JPH0779780A - リコンビナントヒトａｄｆの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明はヒトＡＤＦをコードする遺伝子を有
するプラスミドで形質転換された大腸菌を培養すること
により、目的とするヒトＡＤＦポリペプチドを生産し、
該ポリペプチドを取得することを特徴とするリコンビナ
ントヒトＡＤＦの直接発現生産法である。 【効果】 本発明によりフリーラジカルの発生による生
体障害を伴う炎症、放射線障害等の治療薬としての利用
が期待されているヒトＡＤＦを工業的に大量生産しえ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＡＤＦポリペプチ
ドの直接発現生産法に関する。ヒトＡＤＦは、フリーラ
ジカル消去能およびフリーラジカルにより変性失活した
蛋白質のリフォールディング活性を有し、従って、フリ
ーラジカルの発生による生体障害を伴う炎症、放射線障
害等の治療薬として利用し得る有用な物質である。

【０００２】

【従来の技術】ヒトＡＤＦはＡＴＬ−２細胞の上清に存
在するＩＬ−２レセプタ−誘導因子として１９８５年多
賀谷らによって報告され（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏ
ｌ．１３４、１６２３−１６３０、（１９８５）、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．２、１７
−２６（１９８５））、そのアミノ酸配列及びＤＮＡ配
列も既に決定され、更に大腸菌での生産についても報告
されている（特開平１−８５０９７号公報）。また、ヒ
トＡＤＦはその後の解析により、大腸菌からほ乳動物に
いたるまで広く存在する酸化還元蛋白質であるチオレド
キシンと類似のアミノ酸配列を持ち、しかもチオレドキ
シン活性を有することが明らかになった。従って、研究
者によっては本物質をチオレドキシンと呼ぶ場合もある
が、本発明に於いては、従来通りヒトＡＤＦという名称
で統一することにする。さて、ヒトＡＤＦは、先述の様
に過酸化水素を始めとする活性酸素やフリーラジカル
（以下、フリーラジカルと総称する）を消去する事が出
来、更にはフリーラジカルにより変性失活した蛋白をリ
フォールディングにより再活性化する事もできる。従っ
て、フリーラジカルの発生による生体障害を伴う炎症、
放射線障害等の治療薬として利用が検討されている（特
開平３−２０４８１８号公報）。

【０００３】従来、上述のヒトＡＤＦを取得する為に
は、ヒト末梢決血等より分離した正常人Ｔ細胞をマイト
ゲン刺激するか、成人Ｔ白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）で
トランスフォームさせたＴ細胞株から産生させる方法が
採られてきた（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１４０、
２６１４−２６２０（１９８８））。しかしこれらの方
法では、ヒトＡＤＦの産生量が低いこと、マイトゲンを
用いた場合、有害なマイトゲンが混入しこれを除去する
のが困難である点、また細胞培養にはウシ胎児血清など
血清成分を培地に添加する必要があり、これら添加蛋白
質とヒトＡＤＦを十分分離することが出来ず、医薬品と
して使用するには問題が多かった。

【０００４】上述の問題点を克服するために、最近、淀
井らによって大腸菌を用いたリコンビナントヒトＡＤＦ
の生産技術が開発された（特開平１−８５０９７号公報
参照）。本法では、ヒトＡＤＦを大腸菌体内で高発現さ
せる為に、まずヒトＡＤＦをコードする遺伝子の上流に
ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のＮ末端部分ペ
プチドをコードする遺伝子を接続し、ヒトＩＬ−２部分
ペプチドとヒトＡＤＦとの融合蛋白質（ΔＩＬ−２−ヒ
トＡＤＦ）が発現するようなプラスミド（ｐＴｆＡＤＦ
−２）を構築した。ｐＴｆＡＤＦ−２を用いて形質転換
した大腸菌を培養したところ、培溶液１００ｍＬあたり
２ｍｇのΔＩＬ−２−ヒトＡＤＦが発現蓄積した。

【０００５】ところが、ΔＩＬ−２−ヒトＡＤＦはヒト
ＩＬ−２の部分ペプチドを含むため、クロストリパイ
ン、カリクレイン等の蛋白質分解酵素によってヒトＩＬ
−２部分ペプチドとヒトＡＤＦの接続部分を切断する必
要があった。切断したヒトＩＬ−２部分ペプチド等の夾
雑蛋白質を除くために陰イオンクロマトグラフィー及び
逆相クロマトグラフィーにより精製を進めたところ、得
られた精製ヒトＡＤＦは大腸菌培溶液１００ｍＬ当り約
１００μｇであった。これは、大腸菌に蓄積したΔＩＬ
−２−ヒトＡＤＦの僅か５％にすぎない。さらに、本法
では融合蛋白質の１０％（ｗ／ｗ）に相当する蛋白質分
解酵素が必要であり、用いる酵素は高価格でしかも大量
入手が困難な場合が多い。従って、本法によってリコン
ビナントヒトＡＤＦの工業的大量生産を行う上では、収
率、経済性、材料の供給等、課題が多く残されていた。
この課題を克服する為には、ヒトＩＬ−２部分ペプチド
との融合蛋白質としてではなく、直接発現系によって効
率よく生産させる方法が必要とされていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、フリ
ーラジカルの発生による生体障害を伴う炎症、放射線障
害等の治療薬として有用な物質であるヒトＡＤＦの生産
法で、しかも工業的大量生産に適合しうる方法の提供で
ある。具体的には、リコンビナントヒトＡＤＦの直接発
現生産法の提供である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決するために鋭意検討を行った結果、以下の方法により
目的とするリコンビナントヒトＡＤＦを大量に、かつ効
率良く生産できることを見いだし、本発明を完成するこ
とができた。即ち、本発明はヒトＡＤＦをコードする遺
伝子を有するプラスミドで形質転換された大腸菌を培養
することにより、目的とするヒトＡＤＦポリペプチドを
生産し、該ポリペプチドを取得することを特徴とするリ
コンビナントヒトＡＤＦポリペプチドの直接発現生産法
である。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】本発明のヒトＡＤＦとは通常、配列表の配
列番号１記載のアミノ酸配列を有するものを指すが、こ
れに限定される訳ではない。即ち、Ｎ末端にメチオニン
残基が付加されたポリペプチド（配列表の配列番号２記
載のポリペプチド）でもよい。 更に、化学修飾、塩基
置換法によりアミノ酸配列に置換が加わったポリペプチ
ド、アミノ酸配列の一部に欠損があるポリペプチド、ア
ミノ酸残基の挿入があるポリペプチド、あるいは側鎖に
糖鎖等が付加されたポリペプチドであってもヒトＡＤＦ
活性を有する限り、本発明のヒトＡＤＦに含まれる。し
かし、好ましくは配列表の配列番号１に示されているＮ
末端バリンから始まる１０４個のアミノ酸からなるポリ
ペプチド又は、配列表の配列番号２に示されているメチ
オニンがＮ末端に付加された１０５個のアミノ酸からな
るポリペプチドが好ましい。

【０００９】また、ヒトＡＤＦ遺伝子とは通常、配列表
の配列番号３、または４記載の遺伝子を指すが、これに
限定される訳ではない。即ち、塩基置換、塩基挿入、塩
基欠損がある遺伝子であっても構わない。しかし、好ま
しくは配列表の配列番号３又は４に示されている１０４
個、あるいは１０５個のアミノ酸からなるポリペプチド
をコードする遺伝子が好ましい。尚、配列表の配列番号
４記載の遺伝子は配列表の配列番号３記載の遺伝子の
５’末端に翻訳開始コドンがついた遺伝子である。真核
生物の蛋白質を大腸菌を用いて工業的に有利に生産する
ためには、既述のように、融合蛋白質としてではなく目
的とするポリペプチドだけを大腸菌の菌体内に大量に蓄
積せしめる遺伝子発現系、及び遺伝子発現ベクターを構
築する必要がある。すなわち、まず、５’上流からプロ
モーター領域、リボソーム結合領域、翻訳開始コドン、
目的のヒトＡＤＦをコードする遺伝子領域、翻訳終止コ
ドン、最後にターミネーター領域の順に含有する発現ベ
クターを構築する。

【００１０】さて、本発明においてプロモーターの由来
は問うところではなく、例えば大腸菌のｔｒｐプロモー
ター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａ
ｃプロモーターや、さらにはλファージのλＰＬプロモ
ーター、λＰＲプロモーターなどを用いることができ
る。

【００１１】リボソーム結合領域は、例えば大腸菌のｔ
ｒｐＬやｔｒｐＥ、ｌａｃＺのリボソーム結合領域や、
λファージのＣＩＩ蛋白のリボソーム結合領域を用いる
ことができる。あるいは化学合成したＤＮＡ配列を用い
ることができる。本発明のベクターにおいては、２つ以
上のリボソーム結合領域を連結させてもよく、これらの
リボソーム結合領域は同じ配列であっても、また異なっ
た配列の組み合せでも良い。リボソーム結合領域の連結
様式は特に制約はないが、好ましくは２つのリボソーム
結合領域の隔たりは、５塩基から２０塩基程度である。
遺伝子の発現効率を上げるために、リボソーム結合領域
と翻訳開始コドンの間にアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）
に富む塩基配列を挿入してもよく、さらに生産させるポ
リペプチドのアミノ酸配列を変えない範囲でヒトＡＤＦ
遺伝子の前半部分をアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）に富
む塩基配列に変更してもよい。

【００１２】翻訳終止コドンとして、オーカー（ＴＡ
Ａ）、オパール（ＴＧＡ）、アンバー（ＴＡＧ）、望ま
しくはオーカー（ＴＡＡ）、オパール（ＴＧＡ）が用い
られるが、さらに、目的遺伝子の翻訳停止を確実にする
ために、ＴＡＡかつ／またはＴＧＡの２重の終止コドン
を配置してもよい。転写終結部位は、例えば大腸菌のｔ
ｒｐＡターミネーター、ｒｒｎＢターミネーター、ｒｅ
ｃＡターミネーターなどを用いることができる。また、
発現プラスミドのコピー数は一般的に多い方が好まし
く、複製起点としてｐＢＲ系の複製起点よりｐＵＣ系の
方が望ましい。

【００１３】構築した発現プラスミドを通常の方法で宿
主である大腸菌に形質転換させ、そして発現させれば良
い。本発明においては発現細胞として大腸菌を用いる
が、宿主として大腸菌以外の他の原核生物及び真核生物
を用いてもかまわない。参考までに述べると、原核生物
の例としては枯草菌などを挙げることができる。真核細
胞の例としては酵母、ＣＨＯ細胞なども用いられる。

【００１４】発現ベクターをこれらの大腸菌に組み込む
方法も公知の方法を利用すればよい。例えば、対数増殖
期の細胞を５０ｍＭの塩化カルシウムで氷中約３０分処
理することにより、大腸菌の細胞壁の構造を変化させ、
続いてプラスミドＤＮＡを注入し約１０分後３０℃〜４
２℃で２分間の熱処理を施した後、培地を加え３０℃〜
３７℃で約６０分培養することにより、発現プラスミド
ＤＮＡを生物に組み込むことができる。あるいは、エレ
クトロポレーションによって大腸菌等の宿主に発現ベク
ターを導入してもよい。

【００１５】ヒトＡＤＦは、発現ベクターを有する大腸
菌を培養することによって当該大腸菌の体内に蓄積させ
ることができる。培地は大腸菌を培養し得る公知の培地
を利用すればよく、培養条件も公知の条件でよい。ま
た、当該大腸菌の体内に蓄積したリコンビナントヒトＡ
ＤＦは公知の方法で取得すればよい。例えば、塩析、限
外濾過法、クロマトフォーカシング、ハイドロキシアパ
タイトクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、各種アフ
ィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー等の公知の方法を組み合わせて精製すればよい。

【００１６】次に、精製したリコンビナントヒトＡＤＦ
は、蒸留水、生理食塩水又は適当な緩衝液に溶かした後
使用すればよい。あるいは、凍結乾燥処理したものを用
いてもよい。濃度は通常、０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬ
の範囲で使用するが、この範囲に限定されるわけではな
い。また、マンニトール、サイクロデキストリン等の賦
形剤、安定剤を精製リコンビナントヒトＡＤＦに含有さ
せて使用してもよい。リコンビナントヒトＡＤＦの含有
量は、通常リコンビナントヒトＡＤＦ含有する製剤１０
０重量部当たり０．１〜１００重量部、好ましくは１０
〜８０重量部である。もちろん、上記範囲に限定される
わけではない。以下本発明を実施例に基づいて更に詳細
に説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものでは
ない。

【００１７】

【実施例】

（実施例１）チオレドキシン活性の測定 ヒトＡＤＦの活性測定、定量を行なうために、チオレド
キシンの代表的な活性測定方法であるインスリン還元活
性測定法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２１、
６６２８−６６３３（１９８２））を用いた。測定原理
を（反応１）に示したが、ヒトＡＤＦがインスリンを還
元すると、矢印の方向に水素イオンが流れ、結果として
ＮＡＤＰＨがＮＡＤＰに変換される。ＮＡＤＰＨからＮ
ＡＤＰへの変換速度はヒトＡＤＦの濃度に比例するの
で、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰへの変換に伴う３４０ｎｍ
の吸光度の減少率を求めればヒトＡＤＦを定量すること
ができる。尚、ＴｘＲとはチオレドキシン還元酵素の略
称である。 （反応１） ＮＡＤＰＨ → ＴｘＲ → ＡＤＦ（チ
オレドキシン） → インスリン

【００１８】測定方法は次の通りである。分光光度計の
測定キュベットに０．１ＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ
７．５（４５０μｌ）、５ユニット／ｍＬＴｘＲ（５０
μｌ）、ヒトＡＤＦを含む溶液（５０μｌ）を順次添加
し、最後に１０ｍｇ／ｍＬインスリン溶液（５０μｌ）
を添加し、反応を開始させた。インスリン添加後直ちに
キュベットを分光光度計にセットして０．１分おきに３
４０ｎｍの吸光度（Ａ３４０）を記録した。一分間当た
りの吸光度変化の最大値（ΔＡ３４０／ｍｉｎ）をチオ
レドキシン活性とした。また、（式１）を用いて比活性
を算出した。 （式１） 比活性（ΔＡ３４０／ｍｉｎ・ｍｇ）＝ΔＡ
３４０／ｍｉｎ×０．６×（１／０．０５）×（１／サ
ンプル濃度）

【００１９】下記の表１は、精製リコンビナントヒトＡ
ＤＦのチオレドキシン活性である。細胞内に発現したリ
コンビナントヒトＡＤＦあるいは精製過程のリコンビナ
ントヒトＡＤＦの定量化には、本表をもとに作製した検
量曲線を用いた。なお、ＴｘＲはヒト胎盤から公知の方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２１、６６２
８−６６３３（１９８２））により精製したものを用い
た。

【００２０】

【表１】 表１ 精製リコンビナントヒトＡＤＦのチオレドキシン活性測定の一例 添加ＡＤＦ量（μｇ） チオレドキシン活性（ΔＡ３４０／ｍｉｎ） ０ ０．００４９ ０．５ ０．１１０２ １．０ ０．２１３４ ２．０ ０．３７４３

【００２１】（実施例２）ヒトＡＤＦ直接発現用プラス
ミドＤＮＡ（ｐＡＤＦＤＥ）の構築 大腸菌体内にヒトＡＤＦを大量に発現させるために、下
記の方法でヒトＡＤＦ発現用プラスミドＤＮＡを構築し
た（図１、２参照）。まず、転写開始点からヒトＡＤＦ
のＮ末端に至るＤＮＡ配列を図３のようにデザインし
た。また、ヒトＡＤＦｍＲＮＡの翻訳効率の増大をねら
い、以下の点を考慮した。即ち、リボソームＲＮＡ結合
部位であるシャイン−ダルガーノ配列（ＳＤ配列）の最
適化、ＳＤ配列〜開始コドン（ＡＴＧ）の間の塩基配列
のＡ−Ｔｒｉｃｈ化、ヒトＡＤＦのＮ末端をコードする
コドンのＡ−Ｔｒｉｃｈ化、更にＮ末端から離れている
領域については大腸菌のコドン使用頻度を考慮してＤＮ
Ａ配列をデザインした。

【００２２】図１、２に、ヒトＡＤＦ直接発現用プラス
ミドＤＮＡ（ｐＡＤＦＤＥ）の作製方法を示した。まず
図１に示すように、プラスミドｐＴｆＡＤＦー２の制限
酵素ＣｌａＩ認識部位と制限酵素ＰｓｔＩ認識部位との
間に接続するオリゴヌクレオチド（アダプター１、２、
３、４）を合成した。次に、配列表の配列番号３及び４
記載のヒトＡＤＦのｃＤＮＡ配列を有するΔＩＬ２−ヒ
トＡＤＦ融合蛋白質発現プラスミドｐＴｆＡＤＦ−２を
制限酵素ＣｌａＩ、ＰｓｔＩで切断した後、上述のアダ
プター１、２、３、４の混合物を添加しＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより連結させることによりプラスミドｐＡＤＦＤ
Ｅ（ｐＢＲ）を構築した。尚、プラスミドｐＴｆＡＤＦ
−２を有する大腸菌は微工研（現生命研）に寄託されて
いる。寄託番号はＢＰ−１８８５である。

【００２３】さらに、ＡＤＦ遺伝子の増幅をねらい、ド
ライブユニットを高コピー数プラスミドＤＮＡであるｐ
ＵＣ系に入れ換えたｐＡＤＦＤＥを構築した（図２）。
構築後、サンガー法によるＤＮＡ塩基配列決定法を用い
てｐＡＤＦＤＥがヒトＡＤＦをコードする正しい塩基配
列を有することを確認した。

【００２４】このようにして得られたプラスミドｐＡＤ
ＦＤＥが確かに目的とするヒトＡＤＦ発現プラスミドＤ
ＮＡであるかどうかを、次のようにして確認した。ま
ず、プラスミドｐＡＤＦＤＥで形質転換した大腸菌株Ｈ
Ｂ１０１を１ｍＬのＬＢ培地中で３１℃一晩培養した
後、菌体を超音波破砕し、遠心分離により可溶性画分と
不溶性画分に分離した。不溶性画分は同量の蒸留水に再
懸濁した。それぞれの画分１μＬをＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にて分離し、銀染色により蛋白質
のバンドを染色した後デンシトメータによりバンドの定
量を行った。また、それぞれの画分５μＬを用いてチオ
レドキシン活性測定を行っい菌体内に蓄積したリコンビ
ナントヒトＡＤＦを定量した。表２に示すように、菌体
の可溶性画分にヒトＡＤＦの分子量に一致する１２ｋＤ
ａの蛋白質の発現を認め、しかも１２ｋＤａの蛋白質の
発現量に応じてチオレドキシン活性も確認出来た。抗ヒ
トＡＤＦ抗体を用いたイムノブロッティングを行なった
ところ、上記の１２ｋＤａの蛋白質は抗ヒトＡＤＦ抗体
によって認識されることが明らかになった。以上から、
ｐＡＤＦＤＥによって大腸菌を形質転換することによ
り、確かに菌体内にリコンビナントヒトＡＤＦの発現が
認められた。 また、リコンビナントヒトＡＤＦの発現
量は可溶性蛋白質の約３０％に達した。なお、上記の形
質転換大腸菌ｐＡＤＦＤＥ／ＨＢ１０１は、微工研菌寄
第１２６０６号（FERM P-12606)である。

【００２５】

【表２】 表２ ｐＡＤＦＤＥ／ＨＢ１０１菌体内の１２ｋＤａ蛋白質の含量およびチオレドキ シン活性 １２ｋＤａ蛋白質 チオレドキシン活性 （バンド面積（相対値））（ΔＡ３４０／ｍｉｎ） ＨＢ１０１（対照） 可溶性画分 ０．２１ ０．０３１５ 不溶性画分 ０．１４ ０．００８２ ｐＡＤＦＤＥ／ＨＢ１０１ 可溶性画分 ３１．３１ ０．３５２６ 不溶性画分 ０．１８ ０．０１０３

【００２６】（実施例３）リコンビナントヒトＡＤＦの
調製 リコンビナントヒトＡＤＦの生化学的性質、物性等を検
討する為には、純化したリコンビナントヒトＡＤＦが必
要である。そこで、以下の方法を用いて精製リコンビナ
ントヒトＡＤＦを得た。まず、実施例２で得たプラスミ
ドｐＡＤＦＤＥで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１（FERM
P-12606）を１００ｍＬのＬＢ培地に添加した後、３１
℃で一昼夜、１００ｒｐｍで振盪培養した。次に、この
１００ｍＬの大腸菌培養液を２ＬのＬＢ培地に添加し、
３１℃でさらに１６時間、１００ｒｐｍで振盪培養した
後、遠心分離（１０００×ｇ、１５分）により菌体を回
収した。菌体を２００ｍＬの２０ｍＭピペラジン塩酸緩
衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した後超音波破砕機（１００
Ｗ、３０分間）を用いて破壊し、遠心分離（１００００
×ｇ、１５分）によって不溶性成分を除去した物を大腸
菌粗抽出液とした。チオレドキシン活性測定によって求
めたリコンビナントヒトＡＤＦの発現量は、培養液１Ｌ
当たり５００ｍｇであった。

【００２７】大腸菌粗抽出液からのリコンビナントヒト
ＡＤＦの精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーによ
った。即ち、大腸菌粗抽出液を、予め２０ｍＭピペラジ
ン塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＱセファロー
スカラム（直径１０ｃｍ×４０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ製）に添加した後、同緩衝液で非吸着成分を溶出させ
た。次に、０から１００ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾配に
よってカラムに吸着した成分を溶出した。尚、流速は５
０ｍＬ／ｍｉｎに設定し、勾配の容積は５Ｌとした。リ
コンビナントヒトＡＤＦは約５０ｍＭのＮａＣｌの画分
に回収された。

【００２８】回収されたリコンビナントヒトＡＤＦは培
養液１Ｌ当たり１００ｍｇであり、従来のＩＬ−２との
融合蛋白質法（特開平１−８５０９７号）の１００倍の
収量が達成された。また、回収率は２０％であり従来法
の４培にまで向上した。次に、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳移動を行なったところ、精製リコンビナン
トヒトＡＤＦは分子量１２ｋＤａのほぼ均一なバンドを
示し、デンシトメーターを用いて定量を行なったとこ
ろ、純度は９５％以上と求められた。また、ペプチドシ
ークエンサーを用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定した
ところ、配列表の配列番号１及び２記載の配列を有して
いた。尚、このようにして得られたリコンビナントヒト
ＡＤＦが２種類のＮ末端構造を有するのは、大腸菌内で
当初作成された配列表の配列番号２記載のポリペプチド
（メチオニン型）の一部が、大腸菌内のアミノペプチダ
ーゼによりそのＮ末端のメチオニンが切断され、配列表
の配列番号１記載のポリペプチド（バリン型）に変換さ
れた為と考えられる。さて、このようにして得られたリ
コンビナントヒトＡＤＦのチオレドキシン活性はｍｇ当
たり８０Δ３４０／ｍｉｎであった。更に、変性蛋白質
のリフォールディング活性（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、Ｖ
ｏｌ．２７５、３４９−３５３（１９９１））は、リコ
ンビナントヒトＡＤＦ３μＭのとき０．０００００１７
μｍｏｌ／ｍｉｎであった。培養条件によって、リコン
ビナントヒトＡＤＦのＮ末端構造の比がメチオニン型：
バリン型＝１：９〜９：１の間で変動したが、チオレド
キシン活性、およびリフォールディング活性に差が認め
られなかったことから、メチオニン型とバリン型の両比
活性は同一であると考えられる。

【００２９】（実施例４） 高純度リコンビナントヒト
ＡＤＦの大量調製 マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等の動物を用いて
ヒトＡＤＦの薬効検定を行なう為には、高度に純化した
リコンビナントヒトＡＤＦを大量に得る必要がある。そ
こで、本発明者が鋭意検討を行なったところ、高密度大
腸菌培養と多段階精製工程とを組あわせることにより高
純度リコンビナントヒトＡＤＦを大量に得る方法を見い
だした。表３に精製結果の要約を示した。

【００３０】

【表３】 表３ 高純度リコンビナントヒトＡＤＦ大量調製の要約 工程 収量 工程収率 収率 （菌体粗抽出液） ４００ｇ ブチルスファロース １３３ ３３％ ３３％ セファデックスＧ−２５ １１７ ８８ ２９ ＣＭセファロースＦＦ ９３ ７９ ２３ ＣＭセファロースＦＦ（濃縮） ８３ ８９ ２１ セファロースＳ−１００ＨＲ ６０ ７２ １５

【００３１】この表３を基にそれぞれの工程及び収率を
以下に説明するまず、プラスミドｐＡＤＦＤＥで形質転
換した大腸菌ＨＢ１０１（FERM P-12606）を、１ＬのＬ
Ｂ培地に添加した後３１℃で一昼夜、１００ｒｐｍで振
盪培養した。次に、この１Ｌの大腸菌培養液を２０Ｌの
Ｍ−９カザミノ酸培地（０．６％リン酸水素ナトリウ
ム、０．３％リン酸二水素ナトリウム、０．０５％塩化
ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％硫
酸マグネシウム、０．００１４７％塩化カルシウム、
０．２％グルコース、０．２％カザミノ酸、０．０２％
Ｌ−ロイシン、０．０２％Ｌ−プロリン、０．０００２
％チアミン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２
５μｇ／ｍｌストレプトマイシン、ｐＨ７．４）に添加
し、３１℃で１６時間、３０Ｌ発酵槽を用いて高密度培
養を行なった後、更に培養液全量を１８０ＬのＭ−９カ
ザミノ酸培地に添加し、３１℃で１６時間、３００Ｌ発
酵槽を用いて高密度培養を行なった。培養後、連続遠心
分離機を用いて菌体を回収し、５０Ｌの１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４に懸濁した。菌体懸濁液
は、連続細胞破砕装置を用いて破壊した後、連続遠心分
離機を用いて不溶性成分を除去し、菌体粗抽出液とし
た。チオレドキシン活性測定法により菌体粗抽出液中の
リコンビナントヒトＡＤＦを定量して総リコンビナント
ヒトＡＤＦ量を算出したところ、培養液１Ｌ当たり２
ｇ、計４００ｇであった。培養液当たりのリコンビナン
トヒトＡＤＦの発現量は振盪培養の４倍であった。

【００３２】菌体粗抽出液から下記の方法を用いてリコ
ンビナントヒトＡＤＦを精製した。まず、菌体粗抽出液
に硫酸アンモニウムを添加し４５％飽和とした後、５０
％飽和硫酸アンモニウム、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ５．５で平衡化されたブチルセファロースカラム（直
径２５．２ｃｍ×１５ｃｍ、７．５Ｌ）に添加し吸着さ
せた。同緩衝液で非吸着成分を溶出した後、５０から０
％飽和硫酸アンモニウムの直線濃度勾配（勾配容積６０
Ｌ、流速０．５Ｌ／ｍｉｎ）により吸着成分の溶出を行
なったところ、リコンビナントヒトＡＤＦは約２０％飽
和の硫酸アンモニウムの画分に回収された。なお、カラ
ムの処理能力を考慮して、一回当たりの処理量を全菌体
粗抽出液の６分の１量に設定し、同じ操作を６回繰り返
すことにより全量を処理した。表３に示すようにこの工
程が終わった時の収量は１３３ｇ、収率３３％であっ
た。

【００３３】次に、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．
５で平衡化されたセファデックスＧ−２５カラム（直径
２５．２ｃｍ×２５ｃｍ、１２．５Ｌ）に上記のリコン
ビナントヒトＡＤＦ画分の１８分の１量を添加した後、
同緩衝液で溶出することにより、緩衝液の置換を行なっ
た（流速０．５Ｌ／ｍｉｎ）。同じ操作を１８回繰り返
す事により全量を処理した。表３に示すようにこの工程
が終わった時の収量は１１７ｇ、収率２９％であった。

【００３４】前工程の画分の６分の１量を、予め２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５で平衡化されたＣ
Ｍセファロースファーストフローカラム（直径２５．２
ｃｍ×１５ｃｍ、７．５Ｌ）に添加した後、同緩衝液で
非吸着成分を溶出した。引き続き０から０．５Ｍ塩化ナ
トリウムの直線濃度勾配（勾配容積７５Ｌ、流速０．５
Ｌ／ｍｉｎ）により吸着成分の溶出を行なったところ、
リコンビナントヒトＡＤＦは約０．２Ｍの塩化ナトリウ
ムの画分に回収された。同じ操作を６回繰り返すことに
より全量を処理した。表３に示すようにこの工程が終わ
った時の収量は９３ｇ、収率２３％であった。

【００３５】次に、ＣＭセファロースファーストフロー
カラム（直径１１．３ｃｍ×３ｃｍ、０．３Ｌ）を用い
て濃縮を行なった。方法は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ４．５で平衡化されたカラムに前工程の画分
の１２分の１量を添加し、同緩衝液で非吸着成分を溶出
した後、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で吸着成
分を濃縮回収した（流速０．３Ｌ／ｍｉｎ）。なお、全
量を処理する為に同じ操作を１２回繰り返した。表３に
示すようにこの工程が終わった時の収量は８３ｇ、収率
２１％であった。

【００３６】最後に、ゲル濾過クロマトグラフィーによ
り緩衝液の置換と微量の不純物を除去した。即ち、０．
２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．０で平衡化されたセフ
ァクリルＳ−１００ＨＲカラム（直径１０ｃｍ×６４ｃ
ｍ、５Ｌ）に前工程の画分の２４分の１量を添加後、同
緩衝液で溶出を行なった（流速２０ｍｌ／ｍｉｎ）。同
じ操作を、２４回繰り返すことにより全量を処理した。
このようにして精製したリコンビナントヒトＡＤＦの収
量は６０ｇであり、回収率は１５％であった（表３）。

【００３７】精製リコンビナントヒトＡＤＦをＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって解析したとこ
ろ、分子量１２ｋＤａの均一なバンドを示し、デンシト
メーターによる純度検定では純度９９％以上が保証され
た。さらに、抗大腸菌蛋白質抗体を用いたＥＬＩＳＡ法
で大腸菌由来蛋白質の含量を求めたところ、１０ｐｐｍ
以下であった。また、リムルスアッセイキットを用いて
エンドトキシン含量を求めたところ、０．００１エンド
トキシン単位／ｍｇ以下であった。また、エレクトロス
プレーイオン化質量分析計を用いて分子量を決定したと
ころ、塩基配列から予想される分子量と一致した。即
ち、配列表の配列番号１および２記載の２種のポリペプ
チドの分子量が示された。また、ペプチドシークエンサ
ーを用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定したところ、配
列表の配列番号１および２記載の２種の配列が確認され
た。また、チオレドキシン活性はｍｇ当たり８０Δ３４
０／ｍｉｎであり、変性蛋白質のリフォールディング活
性は、ヒトＡＤＦＰ３μＭのとき０．０００００１７μ
ｍｏｌ／ｍｉｎであった。

【００３８】

【発明の効果】ＳＤ配列の最適化、ＳＤ配列〜ペプチド
のＮ末端をコードするコドンのＡ−Ｔｒｉｃｈ化、さら
に、ｐＵＣ系プラスミドＤＮＡの利用した本発明の直接
発現生産法の確立により、リコンビナントヒトＡＤＦの
飛躍的な発現効率、生産性の向上が達成された。さら
に、高密度培養と多段階精製工程を組み合わせることに
より高純度でしかも大量のリコンビナントヒトＡＤＦを
取得することが可能になった。本発明により得られたフ
リーラジカルの発生による生体障害を伴う炎症、放射線
障害等の治療薬として有用な物質であるヒトＡＤＦを、
大量にしかも安価に製造することが出来る。

【００３９】

【配列表】

【００４０】配列番号：1 配列の長さ：104 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 株名：ATL-2 配列の特徴 特徴を表す記号：active-site 存在位置：31..34 特徴を決定した方法：E 1 5 10 15 Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp Ala 16 20 25 30 Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys Gly 32 35 40 45 Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys Tyr 48 50 55 60 Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp Val 64 65 70 75 80 Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe Lys 80 85 90 95 Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys Leu 96 100 Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val 104

【００４１】配列番号：2 配列の長さ：105 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 株名：ATL-2 配列の特徴 特徴を表す記号：active-site 存在位置：32..35 特徴を決定した方法：E 1 5 10 15 Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp 16 20 25 30 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 32 35 40 45 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys 48 50 55 60 Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 64 65 70 75 80 Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe 80 85 90 95 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 96 100 105 Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val 105

【００４２】配列番号：3 配列の長さ：312 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 株名：ATL-2 配列の特徴 特徴を表す記号：active-site 存在位置：91..102 特徴を決定した方法：E 1 5 10 15 GTG AAG CAG ATC GAG AGC AAG ACT GCT TTT CAG GAA GCC TTG GAC GCT 48 Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp Ala 20 25 30 GCA GGT GAT AAA CTT GTA GTA GTT GAC TTC TCA GCC ACG TGG TGT GGG 96 Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys Gly 35 40 45 CCT TGC AAA ATG ATC AAG CCT TTC TTT CAT TCC CTC TCT GAA AAG TAT 144 Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys Tyr 50 55 60 TCC AAC GTG ATA TTC CTT GAA GTA GAT GTG GAT GAC TGT CAG GAT GTT 192 Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp Val 65 70 75 80 GCT TCA GAG TGT GAA GTC AAA TGC ATG CCA ACA TTC CAG TTT TTT AAG 240 Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe Lys 85 90 95 AAG GGA CAA AAG GTG GGT GAA TTT TCT GGA GCC AAT AAG GAA AAG CTT 288 Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys Leu 100 105 GAA GCC ACC ATT AAT GAA TTA GTC 312 Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val

【００４３】配列番号：4 配列の長さ：315 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 株名：ATL-2 配列の特徴 特徴を表す記号：active-site 存在位置：94..105 特徴を決定した方法：E 1 5 10 15 ATG GTG AAG CAG ATC GAG AGC AAG ACT GCT TTT CAG GAA GCC TTG GAC 48 Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp 20 25 30 GCT GCA GGT GAT AAA CTT GTA GTA GTT GAC TTC TCA GCC ACG TGG TGT 96 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 35 40 45 GGG CCT TGC AAA ATG ATC AAG CCT TTC TTT CAT TCC CTC TCT GAA AAG 144 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys 50 55 60 TAT TCC AAC GTG ATA TTC CTT GAA GTA GAT GTG GAT GAC TGT CAG GAT 192 Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 65 70 75 80 GTT GCT TCA GAG TGT GAA GTC AAA TGC ATG CCA ACA TTC CAG TTT TTT 240 Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe 85 90 95 AAG AAG GGA CAA AAG GTG GGT GAA TTT TCT GGA GCC AAT AAG GAA AAG 288 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 100 105 CTT GAA GCC ACC ATT AAT GAA TTA GTC 315 Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドｐＡＤＦＤＥ（ｐＢＲ）の
構築過程である。

【図２】図２は、プラスミドｐＡＤＦＤＥの構築過程で
ある。

【図３】図３は、デザインした転写開始点からヒトＡＤ
ＦのＮ末端に至るＤＮＡ配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＡＤＦをコードする遺伝子を有する
   プラスミドで形質転換された大腸菌を培地中で培養する
   ことにより、目的とするヒトＡＤＦポリペプチドを生産
   し、該ポリペプチドを取得することを特徴とするリコン
   ビナントヒトＡＤＦポリペプチドの直接発現生産法。
2. 【請求項２】 生産されるリコンビナントヒトＡＤＦが
   配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有することを
   特徴とする請求項１記載の直接発現生産法。
3. 【請求項３】 生産されるリコンビナントヒトＡＤＦが
   配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有することを
   特徴とする請求項１記載の直接発現生産法。