JPH0773668B2

JPH0773668B2 - リポソ−ム及びその前駆体の調製法

Info

Publication number: JPH0773668B2
Application number: JP62211236A
Authority: JP
Inventors: 稔野路; 和男大朏; 高明大熊; 宏二宮
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1987-08-27
Filing date: 1987-08-27
Publication date: 1995-08-09
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: JPS6456136A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は基質の捕捉率が高くしかも安定なリポソーム及
びその前駆体の新規な製造法に関する。

脂質小胞体であるリポソームはセンサーなどの膜素材、
光化学反応や酸素反応などの反応の場、そして人工細胞
などへの応用が試みられている。また、近年、医薬品を
目的組織にだけ到達させたり、生体への吸収を調節させ
たりするようなドラツグデリバリーの担体として用いる
ことが注目されている。

〔従来の技術〕

基質を取込ませたリポソームの調製法としては、例え
ば、(1)リン脂質をクロロホルムに溶解させた後、クロ
ロホルムを除去してリン脂質の薄膜を形成させ、これに
基質の水溶液を加えて、用いたリン脂質の相転移温度
（Tc）以上で機械的振動（ボルテツクスイング）を与え
て乳濁状のリポソームを得る。この時のリポソームは多
重層リポソーム（MLV）である（ボルテツクスイング
法）。次いで多重層リポソームを更に超音波処理すると
小さな一枚膜リポソーム（SUV）が得られる（超音波
法）。

(2)リン脂質、水溶性基質、界面活性剤または（デオキ
シ）コール酸ソーダで混合ミセルを形成させ、ここから
透析、ゲルろ過、超遠心などによつて界面活性剤やコー
ル酸類を除去することによつて一枚膜リポソームを得る
（界面活性剤除去法）。

(3)リン脂質の低沸点有機溶媒溶液に基質の水溶液を分
散させてW/O型エマルジョンを形成させ、これから有機
溶媒を留去してゲル化させる。

次いで、これを水性分散媒に分散させてリポソームを得
る（逆相蒸発法）。また、これらの他、多数のリポソー
ム調製法が報告されている。（たとえば、菊池、井上、
細胞工学２No.9,1136（1983））〔発明が解決しようとする問題点〕これら公知の方法によるリポソームの調製は、工程数が
多かつたり、操作が複雑だつたりするため、工業的に大
量に調製することが困難であり、また、得られるリポソ
ーム分散体の長期保存性が悪く、例えばリポソーム粒子
の凝集や内容物の漏洩などが起る。

更に、保存安定性を改良するため、該リポソームの凍結
乾燥が試みられているが、凍結乾燥品を水性媒体へ再分
散した時、粒子の凝集などが見られ（再分散性が悪い）
たり、リポソームの一部が崩壊して、基質の捕捉率がも
との値にもどらない等の品質及び製造上の問題がある。

〔問題点を解決するための手段〕

これらの問題点を解決すべく、本発明者らは、鋭意検討
を重ねた結果、新規なリポソームの調製法を見い出し本
発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、(1)脂質、脂質が可溶である有機溶
媒、封入すべき水溶性基質及び水からなる均一な油中水
型エマルジョンを形成し、該エマルジョンから凍結乾燥
により，水及び有機溶媒を除去することを特徴とする凍
結乾燥リポソーム前駆体の調製法、(2)脂質、脂質が可
溶である有機溶媒、封入すべき水溶性基質及び水からな
る均一な油中水型エマルジョンを形成し、該エマルジョ
ンから凍結乾燥により水及び有機溶媒を除去して、凍結
乾燥リポソーム前駆体を調製し、これを水性媒体に分散
することを特徴とする新規なリポソームの調製法に関す
る。

本発明において使用される脂質は両親媒性脂質である。
脂質の好ましい親水基としてはホスフエート基、カルボ
キシル基、スルフエート基、アミノ基、グリシジル基が
あるが、これらに限定されるものでなく、また、好まし
い疎水基としては、飽和及び不飽和炭化水素基である
が、これらに限定されるものではない。好ましい両親媒
性脂質はリン脂質及び化学構造がこれに近いものであ
る。これらの例としては、レシチン（ホスフアチジルコ
リン）、ホスフアチジルエタノールアミン、ホスフアチ
ジルセリン、ホスフアチジルイノシトール、ホスフアチ
ジン酸及びこれらのリゾ体、カルジオリピン、スフイン
ゴミエリン、セレブロシド類であるが、これらに限定さ
れるものではない。特に好ましいものは、卵黄レシチ
ン、大豆レシチン、及びこれらの水素添加物、ジパルミ
トイルホスフアチジルエタノールアミン、ジパルミトイ
ルホスフアチジルセリン、脳スフインゴミエリン、ジパ
ルミトイルホスフアチジルコリン、ジミリストイルホス
フアチジルコリン、ジステアロイルホスフアチジルコリ
ン、ジオレオイルホスフアチジルコリン、ジリノレイル
ホスフアチジルコリン、ジパルミトイルホスフアチジル
グリセロール、ジオレオイルホスフアチジルグリセロー
ル、ジパルミトイルホスフアチジン酸、ジミリストイル
ホスフアチジン酸、ジセチルホスフエート、ステアリル
アミン、セチルアミン等が挙げられる。また、脂質膜の
強化のために、コレステロール、コレスタノール、コレ
スタンなどのようなステロイド化合物、酸化防止剤とし
てα−トコフエロール、ブチルヒドロキシトルエン、ブ
チルヒドロキシアニソールなども併用できる。酸性親水
基（ホスフエート基、スルフエート基など）を有する化
合物を使用する場合、得られるリポソームはアニオン性
になり、また、アミノ基のような塩基性基を有する化合
物を使用する場合には、カチオン性のリポソームが得ら
れる。

本発明のリポソームには、生理活性化合物、染料、水溶
性高分子及びこれらの混合物などのいかなる水溶性基質
も捕捉することができる。この際、生理活性化合物とし
ては、核酸類、ポリヌクレオチド類、抗菌活性化合物
類、抗ウイルス性化合物類、抗真菌性化合物類、駆虫性
化合物類、抗腫瘍性化合物類、タンパク質類、トキシン
類、酵素類、ホルモン類、神経伝達物質類、糖タンパク
質類、免疫グロブリン類、抗炎症剤、抗緑内障剤、局部
麻酔薬など、染料としては、酸性染料類、塩基性染料類
及び蛍光染料類など、水溶性高分子として、ヒアルロン
酸などの多糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリアクリル酸（ソーダ）などがある。しか
し、本発明に使用される水溶性基質はこれらに限定され
るものではなく、リポソームへの封入が望まれる化合物
であればよい。

本発明によるリポソームの調製法は次のようである。

まず両親媒性の脂質又は脂質混合物を有機溶媒に溶解す
る。有機溶媒は脂質を溶解し、水と混合しないものであ
れば、どれでも使用できるが、その中でも、ジエチルエ
ーテル、ジプロピルエーテルなどのエーテル類、ジクロ
ルメタン、クロロホルムなどの塩化炭化水素類、ヘキサ
ン、ヘプタンなどの脂肪族炭化水素類及びこれらの混合
物が好ましい。次いでリポソームに包括させようとする
基質の水溶液を加えて超音波分散器やマイクロフルイダ
イザー、エクストルダーなどでよく分散させて均一
な油中水型(W/O)エマルジョンを形成させる。ここで、
基質の水溶性（水相）と脂質溶液（油相）の割合は、水
相／油相が1/1〜1/100、好ましくは1/3〜1/50である。
また脂質の量は、水溶液を被覆するのに必要な量（水相
1ml当り、脂質15mg）を超えるのに十分なものであれば
よい。この上限はコスト効果の実用性によつてのみ限定
される。

次いで、得られたエマルジョンを常法により凍結乾燥す
る。例えばドライアイス−アセトン、液体窒素などの冷
媒で凍結させ、溶剤を真空下に市販の凍結乾燥機を使用
して除去する。

以上のようにして密封容器内で保存可能な凍結乾燥リポ
ソーム前駆体を得ることができる。

本発明で得られたリポソーム前駆体は、そのまま、保存
して置き、必要とする時か、又は該前駆体の調製時に水
性媒体（例えば生理食塩水等）に分散することによつて
基質を包括したリポソームを得ることができる。得られ
るリポソームの粒径は約50nm〜1000nmの間で、脂質の組
成、用いる量、包括する基質の種類、更には、W/Oエマ
ルジヨンの分散の程度などによつて決定される。

〔実施例〕

以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら
のみに限定されるものではない。

実施例１ 20mlのガラスバイアルに脂質としてジパルミトイルホス
フアチジルコリン（DPPC）58.7mg、ジオレオイルホスフ
アチジルコリン（DOPC）15.7mg及びコレステロール9.6m
gをとり、次にジエチルエーテル7.5mlを加えて溶解す
る。これにカルボキシフルオレセイン（CF）水溶液（10
mM Tris−HCl Buffer,pH＝7.5,100mmol/）2.5mlを加
えて、バス型超音波分散器で分散し、W/O型エマルジョ
ンを形成させる。該エマルジョンをドライアイス−アセ
トン冷媒中で凍結させ、凍結乾燥機で凍結乾燥させる。
以上により、必要な時まで密封容器中に保存できる粉末
状のリポソーム前駆体混合物が得られた。

該凍結乾燥粉末に10mM Tris−HCl Buffer（pH＝7.5）6m
lを加え、振盪、ボルテツクスイング、必要に応じて超
音波分散器などで分散させることにより、エマルジョン
状のリポソーム分散体が得られた。リポソーム粒子の平
均粒径は、Ｎ−４サブミクロンアナライザー（コールタ
ー社）を用いて測定した所、950nmであつた。

次いで、CFのリポソーム内への捕捉率を測定した。CFの
定量はケイ光強度（励起光490nm、ケイ光510nm）の測定
で行つた。得られたリポソーム分散体を1000〜10000倍
にBuffer（HEPES,pH＝8.5）で希釈し、A;希釈液そのま
までのケイ光強度（捕捉されていないCFの濃度）、B;希
釈液に10％ドデシル硫酸ナトリウムを加えた時のケイ光
強度（全体のCF濃度）を測定し、次式により捕捉率を求
めた。捕捉率＝（Ｂ−Ａ）/B×100その結果14％のCFが
捕捉されていた。

ここで得られた凍結乾燥リポソーム前駆体の入つたバイ
アルを冷蔵庫中に保存し、６ケ月、12ケ月後のCFの捕捉
率を調べた所、６ケ月後で13％、12ケ月後で13％であつ
た。すなわち、該リポソーム前駆体の保存安定性は良好
である。

実施例２脂質組成がDPPC 58.7mg、DOPC15.7mg、ステアリルアミ
ン（SA）2.7mg、コレステロール9.6mgである他は実施例
１と同様に操作して粉末状リポソーム前駆体混合物を得
た。更に 10mM Tris−HCl Buffer（pH＝7.5）6mlを加
えて、リポソーム分散体を得た。平均粒径が730nmで、C
Fの捕捉率は22％であつた。12ケ月冷蔵保存後の捕捉率
は22％であつた。

実施例３ 100mlのナス型フラスコにDPPC 167.2mg、DOPC 48mg、SA
5.4mg、コレステロール48.6mg、α−トコフエロール20
mg、ジエチルエーテル15mlからなる溶液に、インシユリ
ン水溶液5ml（10IU/ml）を加えて液状混合物を調製し、
これをマイクロフルイダイザーで（１次圧2.3kg/c
m²、２次圧500kg/cm²、４℃）分散しW/O型エマルジョン
を得る。該エマルジョンを２本の20mlガラスバイアルに
10mlずつ入れ、それをドライアイス−アセトンで凍結さ
せ、遠心凍結乾燥機で凍結乾燥する。以上の操作から、
必要な時まで密封容器中に保存できる粉末状のインシユ
リン含有リポソーム前駆体混合物が得られた。

該凍結乾燥粉末に水6mlを加え振盪、ボルテツクスイン
グ、必要に応じて超音波分散器などで分散させると、エ
マルジョン状のインシユリン含有リポソーム分散体が得
られた。リポソーム粒子の平均粒径は750nmであつた。

該リポソーム分散体を遠心分離（100,000g,30分）にか
け、リポソーム粒子を沈降させ、上清中のインシユリン
をEIA法で測定し（EIA法インシユリン測定キツトを使
用）、リポソームへのインシユリンの捕捉率を求めた。
その結果22.5％であつた。該リポソーム前駆体の12ケ月
冷蔵保存後のインシユリンの捕捉率は22％であつた。

実施例４脂質が卵黄レシチン75mg、コレステロール9.6mg、α−
トコフエロール7.5mgで、水相がブレオマイシン水溶液
2.5ml（10mg/ml）である他は、実施例１と同様に操作し
て、ブレオマイシン含有リポソーム前駆体混合物を得
た。更に、これに水6mlを加えてブレオマイシン含有リ
ポソーム分散体を得た。リポソーム粒子の平均粒径850n
m、ブレオマイシンの捕捉率は15.5％であつた。該リポ
ソーム前駆体の12ケ月冷蔵庫保存後のブレオマイシンの
捕捉率は15％であつた。

実施例５脂質が卵黄レシチン150mg、コレステロール19.8mg、α
−トコフエロール15mg、水相がシスプラチン溶液5ml
（５％グルコース水溶液中、1mg/ml）である他は、実施
例３と同様に操作してシスプラチン含有リポソーム前駆
体混合物を得た。更に、これに５％グルコース水溶液6m
lを加えてシスプラチン含有リポソーム分散体を得た。
リポソーム粒子の平均粒径は750nmで、シスプラチンの
捕捉率は9.5％であつた。該リポソーム前駆体の12ケ月
冷蔵保存後のシスプラチンの捕捉率は9.0％であつた。

以下、従来の調製法の中で最も捕捉率の高いものが得ら
れると言われている逆相蒸発法と比較する。

比較例１ 100mlのナス型フラスコにDPPC 58.7mg、DOPC 15.7mg、
コレステロール9.6mg、ジエチルエーテル7.5mlをとり、
更にCF水溶液（Tris−HCl Buffcr（pH＝7.5）100mmol/m
l）2.5mlを加えてバス型超音波分散器で分散し、エバポ
レーターでジエチルエーテルを除去し、ゲルを形成させ
る。これにTris−HCl Buffer（pH＝7.5）を6ml加え、エ
バポレーターで回転させながら、ゲルを分散させ、CF含
有リポソーム（Reverse−phase Evaporation Vesicle）
を得た。実施例１と同様にリポソーム粒子の平均粒径、
CFの捕捉率を求めたところ、それぞれ1100nm,4.5％であ
つた。本発明による方法では14％であつた。

比較例２脂質組成がDPPC 58.7mg、DOPC 15.7mg、SA 2.7mg、コレ
ステロール9.6mgで、水相がインシユリン水溶液2.5ml
（10IU/ml）である他は比較例１と同様に操作し、イン
シュリン含有リポソーム（REV）を得た。

実施例３と同様に、リポソーム粒子の平均粒子径とイン
シユリンの捕捉率を求めたところ、それぞれ、960nm、1
2.5％であつた。

本発明による方法では22.5％であつた。

次いで、得られたリポソーム分散体の5mlを20mlのバイ
アルにとり凍結乾燥した。該凍結乾燥品に5mlの水を加
えて再分散させ、リポソーム分散体にもどした。この時
のインシユリンの捕捉率は3.5％に低下していた。

〔発明の効果〕

本発明によるリポソームの調製法は、調製の工程が他の
方法に比べてその数が少なく、しかも、凍結乾燥粉末状
であるため長期間の保存が可能である。更に、水性媒体
に適宜の方法で分散することにより、基質の包含量の高
いリポソームを得ることができ、リポソームの製造及び
応用の促進に寄与するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭51−26213（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−58915（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−103822（ＪＰ，Ａ) 特開昭55−118415（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脂質、脂質が可溶である有機溶媒、封入す
べき水溶性基質及び水からなる均一な油中水型エマルジ
ョンを形成し、該エマルジョンから凍結乾燥により、水
及び有機溶媒を除去することを特徴とする凍結乾燥リポ
ソーム前駆体の調製法。
【請求項２】脂質、脂質が可溶である有機溶媒、封入す
べき水溶性基質及び水からなる均一な油中型エマルジョ
ンを形成し、該エマルジョンから凍結乾燥により水及び
有機溶媒を除去して、凍結乾燥リポソーム前駆体を調製
し、これを水性媒体に分散することを特徴とする新規な
リポソームの調製法。