JPH08239318A - ヘモグロビン含有リポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 カプセル化効率とリポソームの凝集抑制能が
高く、しかも内水相のメト化上昇が抑制された、人工赤
血球として有用なヘモグロビン含有リポソームの提供。 【構成】 内水相にヘモグロビンを含有するヘモグロビ
ン含有リポソームにおいてリポソーム膜の構成脂質成分
中に１〜３０モル％の脂肪酸塩を含み、ヘモグロビン重
量／リポソーム膜構成脂質重量が０．５〜２．５で、粒
径が１００〜３００ｎｍであることを特徴とするヘモグ
ロビン含有リポソーム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は内包されたヘモグロビン
のメト化が抑制され、酸素運搬能を長期に維持すること
ができるヘモグロビン含有リポソームに関する。ヘモグ
ロビン含有リポソームはリポソーム型人工赤血球として
有用である。

【０００２】

【従来の技術】人工赤血球として、動物や人の赤血球か
ら赤血球膜を除去したヘモグロビン溶液をリポソームの
内水相に内包させ、ヘモグロビン含有リポソームとする
ことが知られている。ヘモグロビン含有リポソームは溶
液全体の粘度や膠質浸透圧が低いという優れた点があ
り、リポソーム型人工赤血球として有効である。

【０００３】ヘモグロビン含有リポソームはリポソーム
内へのヘモグロビンのカプセル化効率を増大させるた
め、及びリポソームの凝集を抑制するために負荷電リン
脂質や脂肪酸を構成脂質内に含有させることが不可欠と
されている。構成膜脂質に脂肪酸を含有した人工赤血球
は特開平１−１８０２４５にも記載されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、膜脂質に脂肪
酸を含有したリポソームに内包されたヘモグロビンはメ
ト化（メトヘモグロビンへの酸化）が起こり易いという
問題点があった。従って、内水相のメト化上昇を抑制
し、しかもカプセル化効率とリポソームの凝集抑制能の
高い人工赤血球の開発が望まれている。

【０００５】本発明の発明者らは上記の問題点を解決す
るため検討した結果、リポソーム膜の構成脂質成分中に
特定量の脂肪酸塩を含有させたリポソームにヘモグロビ
ンを内包させることにより、この目的が達成できること
を見出した。従って本発明の目的は内水相のヘモグロビ
ンのメト化上昇を抑制し、かつ、カプセル化効率と凝集
抑制能の高いヘモグロビン含有リポソームを提供するこ
とである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、内水相にヘモ
グロビンを含有するヘモグロビン含有リポソームにおい
て、リポソーム膜の構成脂質成分中に１〜３０モル％の
脂肪酸塩を含み、ヘモグロビン重量／リポソーム膜構成
脂質重量比が０．５〜２．５で、粒径が１００〜３００
ｎｍであることを特徴とするヘモグロビン含有リポソー
ムである。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００７】本発明において使用されるリポソーム膜の
構成成分となる脂質は、飽和リン脂質、不飽和リン脂質
のいずれを用いてもよく、また、これらを組み合わせて
もよい。

【０００８】飽和リン脂質は例えば卵黄レシチン、大豆
レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチンなどの
天然系リン脂質及びその誘導体、また、ジミリストイル
ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジル
コリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレ
イルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチ
ジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジン酸、
ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアリルホスフ
ァチジン酸、ジオレイルホスファチジン酸、ジミリスト
イルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホス
ファチジルグリセロール、ジステアリルホスファチジル
グリセロール、などのアシル基組成を操作した合成系の
リン脂質、さらにホスファチジルイノシトール、ホスフ
ァチジルセリンなどが利用可能で特に限定されるもので
はない。

【０００９】不飽和リン脂質としては、重合性残基を有
する重合性リン脂質、例えば、１，２−ビス（２，４−
オクタデカジエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
コリン、１，２−ビス（２，４−ヘキサデカジエノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（オク
タデカノイル）−２−（２，４−オクタデカジエノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（ヘキ
サデカノイル）−２−（２，４−オクタデカジエノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（オク
タデカノイル）−２−（２，４−ヘキサデカジエノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（ヘキ
サデカノイル）−２−（２，４−ヘキサデカジエノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（２，
４−オクタデカジエノイル）−２−オクタデカノイル−
ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（２，４−ヘ
キサデカジエノイル）−２−ヘキサデカノイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ビス−（８，１
０，１２−オクタデカトリエノイル）−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホコリンなどの誘導体が利用可能である。重
合性リン脂質には非重合性脂肪酸残基が含有されてもよ
く、非重合性脂肪酸残基としては炭素数２〜２４の直鎖
あるいは分岐鎖のアルキル基、アシル基、非重合性アル
ケニル基、非重合性アルケノイル基などがあげられる。

【００１０】本発明において使用される脂肪酸塩は、他
のリポソーム形成脂質とともに、リポソームを形成し得
るものであれば特に限定はないが炭素数１２〜２２、好
ましくは１４〜１８の脂肪酸残基である。

【００１１】このような脂肪酸塩を構成する脂肪酸とし
ては、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、
ヘプタデカン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール
酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸
などの飽和もしくは不飽和の脂肪酸が用いられる。

【００１２】脂肪酸の塩としては、ナトリウム塩、カリ
ウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が
用いられる。

【００１３】リポソーム膜構成脂質成分中の脂肪酸塩の
含有量は１〜３０モル％であり、特に５〜２０モル％が
望ましい。上記脂肪酸塩の含有量が１モル％未満である
場合には脂肪酸によるカプセル化効率増大効果や人工赤
血球の凝集防止効果が発現されにくいので望ましくな
く、また、３０モル％を越える場合には脂肪酸塩の界面
活性作用によりリポソームが不安定となり崩壊し易いの
で好ましくない。

【００１４】リポソーム膜構成脂質中には膜の安定化剤
としてステロール類を添加することができる。このよう
なステロール類としては例えば、エルゴステロール、コ
レステロール等が挙げられるが、好ましくはコレステロ
ールである。

【００１５】本発明のヘモグロビン含有リポソームは脂
肪酸塩を含むリポソーム膜構成脂質と赤血球膜を除去し
たヘモグロビン溶液とを水和させリポソーム化すること
によって得られる。リポソーム化は常法に従って行うこ
とが可能であり、例えば薄膜法、超音波処理法、エタノ
ール注入法、フレンチプレス法、押し出し法、透析法、
逆相法等いずれの方法を用いてもよい。特に好ましくは
押し出し法によって形成するのがよい。

【００１６】このようにして形成されるヘモグロビン含
有リポソームの粒径は１００ｎｍ〜３００ｎｍである。
粒径が１００ｎｍ以下の場合は膜融合が起こり易く、大
きな粒子を形成しやすい。また３００ｎｍ以上であると
生体内に静脈投与などした場合、毛細血管を通らずに閉
塞する可能性がある。

【００１７】本発明のヘモグロビン含有リポソームにお
いて、ヘモグロビン重量／リポソーム膜構成脂質重量比
（Ｈｂ／Ｌ）は０．５〜２．５である。この重量比が
０．５未満であると生体内での十分な酸素運搬能力が低
下するので好ましくない。また２．５を超えると膜厚が
薄くなり内水相のヘモグロビンが漏出しやすくなる。

【００１８】このようにして得られたヘモグロビン含有
リポソームは、人工赤血球としてそのまま用いることも
できるが、膜成分中に重合性リン脂質を含有している場
合、それを重合させることにより、またその際重合度
や、重合率を調整することにより、保存安定性や血中安
定性に優れた人工赤血球を得ることができる。重合法は
特に限定されず、開始剤重合、紫外線重合、γ線重合、
Ｘ線重合、電子線重合などの公知の方法を用いることが
でき、これらを組み合わせることもできる。重合後に精
製の必要がないという点からは、紫外線重合、γ線重
合、電子線重合などが好ましい。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例とそれに対する比較例
により詳しく説明する。なお、特に明示しない限り、ヘ
モグロビン溶液調製およびヘモグロビン含有リポソーム
調製の各工程は、４℃で行い無菌的環境下で行った。

【００２０】［参考例］（ヘモグロビン溶液の調製） ヒト濃厚赤血球２，５００ｍｌに等量の生理食塩水を加
え、ゆるやかに混合後、遠心分離操作（２，０００Ｇ
× ３０ｍｉｎ ａｔ ＋４℃）を行い、血漿、白血
球、血小板を吸引して除去し、赤血球層を得た。この操
作を３回繰り返して洗浄赤血球２，３００ｍｌを得た。
この洗浄赤血球に蒸留水を２倍容量添加し、ゆるやかに
混合し１時間静置した後、連続遠心操作（２０，０００
Ｇ）によって細胞膜を除去した。さらに、フィルター濾
過を行い、細胞膜を完全に除去した粗ヘモグロビン溶液
５，０００ｍｌを得た。

【００２１】粗ヘモグロビン溶液は、限外濾過操作によ
り、脱塩、濃縮を行い精製されたヘモグロビン溶液を得
た。さらに得られたヘモグロビン溶液をＰＨ８．０のＨ
ＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液を用いてＰＨ７．２−７．４
に調整し、ヘモグロビン１ｍｏｌに対して０．３ｇのＮ
ＡＤＨ及び、酸素親和性調節因子としてヘモグロビンの
３当量のピリドキサル−５−リン酸、７５ｍＭの塩化ナ
トリウムを添加した。

【００２２】［実施例１］（ヘモグロビン含有リポソー
ムの調製） 重合性リン脂質である１−アシル−２−オクタデカジエ
ノイルホスファチジルコリン（以下ＡＯＤＰＣという）
９４４ｍｇ（１．２３ｍｍｏｌ）と非重合性リン脂質で
あるジパルミトイルホスファチジルコリン（以下、ＤＰ
ＰＣという）９０６ｍｇ（１．２３ｍｍｏｌ）とコレス
テロール９５４ｍｇ（２．４７ｍｍｏｌ）にパルミチン
酸ナトリウムを１９６ｍｇ（０．７０ｍｍｏｌ）添加
し、ナス型フラスコに加え、クロロホルム／メタノール
／水混合物（容量比６５／２５／４）６０ｍｌを添加し
て溶解し、エバポレーターを用いて溶媒を留去した。こ
れに水を添加し液体窒素により凍結させ、二晩凍結乾燥
させてパルミチン酸ナトリウム１２．４ｍｏｌ％を含む
乾燥粉末からなる混合脂質を調製した。

【００２３】次に参考例により調製したヘモグロビン溶
液３０ｍｌと上記混合脂質を撹伴、混合することによ
り、ヘモグロビン含有脂質分散液を得た後、エクストル
ーダー（日油リポソーム社製）を用いてポリカーボネー
ト製のフィルターを通過させることにより、０．２μｍ
の大きさとなるようにサイジングした。つぎに封入され
なかったヘモグロビンを取り除くために遠心分離操作
（２０，０００Ｇ×３０ｍｉｎ）を行い、上澄を除去し
た。沈澱を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨ７．４）
を用いて懸濁し、ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を
調製した。

【００２４】得られたヘモグロビン含有リポソームは平
均粒径２２８ｎｍ、Ｈｂ／Ｌ値１．５を示した。得られ
た試料について下記に示す保存安定性試験及び血中安定
性試験を行ない物性を評価し、表１の結果が得られた。

【００２５】＜保存安定性試験＞（メト化率の測定） 得られたヘモグロビン含有リポソーム試料について、３
７℃遮光下でインキュベーションを行い、インキュベー
ション開始時及び、１２，２４，３６，４８時間後のメ
トヘモグロビン量を測定し、３７℃、２４時間後のメト
化率（％）を比較した。メトヘモグロビン量の測定は、
メトヘモグロビンが４０７ｎｍ付近に吸収を持つことを
利用した。

【００２６】＜血中安定性試験＞得られたヘモグロビン
含有リポソーム懸濁液をＳＤ系雄ラット（６週齢）２，
０００ｍｇ／ｋｇ体重となるように静脈投与し、経時的
に１００μｌずつ採血し、等量の１２％ヒドロキシエチ
ルスターチ溶液と混合して、キャピラリーにとり遠心分
離操作を行った。（１１，０００ｒｐｍ×４５ｍｉｎ）
全長に対するリポソーム層の長さの割合（ｌｉｐｏｓｏ
ｍｅ−ｃｒｉｔ値）を測定し、投与直後を１００％とし
て血中半減期を測定し、血中安定性を評価した。

【００２７】［実施例２］実施例１において、パルミチ
ン酸ナトリウムの添加量を９８ｍｇ（０．３５ｍｍｏ
ｌ）に代えた以外は実施例１と同様の操作により、ＡＯ
ＤＰＣ、ＤＰＰＣ、コレステロールとパルミチン酸ナト
リウムを混合して、パルミチン酸ナトリウム６．６３ｍ
ｏｌ％を含む乾燥粉末からなる混合脂質を調製し、ヘモ
グロビン含有リポソーム懸濁液を得た。得られたヘモグ
ロビン含有リポソームは平均粒径２３２ｎｍ、Ｈｂ／Ｌ
値１．０を示した。実施例１と同様にして保存安定性試
験及び血中安定性試験を行ない物性を評価した。結果を
表１に示す。

【００２８】［比較例１］実施例１において、パルミチ
ン酸ナトリウムの添加量を９．８ｍｇ（０．０３５ｍｍ
ｏｌ）に代えた以外は実施例１と同様の操作により、Ａ
ＯＤＰＣ、ＤＰＰＣ、コレステロールとパルミチン酸ナ
トリウムを混合して、パルミチン酸ナトリウム０．７０
ｍｏｌ％を含む乾燥粉末からなる混合脂質を調製し、ヘ
モグロビン含有リポソーム懸濁液を得た。得られたヘモ
グロビン含有リポソームは平均粒径２２３ｎｍ、Ｈｂ／
Ｌ値０．４５を示した。実施例１と同様にして保存安定
性試験及び血中安定性試験を行なった。結果を表１に示
す。

【００２９】［比較例２］実施例１において、パルミチ
ン酸ナトリウムの代わりに同モル数のパルミチン酸を使
用した以外は、実施例１と同様にしてパルミチン酸１
２．４ｍｏｌ％を含む乾燥粉末からなる混合脂質を調製
し、ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を調製した。得
られたヘモグロビン含有リポソームは平均粒径２４０ｎ
ｍ、Ｈｂ／Ｌ値１．０を示した。実施例１と同様にして
保存安定性試験及び血中安定性試験を行なった。結果を
表１に示す。

【００３０】

【表１】未重合ヘモグロビン含有リポソームの評価

【００３１】表１の結果から明らかなように、本発明の
ヘモグロビン含有リポソームは、膜脂質に脂肪酸を含有
したリポソームに内包されたヘモグロビンに比べてメト
化率が低く、人工赤血球として優れた性能を有してい
る。またリポソームに含有させる脂肪酸塩の量を本発明
で特定された範囲内にすることにより、特に優れた効果
が発揮される。

【００３２】［実施例３］実施例１で得られたヘモグロ
ビン含有リポソーム懸濁液にγ線照射を行い脂質膜を重
合し、平均粒径２１８ｎｍ、Ｈｂ／Ｌ値１．１のヘモグ
ロビン含有リポソームが得られた。実施例１と同様にし
て保存安定性試験及び血中安定性試験を行ない物性を評
価した。結果を表２に示す。

【００３３】［比較例３］比較例２で得られたヘモグロ
ビン含有リポソーム懸濁液に実施例３と同様にしてγ線
照射を行い脂質膜を重合した。得られたヘモグロビン含
有リポソームは平均粒径２３５ｎｍ、Ｈｂ／Ｌ値０．９
であり、保存安定性試験及び血中安定性試験の結果は表
２のとおりであった。

【００３４】

【表２】重合ヘモグロビン含有リポソームの評価

【００３５】脂質膜を重合処理することにより、血中安
定性の優れた重合ヘモグロビン含有リポソームが得られ
るが、この場合でも本発明の重合ヘモグロビン含有リポ
ソームは、脂肪酸を使用したものに比べてメト化率上昇
抑制の効果が優れていることがわかる。

【００３６】

【発明の効果】本発明により、内水相のヘモグロビンの
メト化上昇を抑制し、しかもカプセル化効率とリポソー
ムの凝集抑制能の高い人工赤血球が提供される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 内水相にヘモグロビンを含有するヘモグ
   ロビン含有リポソームにおいて、リポソーム膜の構成脂
   質成分中に１〜３０モル％の脂肪酸塩を含み、ヘモグロ
   ビン重量／リポソーム膜構成脂質重量比が０．５〜２．
   ５で、粒径が１００〜３００ｎｍであることを特徴とす
   るヘモグロビン含有リポソーム。