JPH08501059A - Ｃｄ３３関連表面抗原に対する免疫毒素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は腫瘍性疾患を措置するための新しい免疫毒素および方法を提供するものである。これら免疫毒素はCD33に対する結合特性を有する抗原と細胞成長調節子との接合体で構成されている。本発明による免疫毒素はCD33抗原の表現を特徴とする腫瘍細胞を特殊、かつ選択的に殺す。したがって、この新しい免疫毒素はヒトの白血病、急性および慢性そしてその他の骨髄発育不全疾患の措置に有益である。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 CD33関連表面抗原に対する免疫毒素発明の背景 発明の分野 本発明は、基本的には、腫瘍性疾患の措置の分野に関するものである。より具 体的には、本発明は新しい免疫接合体と腫瘍性疾患の措置におけるその使用に関 するものである。さらにより具体的には、本発明はCD33抗原の表現によって特徴 づけられる白血病細胞に対する毒性を有する新しい免疫接合体に関連している。関連技術の説明 腫瘍性疾患は西側世界における死および疾患状態の主要な原因のひとつである 。すべての腫瘍性疾患あるいは「癌」は少なくともひとつの特徴、つまり、細胞 成長を規制するプロセスにおいて欠陥を有していることに起因している。 癌細胞の表面にある抗原は、リンパ球白血病の非リンパ球白血病からの区別、 急性腫瘍性白血病の区分け、治療結果の予測、およびイン・ビボまたは骨髄腫を 取り出してのエクス・ビボでの治療において有益である。急性非リンパ球細胞を 表現する抗原は、その成長の初期の段階で正常な増血細胞も識別する。 CD33抗原はバースト形成ユニット-エリスロイド（BFU-EおよびCFU-顆粒白血球 、エリスロイド、モノサイト、メガカリオサイト）CFU-GEMMのフラクシヨン上で 、正常なコロニー形 成ユニット顆粒白血球-モノサイト（CFU-GM）で見いだされるが、正常な多能性 幹細胞には存在しない、分子量67キロドルトンの糖蛋白質である。 抗体は、通常抗原決定子に応答して、動物の免疫システムによってつくりださ れる蛋白質である。抗体はそれらが向けられた特定の抗原と結合する。特定のモ ノクローナル抗体の開発は、抗原に関連した腫瘍を過剰表現する細胞に対して選 択的に化学療法剤を移動させることができる手段を研究者に提供する。 免疫毒素はひとつの毒素に共有結合したモノクローナル抗体で構成されるハイ ブリッド分子である。免疫毒素は、腫瘍細胞に対する選択性および非常に強力な 毒素伝達の可能性など、従来の抗腫瘍剤と対比していくつかの利点を有している 。 急性非リンパ球白血病細胞および急性骨髄腫白血病細胞上にCD33抗原が存在し ていると、選択性のある免疫毒素が形成される可能性がある。現在、そのような 有効な免疫毒素は存在していない。したがって、この技術分野では、白血病細胞 を選択的に殺すための化合物および方法に対する大きなニーズおよび要求が存在 している。発明の要約 本発明はCD33蛋白質に対する選択的結合性を有する抗原結合領域と細胞成長調 節子との接合体で構成される新しい組成物を提供する。このような組成物は、CD 33抗原の過剰表現を特徴とする腫瘍細胞を選択的に殺すための免疫毒素として作 用する。 したがって、本発明のひとつの実施例においては、CD33抗原に対する選択的な 結合性を示す抗原結合領域と細胞成長調節子との接合体によって構成される物質 の新しい組成を提供する。この細胞成長調節子は毒素、細胞毒性薬、細胞分裂阻 止薬、または生物学的反応修飾子などである。好ましくは、この細胞成長調節子 はゲロニン（gelonin）である。 本発明の別の実施例においては、本発明の免疫毒素を細胞毒性的に有効な量を 措置を必要とする個人に投与するステップを含む腫瘍性疾患の措置法を提供する ものである。 本発明のさらに別の実施例においては、腫瘍性疾患を有する個人から骨髄腫を 取り出して、その骨髄腫を本発明による組成物によって処理し、その処理された 骨髄腫をその個人に戻すステップで構成される、骨髄腫内の腫瘍細胞を殺す方法 を提供する。 本発明による他の実施例においては、その疾患がCD33蛋白質の表現を特徴とす る腫瘍性疾患の再発を防ぐための方法を提供する。再発は、本発明による免疫毒 素を細胞毒性的に有効な分だけ投与することによって阻止することができる。 本発明のさらに別の実施例においては、CD33抗原結合領域と細胞成長調節子と の溶融によって形成される溶融蛋白質で構成される物質の新しい組成を提供する 。好ましくは、その成長調節子はゲロニンである。 本発明の他の実施例で、本発明による腫瘍を有する哺乳動 物に生き残り時間を、本発明による免疫毒素をその哺乳動物に投与することによ って延長するための方法が提供される。さらに別の実施例で、本発明による免疫 毒素の投与によって、腫瘍の成長速度を遅らせる方法を提供する。さらに、本発 明による免疫毒素で構成される医薬品組成物も提供される。図面の簡単な説明 図１は、ゲロニンおよびＭ195免疫毒素によるHL60細胞上での蛋白質合成の抑 制を示している。 図２は、SKLY16およびHL60細胞株による蛋白質合成の抑制を示している。 図３は、Ｍ195免疫毒素をHL60と共に３日間培養した場合の蛋白質合成の抑制 を示している 図４は、Ｍ195-ITをHL60細胞上で５日間培養した場合の蛋白質合成の抑制を示 している。 図５は、HuG１およびHuG１-ITのHL60，Ｕ937，MOLT４細胞に対する結合を示し ている。 図６は、HL60細胞上でのHuG１-ITによるDNA合成の抑制を示している。 図７は、HuG１-ITおよびHuG１またはFD79間の競合を示している。 図８は、M195のみ、反応混合物、ゲロニンのみ、または精製Ｍ195ゲロニンの 電気泳動パターンを示している。本発明の詳細な説明 ここで使われている「キメラ性抗体」または「キメラ性ペ プチド」という用語は、それらペプチドの一部が第一の遺伝子ソースから誘導さ れる抗体またはペプチドにおける対応する配列から誘導された、あるいはそれと 類似したアミノ酸配列を有しており、その鎖の残りの部分が他の遺伝子ソースの 対応する配列と同じであるような抗体、または抗体ペプチドを意味している。例 えば、キメラ性重鎖抗体ペプチドは、マウス可変領域とヒト不変領域を持ってい るような場合がある。これら２つの遺伝子ソースは、通常、２つの別個の種であ るが、場合によって、同じ種に属する場合もある。 キメラ性抗体またはペプチドは通常、組み替え分子および／または細胞技術を 用いてつくられる。多くの場合、キメラ性抗体はひとつの哺乳動物種から誘導さ れた抗体の可変領域を模倣する軽鎖および重鎖の両方の可変領域を有しているが 、不変および／またはフレームワーク部分は第２の異なった哺乳動物種から誘導 された抗体内の配列と同じである。 ここで使われているキメラ性抗体は、本例に限定されるものではない。キメラ 性抗体は、これらのソースが別のクラス、異なった抗原反応、あるいは別の種か らのものであるかどうかには関係なく、また、融合点が可変領域と不変領域のい ずれにあるかには関係なく、重鎖および軽鎖のいずれか一方、またはその両方が 異なったソースの抗体内における配列を模倣する組み合わせで構成されている。 例えば、キメラ性抗体はフレームワークおよび相補性決定領域（CDR）が異なっ たソースからのものである抗体を含んでいる。例えば、非ヒト CDRがヒト不変領域に結合されたヒトフレームワーク領域内に統合され、「ヒト 化抗体」がつくられる。すべて引用によって本文に組み入れているPCT出願公開N o.WO 87/02671；米国特許第4,816,567；欧州特許出願0173494;Jones, et al.,Na ture，321：522−525 （1986）、およびVerhoeyen, et al.,Science，239：1534 −1536（1988）参照。 ここで使われている「ヒト様フレームワーク領域」はそれぞれの抗体鎖のため のフレームワーク領域で、通常、少なくとも約70又はそれ以上のアミノ酸残基、 通常は75−85又はそれ以上の残基で構成されている。ヒト様フレームワーク領域 のアミノ酸残基はヒト免疫グロブリンと少なくとも約80％、好ましくは約80−85 ％、そして最も好ましくは85％以上のヒト免疫グロブリンと同じである。この他 のエンドエルゴニアス（endergeneous）抗体と共通の特徴は、「自己」マーカー に対する応答を最小限化するメカニズムなど、副次的な免疫反応だけを導入する 標的部分を発生させる上で有益である。 ここで使われている「ヒト化」または「ヒト様免疫グロブリン」という用語は 、ヒト様フレームワーク領域および、例えば、少なくとも約80％又はそれ以上、 好ましくは約80−90％又はそれ以上、そして最も好ましくは約95％又はそれ以上 ヒト免疫グロブリンと実質的には同じな不変領域を有する免疫グロブリンを指し ている。したがって、CDRを除いて、ヒト様免疫グロブリンは、１つ以上の天然 由来ヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的には同じである。 ここで使われている「ハイブリッド抗体」という用語は各鎖が哺乳動物抗体鎖 に関しては同じであるが、その組み合わせが新しい集団を形成し、したがって、 ２つの抗原がその抗体によって認識されるような抗体を指している。ハイブリッ ド抗体においては、１つの重鎖および軽鎖対が１つの抗原識別特性、例えばエピ トープに対して発生する抗体の中に見いだされるものと同じであるが、もう１つ の重鎖および軽鎖対は別のエピトープに対して発生する抗体の中に見いだされる ものと同じである。その結果、少なくとも２つのエピトープと同時に結合する能 力など、多機能性結合価という性質をもたらす。こうしたハイブリッドは、勿論 、キメラ性鎖を用いてもつくることができる。 ここで使われている「モノクローナル抗体」とは、個別の抗体決定子を識別す る抗体組成を意味している。この用語はその抗体のソースや、それがつくられる 方法を限定するものではない。 本発明においては、１つの抗体、あるいはその他のペプチドは、標準的な抗体 −抗原あるいは競合アッセイなどのリガンド−受容体アッセイ、飽和アッセイ、 またはELISAまたはRIAなどの標準的な免疫アッセイで測定または判定されるとこ ろの、蛋白質などCD33に結合することができる場合に、CD33に対して特殊性を有 していると認められる。特殊性に関するこの定義は単一の重鎖および／または軽 鎖、CDR、溶融蛋白質または重鎖および／または軽鎖のフラグメントに対しても 適用され、これらも、CD33のみに結合するか、あるいは相補性のある可変領域お よび不変領域との免疫グロブリン立体配座内に適切に組み込まれると、CD33との 結合特性を示す場合に、CD33に対して特殊性を有するとみなされる。 競合アッセイにおいては、１つの抗体やペプチドフラグメントの抗原と結合す る能力は、そのペブチドのその抗原と結合することが知られている化合物の結合 性と競合する能力を検出することによって判定することができる。いろいろなタ イプの競合アッセイが知られており、ここでも検討されている。また、抑制因子 が存在していない状態で、テスト化合物の結合性を測定するアッセイを用いるこ ともできる。例えば、ひとつの分子なり他の化合物のｃ-erbB-2蛋白質と結合す る能力は、その分子を直接ラベルすることによって検出することができるし、ラ ベルしない場合、種々のサンドウィッチアッセイを用いて間接的に検出すること ができる。競合結合アッセイなど、いろいろなタイプの結合アッセイが知られて いる（例えば、ここで引用により本文に組み入れている、米国特許第3,376,110 、4,016,043、およびHarlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPublications,N.Y.（1988）参照）。競合アツセイ以外の、テスト 化合物のひとつの成分への結合性を測定するためのアッセイも利用することがで きる。例えば、免疫グロブリンを用いてCD33の存在を確認することができる。EL ISAなど、モノクローナル抗体アッセイの標準的な手順を用いることもで きる（HarlowおよびLane, supra参照）。利用可能な種々の信号発生システムに 関しては、ここに引用により本文に組み入れている米国特許第4,391,904参照。 さらに、CD33に対する結合部分の特殊性はそれら部分の親和性によって判定す ることができる。その部分の分離定数（Ｋ_D＝１/Ｋ；ここでＫは親和性定数）が ＜１μM、好ましくは＜100nM、最も好ましくは＜１nMの場合に、そうした特殊性 が存在していると認められる。抗体部分と、通常、低い範囲のＫ_Dを有している 。Ｋ_D＝［Ｒ−Ｌ］／［Ｒ］［Ｌ］で、［Ｒ］，［Ｌ］および［Ｒ−Ｌ］はそれ ぞれ受容体またはCD33［Ｒ］、リガンド、抗体またはペブチド［Ｌ］、および受 容体-リガンド複合体［Ｒ−１］の均衡時の濃度である。通常、リガンドまたは ペブチドと受容体または抗原との間の結合作用には静電引力、ファンデルワース 力、および水素結合などの非可逆的結合などが含まれる。 他のアッセイ方式では、ここで引用により本文に組み入れている1991年１月18 日付け出願の米国特願第07/644,361ダウン・モジュレーション、内部化、あるい はフォスフォリル化などから発生する種々の生理学的または化学変化の存在また は不存在の検出を含む場合もある。Receptor-Effector Coupling-APractical Ap proach, ed.Hulme, IRL Press, Oxford（1990）も参照。 ゲロニンはゲロニウムマルチフォーラムの種子から精製された糖蛋白（分子量 ：約29−30,000Kd）である。ゲロニンは 強力なリボソーム非活性化植物毒素のタイプに属する。他のリボソーム非活性植 物毒素のクラスに属するものとしては、アブリン、リシン、およびモデシンであ る。ゲロニンは、アブリンおよびリシンと同様、哺乳動物リボソームの60Ｓサブ ユニットを破壊することによって蛋白質合成を抑制する。ゲロニンは化学的およ び物理的処理に対しては安定的である。さらに、ゲロニン自体は細胞には結合せ ず、単独で投与された場合、通常は非毒性（濃度が高い場合を除いて）であり、 実験室で取り扱う場合は安全である。リボソームの非活性化は非可逆的であり、 補助因子が関与するようには思われず、効率的に行われるので、これはゲロニン が酵素的に作用することを示唆している。 ゲロニンとリシンは蛋白質重量ベースで見て、蛋白質合成を抑制する最も活性 の高い毒素である。ゲロニンは蛋白質合成においては、リシンＡ鎖より10−1000 倍も活性が高い。リシンおよびアブリンのようなペプチドは毒性を持つユニット であるＡ鎖と細胞に接合することによって作用するＢ鎖との２つの鎖で構成され ている。リシンおよびアブリンと違って、ゲロニンは単鎖であり、それはＢ鎖を 持っていないので、それ自体は普通の細胞に対しては比較的毒性が低い。 哺乳動物細胞は天然のゲロニン分子に結合する、および／またはそれを内部化 する能力を明らかに欠いている。ある種の腫瘍細胞上に存在する腫瘍関連抗原に 向けられたＭ195など、腫瘍標的試薬とゲロニンの接合体はゲロニンをその細胞 に結合させるための方法と、ゲロニン−抗体複合体の内部化のためのルートの両 方を提供する。 免疫毒素の細胞毒性部分は細胞毒性薬あるいはバクテリア性または植物性由来 の酵素活性毒素、あるいはそうした毒素の酵素活性フラグメント（「Ａ鎖」）で あってもよい。酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントが好ましく、ゲ ロニン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非活性フラグメント、（シュードモ ナスアクルギノーサからの）外毒素Ａ鎖、リシン鎖Ａ、アブリンＡ鎖、モデクシ ンＡ鎖、アルフア−サルシン、オウリテス フォージイ（Aleurites fordii）蛋 白質、ジアンシン蛋白質、フィトイカアメリカナ（Phytoiaccaamericana）蛋白 質（PAPＩ，PAPIIおよびPAP-Ｓ）、モルモディカ・チャランティアインヒビター （momordica charantiainhibitor）、カルシン（curcin）、クロチン、サポナリ アオフィシナリスインヒビター（saporaria officinalis inhibitor）、ミトゲ リン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンなどがその具体 例である。最も好ましいのは、ゲロニンとの接合体である。 活性フラグメントおよび誘導体にはゲロニンの全長構造と同じ核構造を有して いるが主要配列全体を欠いている化合物を含んでいる。これらのフラグメントま たは誘導体は、ゲロニンと同じ、あるいはそれより改善された生物学的、あるい は細胞毒性活性を有している。ゲロニンフラグメントまたは誘導体はウサギ網状 赤血球細胞溶解物アッセイを用いて、当 業者によって簡単に判定することができる。 Ｍ195抗体に結合され、本発明において用いることができる生物学的応答修飾 子としては、限定するものではないが、IL-１，IL-２、インターフェロン（α， βまたはγ）、TNF，LT，TGF-βおよびIL-６などのリンフォカインおよびサイト カインなどである。これら生物学的応答修飾子は腫瘍細胞に対していろいろな影 響を及ぼす。こうした影響の中には、直接の作用によって殺される腫瘍細胞の増 大、および、ホスト細胞防衛仲介プロセスの増大によって殺される腫瘍細胞の増 大などがある。抗体Ｍ195とこれら生物学的応答修飾子との接合体は、腫瘍内部 への選択的局在化、したがって、より優れた抗増殖効果をもたらす同時に、非標 的細胞の毒性につながる不特定効果は抑制される。 本発明において有益な細胞毒性薬（およびその誘導体）には、限定するもので はないが、アドリアマイシン、シス-プラチニウム複合体、ブレオマイシン、お よびメソトレキセートなどがある。これらの細胞毒性薬は再発性腫瘍の治療的管 理のためには有益であるが、副作用が激しく、非標的細胞の受ける損傷も激しい ので、その使用法は非常に難しい。Ｍ195抗体は、腫瘍への伝達と、腫瘍細胞自 体への侵入をしやすくるための両方の効率的な手段を提供してくれ、こうした薬 剤の有益なキャリアとしての役割を果すことができる。さらに、特定の抗体によ る細胞毒性薬の腫瘍への伝達は肝臓などCD33および骨髄ステム細胞を表現しない 鋭敏な場所を、化学 治療剤の悪性の作用から保護する。伝達システムとしてのＭ195抗体に接合され た薬剤の使用は、すべての薬剤部分が腫瘍細胞に集中する抗体に接合されており 、通常、そこに内部化されるので、薬剤自体の用量を減らす。 このモノクローナル抗体の接合体は種々の２機能性蛋白質結合剤を用いてつく ることができる。こうした試薬の例としてはSPDP、イミノチオラン（IT）、ヂメ チルアジピミデートなどのイミドエステルの２機能性誘導体、HCl、ジサクシイ ミジルスベレートなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、 ビス（ｐ-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどのビス-アジド化合物、ビス -（ｐ-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミンなどのビス-ジアゾニウム誘 導体、トルエン２，６-ジイソシアネートなどのジイソシアネート類、および１ ，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼンなどのビス-活性ふっ素化合物などが ある。 CD33蛋白質の表現によって特徴づけられる白血病を持っていると診断された個 人に対して本発明による免疫毒素を投与すると、その細胞毒性薬の、腫瘍細胞を 殺すためにそれが必要とされている場所への移動と集中が可能になる。そのよう に細胞毒性薬を目的の場所に向かわせることによって、他の器官、組織およい細 胞への毒性が除去され、あるいは低下される。 イン・ビボで治療に用いられる場合には、この免疫毒素は治療的に有効な量、 つまり、腫瘍の負担をなくすか、あるい は軽減する量、または化学療法または放射線療法による初期の治療後に残ってい る疾患を除去するための量だけ、治療対象のヒトまたは動物に対して投与する。 通常は経皮的に、好ましくは静脈注射で投与される。用量および処方は白血病の 性質、その密度、そして、治療指数などの特定の免疫毒素の特性、患者、そして その患者の病歴などに依存する。投与される免疫毒素の量は、通常、患者の体重 の0.01−1.0mg/Kg程度の範囲である。 経皮投与を行うためには、免疫毒素は、薬学的に受け入れ可能な経皮投与伝達 手段との組み合わせによる、ユニット投与による注射可能な形態（溶液、懸濁液 、およびエマルジヨン）の形で処方される。そうしたベヒクルは非毒性で、治療 上の効果をもたないものであることが好ましい。そうしたベヒクルの実例として は、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブ ミンなどがある。固定オイルおよびエチルオレエートなどの非水性伝達手段も用 いることが可能である。キャリアとしてリボソームの使用も可能である。これら のベヒクルは、緩衝剤や保存剤など、等張性および化学的安定性を強化する物質 などの添加物を多少含んでいてもよい。免疫毒素は通常、そうしたベヒクル内で 約0.1mg/ml−10mg mlの濃度で調製される。 本発明による免疫毒素は、骨髄腫における腫瘍細胞を殺すための方法において も用いることができる。この方法では、白血病など腫瘍性疾患を有する個人から 、先ず、骨髄腫が取 り出される。次に、その骨髄腫を細胞毒性的に有効な量の本発明による免疫毒素 によって処理する。 以下の実例は、本発明による免疫毒素の調製、特徴付け、および使用法に関す る詳細な説明である。これらの例はいずれの意味においても、本発明を限定する ことは意図していない。実施例１ ゲロニンの精製 Gelonium multiforumの種子の外皮をとり、実をホモジナイザーで、５mMリン 酸ナトリウム（pH7.4）を含む0.14Ｍ NaCl８容積分と共に砕く。この均一化さ れたものを一昼夜４℃の温度で継続的に撹拌しながら放置し、氷上で冷やして、 ０℃の温度で、20分間、35,000times ｇで遠心分離にかける。上澄液を取り除 いて、５mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で透析してから、pm10フィルターを用い て遠心分離する。サンプルを５mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で均衡化させたCM- 52イオン交換カラム（20×1.5cm）上で層状に置く。このイオン交換樹脂に結合 した物質を400mlの０−0.3M線形勾配を持つNaClで、４℃の温度下、１時間あた り25mlの割合で溶出させた。5ml単位でフラクシヨンを集める。各フラクシヨン を電子顕微鏡で観察した。ゲロニンは画分55−70で溶出し、最後の主要溶出ピー クであった。フラクシヨン55−70が集められ、２回蒸留された水で透析され、凍 結乾燥の方法で濃縮された。各製剤の純度および分子量を、TSK3000ゲル浸透カ ラムを用い、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4および15％ナトリウム・ドデ シルスルフェート−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SDS-ページ）によって 、高圧液体クロマトグラフィーで検査した。ジェロニンは単一の帯として移動し 、その分子量は29,000−30,000ドルトン程度と推定された。実施例２ ゲロニン活性のアッセイ ゲロニンの活性は無細胞蛋白質合成抑止アッセイによって観察された。この無 細胞蛋白質合成抑止アッセイは、50μｌウサギ細胞質溶解物に以下の成分（0.5m lの0.2Ｍトリス-HCl（pH7.8）、8.9mlのエチレングリコール、および0.25mlの１ M HCl）を追加し、追加する度によくかき回した。 0.375Ｍ KCl，10mM Mg (CH3CO2) 2，15mMグルコース、0.25−10mMアミノ酸（ ロイシンを除く）、５mM ATP，１mM GTP，50mM トリス-HCl（pH7.6）、10μｌ クレアチニンフォスフェート-クレアチニンフォスフォキナーゼ、８μｌ¹⁴Ｈロ イシン（Amersham，348mCi/mmol）で構成される塩-アミノ酸エネルギー混合体（ SAEM）と、いろいろの濃度のゲロニン混合物を含む溶液1.5μｌの追加。この混 合物を30℃の温度で60分間培養した。¹⁴Ｃ-ロイキンのとり込みが、グラスファ イバーフィルター上に合成された蛋白質を沈殿させ、10％TCAおよびアセトンで 洗浄し、そして、アクアゾルシンチレーション液を用いるベーターカウンターで その放射能を測定することによって観察した。これら抗体との接合には特殊な活 性が４ ×10⁹Ｕ/mg以上のゲロニンが用いられた。ゲロニンの活性の単位は、無細胞アッ セイにおいて［¹⁴Ｃ］ロイシンの蛋白質への取り込みを50％抑制するゲロニンの 量を基準としている。実施例３ イミノチオランによるゲロニンの調製 ２-IT修飾ゲロニンの調製 フォスフェート緩衝食塩水内のゲロニンをセントリプレップ10濃縮器で10mg/m l程度に濃縮した。トリエタノールアミンヒドロクロライド（TEA/HCl），pH8.0 およびEDTAを加えて最終的な濃度が60mM TEA/HClおよび１mM EDTA，pH8.0となる ようにした。２-イミノチオラン保存液（１mM EDTAを含む60mM TEA/Hcl緩衝液、 pH8.0）を加えて最終的な濃度が１mMとなるようにし、サンプルを窒素ガス流の 存在下、攪拌しながら４℃の温度で９０分培養した。過剰なイミノチオランは0. 01M Na₂HPO₄，0.0018M KH₂PO₄，0.0034M KCl，0.001M EDTAおよび0.17M NaClを 含むフォスフェート-EDTA緩衝液、pH7.5で予め均衡化させたセファデックスＧ-2 5（１×24cm）カラム上でのゲルろ過で除去した。フラクションを分析し、バイ オ-ラッドアッセイを用いて、マイクロタイタープレートで蛋白質の含有量を調 べた。ゲロニンは空隙容積で溶出した（フラクシヨン約21−23）。これらのフラ クションを集めて、４℃で保存した。 ４-サクシイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α（２-ピリジルジオチ）ト ルエン（SMPT）と結合したＭ195は、２- IT-４修飾ゲロニンをSMPT-修飾MAB Ｍ195と結合して調製した。要するに、Ｍ195 をSMPTで修飾するために、PBS1.0ml内の抗体10mgを２Ｘ硼酸塩緩衝液（0.05Ｍ硼 酸ナトリウム1.7％塩化ナトリウム、pH9.0）で１：１に希釈し、乾燥DMF内の４m M SMPT 52μｌを抗体溶液にゆっくり加えた。この反応物を室温で２時間、Ｎ_zの 存在下、攪拌しながら培養した。過剰なSMPTは反応混合物を、フォスフェート-E DTA緩衝液，pH7.5を含むセファデックスＧ-25カラムを通過させることによって 除去し、バイオ-ラッドアッセイで抗体ポジティブフラクションを評価した。こ れらのフラクションを集めて、Ｎ₂ の存在下、４℃の温度で保存した。２-ITとのクロス−リンクを27℃の温度で、 Ｎ₂の存在下、攪拌しながら96時間行った。最終生成物をSPDPについて述べたの と同じように精製した。実施例４ マウスモノクローナル抗体Ｍ195の調製 NS-1マウス骨髄腫細胞と急性非リンパ球白血病（FAB-Ｍ２）をもった親からの 白血病細胞で免疫化した生後５週間のHALB/cマウスの脾臓細胞との融合から得ら れたハイブリドーマからマウスモノクローナル抗体Ｍ195を作成した。クローン されたハイブリドーマ培養株からの上澄液を、スタフイロコッカス アウレウス 蛋白質Ａ（PA）赤血球ロゼッティングを用いて、白血病細胞株および元のANLL白 血病細胞のパネルでスクリーニングした。繰り返しサブクローンされたＭ195 ハイブリドーマを２倍にプリステイン−プライムした（pristane-primed）（Ｃ5 7 BL/６倍BALB/c）Ｆ１マウス内で拡大した。 連続pHステップ希釈法を用いて、Ｍ195を親和性クロマトグラフィーでPA-セフ ァロース上で精製した。純度はクロマシ輝青色に染色したナトリウム・ドデシル （SDS）-ポリアクリルアミド・ゲル上で判定した。ヒト化モノクローナル抗体M1 95はCo et al．，“Chimeric and Humanized Antibodieswith Specificity for the CD33 Antigen”，Ｊ．Immunol．，148：1149−1154（1992）に述べられてい る手順にしたがって調製され、上に述べたようにハイブリドーマから造り精製さ れた。 簡単に述べると、マウスＭ195に対して重鎖および軽鎖に関して非常に変わり やすいドメイン（Ｖ領域）が固定（anchored）PCR法でクローンされた。まず最 初に、Ｍ195ハイブリドーマ細胞を溶解して、ホットフェノール法を用いてRNAを 抽出した。ウィルス性逆転写酵素による培養で、RNAからcDNAを合成した。PCRプ ライマーを設計し、簡単なサブクローニングのためにECO RIおよびHind III部位 の両方を上流および下流プライマーに含めた。温度循環（92℃を１分間、50℃を ２分間、そして72℃を３分間）を30回繰り返すブログラム可能加熱ブロックで、 PCR反応を行った。PCR生成物を低融点アガロースゲル上で電気泳動によって分離 した。バンドを切り取り、制限酵素で消化して、PUC18ベクター内にクローンし て、配列を判定した。マウス重鎖および軽鎖可変領域を、異なった ベクターを用いて、プラズミド含有相補性ヒト重鎖および軽鎖にスライスした。 キメラ性マウス／ヒト軽鎖および重鎖をコード表現するベクターを電気泳動でSP 2/0細胞内にトランスフェクトした。生き残ったコロニーをプレートして、ヒト 化αCD33抗体をつくりだす能力についてテストした。実施例５ SPDP-修飾モノクローナル抗体Ｍ195とイミノチオラン修飾ゲロニンの接合体 実施例１で述べたように調製された精製ゲロニン（PBS内に２mg/ml）１mgを実 施例３に述べたように、イミノチオランで修飾した。実施例４に述べたように修 飾されたモノクローナル抗体Ｍ195を等量の修飾ゲロニンと混合した。この割合 では、ゲロニンが抗体と比較してモル数で５倍多かった。この混合物のpHを0.05 Ｍ TEA/HCl緩衝液pH8.0を追加して調整し、その混合物を４℃の温度で、窒素の 存在下、20時間培養した。遊離スルフヒドリル基が残らないようにするために、 ヨードアセトアミド（0.1Ｍ）を追加して最終濃度を２mMとなるようにして、さ らに約25℃程度の温度で培養を１時間続けた。ゲルろ過による精製を行うまで、 この反応混合物を４℃の温度で保存した。実施例６ ゲロニン−モノクローナル抗体Ｍ195複合体の精製 PBSで予め均衡化したセファデックス３−300カラム（1.6×31cm）上でのゲル ろ過によって実施例６の反応混合物から非接合ゲロニンおよび低分子量生成物を 除去した。 セファデックスカラムに入れる前に、セントリコン30マイクロ濃縮器によって 実施例５からの反応混合物を１ml程度に濃縮した。このカラムをPBSで洗浄した 。１mlフラクションを集めて、50μｌ画分を分析し、ブラッドフォードアッセイ で蛋白質について調べた。 未接合Ｍ195を取り除くために、Ｓ-300カラムからの高分子量ピーク（フラク ション28−40）を0.1Ｍ NaClを含む10mMフォスフェート緩衝液（pH7.2）で予め 均衡化したブルーセパラースCL-６Ｂ（１×４cm）の親和性クロマトグラフィー カラムにかけた。サンプルを入れた後、カラムを30mlの緩衝液で洗浄して、未接 合抗体を完全に除去した。このカラムを10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2中0.1 −２Ｍ直線塩勾配のNaClで洗浄した。溶出されたフラクションの蛋白質含有量を ブラドフォードアッセイで判定した。 未接合抗体を0.1Ｍ NaClを含む10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2で予め均衡 化させたブルーセファロースのカラム（１×24cm）上での親和性クロマトグラフ ィーによって、ゲロニン接合抗体から取り除いた。Ｓ-300溶出サンプルを入れた 後、カラムを30mlのサンプル緩衝液で洗浄して、溶出未接合抗体を完全の除去し た。 ゲロニン接合抗体はカラムに結合し、10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2内で0 .2−２Ｍの直線塩勾配のNaClで溶出した。抗体-ゲロニン複合体は0.7Ｍ NaCl程 度で溶出した。溶出フラクシヨンの蛋白質含有量をブラッドフォードアッセイで 判 定した。この蛋白質を含んだフラクションを集め、５−20％勾配非還元ポリアク リルアミドゲル上での電気泳動によって溶出パターンを確認した。図８はＭ195 のみ、Ｍ195の未精製反応混合物、ゲロニンとＭ195-ゲロニン、ゲロニンのみ、 または精製Ｍ195-ゲロニンの電気泳動を示す。フロー・スルーピーク（フラクシ ョン14−20）は遊離抗体のみを含んでいるが、高塩分で溶出されたフラクション 50−80は、未接合ゲロニンまたは抗体を含んでいなかった。最終的な生成物は１ ，２または３ゲロニン分子を結合したＭ195抗体を含んでいた。平均ゲロニン含 有量は抗体分子１個あたり1.5分子であった。ウサギ網状赤血球イン・ビトロ翻 訳システムを用いて基本的に純粋なゲロニンＭ195抗体複合体のゲロニン活性を 測定した。このアッセイにおける活性の１単位は未処理コントロールと比較して 蛋白質合成を50％抑制するのに必要な蛋白質の量として定義された。このアッセ イを用いて、天然ゲロニンとＭ195-ゲロニン接合体はそれぞれ２×10⁸U/mgおよ び8.2×10⁵U/mgであると判定された。基本的に純粋なゲロニンＭ195抗体は網状 赤血球溶解アッセイにおいて活性である。元のサンプルを１：1000で希釈すると 蛋白質合成が50％抑制された、つまり、蛋白質への¹⁴Ｃ-ロイシンの取り込みが5 0％減少した。したがって、最初の調製物の活性は1000U/mlであった。実施例７ 本発明による組成物はＭ195モノクローナル抗体と細胞毒性部分との融合構造 を含むことができる。本発明による免疫 毒素のこうした融合構造は、引用により本文に組み入れているCo，et al．，に よる方法で調製された。 これらの研究で用いる前に、Sp2/0-Ag14細胞を最初0.1μｇ/mlの天然ゲロニン の存在下で成長する。数か月間に、最終的に細胞を10mg/mlの濃度で維持できる ようになるまで、ゲロニンの濃度を徐々に増大する。次に、10mg/mlの存在下で の制限希釈で細胞をクローンし、その結果できるゲロニンに抵抗性のあるコロニ ーを拡大する。そして、ゲロニンを２つのパッセージとして培養液から取り除い て、その細胞を再度ゲロニンに露出させ、安定した抵抗性を示すクローンの形成 を確認する。ヒト化Ｍ195の生成および活性を確認するためのテストを実施した 後、抗体をつくりだすゲロニンに抵抗性のあるSP2/0細胞を成長させ、制限エン ドヌクレアーゼでの培養によってトータルDNAからＭ195抗体を取り出した。それ と平行して、最適化ゲロニンを表現するJM105大腸菌からのcDNAを取り出し、精 製して、HindIIIおよびEco RIでの消化後、そのDNAをコード表現するゲロニンを 遊離する。このゲロニン遺伝子を重鎖フラグメント内に結紮して、それをゲロニ ン抵抗性SP2/0細胞内に置換する。つぎに、制限希釈で細胞をサブクローンし、 クローンをスクリーニングしてヒト化抗体の生成およびゲロニン含有量について 調べる。最後に、ポジティブクローンを拡大して、組み替え融合蛋白質を精製し 、イン・ビトロ細胞毒性アッセイとイン・ビボ組織分布、薬力学、治療および毒 性の両面に関するテストを行う。それぞれ の長所と短所を判定するために、Ｍ195ゲロニン融合蛋白質の性質と上に述べた Ｍ195ゲロニン構造の特性との比較を行う。これらの調査に基づいて、進行した 乳癌をもった患者で、キメラ性Ｍ195-ゲロニン融合蛋白質のフェーズＩ臨床調査 を行うことができる。実施例８ 図１で、Ｍ195免疫毒素のHL60細胞を殺す能力と遊離ゲロニンの同様の能力と の比較を行った。（トリチウムを含む混合アミノ酸（0.5μCi/ml；New England Nuclear Corp.）のトリクロロ酢酸（TCA）沈殿可能蛋白質への取り込みを利用し た）蛋白質合成の抑制が用いられた試薬の活性の尺度として用いられた。Ｍ195- ゲロニン免疫毒素の最終的な濃度は４μｇ/mlから５ナノグラムの範囲であった 。ゲロニンの最終的な濃度は44μｇ/ml−0.6μｇ/mlの範囲であった。 Ｍ195-ゲロニン免疫毒素は遊離ゲロニンのみの場合と比較して、600倍程度以 上強力であった。Ｍ195-ゲロニン免疫毒素に対するID₅₀は0.4nM程度であった。 ＭI95-免疫毒素による蛋白質合成の抑制は、その後で、細胞分裂の欠如か細胞の 死のいずれかに導く。細胞の死は生きた細胞の総数および生きた細胞の割合を判 定するためのトリパンブルー排除法を用いた実験で確認された。図１で、最終濃 度１×106細胞／ccのHL60細胞をＭ195-ゲロニン免疫毒素またはゲロニンのみの 存在下で、37℃の温度下、３日間培養した。 図２で、最終濃度５×10⁵細胞／ccのHL60 SKLY細胞をゲロ ニンのみ、またはＭ195-ゲロニン免疫毒素のいずれかの存在下で、37℃の温度下 、３日間培養した。Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の最終的な濃度は４μｇ/ml−15.2p g/mlの範囲であった。また、ゲロニンの最終濃度は10μｇ/ml−0.1μｇ/mlの範 囲であった。蛋白質合成のレベルはトリクロロ酢酸沈殿可能蛋白質へのトリチウ ムを含有するアミノ酸への取り込みを５時間実施して判定された。 図２に示されているように、Ｍ195ゲロニン免疫毒素の集中によってHL60蛋白 質合成の80％以上が抑制された。しかし免疫毒素の同様の濃度ではSKLY16細胞に 対する影響は認められなかった。したがって、Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の選択性 は明らかである。 図３および４で、最終濃度１×10⁶のHL60細胞を、Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の 存在下、37℃の温度で、３日間（図３）または５日間（図４）培養された。免疫 毒素の最終濃度は４μｇ/ml−0.9ng/mlの範囲であった。蛋白質合成のレベルは 、トリチウムを含有するアミノ酸のトリクロロ酢酸沈殿可能蛋白質への取り込み を５時間実施して判定した。 図３および４の比較で分かるように、免疫毒素への露出時間の長さがその活性 に影響を及ぼす。実際、HL60細胞で５日間培養を行うと、Ｍ195-ゲロニンの強さ が３日間の培養と比較して10倍も増大することが認められる。 図５で、ヒト化Ｍ195（HuGI）-免疫毒素のHL60，Ｕ937およびMOLT４細胞への 結合が調べた。HuG1およびHuG1免疫毒素 を５μｇ/ml−５ng/mlの範囲の濃度でHL60細胞（図５、パネルＡ）またはＵ937 およびNOLT４細胞株（図５、パネルＢ）に加えた。これらの細胞を氷中で１時間 培養した後、過剰な抗体を洗い流した。その後、ヤギ抗ヒトFITCを細胞に加えて から、それらの細胞をさらに１時間氷上で培養した。過剰な抗体を洗い流した後 、0.5％パラフォルムアルデヒドで混合し、EPICSファイルフローサイトメータで 読み取った。 図５はヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素が標的細胞に選択的に結合できることを 示している。間接フローサイトメトリーにおいて、ヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒 素は、図５で、ヒト化Ｍ195抗体のみの場合と比較して、CD33ポジティブ細胞株 （HL60）およびＵ937とほぼ同等な選択的結合性を示している。それはCD33ネガ ティブ細胞株には結合しなかった（MOLT４；図５、パネルＢ）。 図６において、最終濃度３×10⁴および５×10⁴の濃度のHL60細胞が、最終濃度 が４μｇ/ml−0.2ng/mlの範囲のヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の存在下で、37 ℃の温度で５日間培養された。ゲロニンの最終濃度は50μｇ/ml−0.5μｇ/mlの 範囲であった。DNA合成はトリチウム含有チミジンによる５時間の培養で判定さ れた。図６に示されているように、ヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素はゲロニンの みの場合と比較して、4500倍程度の蛋白質抑制効果を示した。 図７はヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素のHL60細胞を殺す能力を示している。図 ７に示されているように、ヒト化Ｍ195- ゲロニン免疫毒素に対するID₅₀は10ピコモル以下であった。この免疫毒素に対す るID₅₀はゲロニン単独の場合と比較して、4000分の１以下であった。 図８で、HL細胞はヒト化Ｍ195抗体またはＦ79、アイソタイプ・マッチされた （isotype matched）HuG１コントロール抗体の存在下で氷の上で１時間培養され た。ヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素は0.15μｇ/mlの濃度で加えた。細胞は37℃ の温度で、90時間培養された。生きた細胞の量はトリパンブルー排除法（trypan blue exclusion technique）で判定された。抑制の割合は、免疫毒素のみで殺 された細胞と比較して、競合する抗体が存在する状態で殺された細胞の減少傾向 を示す。 図８に示されているように、ヒト化Ｍ195抗体はヒト化Ｍ195抗体-ゲロニン免 疫毒素の毒性を用量に依存する形で阻止することができる。対照的に、不特定ヒ ト化IgGIであるFd79は同じレベルで何の影響も示さなかった。 したがって、結論的に言うと、ここに開示された本発明および実施例は冒頭に 規定された課題および目的を達成するのによく適合している。本発明の精神と範 囲から逸脱せずに、方法および装置に一定の変更を加えることができる。また、 変更が可能であることと、さらに、以下の各請求項で触れられている要素または ステップは基本的に同じ、あるいは同等の方法で基本的に同じ結果を達成するた めのすべての同等の要素またはステップを指すものと理解されるべきである。し たがって、上に述べた課題および目的、およびそれらと本質的に付随した他の課 題および目的を実行、達成するのに良く適合している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 8318−4Ｈ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．CD33蛋白質に対する抗原ドメインに関する結合特性を有する蛋白質と、細胞 成長調整子との接合体によって構成される組成物。 ２．上記結合特性がCD33の細胞外エピトープに関するものである請求項１の組成 物。 ３．上記抗原結合領域が単鎖抗体からのものである請求項１の組成物。 ４．上記抗原結合領域がマウスモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル 抗体からなる群から選択される請求項１の組成物。 ５．上記細胞成長調節子が毒素、細胞毒性薬、細胞成長抑止剤、および生物学的 反応修飾子からなる群から選択される請求項１の組成物。 ６．上記毒素が植物誘導毒素である請求項５の組成物。 ７．上記植物誘導毒素がゲロニン、全長組み替えゲロニンおよびゲロニン・フラ グメントからなる群から選択される請求項６の組成物。 ８．上記毒素が天然の毒素と組み替え毒素からなる群から選択される請求項５の 組成物。 ９．上記接合体が上記抗原結合領域と上記細胞成長調節子との間の融合蛋白質で ある請求項１の組成物。 10．請求項１による医薬組成物。 11．さらに、薬学的に受け入れ可能な基質を含んでいる請 求項１の組成物。 12．請求項11が単一投与（single dose）組成物。 13．CD33蛋白質に対する抗原ドメインに関して結合特性を示す蛋白質と細胞成長 調節子との接合体で構成される用量を上記細胞に投与するステップを含み、上記 腫瘍細胞がCD33抗原蛋白質の表現によって特徴づけられる腫瘍細胞を措置するた めの方法。 14．上記細胞が急性および慢性骨髄白血病、急性および慢性骨髄発育不全症候群 、劇性貧血症、そして未分化細胞性白血病よりなる群から選択される請求項13の 方法。 15．上記組成物が上記細胞の成長速度を遅らせる請求項13の措置法。 16．上記腫瘍細胞がヒトまたはヒト以外の動物のものである請求項13の措置法。