JPH08500836A

JPH08500836A - 神経栄養因子および細胞増殖阻害剤による癌の処置

Info

Publication number: JPH08500836A
Application number: JP6507332A
Authority: JP
Inventors: ロプレスティ，パトリジア; ポルハ，ウォジュシエク; ポルハ，ドロタ・ケイ; ロス，アロンゾ・エイチ
Original assignee: ウスター・ファウンデーション・フォー・エクスペリメンタル・バイオロジー
Priority date: 1992-08-27
Filing date: 1993-08-26
Publication date: 1996-01-30
Also published as: ATE167630T1; EP0658117A1; GR3027661T3; WO1994005315A1; ES2117717T3; DE69319346D1; US5387520A; DK0658117T3; CA2141935A1; EP0658117B1; DE69319346T2

Abstract

(57)【要約】神経芽細胞腫を処置するための方法および組成物を開示する。本方法は神経芽細胞腫と神経栄養因子および致死量以下の細胞増殖阻害剤とを約１から１５日間接触させ、次に神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触をさらに１日から１５日間維持することを含む。本組成物はニューロトロピンのような神経栄養因子、神経成長因子およびアフィジコリン、チミジンまたはヒドロキシ尿素のような細胞増殖阻害剤を含む。また、神経芽細胞腫を緩解し、分化を誘導し、または排除する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】神経栄養因子および細胞増殖阻害剤による癌の処置発明の分野本発明の技術分野は腫瘍の化学療法、殊に腫瘍を処置するための新規方法および組成物である。さらに具体的には、この発明は細胞分化因子および細胞増殖阻害剤を用いる神経芽細胞腫の処置に関する。本発明の背景神経系は細胞増殖と分化との間に良く制御された逆相関を示す多能性前駆細胞から誘導される（ＣａｔｔａｎｅｏとＭｃＫａｙ（１９９１年）、ＴＩＮＳ、１４巻：３３８〜３４０頁）。中枢神経系では、これらの前駆細胞は最後の核分裂直後に特定的な分化経路に関与する（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ（１９８８年）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、８巻：９４５〜９７４頁。ＴｕｒｎｅｒとＣｅｐｋｏ（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２８巻：１３１〜１３６頁）。末梢神経系では、感覚ニューロンは細胞周期からの離脱に続いて分化する（ＲｏｈｒｅｒとＴｈｏｅｎｅｎ（１９８７年）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、７巻：３７３９〜３７４８頁）が、交感神経ニューロンはまだ核分裂的に活性である間に神経伝達系を発現しながら、また短い軸索を伸ばしながら分化し始める（ＤｉＣｉｃｃｏ−Ｂｌｏｏｍなど（１９９０年）、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、１１０巻：２０７３〜２０８６頁）。ニューロンの分化と細胞増殖との間の連係の分子的基礎は最近の興味ある問題である。ニューロンの分化と細胞増殖との間の連係は神経芽細胞腫のようなニューロンの腫瘍の病因にも関連する。神経芽細胞腫は乳児期に発生し、副腎および交感神経鎖に一次病変を伴う最も普通の小児科固形腫瘍の一つである（Ｗ．Ｗ．Ｓｕｔｏｗ、Ｄ．Ｊ．ＦｅｒｎｂａｃｋとＴ．Ｊ．Ｖｉｅｔｔｉ編、「臨床小児科腫瘍学」中、Ｖｏｕｔｅ（１９８４年）、「神経芽細胞腫」、５５９〜５８７頁）。さらに、通常の化学療法の態様が乳児の正常な組織には激烈な副作用を持つのでこの腫瘍は処置が困難である。興味深いことには、神経芽細胞腫は突然の後退またはさらに良性の神経節細胞腫への成熟に移行する能力が注目されている（Ｅｖａｎｓなど（１９８０年）、Ｃａｎｃｅｒ、４５巻：８３３〜８３９頁）。神経芽細胞腫細胞と神経芽細胞との類似性およびより良性型に突然成熟する能力は、この病気が交感神経前駆細胞の分化阻害に起因するかもしれないことを示唆する（ＫｎｕｄｓｏｎとＭｅａｄｏｗｓ（１９８０年）、Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３０２巻:１２５４〜１２５６頁）。それ故、増殖しつつある神経芽細胞の分化を促進する因子は新規治療法のための候補である。癌治療の副作用の故に「天然」の、しかも高度に特異的な医薬的処置への待望が大きい。神経成長因子（ＮＧＦ）は２６０００ダルトンのポリペプチド神経栄養因子であって、種々の生物学的反応を媒介する（Ｌｅｖｉ−ＭｏｎｔａｌｃｉｎｉとＡｌｏｅ（１９８７年）、Ｓｃ１ｅｎｃｅ、２３７巻：１１５４〜１１６２頁）。生体内および培養物において、ＮＧＦは交感神経および感覚ニューロンのための生存因子として作用する（Ｊｏｈｎｓｏｎなど（１９８６年）、Ｔｒｅｎｄｓ・Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、９巻：３３〜３７頁）。ＮＧＦは褐色細胞腫細胞系ＰＣＩ２の分化因子でもある（ＧｒｅｅｎｅとＴｉｓｃｈｅｒ（１９７６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３巻：２４２４〜２４２８頁）。細胞分裂についてのＮＧＦの効果は細胞の型に応じて変化する。ＮＧＦに暴露した後にはＰＣ１２細胞は分裂を殆ど停止する（ＧｒｅｅｎｅとＴｉｓｃｈｌｅｒ（１９７６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３巻：２４２４〜２４２８頁）。胎児のクロマフィン細胞は最終的に分化する前にＮＧＦに反応して数回分裂する（ＬｉｌｌｉｅｎとＣｌａｕｄｅ（１９８５年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１７巻：６３２〜６３４頁）。胚芽腺条からのニューロン前駆細胞がＮＧＦに反応して増殖するのは、基本的線維芽細胞成長因子に接触した後のみである（ＣａｔｔａｎｅｏとＭｃＫａｙ（１９９０年）、ＮａｔｕｒｅＮ３４７巻：７６２〜７６５頁）。ＮＧＦ単独のような細胞分化因子の使用は、しかしながら、神経芽細胞腫の効果的な処置のためには不十分であることが証明されている。第一に、神経芽細胞腫細胞系のＮＧＦに対する反応には変動がある（Ａｚａｒなど（１９９０年）、Ｃｅｌｌ・Ｇｒｏｗｔｈ・Ｄｉｆｆ．、１巻：４２１〜４２８頁。Ｃｈｅｎなど（１９９０年）、Ｃｅｌｌ・Ｇｒｏｗｔｈ・Ｄｉｆｆ．、１巻：７９〜８５頁。ＳｏｎｎｅｎｆｅｌｄとＩｓｈｉｉ（１９８２年）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、８巻：３７５〜３９１頁）。Ｎ−ｍｙｃオンコジーンを増強した神経芽細胞腫細胞系はＮＧＦには殆どまたは全く反応しない。単コピーのＮ−ｍｙｃを持つＳＨＳＹ５Ｙおよびその他幾つかの細胞系はＮＧＦに反応して短く枝分かれした軸索を伸長する（Ｃｈｅｎなど（１９９０年）、Ｃｅｌｌ・Ｇｒｏｗｔｈ・Ｄｉｆｆ．、１巻：７９〜８５頁）。しかしながら、ＮＧＦはこれらの細胞の増殖速度を低下せず、その分化は可逆的である。ＮＧＦの除去によって、軸索は収縮する。神経芽細胞腫細胞の究極的な分化不能性はこの疾患における重大な因子であるかもしれない（Ａｚａｒなど（１９９０年）、Ｃｅｌｌ・Ｇｒｏｗｔｈ・Ｄｉｆｆ．、１巻：４２１〜４２８頁）。以下に検討する文献に記載されているように、細胞分裂阻止が単独で繊維の伸長を促進するために十分であるとは思われない。他方、アフィジコリン化合物はヒト細胞系の分化を強化すると報告されている。アフジコリンはカビから単離されたステロイド様分子であって、ＤＮＡポリメラーゼーαおよびーδを可逆的に阻害し、細胞周期をＧ₁／Ｓで阻止する（Ｈｕｂｅｒｍａｎ（１９８１年）、Ｃｅｌｌ、２３巻：６４７〜６４８頁）。ＣｈｏｕとＣｈｅｒｖｅｎｉｃｋ（Ｃｅｌｌ・Ｔｉｓｓｕｅ・Ｋｉｎｅｔ．（１９８５年）、１８巻：３８７〜３９７頁）は低濃度（０．４μＭ）のアフィジコリンがヒト白血病細胞のレチン酸−誘導分化を強化すると報告した。Ｊｅｎｓｅｎ（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９８７年）、１２０巻：５６〜６４頁）はＮＧＦおよびアフィジコリン・パルスで処理したＳＨＳＹ５Ｙ細胞が長い軸索（３００ μｍ以上）を伸長して、不可逆的に分化することを見出した。Ｊｅｎｓｅｎは核分裂後のＳＨＳＹ５Ｙ細胞を選択するために致死的な高濃度（３０μＭ）のアフィジコリンを用いたが、かなりの細胞毒性を認めた。ＮＧＦおよび致死量以下のアフィジコリンとを組合わせてＳＨＳＹ５Ｙ細胞を成長させ、しかもなお有利な結果を提供することは本発明までには検討されていない。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎなど（Ｅｘｐ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９８２年）、１０巻：７７４〜７８１頁）はＤＮＡポリマー化の低速化がＨＬ−６０ヒト白血病前骨髄球で分化を誘導できるかどうかを確認するためＤＮＡ合成阻害剤２種、シトシンアラビノシドとアフィジコリンの効果を観察した。結果はシトシンアラビノシドとアフィジコリンとは双方ともＨＬ−６０細胞での細胞分化を誘導したことを示した。ＤＮＡ合成とそれによる細胞複製との阻害が細胞に分化した表現型になるべき遺伝子情報を発現させたのかもしれない。骨髄芽球白血病細胞では失われている増殖と分化との間の正常な平衡がシトシンアラビノシドまたはアフィジコリンのような薬剤での増殖阻害により部分的に回復したのかもしれない。これ以外の細胞系でこの目標を達するための具体的方法に関する教示は提供されていない。ＳｏｎｎｅｎｆｅｌｄとＩｓｈｉｉ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（１９８２年）、８巻：３７５〜３９１頁）は培養されたヒトの神経芽細胞腫細胞のＮＧＦに対する反応が、他の悪性癌化細胞型で発現される正常な成長レギュレータに対する感受性低下のパターンに合致する様式で変化したかどうかを研究した。多数の細胞系を検討して細胞系間の反応の変動程度を評価した。そこで、ＮＧＦに対する反応の変化はヒトの神経芽細胞腫に関わるのかもしれない。軸索の成長および細胞の成長または増殖の制御が神経芽細胞腫では分離できることが指摘されている。しかし、ＳｏｎｎｅｎｆｅｌｄとＩｓｈｉｉは神経芽細胞腫細胞系のどれかでＮＧＦが成長速度または生存率を低下させることは証明しなかった。ＣｈｏｕとＣｈｅｒｖｅｎｉｃｋ（Ｃｅｌｌ・Ｔｉｓｓｕｅ・Ｋｉｎｅｔｉｃｓ（１９８５年）、１８巻：３８７〜３９７頁）はアフィジコリンを用いるヒトの前骨髄球白血病（ＨＬ−６０）細胞の複製的ＤＮＡ合成とレチン酸（ＲＡ）− 誘導分化との間の関係を評価した。培養物への３日間致死濃度以下のアフィジコリン（０.４μＭ）の添加はＤＮＡ合成を対照培養物中の休止期段階と同様な水準まで抑制した。３日間後に培養物からアフィジコリンを除去するとＤＮＡ合成と細胞増殖は対照培養物の成長段階に観察される水準まで再活性化された。対照培養物およびＲＡ誘導細胞培養物の双方におけるアフィジコリンのＤＮＡ合成に対する阻害効果は類似であると思われる。しかしながら、ＲＡ−誘導細胞培養物では第３日のアフィジコリン除去後にはＤＮＡ合成の再活性化は観察されなかった。ＲＡ存在または不在下のアフィジコリンに接触した後には、細胞は細胞周期のＧ_１および早期Ｓ期に蓄積されることが指摘された。アフィジコリン単独では細胞に分化を誘導しなかった。アフィジコリン存在下のＲＡ−誘導細胞分化速度はアフィジコリン不在下のＲＡ処理培養物のと同様であった。アフィジコリンとＲＡとを組合せて使用すると激しい細胞毒性を起こさず、またＲＡ誘導細胞分化を阻害せずに白血病細胞増殖を効果的に阻害するであろうと示唆された。ＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地中で０．２μＭ−レチン酸および／または０．４μＭ−アフィジコリンとの接触によるＨＬ−６０細胞の生存率を測定した。アフィジコリンが存在する時、これを接種３日後に培地で洗浄して細胞から除去した。細胞数１倍加期間にわたる白血病細胞のアフィジコリンによる処理はＲＡ−誘導細胞分化に影響せずにＤＮＡ複製を抑制することが判明した。著者らはアフィジコリンが神経栄養因子とともに神経栄養因子の分化能を強化するように作用するかもしれないとは示唆していない。Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７年）、８４巻：９０１５〜９０１９頁）はトロンビンの合成ノナペプチド断片がマウスで高度な転移能を持つヒトの黒色腫サブクローン培養物中での細胞の自動性を阻害することを報告した。このノナペプチドでの細胞前処置は成長または分化因子であるα−メラノトロピン、ＮＧＦおよびβ型形質転換成長因子による原形質膜の受容体を介するシグナル形質導入を阻害しなかった。Ｊｅｎｓｅｎ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌ．（１９８７年）、１２０巻：５６〜６４頁）は７Ｓ−ＮＧＦに長期接触後のヒトの神経芽細胞腫細胞系ＳＨＳＹ５Ｙの試験管内分化能を試験した。５週間を越えて７Ｓ−ＮＧＦに接触し、アフィジコリンで選択したＳＨＳＹ５Ｙ細胞は数種の特徴点から判断して成熟ニーロンに酷似していた。処理し、選択したニューロンはＮＧＦの存在下に長期間培養物内に生存した。ヒトの神経芽細胞腫ＳＨＳＹ５Ｙ培養物をマウスの７Ｓ−ＮＧＦに５週間接触させ、続いてアフィジコリンで１週間選択したが、これらの細胞は既に核分裂的に活性ではなかった。アフィジコリンはα−ＤＮＡポリメラーゼの可逆的阻害剤であり、それ故に長期間の接触によって核分裂的に活性の細胞を殺すと指摘された。そこで、Ｊｅｎｓｅｎはアフィジコリンを単に核分裂的に活性な細胞を殺すために用いた。培養処理第２週目の間にアフィジコリン添加が必要なのは、核分裂的に活性な細胞は少数であっても迅速に成長して核分裂的に静止状態の培養物を超えて生育してしまうからである。アフィジコリン選択段階は分化のタイミングにおける外見的変動性および程度の小さな未分化ＳＨＳＹ５Ｙ細胞内に存在する表現型および／または遺伝子的不安定性を補償するためにのみ導入したものであった。アフィジコリンは分化を強化するために添加されたものではない。さらに、Ｊｅｎｓｅｎは本発明が開示するような致死量以下のアフィジコリンが神経芽細胞腫細胞の分化を促進するＮＧＦの能力を強化することを指摘しなかった。代わりに、Ｊｅｎｓｅｎは高度な、致死濃度（３０ｐＭ）を用いて核分裂的に活性な細胞を殺すために用いた。加えるに、アフィジコリンはＮＧＦの不在下には形態学的変化を促進しない。ＪｅｎｓｅｎはアフィジコリンがＨｅＬａ細胞に細胞周期のＧ_１期に蓄積を起こすことを指摘し、またアフィジコリンはＮＧＦと相乗的に作用してＧ₀期への移行を促進するかもしれないことを示唆している。同様な条件下に、レチン酸も分化表現型のある種の側面を促進した。レチン酸−アフィジコリン処置培養物はＮＧＦ処置培養物と同様な形態学的分化を示した。Ｊｅｎｓｅｎは神経芽細胞腫をＮＧＦおよびアフィジコリンの組合せで処理したけれども、使用したアフィジコリンの用量および細胞にアフィジコリンを適用する時点が新規方法とは相違する。さらに、Ｊｅｎｓｅｎはアフィジコリン単独では分化を誘導しないことを指摘している。アフィジコリンはＮＧＦと相乗的にＧ₀への移行を促進するようにＮＧＦと相乗的に作用するかもしれないとの示唆があるけれども、Ｇ_０への移行と分化とは関連はない。その上、Ｊｅｎｓｅｎは致死量以下のアフィジコリンが神経芽細胞腫細胞の分化を促進するＮＧＦの能力を強化するかもしれないことを指摘していない。Ｇｏｒｅｔｚｋｉなど（Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９８７年）、１０２巻：１０３５〜１０４２頁）は姑息的手術のみをする患者に対するより効果的な補助剤化学療法的アプローチを開始するため、ヒトの髄質甲状腺癌（ｈＭＴＣ）細胞の化学療法剤に対する感受性が試験管内で増加するかどうかを研究した。ＮＧＦがｈＭＴＣ細胞への^３Ｈ−チミジンの取込みを用量に従って刺激し、３倍までの細胞における細胞増殖を強化したと報告している。２４時間にわたるＮＧＦとの前インキュベーションはｈＭＴＣ細胞を刺激し、それらをドキソルビシンでの細胞毒性療法に対してさらに感受性にした。細胞、すなわち、ｈＭＴＣおよび他のＡＰＵＤ細胞、の増殖刺激はＮＧＦによるこれらの細胞への化学療法剤の細胞毒性を強化した。それ故、Ｇｏｒｅｔｚｋｉは癌細胞の分化を強化するための静細胞的または細胞毒性化合物とＮＧＦとの組合せとは別の事項を教示していると思われる。ＣａｔｔａｎｅｏとＭｃＫａｙ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０年）、３４７巻：７６２〜７６５頁）はＮＧＦが早期胎芽脳から誘導された細胞の特定培養システム中からのニューロン前駆体の増殖を制御することを報告している。これらの細胞は基本的繊維芽細胞成長因子に暴露された後にのみＮＧＦに反応して増殖した。ＮＧＦを除去すると、増殖細胞はニューロンに分化した。他の成長因子と組合せて、ＮＧＦがニューロエトテリアル細胞の増殖および末端分化を制御すると指摘した。著者はＮＧＦおよびＮＧＦ族の他の構成員がニューロン前駆体の増殖およびこれらの前駆体から誘導されたニューロンの生存／分化を促進するであろうことを示唆している。Ｃｈｅｎなど（Ｃｅｌ１・Ｇｒｏｗｔｈ・ａｎｄ・Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（１９９０年）、１巻：７９〜８５頁）は一連の神経芽細胞腫および感覚上皮癌細胞系をＮＧＦ−誘導軸索伸長およびニューロンマーカーの発現のＮＧＦ −変調について研究した。結果はニューロン形態を持ち、Ｎ−ｍｙｃ増幅を持たない神経芽細胞腫細胞系３種はＮＧＦ２００ｎｇ／ｍＬに反応して軸索を伸長することを示した。著者らはＮＧＦ−誘導分化は特定クラスのニューロン関連腫瘍に限定され、そしてさらに、これらの細胞系における分化は不完全であると結論している。前述した文献とは異なり、本発明においては、ＮＧＦおよびアフィジコリンの投与は致死濃度以下で殆ど毒性を示さずにＳＨＳＹ５Ｙ細胞の効果的な分化を誘導するために使用した。これらの条件下に、神経芽細胞腫細胞は増殖を停止し、代わりに長い軸索を伸長する。これはそのような神経栄養因子と細胞周期阻害剤との予期されなかった、相乗的効果の初めての証明である。この発明は細胞増殖およびニューロン分化の連係を研究するためのモデルシステムならびに神経芽細胞腫および他の腫瘍の新規処置法を提供する。発明の概要現在、静細胞的化合物が癌を処置するために使用されているが、これらの化合物の効果は神経栄養因子のような分化誘導因子との同時処置により予期できなかったほどに強化しうることが発見された。神経芽細胞腫細胞と神経栄養因子および細胞増殖阻害剤との処置では増殖せず、腫瘍表現型に変換しない細胞となる、予期できなかったほどのニューロン分化を誘導する。さらに、長期間ニューロトロフィンで処置した分化細胞は生存のためにはそれに依存性になる。これらの発見は腫瘍の処置のための新規方法および組成物を開発するために行われてきた。さらに具体的には、本発明は神経芽細胞腫を神経栄養因子と致死用量以下の細胞増殖阻害剤とを約１から１５日間接触させ、次に神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を約１から１５日間維持することを含む神経芽細胞腫を処置する方法を提供する。致死用量以下は神経芽細胞腫を同時に神経栄養因子で処置する時に細胞の増殖を予防するに必要なもの全てである。神経栄養因子と増殖阻害剤との接触は好ましくは約３日間から７日間、最も好適には５日間である。神経栄養因子との追加的接触は好ましくは約３日間から５日間、最も好適には４日間である。ここでは、「分化−誘導因子」には単純な状態から複合型を発生する細胞を起こすどのような分子、分子の組合せも含む。例えば、分化−誘導因子は小さい平滑な神経芽細胞腫細胞が伸長し、軸索伸長を起こすであろう。神経栄養因子は細胞分化−誘導因子の一つの型である。用語「神経栄養因子」にはニューロン細胞に分化を誘導し、天然から誘導された分子またはその合成的または組換え的に製造した類似体も含まれる分子を含む。好ましい神経栄養因子は神経成長因子（ＮＧＦ）、脳誘導神経成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロピン−３およびニューロトロピン−４を含む蛋白質の一族であるニューロトロピン類および合成的または組換え的に製造した類似体である。用語「細胞増殖阻害剤」は細胞分裂の頻度を減少し、または停止するどのような分子も含む。これらの阻害剤は既知の分子または合成的または組換え的に製造した同族体を含みうる。好ましい細胞増殖阻害剤には致死用量以下の約０．１μ Ｍから０．５μＭのアフィジコリン、致死用量以下の約０．５から２．０ｍＭのヒドロキシ尿素および致死用量以下の約１．０ｍＭから２．５ｍＭのチミジンを含む。本発明は神経芽細胞腫細胞を除去する方法も提供する。この方法は神経芽細胞腫と神経栄養因子および致死用量以下の細胞増殖阻害剤とを約１日間から１５日間接触させ、神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を約１６日間以上維持し、次に神経芽細胞腫から神経栄養因子を除去することを含む。神経栄養因子と細胞増殖阻害剤との処置に起因して分化することになった神経芽細胞腫はもし分化が起きた後、約１６日以上接触を維持すると神経栄養因子に依存性になる。そこで、神経栄養因子での処置の停止は細胞死を起こす。追加的に、この発明は神経芽細胞腫の緩解を誘導する方法を含む。この方法において、神経芽細胞腫と神経栄養因子および致死用量以下の細胞増殖阻害剤とを約１日間から約１５日間接触する。接触した神経芽細胞腫を次に神経栄養因子とさらに１日間から１５日間処理する。細胞が増殖を停止し、分化すると神経芽細胞腫の緩解が得られる。さらに、本発明は神経芽細胞腫と神経栄養因子および致死用量以下の細胞増殖阻害剤とを約１日間から１５日間接触させ、次に神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を継続させることを含む神経芽細胞腫の分化を誘導する方法も提供する。この方法は医薬検定用に有用な分化したニューロン細胞の培養物を提供する。本発明はさらに神経栄養因子と致死用量以下の細胞増殖阻害剤とを含む神経芽細胞腫の緩解を誘導するための組成物を提供する。図面の簡単な説明この発明の前記および他の目的、その種々の特性、ならびに本発明自体は以下の記載を次の図面と共に読めば、さらに完全に理解されるであろう。図１は培養した神経芽細胞腫細胞のＮＧＦ存在または不在下に種々のアフィジコリン濃度による生存率のグラフ表示である。図２Ａ〜２Ｃはアフィジコリンおよび／またはＮＧＦの存在下に培養した神経芽細胞腫細胞の分化を示す免疫螢光顕微鏡写真である。図２Ａ、ＮＧＦ・０ｎｇ／ｍＬ。図２Ｂ、ＮＧＦ・１００ｎｇ／ｍＬ。図２Ｃ、０．３μＭ−アフィジコリンおよびＮＧＦ・１００ｎｇ／ｍＬ、５日間、次にＮＧＦ、４日間。Ｂａｒ＝２５μｍ。図３Ａ〜３ＣはＮＧＦおよびアフィジコリンの存在下に５日間培養した神経芽細胞腫細胞軸索伸長の時間的経過と次にＮＧＦ単独を示す免疫螢光顕微鏡写真である。図３Ａ、１日。図３Ｂ、４日。図３Ｃ、８日。Ｂａｒ＝２５μｍ。図４Ａ〜４Ｃはアフィジコリンおよび／またはＮＧＦ処理後にＢｒｄＵで標識した培養神経芽細胞腫細胞の核分裂の傾向を示す免疫螢光顕微鏡写真である。図４Ａは対照細胞を示す。図４ＢはＮＧＦで６日間処理した神経芽細胞腫細胞を示す。図４ＣはＮＧＦ−アフィジコリンで６日間および次にＮＧＦ単独で７日間処理した神経芽細胞腫細胞を示す。図５Ａ〜５Ｄはニューロンの細胞骨格蛋白質発現を示す免疫螢光顕微鏡写真である。（図５Ａ）対照ＭＡｂ−Ｐ３×６３Ａｇ８で染色した対照神経芽細胞腫細胞。（図５Ｂ）抗−ＭＡＰ−１Ｂ。（図５Ｃ）ＮＧＦで７日間処理した神経芽細胞腫細胞の抗−ＭＡＰ−ＩＢ染色。（図５Ｄ）ＮＧＦ−アフィジコリンで６日間およびＮＧＦ単独で７日間処理した神経芽細胞腫細胞の抗−ＭＡＰ−ＩＢ染色。Ｂａｒ＝２５μｍ。図６はＭＡＰ−ＩＢ−ｍＲＮＡのノーザンブロットの写真である。第１レーンは対照細胞。第２レーンはＮＧＦで６日間処理した細胞。第３レーンはＮＧＦ− アフィジコリン処理５日間およびＮＧＦ処理７日間。図７はチミジンとヒドロキシ尿素とにより強化された神経芽細胞腫細胞の分化を示す免疫螢光顕微鏡写真である。図７ＡはＮＧＦおよび２ｍＭ−チミジンで５日間、次にＮＧＦ単独で５日間処理した神経芽細胞腫細胞を示す。図７ＢはＮＧＦおよび１．５ｍＭ−ヒドロキシ尿素で６日間、次にＮＧＦ単独で７日間処理した神経芽細胞腫細胞を示す。好適な態様の記載本発明において本発明の本質または範囲を逸脱することなしに修飾を行いうることは当業者は認識するであろう。本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらをここに記載する本発明または具体的操作の範囲を限定するものと理解すべきではない。Ｉ．材料および方法Ａ．細胞培養神経芽細胞腫細胞系ＳＨＳＹ５ＹはＢｉｅｄｌｅｒなど、１９７８年の方法に本質的に従って誘導した。概略的には、１０％ウシ熱不活化胎児血漿、２ｍＭ− グルタミンおよびゲンタマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地に細胞を生育させた。分化研究のためには細胞を３５ｍｍプリマリア皿に塗布した（１．５×１０⁴〜５×１０⁵細胞／皿）。使用したヒトの他の細胞系にはＩＭＲ３２（Ａｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・Ｃｏｌ１ｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、ＭＤ（ＣＣＬ１２７）から入手）およびＬＡＮ５（Ｒｏｂｅｒｔ・Ｓｅeｇｅｒ博士、チルドレン病院、ロサンゼルス、ＣＡから入手）、増強Ｎ−ｍｙｃオンコジーンを含む神経芽細胞腫細胞系およびＳＨＳＹ５Ｙと同様にＮ−ｍｙｃの単一コピーを含むＧＩＣＡＮ系（Ｐａｏｌｏ・Ｃｏｒｎａｇｌｉａ−Ｆｅｒｒａｒｉｓ博士、Ｇｉａｎｎｉｎａ・Ｇａｓｌｉｎ研究所、ジェノア、イタリーから入手）を含む。Ｂ．分化因子および細胞増殖阻害剤使用した分化因子はニューロトロフィン族からのものを含み（Ｓｙｎｄｅｒによる綜説（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５０巻：１９５頁）、ＮＧＦ、脳− 誘導ＮＧＦ（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３およびニューロトロフィン− ４を含む。勿論、他のニューロトロフィンおよびさらに広範囲には他の分化因子も同様に使用しうる。使用した細胞増殖阻害剤にはアフィジコリン、ヒドロキシ尿素およびチミジンを含む。一例では、ＮＧＦ１００〜２００ｎｇ／ｍＬ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ・ｆｏｒ・Ｓｃｉｅｎｃｅからの２．５Ｓ）および／または種々の濃度のアフィジコリン、チミジンまたはヒドロキシ尿素（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ・Ｃｏ．）を２日毎に培養物に添加した。Ｃ．抗体以下の抗体を使用した。フルオレッセイン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ）複合−抗−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）抗体。マウス抗−微小管−会合蛋白質（ＭＡＰ）・ＩＡ・モノクロナール抗体（ＭＡｂ）ＭＡＰＩＡ −１およびＭＡＰＩＡ−２（Ｂｌｏｏｍなど（１９８４年）、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、９８巻：３２０〜３３０頁）。抗−ＭＡＰ・ＩＢ・ＭＡｂｓ・ＭＡＰ・１Ｂ−２およびＭＡＰ・ＩＢ−４（Ｂｌｏｏｍなど（１９８５年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：５４０４〜５４０８頁；Ｌｕｃａなど（１９８６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻：１００６〜１０１０頁）。抗−ＭＡＰ・２・ＭＡｂs・ＭＡＰ・２−１、ＭＡＰ・２−２、ＭＡＰ・２−３、ＭＡＰ・２−４はウースター・ファウンデーションのＲ．Ｂ．Ｖａｌｌｅｅ博士から恵与（Ｄｉｎｇｕｓなど（１９９１年）、Ｊ．Ｂiｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻、１８８５４〜１８８６０頁）。マウス・抗−タウ・ＭＡｂ・タウ−１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。マウス・抗−シナプシン・Ｉａ／ｂ・ＭＡｂ・Ｍ３１はマサチューセッツ大学医学部のＬ．Ｊ．ＤｅＧｅｎｎａｒｏ博士から恵与。抗−シナプシン・ＩＩａ／ｂ・ＭＡｂ・１９．３１はロックフェラー大学のＡ．Ｊ．Ｃｚｅｒｎｉｃ博士から恵与（Ｍａｎｄｅｌｌなど（１９９０年）、Ｎｅｕｒｏｎ、５巻：１９〜５３頁）。抗−シナプトフィシン・ＭＡｂ・ＳＹ・３８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。抗−ＳＶ２・ＭＡｂはＫ．Ｍ．Ｂｕｃｋｌｅｙ博士（Ｈａｒｖａｒｄ・Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｓｃｈｏｏｌ）から（ＢｕｃｋｅｙとＫｅｌｌｙ（１９８５年）、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、１００巻：１２８４〜１２９４頁）。イソチオシアン酸フルオレッセイン標識ヤギ抗−マウスＩｇＧはＦｉｓｈｅｒ・Ｂｉｏｔｅｃｈから、イソチオシアン酸フルオレッセイン標識ヤギ抗−ヒツジＩｇＧはＳｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ・Ｃｏ．からであった。Ｄ．免疫螢光顕微鏡術ＳＨＳＹ５Ｙ細胞によるＤＮＡ合成はＨａｌｌとＬａｎｄｉｓ（Ｎｅｕｒｏｎ（１９９１年）、６巻：７４１〜７４２頁）に従ってＢｒｄＵ取込みの免疫螢光検出により解析した。プリマリア培養皿上に生育した細胞を１０μｇ／ｍＬのＢｒｄＵと共に１７〜２４時間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、１０分間メタノール−５％酢酸（−２０℃）中で固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡを２Ｎ−ＨＣｌで２０分間変性し、細胞をＰＢＳで洗浄した。抗体の必要容量を減少するため、皿の中心にカバーグラス大の円を残して培養皿に爪磨液を塗布した。細胞を１００μＬの抗−ＢｒｄＵ螢光化抗体（２０ｐｇ／ｍＬ）と０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で１．５時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、皿の塗布しない部分をカバーグラスで覆い、細胞をＺｅｉｓｓ・Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡で２５×ネオフルオル対物レンズを用いて検査した。映像をコダックＴＭＡＸ４００フィルムに撮影した。ＭＡＰ免疫細胞化学のために、細胞を燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い、エタノール−５％酢酸（−２０℃）中で１０分間固定し、抗−ＭＡＰ腹水（１：２００）で３０分間インキュベーションした。タウ免疫細胞化学のためには、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。細胞をＰＢＳで洗い、１００％エタノール（−２０℃）で透過性を向上し、１％ＢＳＡと５分間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄した。細胞をＭＡｂ・タウ−Ｉ（５μｇ／ｍＬ）と３０分間インキュベーションした。シナプシン免疫細胞化学のためには、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。固定化後、細胞を０．１％ＢＳＡとインキュベーションし、次に抗−シナプシンＩａ／ｂ−Ｍ３１腹水（１：５００）または抗−シナプシン１１ａ／ｂ−１９．３１腹水（１：１００）と３０分間インキュベーションした。ＳＶ２免疫細胞化学のためには、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。細胞を１００％エタノール（−２０℃）で透過性を上げ、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５分間閉鎖し、抗−ＳＶ２腹水（０．１％ＢＳＡおよび０．０７５％サポニンで１：５０希釈）と１時間インキュベーションした。シナプトフィシン免疫化学のためには、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、１００％エタノール（−２０℃）で透過性を上げ、０．１％ＢＳＡとインキュベーションし、２μｇ／ｍＬのＳＹ３８−ＭＡｂとインキュベーションした。種々の一次抗体の標識後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、対応する二次抗体とインキュベーションした。ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗−マウスＩｇＧを用いて１：１００ＰＢＳ希釈し、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗ヒツジＩｇＧを用いて１：５０希釈した。ＰＢＳで洗浄後、標本をシティフルオル・グリセロールに装着した。Ｅ．ＲＮＡ分離およびノーザンブロット全ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７年）、１６２巻：１５６〜１５９頁）の単一段階法により分離した。得られたＲＮＡ（１０μｇ／レーン）を１．０％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上の電気泳動により分離し、デュラロース膜（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に移し、紫外線照射で固定化した。この膜をＭＡＰ−ＩＢのためにはｐ１ＢＨＣ −１の^３２Ｐ−ｄＣＴＰ−ランダムプライマー−標識−１．１ｋｂ−Ｓａｃ−Ｉ −Ｅｃｏ−ＲＩ断片（Ｈａｍｍａｒｂａｃｋなど（１９９１年）、Ｎｅｕｒｏｎ、７巻：１２９〜１３９頁）、ＭＡＰ２には０．５ｋｂ−ｐＪＳＮ−１プローブ（Ｄｉｎｇｕｓなど（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：１８８５４〜１８８６０頁）、タウのためには０．４ｋｂ−ｐＫＫ２３３−２プローブ（Ｌｅｅなど（１９８９年）、Ｎｅｕｒｏｎ、２巻１６１５〜１６２４頁）、シナプシンＩのためには１．７ｋｂ−ｐ５Ｅ２プローブ（ＫｉｌｉｍａｎｎとＤｅＧｅｎｎａｒｏ（１９８５年）、ＥＭＢＯ・Ｊ．、４巻：１９９７〜２００２頁）、とハイブリド化した。ブロットを室温で２．０ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄し、続いて６２℃で２．０ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄、６２℃で０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。ブロットをコダックＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で撮影し、β−アクチンのためには２．０ｋｂの相補ＤＮＡプローブと再ハイブリド化（Ｇｕｎｎｉｎｇなど（１９８３年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、３巻：７８７〜７９５頁）した。ＬＫＢ−Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ・ＸＬ・レーザ濃度計を用いてオートラジオグラムの走査濃度測定を行った。結果Ａ．ＳＨＳＹ５Ｙ細胞の分化ＳＨＳＹ５Ｙ細胞をニューロン分化を強化するプリマリア−処理プラスチックに塗布し、種々のアフィジコリン濃度（０．１〜３．０μＭ）でＮＧＦの不在または存在下に検査した。細胞を収穫し、トリパン・ブルーで染色し、処理４日後に計数した。独立した３回の実験を表１に集約する。ＳＨＳＹ５Ｙ細胞の０．３ μＭ−アフィジコリンによる処理は細胞増殖を停止したが、細胞死は殆どなく、生存率は９０％を超えた。アフィジコリン濃度がさらに高い（１．０〜３．０μ Ｍ）とＮＧＦ存在および不在下ともかなりの細胞死が観察された。５日後にアフィジコリンを培地から除去し、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞をＮＧＦ単独で処理した。結果を表１に示す。次の週に、ＮＧＦと０．１〜３．０μＭ−アフィジコリンであらかじめ処理した細胞についてニューロン分化を観察した。ＮＧＦ単独では軸索形成を誘導するが（図２Ｂ）、アフィジコリン−ＮＧＦ−処理細胞（図２Ｃ）で示されるものと比較して、できる軸索は短く、枝分かれが多い。また、ＮＧＦ−アフィジコリン処理ではより円型の細胞体になる。細胞死が最も少ない最適分化（軸索伸長）は０．３μＭ−アフィジコリン（図２Ｃ）で観察された。それ故、それ以後の全ての実験では、このアフィジコリン濃度（０．３μＭ）を用いた。ＮＧＦ−アフィジコリン−処理により誘導される軸索伸長について細胞濃度の影響は認められなかった。同様な結果は皿当り１．５×１０^４から５×１０^５細胞を塗布することによって得られた。軸索伸長はアフィジコリン単独で処理した細胞については観察されなかった。明確な軸索伸長はアフィジコリンと上皮成長因子または基本繊維芽細胞成長因子とで処理した細胞については観察されなかった。また、アフィジコリン単独で処理し、次にＮＧＦで処理した神経芽細胞腫細胞は、ＮＧＦのみで処理した細胞とは区別できなかった。それ故、神経芽細胞腫細胞はＮＧＦとアフィジコリンとで同時に処理して最適な軸索伸長を誘導しなければならなかった。分化の時間−経過はＮＧＦ−アフィジコリン処理が分化への関与を誘導することを示唆する。５日間ＮＧＦ−アフィジコリンで、次に１日間ＮＧＦで処理した神経芽細胞腫細胞の６％のみが長い軸索を示した（図３Ａ参照）。ＮＧＦ処理４日後、細胞の６０〜７０％で形態が変化した（図３Ｂ）。細胞体はさらに丸く、細胞は時には長さ４００μｍ以上の軸索を伸長した。ＮＧＦ処理８日後に分化した細胞体の集合が観察された（図３Ｃ）。もしＮＧＦ中に維持すると、長い軸索を持つ細胞は最低１ケ月間は安定であった。ＮＧＦの除去により、４〜５日以内に軸索の収縮および広範な細胞死が現れた。これは非処理細胞がＮＧＦに依存性を持たないことと比べて顕著な対照である。そこで、ＮＧＦ依存性のある分化した細胞はＮＧＦ処理の停止により除去できる。長い軸索を持つ細胞はＢｒｄＵの取込みから判断すると核分裂しなかった。ＳＨＳＹ５Ｙ細胞をＢｒｄＵで１８時間標識し、前段の方法の部に記載したようにして免疫螢光顕微鏡で分析した。結果を図４に示す。対照細胞はＢｒｄＵで強く標識されたが、ＮＧＦ単独での処理は細胞増殖を明瞭には遅延しなかった（図４Ｂ、表１）。対照的に、アフィジコリンおよびＮＧＦ、続いてＮＧＦで７日間処理したＳＨＳＹ５Ｙ細胞は僅かしか標識されなかった（図４Ｃ）。この僅かなＢｒｄＵ−陽性細胞は長い軸索を示さず、その代わりに元のＳＨＳＹ５Ｙ細胞に類似していた。これらの細胞は実験終了後３〜４週間培養物によく生育した。ＮＧＦ−アフィジコリンによる核分裂細胞の２回目の処理では親の細胞に見られるものと区別のつかない分化した培養物が出現した。そこで、ＮＧＦ−アフィジコリン処理後にできた僅かな核分裂細胞はアフィジコリンに抵抗性ではなく、多分、ＮＧＦ−アフィジコリン処理の不完全な効果に因って起きたものである。Ｂ．ＳＨＳＹ５Ｙ細胞によるニューロン・マーカーの発現軸索伸長および細胞増殖の制御における重要性の故に、対照、ＮＧＦ−処理、およびＮＧＦ−アフィジコリン一処理ＳＨＳＹ５Ｙ細胞におけるニューロン細胞骨格蛋白質の発現を分析した。結果を表２に示す。ＭＡＰ−ＩＡの発現は全３培養条件下で強く、ニューロン分化に明瞭な増加はなかった。図５Ｄに示すようにＭＡＰ−ＩＢの免疫染色はＮＧＦ−アフィジコリン−処理細胞では大きく強化された。ＭＡＰ−ＩＢは細胞体および長い軸索全てに検出された（図５Ｄ）。図６はＭＡＰ−ＩＢ・ｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。全ＲＮＡをＳＨＳＹ５Ｙ細胞から抽出し、アガロースゲル電気泳動で分離し、膜に写し、ＭＡＰ− １Ｂプローブでハイブリド化した。リボソームＲＮＡとマーカーＲＮＡの位置によれば、ＭＡＰ−ＩＢ・ｍＲＮＡは約９．０ｋｂである。ブロットを低イオン強度緩衝液にストリップし、β−アクチンのためのプローブで再ハイブリダイズした。ＭＡＰ−ＩＢのためのｍＲＮＡをＮＧＦとアフィジコリンで５日間および７日間ＮＧＦ処理した細胞内で３倍にアンレギュレートした（図６、レーン３）。転写前に臭化エチジウム染色したＲＮＡならびにフィルターと６−アクチンプローブとの再ハイブリダイズ化はＲＮＡは無傷であり、ＭＡＰ−ＩＢ・ｍＲＮＡ水準の差は不均等負荷が原因ではないことを確認した。ＳＨＳＹ５Ｙ細胞のアフィジコリン単独での処理はＭＡＰ−１Ｂ・ｍＲＮＡまたは蛋白質を活性向上しなかった。分化した細胞におけるＭＡＰ−１Ｂ・ｍＲＮＡの活性向上および抗−ＭＡＰ−１Ｂ抗体による全軸索の強い染色は、ＭＡＰ−１ＢがＳＨＳＹ５Ｙ細胞による軸索伸長に重要な役割を果たしていることを示唆する。ノーザンブロットにより、ＭＡＰ−２・ｍＲＮＡは９．０ｋｂに弱いバンドとして検出された（表２）。しかしながらＭＡＰ２を検出するＭＡｂ４個のセットを用いると免疫螢光顕微鏡術では蛋白質は検出されなかった。対照および分化ＳＨＳＹ５Ｙ細胞の核仁にはタウ抗原が検出された（表２）。タウの核小体染色が他の神経芽細胞腫細胞系で報告されているが、この特定のＭＡｂとタウ−関連蛋白質との交差反応性に基づくものであろう。ＮＧＦ−アフィジコリン−処理細胞でいくらかの細胞（３０〜３５％）では細胞体と軸索の染色が観察されたが、タウ−ｍＲＮＡの活性向上は検出されなかった。シナプス小胞に関連する抗原の発現も分析した。シナプシス小胞のＣａ⁺⁺受容体であると推定され、神経芽細胞腫の臨床的マーカーでもあるシナプトフィシンはＳＨＳＹ５Ｙ細胞に検出された（表２）。免疫螢光染色はＮＧＦ−アフィジコリンで分化を誘導した細胞で細胞の約１０〜１５％が陽性として強化された。機能が未知のシナプシス小胞蛋白質であるＳＶ２では対照およびＮＧＦ−処理ＳＨＳＹ５Ｙ細胞では検出されなかった。ＮＧＦ−アフィジコリン−処理細胞の低率（５〜１０％）が細胞質および軸索の染色に陽性であった。シナプス形成を制御し、シナプス小胞用に細胞骨格構造を提供するシナプシンＩａ／ｂおよびＩＩａ／ｂは検出されなかった（表２）。陽性対照として、ＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞を同一条件を用いて分析し、ＳＶ２およびシナプシンＩａ／ｂの強い免疫染色が検出された。そこで、軸索マーカーの強い発現がある条件下では数種の限界的シナプス抗原の発現は不均質であるか検出できない。Ｃ．細胞増殖に関する他の阻害剤の効果ＳＨＳＹ５Ｙ分化に関する他の細胞増殖阻害剤の効果をチミジンまたはヒドロキシ尿素をアフィジコリンの代わりにＮＧＦと組合せて用いてテストした。ＮＧＦとチミジンへのＳＨＳＹ５Ｙ細胞の反応はＮＧＦとアフィジコリンについて記載されたものとは僅かに高率の細胞がＢｒｄＵで標識される点を除いて同様であった（図７Ａ、表１）。ＮＧＦとヒドロキシ尿素とに対するＳＨＳＹ５Ｙ細胞の反応はＮＧＦとアフィジコリンとに対するものとは反応がより速い点を除いて同様であった（図７Ｂ、表１）。ＮＧＦとヒドロキシ尿素とで４日間処理した細胞では軸索は明瞭であった（図３）のと対照的にＮＧＦとアフィジコリン−処理細胞ではアフィジコリン除去後数日間経過するまで軸索が明瞭にならなかった。チミジンもヒドロキシ尿素も単独では軸索伸長を誘導しなかった。どちらの場合も同様な形態学の順序が観察された。細胞は初めに軸索を伸長した（ＮＧＦとチミジンとで処理した細胞での初期の分化を示す図７Ａ参照）、次に後刻に、細胞体がより丸くなり、クラスターを形成した（ＮＧＦとヒドロキシ尿素−処理細胞での後段階を示す図７Ｂ参照）。細胞周期をＭ相で阻害するノコダゾールとコルセミドもテストした。ＳＨＳＹ５Ｙ細胞をこれらの薬剤で処理するといくらかの生存細胞は長い軸索を示すが、かなりの細胞毒性が出現した。この研究の結果は基本的に、細胞増殖を阻害し、細胞分化を誘導する薬剤はＳＨＳＹ５Ｙ細胞が非癌段階に分化するように誘導するように相乗的に作用することである。アフィジコリン、ヒドロキシ尿素およびチミジンは化学的には関連がないが、これらの薬剤は細胞周期の阻害により、また非特定的副作用によらずに作用すると思われる。この系は細胞増殖とニューロン分化との連係のためのモデルを提供するかもしれない。以前の研究では、ＳＨＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞をＮＧＦとアフィジコリン３０μＭとで処理し、次にＮＧＦ単独で処理した（Ｊｅｎｓｅｎ（１９８７年）、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１２０巻：５６〜６４頁）。得られたＳＨＳＹ５Ｙ細胞は高度に分化しており、ポストミトティックであり、また生存のためにはＮＧＦに依存性であった。しかしながら、広範な細胞死（＞６０％）があり、低率の細胞のみが最終的分化に至った。本発明にあっては、分化の効果がアフィジコリンの致死濃度以下（０．３μＭ）を使用することによって増加した。そこで、細胞増殖阻害剤の致死用量以下を用いることによって、本発明の方法は多数の健康な、分化した細胞を提供するものである。得られた細胞は次の基準によって判断すると究極的に分化しているように思われる：（１）細胞がニューロン分化マーカーを発現し、高度に分化した形態を示す。（２）ＢｒｄＵ標識によって判断すると、細胞は核分裂性ではない。（３）非処理またはＮＧＦ−処理ＳＨＳＹ５Ｙ細胞とは異なり、ＮＧＦ−アフィジコリン−処理細胞は生存のためにＮＧＦを要求する。最後の基準についての警告は分化ＳＨＳＹ５Ｙ細胞はＮＧＦを除くと交感神経ニューロン（１〜２日間）より死滅が遅い（４〜５日間）ことである（Ｍａｒｔｉｎなど（１９８８年）、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、１０６巻：８２９〜８４４頁）。しかしながら、分化細胞のＮＧＦに対する依存性は分化した神経芽細胞腫細胞の除去が望ましいときには神経芽細胞腫処置法として役立てることができる。ＰＣ１２細胞ではＮＧＦ単独で細胞増殖を止めるけれども、いくつかの考えられる理由から細胞増殖を止めるのにアフィジコリンが必要である（ＧｒｅｅｎｅとＴｉｓｃｈｌｅｒ（１９７６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３巻：２４２４〜２４２８頁）。一つの可能性はオンコジーン形質転換の間に細胞増殖の正常な制御が喪失したことである。例えば、ＳＶ４０のＴ− 抗原で形質転換した網膜細胞はニューロンマーカーを発現し、成熟網膜ニューロンに類似であるが、まだ核分裂的に活性である（Ｈａｍｍａｎｇなど（１９９０年）、Ｎｅｕｒｏｎ、４巻：７７５〜７８２頁）。第二の可能性は神経芽細胞腫が誘導された親の神経芽細胞前駆細胞の増殖はＮＧＦに対して感受性がないことである。事実、ＮＧＦはラット細胞のアミノ酸代謝を制御しないが、ニワトリとマウスの交感神経芽細胞前駆細胞の増殖はＮＧＦには影響されないと報告されている（Ｅｒｎｓｂｅｒｇｅｒなど（１９８９年）、ＮｅｕｒｏｎＮ２巻：１２７５〜１２８４頁。ＤｉＣｉｃｃｏ−Ｂｌｏｏｍなど（１９９０年）、Ｊ．Ｃｅｌ１・Ｂｌｏｌ、１１０巻２０７３〜２０８６頁）。ＤｉｎｓｍｏｒｅとＳｏｌｏｍｏｎ（Ｃｅｌｌ（１９９１年）、６４巻：８１７〜８２６頁）は分化と細胞増殖とがＭＡＰを通して連係すると提唱している。殊に、レチン酸−処理胎芽癌細胞の細胞増殖の停止のためにはＭＡＰ−２の発現が必要であることをかれらは発見した。ＮＧＦ−アフィジコリンでの処理後、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞はＭＡＰ−１ＡおよびＭＡＰ−１Ｂおよびタウを含むがＭＡＰ− ２を欠いている、長く、比較的に枝分かれしない軸索を樹立する。ＭＡＰ−２は樹状突起マーカーであり、樹状突起に特徴的な形態を持つ広い軸索が観察されなかったので、ＭＡＰ−２の不在が軸索の軸索的特性に反映するかもしれない。以前の研究はＭＡＰ−１Ａ、ＭＡＰ−１Ｂ、ＭＡＰ−２およびタウが軸索伸長および維持に役割を果たしている（Ｖａｌｌｅｅ（１９９０年）に綜説）ことを示唆している。分化したＳＨＳＹ５Ｙ細胞におけるＭＡＰ−１Ｂ・ｍＲＮＡの活性向上およびＮＧＦ−アフィジコリン−処理細胞における軸索の強い免疫染色はこの系ではＭＡＰ−１Ｂが軸索伸長のために殊に重要であろうことを示唆する。シナプスマーカーの発現も分析して、シナプトフィシンおよびＳＶ２の弱い発現を検出した。シナプス形成のために必須と考えられているシナプシンＩａ／ｂおよびＩＩａ／ｂの発現は発見されなかった。Ｔｈｉｅｌなど（１９９１年）は以前にＳＨＳＹ５Ｙを含む増殖神経細胞系はシナプシンＩａ／ｂまたはＩＩａ／ｂを殆どまたは全く発現しないと報告した。シナプシンＩａ／ｂが殆どのＣＮＳおよびＰＮＳニューロンで発現されるので、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞が不適当な型のニューロンに分化しつつあるからそれを発現しないのであるとは思われない。シナプシンの欠損はヒトの神経芽細胞腫細胞系のシナプシス小胞における一般的な欠陥を反映しているのかもしれない。神経芽細胞腫細胞はナトリウム−依存性の、再アップテーク蛋白質を通して培地からカテコールアミンを取込むが、これらの細胞はカテコールアミンを濃縮し、貯蔵することのできる小胞を持たない。これらの結果は軸索およびシナプスマーカーの制御機構が異なることおよび神経の腫瘍がシナプシンの発現には必要であるが、ＭＡＰ−１Ｂのような軸索マーカーの発現には必要でない因子を持っていないかもしれないことを示唆する。これらの研究が示唆するモデルはニューロンの分化が細胞増殖の停止および適当な神経栄養因子の存在の同時的シグナル２つによって触発されるものである。前記のように本発明の具体的な態様を説明の目的でここに記載したが、本発明の本質または範囲から逸脱することなしに種々の修飾をなしうることは認識されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ポルハ，ウォジュシエクアメリカ合衆国01545マサチューセッツ、シュロウズバリー、サウンダース・ドライブ16番 (72)発明者ポルハ，ドロタ・ケイアメリカ合衆国01545マサチューセッツ、シュロウズバリー、サウンダース・ドライブ16番 (72)発明者ロス，アロンゾ・エイチアメリカ合衆国01545マサチューセッツ、シュロウズバリー、ナンバー48、サウス・ストリート237番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）神経栄養因子および致死用量以下の細胞増殖阻害剤を神経芽細胞腫に約１日から１５日間接触させること、および（ｂ）神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を約１日から１５日間維持することからなる神経芽細胞腫の処置法。２．神経芽細胞腫をニューロトロピンである神経栄養因子と接触させる請求項１に記載の神経芽細胞腫の処置法。３．神経芽細胞腫を、神経成長因子、脳−誘導因子、ニューロトロピン− ３およびニューロトロピン−４から構成される群から選択されるニューロトロピンと接触させる請求項２に記載の神経芽細胞腫の処置法。４．神経芽細胞腫を神経成長因子と接触させる請求項３に記載の神経芽細胞腫の処置法。５．神経芽細胞腫をアフィジコリン、ヒドロキシ尿素およびチミジンから構成される群から選択される細胞増殖阻害剤と接触させる請求項１に記載の神経芽細胞腫の処置法。６．神経芽細胞腫をアフィジコリン、ヒドロキシ尿素およびチミジンから構成される群から選択される細胞増殖阻害剤と接触させる請求項４に記載の神経芽細胞腫の処置法。７．神経芽細胞腫と神経栄養因子および細胞増殖阻害剤とを約３日から７日間接触させる請求項１に記載の神経芽細胞腫の処置法。８．神経芽細胞腫と神経栄養因子および細胞増殖阻害剤とを約５日間接触させる請求項７に記載の神経芽細胞腫の処置法。９．神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を約３日から５日間維持する請求項８に記載の神経芽細胞腫の処置法。１０．神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を約４日間維持する請求項９に記載の神経芽細胞腫の処置法。１１．細胞増殖阻害剤がアフィジコリンである請求項５に記載の神経芽細胞腫の処置法。１２．致死用量以下のアフィジコリンが約０．１μＭから約０．５μＭである請求項１１に記載の神経芽細胞腫の処置法。１３．致死用量以下のアフィジコリンが約０．３μＭである請求項１２に記載の神経芽細胞腫の処置法。１４．神経栄養因子が神経成長因子である請求項１１に記載の神経芽細胞腫の処置法。１５．（ａ）神経芽細胞腫を、神経成長因子および０．３μＭアフィジコリンと約５日間接触させることおよび（ｂ）神経芽細胞腫と神経成長因子との接触を約４日間維持することからなる神経芽細胞腫の処置法。１６．細胞増殖阻害剤がヒドロキシ尿素である請求項５に記載の神経芽細胞腫の処置法。１７．致死用量以下のヒドロキシ尿素が約０．５ｍＭから約２．０ｍＭである請求項１６に記載の神経芽細胞腫の処置法。１８．致死用量以下のヒドロキシ尿素が約１．５ｍＭである請求項１７に記載の神経芽細胞腫の処置法。１９．神経栄養因子が神経成長因子である請求項１６に記載の神経芽細胞腫の処置法。２０．細胞増殖阻害剤がチミジンである請求項５に記載の神経芽細胞腫の処置法。２１．致死用量以下のチミジンが約１．０ｍＭから約２．５ｍＭである請求項１に記載の神経芽細胞腫の処置法。２２．致死用量以下のチミジンが約２．０ｍＭである請求項２１に記載の神経芽細胞腫の処置法。２３．神経栄養因子が神経成長因子である請求項２０に記載の神経芽細胞腫の処置法。２４．（ａ）神経芽細胞腫と神経栄養因子および致死用量以下の細胞増殖阻害剤とを約１日から１５日間接触させること、および（ｂ）神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を約１日から１５日間維持することを含む神経芽細胞腫の緩解を誘導する方法。２５．（ａ）神経芽細胞腫と神経栄養因子および致死用量以下の細胞増殖阻害剤とを約１日から１５日間接触させること、および（ｂ）神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を維持することを含む神経芽細胞腫の分化を誘導する方法。２６．（ａ）神経芽細胞腫と神経栄養因子および致死用量以下の細胞増殖阻害剤とを約１日から１５日間接触させること、（ｂ）神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を少なくとも１６日間維持すること、および（ｃ）神経芽細胞腫と神経栄養因子との接触を停止することからなる神経芽細胞腫細胞を除去する方法。２７．神経栄養因子および致死用量以下の細胞増殖阻害剤を含む神経芽細胞腫の緩解を誘導するための組成物。２８．神経栄養因子が神経成長因子であり、細胞増殖阻害剤がアフィジコリン、チミジンおよびヒドロキシ尿素から構成される群から選択されるものである請求項２７に記載の神経芽細胞腫の緩解を誘導するための組成物。