JPH07503026A - ほぼ純粋なｅｇ３セルラーゼを含有する洗剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 はぼ純粋なＥＧｒｌｌセルラーゼを含有する洗剤組成物発明の背景 １、発明の利用分野 本発明はトリコダーマｓｐｐ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐｐ、）がら得られ るほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼを含有する洗剤組成物およびその組成物の使 用方法に関するものである。より詳しくは、本発明の洗剤組成物は洗浄に有効な 量の少なくとも一種の界面活性剤とほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼから成って いる。

２、技術の現状 セルラーゼはセルロース（β−１，４−グルカンリンケージ）を加水分解してグ ルコース、七ロビオース、七ロオリゴ糖類等を生成する酵素として知られている 。セルラーゼは菌類、バクテリア等内で生成（発現）されるが、ある種の菌類、 特に、菌類トリコダーマ５ＰＰＣ中でもト’）Ｊ’ｆ−マ’）−セイ（ｒｅｅｓ ｅｉ））によって生成されるセルラーゼは、結晶形態のセルロースを減成するこ とのできる完全なセルラーゼシステムを発酵によって容易に大量に製造すること ができるため特に注目されている。

上述のようなことに関して、ウッド（Ｗｏｏｄ）等の［酵素学の方法（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１１６０．２５（１９８８）２３４ペー ジ以降には、完全な菌セルラーゼシステムはエキソ−セロビオハイドロラーゼ（ ｅｘｏ−ｃｅ１１ｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓＸＥＣ３，２，１，９１）（Ｃ ＢＨ）、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｓ）（ＥＣ３，２， １，４ＸＥＧ）、β−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓＸＥＣ３ ，２，１，２１ＸＢＧ）と称されるものを含む異なる数種の酵素からなっている ことが開示されている。その菌セルラーゼ類ＣＢＨ，ＥＧ、ＢＧは各種には多成 分のものを含ませることができる。

例えば、様々な菌源がら多成分ＣＢＨ及び多成分ＥＧが分離されている。

ＣＤＩ（、ＥＧ、ＢＧ酸成分らなる完全なセルラーゼシステムは結晶セルロース をグルコースに効率よく変換するのに要求されている。遊離した成分の結晶セル ロースの加水分解作用は極めて弱い。更に、セルラーゼ成分の間には、特にそれ らが異種である場合には、和動作用がみられる。

一方、セルラーゼとその成分は単独で用いても、組み合せて用いても、洗剤組成 物に有用であることが知られている。例えば、菌セルラーゼのエンドグルカナー ゼ成分は洗剤組成物の洗浄能力を高めるためや綿製品の感触をよくするためにも 使用されているし、また、軟化剤としても使用されている。しかしながら、トリ コダーマ８ｐｐとくにトリコダーマリーゼイから誘導されたＥＧＩやＥＧ１１成 分を洗剤組成物に使用する場合にはつぎのような問題がある。このような成分の 最適ｐＨは酸性領域にあるが、はとんどの洗濯用洗剤組成物は中性若しくはアル カリ（ｐＨ７から約ｐＨ１０）状態で使用するように調製されている。米国特許 出願Ｎｏ、０７／６６８，６４０には洗剤組成物にトリコダーマリーゼイの少な くとも一種の酸性成分分用いることによって、例えアルカリ状件で処理しても、 綿を含む生地の軟化、保色性、色の回復性、および感触を改良することが開示さ れているが、本発明はトリコダーマｓｐｐのＥＧＩＩＩ成分がトリコダーマリー ゼイのＥＧＩやＥＧＩＩ成分と比較して優れたそして予期せぬ効果を洗剤組成物 に与えると旨う発見に基づくものである。

このＥＧＩＩ＋成分はアルカリ条件下でも極めて高い酵素活性を示すことが発見 された。

発明の概要 本発明はほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼを洗剤組成物に使用することによって 軟化、保色性、色の回復性、および感触を改良することを目的とするものである 。特に、ＥＧＩＩ’ｌセルラーゼはアルカリ条件下で極めて高い活性を示すので 、はぼ純粋なＥＧｎｌセルラーゼを含有する洗剤組成物は中性ないしアルカリ性 の洗剤を使用する洗濯に特に適している。

本発明の洗剤組成物は洗浄に有効な量の少なくとも一種の界面活性剤と約０，０ １から約５ｗｔ％の、望ましくは約０．０５から約２ｗｔ％のほぼ純粋なＥＧｎ ｌセルラーゼから成っている。

本発明の一つの方法は、綿を含む生地の柔らかさを高める方法であって、洗浄に 有効な量の少なくとも一種の界面活性剤と約０．０１から約５ｗｔ％の、望まし くは約０．０５から約２ｗＬ％のほぼ純粋なＥＧＩＩ＋セルラーゼから成る洗剤 組成物から得られる洗濯媒体でその生地を洗うことを特徴とするものである。

本発明の他の方法は、綿を含む生地の保色性と色の回復性を改良する方法であっ て、洗浄に有効な量の少なくとも一種の界面活性剤と約０．０１から約５ｗｔ％ の、望ましくは約０．０５から約２ｗｔ％のほぼ純粋なＥＧｒｌｌセルラーゼか ら成る洗剤組成物から得られる洗濯媒体でその生地を１度ないし数度洗うことを 特徴とするものである。

図面の簡単な説明 第１図はＣＢＨＩとＣＢＨＩＩ発現できないように変性されたトリコダーマリー ゼイの変種から誘導されたＥＧ富裕化菌性セルラーゼの４０℃における一定ｐＨ Ｍ域での、ＲＢＢ−ＣＭＣ活性を、トリコダーマリーゼイから誘導されたＥＧ口 １富裕化セルラーゼのそれとともに示す。

第２図は等電位電気泳動ゲルであり、レーンＡは自生型トリコダーマリーゼイに よって生産された蛋白質を示し、レーンＢはＥＧＩ、ＥＧ■成分を発現できない ように変性されたトリコダーマリーゼイの変種によって生産された蛋白質を示し 、レーンＣはほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ内で発見された蛋白質を示す。こ の図の右端にはＣＢＨｌ、ＣＢＨｎ、ＥＧＬＥＧＩＩ、ＥＧＩＩＩに起因するバ ンドを示すマークが付されている。

第３図はＥＧＩＩＩの種々のｐＨにおける繊維除去特性すなわち色囲付特性を示 す。

第４図はＥＧＩＩＩの２つの断片から得られたアミノ酸配列である。

第５図はＰΔＣＨＢ　Ｉ　ｐｙｒ４の形成を概略的に示す。

第６図はＰΔＣＨＢ　Ｉ　ｐｙｒ４からの大きい方の断片をトリコダーマリーゼ イクロモソームの一方のｃｂｈｌ座に組込むことによるトリコダーマリーゼイの 遺伝子の除去を示す。

第７図は３２ｐで標識されたＰΔＣＨＢ　Ｉ　ｐｙｒ４をプローブとしてサイン 法を行った後の、ＥｃｏＲＩで消化されたＰΔＣＨＢ　Ｉ　ｐｙｒ４で変性した トリコダーマリーゼイ変種ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラヂオグラフィーで、 分子量マーカーの大きさが図の左側にキロ塩基対で示されている。

第８図は３２ｐで標識されたｐ　Ｉ　ｎｔｃＨＢ　Ｉをプローブとして変性した トリコダーマリーゼイ変種ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラヂオグラフィーで、 分子量マーカーの大きさが図の左側にキロ塩基対で示されている。

第９図は自生型トリコダーマリーゼイおよび変性されたトリコダーマリーゼイ変 種から分泌された蛋白質を示す等電集束ゲルである。レーンＡはトリコダーマリ ーゼイからの部分的に精製されたＣＨＢＩを使用しており、レーンＢは自生型ト リコダーマリーゼイを使用しており、レーンＣはｃｂｈｌ遺伝子を除去したトリ コダーマリーゼイ変種からの蛋白質を使用しており、レーンＤはｃｂｈｌ遺伝子 とｃｂｈ２遺伝子を除去したトリコグーマリーゼイ変種からの蛋白質を使用して いる。第９図の右側には分泌された蛋白質内に発見された個々のたんばく質の位 置を示すマークがふされている。ＢＧはβ−グルコシグーゼ、Ｅｌはエンドグル カナーゼ１．Ｅ２はエンドグルカナーゼ■、Ｅ３はエンドグルカナーゼ■、Ｃ１ はエキソ−セロビオハイドロラーゼＬＣ２はエキソ−セロビオハイドロラーゼ■ である。

第１０Ａ図はゲノムＤＮＡの４．１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片としてクローニングさ れたトリコダーマリーゼイのｃｂｈＺ座を示し、第１０Ｂ図はｃｂｈ２遺伝子除 去ベクターＰΔＣＨＢＴＩを示している。

第１１図は３２ｐで標識されたＰΔＣＨＢＩＩをプローブとしてサイン法を行っ た後の、ＥｃｏＲＩで消化されたＰΔＣＨＢ［１で変性したトリコダーマリーゼ イ変種Ｐ３７ＰΔＣＨＢ　Ｉ　ｐｙｒ２６からのＤＮＡのオートラヂオグラフィ ーである。分子量マーカーの大きさが図の左側にキロ塩基対で示されている。

第１２図はプラスミドｐＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ４の模式図である。

第１３図は便利な制限エンドヌクレアーゼクリーヴイノジ部位を作るためにｅｇ ｌｌ遺伝子とｅｇ１２遺伝子遺伝行内れた部位変更を示す模式図である。

第１４図はｐｃＥＰｃｌから得られる大きい方のＥｃｏＲＩ断片の模式図である 。

第１５図は変性していなトリコダーマリーゼイ変種ＲｕｔＣ３０からのＤＮＡお よびＥｃｏＲＩで消化されたｐｃＥＰｃｌで変性して得られる変性様からのＤＮ Ａのオートラヂオグラフイーである。ＤＮＡはＰｓｔ　Ｉで消化され、サザンブ ロノトが得られ、３２ｐでＷ識されたｐＵＣ４に：：ｃｂｈｌとのあいだでハイ ブリッド成形がなされた。マーカーＤＮＡ断片の大きさが図の左側にキロ塩基対 で示されている。

第１６図はプラスミドｐＥＧ　ｎ　：：Ｐ−１の模式図である。

第１７図はｐＥＧ　ＩＩ　：：Ｐ−１で消化されたＨｉｎｄ　ｍとＢａｍＨＩで 変性したトリコダーマリーゼイ変種ｐＥＧ　ＩＩ　：：Ｐ−１からのＤＮＡのオ ートラヂオグラフィーである。サザンプロットが用意され、ＤＮＡはｅｇ１３遺 伝子を含む放射線標識されたトリコダーマリーゼイＤＮＡの約４ｋｂのＰｓｔ　 Ｉ断片との間でハイブリット形成した。レーンＡ、　Ｃ，Ｅは変性されていない 変種からのＤＮＡを含み、レーンＢ、　Ｄ、　Ｆは変性されていないトリコダー マリーゼイ変種からのＤＮＡを含む。トリコダーマリーゼイＤＮＡはレーンＡ、 　ＢにおいてＢｇｌ　ｎ、レーンＣ，ＤにおいてＥｃｏＲＶ、レーンＥ、　Ｆに おいてＰｓｔ　Ｉに消化された。マーカーＤＮＡ断片の大きさが図の左側にキロ 塩基対で示されている。

第１８図はプラスミドｐＰＡＥＧＩ−１の模式図である。

第１９図はＨｉｎｄ［で消化されたＰＡＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ−３によって得られた 変種ＧＣ６９から分離されたＤＮＡのサザンプロットのオートラヂオグラフィー である。変性されていない変種にたいして予想される、プローブ、すなわ放射線 標識されたＰΔＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ−３、とのハイブリッド成形のパターンがレー ンＣに示されている。レーンＡはｅｈｌｌ遺伝子が破壊されている変性様にたい して予想されるパターンを示している。レーンＢはＰＡＥＧＩｐｙｒ−３ＤＮＡ がゲノムに組込まれているが、ｅｈｌｌ遺伝子が破壊されていない変性様にたい して予想されるパターンを示している。レーンＤ果てきとうな大きさのマーカー を提供するようにＨｉｎｄＩ［Ｉで消化されたＰΔＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ−３を含ん でいる。マーカーＤＮＡ断片の大きさが図の左側にキロ塩基対で示されている。

発明の詳細な説明 前述のように、はぼ純粋なＥＧｎｌセルラーゼを含む洗剤組成物とその洗剤組成 物の使用方法に関するものである。このような洗剤組成物はアルカリ性の水性洗 濯媒体中で使用すると綿を含む生地の軟化、保色、色の回復、および触感の改良 に極めて効果的である。

本発明について詳細に説明する前に次の用語について定義する。

ｒＥＧＩＩＩセルラーゼ」とは、トリコダーマＳｐｐから得られる、最適ｐＨが 約５．５から６．０、等電点ｐｌが約７．２から８．０、分子量が約２３から２ ８Ｋｄａｌｔｏｎのエンドグルカナーゼ成分を称する。ＥＧｌ［］セルラーゼは トリコダーマリーゼイもしくはトリコダーマヴアイライド（Ｖｉｒｉｄｅ）から 誘導するのが望ましい。トリコダーマリーゼイから誘導されるＥＧＩ１１セルラ ーゼは最適ｐＨが約５．５から６．０、′！Ｉｆ電点（ｐＩ）が約７．４、分子 量が約２５から２８Ｋｄａｌｔｏｎである。トリコダーマヴアイライドから誘導 されるＥＧｎｌセルラーゼは最適ｐＨが約５．５、等電点（ｐＩ）が約７．７、 分子量が約２３．５Ｋｄａｌｔｏｎである。

「はぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ」とは、少なくとも約４０ｗｔ％、望ましく は少なくとも約７０ｗｔ％、さらに望ましくは少なくとも約９０ｗｔ％のＥＧ［ Ｉｌを含有する七ルラーゼ蛋白組成物（ｗｔ％はセルラーゼ蛋白の総重量に基づ く）を称するものである。

ＥＧｎｌセルラーゼは発行条件が適当であればＥＧｎｌを生産するトリコダーマ ｓｐｐのどのような変種からも精製することができる。ＥＧＩＩＩ源はあまり重 要ではないが、トリコダーマリーゼイとトリコダーマヴアイライドが望ましい。

トリコダーマリーゼイからのＥＧＩＩＩの特に望ましい供給源はサイトラーゼ１ ２３セルラーゼ（Ｃｙｔｏｌａｓｅ　１２３ｃｅ１１ｕｌａｓｅｌである。この サイトラーゼ１２３セルラーゼＧｅｎｅｎｃｏｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｉｎｃ、（１８０Ｋｉｍｂａｌｌ　Ｗａｙ、　５ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃ ｉｓｃｏ、　ＣＡ９４０８０）から販売されている。ｐＩが高いために、ＥＧＩ ＩＩセルラーゼは、トリコダーマｓｐｐによって発現される高ｐＩキシラナーゼ 等の高ｐＩ成分が一般に存在する等電集束ゲル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｏｒｏｃｕ ｓｉｎｇ　ｇｅｌ）の領域の領域に存在する。実際は、図２のＥＧＩＩＩと示さ れているバンドはＥＧＩもしくはＥＧＩＩの減成生成物であると仮定されている 。しかしながら、ＥＧＩとＥＧ［１を除去したセルラーゼ（米国特許出願Ｎｏ、 ０７１５９３，９１９及びＮｏ、０７／６６８，６４０に記載された方法で調製 ）のゲル等電集束によれば、このバンドがＥＧＩもしくはＥＧＬＩの減成生成物 に起因すると考えることは出来ない。（図２参照） ＥＧＩＩは以前はある用語体系ではＥＧＩＩＩと命名されていたが、現在の用語 体系ではｒＥＧＩＩＪが当てられている。いずれにしても、後述の実施例２の表 １に明白に示されるようにＥＧＩＩ蛋白は分子量、ｐＩ、最適ｐＨにおいてＥＧ ＩＩＩ蛋白とは相当に異なっている。

トリコダーマｓｐｐから誘導される完全なセルラーゼシステム（全セルラーゼ） からほぼ純粋なＥＧ［Ｉｌセルラーゼを得る適当な方法は例えば以下の実施例に 挙げるようなものがある。以下の実施例から明らかとなるように、異名る分留材 （分留塔）を使用して繰りかえし分留する工程を含む精製法によって全セルラー ゼを精製することによってほぼ純粋なＥＧＩＩ［セルラーゼを容易に得ることが できる。また分留工程の前に、ポリエチレングリコール８０００を使用した抽出 によってＥＧＩ１１セルラーゼフラクション（約２０から５０％の純粋なＥＧＩ １１セルラーゼを含む）を得て、そのＥＧＩＩ＋セルラーゼフラクションを分留 することによってほぼ純粋なＥＧＩ１１セルラーゼを得るようにしてもよい。

更に、微生物を、はぼ純粋なＥＧＩＩＩＩセルラーゼを産生ずるように遺伝学的 に操作してほぼ純粋なＫＧＩｎセルラーゼを得ることも考えられる。例えば、後 述の実施例において分留法によって調製されたほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ は公知の配列法でたんばく質の一部又は全部のアミノ酸配列を決定するのに使用 することができる。ＥＧＩＩＩセルラーゼの部分のアミノ酸配列が分かれば、合 成りＮＡプローブを作ってこの情報をエンコードする遺伝子をクローニングする ことができる。そのＥＧＩＩＩエンコード遺伝子がクローニングできれば、それ を操作して挿々のトリコダーマｓｐｐ変種や他の微生物に挿入することができる 。例えば、１９９０年１０月５日出願の米国特許出願Ｎｏ、０７１５９３，９１ ９および１９９１年３月１３日出願の米国特許出願Ｎｏ、０７／６６８，６４０ にはトリコダーマリーゼイを遺伝子工学的に操作して特定のセルラーゼ遺伝子を 発現できないようにするとともに、他のセルラーゼ遺伝子を過剰に生産させるよ うにする方法が開示されている。１９９０年１０月５日出願の米国特許出願Ｎｏ 、０７１５９３，９１９および１９９１年３月１３日出願の米国特許出１ｉＮｏ 、０７／６６８，６４０を参考例としてここに引用する。本出願に記載された方 法を使用することによって、トリコダーマリーゼイをＥＧＯＩを単独でもしくは 他のセルラーゼ蛋白質とともに産生するように遺伝子工学的に操作することがで きる。また本出願に記載された方法によって、異種蛋白質を産生じないトリコダ ーマリーゼイ変種を作ることができる。

また、サノ力ロマイセスセレヴイジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）、ビチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｊｓ）、ハンセ ヌラボロモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイヴア ロマイセスラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　Ｉａｃｔｉｓ）、ヤロイア リボリチ力（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、スカニオマイ七スオク シデンタリス（Ｓｃｈａｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等のイー スト菌等の他の微生物にＥＧ［ＩＩエンコード遺伝子を発現させてもよい。例え ば、ＰＣＴ　Ｎｏ、ＷＯ３５１０４６７２を参照されたい。このような代替の非 トリコダーマ宿主に発現させるためには、ＥＧＩＩＩエンコードＤＮＡ配列をそ の特定の宿主がらの遺伝子から得られるプロモータ配列とターミネータ配列に機 能的に結合させる必要があるかもしれない。また、その代替宿主からの分泌信号 配列をエンコードするＤＮＡ配列をＥＧＩＩ＋分泌、信号配列をエンコードする ＤＮＡ配列と置き換える必要もあるがもじれない。他の有機体内でのＥＧ［ＩＩ の分泌と産生ができればＥＧＩＩＩをほぼ純粋な形で得ることができる。

「セルラーゼ蛋白」とは自生のトリコダーマｓＰｐもしくはその形質転換された 変種によって発現された全てのそして各々のエキソセロビオハイドロラーゼ（ｅ ｘｏ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅＸＣＢＨ）蛋白、エンドグルカナー ゼ（ＥＧ）蛋白およびβ−グルコシターゼ（ＢＧ）蛋白を称するものである。し たがって、セルラーゼ蛋白はギシラナーゼ、プロティアーゼ、アミラーゼ等のト リコダーマｓｐｐが発現する他の蛋白を含まない。

［エキソセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）成分Ｊとはトリコダーマリーゼイの ＣＢＨＩ成分やＣＢＨＩＩ成分を称するものであり、またｒＣＢＨ型成分」とい う用語はトリコダーマリーゼイのＣＢＨＩ成分やＣＢＨＩＩ成分と同様な洗剤活 性特性を示す菌セルラーゼ成分を称するものである。この意味において、トリコ ダーマリーゼイのＥＧ酸成分非存在下で使用した場合には、トリコダーマリーゼ イのＣＢＨＩ。

ＣＢＨＩＩ成分だけでは処理された綿含有生地に充分な保色性や急回復性を与え ることは出来ないし、またその触感を良くすることも出来ない。更に、そのよう なＥＧ酸成分ともに使用したときには、トリコダーマリーゼイのＣＢＨＩ成分は 綿含有生地の強度ロスを大きくするとともにクリーニングの効果を増大させるこ とができる。

したがって、ｒｃＢＨＩ型成分」、ｒ　ＣＢＨＩＩ型酸成分とはそれぞれトリコ ダーマリーゼイのＣＢＨＩ成分とＣＢＨＩＩ成分と同様な洗剤活性特性を示す菌 セルラーゼ成分を称するものである。上述のように、ＣＢＨＩ型成分に関しては ＣＢＨＩ成分と同様な洗剤活性特性とは、ＥＧ酸成分ともに使用したときに綿含 有生地の強度ロスを大きくするとともにクリーニングの効果を増大させることが できる特性を含むものである。望ましい実施例においては、ＣＢＨＩ型成分はＥ Ｇ酸成分存在かでは生地をより軟化させることができる。

そのようなＣＢＨ型成分には、従来ＣＢＨＩとＣＢＨＩＩをトリコダーマリーゼ イから特徴イ＋１’＋ｊるために使用される活性度弐験によってエキソセロビオ ハイドロラーゼ成分と分類されていた成分を含まなくともよい。例えば、そのよ うな従来の分類試験によった場合に、そのような成分は（ａ）セロビオースによ って競合阻害される（Ｋｉ＝約１ｍＭ）、（ｂ）リン酸によって膨れたセルロー スを重合度の低い高度に結晶化したセルロースに加水分解する、（Ｃ）カルボキ シメチルセルロースのような高度に置換されたセルロースを加水分解することが できない。これに対して、Ｌ記のような活性度鵡によってエキソセロビオハイド ロラーゼ成分とされるＣＢＨ成分のうちにはトリコダーマリーゼイのＣＢＩ（成 分と同様な機能的特性を持たないものがあると考えられている。づなわち、この ような成分は、トリコダーマリーゼイのＣＢＨ成分が有するような洗剤組成物中 での機能的特性を持たないから、ここでの目的に照らして、このようなエキソセ ロビＡハイドロラーゼはＣＢＨ型成分としない方がより正確であると考えられる 。

ｌβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）成分」とはＢＧ活性全示ずセルラーゼの成分を称 する。すなわち、そのような成分はセロビオースや他の可溶性セロオリゴサツカ ライド（七ロビＡ−ス）の非還元性末端がら作用し唯一の生成物としてグルコー スを生成する。ＢＧ酸成分セルロースポリマーに吸着もしないし反応もしない。

またこのようなりＧ成分はグルコースによって競合阻害される（Ｋｉ　：約１ｍ Ｍ）。なおりＧ成分はセルロースを減成できないので、厳密な意味では学術」ニ セルラーゼではない。このようなりＧ成分はセルラーゼシステムのなかに含まれ るものである。なぜなら、これらの酵素はＣＢＨ成分とＥＧ酸成分相乗作用によ って産生された阻害性のセルロース減成産物（特にセロビオース）をさらに減成 することによってセルロース全体の減成を容易にするからである。ＢＧ酸成分な いと、結晶セルロースの適度な加水分解が生ずるか、あるいは加水分解がほとん ど生じないかである。ＢＧ酸成分しばしばＰ−二トロフェノールＢ−Ｄ−グルコ シド（ＰＮＰＧ）等のアリル基質に対して特徴付けられ、アリル−グルコシダー ゼと呼ばれることが良くある。しかしながら、全てのアリル−グルコシダーゼが ＢＧ酸成分ある分けではなく、その内にはセロビオース全加水分解しないものが ある。

本発明の洗剤組成物にＢＧ酸成分混合した方が望ましい場合もある。（例えば、 ＢＧ酸成分ない場合にセロビオースのレベルがセルロースの全体的な加水分解を 抑えるほど高くなるようなときに全体的な加水分解を促進するために）このよう な場合には、精製したＢＧ酸成分洗剤組成物に加えてもよい。このとき加えるＢ Ｇ酸成分量は洗濯の際に生ずるセロビオースの量によるが、それは当業者には容 易に決定できる。しかしながら、ＢＧ酸成分加える場合には、はぼ純粋なＥＧ［ Ｉ］セルラーゼの総重量にないするＢＧ酸成分量は約０．４から約１０ｗｔ％が 望ましく、更に望ましくは、約１から約５ｗｔ％である。

菌セルラーゼは２様態」二のＢＧ酸成分含むことがあり、一般にイオン交換クロ マトグラフィー等によって分ＩＩＩＩされる。分離を容易にするために、ＢＧｔ が増加されたセルラーゼ組成物を使用するのが望ましい。セルラーゼ組成物中の ＢＧ酸成分量を増加させる方法については、１９９０年１２月１０日出願の米国 特訂出願Ｎｏ、０７／６２５．１４０　ｒ　５ＡＣＣＩＩＡＲＩＦＩＣＡＴＩＯ Ｎ　ＯＦ　ＣＥＬＬＵＬＯ８Ｅ　ＢＹＣＬＯＮＩＮＧＡＮＤＡＭＰＬＩＦＩＣＡ ＴＩＯＮＯＦＴＨＥ　β−ＧＬＵＣＯ８ＩＤＡＳＥＧＥＮＥＯＦＴＲＩＣＨＯＤ ＥＲＭＡ川死ＳＥ月に開示されている。

［綿含有生地ｊとは綿の織り地、用のニット、綿のデニム等の１００％コツトン もしくはコツトンブレンドの縫製後および未縫製の生地を意味する。コノトンブ レンドの場合には、綿の量は少なくとも約４０ｗｔ％であるべきであり、望まし くは約６０ｗｔ％以上、更に望ましくは、約７５ｗｔ％以上である。コツトンブ レンドの場合一種または２様態」二の線以外の繊維を綿に混ぜることできる。例 えば、ポリアミド繊維（例えば、ナイロン６、ナイロン６６）、アクリル（例え ば、ポリアクリロニトリル繊維）、ポリエステル繊維（例えば、ポリエチレンテ レフタレート）、ポリヴイニルアルコール繊維（例えば、ヴイニロン）、ポリヴ イニルクロライド繊維、ポリヴイニリデンクロライド４Ｊ！維、ポリウレタン繊 維、ボリュリア緘維、アラミド繊維等の合成繊維を混ぜることができる。また、 レーヨン等の再生セルロースを綿に有生地に含まれる綿の替わりに使用してもよ い。

「界面活性剤」とは、従来から洗剤組成物に使用されているアニオン界面活性剤 、ノニオン界面活性剤及び両性界面活性剤を称する。

「洗濯媒体」とは、水に必要量の洗剤（界面活性剤）組成物を加えて得られる洗 濯水である。一般にその洗濯媒体は洗浄に有効な量の洗剤を含んでいる。

ｐＨが約４以上７未満である場合、その洗濯媒体を酸性洗濯媒体と定義し、約７ である場合、その洗濯媒体を中性洗濯媒体と定義し、約７から約１０である場合 、その洗濯媒体をアルカリ性洗濯媒体と定義する。

アルカリ性洗濯媒体はｐＨが約７から約９であるのが望ましく、更に望ましくは ｐＨが約７から約８である。

ＣＢＨＩの欠けたセルラーゼ組成物、ＣＢＨＩを増加させたセルラーゼ組成物、 あるいはＥＧＩＩＩを増加させたセルラーゼ組成物を含む洗剤組成物の場合、綿 含有生地に対する望ましい洗剤特性、すなわち、改良された色回復性、改良され た軟化性もしくは改良された洗浄効果、を洗剤組成物に付与するのはセルラーゼ の量であって、セルロースから還元糖類な産する特定の酵素組成物による加水分 解の相対速度ではないということが発見された。

本発明は、はぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼを洗剤組成物に加えると、その洗剤 組成物から得られる洗濯媒体が酸性であっても、中性であっても、アルカリ性で あっても、綿含有生地の柔らかさを増し、保色性、色回復性を改良し、触感を改 良することができると言う発見に基づくものである。しかしながら、ＥＧＩＩＩ はアルカリ条件かで極めて高い活性を示すので、はぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラー ゼを使用した洗剤組成物は、トリコダーマリーゼイから誘導される他のエンドグ ルカナーゼ成分を使用した洗剤組成物に比べて綿含有生地の柔らかさを増し、保 色性、色回復性を改良し、触感を改良する点において優れている。

ＥＧ［セルラーゼの存在によって、綿含有生地の柔らかさを増し、保色性、色回 復性を改良し、触感を改良することができるが、ＥＧＩ［ｌセルラーゼと他のセ ルラーゼの特定の混合によって付加的な利益が得られる。すなわち、ＥＧＩＩＩ セルラーゼの使用によって、洗浄効果と軟化性が向上するが、ＥＧＩＩ！セルラ ーゼとＣＢＨＩ型セルラーゼと？含む洗剤組成物で綿含有生地を洗濯すると洗浄 効果と軟化性が更に向上する。

一方、相当量のＣＢＨＩ型成分がＥＧ［Ｉ］セルラーゼと共に存在すると、ＣＢ ＨＩ型成分が全く存在しないかあるいは少量である場合に比べて綿含有生地の強 度ロスを大きくしてしまうことがある。従って、洗剤組成物がＣＢＨＩ型成分を 含む場合には、その量はセルラーゼ蛋白の総重量に対して、約１０ｗｔ％以下で あるのが望ましく、より望ましくは約５ｗｔ％以下、更により望ましくは約２ｗ ｔ％以下である。

上述の点に関して、本発明の洗剤組成物に一般に使用されるほぼ純粋なＥＧＩＩ Ｉセルラーゼの量は綿含有生地の柔らかさ、保色性、色回復性を与えるのに充分 な量である。はぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ洗剤組成物の量は総洗剤組成物の 重量にたいして約０．０１ｗｔ％がら約５ｗｔ％であるのが望ましく、更に望ま しくは約０．０５ｗｔ％から約２ｗｔ％である。

一般に、本発明の洗剤組成物に一般に使用される他のセルラーゼ蛋白の量はＥＧ ＩＩＩセルラーゼを含むセルラーゼ蛋白の総重量の約６０ｗｔ％以下であり、望 ましくは約３０ｗｔ％以下、更に望ましくは約１０ｗｔ％以下である。更に望ま しくは、ＣＢＨＩ型成分の量はセルラーゼ蛋白の総重量の約５ｗｔ％以下である （すなわちほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ）。

洗剤組成物に使用されるほぼ純粋なＥＧＩＩＩ七ルラーモルラーゼ洗濯媒体中で 希釈したときにＥＧ［ｌＩセルラーゼの濃度が約０．５から約５００ｐｐｍとな るように選択するのが望ましく、約２から約１１００ｐｐとなるようにｉｆ！択 するのが更に望ましい。また洗剤組成物に使用されるほぼ純粋なＥＧＩセルラー ゼの量は水に加えて洗濯媒体を作るときに洗剤組成物がどの程度に希釈されるか による。これらのファクターは当業者には容易に決定することができるであろう 。

セルラーゼ濃度が低い場合には（洗濯媒体中のＥＧ■１セルラーゼ濃度が約５ｐ ｐｍ未満）、本発明の洗剤組成物の綿含有生地の柔らがさ、保色性、色回復性お よび触感に対する効果は洗濯を繰りかえず度に顕著になる。またセルラーゼ濃度 が高い場合には（洗濯媒体中のＥＧＩＩＩセルラーゼ濃度が約５ｐｐｍ以上）、 本発明の洗剤組成物の綿含有生地の柔らかさ、保色性、色回復性および触感に対 する効果は１度の洗濯ではっきりする。

本発明の重要な点の一つは、セルラーゼ組成物をほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラー ゼを含むようにすることによって、洗剤組成物中でのセルラーゼ濃度が低くても 綿含有生地の柔らがさ、保色性、色回復性を向上させる効果が得られることであ る。セルラーゼ濃度が低い方が消費者の安全には望ましい。

はぼ純粋なＥＣＩＩＩセルラーゼは液体状態で洗剤組成物に加えてもよいし、顆 粒状態で加えてもよいし、エマルジョン状態で加えてもよいし、ゲル状態で加え てもよいし、ペースト状態で加えてもよいし、他の種々の状態で加えてもよい。

洗剤組成物が固体である場合には、セルラーゼ組成物は顆粒状態であるのが望ま しい。またセルラーゼ保護剤を含んだ状態で顆粒化するのが望ましい。例えば、 １９９１年１月１７日出願の米国特許出願Ｎｏ、０７／６４２／６６９　ｒ　Ｇ ＲＡＮＵＬＥＳＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧＳＵＣＨＧＲＡＮＵＬＥＳＪを参照された い。洗濯媒体中への顆粒の溶解速度を小さくする相打を含むように顆粒化するこ とも出来る。そのような材料および顆粒は１９９１年１月１７日出願の米国特許 出願Ｎｏ、０７／６４２１５９６　ｆ’　ＧＲＡＮＵＬＡＲＣＯＭＰＯ８ＩＴＴ ＯＮＳ　Ｊに開示されている。

本発明の洗剤組成物にはアニオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、両性界面活 性剤等の従来から洗剤組成物に使用されている界面活性剤が使用される。

本発明の洗剤組成物に使用するのに適したアニオン界面活性剤としては、直鎖ま たは技分かれアルキルベンゼンスルフォネート、直鎖または枝分かれアルキル基 あるいはアルケニル基な有するアルキルもしくはアルケニルエーテルスルフェー ト、アルキルもしくはアルケニルスルフェート、オレフィンスルフォネート、ア ルカンスルフォネート等がある。アニオン界面活性剤に対する適当なカウンタイ オンとしては、ナトリウム、リン等のアルカリ金属イオン、カルシウム、マグネ シウム等のアルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、および炭素数が２ま たは３のアルカツル基を１から３個有するアルカツルアミンがある。

両性界面活性剤としては、第４アンモニウム塩スルフオネート、ベタイン型両性 界面活性剤等がある。これらの両性界面活性剤は同一分子中に正電荷を有する基 と陰電荷を有する基の両方を持っている。

ノニオン界面活性剤としてはポリオキシアルキレネーテル、高級脂肪酸のアルカ ノルアミド、そのアルキレンオキシドアダクト、脂肪酸グリセリンモノエステル 等がある。

本発明において使用するのに適した界面活性剤は英国特許出願Ｎｏ、２０９４８ ２６に開示されている。

界面活性剤の混む物も使用することができる。

本発明の洗剤組成物に使用される界面活性剤または界面活性剤の混合物の量は総 洗剤組成物の約１から約９５ｗｔ％であり、約５から約４５ｗｔ％であるのが望 ましい。洗濯媒体中に希釈したときの界面活性剤濃度は通常約５００ｐｐｍ以」 二であり、約１，０００ｐｐｍから１５，０００ｐｐｍであるのが望ましい。

本発明の洗剤組成物はセルラーゼ組成物と界面活性剤の他に、次の成分の一つま たはそれ以上を含んでも差し支えない。

セルラーゼ以外のハイドロラーゼ カルボキシレートエステルハイドロラーゼ、チオエステルハイドロラーゼ、フォ スエートモノエステルハイドロラーゼ、エステル結合に作用するフォスエートジ エステルハイドロラーゼ、グリコジル化合物に作用するグリコシドハイドロラー ゼ、Ｎ−グリコジル化合物を加水分解する酵素、エーテル結合に作用するヂオエ ーテルハイドロラーゼ、σ−アミノーアシルーペプチドハイドロラーゼ、ペブチ ジールーアミノ酸ハイドロラーゼ、アシル−アミノ酸ハイドロラーゼ、ジペプチ ドハイドロラーゼ、ペプチド結合に作用するベプチジールーペプチドハイドロラ ーゼ。この中で、カルボキシレートエステルハイドロラーゼ、グリコシドハイド ロラーゼ、およびベプチジールーペプチドハイドロラーゼが望ましい。適当なハ イドロラーゼとしては（１）ペプシン、ペプシンＢ、レンニン、トリプシン、デ モトリプシンＡ、デモトリプシンＢ、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプ シンＣ、パパイン、デモパパイン、フィシン、スロムビン、フイビリノリジン、 レニン、サブチリシン、アスバジロベブチターゼＡ、コラゲナーゼ、クロストリ ヂオベブチダーゼＢ、カリクレイン、ガストリジン、カテプシンＤ、ブロメリン 、ケラチナーゼ、デモトリプシンＣ、ペプシンＣ、アスパジロペブチターゼＢ、 ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ、アミノペプチダーゼ等のベプチ ジールーペプチドハイドロラーゼに属するプロテアーゼ、（２）α−アミラーゼ 、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、インヴエルターゼ、リソシーム、ペクチ ナーゼ、ヂチナーゼ、デキストラナーゼ等のグリコシドハイドロラーゼ（必須の 成分であるセルラーゼはこのグループから除いである）。これらは酸性ないし中 性の系内で作用するが、バクテリアから得られたものはアルカリ性系内で高い活 性を示す。例えば、（３）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエス テラーゼ、クロロフィラーゼ等のカルボキシレートエステルハイドロラーゼがあ る。特にリパーゼが効果的である。

商品名と生産者は次の通りである。

”Ａｌｋａｌａｓｅ”、”Ｅｓｐｅｒａｓｅ”、”５ａｖｉｎａｓｅ”、”ＡＭ Ｇ”、”ＢＡＮ”、”Ｆｕｎｇａｍｉｌｌ”、”Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ”、’Ｔｈ ｅｒｍａｍｙｌ”（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　−ＣｏｐｅｎｈａｇｅｎＤｅ ｎｍａｒｋ）　、”Ｍａｋｕｓａｔａｓｅ”　、”Ｈｉｇｈ−ａｌｋａｒｉｎｅ 　ｐｒｏｔｅａｓｅ”　、”ＡｍｙｌａｓＴＨＣ”、”Ｌｉｐａｓｅ”（Ｇｉｓ ｔ　Ｂｒｏｃａｄｅｓ、　Ｎ、Ｖ、、Ｄｅｌ几、Ｈｏ１ｌａｎｄ）、’Ｔ’ｒｏ ｔｅａｓｅ　Ｂ−４００”　、　”Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｂ−４０００”　、　” Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ＡＰ”　、　”Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ＡＰ２１００”（Ｓｃｈ ｗｅｉｚｅｒｉｓｃｈｅ　Ｆｅｒｍｅｎｔ　Ａ、Ｇ、、　Ｂａ５ｅｌ、　３ｗ１ ｔｚｅｒｌａｎｄ）、”ＣＲＤ　Ｐｒｏｔｅａｓ”（Ｍｏｎｓａｎｔ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）　、”Ｐｉｏｃａｓｅ” 　（ＰｉｏｐｉｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ、　ｌ１ｌ ｉｎｏｉｓ）　、”ＰｒｏｎａｓｅＰ”　、　”ＰｒｏｎａｓｅＡｓ”、”Ｐｒ ｏｎａｓｅ　ＡＦ”　（Ｋａｋｅｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｌｔｃｌ、　 Ｊａｐａｎ）、”Ｌａｐｉｄａｓｅ　Ｐ−２０００”　（Ｌａｐｉｄａｓ、　５ ｅｃｒａｎ、　Ｆｒａｎｃｅ）、プロテアーゼ産物（タイラー標準ふるい、１６ メノシユ１００％通過、１５０メソシュ１００％不通過ＸＣ１ｉｎｇｔｏＸＣ１ １ｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｒ　５ｔａｎｄａｒｄ　Ｂｒ ａｂｄｓ　Ｃｏｒｐ、、　ＮｅｗＹｏｒｋ）　、ゴａｋａｍｉｎｅ”　、”Ｂｒ ｏｍｅｌａｉｎ　１：１０”　、”ＨＴ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ２００”、”Ｅｎｚ ｙｍｅ　Ｌ−Ｗ”　（バクテリアではなく菌類から得られたものＸＭｊｌｅｓ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅｌｋｈａｒｔ、　Ｉｎｄ、）　、”Ｒ ｈｏｚｙｍｅ　Ｐ−１１Ｃｏｎｅ、−”Ｐｅｃｔｉｎｏｌ”、”Ｌｉ　ｐａｓｅ 　Ｂ”、”Ｒｈｏｚｙｍｅ　ＰＦ”、”Ｒｈｏｚｙｍｅ　Ｊ−２５”（Ｒｏｈｍ ＆Ｈａａｓ、　Ｇｅｎｅｃｏｒ、　５ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、 　ＣＡ）　、Ａｍｂｒｏｚｙｍｅ２００”（Ｊａｃｋ　Ｗｏｌｆ　＆　Ｃｏ、、 　Ｌｔｄ、、　５ｕｂｓｉｄｉａｒｙ　ｏｒＮｏｐｃｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｍｐａｎｙB Ｎｅｗａｒｋ、　Ｎ、Ｊ、）　、　”ＡＴＰ　４０”　、”ＡＴＰ　１２０”　 、　”ＡＴＰ１６０”（Ｌａｐｉｄａｓ。

５ｅｃｒａｎ、　Ｆｒａｎｃｅ）、”０ｒｉｐａｓｅ”（Ｎａｇａｓｅ　＆　Ｃ ｏ、、　Ｌｔｄ、　Ｊａｐａｎ）セルラーゼ以外のハイドロラーゼは目的に応じ て必要な量だけ加えられ、精製された量で０．００１から５ｗｔ％加えるのが望 ましく、更に望ましくは０．０２から３ｗｔ％である。この酵素は粗酵素だけで あるいは洗剤組成物の他の成分と組み合わされた状態で顆粒化した形で使用する 必要がある。粗酵素の顆粒は精製された酵素が顆粒の０．００１から５０ｗｔ％ であるような量で使用される。また顆粒は０．００２から２０ｗｔ％、望ましく は０．１から１０ｗｔ％だけ加えるのが望ましい。セルラーゼと同様に酵素保護 剤と溶解遅延剤を含んだ状態で顆粒化することもできる。

カチオン　面活性剤と長鎖脂肪酸塩 カチオン界面活性剤と長鎖脂肪酸塩には、飽和もしくは不飽和脂肪酸塩、アルキ ルもしくはアルゲニルエーテルカルボキシル酸塩、。−スルフオ脂肪酸塩もしく はエステル、アミノ酸型界面活性剤、フォスフェートエステル界面活性剤、第４ アンモニウン塩（３から４個のアルキル置換基と１個までのフェニル置換′ｒル キル置換基を有するものを含む）等がある。適当なカチオン界面活性剤と長鎖脂 肪酸塩は英国特許出ＭＮｏ、２０９４８２６　Ａに開示されている。本発明の洗 剤組成物はそのようなカチオン界面活性剤と長鎖脂肪酸塩を約１から２０ｗｔ％ 含んでも差し支えない。

ビルダー Ａ、２価の金属イオン封鎖剤 本発明の洗剤組成物は次にあげる化合物のアルカリ金属塩とアルカツルアミン塩 からなる詳から選ばれた一種もしくは数種のビルダー成分を約５０％まで含んで も差し支えない。フォスフェート、フォスフ吋ネート、フォスフォノカルボキシ ネート、アミノ酸塩、アミノポリアセテート高分子電解質、非解離性ポリマー、 ジカルボキシｌし酸塩、及びアルミノシリケート塩。適当な２価の金属イオン封 鎖剤（よ英国特許出願Ｎｏ、２０９４８２６　Ａに開示されてし・る。

Ｂ、アルカリまたは無機電解質 本発明の洗剤組成物は次にあげる化合物のアルカリ金属塩の一種以上を約１から 約５０ｗｔ％、望ましくは約５から約３０ｗｔ％、アルプノリまたは無機電解質 として含んでも差し支えない。シリケート、カー１３才・−ト、スルフェート。

また、トリエタノールアミン、ジェタノールアミン、モノエタノールアミン、ト リイソブロノ（ノールアミン等の有機アルカリでも差し支えなし１゜アンチリゾ ポジション剤 本発明の洗剤組成物は次にあげる化合物の一種以上を約０．１力・ら約５ｗｔ％ アンチリゾポジション剤として含んでも差し支えなＩ／）。Ｊミ１エチレングリ コール、ポリビニルアルコ−Ｊし、ポリビニルピロ１ノドン、カルボキシメチル セルロース これらの内で、カルボキシメチルセルロースやポリエチレングリコールを本発明 のセルラーゼ組成物と組み合せると塵埃除去組成物として極めて有用である。

ｌ亘覆 本発明のセルラーゼをソヂウムベルカーボネート、ソヂウムベ２レボレート、ソ ヂウノ・スルフェート／）８酸化水素アダクト等の１票白Ａ’ｌＪやスルホン化 されたフタロシアニンの亜鉛塩、アｌレミニウム塩等の感光性漂白染料等と組み 合せて使用すると洗浄効果が更Ｇ二高くなる。

もし必要ならば、種々の青味剤と蛍光染料を本発明の洗剤組成物に加えて差し支 えない。適当な青味剤と蛍光染料は英国特許出願Ｎｏ、２０９４８２６　Ａに開 示されている。

グーキング防止剤 粉末洗剤には次のようなグーキング防止剤を加えて差し支えない。Ｐ−）ルエン スルフォン酸塩、キシレンスルフォン酸塩、酢酸塩、硫化琥珀酸塩、タル乞微粉 砕したシリカ、粘土、カルシウムシリケート（例えば、Ｊｏｈｎｓ　Ｍａｎｖｉ ｌｌｅ　Ｃｏ、製のＭｉｃｒｏ−Ｃｅｌｌ）、カルシウムカーボネート、酸化マ グネシウム セルラーゼ活性を阻害する因子にたいするマスキング剤本発明のセルラ−ゼ組成 物は銅、亜鉛、クロム、水銀、鉛、マンガン、銀のイオンもしくはこれらの化合 物の存在かで奪活されることがある。これらの阻害剤にたいしては種々の金属キ レート化剤および金属沈殿剤が有効である。そのような金属キレート化剤ないし 金属沈殿剤としては、上述の２価の金属イオン封鎖剤やマグネシランシリケート 、マグネシウムスルフェート等がある。

七ロビオーゼ、グルコースおよびグルコノラクトンが阻害剤として作用する場合 もある。このようなサツカライドとセルラーゼの共存は出来る限り避けるのが望 ましい。その共存が避けられない場合にはサツカライドをコーティングするなど してサツカライドがセルラーゼと直接接触しないようにする必要がある。

長鎖脂肪酸塩やカチオン界面活性剤も阻害剤として作用する場合がある。しかし ながらこれらのセルラーゼとの共存は、タブレット化、コーティング等によって 両者が直接接触するのを防止できれば差し支えない。

上述のようなマスキング法やマスキング法は必要ならば使用して差し支えない。

セルラーゼ活性剤 活性剤はセルラーゼの種類によって変わる。蛋白質、コバルトおよびその塩、マ グネシウムおよびその塩、カリウムおよびその塩、ナトリウムおよびその塩、ま たはマンノース、キシロース等のモノサッカライドの存在下では、セルラーゼは 活性化され、その洗浄力が大きく向上する。

酸化防止剤 酸化防止剤としては、ターブチルヒドロキシトルエン、４，４′−ブチリデンビ ス（ローターブチル−３−メチルフェノール）、２，２′−ブチリデンビス（ロ ーターブチル−４−メチルフェノール）、モノスチレネーチノドクレゾール、ジ スチレネーヂソドクレゾール、モノスチレネーヂノドフェノール、ジスチレネー ヂッドフェノール、１．１−ビス（４−ヒドロキシ−フェニール）シフロケキサ ン等がある。

町溶化剤 可ｉｌＪ化剤としてはエタノール等の低級アルコール、ベンゼンスルフォネート 塩、ｐ−１ルエンンスルフオネート塩等の低級アルキルベンゼンスルフォネート 塩、プロピレングリコール等のグリコール、アセデルベンゼンスルフォネート塩 、アセトアミド、ビリジニンジカルボキシル酸アミド、ベンゾネート、尿素等が ある。

本発明の洗剤組成物は酸性からアルカリ性にわたる広いｐＨ範囲で使用すること ができる。望ましい実施例では、本発明の洗剤組成物はアルカリ性洗濯媒体中で 使用することができ、更に望ましい実施例においてはｐＨが７より高く約８以下 のアルカリ性洗濯媒体中で使用することができる。

上述の成分の他に、香料、！！衝剤、防腐剤、染料等、従来一般に使用されてい るものを本発明の洗剤組成物に、必要ならば加えて差し支えない。

洗剤の基礎材料が粉末である場合、噴霧乾燥法、顆粒化法等公知のどの様な方法 で調製しても差し支えない。しかしながら、噴霧乾燥法または噴霧乾燥顆粒化法 によって得られるものが望ましい。噴霧乾燥法によってえられる基礎材料は調製 条件によって制限されるものではない。噴霧乾燥法によってえられる基礎材料は 、界面活性剤、ビルダー等の耐熱性成分の水性スラリーを高熱の空間内に噴霧し て得られる中空の顆粒である。その顆粒の大きさは５ｏがら２０００ミクロンで ある。噴霧乾燥の後に香料、酵素、漂白剤、無機アルカリ性ビルグーを加えても よい。噴霧乾燥顆粒化法によって得られるような高度に稠密な顆粒状基礎材料の 場合にはその調製後に種々の成分を加えてもよい。

基礎材料が液体である場合それは均一な溶液であってもよいし、不均一な分散液 であってもよい。洗剤中のセルラーゼによってカルボキシメチルセルロースが分 解されるのを避けるために、カルボキシメチルセルロースを前もって顆粒化もし くはコーティングしておくのが望ましい。

本発明の洗剤組成物は工業用にも家庭用にも通常の温度及び割合で使用される。

本発明のほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼは洗剤に使用されるだけでなく、綿含 有生地の柔らかさを増し、保色性、急回復性を改良し、触感を改良するのに充分 な活性を有する中間的なｐＨで適当な溶液中で予備洗濯するのにも使用すること ができる。はぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼが予備浸軟（例えは、予備洗濯）組 成物に使用する場合には、それは液体組成物、噴霧組成物、ゲル組成物、あるい はペースト組成物どしてその予備浸軟組成物の総重量の約０．０１から約２０ｗ ｔ％の範囲で使用するのが普通である。予備浸軟組成物の場合には、界面活性剤 を使用することができ、使用するばあいには予備浸軟組成物の総重量の約０．０ １から約２０ｗｔ％の範囲の濃度で使用される。予備浸軟組成物の残部は希釈剤 、緩衝剤、他の酵素（プロテアーゼ）等の公知の成分であり、通常の濃度で使用 される。すなわち予備浸軟組成物は０から約２０ｗｔ％の界面活性剤と約０．０ １から約２０ｗｔ％のほぼ純粋なＥＧ［Ｉセルラーゼを含む。

また本明細書でいうほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼはしみ抜き、あるいは退色 した生地の急回復に適した（例えば、米国特許Ｎｏ、４，７３８，６８２参照） 独立した組成物として家庭で使用することができる。

またそのほぼ純粋なＥＧＩ１１セルラーゼは中性からアルカリ性の条件下で活性 が高いため、紡織工程で綿含有生地を処理（米国特許出願Ｎｏ、０７／６７７． ３８５およびＮｏ、０７／６７８，８６５参照）するのに有用であり、また緑蔵 飼料や堆肥な作るのにも有用である。

以下に示す実施例は本発明を説明するだめのものであり、本発明の範囲を限定す るものと解釈すべきものではない。

実施例 実施例１はＣｙｔｏｌａｓｅ　１２３　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅ（）リコダーマリー ゼイから得られた全国セルラーゼ組成物、５ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓ ｃｏのＧｅｎｅｃｏｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ発売）からの精製 によるＥＧＩｒｌ以外の成分の分離を説明するものである。

夾胤ｍ シトラーゼ１２３セルラーゼのセルラーゼ成分への精製Ｃｙｔｏｌａｓｅ　１２ ３　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅを次のようにして精留した。このセルラーゼ系のセルラ ーゼ成分の正規分布は次の通りである。

ＣＢＨＩ　４５−５５ｗｔ％ ＣＢＨＨ１３−１５ｗｔ％ ＥＧＩ　１１−１３ｗｔ％ ＥＧＴＪ　８−１０ｗｔ％ ＥＧＩＩＩ　１−４ｗｔ％ ＢＧ　Ｏ，５１ｗｔ％ 精留は次の樹脂を入れた塔を使用して行われた。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ゲル濾過樹脂（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｍｐａｎｙ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ）、ＱＡ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍアニ］ ン交換樹脂、ＳＰ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍカチオン交換樹脂（ＩＢＦ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｉｃｓ、　Ｓａｖａｇｅ、　Ｍｄ）０．５ｇのＣｙｔｏｌａｓｅ　１ ２３　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅを３ｅの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ゲル濾過樹脂と １０ｍＭのりん酸ナトリウム緩衝液？入れた塔でｐＨ６，８で脱塩した。得られ た脱ｊｘ溶液を２０ｍｆｆのＱＡ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍアニオン交換樹脂の 塔に充填した。この塔に結合されたフラクションはＣＢＨＩとＥＧＩを含んでい た。これらの成分はＯから約５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む水性密度勾配を 使用して、密度勾配溶離によって分離した。この塔に結合されなかったたフラク ションはＣＢＨＬＩとＥＧＬＩを含んでいた。これらのフラクションは１０ｍＭ のくえん酸ナトリウム（ｐＨ３，３）で平衡させた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ ゲル濾過樹脂の塔を使用して脱塩した。この溶液２００ｍｅをＳＰ　Ｔｒｉｓａ ｃｒｙｉ　Ｍカチオン交換樹脂２０ｍｅの塔に充填した。

ＣＢＨＩＩとＥＧ［ｌは０から約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む水性密度勾 配を使用して別々に溶離した。

実施例２ Ｃｙｔｏｌａｓｅ　１２３　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅからのＥＧＩＩ＋の精製実施例 １においてはＣｙｔｏｌａｓｅ　１２３　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅがらいくっがの成 分が分離された。ＥＧ［ＩＩはＣｙｔｏｌａｓｅ　１２３　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅ には極めて微量しか含まれていないため、この成分を分離するために次のような 手法が使用された。

Ａ、ＥＧ［１七ルラーゼ酵　の大規模抽出１００ｅのセルのないセルラーゼ濾液 を約３０°Ｃに加熱した。この加熱された拐料は、約４％ｗｔ／ｖｏｌのＰＥＧ ３０００（分子量約８０００のポリエチレングリコール）と約１０％ｗｔ／ｖｏ ｌの無水硫酸ナトリウムを含んでいた。

混合物は２相の液体であった。その２相は５Ａ−１積層ディスク（ｄｉｓｋｓｔ ａｃｋ）円心機によって分離した。また相は銀汚染性等電集束ゲルを使用して分 析した。ＥＧＩｒｌとキシラーゼが精留され富裕化していた。回収された組成物 は約２０から５０ｗｔ％のＥＧ［ｌｌを含んでいた。

上記の方法に関して、分子量が約８０００より小さいポリエチレングリコールを 使用すると分離が不適切になった。これに対して、分子量が約８０００より相当 大きいポリエチレングリコールを使用すると、所望の酵素を回収組成物から追い 出す結果となった。硫酸ナトリウムの量に関しては、その量が約１０％ｗｔ／ｖ ｏはり相当多いと沈殿の問題が生じ、それより相当少ないとうまく分離しないか 、あるいは溶液が１相のままであった。

Ｂ、精留によるＥＧＩＩＩの精製 自生型のトリコダーマリーゼイから産出された全国セルラーゼ組成物（Ｃｙｔｏ ｌａｓｅ　１２３　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅ、　５ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉ ｓｃｏのＧｅｎｅｃｏｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ発売）からの精 留によってＥＧ［ｌを精製した。精留は次の樹脂を入れた塔を使用して行われた 。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ゲル濾過樹脂（Ｓｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏｍｐａｎｙ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ）、ＱＡ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍアニ オン交換樹脂、ＳＰ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍカチオン交換樹脂（ＩＢＦ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、　Ｓａｖａｇｅ、　Ｍｄ）０．５ｇのＣｙｔｏｌａｓｅ　 １２３　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅを３ｅの８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ゲル濾過樹脂 と１０ｍＭのりん酸ナトリウム緩衝液を入れた塔でｐＨ６，８で脱塩した。得ら れた脱塩溶液を２０ｍｆｆのＱＡ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍアニオン交換樹脂の 塔に充填した。この塔に結合されたフラクションはＣＢＨＩとＥＧＩ含んでいた 。この塔に結合されなかったたフラクションはＣＢＨＩＩとＥＧＩＩとＥＧＩＩ Ｉを含んでいた。これらのフラクションは１０ｍＭのくえん酸ナトリウム（ｐＨ ４，５）で平衡させた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ゲル濾過樹脂の塔を使用して 脱塩した。この溶液２００ｍｅをＳＰ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍカチオン交換樹 脂２０ｍｅの塔に充填した。ＥＧｒＩＩは２００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液２ ００ｍＬで溶離した。

ＥＧＩＩＩの分離効率を上げるためには、ＥＧＩＩＩを過剰に生産するか、およ びｌまたはＥＧＩ、ＥＧＩｌ、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ成分の少なくとも一種を生 産できないように遺伝学的に変質されたトリコダーマリーゼイを使用するのが望 ましいかもしれない。これによれば、例えば、精留およびｌまたはＰＥＧ抽出に よって必然的にＥＧＩＩＩの分離効率が上がる。１９９１年３月１３日出願の米 国特許出願Ｎｏ、０７／６６８，６４０にはこのような変種のいくつかの製造が 開示されている。

同様に、上述のＥＧＩＩＩ組成物を更に精製した方が望ましいかもしれない。例 えば、上記の方法Ａ）又はＢ）で分離されたＥＧＩ［Ｉ蛋白を、方法Ａ）で得ら れた材料を方法Ｂ）で使用することによって、またはその逆によって更に精製す ることができる。ＥＧｎＴを更に精製する特別の方法の一つは、この実施例２の パートｂ）で得られたＥＧＩＩＩサンプルを更に精製することである。Ｍｏｎｏ −８−ＨＲ５１５ｃｏｌｕｍｎ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、のＰｈａ ｒｍａｉｃａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用したＦＰＬＣ 装置によって更に１′ｌｖ製した。ＦＰＬＣ装置は液体クロマトグラフィー制御 装置、２個のポンプ、デュアルバスモニター、フラクション収集装置およびチャ ートレコーダー（全てＰｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、のＰｈａｒｍａｉｃａ 　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）から成っている。この実施例２のバ ー）ｂ）で得られたＥＧｍサンプル５ｍｅを１０ｍＭのくえん酸ナトリウム（ｐ Ｈ４）であらかじめ平衡させた２０ｍｅの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５の塔を使 用して脱塩した。

この塔を０から２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む水性密度勾配を使用して０． ５ｍｅ／分の速度で溶離して、サンプルを１ｍｅずつのフラクションとした。Ｅ Ｇｒｌｌはフラクション１０．１１内に回収されており、その純度はゲルｆ、策 泳動によって９０％を超えると決定された。この純度のＥＧＩＩＩは公知の技法 によってＮ−末端アミノ酸配列を決定するのに適している。

はぼ純粋なＥＧ［］］の特性をトリコダーマリーゼイから分離された他のエンド グルカナーゼと比較して次に示す。

上記表から分かるように、ＥＧＩＩＩはトリコダーマリーゼイの他のエンドグル カナーゼ成分と比べて最適ｐＨもｐＩも高い。下記の実施例３において分かるよ うに、ＥＧＩＩＩはアルカリｐＨ下で相当高いＲＢＢ−ＣＭＣ活性を保持してい る。

トリコダーマｓｐｐの他の変種がら得られたＥＧＩＩＩ七ルラーセルラーゼして 精製することができる。例えば、トリコダーマヴアイライドから誘導されたＥＧ ＩＩＩセルラーゼについてＶｏｒａｇｅｎ等のｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ、１６０：２４３−２４９１に記載がある。これにはＥＧＩＩＩ セルラーゼは約２３．５Ｋｄａｌｔｏｎの分子量を有し、最適ｐＨが５．５、ｐ Ｉが７．７であると記載されてる。

実逸溌照 所　のＨ領域におけるセルラーゼ　の６次は二つの異なるセルラーゼ組成物のｐ Ｈ特性を決定するためになされたものである。第１のセルラーゼ組成物は上述と 同様にしてＣＢＨＩ成分とＣＢＨＩＩ成分を産生出来ないように遺伝子工学的に 変性したトリコダーマリーゼイがら調製した、ＣＢＨＩ成分とＣＢＨｎ成分の欠 けたセルラーゼ組成物であった。このセルラーゼ組成物は、トリコダーマリーゼ イから誘導されたセルラーゼ組成物の約５８がら７０％を通常占めるＣＢＨＩ成 分とＣＢＨｒｌ成分を有さないため、必然的にＥＧ酸成分富んでいる。ＥＧＩＩ Ｉはｌ・リコダーマリーゼイのエンドグルカナーゼ成分の内で最も少ないがら、 この組成物はＥＧＩとＥＧｌｌがほとんどである。

第２のセルラーゼ組成物は実施例２のパートｂ）と同様な精製法によってトリコ ダーマリーゼイから誘導されたセルラーゼ組成物から分離された純度約２０から ４０％のＥＧ　ＩＩ＋ＩＩクションであった。

これらのセルラーゼ組成物の活性を４０’Ｃで次のようにして決定した。

５から２０μｅの適切な酵素溶液を最終溶液に必要量の酵素を与えるのに充分な 濃度で加える。２ｗｔ％のＲＢＢ−ＣＭＣ（Ｒｅｍａｚｏｌ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎ ｔ　ＢｌｕｅＲ−Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　−−−６ Ａｌｔａｎａ　Ｐｌａｃｅ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｒｏｃｋｓ、　Ｎ、Ｓ、Ｗ。

２１５１、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａのＭｅｇａＺｙｍｅ社製）２５０７１ｅをｐＨ ４，５，５，５，６，６，５，７，７，５，８のシトレートｌフォスフェート緩 衝液０．５Ｍと混合したものを加える。

撹拌し、４０°Ｃで３０分間インキュベートする。水浴で５から１０分分間中す 。０．３Ｍの酢酸ナトリウムと０．０２Ｍの酢酸亜鉛を含むメチルセロソルブ１ ０００７１ｆｆを加える。撹拌し、５から１０分間放置する。遠心分離し、」二 １ｆｆｌみをキュベツト（ｃｕｖｅｔ）に注ぐ。

各キュベツト内の溶液の光学濃度（ＯＤ）を５９０ｎｍで測定することによって 比活性を決定した。光学濃度が高いほど活性が高いことを示している。

この分析結果は第１図に示されている。第１図はＣＢＨＩとＣＢＨｎの欠けたセ ルラーゼ組成物の比活性をＥＧＩ［Ｉセルラーゼのそれと比較して示すものであ る。。第１図から分かるように、ＣＢＨＩとＣＢＨＩＩの欠けたセルラーゼ組成 物はＲＢＢ−ＣＭＣに材する最大セルロース加水分解活性がｐＨ５，５付近にあ り、ｐＨ約７から８のアルカリ領域でもある程度の活性がある。これに対して、 ＥＧＩ［Ｉに富んだセルラーゼ組成物は最大セルロース加水分解活性がｐＨ５， ５から６にあり、アルカリ領域でも相当のの活性がある。

実ハ璽練 等電集東ゲル この実施例の目的は異なるＥＧＩ七ルプルラーゼ組成物等電集束ゲル明すること である。すなわち、自生型のトリコダーマリーゼイによって産生されたセルラー ゼ、ＥＧｌ、ＥＧＩＩセルラーゼ蛋白を産生出来ないように変性したトリコダー マリーゼイの変種から誘導したセルラーゼおよびほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラー ゼを等電集束ゲルについて分析した。

これらのセルラーゼをＰｈｅｒｍａｃｉａ　ＩＥＦ装置（ＦＢＥ−３０００、Ｐ ｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、のＰｈａｒｍａｉｃａ社製）とｐＨ３から１０ のプリキャストゲル（Ｓｅｒｖａｌｙｔ　Ｐｒｅｃｏｔ、ドイツン、Ｃａｒｌ− Ｂｅｒｇの５ｅｒｖａ社製）を使用してメーカーのインストラクションにしたが って等電集束によって分析した。ゲルは蛋白バンドが見えるようにＥｐｈｏｒｔ ｅｃ変ｆｌ（Ｓｅｒｖａ　ＢｌｕｅＷ、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙの５ｅｒｖａ　Ｆｉ ｎｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）で汚した。得られたゲルを第２図に示す 。第２図では、レーンＡは自生型のトリコダーマリーゼイから誘導されたセルラ ーゼの等電集束ゲル、レーンＢはＥＧｌ、ＥＧＩＩセルラーゼ蛋白を産生出来な いように変性したトリコダーマリーゼイの変種から誘導したセルラーゼの等電集 束ゲル、レーンＣはほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼの等電集束ゲルを示す。こ の図では、各蛋白の特定ができるように七ルラーゼ蛋白に対応するバンドを示す マークをレーンＡに隣接する縁に付けた。

第２図から明らかなように、ＥＧ［ＴＩはｐＩが高いために、通常は高ｐＩキシ ラーゼ、高ｐＩのβ−グルコシダーゼ等の他の高ｐＩ成分と結び付く領域にＥＧ ［ＩＩが存在する。更に、第２図によればレーンＢにはＥＧＩＩＩはあるがＥＧ ｉＥＧｌｌはないことがらＥＧＩＩＩはＥＧＩの減成産物でもなければ、ＥＧＬ Ｉの減成産物でもないことが分かる。

実加ル燈 玖回湛１ ＥＧＩＩＩセルラーゼの綿含有生地の色全回復する能力について分析した。擦り 切れた綿の生地の色の鮮明度の低下は表面の繊維が生地の上に集積することによ って生じる。その集積した繊維のために生地が退色した艶消しの外観を呈する。

したがってその集積した繊維を取り除くことが、その生地の元の鮮明な色を回復 するためには不可欠である。この意味において、この実施例ではＥＧｒｌｌセル ラーゼの表面繊維を取り除く能力を測定して、色を回復する能力を決定した。

この実施例では二つの異なる組成物の表面繊維を取り除く能力を比較した。第１ の組成物は実施例２と同様にして調製したほぼ純粋なＥＧＩＩＩ七ルラーセルラ ーゼおり、第２の組成物はＥＧＩＩＩ七ルラーセルラーゼいなかった。

この実施例では、０．５ｍｅのノニオン界面活性剤を含む２０ｍＭのシトレート ／フォスフェート緩衝液４００ｍｅずつに適当量のセルラーゼ（もし使用するな ら）を加えた。サンプルを調製滴定し、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９の４つ のサンプルを作った。得られた溶液を別々のラウンゾロメータキャニスタ−（Ｉ ａｕｎｄｅｒｏｍｅｔｅｒ　ｃａｎｉｓｔｅｒ）に加えた。これらのキャニスタ −に繊維除去を容易にするための大理石をフインチＸ５インチの綿生地（１００ ％綿織物、２００Ｂｌａｃｋｆｏｒｄ　ａｖｅ、、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＮＪＯ ８８４６のＴｅ５ｔ　Ｆａｂｒｉｃｓ、　Ｉｎｃ製スタイルＮｏ、４３９Ｗ）と ともに加えた。次に各Ａヤニスター全閉めて、４３°Ｃに保たれているラウンゾ ロメータ浴に沈め、少なくとも約４Ｏｒｐｍで約１時間回転させた。その後、生 地を取り出して、よくすすいで、標準のドライヤーで乾燥した。

このように処理した生地の繊維除去をパネルテストの評価によって分析した。各 生地は印を（ＸＩけずに６人によって繊維のレベルを評価した。各生地の表面繊 維を目視で評価し、７の等級に分けた。各等級に対して次のような見本を使用し た。

全ての見本の生地は、２００Ｂｌａｃｋｆｏｒｄ　ａｖｅ、、Ｍｉｄｄｌｅｓｅ ｘ、ＮＪＯ８８４６のＴｅ５ｔＦａｂｒｉｃｓ、　Ｉｎｃ製の１００％綿の粗布 規格化試験生地（スタイルＮｏ、４３９Ｗ）であった。また各見本を処理したセ ルラーゼは同一の組成であり、その濃度は総蛋白に基づくものである。ラウンゾ ロメータ処理条件は実施例１６と同じである。

各生地は上記見本の内で最も近いものの等級を与えられ、各生地に対して全員が 与えた等級の値を合計し平均値をだした。この値が小さい程４ＩＩｉ維除去が良 いことになる。

この分析の結果は第３図に示されている。第３図からほぼ純粋なＥＧＤＩセルラ ーゼが酸性、中性、アルカリ性のいずれにおいても繊維除去に寄与することが明 らかである。

蛋白質溶液（濃度１ｍｇ／ｍｆｆ）０．１ｍｅに０．９ｍｆｆのア七トンを加え て、−２０°Ｃで１０分間インキュベートしてＥＧｒｌｌ成分を沈殿させた。蛋 白質を遠心分離で集め、そのベレットを乾燥し、８Ｍの尿素０．０１ｍｅの８８ ％蟻酸溶液中及びジアノゲンブロミド（２００ｍｇ／ｍｆｆ）０．０１ｍｆｆの ８８％蟻酸溶液中に再懸濁させた。その混合物を室温で４時間インキュベートし た。

個々のペプチドをＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー戸ラムで精製した。５ ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　ＲＰ−４コラムを０．０５％のＴＥＡ（トリエ・１−ルア ミン）と０．０５％のＴＦＡとｍ１ｌｌｉＱ水中で平衡させた。サンプルＨ什Ｌ Ｃコラムに充填し、１００％７セトニトリル、０．０５％のＴＥＡ、　０．０５ ％のＴＦＡで１％ん１分の勾配で溶離を行った。分離されたペプチドのアミノ末 端基領域を完全自動装置を使用してエドマン法で配列した。ＥＧＩＩＩ成分の２ つの部分から得られたアミノ酸配列が第４図に示されている。

実施Ｖ〃 トリコダーマリーゼイの　ｒ４誘導体選出ｐｙｒ４遺伝子はウリジンを生合成す るのに必要な酵素であるオロチジン−５°−モノフォスフェートデカルボキシラ ーゼをコードする。

毒性インヒビターの５−フルオロオロチックアシノド（ＦＯＡ）を自生型セルに よって組み込んでそのセル全こわした。しがしながら、ｐｙｒ４遺伝子に欠陥が あるセルはこのインヒビターに耐性があり、ウリジンに増殖をめる。そのため、 ＦＯＡを使用してｐｙｒ４誘導体変種選出が可能である。実際には、トリコダー マリーゼイ変種ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｏｎ ｔｅｎｅｃｏｕｒｔ、　Ｂ、８．　Ａ　１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌ、２０゜Ｐ、４６−５３（１９８４）参照）の胞子を２ｍｇ／ｍｅ のウリジンと１．２ｍｇ／ｍｅのＦＯＡを含む固形媒質の表面にまいた。３．４ 日の内に自発性耐ＦＯＡコロニーが現れ、ウリジンに増殖をめる耐ＦＯＡ誘導体 を特定することができた。それらの欠陥のあるｐｙｒ４遺伝子を特異的に有する 誘導体を特定するために、原形体を作り、自生型のｐｙｒ４遺伝子を含むプラス ミドで変性した。変性の後、原形体を媒質のうちウリジンに塗った。

その後に変性され！ごコロニーの増殖があったことは、欠陥ｐｙｒ４遺伝了・の プラスミドに担われたｐｙｒ４遺ｆ云子による補足性を示している。

このようにして、変種ＧＣ−６９が変種Ｒ１，Ｐ３７のｐｙｒ４誘導体であるこ とが特定された。

実加虚昭 ＣＢＨＩ欠失ベクターの調製 ＣＢＨＩ蛋白をコードするｃｂｈｌ遺伝子を、トリコダーマリーゼイ変種の遺ｆ 云子ＤＮＡから、公知のプローブ合成法（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ等による）によっ てこの遺伝子の既知の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオヂドブ１７−ブ とのハイブリッド成形によってクローニングした。ｃｂｈ　１遺伝子は６．５ｋ ｂＰｓＬＩ断片上にあり、公知の技法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等によって開示された ）によってベクターのＫａｎ遺伝子を置き換えて、ＰｓｔＩ切断ｐＵＣ４ｋ（Ｎ Ｊ、　ＰｉｓｃａｔａｗａｙのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、がら購入）に挿入 した。得られたプラスミド、ｐＵＣ４に：：ｃｂｈ　１をＨｉｎｄ［ＩＩで切断 し、約６ｋｂの大きい方の断）↑を分離し、再結紮してｐＵ０４に：：ｃｂｈｌ △Ｈ／Ｉ（（第５図参照）を得た。この手順によ一ノてｃｂｈｌをコードする配 列全体とフランキング（ｔｈａｎｋｉｎｇ）配列の約１．２ｋｂ上流と１．５ｋ ｂ下流が除かれる。元のＰｓｔＩ断片の両端からｌｋｂずつのフランキングＤＮ Ａが残る。

トリコダーマリーゼイのｐｙｒ４遺ｒム子を上述のＭａｎｉａｔｉｓ等の方法に １−たがっ−（’ｐＵ０１８内の遺（ｚｆ、子ＤＮＡの６．５ｋｂのＨｉｎｄｌ ｌｌ断片としてりｔＬ７−　二一ングしグご。〕゛ララスミドｐＵＣ：：ｃｂｈ ｌΔＨ／Ｔ（をＨｉｎｄｌｌｌで切断ｌ−１その両端を子牛の腸のアルカリフォ スファターゼでデフォスフ噌リレートしグご。この朱９嵩デフォスフ寸リレー） −ＤＮＡをｌ−リコダーマリーゼイのｐｙｒ４遺伝子を含む６．５ｋｂのＨｉｎ ｄ［Ｉ断片と結紮（Ｉｉｇａｔｅ）ｌ、ｐΔＣＢＨＩ　ｐｙｒ４を得た。このプ ラスミドの構造が第５図に示されている。

友胤呻 駒オヒ欧負 約５Ｘ１０７のトリコダーマリーゼイＧＣ６９の胞子（ｐｙｒ４誘導変種）に１ ００ｍｆｆ（７）ＹＥＧ（０，５％イーストエキス、２％グルコース）を５００ ｍ／ノ７ラスコ内で接種して菌糸体を得た。そのフラスコを振盪しながら３７° Ｃで約１６時間インキュベートした。２，７５０　ｘ　ｇで遠心分離して菌糸体 を収穫した。その菌糸体を１．２Ｍのソルビトール溶液で洗浄し、更に５ｍｇ／ ｍｔ’のＮｏｖｏｚｙｍＲ２３４溶液（１，３−，７−グルカナーゼ、■、３− β−グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナーゼ、キヂナーゼおよびプロテア ーゼを含む多成分酵素系の商品名、ＣＴ、　ＤａｎｂｕｒｙのＮｏｖａＢｉｏ１ ａｂｓ？ｆ製）、５ｍｇ／ｍｅのＭｇＳＯ４−７Ｈ２０，０，５ｍｇ／ｍｅの牛 の血清アルブミン、および１，２Ｍのソルビトールを含む溶液中に再懸濁させた 。細胞層から原形体をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣＡ、　Ｌａ　ＪｏｌｌａのＣａｌ ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｏｒｐ、製）を使用した濾過によって取りだし、２０００　 ｘ　ｇでの遠心分離で回収した。その原形体を１．２Ｍのソルビトール中で３度 洗浄し、１．２Ｍのソルビトール、５０ｍＭのＣａＣｌ２中で１度洗浄し、遠心 分離し、１．２Ｍのソルビトール、５０ｍＭ”−）ＣａＣ１２１ｍｅにつき約２ ２１０８の原形体の密度で再！ｌｖ濁させ／こ。

実施例１０ 直り凶二μｍ世工匠団ｂす」皿 実施例９で調製した原形体懸濁液２ｏｏｌ／ｅを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒ ｉｓ、　ｐＨ７，４，１ｍＭのＥＤＴＡ）および５０ｐｅのポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）溶液（２５％ＰＥＧ４０００．０．６Ｍ）ＫＣＩおよび５０ｍＭ のＣａＣｌ２を含む）中で、ＥＣ０ＲＩ消化ｐΔＣｌ５ＨＩ　ｐｙｒ４（実施例 ８で調製）に加えた。この混合物を氷の−［−で２０分間インキュベートした。

このインキュベーション期間の後、」−述のＰＥＧ溶液を２．０ｍｆｆ加えた。

そしてその溶液を更に混合して、５分間室温でインキュベートした。この２回目 のインキュベーションの後、１．２Ｍのソルビトール、５０ｍＭのＣａＣｌ２を 含む溶液４．０ｍｅを加え、更（二混合した。その原形体溶液を、更に１％のグ ルコースと１．２Ｍのソルビトールと１％のアガロースとを含むフォーゲル（７ ’）媒質Ｎ（Ｉｅあたり３ｇ（７）ソジウムシトレート、５ｇノＫＨ２ＰＯ４， ２ｇ（７）ＮＨ４Ｎ０３．０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，１ｇのＣａＣ ］ｇ２Ｈ２０、ｓｐｇのａ−ビオチン、５ｍｇのクエン酸、５ｍｇのＺｎＳＯ４ ・７Ｈ２０，１ｍｇのＦｅ（ＮＨ４）２・６Ｈ２０，０，２５ｍｇのＣｕＳ０４ ７５Ｈ２０，５０ｐｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２０を含む）の溶融アリコートに直ち に加えた。その原形体／媒体混合物全回じフォーゲルの媒質を含む固体媒質上に 注いだ。その媒質にはウリジンが存在しないので、ｐΔＣＢＨＩ　ｐｙｒ４内の 自生型ｐｙｒ４遺伝子インサートによる変ｆ！ＧＣ６９のｐｙｒ４突然変異の補 足の結果として変性コロニーのみが増殖できた。これらのコロニーを移して、１ ％のグルコースを添加剤として含む固体フォーゲルの媒質Ｎ上で精製した。次の 分析のために安定した変性様（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を選んだ。

この段階では、安定した変性様は、増殖の速さと、ウリジンのない培養基上での ぎざぎざでない滑らかな輪郭を持つ円形のコロニーの形成によって不安定な変性 様と区別した。その変性様を固体の非選択的培養基（すなわちウリジンを含む） 上で増殖させ、胞子を取って、その胞子の内でウリジンのない選択的培養基上で 発芽し増殖するものの割合を決定することによって安定度を試験した場合もあっ た。

犬旌四Ｕ 実施例１０で得た変性様から、その変性様を液体フ（−ゲルの媒質Ｎ上で増殖さ せた後、ＤＮＡを分離した。その変性様ＤＮＡサンプルをＰｓｔ　Ｉ制限酵素で 切断し、アガロースゲル電気泳動にかけた。そのゲルをＮｙｔｒａｎメンブラン フィルタ−上に移し、３２ｐで標識したｐΔＣＢＨＩ　ｐｙｒ４プローブとの間 でハイブリットを形成した。そのプローブは自生のｃｈｂｌ遺伝子を６．５ｋｂ Ｐｓｔ　Ｉ断片、自生のｐｙｒ４遺伝子および変性ＤＮＡ断片から誘導されるい ずれかのＤＮＡ配列であると特定するために」パ択された。

ハイブリッド形成からの放射性バンドをオートラジオグラフィーで可視化した。

第７図はそのオートラジオグラフを示す。５つのサンプルが上記のように処理さ れた。そのサンプルをサンプルＡ、　Ｂ、Ｃ，Ｄ、　Ｅとする。レーンＥは変性 されていない変種ＧＣ６９であり、この分析においてコントロールとして使用さ れた。レーンＡがらＤは上述の方法で得られた変性様を表している。オートラジ オグラフの横の数字は分子量マーカーの大きさを表している。このオートラジオ グラフから分かるように、レーンＤは６．５ｋｂのＣＢＨＩバンドを含んでいな い。これはこの遺伝子が、ＤＮＡ断片がｃｂｈｌ遺伝子に組み込まれることによ って変性様の中から完全に除かれていることを示している。ｃｂｈｌを除去され た変種はｐ３７ΔＣＢＨＩと呼ばれる。第６図は一方のトリコダーマリーゼイ上 のｃｂｈｌ遺伝子座におけるｐΔＣＢＨＩ　ｐｙｒ４からの大きい方のＥｃｏＲ Ｉ断片のダブルクロスオーバーを通じた組み込みによるトリコダーマリーゼイの ｃｂｈｌ遺伝子際去を概略的に示すものである。他の変性様の分析結果は変性さ れていないコントロールと同じであった。

去施洩叱 Ｌｌメ旦ＨＩはムゑ塞憔燻二盆哲 本実施例は使用するプローブを３２ｐで標識したｐ　Ｉ　ｎＬｃＢＨＩプローブ に変えた以外は実施例１１と同様な方法で行った。このプローブはｐＵ０４に： ：ｃｂｈ　１Δ）Ｌ／Ｈにおいて取り除かれた領域内のｃｂｈｌ座からの２ｋｂ のＢｇｌ　ＩＩ断片をかむｐＵＣ型プラプラスミドる。この実施例はサンプルＡ とサンプルＢの２つのサンプルについて行われた。サンプルＡはコントロールで あり変性していない変ｆｉＧｃ６９であり、サンプルＢは変性様Ｐ３７ＰΔＣＢ ＨＩであった。第８図から明らかなように、６．５ｋｂのバンドが示すようにサ ンプルＡはｃｂｈｌ遺伝子を含んでいたが、変性様サンプルＢはｃｂｈ　１遺（ Ｅ、子もｐＵＣプラスミドから誘導されるどんな配列も含んでいない。

太旌厩す 突田胆ｌ串区旦Ｗ巳聾召１熊１公叉 Ｐ３７ＰΔＣｌ５ＨＩ変種からの胞子を１％のグルコース、０．１４％の（ＮＨ ４）２８０４．０．２％のＫＨ２ＰＯ４，０，０３％のＭｇＳＯ４，０，０３％ の尿素、０．７５％のバクトドリブトン、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０．０．０ ０００１６％のＣｕ　Ｓ０４　・５　Ｈ２Ｏ、ｏ、ｏｏｉ％のＦｅＳＯ４・７Ｈ ２０，０，０００１２８％のＺｎＳＯ４・７Ｈ２０，０，０００００５４％のＮ ａ２ＭｏＯ４・２　Ｈ２Ｏ，０，００００００７％のＭｎＣ１４Ｈ２Ｏを含むト リコダーマ基礎媒質５０ｍｅに接種し、その媒質を２５０ｍｅフラスコ中で振盪 しながら、３７℃で約４８時間インキュベートした。得られた菌糸体をＭｉｒａ ｃｌｏＬｈによる濾過によって回収し、１７ｍＭのリン酸カリウムで２ないし３ 回洗った。さらにその菌糸体をラジオローズ１ｍＭを含む１７ｍＭのリン酸カリ ウム中に懸濁させ、振盪しながら、３０’Ｃで約２４時間さらにインキュベ−１ ・した。上澄みをこれらの培養基から回収し、菌糸体を捨てた。その上澄みサン プルをＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔｇｅｌ装置とｐＨ３から９のプリキャス トゲルを使用して等を集束によって分析した。ゲルは蛋白バンドが見えるように 銀で汚された。第９図に示すようにｃｂｈｌ蛋白に対応するバンドはＰ３７ＰΔ ＣＢＨＩ変種がら誘導されたサンプルには欠けている。この等電集束ゲルはトリ コダーマリーゼイの異なる上澄み培養基内の種々の蛋白を示している。レーンＡ は部分的に精製されたＣＢＨｌ、レーンＢは変性されていないトリコダーマリー ゼイ培養基からの上澄み、レーンＣは本発明の方法にしたがって製造されたＰ３ ７ＰΔＣＢＨＩ変種からの」二澄みである。それぞれのセルラーゼ成分の位置に ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、Ｅ（ｄ、ＥＧ［Ｉ、ＥＧＩＩＩと標識した。ＣＢＨＩは 総細胞外蛋白の５０％を占める主たる分泌蛋白であるため、最も黒いバンドにな っている。この等電集束ゲルはＰ３７ＰΔＣＢＨＩ変種からＣＢＨＩ蛋白が除去 されていることを明確に示している。

夾旌匹尺 ばがユ男匪犯Ｐ製 第１０Ａ図に模式的に示すように（Ｃｈｅｎ等の、　１９８７．　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ、５−２７４−２７８）遺伝子ＤＮＡの４．１ｋｂのＥｃｏＲＩ 断片としてクローニングされた、ＣＢＨＩＩ蛋白をコードするトリコダーマリー ゼイｃｂｈ２遺伝子をｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲＩ部位間に挿入した。後者のプラ スミドはｐＵＣ誘導体（Ｇｅｎｅｃｏｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ 、　Ｒ，Ｍ、　Ｂｅｒｋａによる）であり、次に示すような順で並んだ制限エン ドヌクレアーゼ部位の対称パターンを有する多重クローニング部位を含んでいる 。ＥｃｏＲ１，ＢａｍＨＩ　。

Ｓａｃ　Ｉ　、　Ｓｍａ　Ｉ　、　ＨｉｎｄｌＩＩ、Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｂｇｌ　 ＩＩ、Ｃ１ａ　Ｉ、Ｂｇｌ　ＩＩ、Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｈｉｎｄｍ、Ｓｍａ　Ｉ　 、　Ｓａｃ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ公知の方法によって、Ｈｉｎｄ　 Ｉ１１部位（ＣＢＨＩＩ翻訳開始部位の７４ｂｐ３’）とＣ１ａ　１部位（ＣＢ ＨＩＩ　ｊｉ’を後のコドンの２６５ｂｐ３’）の間の１．７ｋｂの中央領域が 除かれ、トリコダーマリーゼイｐｙｒ４遺伝子を含む１．６ｋｂのＨｉｎｄｌｆ ｌ　−Ｃ１ａ　Ｉ　ＤＮＡ断片と入れ変えてなる、プラスミド、ｐＰΔＣＢＨＩ Ｉ（第１０Ｂ図）を形成した。

トリコダーマリーゼイｐｙｒ４遺伝子を１．６ｋｂのＮｈｅ　Ｉ　−Ｓｐｈ　Ｉ 断片に乗せてｐ’ｒｐｙｒ２（第８図参照）から除去し、ｐＵｃ２１９（実施例 ２２参照）のｓｐｈ　１部位とＸｂａＩ部ｆヶの間に挿入してｐ２１９Ｍ（Ｓｍ ｉｔｈ等、１９９１、Ｃｕｒｒ、　ＧｅｎｅＬ　１９ｐ、２７−３３）を作った 。次に、ｐｙｒ４遺伝子を、ｐＵｃ２１９ｎ。

多重クローニング部位から誘導された一端にＤＮＡの７ｂｐを有し、他端に６ｂ ｐを有するＨｉｎｄ　［１１−Ｃ１ａ　Ｉ断片として除去し、ｃｂｈ２遺伝子の Ｈｉｎｄｌ１１部位およびＣ１ａ　Ｉ部位に挿入して、プラスミド、ｐＰ△ＣＢ ＨＩＩ（第１０Ｂ図）を形成した。

このプラスミドをＥｃｏＲＴで消化すると、ｃｂｈＺ座からの０．７ｋｂのフラ ンキングＤＮＡを一端に有し、ｃｂｈＺ座からの１．７ｋｂのフランキングＤＮ Ａを他端に有し、トリコダーマリーゼイｐｙｒ４遺伝−ｒ−を中央に有する断片 が遊離される。

実施匿坊 上巴二ノ上ニゲ肚＝隻追突輿」坦卯形ジ以ｌ直臥Ｌ９除去実施例８．９で説明し た方法で変種ＧＣ６９の原形体を得、ＥｃｏＲＩ消化ｐＰΔＣＢＨｎで変性する 。その変性種からのＤＮＡをＥｃｏＲＩとＡｓｐ７１８で消化し、アガロースゲ ル電気泳動にかける。そのゲルからのＤＮＡをメンブランフィルタ−１−に移し 、３２ｐで標識したｐΔＣＢＨＩＩどの間で実施例１７の方法でハイブリットを 形成した。その変性種はｃｂｈ２座に正確に組み込まれたｐＰΔＣＢＨｎからの ＥｃｏＲＩ断片の単一のコピーを有するものとして特定される。またその変性徨 は実施例１３において振盪フラスコ内で増殖され、培養基の上澄み内の蛋白が等 電集束で調べられる。このようにして、ＣＢＨＩＩ蛋白を産生じないトリコダー マリーゼイ変種Ｇｃ６９が形成される。

大施匹胆 Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩの　ｒ４誘導本の形成ｃｂｈｌＪｉｆｉ子を除去された変性 ｆｌ（Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ）の胞子をＦＯＡを含む媒質上にまいた。次にこの変 性種のｐｙｒ４誘導体を実施例７の方法で得た。このｐｙｒ４変種はＰ３７ＰΔ ＣＢＨＩ　Ｐｙｒ２６と名ずけた。

去施匿奴 Ｃ抽山粗左り主除去上土１５」駐江世ユ竺除人変徨Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ　Ｐｙｒ ２６を形成し、実施例８．９で説明した方法でＥｃｏＲＩ消化ｐＰΔＣＢＨＩ［ で変性した。

精製された安定な変性種を実施例１３と同様にして振盪フラスコ内で培養し、上 澄み内の蛋白を等電集束で調べた。変性種の１つ（Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７と命 名）はＣＢＨ［１蛋白を全く産生じなかった。第９図のレーンＤは本発明の方法 で作られた、ｃｂｈｌ遺伝子、ｃｂｈ２遺伝子の両方を除去された変性挿の上澄 み を示している。

ＤＮＡを変種Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７から抽出し、ＥｃｏＲＩとＡｓｐ７１Ｂで 消化させ、アガロースゲル電気泳動にかけた。そのゲルからのＤＮＡをメンブラ ンフィルタ−上に移し、３２ｐで標識したｐΔＣＢＨＩＩとの間でハイブリット を形成した。（第１１図）第１１図のレーンＡは変性されていないトリコダーマ リーゼイ変種からのＤＮＡのハイブリッド形成パターンを示している。自生型の ｃｂｈ２遺伝子を含む４．１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が見られた。レーンＢは変ｆ ｉＰ３７ＰΔΔＣＢＨ６７のハイブリッド形成パターンを示している。屯−の４ ．１ｋｂバンドが消えており、はぼ０．９と３．１ｋｂの２本のバンドに変わっ ている。これは、ｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一のコピーがｃｂ ｈ２座に正確に組み込まれたとすると当然予想されるパターンである。

同じＤＮＡサンプルをＥｃｏＲＩで消化させ、上述と同様にサラン法を実行した 。この実施例では、プローブとして３２ｐで標識したｐＩｎＬｃＢＨＩＩを使用 した。このプラスミドにはプラスミドｐＰΔＣｌ５Ｈ１１から除去したｃｂｈ２ 遺伝子のセグメントのｃｂｈ２遺伝子をコードする配列の一部が含まれている。

変種Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７からのＤＮＡとの間にはハイブリッド形成が見られ なかったが、これはｃｂｈ２遺伝子が除去されており、したがってこの変種には ｐＵＣプラスミドから誘導された配列が存在しないことを示している。

去踵匹坊 ｐｕ上度Ｕ史形戊 ＥＧＩをコードするトリコダーマリーゼイのｅｇｌｌ遺ｆ云子を、公知の配列（ ｐ６Ｈｔｔｉｌａ等、１９８６．　Ｇｅｎｅ　４５：２５３−２６３；　ｖａｎ 　Ａｒ５ｄｅｌ１等、　１９８７゜Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：６Ｏ− ６４）に従って合成した］ダレヌクレチぢドとのハイブリッド形成によって変種 ＲＩ、−Ｐ３７からの遺伝子ＤＮＡの４．２ｋｂの１Ｉｉｎｄ用断片としてクロ ーニングした。このりＩＪ−ンから３．６ｋｂのＨｉｎｄ　［Ｉｌ　−ＢａｍＨ Ｉ断片をとりだし、ｐＴｐｙｒ２（実施れ８参照）から得たトリコダーマリーゼ イｐｙｒ４遺伝子と、Ｈｉｎｄｌｌｌで切断したｐｃＵ２１８（ｐｃＵ２１９と 同じであるが（第２２図参照）、反対方向に多重クローニングぶいをもっている ）とを含む１．６ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ断片と結紮して、プラ スミドｐＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ４を得た（第１２図）。ｐＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ４をＨｉ ｎｄｌｌｌで消化させることによって、２つの遺伝子の間の２４ｂｐの配列され た合成りＮＡと一端の６ｂｐの配列された合成りＮＡを除いてはトリコグーマリ ーゼイの遺伝’ｆ−ＤＮＡのみを含むＤＮＡ断片が遊離される（第１２図参照） 。

去履匿坦 １λＬ辷］磨■肛挾句墓ユ」三ヱニニ光＝ハフ獲韮トリコダーマリーゼイの変ｆ ！１Ｒｕｔｃ３０（Ｓｈｉｅｒ−Ｎｅｉｓｓ　ａｎｄＭｏｔｅｎｅｃｏｕｒｔ、 　（１９８４）、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ 、　２０：４６；５３）のｐｙｒSに 欠陥のある誘導体を実施例７の方法で得た。この変種の原形体を未消化のｐＥＧ 　Ｉ　ｐｙｒ４で変性し、安定な変性徨を精製した。

これらの変種の内の５つ（ＥＰ２、ＥＰ４、ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰＩＩ）を変性 していないＲｕＬＣ３とともに２５０ｍｅの振盪フラスコ中で５０ｍｅのＹＥＧ 媒質（イーストエキス５ｇ／ｅ、グルコース２０ｇｏに接種して、振盪しながら ２８°Ｃで２日間培養した。得られた菌糸体を無菌水で洗い、５０ｍｅＬｙ′） ＴＳＦ媒質（０，０５Ｍのシトレートｌフォスフェート緩衝液、ｐＨ５；アヴイ 七ル微品質セルロース、Ｌｏｇ／ｅ；　ＫＨ２ＰＯ４，２，０ｇ／ｅ；　（ＮＨ ４）２ＳＯ４，１，４ｇ／ｅ；ブロテオーゼベブトン、１．０ｇ／ｅ；尿素、０ ．３ｇ／ｌ’；　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０，０，３ｇ／ｅ；ＣａＣｌ２．０．３ｇ ／ｆｆ；　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０，５，０ｍｇ／ｅ；　ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，１ ，６ｍｇ／ｅ；ＺｎＳＯ４，１，４ｍｇ／ｅ；　ＣｏＣｌ２．２．０ｍｇ／ｅ； ０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）に加えた。これらの培養基を振盪しながら２８°Ｃで さらに４日間インキュベートした。

これらの培養基から］二澄みのサンプルを取りだし蛋白の総量の測定とエンドグ ルカナーゼの活性の測定を以下のようにして行った。

エンドグルカナーゼの活性の測定はＲｏｍａｚｏｌ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌ ｕｅ−ｃａｒｂｏｘｉｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　（ＲＢＢ−ＣＭＣ，Ａ ｕ５ｔｒａｌｉａ　Ｎｏｒｔｈ　ＲｏｃｋｓのＭｅｇａＺｙｍｅ社性）からの可 溶性の染められたオリゴサツカライドの遊離に元ずいて行った。２ｇの乾燥ＲＢ Ｂ−ＣＭＣを沸騰したばがりの脱イオン水８０ｍｅに激しく撹拌しながら加えて 基質を調製した。室温まで温度が下がってから、２Ｍのソヂウムアセテート緩衝 液（ｐＨ４，８）を５ｍｅ加えて、ｐＨを４．５に調整した。脱イオン水で体積 を最終的に１００ｍ／にし、アジ化ナトリウムを最終濃度が０．０２％となるよ うに加えた。トリコダーマリーゼイコントロール培愛基のアリコート、ｐＥＧ　 Ｔ　ｐｙｒ４変性挿の培養基上澄みのアリコート、０．１Ｍのソヂウムア七テー ト１０−２０μｅ（ブランクとして）を試験管に入れ、２５０ｐｅの基質を加え て、その試験管を３７°Ｃで３０分間インキュベートした。その試験管全１０分 量水の上に置き、１ｍｅの冷やした沈殿剤（３，３％ソヂウムアセテート、０． ４％の酢酸亜鉛、７６％エタノール、塩酸でｐＨ５に調整）を加えた。その試験 管を撹拌して、５分間放置した後、約１３，０００　ｘ　ｇで３分間遠心分離し た。光学濃度を５９０から６００ｎｍの波長で分光光度分析によって測定した。

使用された蛋白測定はｌ１ｌｉｎｏｉｓ州ＲｏｃｋｒｏｒｄのＰｉｅｒｃｅ社製 の試薬を使用するＢＣＡ（パイシンコニン酸）測定であった。標準は牛の血清ア ルブミンであった。ＢＣＡ試薬は試薬Ｂ１部と試’ＸＡ３０部を混合して作った ０１ｍｅのＢＣＡ試薬を適当に希釈したＢ５Ａ３０μｅもしくは測定培養基の上 澄みと混合した。３７°Ｃで３０分間インキュベートし、最後に光学濃度を５６ ２ｎｍの波長で分光光度分析によって測定した。

上記測定の結果を表１にしめす。変性棟のなかには変性してない変種Ｒｕｔ３０ に比べて大量のエンドグルカナーゼ活性を産生じたものがあるのは明白である。

変性してないトリコダーマリーゼイによって産生されたエンドグルカナーゼとエ キソ−セロビオハイドロラーゼは分泌された蛋白の総量のそれぞれ約２０％と７ ０％を占めると考えられる。それ故、ＥＰ５のような変性種は、変ｆｆ１Ｒｕｔ ３０の約４倍以上のエンドグルカナーゼを産生ずるが、エンドグルカナーゼ型蛋 白とエキソ−セロビオハイドロラーゼ型蛋白をほぼ同量ずつ分泌すると思われる 。

この実施例の変性挿は無傷のｐＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ４を用いて得られ、ｐＵＣプラ スミドから誘導されたゲノムに組み込まれたＤＮＡ配列を含んでいる。変性の前 に、ｐＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ４をＨｉｎｄＴＩ＋で消化し、トリコダーマリーゼイＤ ＮＡのみを含むより大きなりＮＡ断片を分離することも出来る。

この分離されたＤＮＡ断片でトリコダーマリーゼイを変性するとＥＧＩを過剰に 産生じ、第１２図に示した２本の短い合成りＮＡ以外は異種のＤＮＡ配列を含ま なかったへんせいしゆを分離できたと考えられる。またｃｈｂｌ遺伝子とｃｈｂ ２遺伝子のどちらか一方又は両方を除去された変種を変性するのにｐＥＧ　Ｉ　 ｐｙｒ４を使用することも可能である。

このようにして、ＥＧＩ＆過剰に産生じエキソ−セロビオハイドロラーゼをほと んどまたは全く産生じない変種を形成することができると思われる。

実施例１９の方法によって、トリコダーマリーゼイによって通常作られる他のセ ルラーゼ成分、キシラナーゼ成分および他の蛋白質の任意のものを過剰に産生す るトリコダーマリーゼイの変種を作ることができると思われる。

上記結果は、総蛋白質に対してＥＧＩ成分を過剰に生産できることを示すために 掲げたものであり、過剰生産される量を示そうとするものではない。この、つに 関して、過剰生産される量は実験の度に変わると予想される。

大旌憇苑 区工玖ま０形戊 ＥＧＩをコードする配列がｃｂｈｌ遺伝子からのプロモーターに機能的に結合さ れているプラスミド、ｐｃＥＰｃｌ、を形成した。これはｃｂｈｌ遺伝子とｃｂ ｈ２遺ｆ云子のＤＮＡはい列を変えて、それぞれの翻訳開始部位のすぐ５゛末端 側（上流）に便利な制限エンドヌクレアーゼクリーヴイノジ部位を作るために生 体外部位特異的ミュータゲネシス（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用してなされ た。２つのＤＮＡセグメントの結合部における予想される配列を実証するために ＤＮＡ配列分析をした。その変更が第１３図に示されている。

ｐｃＥＰｃｌを形成するために組み合わされたＤＮＡ断片はｐＵＣ４にのＥｃｏ Ｒ１部位の間に挿入され、次の通りであった（第１４図参照）。

Ａ）ｃｂｈｌ座の５“フランキング領域からの２．１ｋｂの断片。これはプロモ ーター領域を含み、操作されたＢｃｌ　１部１ケまで延び、ｃｂｈ　１をコード する配列を含んでいない。

Ｂ）操作されたＢａｍＨＩ部位を有する５“末端がら始まり、コード領域を通っ て延びるとともに翻訳終結コドンを越えた約０．５ｋｂを含むｅｇｌ　ｌ座から のゲノムＤＮＡの１．９ｋｂの断片。その断片の３“末端には、ｐＵｃ２１８多 重クローニング部位から誘導された１ｓｂｐとこの断片を下記の断片とリンクす るのに使用される１５ｂｐの合成オリゴヌクレオチドがある。

Ｃ）約１ｋｂｆ流の位置からｃｂｈｌＢ訳終結コドンの約２．５ｋｂＴ流まで延 びる、ｃｂｈｌＥの３°フランキング領域からのＤＮＡ断片。

Ｄ）断片（Ｃ）のＮｈｅＩ部位に挿入されたのは、ｐＴｐｙｒ２（実施例８）か ら得られたトリコダーマリーゼイｐｙｒ４遺伝子を含むとともに一端にｐＵｃ２ １８多重クローニング部位から誘導された２４ｂｐのＤＮＡを有するＤＮＡの３ ．１ｋｂのＮｈｅ　Ｉ　−Ｓｐｈ　Ｉ断片であった。

プラスミドｐｃＥＰｃ１は、ホスト変種に外部のＤＮＡを持ち込まずにＣＢＨＩ をコードする配列を置き換えてＥＧＩコード配列をｃｂｈｌ座に組み込むように 股引されている。ＥｃｏＲＩによってこのプラスミドを消化すると、ｃｂｈｌプ ロモーター領域、ｅｇｌｌコード配列、ｅｇ１１転写終結領域トリコダーマリー ゼイｐｙｒ４遺伝子およびｃｂｈｌ座の３′（下流）フランキング領域からのＤ ＮＡセグメント（第１３図参照）を含む断片が遊離する。

大旌区麩 ＣＥＰＣＩＤＮＡを含む弁性重 トリコダーマリーゼイの変種ＲｕｔＣ３０（Ｓｈｉｅｒ−Ｎｅｉｓｓ前出）のｐ ｙｒ４に欠陥のある誘導体を実施例７の方法で得た。この変種をＥｃｏＲＩで消 化されたｐｃＥＰｃｌで変性した。安定な変性種を選択して実施例１９で述べた ようにセルラーゼを作るために振盪フラスコ内で培養した。そのセルラーゼ可視 化するために等電集束ゲル電気泳動を実施例１３に記載の方法でこれらの培養基 からのサンプルに対して行った。このようにして分析した計２３の変性棟の内１ ２はＣＢＨＩ蛋白を生産しなかった。

これはｃｂｈｌ座にＣＥＰＣＩＤＮＡを組み込んだことによる予想通りの結果で ある。サチン法を使用して、組み込みがこれらの変性種のし）くつかで確かに起 きたことを確認し、バクテリアプラスミドベクター（ｐＵＣ４Ｋ）から誘導され た配列が存在しない（第１５図参照）ことを確認した。この分析のために、変性 徨からのＤＮＡを、電気泳動を行し）メンブランフィルタ−に移す前に、Ｐｓｔ 　Ｉで消化させた。得られたサザンブロノトを放ローＦ線標識したプラスミドｐ ＵＣ４に：：ｃｂｈｌ（第８図参照）でプローブした。そのプローブは変性され て１，１なｔ７１コントロール培養基からのＤＮＡの６．５ｋｂ断片上のｃｂｈ 　１遺ｒ云子とノ＼イブリ・ノド形成した。ｃｂｈｌ座にＤＮＡのＣＥＰＣＩ断 片を組み込むと、この６．５ｋｂノくノドが失われ、約１．Ｏｋｂ、２．０ｋｂ 、３．５ｋｂのＤＮＡ断片に対応する他の３つのノイノドが現れると予想される 。これは第１５図のレーンＣに示す変性棟について観察されたパターンそのもの である。また第１５図のレーンＢはｃｂｈ　ｌ座以外のデノム内の部位にｐｃＥ Ｐｃｌの複数のコピーが組み込まれた変性種の例である。

変性されていない培養基と変性棟の上澄みのサンプルに対して、各サンプルの蛋 白質濃度がほぼ０．０３ｍｇ／ｍｅから０．０７ｍｇ／ｍｅとなるようにそれら を前もって５０１キに希釈した以外は実施例１９と全く同様にしてエンドグルカ ナーゼ活性を測定した。変性されていないコントロール培養基と４つの異なる変 性種（ＣＥＰＣＩ−１０１、ＣＥＰＣＩ−１０３、ＣＥＰＣＩ−１０５、ＣＥＰ ＣＩ−１１２）に月して行った測定の結果を表２にしめす。ＣＥＰＣＩ−１０５ とＣＥＰＣＩ−１１２はＣＥＰＣＩ断片の組み込みがＣＢＨＩ産出の欠失につな がった例である。

上記結果は、総蛋白質に対してＥＧＩ成分を過剰に生産できることを示すために 掲げたものであり、過剰生産される量を示そうとするものではない。この点に関 して、過剰生産される量は実験の度に変わると予想される。

ｅｇｌｌ遺ｆ云子を置き換える他のどのトリコダーマリーゼイ遺伝子を有するｐ ｃＥＰｃｌに似たプラスミドを形成することも可能である。これによって、他の 遺ｆ云子を過剰生産させると同時にｃｂｈｌ遺伝子を除去することができる。

また他の遺伝子、例えば、ｃｂｈ２を予め除去されたトリコダーマリーゼイのｐ ｙｒ４誘導変種をｐｃＥＰｃｌで変性して、例えば、エキソー上＋１ビオハイド ＩＬフラーゼを生産せず、エンドグルカナーゼを過剰生産する変性挿を形成する ことも可能である。

ｐｃＥＰｃｌに似た構造であるが、トリコダーマリーゼイの他の遺伝子座からの ＤＮＡがｃｂｈｌ遺伝子座からのＤＮＡに置き換わっている構造を使用すると、 トリコダーマリーゼイゲノムの他の遺伝子座にある他のプロモーターの制御下で 遺伝子を挿入することが可能である。

実旌匿蔓 ｌｌｌ刊鷺９形戊 ＥＧ旧かってＥＧＩＩＩと呼ばれたこともある）をコードするｅｇ１３遺伝子を トリコダーマリーゼイと公知のＤＮＡ配列（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ等、　１９８Ｂ 。

Ｇｅｎｅ　６３：１ｌ−２１）からクローニングした。変（重ＲＩ、−Ｐ３７か らｐＵｃ２１９のＰｓｔ　Ｉ部位とＸｈｏ　Ｉ部位の間に挿入されたゲノ１ｔＤ ＮＡの約４ｋｂのＰｓｔ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片として遺伝子を得た。後者のベク ター、ｐＵｃ２１９、は多重クローニング部位をＢｇｌ　ＩＩ、Ｃ１ａ　Ｉ　、 　Ｘｈｏ　Ｉの制限部位を含むように拡大することによって、ｐＵｃ１１９（Ｗ ｉｌｓｏｎ等によって述べられている、１９８９．　Ｇｅｎｅ　７７：６９−７ ８）から誘導される。公知の技法によって、ゲノムＤＮＡの２．７ｋｂのＳａｌ 　Ｉ断片上にあるトリコダーマリーゼイのｐｙｒ４遺伝子をＥＧＩＩコード配列 内のＳａｌ　１部位に挿入しプラスミドｐＥＧ　Ｕ　：：Ｐ−１（第１６図）を 形成した。これによってどの配列も除去することなくＥＧＩＩコード配列をこわ した。プラスミドｐＥＧ　ＩＩ　：：Ｐ−１はＨｉｎｄｌＩＩとＢａｍＨＩに消 化されて、一端の５ｂｐと他端の１６ｂｐ（ともにｐＵｃ２１９の多重クローニ ング部位から誘導される）を除いてはトリコダーマリーゼイだけから誘導される ＤＮＡの直線断片を生じる。

実施例２３ 計速１ｊ醍１ヱυ二昼りひ二丘去二至ヱｑ四隻坐（お且鉦ユニ挺３１１％二判し 二と（蓋衷１影国立 トリコダーマリーゼイの変種ＧＣ６９をＨｉｎｄｕ［とＢａｍＨＩに消化された ｐＥＧ　Ｕ　：：Ｐ−１で変性し、安定な変性種を選ぶ。全ＤＮＡをその変性徨 から分離し、ｐｙｒ４遺伝子とｅｇ１３遺伝子を含むＤＮＡ断片がｅｇｌａ座に 組み込まれてＥＧｎコード配列をこわしている変性種を特定するためにサラン法 を実施した。その変性種はＥＧＩＩを生産できない。ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｇ ｌｌ遺伝子の１つまたは全部が除去されている変種を変性するのにもｐＥＧ旧： Ｐ−１を使用することができる。このようにして、あるセルラーゼ成分のみを生 産し、ＥＧＩＩ成分を生産しない変種を作ることができる。

大施週晟 ル旦七工工立エヒＬ振２ニニョ」７ヱ」二旦主ユニＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧ ＩＩを生産できない亦重を　る実施例７の方法によって変ｆｉＰ３７ＰΔΔＣＢ Ｈ６７（実施例１７で得た）のｐｙｒ４の欠けた誘導体を得た。この変種Ｐ３７ ＰΔΔＣＢＨ６７Ｐ１をＨｉｎｄｌＩＩとＢａｍＨＩに消化されたｐＥＧ　ＩＩ 　＋：Ｐ−１で変性し、安定な変性種を選んだ。全ＤＮＡをその変性種から分離 し、ｐｙｒ４遺伝子とｅｇ１３遺伝子を含むＤＮＡ断片がｅｇｌａ座に組み込ま れてＥＧＩＩコード配列をこわしている変性棟を特定するためにサラン法を実施 した。第１７図に示されているサザンブロノトをｐＵｃ１８のＰｓｔ　Ｉ部位に クローンされた後、再分離されていたｅｇ１３遺伝−ｒ−を含むトリコダーマリ ーゼイＤＮＡの約４ｋｂのＰｓｔ　Ｉ断片でプローブした。変種Ｐ３７ＰΔΔＣ ＢＨ６７Ｐ１から分離されたＤＮＡをサラン法のためにＰｓｔ　Ｉで消化すると 、ｅｇｌ３座がオートラジオグラフ上に忙−の４ｋｂバンド（第１７図、レーン Ｅ）として見えた。しかしながら、ｇ１３を破壊された変性徨の場合は、このバ ンドは失われ、予想通り２本の新しいバンド（第１７図、レーンＦ）に変わって いた。もしＤＮＡがＥｃｏＲＶまたはＢｇｌ　ＩＩに消化されていると、ｅｇ１ ３遺伝子に対応するバンドは変性されていないＰ３７ＰΔΔＣＢＨ６７Ｐ１変種 （レーンＡとＣ）とｅｇｌ３を破壊された変性種（第１７図、レーンＢとＤ）と の間で、約２．７ｋｂ（挿入されたｐｙｒ４断片の大きさ）拡大されている。第 １７図に示す破壊されたｅｇ１３遺伝子を含む変性種はＡ２２と命名された。第 １７図に特定された変性種はＣＢＨｒも、ＣＢＨＩ［も、ＥＧＩＩもを生産でき ない。

叉施聾％ Ｐ部ａｉ−ｉの形成 トリコダーマリーゼイの変種ＲＬ−Ｐ３７のｅｇｌｌ遺伝子を実施例１８のよう にしてゲノムＤＮＡの４．２ｋｂのＨｉｎｄｌＩｌ断片として得た。この断片な ｐＵｃｌｏｏ（ｐＵｃ１８の誘導体、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、１９８ ５．　Ｇｅｎｅ　３３：１０３−１１９、多重クローニング部位に挿入されてＢ ｇｌ　［＋、Ｃ１ａ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉの制限部位を増加させるオリゴヌクレオリ ドを有する）のＨｉｎｄｌ１１部位に挿入した。公知の技法を用いて、ＥＧＩコ ード配列の中央に近い位置からそのコード配列の３゛端を越える位置まで延びる 約１ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を除去し、ｐｙｒ４遺伝子を含むトリコダーマリーゼ イＤＮＡの３．５ｋｂのＣ１ａ　Ｉ断片と置き換えた。得られたプラスミドをｐ ＰＡＥＧＩ−１（第１８図参照）と命名した。

プラスミドｐＰΔＥＧＩ−１はＨｉｎｄＩ［Ｉで消化されて、どちらか一端にｅ ｇｌｌ遺伝子のセグメントを有し、ＥＧＩコード配列の一部に置き換わったｐｙ ｒ４遺伝子を中央に有するトリコダーマリーゼイのゲノムＤＮＡのみからなるＤ ＮＡ断片を遊離する。

ＨｉｎｄｌＩｌで消化されたｐＰＡＥＧＩ−１で適当な、ｐｙｒ４の欠けたトリ コダーマリーゼイ変種の変性によって、ある変性種ではこのＤＮＡ断片をｅｇｌ ｌ座に組み込む結果になる。このようにして、ＥＧＩを生産できない変（重がえ られる。

大施憇岨 Ｐ旺ＧＩ　ｒ−３の形成と　ｒ４の欠けたトリコダーマリーゼイ亦重の亦重 実施例２５の方法によって、ＥＧＩ遺伝子を不活性に出来るのではないかと言う 予測がこの実施例によって強められた。この場合には、Ａｓｏｅｒｇｉｌｌｕｓ 　ｎｉｇｅｒ　ｐｙｒ４遺伝子が；パ択可能なマーカーとしてトリコダーマリー ゼイｐｙｒ４遺伝子に置き換わっている以外はｐＰＡＥＧＩ−１に似ているＰＡ ＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ−３を形成した。この場合、ｅｇｌｌ遺伝しはｐＵｃｌｏｏの Ｈｉｎｄ１１１部位に挿入された４、２ｋｂの）ｉｉｎｄＩｒｌ断片として存在 した。同じｌｋｂの内部ＥｃｏＲＶ断片がｐＰＡＥＧＩ−１の形成中に（実施例 ２５参照）除去されたが、この場合には、クローンされたＡｓｏｅｒｇｉｌｌｕ ｓ　ｎｉｇｅｒ　ｐｙｒＧ遺伝子（Ｗｉｌｓｏｎ等、１９８８．　Ｎｕｃｌ、　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６ｐ、２３３９）を含む２．２ｋｂの断片によって置き 換えられた。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩに消化されて、ｅｇｌｌ座からのフランキング領 域を有するｐｙｒＧ遺伝子を含む断片を遊離した後に、トリコダーマリーゼイの ｐｙｒ４遺伝子の欠けた変種をＰＡＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ−３によって変性すると、 ｅｇｌ　１遺伝子の破壊された変性種が得られる。これらの変性種は、Ｈｉｎｄ ｌＢに消化された変性種ｆ）ＮＡのサラン法による分析によって認識し、放射線 標識されたＰＡＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ−３によってプローブした。トリコダーマリー ゼイの変性されていない変種においては、ｅｇｌｌ遺伝子はＤＮＡの４．２ｋｂ のＨｉｎｄＵＪ断片に存在した。しかじなから、その後、ＰＡＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ −３からの望ましい断片の組込みによって、ｅｇｌｌ遺伝そを除去すると、この ４．２ｋｂの断片が消え、約１．２ｋｂ大きい断片に置き換わった（第１９図、 レーンＡ）。第１９図のレーンＢ１１ｃｂｈｌ座以外のゲノム内の部位にｐＰΔ ＥＧ　Ｉ　ｐｙｒ−３の単一のコピーが組み込まれた変性撞の例である。

叉施聾Ｕ ＰΔＥＧＩ−１でのトリコダーマリーゼイの亦　によってＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ 、ＥＧｌ、ＥＧＩＩを生産できない左型を作る実施例７の方法によって変種Ａ２ ２（実施例２４で得た）のｐｙｒ４の欠けた誘導体を得る。Ｈｉｎｄｌｌに消化 されてどちらか一端にｅｇｌｌ遺伝子のセグメントを有するとともにＥＧＩコー ド配列の一部に置き換わったｐｙｒ４遺伝子を有するトリコダーマリーゼイのゲ ノムＤＮＡのみからなるＤＮＡ断片を遊離したｐＰＡＥＧＩ−１でこの変種を変 性する。

安定なｐｕｒ４＋変性種を選び、全ＤＮＡをその変性種から分離する。

ｐｙｒ４遺伝子とｅｇｌｌ遺伝子を含むＤＮＡ断片がｅｇｌｌ座に組み込まれて ＥＧＩコード配列をこわしている変性種を特定するためにサラン法を実施した後 、３２ｐで標識したｐＰＡＥＧＩ−１でプローブする。特定された変性種はＣＢ ＨＩも、ＣＢＨＩＩも、ＥＧＩも、ＥＧ■もを生産できない。

♀　愕　８　起　３　＝　Ｓ　８　。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）洗浄有効量の界面活性剤または界面活性剤混合物と、約０．０１から約５ｗ ｔ％のほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼからなる洗剤組成物。 ２）前記ほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼが前記洗剤組成物の約０．０５から約 ２ｗｔ％をしめることを特徴とする請求の範囲第１項記載の洗剤組成物。 ３）ＣＢＨＩ型成分を全く含まないことを特徴とする請求の範囲第１項記載の洗 剤組成物。 ４）ＣＢＨ型成分を全く含まないことを特徴とする請求の範囲第３項記載の洗剤 組成物。 ５）綿を含有する生地の柔らかさを高める方法であって、洗浄有効量の界面活性 剤または界面活性剤混合物と、約０．０１から約５ｗｔ％のほぼ純粋なＥＧＩＩ Ｉセルラーゼからなる洗剤組成物から得られる洗濯媒体でその生地を洗うことを 特徴とする方法。 ６）前記ほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼが前記洗剤組成物の約０．０５から約 ２ｗｔ％をしめることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。 ７）前記洗剤組成物がＣＢＨＩ型成分を全く含まないことを特徴とする請求の範 囲第５項記載の方法。 ８）前記洗剤組成物がＣＢＨ型成分を全く含まないことを特徴とする請求の範囲 第７項記載の方法。 ９）綿を含有する生地の色を保ちかつ回復する方法であって、洗浄有効量の界面 活性剤または界面活性剤混合物と、約０．０１から約５ｗｔ％のほぼ純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼからなる洗剤組成物から得られる洗濯媒体でその生地を１度な いし数度洗うことを特徴とする方法。 １０）前記ほぼ純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼが前記洗剤組成物の約０．０５から 約２ｗｔ％をしめることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。 １１）前記洗剤組成物がＣＢＨＩ型成分を全く含まないことを特徴、とする請求 の範囲第９項記載の方法。 １２）前記洗剤組成物がＣＢＨ型成分を全く含まないことを特徴とする請求の範 囲第１１項記載の方法。