JPH07501930A - 酵母人工染色体およびその遺伝子発現制御における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５、該外来遺伝子または遺伝子座が胚性立体配座に存在する前記請求項いずれが １つに記載の細胞。

６、実質的に酵母ＤＮＡがない前記請求項いずれが１つに記載の細胞。

７、少なくとも１００ｋｂの外来遺伝子または遺伝子座および原核生物または酵 母細胞でない細胞における選択を可能とするマーカー遺伝子を包含する酵母人工 染色体　（ＹＡＣ）。

８、該マーカーがネオマイシン、ハイグロマイシンまたはＨＰＲＴに対する抵抗 性についてのものである請求項７記載のＹＡＣ０９、該外来遺伝子または遺伝子 座および／またはマーカー遺伝子が請求項３がら５のいずれか１つに記載したも のである請求項７または８記載のＹＡＣｏｌｏ、少なくとも１００ｋｂの外来遺 伝子または遺伝子座を包含するトランスジェニック非ヒト動物。

１１、池の動物の産物を発現できるが、対応する自身の産物を発現できないトラ ンスジェニック非ヒト動物。

１２、該他の動物がヒトである請求項１１記載の動物。

１３、請求項１０および請求項１１または請求項１２記載の動物。

１４、泌乳動物で、該遺伝子産物がそのミルクがら分離可能な請求項１０がら明 細書 酵母人工染色体およびその遺伝子発現制御における使用発明の分野 本発明は、酵母人工染色体およびその操作および遺伝子発現の制御を開発するた めの細胞および動物への移入、また得られた細胞および動物に関する。

発明の背景 外来ＤＮＡで適当な宿主を形質転換し、かくして通常その宿主によって産生され ていない遺伝子産物を発現させる能力は、バイオテクノロジー研究の重要なゴー ルである。望ましい特性を有する高等動物も産生されてきたにもかかわらず、所 望のタンパク質を産生ずるために微生物を用いることができる。例えば、欧州特 許出願第０２６４１６６号、ＷＯ−Ａ−８８００２３９、ＷＯ−Ａ−８８０１６ ４８、ＷＯ−Ａ−９００５１８８およびＷＯ−Ａ−９２１１３５８は、そのミル ク中に生産されその中から分離可能な外来タンパク質を発現する泌乳動物の使用 を記載している：これは、非常に満足でき、制御される純粋なタンパク質源を提 供している。

クローン化したＤＮＡを哺乳動物細胞およびトランスジェニック動物へ移行する 技術は、遺伝子の制御および発現の研究を非常に容易にした。また、遺伝子トラ ンスフェクション実験は、数多（の限定された大きさのクローン化したＤＮＡ分 子が、発現を制御すると信じられる多数の離れた調節配列の効率的な使用を妨げ るという事実を強調している。

さらに詳細には、遺伝子集団を有する複合遺伝子座（ｃｏｍｐｌｅｘ　ｆｏｃｉ ）および染色体ドメインの調節を研究するためには、非常に大きなりＮＡ断片を 細胞および動物に導入することが不可欠である。トランスジェニック動物技術に おいて用られた通常のアプローチには限界があり、１００ｋｂを超えるＤＮＡ断 片を導入することを困難としている：ブリュッゲマン（Ｂ　ｒＬｌｇｇｅｍａｎ ｎ）ら、ユーロビアン°ジャ２６頁（１９９１）参照。例えば、生殖性依存型の ゲノムインプリンティング（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｉａ＋ｐｒｉｎｔｉｎｇ）が、多 くの遺伝子が同様に調節されうる広い範囲にわたり影響しつるにもかかわらず、 そのような［インプリントチイツト（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ）Ｊドメインを研究す る効率的な方法はない。大きなりＮＡ断片を導入するための満足のい（技術は、 哺乳動物の成長に非常に重要な数多くの遺伝子がマツプされている（特異的な欠 損を隠す）Ｔ−複合体のごとき、他の複合遺伝子座の分析を発展させ、また容易 するであろう。真核生物遺伝子の調節をより理解するためには、クローニングお よび細胞への再導入の後に、真正なゲノムの状況（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｃｏｎｔｅ ｘｔ）においてこれらの遺伝子を発現させることが望ましいであろう。

哺乳動物遺伝子の発現は、種々のレベル、該ゲノムの状況（近隣遺伝子の影響） 、エクソンに隣接する調節エレメント（例えば、プロモーター）、終止コドンの 下流にある調節配列（ポリアデニル化サイト）および暗号配列から遠く離れた調 節モチーフ（例えば、エンハンサ−）にて制御されている。イムノグロブリン遺 伝子については、エンハンサ−・モチーフが欠けると外来遺伝子の発現は低下す ること、およびこれらのモチーフは最も近隣のエクソンから数千塩基対離れたと ころに存在する場合がある（重鎖３°−エンハンサ−では２５ｋｂ）ことが示さ れている。　治療目的に使用されるキメラ、外来および真正の抗体の免疫原性に 対する疑問に精力を傾けるため、マウス・モデルが確立されている；ブリュツゲ マン（Ｂ　ｒｕｇｇｅｍａｎｎ）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・ メデイシン（Ｊ　、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　）　、１ヱＯ：２１５３頁（１９８ ９）参照。真正のタンパク質だけが免疫系の監視を逃れるということが明らかに なってきた。

ヒト抗体生産のため現在用いられる技術は、ヒトリンパ球のｉｎ　ｖｉｔｒｏ免 疫化および永続培養または遺伝子工学の一方を、包含する。体外で希少な特異的 抗体を産出するヒトリンパ球を選択することは困難であり、一旦その系が得られ てもそれらの産出量および安定性は低い：ボーレベック（Ｂ　ｏｒｒｅｂａｅｃ ｋ）　、イミュノロジカル・トウディ（Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ）　、 ９　：　３５５頁（１９８８）参照。（薩歯動物抗体の［ヒト化（ｈｕｍａｎｉ ｓａｔｉｏｎ）　Ｊとも名付けられている）遺伝子工学は、第１に、治療用途の 各個別のマウスまたはラット抗体について行わなければならず、第２に、完全に はヒト抗体を得ていない：リーチマン（Ｒ１ｅｃｂＩｌａｎｎ）ら、ネイチ＋　 −（Ｎａｔｕｒｅ）　、３３２　：　３２３頁（１９８８）参照。すでに治療用 に許可されている［ヒト化（Ｈｕ■ａｎｉｓｉｎｇ）　Ｊの存する醤歯動物抗体 は、免疫原性のより少ない試薬を得るのに現在量も成功した方法である。しかし 、ヒトの物質で免疫した後、真正なヒト抗体を産生ずるのに利用できるマウス系 統を得るのが重要な改良であろう。

生殖性配置に挿入されたヒト抗体遺伝子断片を有するトランスジェニック・マウ スからイミュノグロブリンのレパートリ−が得られている。ＷＯ−Ａ−９００４ ０３６およびブリュッゲマン（Ｂ　ｒｕｇｇｅｍａｎｎ）ら、プロシーディング ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・イン・ニーニスエイ（ ＰＮＡＳ）、８６：６７０９頁（１９８９）参照。可変部遺伝子（ＶＳ）、多様 性セグメント（Ｄｓ）、結合セグメント　（Ｊ　ｓ）およびμ定常領域遺伝子（ Ｃμ）でヒトのミニＩｇＨ遺伝子座が構築されている。該ヒト遺伝子セグメント は、これらのマウスのリンパ組織で転位しくＶＤ　Ｊ−Ｃμ）、免疫化した後に ヒトμＨ鎖を有する抗体を得ることができる。しかし、マウスＩｇＭとは対照的 にヒトＩｇＭのレベルは低く、免疫後のヒトμ鎖を有する特異的なハイブリドー マは稀である。

さらに複雑なことには、ヒトμ鎖を産生ずるこれらの細胞のほとんどは、内因性 のマウスＩｇも分泌する。このことは、ヒトμの転位は内因性の転位を停止しな いということを意味する：言い換えると、対立遺伝子排除は達成されていない。

さらに、産生されたヒト抗体の実際のレパートリ−の大きさは未知であるが、Ｉ ｇｌ（構築物が限定された数のＶおよびＤセグメントだけを含有するごとく小さ なものであろう。

スリバスタバ（Ｓ　ｒｉｖａｓｔａｖａ）ら［ジーン（Ｇｅｎｅ）　、１０３　 ：　５３〜５９頁（１９９１）］は、ヒトＤＮＡインサートまたはＹＡＣのベク ター・アームヘネオマイシン抵抗性遺伝子を挿入できるプラスミドを記載してい る。後者の場合、該プラスミドは酵母宿主における選択用のＬＹＳ２遺伝子も含 有する。次いで、ＵＲＡ３遺伝子を新しいインサートで置き換え、かくしてＵＲ Ａを不活化する。

ポス’Ｊユタイン（Ｂ　ｏｔｈｓｔｅｉｎ）ら［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ ）、２４０　：１４３９〜１４４３頁（１９８８）］は、大きなりＮＡ分子のク ローニングおよび操作のための酵母生物の実際的有利性を記載している。グリー ン（Ｇｒｅｅｎ）ら［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）　、λ５０：９４〜９８ 頁（１９９０）］は、人工染色体（ＹＡＣ）にての酵母細胞における百方塩基対 におよぶセグメントのクローニングにより、複合ゲノムの長範囲のマツピングお よび分析が可能となると報告している。大きなりＮＡ分子クローニング用の酵母 ベクターは、２つの特徴；イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中でそれが増殖するため のプラスミド配列および酵母中で増殖した場合に直鎖分子の複製および保持を確 実とするための酵母特異的配列を合わせたものである。

それにもかかわらず、商業スケールにおける大きな分子の製造には問題が残って いる（その特別な例は、イミュノグロブリン、ファクター■およびファクター■ である）。分子レベルでは、正確な発現を助長するためかなりの大きさの単一遺 伝子を含有する大きなりＮＡ分子を導入することが望ましいであろう。例えば、 全てのＶｓ、Ｄｓ、Ｊ　ｓおよびＣ領域を収容するヒトＩｇのμ鎖遺伝子座は、 ３０００ｋｂのＤＮＡにわたって広がると見積られている：該ファクターｍ遺伝 子は、２３個のエキソンを有し大きさでほぼ２００ｋｂである。現在のところ、 トランスジェニック動物へのｃＤＮＡおよび設計されたゲノムの「ミニ遺伝子」 の導入により高いレベルの発現は稀にしか達成されていない。

発明の概要 驚くべきことに、今や、かなりの長さの特異的なりＮＡを、酵母からＤＮＡを導 入することなしに、ＹＡＣを経由してＥＳ細胞に導入できることが判明した。

かくして、酵母からＹＡＣを精製する必要性が避けられ、形質転換が本質的に確 実である。この発見は、そのようなりＮＡを他の細胞へ導入するのにも適用でき る。

本発明に使用する適当なＹＡＣは、少な（とも１００ｋｂの外来遺伝子または（ 例えば、１つもしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子セグメントを含む）遺伝子 座および原核生物または酵母細胞でない細胞が選択できるマーカー遺伝子を含有 する。この構築物は、例えばＮｅｏ’等のマーカー遺伝子を外来遺伝子を有する ＹＡＣに組み込ませることにより得ることができる。

本発明のさらなる態様においてＥＳ細胞または他の細胞は、マーカー標識した（ ｍａｒｋｅｄ）　ＹＡＣによって形質転換され、かくして、それを選択でき、例 えばヒト・イミュノグロブリンおよび他の遺伝子を最終的に発現する動物に挿入 できる。

具体的には、トランスジェニック泌乳動物であるヒツジまたはウシ、マウスまた は他の誓歯動物、またはいずれのヒト以外の動物が、例えば少なくとも１００ｋ ｂ１時として少なくとも３００ｋｂ、要すればＩＭｂまたはそれ以上のかなりの 長さの外来遺伝子または遺伝子座を含有することができる。該動物は、その動物 自体に対応する産生物はできないが、例えばヒト産生物のような他の動物の生産 物を発現することができる。

発明の詳細な説明 該入手可能なＹＡＣは、例えばアンピシリン抵抗性のような、原核生物細胞中で 選択できるマーカー遺伝子を含有するが、真核生物、ＥＳ、体細胞または哺乳動 物細胞への組込みを選択するマーカー遺伝子は含有しない。本発明は、組換えに よりＹＡＣへ抗生物質抵抗性を導入するための酵母の組換えの進歩を利用してい る。例えば、チミジンキナーゼプロモーターにより制御されるネオマイシン抵抗 性遺伝子（”ｎ　ｅ　ｏ）は、哺乳動物細胞における選択を可能とするであろう 。

他の適当なマーカーは、ハイグロマイシンおよびＨＰＲＴ抵抗性である。組込み 用に、状況に応じて異なうたマーカーを有する’Ｉ’ＡＣを調製することが望ま しいであろう。　′ 本発明は、優性の選択性マーカー遺伝子を有する酵母ベクターがヒト由来のイン サートＤＮＡに対する変化と同様に、左（セントロメリック）および右（非セン トロメリヅク）ＹＡＣアームへの標準化組込みを可能とするという認識に一部基 づく。酵母は予め定義した挿入物に対し線状末端の相同性を好むが、形質転換実 験においては、もっばら相同性組換えにより組込みが進行する。内部のヒト配列 および５°および３’ＹＡＣインサート境界の同定を促進する標的化領域を解放 できる。例えばネオマイシン抵抗性遺伝子の種々のＹＡＣ部位への組込みは、移 入および安定な組込みを可能とし、また大きなりＮＡ分子の胚性幹細胞を含有す る種々の哺乳動物細胞への取込みを解放する。

本発明は、以前は移入が困難であった長さのＤＮＡの完全な組込みのためのクロ ーニング媒体としてのＹＡＣを利用する。本発明は、ＤＮＡの特異的な修飾も行 いつる。

μ鎖およびＬ鎖遺伝子を含有する現存のＹＡＣを大きくすることが必要であろう 。種々のヒトμ鎖およびＬ鎖を含有するニスミドが入手できる：それらは相同性 、部位特異性もしくは他の組込みによりＹＡＣに付加することができる。さらに １つのＹＡＣで近接したＤＮＡ分子を得るため、定義した遺伝子座の異なったま たは重複した部分を含有するＹＡＣが交雑できる。このことは、ヒトμ鎖および Ｌ鎖遺伝子集団の大部分が再構築されることおよびヒトの真正の抗体を産生ずる トランスジェニック動物を得ることを可能とする。

同様にして、例えばミルクにおいて直接発現させるためにファクター■含有Ｙへ Ｃを修飾てきる。このことは、例えばネズミホエイ酸性タンパク質遺伝子プロモ ーターのように、酵母中での相同性組換えによるファクター■プロモーターのミ ルク遺伝子プロモーターへの変換を包含することができる。ファクター■は、同 様にして製造できるもう一つの産物である。

選択できるように、マーカー遺伝子が活性型でＹＡＣ中に組み込まれることは、 本発明の重要な特徴である。本目的のために、そのマーカーを有しないＹＡＣを 、例えばアンピシリン抵抗性遺伝子のようなマーカー遺伝子および外来遺伝子外 側の配列を含有するプラスミドでの組込みに付す。このことは、両マーカーの複 数コピーを含有するＹＡＣに誘導でき、複製が少なくとも好ましいが重要な点は 、例えばネオマイシン抵抗性が認められることである。

本発明に用いる出発物質および技術は公知であるか、あるいは該物質は公知技術 により調製できる。例えば、いくつかの別々に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞系が 入手できる：マンシＢ　−（Ｍａｎｓｏｕｒ）ら、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ） 、３３旦・３４８頁（１９８８）　：ンユワルツバーグ（Ｓ　ｃｈｗａｒｔｚｂ ｅｒｇ）ら、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２４６＋７９９頁（１９８９） ：ジョンソン（Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４５ ＋１２３４頁（１９８９）　；およびジールストラ（Ｚ　ｉ　ｊｌｓｔｒａ）択 方法はすでに確立されている。ファクター■遺伝子を含有するＹＡＣもそうであ るが、ＹＡＣ上のイムノグロブリンを利用できる；これらのクローンは、種々の ＹＡＣライブラリーをスクリーニングすることによって独立に得られている：リ トル（Ｌｉｔｔｌｅ）ら、プロン−ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズ・イン・ニーニスエイ　（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）、８６：１５ ９８頁（１９８９）参照。ＹＡＣ用の該大きさは変化し、２００から６００ｋｂ の間である。ニスミドでは、例えば、１．８Ｍｂまで大きさを増加できる。

細胞への大きなりＮＡ分子の導入に関する方法には、酵母プロトプラストを用い た（ＹＡＣ，ゲノミックＤＮＡまたは分断染色体のようないずれかの裸のＤＮＡ を用いた）マイクロインンエクンヨンおよびリン酸カルシウム共沈またはプロト プラスト融合がある：オイ（Ｏｌ）ら、プロン−ディング・オブ・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンシズ・イン・ニーニスエイ（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）、 １７５〜１７７頁（１９８９）参照。大きなりＮＡ分子を受精卵またはＥＳ細胞 に直接注射するアプローチは、（大きなりＮＡ分子は粘着性である）ＤＮＡの性 質のため困難であった。核種々のＹＡＣはプロトプラスト融合により導入するの が好ましいが：しかし、これは選択マーカーをＹＡＣに導入することを必要とす る（後記参照）。もう一つのアプローチは、選択マーカーＤＮＡと混合した高分 子量ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡのリン酸カルシウム共沈によるＥＳ細胞へのトラ ンスフェクシヨンである。次いで、目的とする組込み遺伝子の同定を、組込みお よび大きさを確認するのにヒトＡｌｕ反復配列、および特異的プローブで探索す ることにより行うことができる。このランダムなアプローチは、ライブラリー・ スクリーニングと同様であり、トランスフエクンヨン頻度に依存する。かくして 、選択マーカー遺伝子の複数コピーが産生できる。

大きなりＮＡ分子をマウスまたは他の非ヒト動物の生殖性に、例えばＥＳ細胞を 経由して、導入することは本発明の第一の目的である。本発明の該目的のために 、そのような大きな分子は生殖性配置に導入されるべきである。これらをＥＳ細 胞へ導入することにより、例えば、抗体またはイミュノグロブリンについての生 殖性遺伝子座は動物のリンパ組織内で組み換わり、かくして、抗体産生が起こる 。上記にて概説した技術は、例えばヒト・イムノグロブリンＬ鎖およびＨ鎖遺伝 子座またはファクター■遺伝子のよく特徴付けられている部分を含有するＹＡＣ を利用する。加えて、目的とするいずれの（大きな）遺伝子を運搬する高分子量 ＤＮＡを、トランスジェニックマウスを得るのに用いることができるＥＳ細胞を 含有する種々の細胞に移入できる。

大きなりＮＡ分子上の暗号配列およびフランキング領域を導入する目的は、正確 な発現を助長するオリジナルのゲノムの状況を保存することにある。これらの技 術は、大きな遺伝子ファミリーの導入および研究を可能ならしめる。遺伝子ター ゲティングと組み合わせて、真正な外来タンパク質を、相同な内因性遺伝子産物 の妨害なくして大量に得ることができる。このようにして、（抗体産生に関して ）ヒトのものと区別できない免疫系を有する動物を得ることができる。

内因性マウス抗体は、トランスジェニック・ヒト・イミュノグロブリンで妨害さ れうる。よって、ＥＳ細胞中での遺伝子ターゲティングによってマウスイミュノ グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座をサイレントする必要がある。次いで、ト ランスジェニック・ヒト・イムノグロブリンＨ鎖およびＬ鎖遺伝子集団を有し、 それ自身の抗体を産生じないマウス系を得ることができる。

本発明の具体的な例において、ネオマイシン抵抗性カセットを大きなＹＡＣ（３ ００ｋ　ｂ）に組み込んだ。該ＹＡＣは、ヒト・イミュノグロブリン（Ｉｇ）・ カッパー（に）Ｌ鎖遺伝子座のよく特徴付けられた領域を含有する。該修飾した ＩＧにＹＡＣを胚性幹（ＥＳ）細胞系にスフェロプラスト融合により移入した。

該方法は、ＥＳ細胞を経由して他の種の生殖系に、オリジナルのゲノム状況にあ る大きな遺伝子および遺伝子ファミリーの移入および発現に有効である。

ヒトにおける該に遺伝子座は、ＤＮＡ上に２５０万塩基対にわたり広がっている と見積もられている。該イムノグロブリンにＬ鎖の遺伝子は、体細胞組換えによ りＢ細胞分化の間に集合する：多くのＶ、（Ｖ＝可変）遺伝子セグメントのうち の１つが、５つのＪ、（Ｊ＝結合）セグメント中の１つと再配列し、Ｃ，（Ｃ＝ 定常領域）ポリペプチドが転写される。そのような複合遺伝子座の発現を研究す るためには、多くの遺伝子セグメントおよび必要な調節配列を含有する大変大き な断片を細胞および動物に導入することが必須である。

ＹＡＣ上の大きなりＮＡ分子の導入のような遺伝子操作実験にＥＳ細胞は適する 。さらに、ＥＳ細胞は胚芽細胞に再導入でき、導入された遺伝子座を運搬するキ メラおよび生殖性マウスが、それから得ることができる。

さらに本発明を、以下の特別な記載に例示するが、デビエス　（Ｄａｖｉｅｓ） ら、ヌクレイツク・アノッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ）　、２０（１１）・２６９３〜２６９８頁（１９９２）の「材料お よび実験方法」のセクションによっても説明されている。この文献の該文脈を、 出典明示して本明細書の一部とみなす。

該ヒトに遺伝子座を含有するＹＡＣは、ＥＳ細胞中で選択できるマーカー遺伝子 を含有しない。従って、本発明の１つの具体例では、ネオマイノン抵抗性遺伝子 （ｎ　ｅ　ｏ）を’ｒ”ＡＣに導入した。該ｎｅｏ遺伝子は、哺乳動物細胞へ移 入した時に安定なりローンの選択を可能とする。通常にも用いられる酵母選択マ ーカー遺伝子の例は、リジン欠損酵母培地における増殖を可能とするＬＹＳ２で ある。酵母における外因性ＤＮＡの組込みは、同様の方法で進行し、エリセリ（ Ｅ　１１ｃｅｉｒｉ　）ら［プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシズ・イン・ニーニスエイ（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）、８８：２１ ７９〜２１８３頁（１９９１）コにより［レトロフィッティング（ｒｅｔｒｏｆ ｉｔｔｉｎｇ）Ｊと呼ばれるＹＡＣへの新しい配列の導入がＹＡＣアームのプラ スミド相同性領域のために容易とされる。

酵母における標準化組込みは、置換構築物または組込みベクターのどちらか一方 を用いて行われる。ノーシー（Ｓ　ｃｈｅｒｅ）ら、プロン−ディング・オブ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・イン・ニーニスエイ（ＰＮＡＳ 　ＵＳＡ）アンド・セルラー・バイオロジー　（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　）、よＯ：４１６３〜４１６９頁（１９９０）、およびプロシーディング ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・イン・ニーニスエイ（ ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）、８８ニア７８８〜７７９１頁（１９９１）；およびスリバ スタバ（Ｓ　ｒｉｖａｓｔａｖａ）ら、前掲、参照。置換ベクターは、外因性Ｄ ＮＡの挿入により相同性の領域を破壊するようデザインされている。具体的な例 として、ＹＡＣへの相同性組込みは、所与の標的配列をその機能を損なうことな く全配列および複製として組み換える組込みベクターを用いて研究した。細菌配 列が、細菌においてサブクローニングを可能とし、例えば、これがフランキング ・インサートＤＮＡの単離を可能とするので、組込みベクターはＹＡＣおよびト ランスフエンクト細胞からも取り出すことができる。ベクターのセット、幾つか の標的サイトおよび異なったＹＡＣを用いる組込みの一般原理は示されている。

該修飾したＹＡＣは安定して胚性幹細胞に導入されており：か（して、該実験は 、１つの種からもう１つの種へ複合遺伝子座を移入する可能性を示している。

該事象の重要な態様は、遺伝子座を本質的な配置および大きさにおいて保持しつ つ、潜在的に望ましくない酵母ＤＮＡを移入することなく、そのような遺伝子座 を他の細胞へ移入するのにＹＡＣを用いることができることである。

１−−一−１、−５−一−−１−ρＣＴ／ＧＢ　９２１０１６５１フロントペー ジの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　Ｓ／ １０ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｒ１：８５） 、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ ト　ＦＩ （Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ Ｃ１２Ｒ１：８５） （Ｃ１２Ｎ　５１００　Ａ Ｃ１２Ｒ１：９１）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１００ｋｂの外来遺伝子または遺伝子座と当該および他のそのよ うな細胞において選択を可能とするマーカー遺伝子とで形質転換した原核生物ま たは酵母細胞でない細胞。
2. ２．胚性幹細胞である請求項１記載の細胞。
3. ３．アンピシリン抵抗性または他の原核生物選択性マーカー遺伝子および／また はウラシル抵抗性または他の酵母選択性マーカー遺伝子に加えて該遺伝子マーカ ーを存在させる請求項１または２記載記載の細胞。
4. ４．該もしくは各遺伝子の少なくとも２コピーからなるいずれの前記請求項記載 の細胞。
5. ５．該外来遺伝子または遺伝子座が胚性立体配座に存在する前記請求項いずれか １つに記載の細胞。
6. ６．実質的に酵母ＤＮＡがない前記請求項いずれか１つに記載の細胞。
7. ７．少なくとも１００ｋｂの外来遺伝子または遺伝子座および原核生物または酵 母細胞でない細胞における選択を可能とするマーカー遺伝子を包含する酵母人工 染色体（ＹＡＣ）。
8. ８．該マーカーがネオマイシン、ハイグロマイシンまたはＨＰＲＴに対する抵抗 性についてのものである請求項７記載のＹＡＣ。
9. ９．該外来遺伝子または遺伝子座および／またはマーカー遺伝子が請求項３から ５のいずれか１つに記載したものである請求項７または８記載のＹＡＣ。
10. １０．少なくとも１００ｋｂの外来遺伝子または遺伝子座を包含するトランスジ ェニック非ヒト動物。
11. １１．他の動物の産物を発現できるが、対応する自身の産物を発現できないトラ ンスジェニック非ヒト動物。
12. １２．該他の動物がヒトである請求項１１記載の動物。
13. １３．請求項１０および請求項１１または請求項１２記載の動物。
14. １４．泌乳動物で、該遺伝子産物がそのミルクから分離可能な請求項１０から１ ３のいずれか１つの記載の動物。