JPH08510649A

JPH08510649A - Ｂｃ２００ｒｎａ、それに対するプローブ及びその使用

Info

Publication number: JPH08510649A
Application number: JP7500945A
Authority: JP
Inventors: ティージ，ヘンリ; ブロシウス，ユルゲン
Original assignee: マウントシナイスクールオブメディシンオブザシティーユニバーシティーオブニューヨーク
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-25
Publication date: 1996-11-12
Also published as: CA2163249A1; EP0701629B1; US5736329A; EP0701629A1; ATE335091T1; DE69434809T2; WO1994028176A2; US5670318A; DE69434809D1; WO1994028176A3

Abstract

(57)【要約】ヌクレオチド１５９で始まるＢＣ２００ＲＮＡの３'末端は配列：UAAGCGUAAC UUCCCUCAAA GCAACAACCC CCCCCCCCCU UU 42 ［配列番号：２］を有する。本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、この配列の少なくとも一部分と相補的であるので、それらはヒトＢＣ２００ＲＮＡに特異的かつ選択的に結合する。これらプローブは、体内でのＢＣ２００ＲＮＡの分布を測定のに及び非神経系組織内での新生物疾患の指標として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ＢＣ２００ＲＮＡ、それに対するプローブ及びその使用発明の背景この出願は、ヒトＢＣ２００ＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ並びに新生物疾患及び神経及び精神障害のスクリーニングにおけるこれらプローブの使用に関する。ＢＣ２００ＲＮＡは、ヒトを含む霊長類の神経系において主に発現される２００ヌクレオチド長の非翻訳性ＲＮＡである。サルの脳からのＢＣ２００ＲＮＡの部分的なヌクレオチド配列がWatsonとSutcliffeによりMolecular & Cellula r Biology7，3324-3327（1987）に報告された。この１３８ヌクレオチド配列は、Ａｌｕ左単量体、つまりヒト及び他の霊長類ゲノム全体にわたって何回も繰り返される配列に実質的な相同性を示した。WatsonとSutcliffeは、この２００ヌクレオチドＲＮＡの残りの部分がポリ（Ａ）領域（poly-（A）tract）に相当すると仮定した。今回、本発明者らはヒトＢＣ２００ＲＮＡの完全な配列を決定し、そしてそのポリヌクレオチドの３'末端が、ゲノム内のＡｌｕ配列の他の部分から邪魔されることなく、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの存在を特異的に検出するのに用いることができる特有な配列を含むことを発見した。更に、本発明者らはＢＣ２００ＲＮＡは生殖細胞以外の正常な非神経系組織内では検出可能な量では存在しないようであるのに、種々の非神経系ヒト腫瘍組織内には一貫して多量に存在することを発見した。従って、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの特有な部分又は対応する染色体ＤＮＡ配列と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを提供するのが本発明の目的である。特に新生物疾患並びに神経及び精神障害のスクリーニングの目的で組織試料中のＢＣ２００ＲＮＡの存在について試験する方法を提供するのが本発明の更なる目的である。組織試料中のＢＣ２００ＲＮＡの存在について試験するのに有用なキットを提供するのが本発明の更なる目的である。発明の要旨ヌクレオチド１５９で始まるＢＣ２００ＲＮＡの３'末端は次の配列：を有する。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、この配列の少なくとも一部分と相補的であるので、それらはヒトＢＣ２００ＲＮＡに特異的かつ選択的に結合する。これらプローブは、体内でのＢＣ２００ＲＮＡの分布を測定するのに、及び非神経系組織内での新生物疾患の指標として有用である。加えて、ＢＣ２００ＲＮＡのヌクレオチド４８及び４９又はＡ豊富（A-rich）領域（１４６〜１４８）のＡ欠如ヌクレオチドに跨がるプローブは、このＲＮＡを検出するのに有用である。図面の簡単な説明図１Ａ及びＢは、種々のヒト組織内でＢＣ２００ＲＮＡを検出するためのノーザンブロット実験の結果を示す。発明の詳細な説明霊長類のＢＣ２００ＲＮＡは、２００ヌクレオチド長の非翻訳性ＲＮＡである。本発明者らは、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの一次配列を次の通りに決定した：１位及び２位のＸは独立にＧであるか又は存在しないかのいずれかである。この一次配列を３つの構造ドメインに細分することができる。ドメインＩはヌクレオチド１〜１２２であって、霊長類のゲノム内で高いコピー数で見出されるＡｌｕ繰り返し要素に実質的に相同性である。しかしながら、この領域は、ＡｌｕにもＳＲＰ−ＲＮＡにも見出されない２つの塩基、即ち４８位及び４９位のヌクレオチドを含み、これらはＢＣ２００配列に特有の増幅用プライマーを生じさせるのに用いることができる。ドメインIIは、ヌクレオチド１２３〜１５８からなるＡ豊富領域である。ドメインIIIは、ヌクレオチド１５９〜２００からなるが、他の既知のヒトの配列に相同性を有さない特有な配列を含有し、これは組織内のＢＣ２００ＲＮＡを同定するのに用いることができる。本発明の１つの側面においては、ヒトＢＣ２００ＲＮＡのドメインIIIの特有な配列に相補的である、即ち次の配列：の少なくとも一部分に相補的である、又は対応する染色体ＤＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブが提供される。かかるプローブは、約１０〜６０塩基を含有する直鎖状オリゴヌクレオチドである。その長さは、ＢＣ２００ＲＮＡとの結合が他のポリヌクレオチドへの結合よりも好ましくなるのに程よい特異性を与えるのに十分なものでなければならない。ここで用いる場合、“オリゴヌクレオチドプローブ”という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブのいずれかをいう。本発明の範囲内に属する１つのプローブは、ＢＣ２００ＲＮＡのヌクレオチド１５６〜１８５に相補的である。この３０ヌクレオチドプローブは次の配列：を有する。もう１つの有用なプローブは、ヌクレオチド１５８〜１７８に相補的な２１ヌクレオチドプローブ、即ち：である。これら２つの例から明らかであろうが、適するプローブは、特異性を得るにの十分な特有なドメインIIIの一部分（即ち、少なくとも約１０塩基）にも相補的であることを条件として、ドメインIIIの外側のＢＣ２００ＲＮＡの部分と相補的であってもよい。プローブは、ドメインIIIの部分にだけ相捕的であってもよい。本発明の更なる側面は、ヌクレオチド１４６〜１４８に跨がるドメインIIの一部分に相補的な第２組のプローブである。これらプローブをＢＣ２００ＲＮＡの検出に用いても、増幅用プライマーとして用いてもよい。本発明のなお更なる側面においては、ＢＣ２００ＲＮＡの４８位及び４９位のような２つの特有なヌクレオチドに跨がるＡｌｕ繰り返し配列の一部分又は対応するＤＮＡに相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズするプローブを用いることができる。かかるプローブの例は、ＢＣ２００ＲＮＡに結合するであろうアンチセンスプローブ：及び対応するＤＮＡ配列に結合するであろうセンスプローブ：である。これらプローブを検出に用いても増幅用プライマーとして用いてもよい。本発明のプローブは、当該技術分野で既知の種々の方法によって作ることができる。例えば、ＲＮＡプローブをin vitro転写により生成させることができる。このアプローチでは、まず、所望の配列を適する転写ベクター（例えば、pBlues cript）内にクローン化する。このベクターを転写が特定の位置で停止するように直鎖状にし、そしてＳＰ６、Ｔ３、又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてかかる直鎖状鋳型からＲＮＡを転写する。反応混合液中に適切な放射標識前駆体を添加することによりこれらプローブを³⁵Ｓ又は³Ｈ標識してもよい。次いで、鋳型ＤＮＡをＤＮase Ｉで消化する。ＲＮＡプローブは、ゲル濾過又はゲル電気泳動により更に精製することができる。プローブをオリゴ標識（oligolabeling）により作ることもできる。もっとも、この方法はより長い核酸ポリマーにより適している。この方法では、まず、二本鎖ＤＮＡを変性する。次いで、ランダム配列オリゴヌクレオチドをＤＮＡの合成に向けられた鋳型についてのプライマーとして用いる。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片がこの用途に頻繁に用いられる。その鋳型がＲＮＡであるなら逆転写酵素を用いてもよい。プローブの標識化は、放射標識ヌクレオチド、例えば、［α−³²Ｐ］ｄＮＴＰを取り込むことにより行われる。プローブを生じさせる他のアプローチはニック翻訳である。この方法では二本鎖ＤＮＡを用いる。ニック（１本の鎖における切れ目）をＤＮase Ｉにより導入する。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを同時に用いてそのＤＮＡの３'末端のニック点にヌクレオチド残基を付加する。放射標識前駆体ヌクレオチドの組み込みでプローブの一様な標識化がもたらされる。プローブは両方の鎖を含有する。一本鎖ＤＮＡプローブは、バクテリオファージＭ１３又は類似のベクターから誘導される鋳型から作ることができる。次いで、その鋳型の特定のセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片と共に用いてその鋳型に相補的な放射標識鎖を生じさせる。このプローブを、例えば変性条件下でゲル電気泳動により精製する。あらゆる所望の配列のオリゴヌクレオチドを化学的に合成することもできる。オリゴヌクレオチドの自動化された合成では固相法が定型的に用いられる。本発明に有用なプローブを標識してもよい。（ｄＮＴＰ前駆体を用いて）ＤＮＡ末端に放射標識を付けるのに種々の酵素を用いることができる。二本鎖ＤＮＡの３'末端は、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いることにより標識することができる。ブラント末端型ＤＮＡ又は凹型３'末端が適切な基質である。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて突き出ている３'末端を標識することもできる。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐ−リン酸基をＤＮＡの５'末端に移すことができる。この反応は一本鎖オリゴヌクレオチドを標識するのに特に有用である。標識核酸及び／又は標識プライマーを適切なクローンからのプローブのＰＣＲ生成に用いるＰＣＲ標識法により、プローブを標識することもできる。Kellyら，Genomics 13：381-388（1992）を参照のこと。本発明のプローブを用いてＢＣ２００ＲＮＡの存在について組織をスクリーニングすることができる。例えば、ヒト網膜内でのＢＣ２００ＲＮＡの分布を測定して、ＢＣ２００ＲＮＡが、網膜の神経節細胞層、内部網状層及び内核層の最内層内で検出されるが網膜のその他の部分では検出されないという結果となった。本発明のプローブを用いて、類似のマッピングが海馬及び新皮質において可能であった。前述のプローブをin situハイブリダイゼーション実験に用いて、本発明者らは、ＢＣ２００発現レベルが老化個体の相当な脳領域において及びアルツハイマー病の脳において変化していることを証明した。幾つかの皮質領域、特にブロードマン領域９及び１７／１８では、ＢＣ２００レベルが年齢と共に減少することが分かった（年齢グループ５０〜９０歳）。アルツハイマー病患者の同じ脳領域では、ＢＣ２００発現の劇的な増加が認められた。従って、ＢＣ２００プローブを用いて、アルツハイマー病と正常な老化とを区別することができる。本発明に従い、ＢＣ２００ＲＮＡの存在について非神経系組織を試験することもできる。本発明者らは、本発明のプローブを用いて、殆どの正常な非神経系組織は検出できるほどの量のＢＣ２００ＲＮＡを含有していないが、種々のヒト腫瘍組織は検出できるＢＣ２００ＲＮＡを発現することを認めた。かくして、本発明の更なる側面は、ＢＣ２００ＲＮＡに対するプローブを用いて新生物疾患をスクリーニングする方法である。このスクリーニング操作の基本的手順は次の段階を包含する：（1）生理試料を得る段階；（2）該試料を処理してＲＮＡ及び／又はＤＮＡをハイブリダイゼーションできるようにする段階；（3）該処理試料をヒトＢＣ２００ＲＮＡのドメインIIIに特異的なプローブとハイブリダイズさせる段階；及び（4）ハイブリダイゼーションの存在について分析する段階。適する生理試料には、生体組織検体、痰の如き体液、頸部又は食道掻き取り片及び皮膚試料が含まれる。神経系組織、例えば、生体組織検体及び死後材料も、神経系障害の評価のためにＢＣ２００ＲＮＡについてスクリーニングすることができる。組織試料を処理するのに用いる方法は、その試料中の核酸をハイブリダイゼーションできるようにすることを条件として臨界的なものではないが、幾つかの特定の選択をすることは注目に値する。チオシアン酸グアニジン法を行ってからＣｓＣｌ密度勾配遠心分離法を行うことによりＲＮＡを直接単離するのが、多くの場合、特に生体組織検体からのＲＮＡの単離に効果的であるといえる（実施例４を参照のこと）。しかしながら、例えば、痰試料におけるように、試料サイズが小さい場合には、ＲＮＡの増幅が望ましいといえる。ＲＮＡの増幅は、まず、試料中の細胞を溶解してＲＮＡをハイブリダイゼーションできるようにすることによって行うことができる。これは、プロテイナーゼ消化と組み合わせて、（1）ＲＮＡをチオシアン酸グアニジニウムで抽出してから塩化セシウム中で遠心分離を行う；（2）ＲＮＡをグアニジン・ＨＣｌ及び有機溶媒で抽出する；又は（3）ＲＮＡを温和な界面活性剤（ＮＰ−４０の如きもの）で抽出することにより行うことができる。これら及びその他のＲＮＡ抽出法は、Sambrookらに記載されている。単離したＲＮＡをｃＤＮＡに転換してからＢＣ２００配列の３'末端に対して選択性のプローブを用いて増幅する（実施例３及び米国特許第４,６８３,２０２号を参照のこと。なお、この米国特許は参照によりここに組み入れられるものとする）。ｃＤＮＡをリガーゼに基づく方法（Ba ranyら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，189-193（1991））又は等温転写に基づく方法（Kwohら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86，1173-1177（1989））を用いて増幅することもできる。次いで、増幅したＤＮＡを本発明による適切なプローブにより直接検出することができる。このハイブリダイゼーションは、核酸をアッセイするための多数の既知操作のいずれかを用いても行うことができる。これらには、種々のブロット技術（即ち、ドット、ノーザン、サザン等）、及び米国特許第４,４８６,５３９号；４,７５１,１７７号；４,８６８,１０５号；４,８９４, ３２５号及びヨーロッパ特許公報第０２３８３３２号（これら全ては参照によりここに組み入れられるものとする）に記載された技術の如きサンドイッチに基づく技術が含まれる。検出を容易にするために、プローブは放射標識、化学発光標識、蛍光標識又は色素標識の如き標識又は固定化部分を有してもよい。検出可能標識又は固定化部分のいずれかとして役立つことができるビオチン又はジゴキシゲニンで修飾されたプローブが特に有用である。本発明のプローブは、ＢＣ２００ＲＮＡについて組織をスクリーニングするためのキットの一部として好適に供給される。このプローブ、又はＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に診断に役立つ反応生成物を生成する他の検出試薬に加えて、そのようなキットは次のものを１又は２以上含むことができる：（1）スクリーニング操作の間に診断に役立つ反応生成物が付着する固体支持体；（2）試料中の核酸を増幅するための増幅用プライマー及び酵素；（3）該診断に役立つ反応生成物と反応してそれを検出できるようにする標識された試薬；及び（4）該生理試料を細胞溶解してＲＮＡをハイブリダイゼーションできるようにするのに有効な溶液。適する増幅用プライマーには、実施例２において同定されたプライマー、並びにＢＣ２００ＲＮＡのドメインIIIが（おそらくドメインII及びＩの部分と一緒であろう）存在する場合にはその増幅をもたらすであろう他のプライマーが含まれる。特に好ましい５'増幅用プライマーは、４８位及び４９位で特有なヌクレオチドを含むＢＣ２００ＲＮＡのドメインＩの部分又は対応するｃＤＮＡに相補的であるプライマーである。適する酵素には、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼが含まれる。本発明は、主として、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いてＢＣ２００ＲＮＡを検出することに関して記載されているが、どのような検出技術を用いても新生物疾患についてのスクリーニングの有益な結果を得られることが理解できるであろう。例えば、ＢＣ２００ＲＮＡに対するＲＮＡ特異性抗体を、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに用いて、組織試料中のＢＣ２００ＲＮＡを検出できるであろう。Uchiumiら，J.Biol．Chem．266：2054-62（1991 ）を参照のこと。ＢＣ２００ＲＮＡとハイブリダイズするペプチド核酸を診断試薬として用いることもできる。Hanveyら，Science 258：1481-1485（1992）を参照のこと。同様に、本発明者らは、ＢＣ２００ＲＮＡがin vivoでタンパク質と複合化してリボヌクレオタンパク質（“ＲＮＰ”）を生成できることを認めた。ＢＣ２００ＲＮＡに特異的な抗体もイムノアッセイ検出スキームに用いることができよう。実施例１ヒトＢＣ２００ＲＮＡ配列の決定 Feramiscoら，J．Biol．Chem．257：11024-11031（1982）の方法に従って、ヒト新皮質から全細胞ＲＮＡ及びポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを単離した。５μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡにポリＡポリメラーゼを用いてＣＴＰでテーリングし、そしてこのＣ−テイルを有するＲＮＡをDeChiaraら，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 84：2624-2628（1987）に記載された通りに二本鎖ｃＤＮＡに転換した。ＥｃｏＲＩアダプター（Pharmacia）を製造業者の使用説明書に従って付け、そして約４００塩基対よりも小さなｃＤＮＡを４％ポリアクリルアミドゲル上で選択した。電気溶離（electro-eluted）ｃＤＮＡを製造業者のマニュアルに従ってλＺＡＰ（Stratagene）内に閉じ込めた。本発明者らは、ラットＢＣｌＲＮＡ（DeChiaraら，1987；Tiedgeら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：2093-2097（ 1991））の最も３'側の６０ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドプローブで３.６×１０⁴のプラークを低ストリンジェンシー（６×ＳＳＣ中で３５℃で最終洗浄；１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７.４である）でスクリーニングした。４クローンを陽性と同定し、それら挿入物（両方の鎖）の配列を酵素的連鎖停止反応（enzymatic chain termin ation reaction）を用いて決定した。Sangerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 7 4：5463-5467（1977）；Toneguzzoら，Biotechniques 6:460-469（1988）。その後、特定のＢＣ２００ＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブでこのライブラリーを再スクリーニングした後、１２の追加のクローンを同定して酵素的連鎖停止法を用いて配列決定し、ドメインＩについての追加の情報を得た。これら全てのクローンに基づいて得られた配列は上に示されている（配列番号：１）。実施例２ＢＣ２００ＲＮＡの増幅ＢＣ２００ＲＮＡの３'及び５'ドメインを別々に増幅した。５’ＢＣ２００配列の増幅については、チオシアン酸グアニジニウム法に続けてフェノール抽出及びＣｓＣｌ遠心分離法を用いて、１μｇの全ＲＮＡをヒト新皮質から単離し、そして製造業者の使用説明書に従って熱安定性ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を用いて第１鎖ｃＤＮＡに転換した。この段階で用いたプライマーはであった。次いで、この生成物の３'末端をｄＴＴＰ及びターミナルトランスフェラーゼ（Boehringer Mannheim）を用いてＴ−テーリングした。次のプライマーを用いてこの有尾ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅（Frohmanら，Proc.Natl．Acad．Sci．U SA 85：8998-9002（1988））を３０サイクル行った（９４℃で３０秒間変性、５５℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長；最初の変性は９４℃で４分間で、最後の伸長は７２℃で１０分間であった）。更に、これら生成物の増幅を第２セットの３０サイクル（条件は上を参照のこと）で、次のアダプタープライマーを用いて行った。ＥｃｏＲＩで消化した後、これらＰＣＲ生成物を製造業者のマニュアルに従ってλＺＡＰII（Stratagene）のＥｃｏＲＩ部位内にクローン化した。１０³のプラークを内部オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングして、６個の陽性クローンを配列決定した。３'ＢＣ２００配列の増幅については、ヒト新皮質からの１０μｇの全ＲＮＡをポリＡポリメラーゼを用いてＡ−テーリングした（DeChiaraら，1987）。次いで、テイルを有するＲＮＡを逆転写酵素でＭｅＨｇＯＨ（Invitrogen）の存在下、次のプライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡに転換した。このプライマーを次のプライマーと組み合わせてＰＣＲ増幅にも用いた（上記参照）。生成物をλＺＡＰII（上記参照）内にクローン化し、そして配列番号：１１で同定した１４クローンを酵素的連鎖停止反応を用いて配列決定した。実施例３ＢＣ２００ＲＮＡ特異性プローブの作成２つのタイプのプローブを定型的に用いた。第１の例では、所望の配列のオリゴデオキシヌクレオチドを化学合成してクロマトグラフィー又はゲル電気泳動により精製した。次いで、このオリゴヌクレオチドを５'末端のリン酸化により放射標識した。これは、γ³²Ｐ標識ＡＴＰで酵素ポリヌクレオチドキナーゼを用いることにより行った。この放射標識プローブ（比活性：＞１０⁸ｃｐｍ／μｇ）をゲル濾過によって未取込み標識から分離して、このプローブを１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの濃度で用いた。第２の例では、ＲＮＡプローブをin vitro転写により生成させた。このアプローチでは、まず所望の配列を適する転写ベクター（例えば、pBluescript）内にクローン化した。次いで、このベクターを（転写が所望の位置で停止するように）直鎖状にし、そしてＲＮＡをかかる直鎖状鋳型からＳＰ６、Ｔ３、又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。³⁵Ｓ−又は³Ｈ−ＵＴＰをこの転写反応の間存在させたので、得られたプローブは³⁵Ｓ又は³Ｈで標識された。次いで、鋳型ＤＮＡをＤＮase Ｉで消化し、タンパク質をフェノール抽出し、そしてそれらプローブをエタノール沈殿させた。ＲＮＡプローブをin situハイブリダイゼーション実験に頻繁に用いた。実施例４ヒト組織におけるＢＣ２００ＲＮＡの評価腫瘍組織自体及び同じ器官からの隣接する正常組織を含むヒト生検材料を得た。腫瘍組織と正常組織とを分離して更なる処理まで凍結した。チオシアン酸グアニジン法をＣｓＣｌ密度勾配遠心分離法と組み合わせて用いて、かかる組織からＲＮＡを抽出した。ノーザンハイブリダイゼーション分析用として、（試料当たり）１０μｇの全ＲＮＡを１.５％アガロースゲル上で２.２Ｍホルムアルデヒドの存在下に泳動した。ＲＮＡをGene Screen膜（NEN）に移してＵＶ照射により固定化した。ＢＣ２００ＲＮＡの特有な３'領域内の３０ヌクレオチドを認識するプローブ（配列番号：３）を用いることによって、かかるブロット上でＢＣ２００ＲＮＡを検出した。ハイブリダイゼーションは４２℃であった。濾紙を０.５×ＳＳＣ、０. １％ＳＤＳ中で５０℃で洗浄して、オートラジオグラフィー用に露光した。これら実験の結果を図１及び図２に示す。図１は、種々の腫瘍及び対応する正常組織内におけるＢＣ２００ＲＮＡ（１Ａ）及び７ＳＬＲＮＡ（１Ｂ；７ＳＬＲＮＡを全ての細胞型により至るところで発現されるコントロールＲＮＡとして追跡した）の発現レベルを明らかにしている。略号：ＨＢ，ヒト脳（正常組織；陽性コントロールとして流した）；ＨＬｕ，ヒト肺（偏平上皮癌）；ＨＭ，ヒト肺転移性黒色腫；ＨＢＴ，ヒト乳癌（腺癌）；ＨＰ，ヒト耳下腺癌；Ｔ，腫瘍組織；Ｎ，同じ器官からの隣接正常組織。図１Ａに示した例において、ＢＣ２００ＲＮＡは非神経系腫瘍組織内で強く発現されると同時に対応する正常組織内では検出できないことに注目のこと。図２には、ＢＣ２００ＲＮＡを発現しない腫瘍の例が含まれている。図２ＡはＢＣ２００ＲＮＡを示し；図２Ｂは７ＳＬＲＮＡを示す。略号：ＨＢ，ヒト脳；ＨＬｕ，ヒト肺（偏平上皮癌）；ＨＬ，ヒト肝臓癌；ＨＢｄ，ヒト膀胱癌；ＨＫ，ヒト腎臓癌；ＨＣ，ヒト結腸癌。insituハイブリダイゼーション実験で、ＢＣ２００陽性腫瘍ではそのＲＮＡは腫瘍細胞により発現され、近傍の非新生物細胞（例えば、ストロマ細胞、炎症細胞）によっては発現されないことが確認された。種々のヒトの腫瘍内でのＢＣ２００ＲＮＡの発現に関するこれら実験データを表１に纏める。記号＋、++及び+++は検出されたＲＮＡの増加レベルを意味するものである。特に注目に値するのは、これらデータの患者対患者の一致性である。つまり、乳腺癌組織では高レベルのＢＣ２００ＲＮＡが異なる５人の患者において発現されることが示された一方で、例えば、結腸腺癌ではこのアッセイで少しも陽性と出なかったことである。このことは、種々の腫瘍及び新生物疾患に対して広いスペクトルマーカーとして働くＢＣ２００ＲＮＡの能力を示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月１２日【補正内容】請求の範囲２．下記配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ。３．下記配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ。４．更に検出可能な標識を含む、請求項２又は３のオリゴヌクレオチドプローブ。５．標識が、放射標識、化学発光標識、蛍光標識又は色素標識である、請求項４のオリゴヌクレオチドプローブ。６．新生物形成の存在について非神経系ヒト組織をスクリーニングする、下記段階：（a）ヒト組織の試験試料を得る段階；（b）該試験試料中のＲＮＡが検出試薬と反応できるように該試験試料を調製する段階；（c）該試験試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に検出可能な反応生成物を生成する条件下で、該検出可能な反応生成物の量が存在するＢＣ２００ＲＮＡの量の指標となるように該試験試料を該検出試薬と混合する段階；（d）生成した検出可能な反応生成物の量を定量する段階；及び（e）該検出可能な反応生成物の量を、正常なヒト組織の対照試料から生成した検出可能な反応生成物の量と比較する段階；を含む方法であって、該対照試料に比べて増加した該試験試料中の検出可能な反応生成物の量が新生物形成の存在と正の相関関係を有する方法。７．検出試薬が、（1）下記配列を有するＤＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、かつ（2）ヒトＢＣ２００ＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブである、請求項６の方法。８．プローブが下記配列を有する、請求項７の方法。９．プローブが下記配列を有する、請求項７の方法。 10．試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在するか否かの確認を容易にするために、検出可能な反応生成物を固定化する、請求項６の方法。 11．プローブが検出可能な標識を含む、請求項７の方法。 12．組織試料中に存在するＲＮＡをＤＮＡに転換する段階、及びＢＣ２００ＲＮＡに対応するＤＮＡ配列が存在する場合にそのＤＮＡの数を増やすために該試料中の該ＤＮＡを選択的に増幅する段階を更に含む方法であって、オリゴヌクレオチドプローブが該増幅ＤＮＡ配列に相補的である、請求項７の方法。 13．下記ヌクレオチド配列を有するヒトＢＣ２００ＲＮＡの一部分に特定のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブであって、該一部分が該ヒトＢＣ２００ＲＮＡ配列の４８残基及び４９残基を含み、かつ前記ハイブリダイゼーション条件下ではＢＣ２００ＲＮＡの外側に存在するＡｌｕ要素又はそのコーディングＤＮＡに実質的にハイブリダイズできないオリゴヌクレオチド 14．プローブが下記配列を有する、請求項13のオリゴヌクレオチドプローブ。 15．プローブが下記配列を有する、請求項13のオリゴヌクレオチドプローブ。 16．下記ヌクレオチド配列を有するヒトＢＣ２００ＲＮＡの一部分に特定のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブであって、該一部分が該ヒトＢＣ２００ＲＮＡ配列の１４６〜１４８残基を含み、かつ前記ハイブリダイゼーション条件下ではＢＣ２００ＲＮＡの外側に存在するポリアデノシン要素又はそのコーディングＤＮＡに実質的にハイブリダイズできないオリゴヌクレ 18．ＢＣ２００ＲＮＡを含有する組織試料を同定するためのキットであって、下記のものを含むキット。（a）該試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に特殊な検出可能な反応生成物を生成する検出試薬；及び（b）該検出可能な反応生成物を固定化するように仕組まれた固体支持体。 20．ＢＣ２００ＲＮＡを含有するヒト組織試料を同定するためのキットであって、下記のものを含むキット。（a）該試料中にＢＣ２００が存在する場合に特殊な検出可能な反応生成物を生成する検出試薬；及び（b）ＢＣ２００ＲＮＡに相補的なＤＮＡの選択的増幅を可能にするのに有効な増幅用プライマー。 21．検出試薬が、（1）下記配列を有するＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、かつ（2）ヒトＢＣ２００ＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブである、請求項18のキット。 22．ＢＣ２００ＲＮＡを含有する組織試料を同定するためのキットであって、下記のものを含むキット。（a）該試料中にＢＣ２００が存在する場合に診断に役立つ反応生成物を生成する検出試薬；及び（b）該診断に役立つ反応生成物と反応してそれを検出できるようにする標識された試薬。 23．検出試薬が、（1）下記配列を有するＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、かつ（2）ヒトＢＣ２００ＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブである、請求項20のキット。 24．（1）下記配列を有するＲＮＡ分子のｃＤＮＡ転写産物にハイブリダイズすることができ、かつ（2）ヒトＢＣ２００ＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブ。 25．アルツハイマー病の存在についてヒト脳組織をスクリーニングする、下記段階：（a）ヒト脳組織の試験試料を患者から得る段階；（b）該試験試料中のＲＮＡが検出試薬と反応できるように該試料を調製する段階；（c）該試験試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に検出可能な反応生成物を生成する条件下で、該検出可能な反応生成物の量が存在するＢＣ２００ＲＮＡの量の指標となるように該試験試料を該検出試薬と混合する段階；（d）生成した検出可能な反応生成物の量を定量する段階；及び（e）該検出可能な反応生成物の量を、同じ操作を正常なヒト脳組織の対照試料に適用したときに生成する検出可能な反応生成物の量と比較する段階；を含む方法であって、該対照試料に比べて増加した該試験試料中の検出可能な反応生成物の量が該患者におけるアルツハイマー病の存在と正の相関関係を有する方法。 26．腺癌の存在についてヒト乳房組織をスクリーニングする、下記段階：（a）ヒト乳房組織の試料を得る段階；（b）該試験試料中のＲＮＡが検出試薬と反応できるように該試験試料を調製する段階；（c）該試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に検出可能な反応生成物を生成する条件下で、該検出可能な反応生成物の量が存在するＢＣ２００ＲＮＡの量の指標となるように該試験試料を該検出試薬と混合する段階；（d）生成した検出可能な反応生成物の量を定量する段階；及び（e）該検出可能な反応生成物の量を、正常なヒト乳房組織のコントロール試料から生成した検出可能な反応生成物の量と比較する段階；を含む方法であって、該コントロール試料に比べて増加した該試験サンプル中の検出可能な反応生成物の量が乳房腺癌の存在と正の相関関係を有する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブロシウス，ユルゲンアメリカ合衆国 10029 ニューヨーク州ニューヨーク，フィフスアヴェニュー 1212番地

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＢＣ２００ＲＮＡの特有なドメインの少なくとも一部分又は対応するＤＮＡ配列と相補的でありかつそれと選択的に結合するオリゴヌクレオチドプローブであって、前記特有なドメインが下記配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ。２．プローブが下記配列を有する、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。３．プローブが下記配列を有する、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。４．更に検出可能な標識を含む、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。５．標識が、放射標識、化学発光標識、蛍光標識又は色素標識である、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。６．ＢＣ２００ＲＮＡの存在についてヒト組織をスクリーニングする下記段階を含む方法。（a）ヒト組織試料を得る段階；（b）該試料を、該試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に診断に役立つ反応生成物を生成する検出試薬と混合する段階；及び（c）該診断に役立つ反応生成物が生成したか否かを確認する段階。７．検出試薬が、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの特有なドメインの少なくとも一部分と相補的でありかつそれと選択的に結合するオリゴヌクレオチドプローブであって、前記特有なドメインが下記配列を有する、請求項６の方法。８．プローブが下記配列を有する、請求項７の方法。９．プローブが下記配列を有する、請求項７の方法。 10．試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在するか否かの確認を容易にするために、診断に役立つ反応生成物を固定化する、請求項６の方法。 11．プローブが検出可能な標識を含む、請求項７の方法。 12．組織試料中に存在するＲＮＡをＤＮＡに転換する段階、及びＢＣ２００ＲＮＡに対応するＤＮＡ配列が存在する場合にそのＤＮＡの数を増やすために該試料中の該ＤＮＡを選択的に増幅する段階を更に含む方法であって、オリゴヌクレオチドプローブが該増幅ＤＮＡ配列に相補的である、請求項７の方法。 13．ヒトＢＣ２００ＲＮＡのＡｌｕ繰り返しドメインの少なくとも一部分又は対応するＤＮＡ配列と相補的でありかつそれと選択的に結合するオリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブが相補的である該Ａｌｕ繰り返しドメインの該一部分が該ヒトＢＣ２００ＲＮＡ配列の４８位及び４９位の塩基を含むオリゴヌクレオチドプローブ。 14．プローブが下記配列を有する、請求項13のオリゴヌクレオチドプローブ。 15．プローブが下記配列を有する、請求項13のオリゴヌクレオチドプローブ。 16．ヒトＢＣ２００ＲＮＡのＡ豊富領域の少なくとも一部分又は対応するＤＮＡ配列と相補的でありかつそれと選択的に結合するオリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブが相補的である該Ａ豊富領域の該一部分が該ヒトＢＣ２００ＲＮＡ配列の１４６〜１４８位の塩基を含むオリゴヌクレオチドプローブ。 17．新生物疾患について非神経系ヒト組織をスクリーニングするための下記段階：（a）組織試料を得る段階；及び（b）該組織試料を分析して該試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在するか否かを確認する段階；を含む方法であって、ＢＣ２００ＲＮＡの存在が新生物疾患の指標となる方法。 18．ＢＣ２００ＲＮＡを含有する組織試料を同定するためのキットであって、下記のものを含むキット。（a）該試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に診断に役立つ反応生成物を生成する検出試薬；及び（b）該診断に役立つ反応生成物を固定化するように仕組まれた固体支持体。 19．検出試薬が、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの特有なドメインの少なくとも一部分又は対応するＤＮＡ配列と相補的でありかつそれと選択的に結合するオリゴヌクレオチドプローブであって、前記特有なドメインが下記配列を有するオリゴヌクレオチドプローブである、請求項16のキット。 20．ＢＣ２００ＲＮＡを含有する組織試料を同定するためのキットであって、下記のものを含むキット。（a）該試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に診断に役立つ反応生成物を生成する検出試薬；及び（b）ＢＣ２００ＲＮＡに相補的なＤＮＡの選択的増幅を可能にするのに有効な増幅用プライマー。 21．検出試薬が、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの特有なドメインの少なくとも一部分又は対応するＤＮＡ配列と相補的でありかつそれと選択的に結合するオリゴヌクレオチドプローブであって、前記特有なドメインが下記配列を有するオリゴヌクレオチドプローブである、請求項18のキット。 22．ＢＣ２００ＲＮＡを含有する組織試料を同定するためのキットであって、下記のものを含むキット。（a）該試料中にＢＣ２００ＲＮＡが存在する場合に診断に役立つ反応生成物を生成する検出試薬；及び（b）該診断に役立つ反応生成物と反応してそれを検出できるようにする標識された試薬。 23．検出試薬が、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの特有なドメインの少なくとも一部分又は対応するＤＮＡ配列と相補的でありかつそれと選択的に結合するオリゴヌクレオチドプローブであって、前記特有なドメインが下記配列を有するオリゴヌクレオチドプローブである、請求項20のキット。