JPH08508409A - 変異インスリン様増殖因子▲ｉ▼受容体サブユニットおよびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，修飾されたＩＧＦ−Ｉ受容体の機能によって特徴づけられる新規なＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット，これらの受容体サブユニットをコードする新規なポリ核酸配列，およびそれらの使用のための様々な応用を提供する．

Description

【発明の詳細な説明】 変異インスリン様増殖因子Ｉ受容体サブユニットおよびそれらの使用方法 謝辞 本発明は，国立保健衛生研究所（National Institute of Health）により付与 された補助金ＤＫ３４８２４およびＤＫ０２０２３に基づく政府の援助のもとに 行われた．政府は本発明についてある権利を有する． 発明の分野 本発明は，インスリン様増殖因子−Ｉおよびその受容体に関し，さらに詳しく は，修飾されたチロシンキナーゼ活性を有するインスリン様増殖因子−Ｉ受容体 サブユニットおよび受容体，ならびにそれらの使用方法に関する． 発明の背景 インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）は血漿中を高濃度で循環し，大部分の組 織に検出される７．５−ｋＤのポリペプチドである．ＩＧＦ−Ｉは様々な細胞お よび組織型において主として分裂誘発因子であるが，また細胞分化および細胞増 殖も刺激する．組織の成長に対するＩＧＦ−Ｉの重要性は思春期を通じてその血 漿濃度は増大し成人でプラトーに達すること，および大部分の哺乳類細胞種が増 殖の維持にＩＧＦ−Ｉを要求することによって示唆される．ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ −Ｉ受容体の相互作用が細胞増殖を仲介する広範囲の細胞種の総説には， Goldring，M.B．& Goldring，S.R.,Eukar．Gene Expression，１：３１−３２６ （１９９１）がある． インビボにおいて，ＩＧＦ−Ｉの血清レベルは下垂体成長ホルモン（ＧＨ）に 依存する．成長ホルモン依存性ＩＧＦ−Ｉの合成の主要部位は肝臓であるが，最 近の研究では大部分の正常組織もＩＧＦ−Ｉを産生することを指示している．各 種の腫瘍組織もＩＧＦ−Ｉを産生する．すなわち，ＩＧＦ−Ｉは自己分泌または 傍分泌，ならびに内分泌機構を介して正常および異常細胞の増殖の調節因子とし て作用するものと思われる． ＩＧＦ−Ｉ刺激細胞増殖を導く伝達経路の最初のステップはＩＧＦ−Ｉ受容体 への受容体リガンド（ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩI，または超生理学的濃度のイン スリン）の結合である．ＩＧＦ−Ｉ受容体は２種類のサブユニット，αサブユニ ット（完全に細胞外にあってリガンドとの結合に機能する１３０〜１３５−ｋＤ のタンパク質）とβサブユニット（膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有す る９５−ｋＤ膜貫通タンパク質）から構成される．ＩＧＦ−Ｉ受容体は最初は単 一鎖のプロ受容体ポリペプチドとして合成され，これがグリコシル化，タンパク 分解的切断，および共有結合によるプロセッシングを受けて，２個のαサブユニ ットと２個のβサブユニットからなる成熟４６０−ｋＤヘテロテトラマーに組み 立てられる．βサブユニット（単数または複数）はリガンド活性化チロシンキナ ーゼ活性を有する．この活性がβサブユニットの自己リン酸化およびＩＧＦ−Ｉ 受容体基質のリン酸化を含むシグナル伝達経路を誘導するリガンド作用であると 解釈される． すなわち，ＩＧＦ−Ｉ受容体は，正常および異常増殖過程において中枢的役割 を果たしているものと考えられる．ＩＧＦ−Ｉレベルの上昇は，下垂体機能亢進 症，巨人症を含めたいくつかの多様な病的状態と相関する．異常なＩＧＦ−Ｉ／ ＩＧＦ−Ｉ受容体機能は，乾癬，糖尿病（微小血管増殖），血管形成術後の血管 平滑筋の再狭窄と結び付けられてきた．様々な癌，たとえば白血病，肺癌，卵巣 癌および前立腺癌においては，非癌組織に比べて腫瘍組織によるＩＧＦ−Ｉ受容 体の過剰発現が存在し，これには多分，組織の自律増殖を招く自己分泌または傍 分泌フィードバックループにおけるＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−Ｉ受容体の相互作用が 関与するものと思われる．各種ヒト腫瘍の増殖において，ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ− Ｉ受容体相互作用が果たす役割についての総説は，Macaulay,V.M.,Br.J.Cancer, ６５：３１１−３２０（１９９２）を参照されたい． このような病的状態に伴う細胞増殖を阻害するための可能性のある戦略として は，ＩＧＦ−Ｉレベルの抑制またはその細胞受容体レベルにおけるＩＧＦ−Ｉ作 用の遮断が考えられる．たとえば，ＩＧＦの合成および／または分泌を低下させ る薬剤が用いられてきた．これらには，カルシノイドを含む内分泌腫瘍の処置な らびに下垂体機能亢進症および乳癌の実験的処置のための長時間作用型ソマトス タチン類縁体オクトレオチド，ならびに乳癌の処置のためのタモキシフェンが包 含される．しかしながら，とくに非標的組織の正常な増殖に影響を与えないで， 循環ＩＧＦ−Ｉを組織濃度が細胞増殖を制限するようなレベルまで抑制すること には，固有の困難性が認められてきた． ＩＧＦ−Ｉの作用をその細胞受容体レベルで遮断する可能性が考えられる一つ の戦略には，ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する抗体の使用がある．しかしながら，これ らの抗体では長期の拮抗よりもむしろ刺激を認めることが報告されている．した がって，本技術分野においては，リガンドによって活性化されるＩＧＦ−Ｉ受容 体の機能を細胞レベルで修飾する方法の必要性が明らかである．このような方法 は，非標的組織の細胞における内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体機能を遮断することなく 標的組織の細胞におけるＩＧＦ−Ｉ受容体機能を遺伝的に修飾可能なものである ことが好ましい． 発明の簡単な説明 本発明は，内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体に比較して修飾されたＩＧＦ−Ｉ受容体機 能を有するＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット（単数または複数）をコードする配列 からなる新規なポリ核酸ならびにそれらによってコードされるポリペプチドを提 供する．本発明のポリ核酸によってコードされるＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット （単数または複数）は，ＩＧＦ−Ｉ受容体のβサブユニットまたはαおよびβサ ブユニットのいずれに相当するものであってもよい．修飾できるＩＧＦ−Ｉ受容 体機能の一つはチロシンキナーゼ活性である．チロシンキナーゼ活性には自己リ ン酸化および細胞内ＩＧＦ−Ｉ受容体基質のリン酸化が包含され，これらの一方 または両者が本発明によって修飾される． 本発明によって提供される変異ＩＧＦ−Ｉ受容体は，内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体 に比較して修飾されたＩＧＦ−Ｉ受容体機能，たとえば修飾されたチロシンキナ ーゼ活性によって特徴づけられ，通常少なくとも１個の変異βサブユニットから 組み立てられて変異ＩＧＦ−Ｉ受容体ヘテロテトラマーを形成する．また，変異 ＩＧＦ−Ｉ受容体は２個の変異βサブユニットから組み立てられてもよい． 本発明はまた，本発明の新規なポリ核酸およびポリペプチドを用いて内因性の ＩＧＦ−Ｉ受容体機能を阻害する方法を提供する． 図面の簡単な説明 図１は標的細胞のトランスフェクションに用いられるｐＲＳＶ−ＩＧＦＩＲプ ラスミドの模式的なダイアグラムである．ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡの４． ２−kbのＨｉｎｃII／ＳｓｔＩフラグメントが発現ベクターＲｅｘｐ中にクロー ン化された． 発明の詳細な説明 本発明では，修飾されたＩＧＦ−Ｉ受容体機能によって特徴づけられる新規な ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット，これらの受容体サブユニットをコードする新規 なポリ核酸配列，およびそれらの使用のための様々な応用が提供される． ＩＧＦ−Ｉ受容体のそのリガンドによる活性化は，広範囲の細胞種の増殖に中 心的な役割を果たしていて，多くの疾患の進行に関与している．高レベルの細胞 ＩＧＦ−Ｉに関連する疾患の処置に向けられた努力は，ＩＧＦ−Ｉの血清濃度の 低下あるいはＩＧＦ−Ｉ受容体へのＩＧＦ−Ｉの結合の妨害に集中されてきたの で，限られた成功しか達成されなかった．本発明はこれらの戦略に伴う固有の困 難性を回避し，リガンドにより活性化されるＩＧＦ−Ｉ受容体の機能を細胞のレ ベルで修飾する遺伝的，組織特異的方法を提供するものである． ＩＧＦ−Ｉ受容体にはいくつかの機能部位がある．たとえばリガンド結合，基 質結合，自動リン酸化，基質のリン酸化，膜との会合，サブユニット間の結合等 の機能部位である．一般的にいえばＩＧＦ−Ｉ受容体の１種または２種以上の機 能が受容体の他の機能を有意に遮断することなく，独立に［すなわちＩＧＦ−Ｉ 受容体サブユニット（単数または複数）をコードする核酸の選択的突然変異によ り］修飾できることが見出されたのである． この現象を利用して，興味ある機能をコードするヌクレオチド配列の部分を選 択的に突然変異させることにより，内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体の変異体を形成させ ることができる．得られた変異サブユニットは，内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユ ニットまたは他の変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットと複合して変異ＩＧＦ−Ｉ 受容体を形成する能力を維持している．変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットが標 的細胞中に存在する場合には，標的細胞は優性負様式により変異ＩＧＦ−Ｉ受容 体サブユニットに特徴的な表現型を表す． 変異サブユニットおよび受容体に特徴的な表現型は，内因性遺伝子の存在下に も表現されるので「優性」と呼ばれる．変異サブユニットおよび受容体の表現型 は内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体の表現型と拮抗的であることから「負」と呼ばれる． しかし，優性負の語を使用しても，細胞中における多数の変異サブユニットの存 在により競合によって生じる所望の表現型の排除を意図するものではない． すなわち，本発明の方法は，変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットを発現させる ために組み換え核酸技術を使用する．変異サブユニットの発現は内因性ＩＧＦ− Ｉ受容体サブユニットに対して優性負の効果を発揮し，標的細胞ならびにそれら の子孫細胞に所望の表現型を生成させる． 本発明は，ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット（単数または複数）をコードする配 列からなる組み換えポリ核酸を提供する．コードされたＩＧＦ−Ｉ受容体サブユ ニット（単数または複数）は，内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体のＩＧＦ−Ｉ受容体機 能に比較して修飾されたＩＧＦ−Ｉ受容体機能によって特徴づけられる． 「ポリ核酸」の語はすべての形態のデオキシリボ核酸およびリボ核酸，すなわ ち二重鎖ＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ等を包含することを意図する．ＩＧＦ−Ｉ 受容体サブユニット（単数または複数）をコードするポリ核酸配列は，ＩＧＦ− Ｉ受容体のαサブユニットをコードしなくても，またその一部もしくはすべてを コードしていてもよい．本発明の現時点で好ましい実施態様においては，ポリ核 酸配列は，修飾されたチロシンキナーゼ活性を達成するために適当な突然変異を もつＩＧＦ−Ｉ受容体のαおよびβサブユニットの両者をコードする． 「ＩＧＦ−Ｉ受容体機能」の語は，疾患および非疾患状態の両者に関連する機 能たとえば，チロシンキナーゼ活性，リガンド結合，リガンドのインターナリゼ ーション，ＡＴＰ結合，細胞内基質の結合，リガンド依存性細胞分化 リガンド 依存性細胞増殖，リガンド依存性細胞トランスフォーメーション，リガンド依存 性の細胞腫瘍形成等のＩＧＦ−Ｉ受容体機能を包含するものである．「リガンド 依存性」の語は本明細書においてはＩＧＦ−Ｉ受容体の機能がその機能を活性化 するためのＩＧＦ−Ｉ受容体へのリガンドの結合に依存することを指示する． 「ＩＧＦ−Ｉ受容体機能」もしくは「チロシンキナーゼ活性」またはＩＧＦ− Ｉ受容体機能のいずれかの一つを修飾するのように用いられる「修飾された」の 語は，内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体の機能と比較して，機能の上昇，低下，パター ン変化またはその機能の欠如を意味するものである． 本明細書で用いられる「内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体」の語は，関心のある細胞に ネイティブなＩＧＦ−Ｉ受容体を意味するものである．本明細書において用いら れる「内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット」の語は，その細胞にネイティブな ＩＧＦ−Ｉ受容体のαおよび／またはβサブユニットを意味するものである． 本発明はまた，内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットのチロシンキナーゼ活性 に比較してチロシンキナーゼ活性が修飾されていることを特徴とするＩＧＦ−Ｉ 受容体サブユニット（単数または複数）をコードする配列からなる組み換えポリ 核酸を提供する． 本明細書において用いられる「修飾されたチロシンキナーゼ活性」の語は，内 因性ＩＧＦ−Ｉ受容体のチロシンキナーゼ活性に比較してチロシンキナーゼ活性 が上昇，低下，パターン変化または欠如していることを意味する．「チロシンキ ナーゼ活性」の語にはＩＧＦ−Ｉ受容体の自己リン酸化および細胞内基質すなわ ちＩＲＳ−１，Ｐ１３キナーゼ，ｐｐ１８５等のリン酸化が包含される． 配列番号１として掲げたＤＮＡ配列はヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のαおよびβサブ ユニットをコードするｃＤＮＡクローンを示す．配列番号２として掲げた配列は 配列番号１によってコードされる推定アミノ酸配列である．ヌクレオチド３２か ら１２１はシグナル配列をコードする．ヌクレオチド１２２から２２３９および アミノ酸１から７０６はαサブユニットをコードする．ヌクレオチド２２５２か ら４１３２およびアミノ酸７１１から１３３７はβサブユニットをコードする． 成熟ＩＧＦ−Ｉ受容体のαおよびβサブユニットはジスルフィド結合によって 連結されている．配列番号２に関しては，βサブユニット上のこの結合部位はア ミノ酸７４４〜約９０６内にある．βサブユニットはさらに膜貫通領域を配列番 号２のアミノ酸残基９０６もしくはその付近から約９２９にもつと説明すること ができる．βサブユニットはまた，アミノ酸残基９３０から約９９０に膜貫通領 域に隣接する膜近接領域を有する．成熟ＩＧＦ−Ｉ受容体が細胞膜内に繋留され ると，膜近接領域は細胞膜に隣接する細胞質内に位置する．βサブユニット上， 膜近接領域のさらに下流は，ほぼアミノ酸残基１００３におけるＡＴＰ結合ドメ インである．ＡＴＰ結合部位とアミノ酸１３３７のカルボキシ末端の間，アミノ 酸残基約９７３〜１２２９に，細胞質内チロシンキナーゼドメインが存在する． 本発明の他の実施態様においては，内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットの核 酸配列，または標的細胞と適合性を有しＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットをコード する核酸配列を，たとえば，発現されたＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットが修飾さ れたＩＧＦ−Ｉ受容体機能をもつように突然変異によって修飾される．もちろん 突然変異のために選択される位置は，修飾を所望の内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体の機 能に依存することになる．たとえばアミノ酸残基９４３，９５０および９５７の 膜近接領域，たとえば残基１００３のＡＴＰ結合部位，ならびにたとえばアミノ 酸残基１１３１，１１３５および１１３６の細胞内チロシンキナーゼドメインと アミノ酸残基１３１６におけるカルボキシ末端はすべて，チロシンキナーゼ活性 を修飾するためのアミノ酸置換が可能である．さらに，たとえばβサブユニット のアミノ酸残基９５２におけるインフレーム終結コドン（ＵＡＧ，ＵＡＡまたは ＵＧＡ）の挿入によるβサブユニットの中断，ならびにアミノ酸９４３から９６ ６の２２アミノ酸の欠失は，チロシンキナーゼの修飾を生じる．上述したβサブ ユニットに対する突然変異の詳細は以下に記載の実施例でさらに細かく説明する ．本開示によって提供された情報を用いれば，本技術分野の熟練者には，所望の 結果を達成するために，多くのミスセンスまたはナンセンス突然変異を含めて， 核酸配列の突然変異またはアミノ酸配列の変換を行う本技術分野の熟練者にはよ く知られた多くの他の方法があることは自明であろう． 現時点で好ましい実施態様では，αサブユニットを結合して成熟ＩＧＦ−Ｉ受 容体テトラマーを形成するのに必要なβサブユニットの部分のみおよびＩＧＦ− Ｉ受容体サブユニットを細胞膜内に繋留するのに必要なβサブユニットの部分の みが，本発明のポリ核酸配列およびアミノ酸配列によってコードされる．たとえ ば，この核酸配列およびアミノ酸配列は，βサブユニットのアミノ末端から繋留 の達成に必要な膜貫通ドメインの部分まで，すなわち，アミノ酸残基２２５２か ら約２９０９までをコードするのみでもよい． 「実質的に同一」の句は本明細書においては，本発明の修飾されたＩＧＦ−Ｉ 受容体機能を達成するために必要な変異以外に，それぞれ配列番号１および配列 番号２からの結果に影響する配列変異はない核酸配列またはアミノ酸配列を意味 して用いられる．たとえば例IIに記載したヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡに対す る突然変異から生じる核酸配列およびアミノ酸配列は配列番号１と実質的に同一 ということになる．同様に，これらの突然変異ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡの 発現によって生じるアミノ酸配列は，配列番号２と実質的に同一ということにな る．同様に，ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットの機能（上述のものを除く）または その三次元構造を実質的に変化させない荷電残基の同様に荷電した残基による置 換または非極性残基の他の非極性残基による置換で生じる核酸配列またはアミノ 酸配列の変化は「実質的に同一」の配列の範囲である． 本発明のさらに他の実施態様においては，修飾されたＩＧＦ−Ｉ受容体機能， たとえば内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体機能と比較して修飾されたチロシンキナーゼ活 性，およびさらに内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット（単数または複数）と複 合して変異ＩＧＦ−Ｉ受容体を形成する能力によって特徴づけられるＩＧＦ−Ｉ 受容体サブユニットをコードする配列からなるポリ核酸を提供する． 本明細書において用いられる「変異ＩＧＦ−Ｉ受容体」の語は２個のαサブユ ニットおよび２個のβサブユニットからなるテトラマー構造を有し，その少なく とも１個のβサブユニットは変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットであり，その受 容体は，通常は内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体の表現型に拮抗する所望の優性表現型を 有する成熟ＩＧＦ−Ｉ受容体を意味する． 本明細書において用いられる「変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット」の語は， 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットが変異ＩＧＦ−Ｉ受容体の構成成分である場 合，内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体機能に比較して修飾されたＩＧＦ−Ｉ受容体機能を 発揮するＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットを意味する．たとえば，変異ＩＧＦ−Ｉ 受容体サブユニットは内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットに比較して修飾され たチロシンキナーゼ活性を示すものであってもよい．変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブ ユニットはさらに内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット（単数または複数）と複 合して変異ＩＧＦ−Ｉ受容体を形成する能力により特徴づけることもできる． 本発明のさらに他の実施態様においては，本発明の核酸を含有するベクターが 提供される．本明細書において用いられる「ベクター」または「プラスミド」の 語は，本発明のポリ核酸配列を発現または転写のいずれかのために細胞内に導入 するのに使用される独立した要素を意味する．このようなベクターの選択および 使用は本技術分野の熟練者にはよく知られていて，そのポリ核酸を受容する標的 細胞に応じて変動する． 発現ベクターは，調節配列たとえばプロモーター領域と操作性に連結するポリ 核酸配列を発現できる構築体である．すなわち，「発現ベクター」は，組み換え ＤＮＡまたはＲＮＡ構築体，たとえばプラスミド，ファージ，組み換えウイルス または適当な宿主細胞中に導入するとクローン化されたポリ核酸配列の発現が起 こる他のベクターを意味する．適当な発現ベクターは本技術分野の熟練者にはよ く知られていて，真核細胞および／または原核細胞中で複製可能であって，エピ ソームに留まるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれるベクターが包含され る．変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットの真核宿主細胞とくに哺乳動物細胞中で の発現に現時点で好ましいプラスミドには，ＲＳＶ ＬＴＲを有するＲｅｘｐ， モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ駆動発現ベクター等がある． 本明細書において用いられるプロモーター領域の語はそれに操作性に連結した ＤＮＡの転写を制御するポリ核酸のセグメントを意味する．プロモーター領域は ＲＮＡポリメラーゼの認識，結合ならびに転写開始に十分な特異的配列を包含す る．プロモーター領域のこの部分がプロモーターと呼ばれる．さらに，プロモー ター領域にはＲＮＡポリメラーゼのこの認識，結合および転写開始活性を調節す る配列が包含される．プロモーターは調節の性質に応じて構成的であっても調整 的であってもよい．たとえば本発明の実施に際しての使用が考えられるプロモー ターには，ＳＶ４０初期プロモーター，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモ ーター，モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーター，チミジンキ ナーゼプロモーター，ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター等がある． 本明細書において用いられる「操作性に連結する」の語は，ポリ核酸配列とヌ クレオチドの調節およびエフェクター配列，たとえば，プロモーター，エンハン サー，転写および翻訳停止部位，ならびに他のシグナル配列との機能的関係を意 味する．たとえば，ＤＮＡのプロモーターへの操作性連結とは，このＤＮＡの転 写が，そのＤＮＡを特異的に認識し，それに結合し，それを転写するＲＮＡポリ メラーゼによってプロモーターから開始されるような，ＤＮＡとプロモーターの 間の物理的および機能的関係を意味する． 本発明の他の実施態様においては，上述のポリ核酸を含む細胞が提供される． このような宿主細胞たとえば細菌，酵母および哺乳類細胞が，本発明のポリ核酸 の転写ならびに変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット（単数または複数）の製造に 使用できる．クローン化ポリ核酸の適当な発現ベクターへの導入，プラスミドベ クターもしくはプラスミドベクターの組合せまたは線状ＤＮＡによる真核細胞の トランスフェクション，あるいはレトロウイルス構築体による感染，およびトラ ンスフェクトまたは感染細胞の選択は，本技術分野においてはよく知られている （Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，２版，Cold Spring Harbor，１９８９参照）．異種ＤＮＡは，本技術分野の熟練者にはよく知られた 任意の方法で，たとえば異種ＤＮＡをコードするベクターのCaPO₄法によるトラ ンスフェクションにより宿主細胞に導入できる（たとえば，Kashanchi，F．ら，Nucl．Acids Res． ２０：４６７３−４６７４，１９９２参照．この同じ方法を 本発明のタンパク質の宿主細胞への導入に使用できる）．ついで組み換え細胞を そのＤＮＡによってコードされたサブユニット（単数または複数）が発現する条 件下に培養することができる．好ましい細胞には，哺乳類細胞，たとえば腫瘍細 胞，リンパ球，幹細胞，下垂体細胞，骨髄細胞，線維芽細胞等がある． 本発明のさらに他の実施態様においては，本発明の核酸によってコードされる ポリペプチドが提供される．本明細書において用いられる「タンパク質」，「ペ プチド」および「ポリペプチド」の語は，同等の語と考えてよく，互いに交換し て使用できる． ポリ核酸およびタンパク質で構成される物質に加えて，本発明は本発明のポリ 核酸およびポリペプチドのいくつかの新規な使用方法を提供する．本発明は内因 性ＩＧＦ−Ｉ受容体チロシンキナーゼ活性に比較して修飾されたチロシンキナー ゼ活性によって特徴づけられる変異ＩＧＦ−Ｉ受容体が形成されるのに適当な条 件下に，変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットを細胞中に導入することによって， 細胞内の内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体機能を阻害する方法を提供する．本発明のこの 方法はインビトロでも同様に実施できることは容易に理解されよう． 本発明の方法によれば，変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットをコードする核酸 配列は本技術分野の熟練者に知られている任意の方法，たとえば腹腔内，皮下， 脈管内，筋肉内，経鼻もしくは静脈内注射，移植もしくは経皮投与様式等によっ て，治療剤として哺乳類動物に投与することができる．本発明の構成物質を治療 剤として投与する場合には，構成物質を適当な医薬用担体と配合する必要がある ことは本技術分野の熟練者には自明であろう．医薬用担体の選択および治療剤と しての組成物の製造は，意図された用途および投与様式に依存する．治療剤の適 当な製剤および投与方法は本技術分野の熟練者によれば容易に決定できる． ＩＧＦ−Ｉ関連疾患の処置のための投与基準は様々な因子，たとえば疾患の種 類，患者の年齢，体重，性別および医学的状態，ならびに病的状態の重症度，投 与経路，使用する治療剤の種類に依存する．熟練した医師または獣医師によれば 患者の処置に必要な化合物または医薬の有効量を決定し処方することは容易であ る．通常は，本技術分野の熟練者によれば，初期には比較的低用量が用いられ， ついで最大の応答が得られるまで用量を増大していくことになる．本発明の核酸 は増幅されやすいので，通常の薬剤投与方法の場合に比べてはるかに低用量で有 効であると考えられる． 次に本発明を，以下の非限定的実施例によりさらに詳細に説明する． 例Ｉ プラスミドの構築 Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，２版，Cold Spring Harbor（１９８９）に記載されているようなＤＮＡ操作の標準的方法を，すべて のプラスミドの構築に使用した．以下の例で使用されるヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を コードする４．２−kbのｃＤＮＡフラグメントは，ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡラ イブラリー（Stratagene，La Jolla，CA）を，配列番号１のＤＮＡフラグメント （核酸残基４３〜２８０）およびUllrich A.ら，EMBOJ，５：２５０３−２５１ ２（１９８６）に記載され配列番号14に掲げたオリゴヌクレオチドプローブでス クリーニングによって得られた．このオリゴヌクレオチドはABI#３９４ＤＮＡシ ンセサイザー（Applied Biosystems，Inc．Foster City，CA）で合成した．特異 的なクローンは³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡフラグメントプロー ブとの３ラウンドの配列特異的コロニーハイブリダイゼーションによって選択し た． 重複クローンを互いにリゲートさせて完全長クローンを得て，その同一性はＤＮ Ａ配列決定によって確認した． 発現構築体は単離されたヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡの４．２−kbＨｉｎｃ II−ＳｓｔＩフラグメントを，哺乳類発現ベクターＲｅｘｐ（図１参照）のポリ リンカー部位にライゲートすることにより調製した．ＲｅｘｐはYamasaki,Hら，Mol.Endocrinology ５：８９０（１９９１）に記載されていて，California大学 （San Diego，CA）のM．Rosenfeld氏から入手した．正方向の構築体が制限地図 の作成によって同定され，ｐＲＳＶ−ＩＧＦＩＲと命名された． ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡをＲｅｘｐ発現ベクターのＢａｍＨ１部位にラ イゲートして生成させた負の方向の構築体はｐＲＳＶ−ｒＩＧＦＩＲと命名され た．すべてプラスミドは２種の塩化セシウム勾配上で精製した． 例II ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡの突然変異生形 ｐＲＳＶ−ＩＧＦＩＲからの０．４５−kb ＳｍａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメ ントを，Ｍ13ｍｐ19中にサブクローニンクした．突然変異形成には以下のプライ マーを使用した． 突然変異したオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡにアニーリングし，以後の突 然変異形成は，Amershamのキットを使用し製造業者の説明書に従って実施した． ＩＧＦ−Ｉ受容体をコードするＳｍａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントのＳｃａＩ 部位にＳａｌＩリンカー（５’−GTCGAC−３’）を挿入して，位置９５０にさら に３個のアミノ酸（Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ）を含有するＩＧＦＩＲ−ＣＲＨを 生成させた．ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体の中断には，０．４５−kb ＳｍａＩ−Ｈｉ ｎｄIIIフラグメントをＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングした．ＩＧＦ−Ｉ 受容体ｃＤＮＡのＳｍａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント中に存在するＳｃａＩ部 位に，Ｘｂａリンカー，すなわち５’−TGCTCTAGAGCA−３’（配列番号１３）を 挿入して，位置９５２にインフレーム終結コドンを生成させた． 突然変異配列をｐＲＳＶ−ＩＧＦＩＲベクター中に再導入したのち，すべての 構築体を，Ｔ７シーケナーゼ（U．S．Biochemical，Cleveland，Ohio）を用いて ジデオキシ配列決定に付し，突然変異配列を確認した．以下の野生型および以下 の変異型ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットをコードするｃＤＮＡを含むプラスミド を形成させた． ＷＴ＝突然変異のないヒトＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット， ⁹⁴⁰Ａｌａ＝膜近接領域における残基９４０のアラニン置換を有するヒトＩＧ Ｆ−Ｉ受容体サブユニット， ⁹⁴³Ａｌａ=膜近接領域における残基９４３のアラニン置換を有するヒトＩＧ Ｆ−Ｉ受容体サブユニット， ⁹⁵⁰Ｃｙｓ＝膜近接領域における残基９５０のシステイン置換を有するヒトＩ ＧＦ−Ｉ受容体サブユニット， ⁹⁵⁰Ｓｅｒ＝膜近接領域における残基９５０のセリン置換を有するヒトＩＧＦ −Ｉ受容体サブユニット， ⁹⁵⁰Ｌｅｕ＝膜近接領域における残基９５０のロイシン置換を有するヒトＩＧ Ｆ−Ｉ受容体サブユニット， ⁹⁵⁰Ｔｈｒ＝膜近接領域における残基９５０のスレオニン置換を有するヒトＩ ＧＦ−Ｉ受容体サブユニット， ⁹⁵²ＳＴＯＰ＝βサブユニットが中断されているヒトＩＧＦ−Ｉ受容体サブユ ニット， ⁹⁵⁷Ａｌａ＝膜近接領域における残基９５７のアラニン置換を有するヒト ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット， ¹⁰⁰³Ａｌａ＝ＡＴＰ結合ドメインにおける残基１００３のアラニン置換を有す るヒトＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット， Δ２２＝残基９４３〜９６６に２２個のアミノ酸欠失を有するヒトＩＧＦ−Ｉ 受容体サブユニット，および ＩＧＦＩＲ−ＣＲＨ＝残基９５０に３個の付加的アミノ酸（Cys−Arg−His） を有するヒトＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット． すべてプラスミドは２種の塩化セシウム勾配上で精製した． 例III ＧＣラット下垂体細胞およびラットＩ線維芽細胞の トランスフェクション 成長ホルモンを分泌するＧＣラット下垂体細胞（ＧＣ細胞）はNew York（NewY ork）のH.H.Samuels博士から入手したが，多種の市販ソースから入手することも できる．ＧＣラット下垂体細胞は，１０％（容量／容量）ウシ胎児血清を補充し たダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中，加湿した９５％空気／５％ＣＯ₂ 雰囲気下に３７℃で増殖させた． ラットＩ線維芽細胞は，P．Koeffler氏（Cedars-Sinai Medical Center，LosA ngeles，CA）から入手したが，多種の市販ソースから入手することも可能である ．ラットＩ線維芽細胞は１０％（容量／容量）ウシ胎児血清を補充したαＭＥＭ 中において３７℃で増殖させた． セミコンフルーエントなＧＣ細胞またはラットＩ線維芽細胞は線状化ベクター ｐＲＳＶ−ＩＧＦＩＲまたはｐＲＳＶ−ｒＩＧＦＩＲ（例IIに記載したプラスミ ド変異体）１０μgで２４時間コトランスフェクトした．ラットＩ線維芽細胞は ＷＴまたは⁹⁵²ＳＴＯＰのみおよびネオマイシン抵抗性による選択を可能にする ために，１μｇのｐＳＶ２ｎｅｏによりトランスフェクトした（Southern P．J. ら，J.Mol.Appl.Genet.,１：３２７−３４１，１９８２の記載参照）．トランス フェクションはリン酸カルシウム沈殿法によりPrager．D.ら，J.Biol.Chem.２６ ３：１６５８０−１６５８５（１９８８）の記載のように実施した． ついで細胞を１：６に分割し，新鮮培地に，ＧＣ細胞では４００μg/ml，ラッ トＩ線維芽細胞では６００μg/ml濃度でネオマイシン（Ｇ４１８；Gibco，Gaith ersburg，MD）を添加した．培地の補充は７２時間毎に実施した．細胞表面にヒ トＩＧＦ−Ｉ受容体の発現をみない模擬トランスフェクトしたラットＩ細胞（Ｉ ５１Ｎｅｏすなわち，ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡおよびｐＳＶ２ｎｅｏを導 入）を対照として使用した． 例IV 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体はＩＧＦ−Ｉを結合する 放射標識ＩＧＦ−Ｉの結合は懸濁液中で実施した．トランスフェクトしたＧＣ 細胞またはラットＩ線維芽細胞約１×１０⁶個を［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉ（５０，０ ００cpm,比活性２，０００Ci/mmol）（Amersham，Arlington Height，IL）とイ ンキュベートした．最終容量１mlの結合緩衝液（１％ウシ血清アルブミン，１２ ０mMまたは１５０mM ＮａＣｌ，１．２mM ＭｇＳＯ₄含有５０mM ＨＥＰＥＳ ，pH８）中において非標識組み換えヒトＩＧＦ−Ｉ（Ｍｅｔ−５９）（Fujisawa Pharmaceutical Co.，Osaka，Japan）を濃度を増大させ約１５℃で添加した．非 特異的結合は過剰の（１００nM）非標識ＩＧＦ−Ｉの存在下に観察された結合と 定義した． ３時間インキュベートしたのちトランスフェクタントを遠心分離し，氷冷した ジブチルフタレート３００μlを加え細胞に結合した放射能を遊離の［¹²⁵Ｉ］Ｉ ＧＦ−Ｉから分離した．サンプルの細胞結合放射能をついでガンマーカウンティ ングによって測定した．総結合リガンドの計算には遊離標識リガンドを包含した ． 非標識ＩＧＦ−Ｉの量を増大させて，すべてのトランスフェクタントに対する ＧＣ細胞関連［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉ結合を置換すると，０．６〜２nMのＩＧＦ− Ｉにより最大結合の５０％置換が達成された．これらの結合置換データをスキャ ッチャード解析に付すと，すべての突然変異トランスフェクタントについて直線 のプロットが得られ，これらのＧＣトランスフェクタントにおける単一クラスの 高親和性受容体の存在が指示された．［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉ結合について誘導さ れる結合定数（Kd）はすべてのトランスフェクタントで類似していて，１．１９ nMのKdを示した⁹⁴⁰Ａｌａの場合を除いて０．２５〜０．６６nMの範囲であった ．異なる突然変異受容体についてのリガンド親和性のこの類似性は，βサブユニ ット が突然変異した場合でも細胞外αサブユニットは無傷のままであると期待される ことから，考えられることである．各トランスフェクタント上に存在する変異Ｉ ＧＦ−Ｉ受容体の誘導数は非トランスフェクト細胞に比較して７〜３４倍に増加 した． 同様に，さらに検討するために選択されたトランスフェクトラットＩ線維芽細 胞クローンのスキャッチャード解析によれば，無傷のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ＷＴ ｃＤＮＡトランスフェクタント，および中断ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡトラ ンスフェクタント⁹⁵²（ＳＴＯＰ）についての結合親和性（それぞれ，１．０８ および０．６７nM）はトランスフェクトされていないラットＩ線維芽細胞に対す るＩＧＦ−Ｉ結合のKdと類似するが，トランスフェクタントでは細胞あたりのＩ ＧＦ−Ｉ結合部位の２．５〜７倍の増加が認められた． 要約すると，ＧＣ細胞およびラットＩ線維芽細胞における変異ヒトＩＧＦ−Ｉ 受容体サブユニットの発現は，細胞あたりのＩＧＦ−Ｉ結合部位の増大を招く． 結合部位の増加は変異ＩＧＦ−Ｉ受容体の形成に起因する． 例Ｖ 変異ＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込み 外因性ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ＤＮＡのＧＣ細胞およびラットＩ線維芽細胞ゲノ ムＤＮＡへの組み込みを確認するために，トランスフェクトされた細胞のＤＮＡ のサザンブロット分析を実施した． トランスフェクトされた細胞およびトランスフェクトされていない細胞からの 単離ゲノムＤＮＡは，Prager，D.ら，J.Clin.Invest.，８５：１６８０−１６８ ５（１９９０）の記載のようにして調製し，ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ（Beth esda Research Laboratories，Gaithersburg，MD）によって消化した．ＤＮＡフ ラグメントは０．８％アガロースゲル上電気泳動によって分離し，ナイロン膜に 移した．膜を８０℃で２時間加熱し，２５０mM ＮａＨＰＯ₄−Ｈ₂Ｏ，２５０mM ＮａＨ₂ＰＯ₄−７Ｈ₂Ｏ，７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），１％ＢＳ Ａおよび１mM ＥＤＴＡを含有する溶液１０ml中６５℃で２時間プレハイブリダ イズした． ³²Ｐ−標識ＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡ（Boehringer Mannheim，Indianapolis ） 比活性６×１０⁷dpmはランダムプライミングによって調製した．ハイブリダイゼ ーションは６５℃で２４時間行った．膜は，２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３Ｍ食 塩および０．３Ｍクエン酸ナトリウム）および０．１％ＳＤＳ，２００ml中６５ ℃で１５分間２回，０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ，２００ml中６５℃で１５ 分間２回洗浄した．フイルターをKodakフイルム（Eastman Kodak，Rochester，N Y）ならびに増感スクリーンを使用して−７０℃で７日間オ−トラジオグラフィ ーを行った． ヒト受容体プローブはすべてのトランスフェクタントＤＮＡサンプルに適当に ハイブリダイズしたが，トランスフェクトしていないＧＣ細胞およびラットＩ線 維芽細胞から抽出したＤＮＡには最低限ハイブリダイズしたのみで，外因性ヒト ＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡはこれらの細胞のゲノムに組み込まれたことが確認さ れた．ランダムなサイズのＤＮＡバンドに加えて，ＥｃｏＲＩでの消化によって ｐＲＳＶ−ＩＧＦＩＲからの放出が期待された大きな約５キロベースのＤＮＡフ ラグメントが各トランスフェクタントで可視化された． 例VI 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体の特性 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体の形成（内因性ラットＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット／ 変異ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットおよび／または変異ヒトＩＧＦ−Ｉ受容 体サブユニット／変異ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット）は，移動標識³⁵Ｓ− メチオニン（ICN，Irvine，California）によるトランスフェクタントの代謝的 な標識化ついでαIＲ３（Oncogene,Manhesset,NY）ならびにCambridge大学（Cam bridge，England）K．Siddle博士から入手したＡｂ１−２モノクローナル抗体の 両者でのタンパク質の免疫沈降によって証明された． ＷＴ ＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡによりトランスフェクトしたコンフルーエン トＧＣ細胞およびラットＩ線維芽細胞ならびに⁹⁵²（ＳＴＯＰ）ＩＧＦ−Ｉ受容 体ｃＤＮＡ細胞をリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）５mlで濯ぎ，血清およびメチオ ニンを含まない培地５ml中０．５mCi［³⁵Ｓ］メチオニン（CSA,１,０４９Ci/mmo l）により３７℃で代謝的に標識した．１６時間後に，細胞を溶解緩衝液（０． ０１M ＮａＣｌ，０．５％デオキシコール酸，１％Triton X−１００，０．１％ ＳＤＳ，０．０１％ナトリウムアジド，および１mMフェニルメチルスルホニルフ ルオリド）で溶解し，３，０００rpm,４℃で１５分間遠心分離した．αＩＲ３ま たはＡｂ１−２のいずれかを，それぞれ１：５００または１：３００の最終濃度 で使用した．免疫複合体はプロテインＡ−Sepharose（Pharmacia Inc.,Piscata way,NJ）で沈殿させた．ペレットをついで洗浄し，４％非変性ポリアクリルア ミドＳＤＳゲルに予め染色したタンパク質分子量マーカー（Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD）と共に負荷した． αＩＲ３はヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のαサブユニットを認識する．したがって， ４６０−ｋＤのＷＴ受容体ホロテトラマーおよび中断３００−ｋＤの⁹⁵²ＳＴＯ Ｐ変異受容体ホロテトラマーがαＩＲ３での免疫沈降に応答してゲル上に明瞭な バンドとして現れる．Ａｂ１−２はラットおよびヒト両ＩＧＦ−Ｉ受容体のカル ボキシ末端βサブユニットエピトープを認識し，したがって３６０−ｋＤ変異（ ラットＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット／変異ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット ）受容体ヘテロテトラマーがゲル上に明らかに異なるバンドとして同定される． 無傷のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ホロテトラマーは，ＷＴトランスフェクタント中 αＩＲ３およびＡｂ１−２の両者で免疫沈降させた．αＩＲ３は⁹⁵²ＳＴＯＰト ランスフェクタント中の変異中断ヒト受容体ホロテトラマーを沈殿させた．Ａｂ １−２による⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントの免疫沈降に応答した唯一の卓 越したバンドは３６０−ｋＤの変異ラット／ヒトハイブリッド受容体であった． 例VII 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体の寿命 ＩＧＦ−Ｉ受容体の生合成半減期を検討するために，セミコンフルーエントの ＧＣ細胞トランスフェクタントを例VIの場合と同様にして［³⁵Ｓ］メチオニンで 代謝的に標識した．１６時間後に，メチオニンを含有し６．５nMのＩＧＦ−Ｉを 含むまたは含まない無血清特定（ＳＦＤ）培地を補充した．さらに３７℃でイン キュベートし，細胞を０，０．５，２，６および１６時間に収穫して例VIの記載 と同様に処理した． ＷＴ受容体の半減期は６時間以上であった．濃度計測スキャニングにより，１ ６時間までに受容体の分解の９０％増大が明らかにされた．リガンドの添加は受 容体の分解速度には影響しないように思われた．⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタ ントにおいては変異ラット／ヒトハイブリッド受容体の分解速度は明らかに遅延 し，１６時間後にも大部分の合成受容体はなお存在した．同様に，リガンドの存 在は変異ラット／ヒトハイブリッド受容体の半減期には影響しなかった．変異中 断−ヒトＩＧＦ−Ｉホロテトラマーはまた，変異ラット／ヒトハイブリッド受容 体の緩徐な分解に類似して遅い速度で分解するように思われた． 例VIII ＩＧＦ−Ｉインターナリゼーション 約１×１０⁶ラットＩ線維芽細胞およびＧＣ細胞トランスフェクタントを，１ ％ウシ血清アルブミンおよび１０mM ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ（pH７．８）０ .５ml中において，［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉ（４０〜５０，０００cpm）と３７℃で ３０分間インキュベートした．指示されたインキュベーション時間終了時に，培 地を３０μlのＩＮ ＨＣｌで酸性とし，４℃でさらに６分間インキュベートし た．細胞内（酸抵抗性）または細胞連結［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉを例VIの記載と同 様にして測定した．分解した［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉは，３００μｌインキュベー ション緩衝液のトリクロロ酢酸沈殿（１０％）によって評価した．さらに４℃に ４分間置いたのちに，上清中の分解した［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−ＩをLevyJ．R．ら，E ndocrinology, １１９：５７２−５７９（１９８６）の記載のようにガンマーカ ウンターで測定した．％インターナリゼーションは非トランスフェクト細胞での それぞれの値を差し引いたのち以下の式によって計算される． 位置９４０，９４３または９５０にアミノ酸置換を有するｃＤＮＡでトランス フェクトされたＧＣ細胞およびＩＧＦＩＲ−ＣＲＨトランスフェクタント，なら びにＷＴトランスフェクタントは４６〜７０％の外因性［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉを インターナライズした．これに対し，⁹⁵⁷Ａｌａトランスフェクタントは総結合 ［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉの２４％をインターナライズしたのみであり，Δ２２およ び¹⁰⁰³Ａｌａトランスフェクタントでは標識ＩＧＦ−Ｉリガンドをインターナラ イ ズしなかった． 同様に，トランスフェクトされていないラットＩ線維芽細胞およびＷＴトラン スフェクタントはいずれも［¹²⁵Ｉ］ＩＧＦ−Ｉを時間依存性にインターナライ ズした．しかしながら，⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントにおいては，３０分 のインキュベーション期間中に標識リガンドはインターナライズされなかった． これらのインターナリゼーションの研究は，例VIの免疫沈降アッセイの結果と 合わせて考えると，残基９５７および１００３におけるアミノ酸置換ならびに欠 失突然変異から生じる変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットがラットＩ線維芽細胞 およびＧＣ細胞の内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットと複合して変異ラット／ ヒトハイブリッドＩＧＦ−Ｉ受容体を形成することを示している．これらの変異 ＩＧＦ−Ｉ受容体は内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体リガンドのインターナリゼーション に対して負のトランスドミナントな効果を発揮する． 例IX 内因性基質の変異ＩＧＦ−Ｉ受容体自己リン酸化およびリン酸化 ［³⁵Ｓ］メチオニンで１０または１６時間標識したトランスフェクタントＧＣ 細胞をＰＢＳで洗浄し，無血清特定培地中ＩＧＦ−Ｉ（６．５nM）とともにまた はＩＧＦ−Ｉを加えないで３７℃において１分間インキュベートした．細胞をつ いで溶解緩衝液［１％Triton X−１００，３０mMピロリン酸ナトリウム，１０mM Tris（pH７．６），５mM ＥＤＴＡ（pH８），５０mM ＮａＣｌ，０．１％ウシ 血清アルブミン，２mMオルトバナジン酸ナトリウム，２００mMフェニルメチルス ルホニルフルオリド］に溶解し３，０００rpmにおいて１５分間遠心分離した． 免疫沈降はモノクローナル抗−ホスホチロシン抗体，Ａｂ２またはＰＹ２０を 用い，４℃でそれぞれ３時間または１６時間実施した（Ａｂ２は Oncogene Scie nce，Manhasset，NYから入手し，ＰＹ２０はICN，Costa Mesa，CAから入手した ）．Ａｂ１−２で行ったアッセイについてはプロテインＡ−Sepharoseを抗−マ ウスＩｇＧ（Sigma Chemical Corp.，St．Louis，Missouri）とともに，ＰＹ２ ０で実施したアッセイでは抗−マウスＩｇＧを使用せずに，モノクローナル抗− ホスホチロシン抗体細胞溶解物複合体と室温で２時間インキュベートした．免疫 沈殿を０．９mlの溶解緩衝液中で６回洗浄し，０．０４mlのサンプル緩衝液中 に再懸濁し，９５℃に３〜５分間加熱し，７．５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポ リアクリルアミドゲル上電気泳動に付した． ＩＧＦ−Ｉリガンドに応答して，ＷＴおよび⁹⁵⁷Ａｌａトランスフェクタント は，ＩＧＦ−Ｉ受容体（９７kD）のβサブユニットおよびチロシン残基を含む細 胞内タンパク質基質，ｐｐ１８５および／またはＩＲＳ−１（１６５−１８５kD ）の両者のチロシンリン酸化を誘導した．⁹⁵⁰ＡｌａトランスフェクタントはＩ ＰＳ−１をリン酸化しなかったが，他の場合では，強度は低いもののＷＴトラン スフェクタントに類似のリン酸化が認められた．⁹⁴³Ａｌａトランスフェクタン トは受容体のβサブユニットを自己リン酸化したが，ＩＲＳ−１のリン酸化はＷ Ｔトランスフェクタントの場合に比べて低下した．¹⁰⁰³Ａｌａおよび⁹⁵²ＳＴＯ Ｐトランスフェクタントは，リガンド仲介ＩＧＦ−Ｉ受容体自己リン酸化および 内因性タンパク質リン酸化を受けなかった． これらの結果は，位置９５０および多分９４３におけるチロシン残基がＩＲＳ −１のリン酸化に重要な部位であること，また，ＩＲＳ−１が成長ホルモン遺伝 子へのＩＧＦ−Ｉリガンドのシグナリングを仲介することを示唆するものである ．さらに，成長ホルモンの抑制レベルは，ＩＧＦ−Ｉ受容体基質，ＩＲＳ−１の チロシンリン酸化によって評価された細胞中のＩＧＦ−Ｉ刺激チロシンキナーゼ 活性とほぼ平行する．ＡＴＰドメイン中の位置１００３におけるリジン残基は自 己リン酸化およびリン酸化に重要である． 例Ｘ 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体はＩＧＦ−Ｉのシグナリングを阻害する 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体の形成が，ＩＧＦ−Ｉシグナルを成長ホルモン遺伝子に 伝達する内因性ラットＩＧＦ−Ｉ受容体の能力に及ぼす影響を決定するために， 約５×１０⁵個のＧＣ細胞で９cm²のマルチウエルを覆い，増殖培地中で，２４時 間増殖させた．ついで培地を吸引し，Yamasaki,Hら，Endocrinology，１２８： ８５７−８６２（１９９１）に記載の培地［ＤＭＥＭ中，０．６nMトリヨードサ イロニン（Ｔ₃），０．２ng/mlの副甲状腺ホルモン（PTH）,１０mg/mlのトラン スフェリン，０．１ng/mlの上皮増殖因子，０．２ng/nlの線維芽細胞増殖因子， １０pg/mlのグルカゴン，１００nMのハイドロコーチゾン，ならびに０．３％ウ シ血清アルブミン］１．５〜２．０mlを，６．５nMのＩＧＦ−Ｉを加えてまたは 加えないで補充した．培地の一部を様々な時間間隔にて採取し，National Hormo ne and Pituitary Program，National Institute of Diabetes and Digestive a nd Kidney Diseases（Bethesda，MD）により供給された放射標識ラット成長ホル モンおよび抗−ラット成長ホルモン抗体を用いてラット成長ホルモンを検定した ．成長ホルモン分泌の％抑制は次式で計算される． 式中，ＧＨは成長ホルモン，ＵＣは非処置細胞，ＴＣは処置細胞である． ＩＧＦ−Ｉ処置１８時間後に，非トランスフェクト細胞では成長ホルモンは２ ０％抑制されたに過ぎなかったが，ＷＴトランスフェクタントでは既に成長ホル モン分泌は５８％の抑制を示した．⁹⁴⁰Ａｌａおよび⁹⁵⁷Ａｌａ点突然変異はいず れも，ＷＴトランスフェクタントに認められたのと同じＩＧＦ−Ｉによる成長ホ ルモンの高い抑制を示した．⁹⁴³Ａｌａ点突然変異は，ＷＴと非トランスフェク ト細胞におけるＩＧＦ−Ｉ作用の中間の抑制効果を示した．残基９５０または１ ００３におけるアミノ酸置換を有するトランスフェクタントはＩＧＦ−Ｉに対し て非トランスフェクト細胞の場合と同様に応答した．⁹⁵²ＳＴＯＰは成長ホルモ ンの分泌を抑制しなかった． ３６時間までに，非トランスフェクト細胞は成長ホルモンを４０％抑制し，Ｗ Ｔトランスフェクタントは成長ホルモンの６０％抑制を示した．しかし，⁹⁵²Ｓ ＴＯＰ細胞は依然としてＩＧＦ−Ｉリガンドに応答せず，これらの細胞における 成長ホルモンの分泌は実際，内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体の存在にもかかわらず，ト ランスフェクトされていない対照細胞の場合より高かった．すなわち，⁹⁵²ＳＴ ＯＰトランスフェクタントは内因性ラットＩＧＦ−Ｉ受容体の存在にもかかわら ず，成長ホルモンへの生物学的シグナリングを完全に欠くものであった． これらの観察は，ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体の膜近接ドメインに局在する３個のチ ロシン残基のうち，位置９５０のチロシン残基は成長ホルモン遺伝子へのＩＧＦ −Ｉシグナリングに重要であるが，位置９５７におけるチロシンは必要であると は思えないことを示唆している．⁹⁴³ＡｌａでＩＧＦ−Ｉに応答する成長ホルモ ンを抑制する効果が低下することは，９４３におけるチロシンがソマトトロフ核 における成長ホルモン遺伝子へのシグナリングカスケードに関与するタンパク質 の重要なフォールディングおよび／または接触点である可能性を示唆するもので ある．⁹⁵²ＳＴＯＰ ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットは内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体 機能の優性負のインヒビターとして挙動することが明らかである． 例ＸＩ 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体はＩＧＦ−Ｉ誘導細胞増殖を修飾する 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体形成が内因性受容体機能を修飾することをさらに証明す るため，約１×１０⁴のラットＩ線維芽細胞ＷＴおよび⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェ クタントをＳＦＤ培地に２４時間接種してＩＧＦ−Ｉの存在および不存在下にお ける細胞増殖を検討した．ついで培地を補充し，濃度３．２５nMのＩＧＦ−Ｉを 「ＩＧＦ−Ｉ添加」テストウエルに加えた．７２時間インキュベートしたのち， 培地を吸引し，単層を５mlのＰＢＳ（pH７．４）で２回洗浄した． クリスタルバイオレット（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）を室温でメ タノール中０．５％に調製し，その１００μｌを各ウエルに１５分間加えた．ウ エルをついで１mlのＨ₂Ｏ₂で脱色して，風乾した．結晶をついで，０．１Mのク エン酸ナトリウム（pH４．２）および５０％エタノール１００μｌ中に室温で３ ０分間溶解した．プレートをElisaプレートリーダーにより波長５４０nmで読み 取った．以下のように増殖刺激比（％ＧＳＲ）を計算した． 式中，Ａは吸収である．データは模擬トランスフェクト細胞（Ｉ５１Ｎｅｏ） に対して，Ｉ５１Ｎｅｏ値を差し引くことにより補正した． 表１には，対照トランスフェクト細胞の細胞増殖に対する百分率として測定し たＷＴおよび⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントのＩＧＦ−Ｉの存在下および不 存在下における増殖刺激比を示す． ＩＧＦ−Ｉリガンドの不存在下および存在下のいずれにおいても，ＷＴトラン スフェクタントは⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントより速やかに（ｐ＜０．０ ０５）増殖した．⁹⁵²トランスフェクタントはＩＧＦ−Ｉに応答しなかった． 例ＸII 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体はＩＧＦ−Ｉ誘導ＤＮＡ合成を修飾する 例ＸIIで確認された変異ＩＧＦ−Ｉ受容体トランスフェクタントの鈍い増殖応 答は，ＩＧＦ−Ｉ処置後の［³Ｈ］チミジンの取り込みによるＤＮＡ合成を測定 することによって確認された． 約１×１０⁴ラットＩ線維芽細胞，ＷＴまたは⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタン トをＳＦＤ培地中で２４時間増殖させた．ついで培地を補充し，「ＩＧＦ−Ｉ添 加」テストウエルには濃度３．２５nMのＩＧＦ−Ｉを２ml加えた．４８時間イン キュベートしたのち［³Ｈ］チミジン（１μCi）（ICN Biochemicals,Costa Mesa ,CA）を培地に加え，細胞を３７℃で５時間インキュベートした．ついで培地を 吸引し，各ウエルに１００μｌの冷トリカルボン酸（１０％）を加え４℃に２０ 分間置いた．ウエルを吸引したのち１０％トリカルボン酸で２回洗浄した．次に 各ウエルに１Ｎ水酸化ナトリウム１００μｌを添加し，プレートを振盪器上室温 で１５〜３０分間インキュベートした．可溶化後，各ウエルから液体シンチレー ションカウンターでのカウントのために９０μｌを採取した．結果は対照のトラ ンスフェクトしたＩ５１Ｎｅｏ細胞の値を差し引いて補正した．表２に示した値 は６回の測定値の平均である． ＷＴトランスフェクタントへの［³Ｈ］チミジンの取り込みはＩＧＦ−Ｉの存 在下には２倍以上であった．しかしながら，ＩＧＦ−Ｉは⁹⁵²ＳＴＯＰトランス フェクタントではＤＮＡの合成を刺激しなかった．さらに，⁹⁵²ＳＴＯＰトラン スフェクタントの絶対増殖率はＷＴまたは非トランスフェクトラットＩ線維芽細 胞の場合より著しく低かった．これらの結果は，ＩＧＦ−ＩがラットＩ線維芽細 胞の無傷な内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体を介して作動する正の増殖レギュレーターで あること，また変異ＩＧＦ−Ｉ受容体ｃＤＮＡの過剰発現はこの正の調節増殖調 節を修飾するために使用できることを示している． 例ＸIII 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体は細胞の形態を変化させコロニー形成を阻害する 約１×１０⁵の非トランスフェクトラットＩ線維芽細胞，ＷＴトランスフェク タントまたは⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントをＳＦＤ培地中それぞれプレー ト上に置いた．テストプレートには濃度５０nMのＩＧＦ−Ｉまたは６５０nMのイ ンスリンを加えて，全プレートを４８時間インキュベートした． ＷＴトランスフェクタントは，ＩＧＦ−Ｉまたはインスリンのいずれかによる 処置後に，細胞の形態に著しい変化を示した．リガンドの不存在下に増殖したト ランスフェクタントは，トランスフェクトしていないラットＩ線維芽細胞および⁹⁵² ＳＴＯＰトランスフェクタントの場合と同じ正常な表現型の外観を呈した． しかしながら，ＩＧＦ−Ｉまたはインスリンの存在下には，ＷＴトランスフェク タントは集合し，プレートに弱く接着した．トランスフェクトしていないラット Ｉ線維芽細胞および⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントはリガンドの添加後も， 細胞の形態に重大な変化は生じなかった． ＩＧＦ−Ｉにおけるこの形態変化の促進はインスリンの場合より１０倍以上強 力で，ＩＧＦ−Ｉ受容体への結合親和性はインスリンの場合の１０倍を示した． これらの観察は，これらの増殖因子によって誘導される表現型変化が変異ＩＧＦ −Ｉ受容体の存在によって修飾可能なＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現を介して起こ ることを指示している． コロニー形態の変化がトランスフェクタントの増殖表現型におけるより普遍的 な変化を意味するものかどうかを決定するため，軟質アガール中でのそれらの増 殖を解析した．約２×１０³の非トランスフェクトラットＩ線維芽細胞，ＷＴト ランスフェクタント，または⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントを，０．４２ml の０．３％Bacto-Agar,０．８３mlのαＭＥＭ，０．３３mlの１０％ウシ血清ア ルブミン，０．２mlのペニシリンおよびストレプトマイシン合剤を含む０．３％ 軟質アガール３５mm中に，１３nMのＩＧＦ−Ｉの不存在下または存在下の６群を プレート上に置いた．プレートは３７℃において１２日間インキュベートした． ＞４０の細胞を含有するすべてのコロニーを計測した．表３中の数字は６つのウ エル中でカウントされたコロニーの平均数を表す． 非トランスフェクトラットＩ線維芽細胞は，軟質アガール中で増殖したが，そ れらのコロニーサイズはＷＴトランスフェクタントの場合よりはるかに小さかっ た．小さな非トランスフェクトラットＩ線維芽細胞コロニーはＩＧＦ−Ｉに応答 してサイズおよび数が増大したが，依然として，ＩＧＦ−Ｉの不存在下における ＷＴコロニーの場合より数は少なくサイズは小さかった．リガンド処置後，ＷＴ コロニーはサイズおよび数のいずれも増大した．これに反し，⁹⁵²ＳＴＯＰトラ ンスフェクタントは軟質アガール中リガンドの不存在下には増殖せず，リガンド の存在下にも最低の増殖を示したのみであった． すなわち，内因性ラットＩＧＦ−Ｉ受容体は⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタン トの足場依存性増殖を促進することは不可能であった．これは，変異ＩＧＦ−Ｉ サブユニットの発現は，非機能性変異受容体の形成を生じることを示唆するもの である． 例ＸIV 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体はインビボにおいて腫瘍形成を阻害する 変異受容体がインビボで優性負の表現型効果を発揮するかどうかを決定するた め，各群９匹の無胸腺ヌードマウスからなる３群のマウスの右または左側腹部に 約１×１０⁶の非トランスフェクトラットＩ線維芽細胞，ＷＴトランスフェクタ ントまたは⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントを皮下注射した．マウスは８週間 観察したのち屠殺した． ＷＴトランスフェクタントを注射したマウスはすべて，注射から３週以内に， 触知可能な肉眼で見える腫瘍を発症した．非トランスフェクトラットＩ線維芽細 胞を注射したマウスでは９例中６例が５〜６週後にのみ腫瘍を発症した．非トラ ンスフェクトラットＩ線維芽細胞を注射されたマウスの場合の小さく壊死性であ った腫瘍に比較して，でＷＴトランスフェクタントを注射されたマウスには大き な腫瘍が発症した．⁹⁵²ＳＴＯＰトランスフェクタントを注射されたマウスには ８週間の観察期間中，腫瘍は発症しなかった． 屠殺後，ラットＩ線維芽細胞（ラットＩＭＴ）およびＷＴトランスフェクタン ト（ＷＴＭＴＩ−９）から得られた充実性腫瘍をコラーゲナーゼ（０．３５％） およびヒアルロニダーゼ（０．１％）で酵素的に分散させ，Ｇ４１８中インビト ロで培養した．ネイティブならびにエクスビボのラットＩＭＴ細胞はいずれもゲ ンチシンの存在下に増殖しなかった．しかしながら，エクスビボで誘導されたＷ ＴＭＴＩ−９細胞はすべて，６００μl/mlでＧ４１８中インビトロで増殖した． 例IVの記載のように実施したこれらの細胞に対する特異的［¹²⁵Ｉ］-ＩＧＦ− Ｉ の結合から，非トランスフェクトラットＩ線維芽細胞もしくはラットＩＭＴ細胞 （特異的ＩＧＦ−Ｉの結合５％）に比較して，エクスビボＷＴＭＴ１−９細胞で は（特異的ＩＧＦ−Ｉの結合２０〜４１％），ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現が続 くことが明らかにされた． ラットＩＭＴおよびＷＴＭＴ１−９腫瘍に由来する細胞からのＥｃｏＲＩ消化 ＤＮＡについて，例Ｖの記載と同様にして実施したサザンブロット解析により， 変異ＩＧＦ−Ｉ受容体がなおエクスビボ細胞中に組み込まれていることが確認さ れた． ＷＴＭ４およびラットＩＭＴホルマリン固定腫瘍の病理検査から，腫瘍は肉腫 の鑑別に一致するビメンチン免疫反応性を含むことが明らかにされた．これらは ケラチン，Ｓ１００タンパク質，神経細糸，白血球共通抗原，デスミンまたはミ オグロビンを発現せず，したがってカルシノーマ，神経細胞鑑別，リンパ腫また は筋細胞鑑別は除外された． 電子顕微鏡による観察結果は肉腫鑑別に一致した．いずれの腫瘍も線維肉腫で あり，著しく硬くほとんど壊死領域のなかったラットＷＴＭ４腫瘍に比較して， ラットＩＭＴ腫瘍は大きな壊死領域を有しこの腫瘍のより脆い性質と一致した． 以上本発明を現時点で好ましい実施態様について記載したが，本発明の精神か ら逸脱することなく様々な改変が可能であることを理解すべきである． 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：４９７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：両者 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３２．．４１３５ 他の情報：産物＝「増殖因子受容体シグナルペプチド」 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：３２．．１２１ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１２２．．２２３９ 他の情報：産物＝「増殖因子受容体αサブユニット」 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：２２５２．．４１３２ 他の情報：産物＝「増殖因子受容体βサブユニット」 配列 配列番号：２ 配列の長さ：１３６７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：１０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：１１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：１２ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：１３ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 配列番号：１４ 配列の長さ：１５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年５月１９日 【補正内容】 請求の範囲 １．内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体のＩＧＦ−Ｉ受容体機能に比較して修飾された ＩＧＦ−Ｉ受容体機能を有するＩＧＦ−Ｉ受容体のサブユニットをコードし，配 列番号２に掲げたアミノ酸配列をコードする配列を含む組み換えポリ核酸におい て，アミノ酸残基９４３，９５７または１００３の少なくとも１個が内因性ＩＧ Ｆ−Ｉサブユニットの相当する残基と異なる残基で置換されていることを特徴と する上記組み換えポリ核酸。 ２．ＩＧＦ−Ｉ受容体機能はチロシンキナーゼ活性である「請求項１」に記載 の組み換えポリ核酸。 ３．チロシンキナーゼ活性は自己リン酸化である「請求項２」に記載の組み換 えポリ核酸。 ４．チロシンキナーゼ活性は細胞内基質のリン酸化である「請求項２」に記載 の組み換えポリ核酸。 ５．配列はＩＧＦ−Ｉ受容体のβサブユニットをコードする「請求項１」に記 載の組み換えポリ核酸。 ６．配列は更にＩＧＦ−Ｉ受容体のαサブユニットをコードする「請求項５」 に記載の組み換えポリ核酸。 ７．アミノ酸残基９４３はアラニンである「請求項１」に記載の組み換えポリ 核酸。 ８．アミノ酸残基９５０はシステイン，セリン，アラニン，ロイシンまたはス レオニンから選択される「請求項１」に記載の組み換えポリ核酸。 ９．アミノ酸残基９５７はアラニンである「請求項１」に記載の組み換えポリ 核酸。 10．アミノ酸残基１００３はアラニンである「請求項１」に記載の組み換えポ リ核酸。 11．配列番号２に掲げた配列の残基７１１から約９２９と実質的に同一のアミ ノ配列をコードする「請求項１」に記載の組み換えポリ核酸。 12．配列番号１の残基２２５２〜２９０９と実質的に同一の配列を有する「請 求項１」に記載の組み換えポリ核酸。 13．配列番号１のコドン少なくとも１個が欠失しているかまたは内因性ＩＧＦ −Ｉ受容体をコードするポリ核酸の相当する残基と異なるコドンで置換されてい る配列番号１と実質的に同一の配列を含む「請求項１」に記載の組み換えポリ核 酸。 14．ヌクレオチド２９７５〜２９７７は終結コドンである「請求項１４」に記 載の組み換えポリ核酸。 15．ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットはさらに内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニ ットと複合して変異ＩＧＦ−Ｉ受容体を形成するその能力によって特徴づけられ る「請求項１」に記載の組み換えポリ核酸。 16．「請求項１」のポリ核酸を含有するベクター。 17．「請求項１」に記載のポリ核酸を含有する細胞。 18．「請求項１７」に記載のベクターを含有する細胞。 19．「請求項１」のポリ核酸によってコードされる配列を含むポリペプチド。 20．「請求項１」の組み換えポリ核酸によってコードされるＩＧＦ−Ｉ受容体 サブユニット。 21．内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体のＩＧＦ−Ｉ受容体機能に比較して修飾された ＩＧＦ−Ｉ受容体機能を有することによって特徴づけられる「請求項２０」に記 載の変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット。 22．ＩＧＦ−Ｉ受容体機能はチロシンキナーゼ活性である「請求項２１」に記 載の変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット。 23．変異受容体はさらに内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットと複合して変 異ＩＧＦ−Ｉ受容体を形成するその能力を特徴とする「請求項２１」に記載の変 異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット。 24．「請求項２１」の変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットを含むＩＧＦ−Ｉ受 容体。 25．ＩＧＦ−Ｉ受容体誘導リガンド依存性の細胞の腫瘍形成を阻害するための 「請求項２０〜２３」に記載の変異ＩＧＦ−Ｉ受容体の使用。 26．細胞を変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットと，（ａ）変異ＩＧＦ−Ｉ受容 体のサブユニットをコードする組み換えポリ核酸を細胞に導入し，（ｂ）工程（ ａ）の産物を，変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットを発現させるのに適当な条件 下に維持することによって接触させる「請求項２５」に記載の使用。 27．組み換えポリ核酸はｃＤＮＡである「請求項２６」に記載の使用。 28．細胞は哺乳類細胞である「請求項２６」に記載の使用。 29．哺乳類細胞はヒト細胞である「請求項２８」に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体のＩＧＦ−Ｉ受容体機能に比較して修飾された ＩＧＦ−Ｉ受容体機能を特徴とするＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットをコードする 配列からなる組み換えポリ核酸。 ２．ＩＧＦ−Ｉ受容体機能はチロシンキナーゼ活性である「請求項１」に記載 の組み換えポリ核酸。 ３．チロシンキナーゼ活性は自己リン酸化である「請求項２」に記載の組み換 えポリ核酸。 ４．チロシンキナーゼ活性は細胞内器質のリン酸化である「請求項２」に記載 の組み換えポリ核酸。 ５．配列はＩＧＦ−Ｉ受容体のβサブユニットをコードする「請求項１」に記 載の組み換えポリ核酸。 ６．配列は更にＩＧＦ−Ｉ受容体のαサブユニットをコードする「請求項５」 に記載の組み換えポリ核酸。 ７．配列番号２に掲げた配列の残基７１１から約９２９の配列と実質的に同一 のアミノ酸配列をコードする「請求項２」に記載の組み換えポリ核酸。 ８．配列番号２に掲げたアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基 が欠失しているかまたは内因性ＩＧＦ−Ｉサブユニットの相当する残基とは異な る残基で置換されているアミノ酸配列をコードする「請求項１」に記載の組み換 えポリ核酸。 ９．配列番号２に掲げたアミノ酸配列においてアミノ酸残基９４３，９５０， ９５７または１００３の少なくとも１個が内因性ＩＧＦ−Ｉサブユニットの相当 する残基と異なる残基で置換されているアミノ酸配列をコードする「請求項８」 に記載の組み換えポリ核酸。 10．アミノ酸残基９４３はアラニンである「請求項９」に記載の組み換えポリ 核酸。 11．アミノ酸残基９５０はシステイン，セリン，アラニン，ロイシンまたはス レオニンである「請求項９」に記載の組み換えポリ核酸。 12．アミノ酸残基９５７はアラニンである「請求項９」に記載の組み換えポリ 核酸。 13．アミノ酸残基１００３はアラニンである「請求項９」に記載の組み換えポ リ核酸。 14．配列番号１の残基２２５２〜２９０９と実質的に同一の配列を有する「請 求項１」に記載の組み換えポリ核酸。 15．配列番号１のコドン少なくとも１個が欠失しているかまたは内因性ＩＧＦ −Ｉ受容体をコードするポリ核酸の相当する残基と異なるコドンで置換されてい る配列番号１と実質的に同一の配列を含む「請求項１」に記載の組み換えポリ核 酸。 16．ヌクレオチド２９７７〜２９７９は終結コドンである「請求項１５」に記 載の組み換えポリ核酸。 17．ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットはさらに内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニ ットと複合して変異ＩＧＦ−Ｉ受容体を形成するその能力によって特徴づけられ る「請求項１」に記載の組み換えポリ核酸。 18．「請求項１」のポリ核酸を含有するベクター。 19．「請求項１」に記載のポリ核酸を含有する細胞。 20．「請求項１８」に記載のベクターを含有する細胞。 21．「請求項１」のポリ核酸によってコードされる配列を含むポリペプチド。 22．「請求項８」の組み換えポリ核酸によってコードされるＩＧＦ−Ｉ受容体 サブユニット。 23．内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体のＩＧＦ−Ｉ受容体機能に比較して修飾された ＩＧＦ−Ｉ受容体機能を有することを特徴とする変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニ ット。 24．ＩＧＦ−Ｉ受容体機能はチロシンキナーゼ活性である「請求項２３」に記 載の変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニット。 25．変異受容体はさらに内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットと複合して変 異ＩＧＦ−Ｉ受容体を形成するその能力によって特徴づけられる「請求項２３」 に記載の変異いＧＦ−Ｉ受容体サブユニット。 26．「請求項２３」の変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットからなるＩＧＦ−Ｉ 受容体。 27．細胞を変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットと変異ＩＧＦ−Ｉ受容体の形成 に適当な条件下に接触させることからなる内因性ＩＧＦ−Ｉ受容体機能の阻害方 法において，変異受容体は内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体機能に比較して修飾された ＩＧＦ−Ｉ受容体機能によって特徴づけられる上記方法。 28．「請求項２５」の方法において，細胞を，（ａ）変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サ ブユニットをコードする組み換えポリ核酸を細胞中に導入し，（ｂ）工程（ａ） の産物を，変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットを発現させるのに適当な条件下に 維持することによって，変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットと接触させる上記方 法。 29．組み換えポリ核酸はｃＤＮＡである「請求項２８」に記載の方法。 30．細胞は哺乳類細胞である「請求項２８」に記載の方法。 31．哺乳類細胞はヒト細胞である「請求項３０」に記載の方法。 32．内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体機能は増殖因子依存性細胞増殖である「請求項 ２７」に記載の方法。 33．内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体機能はＩＧＦ−Ｉ受容体誘導リガンド依存性の 細胞トランスフォーメーションである「請求項２７」に記載の方法。 34．内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体機能はＩＧＦ−Ｉ受容体誘導リガンド依存性の 細胞の腫瘍形成である「請求項２７」に記載の方法。 35．変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットの作成方法において，（ａ）ＩＧＦ− Ｉ受容体のβサブユニットをコードするポリ核酸を，内因性のＩＧＦ−Ｉ受容体 機能に比較してそのＩＧＦ−Ｉ受容体の機能が修飾されるように突然変異させ， （ｂ）工程（ａ）の産物を，変異ＩＧＦ−Ｉ受容体サブユニットを発現させるの に適当な条件下に維持する上記方法。