭＸ　２ ．６２７　２４．３２３　４．３４６　０．８２４放射活性カウントは、皿ごと の総ＣｐｌＱまたは免疫沈降放射活性ｃｐｓである。間隔二Ａは細胞を終夜かけ てラベルした。Ｂは２４時間追跡後の同時培養。

表２に示す結果から、ｐｓｓｘは、細胞抽出物中の蛋白質のおよそ０．８％を占 めることがわかった。

ラベルしたアミノ酸と共に終夜培養した培養細胞および並行培養（アミノ酸を完 全に補充した「コールド」の培地でさらに２４時間インキュベートしたもの）の 培養細胞からも非常に近似した値が得られた。これらの結果は、得られた放射活 性の値が既に平衡状態にあることを反映したものであり、取り込みの速度を表し たものではないことを示しており、該値は、抽出物中のｐｓｓｘの実際の含量と 大差はない。［３５３］メチオニンでラベルした細胞の抽出物のｐｓｓｘの値は 、［＋４（：］アミノ酸混合物でラベルした培養の抽出液内のそれと同程度であ った。

実施例１０ 対照およびＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の免疫電子および走査顕微鏡性上記の実施例１ に示したように、ＭＡｂ　Ｍ２Ｓを用いた直接免疫蛍光法により検出されたＭＮ 抗原は、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の膜表面および核内あるいは高密度培養で増殖さ せたＨｅＬａ細胞内に存在している。ＭＮ抗原の所在をさらに明らかにさせるた めに、免疫電子顕微鏡法を用いた。該方法においては、ＭＮ抗原に結合したＭＡ ｂ　Ｍ２Ｓを免疫金（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ）ビーズで視覚化した（ヘルゾーグ （Ｈｅｒｚｏｇ）ら、「細胞表面域判定のためのコロイド金ラベリング法（Ｃｏ ｉｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎ ｇ　ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｒｅａ）　Ｊコロイド金（ＣI２ １１ｏｉｄａｌ　Ｇｏｌｄ）第３巻（ハヤット（［Ｉａｙａｔ）　、　Ｍ、　Ａ 、編）より、１３９−１４９ページ（アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ）社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）参照）。

ＭＸ非感染（対照）およびＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の超薄片を免疫金を含むＭＡｂ 　Ｍ２Ｓおよび含まないＭＡｂ　Ｍ２Ｓで染色した。（いくつかの細胞は、包埋 し、切断する前にＭ２Ｓと免疫金で固定し、処理した。この操作により、免疫全 装飾が細胞表面の抗原に対してのみ施される。いくつかの細胞は、包埋し、切断 した後にのみＭ２Ｓと免疫金で処理した。こうすると、細胞内の抗原も装飾され る。免疫金で処理しなかったいくつかの細胞は、細胞分裂の末期のものである。

） 染色した細胞の免疫電子および走査顕微鏡像から、細胞内のＭＮ抗原の局在が示 され、さらに、対照およびＭＸ感染ＨｅＬａ細胞とでは微細構造にかなりの違い があることが見出された。対照のＨｅＬａ細胞は、その表面に、金ビーズで視覚 化されたＭＮ抗原をほとんど有していないことが示された。細胞表面は比較的滑 らかで、２つの小さい突起を有するだけであった。細胞質内にはミトコンドリア は見られなかった。これとは対照的に、Ｍｘ感染ＨｅＬａ細胞では、表面にたく さんの密集した糸状突起がみられた。はとんどのＭＮ抗原はこれらの糸状体の上 に局在しており、該抗原は、染色に免疫金を用いた場合には免疫金によって修飾 されていた。ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の細胞質には多くのミトコンドリアを含んで いるのが見られた。ＭＮ抗原は、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の核にあった。ＭＮ抗原 は核質の中にい（らか存在していたが（おそらくクロマチンと結合しているので あろう）、より高濃度のＭＮ抗原は核小体に存在していた。繰り返すと、正常Ｈ ｅＬａ細胞の細胞表面は比較的滑らかであり、一方、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の表 面には多数の糸状体と「水ＫＡ　（ｂｌａｂｓ）　Ｊがある。糸状体のいくつか は、近隣の細胞とつながる橋を形成しているように見える。

インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で形質転換された細胞とそれらの正常親細胞を 比較したいくつかの例において注目すべきことは、相違点の一つが、正常細胞の 表面は滑らかであるが、形質転換された細胞の表面には多数の毛髪状の糸状体を 有するということである（ダーネル（Ｄａｒｎｅｌ　ｌ）ら、「分子細胞生物学 （ｌｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１Ｉ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　Ｊ　（第２版）、サイ エンスアメリカンブック７、　（Ｓｃｉ、　Ａｍ、　Ｂｏｏｋｓ）、Ｗ、　Ｈ， フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）株式会社、米国、ニューヨーク州（１９９０年） ）。

これらの特徴からすると、本実施例の顕微鏡像で明らかにされたように、ＭＸ感 染ＨｅＬａ細胞は超形質転換した外観を呈している。

さらに、数種の腫瘍では、ミトコンドリアの増幅が報告されている（ベーン／’ ％−ド（Ｂｅｒｎｈａｒｄ）　、Ｗ、　、ｒ分子細胞学ハンドブック（Ｈａｎｄ ｂｏｏｋ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｙｔｏｌｏｇｙ）　Ｊ　、６８７−７１ ５ページ、す７−デ・ファリア（Ｌｉｍａ　ｄｅ　Ｆａｒｉａ）編、ノースホラ ンド（Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌ　１ａｎｄ）出版株式会社、アムステルダムーロンド ン（１９７２年））。そのような増幅は、ヤーヌス緑（Ｊａｎｕｓ’　ｇｒｅｅ ｎ　）で特にミトコンドリアが強く染色されたＭＸ感染ＨｅＬａ細胞において顕 著であり、一方、対照のＨｅＬａ細胞では弱くしか染色されなかった。

電子顕微鏡の熟練者によっても、腫瘍細胞に特異的な構造的特徴は見出すことが できなかったことを付記しておく。

ｐ５４１５８Ｎ蛋白質の両方が一つの遺伝子によってコードされているか否かを 確認するために、アンチセンス０ＤＮｓを用いて以下の実験を行った。過密培養 を作るために、事前に希薄培養していたＨｅＬａ細胞をまき、ＭＮ　ｍＲＮＡの ５°末端に相補的で２つの遺伝子に特異的な０ＤＮｓの非存在下および存在下で １３０時間インキュベートした。ＨｅＬａ細胞は、１０％のＦｅ２を含むＤＭＥ Ｍｌｍｌあたり８Ｘ１０５個となるように継代した。同時に、次のように０ＤＮ ｓを培地に添加した。（Ａ）２９−ｍｅｒ　０ＤＮＩ　（５°　ＣＧＣＣＣＡＧ ＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧ３°　（ＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎ ｏ、　：３）　、４４−７２位に相補的）を４μＭ（最終濃度）、（Ｂ）１９− ｍｅｒ　０ＤＮ２　（５’　ＧＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＧＧ３”　（ ＳＥＱ、ＩＤ、ＮＯ，：４）　、１２−３０位に相補的）を４μ証（最終濃度） 、（Ｃ）ＣＤＮＩおよび０ＤＮ２をおのおの２μＭ（最終濃度）、（Ｄ）同様に 処理したが、０ＤＮｓを加えずにインキュベートしたものであり、対照とする。

１３０時間後に細胞から抽出物を調製し、１２５ＩでラベルしたＭＡｂｓＭ７５ を用いたイムノプロットにより分析した。細胞の蛋白質抽出物は、ＭＡｂｓＭ７ ５を用いたイムノプロットおよびＲＩＡにより分析した。　ＯＤＮ　ｓを添加し たＨｅＬａ細胞の培養の結果、ｐ５４１５８Ｎ合成がかなり阻害されていること がわかった。最終濃度４μ舅の１９−ｍｅｒ　０ＤＮ２が非常に効果があり、Ｒ ＩＡで測定したところ、４０％の阻害を起こした。一方、２９−ｍｅｒＯＤＮＩ 　（４μＭ）および２つの０ＤＮｓの組合せ（おのおの最終濃度２μＭ）では効 果は低くなり、ＲＩＡで２３−３５％のＭＮ関連蛋白質の増加を示した。このと き、特異的ＭＡｂ　Ｈ４６０を用いたＲＩＡで測定した、別のＨｅＬａ細胞蛋白 質の量は、全ての細胞変異種においてほぼ同程度であった。最も重要なことは、 イムノプロットにおける０ＤＮｓによる特異的阻害は、ｐ５４１５８Ｎ蛋白質の 両方に影響を与えていることである。このことから、発明者らがクローンしたＭ Ｎ遺伝子は、ＨｅＬａ細胞内においてｐ５４１５８Ｎ蛋白質の両方をコードして いると結論づけられる。

ヒト細胞系のＭＮ　ｍＲＮＡのノーサンブロツティングを行った。全ＲＮＡは、 次の細胞系からグアニジンチオシアネートＣｓＣ１法により調製した。高密度（ Ａ）および希薄（Ｂ）培養で増殖したＨｅＬａ細胞；　（Ｃ）ＣＧＬＩ　（Ｈ／ Ｆ−Ｎ）ハイブリッド細胞、（Ｄ）ＣＧＬ３分離体および（Ｅ）ＣＧＬ４分離体 （両者ともＨ／、Ｆ−Ｔ）、ならびに（Ｆ）ヒト胚線維芽細胞。１５μｇのＲＮ Ａを１゜２％のホルムアルデヒドゲルで分離し、ハイボンドＣスーパーメンブレ ン（Ｂｙｂｏｎｄ　Ｃ５ｕｐｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）　（アマジャム（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ）社）の上にプロットした。ＭＮｃＤＮＡのＮｏｔｌプローブを、ラ ンダムプライミング（マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（Ｍｕｌｔｉｐ ｒｉｍｅ　ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）、（アマジャム（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）社）を用いてラベルした。５０％のホルムアミド存在下４２℃で ハイブリダイゼーションを行い、０．１％の５ＳＰＥと０．１％のＳＤＳを用い て６５℃で最終洗浄を行った。ＲＮＡラダー（ＲＮＡ　１ａｄｄｅｒ）　（０， ２４−９，５ｋｂ）　（ベセスダ研究所（ＢＲＬ）　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、米国、メリーランド州、ベセス ダ）をサイズマーカーとして用いた。

検出されたのは１．５ｋｂのＭＮ特異的ｍＲＮＡで、２つの腫瘍形成性分離体ク ローン、ＣＣｌ２とＣＣｌ２　（Ｈ／Ｆ−Ｔ）からのみであり、非腫瘍形成性ハ イブリッドクローンＣＧＬＩ　（Ｈ／Ｆ−Ｎ）あるいは正常ヒト線維芽細胞から は検出されなかった。さらに、１．５ｋｂのｍＲＮＡは、高密度培養で増殖した ＨｅＬａ細胞からは検出されたが、希薄培養のものからは検出されなかった。

このように、ＭＮ関連蛋白質が腫瘍形成性と関連しているということについてノ ーサンブロツティングの結果は、上述の実施例の結果と一致している。

いろいろなを椎動物のゲノムＤＮＡ中のＭＮ遺伝子をササンブロッティングによ り検出した。次のものの染色体ＤＮＡを５ｓｔＩで消化した。（Ａ）ニワトリ、 （Ｂ）ウシ、（Ｃ）ネコ、（Ｄ）ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞、（Ｅ）？ウスＮ　Ｉ　 Ｈ３Ｔ３細胞、（Ｆ）ヒト胎盤細胞、（Ｇ）ＨｅＬａ細胞、（Ｈ）ヒツジ、（１ ）ヒトメラノーマ細胞、および（Ｊ）サルベロ（Ｖｅｒｏ）細胞。制限酵素によ る断片を、０．７％の寒天ゲルで分離し、ハイボンドＮメンブレン（Ｈｙｂｏｎ ｄ　Ｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）（アマンヤム（＾ｍｅｒｓｈａｍ）社）の上にアル カリプロットした。ＭＮ　ｃＤＮＡプローブのラベリングおよびハイブリダイゼ ーションの操作は、実施例１２のノーサンプロット分析と同様に行った。

染色体ＤＮＡの５ｓｔＩ制限酵素断片を用いたササンプロット分析は、いずれの 種においても、約１．５ｋｂのところに唯一のバンドを示した。さらに、Ｘｈｏ Ｉおよび５ａｌＩによる切断によって生じた制限酵素断片を用いたハイブリダイ ゼーションにおいては、おのおのの染色体ＤＮＡサンプルは４．５ｋｂおよび４ ．７ｋｂにそれぞれ１本のバンドを示した。これらの結果から、を椎動物のゲノ ムにおいては、ＭＮ遺伝子は単一のコピーとして存在していることが示唆される 。さらに、これらの結果は、ＭＮ遺伝子がその側面配列と共に保存性であること を示唆している。

５ｓｔｌの開裂部位がＭＮ遺伝子における自然な境界を形成し、ＭＮ　ｍＲＮＡ のサイズがノーサンプロットにおけるＭＮ遺伝子のサイズと同じであることから （実施例１２の結果と比較されたい）、ＭＮ遺伝子にはイントロンが存在しない と推論される。この結論は、ＭＮ　ｃＤＮＡの制限酵素パターンとＭＮ特異的ゲ ノムの５ｓｔＩ断片のそれとが同じであることからも支持される。

下記に挙げる材料は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　（ＡＴＣＣ）　（米国 、メリーランド州、ロツクヴイル、パークローン通り（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ ｉｖｅ）　１２３０１番地、郵便番号２０８５２）に寄託されている。寄託は、 特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐ ｅｓｔ　Ｔｒｅａｔｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｃｏ ｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ@Ｍｉｃｒｏ。

ｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｐｏｓｅｓ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔ　 Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ　ｔ■■窒■浮獅р■秩 j （ブダペスト条約）に基づいてなされた。生細胞培養の維持は寄託の日から３０ 年間保障されている。微生物は、ブダペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣから 入手可能であり、寄託者とＡＴＣＣは、関連する米国特許が付与されると制限さ れることなく入手できることについて合意している。寄託した株が入手可能でき るとは言っても、ある政府機関がその国の特許法に基づいて許可する権利に違反 して発明を実施する実施権を与えるということではない。

ハイブリドーマ　！氏旦　ＡＴＣＣ番号ＶＵ−Ｍ２Ｓ　１９９２年９月１７日　 ＨＢ　１１２８本発明に関する以上の具体例の記述は、例示および説明のための ものである。

これらの具体例は全てではなく、また、開示された特定のものに発明を限定する ものでもない。さらに、以上の教示から多くの修正や変形が可能なことは明かで ある。以上の具体例は、本発明の詳細な説明するため、および、当該業者が図す る特定の使用に適するようにさまざまな修正を加えた各種の態様で本発明を利用 できるようにするために、選択して記載したものである。本発明の範囲は、明細 書に添付された請求項によって定められる。

引用した全ての文献は、参考のために本明細書に取り入れられている。

ＦＩＧ、／Ａ。

＋３０６　ＣＡ丁　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＧ　ＡＧＣＣＧＧ　ＴＡＡ　ＣＴＧ　 丁ＣＯＴＧＴ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＣＡ丁　ＴＡＴ　ＧにＣ１３５１ＡＣＴ　ＴＣ ＣｎＴ　ＴＡＡ　ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　’ＡＡＴ　ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＡＡＡ 　ＴＡＡ　ＡＴＡ　ＴＴＴ　ＡＴＡ１３９６　ＡＴ ＦＩＧ　／１３゜ ＦＩＧ、２Ａ。

ＦＩＧ、２Ｂ。

与Ｊ、７　２ＪＩＸＷｄｌ 鬼＋−３，づ　、−０１Ｘ　Ｈｄ口 ＩＧ　４ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内Ｗ　理番号Ｃ０７Ｋ　１４／４７ 　８３１８−４Ｈ１６／１８　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　７０５５ −２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、ＳＥ ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ 、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　Ｋ Ｐ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、〜ｉＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、ＮＯ，ＮＺ、Ｐ Ｌ、ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ ＦＩ Ａ６１Ｋ　４９１０２　Ａ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ｃ （７２）発明者　ザバダ、ヤン チェコ国　１６０　００　プラム　６　す　ペクネ　ヴイリドス　１ （７２）発明者　パストレコヴ乙シルヴイアスロヴアキア国　８４１　０７　ブ ラティスラヴア　アイ　ブコフカナ　１８ （７２）発明者　パストレク、ヤロミールスロヴアキア国　８４１　０７　ブラ ティスラヴア　アイ　ブコフカナ　１８

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．単離されたＭＮ遺伝子および／またはその断片、あるいは該ＭＮ遺伝子また はその断片と実質上相補的である、単離された核酸配列を含むことを特徴とする 組成物。
2. ２．第１Ａ図一第１Ｂ図［ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１］に示されるｃＤＮＡ配列ま たはその断片に実質上相補的な核酸配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の組成物。
3. ３．前記ＭＮ遺伝子またはその断片、あるいは前記ＭＮ遺伝子またはその断片と 実質上相補的である核酸配列がベクターに含まれていることを特徴とする請求の 範囲第１項記載の組成物。
4. ４．前記核酸配列が、前記ベクター内の発現コントロール配列に機能的に結合し ていることを特徴とする請求の範囲第３項記載の組成物。
5. ５．請求の範囲第４項記載の組成物で形質転換またはトランスフェクトした原核 細胞または真核細胞である単細胞宿主。
6. ６．ＭＮ遺伝子および／またはその断片によりコードされている蛋白質および／ またはポリペプチドを含むことを特徴とする組成物。
7. ７．前記蛋白質および／またはポリペプチドが、第１Ａ図一第１Ｂ図［ＳＥＱ． ＩＤ．ＮＯ．２］に示されるアミノ酸配列またはその一部、あるいは該アミノ酸 配列またはその一部の変異体および／または第１Ａ図一第１Ｂ図に示されるアミ ノ酸配列に実質上相補的な蛋白質および／またはポリペプチドからなることを特 徴とする請求の範囲第６項記載の組成物。
8. ８．ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮであることを特徴とする請求の範囲第７項記載の組成 物。
9. ９．ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに特異的に結合する単一の抗体または複数の抗体 を含むことを特徴とする組成物。
10. １０．前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第９項 記載の組成物。
11. １１．前記モノクローナル抗体がＭ７５と称され、ＡＴＣＣにＡＴＣＣ番号ＨＢ １１１２８として寄託されているハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５から産生されるこ とを特徴とする請求の範囲第１０項記載の組成物。
12. １２．前記抗体が、化学療法剤もしくは毒性剤および／またはイメージング剤と 結合していることを特徴とする請求の範囲第９項記載の組成物。
13. １３．ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに対する特異的結合性を有するモノクローナル 抗体を産生するハイブリドーマを含むことを特徴とする組成物。
14. １４．患者の腫瘍性疾患をイメージングする方法であって、ａ．請求の範囲第１ ２項記載の抗体を適切にラベルして該患者に投与し、次に、ｂ．該ラベル化した 抗体の結合を検出することを含むことを特徴とする方法。
15. １５．癌細胞に化学療法剤または毒性剤を輸送する方法であって、請求の範囲第 １２項記載の抗体に該細胞を接触させることを含むことを特徴とする方法。
16. １６．ＭＮ蛋白質またはポリペプチドを組換えにより産生する方法であって、ａ ．請求の範囲第４項記載の組成物を用いて単細胞宿主を形質転換し、ｂ．該単細 胞宿主を培養してＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドを発現させ、次に、 ｃ．該ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドを抽出し単離する、各工程を含む ことを特徴とする方法。
17. １７．脊椎動物サンプル中のＭＮ抗原を検出および／または定量する方法であっ て、ａ．該サンプルを請求の範囲第９項記載の単一または複数の抗体と接触させ 、ｂ．該サンプル中の抗原に対する該抗体の結合を検出および／または定量する 、各工程を含むことを特徴とする方法。
18. １８．脊椎動物サンプル中のＭＮ特異的抗体を検出および／または定量する方法 であって、 ａ．脊椎動物のサンプルをＭＮ蛋白質／ポリペプチドと接触させてインキュベー トし、次に、 ｂ．該サンプル中の抗体に対する該ＭＮ蛋白質／ポリペプチドの結合を検出およ び／または定量する、 各工程を含むことを特徴とする方法。
19. １９．一つもしくはそれ以上の実質的に純粋なＭＮ蛋白費および／またはポリペ プチドが免疫原となる量で存在して、生理学的に許容性で非毒性の基剤中に分散 されたワクチンであって、該量がＭＮタンパク質の発現に関連する腫瘍性疾患に 対して脊椎動物を免疫するのに有効な量であることを特徴とするワクチン。
20. ２０．ＭＮ遺伝子から伝写されたｍＲＮＡに実質的に相補的なアンチセンス核酸 配列を投与することにより、ＭＮ遺伝子の発現を阻害することを含むことを特徴 とする、腫瘍性疾患および／または前腫瘍性疾患の治療法。