JPH08510898A

JPH08510898A - Ｄｎａ配列の迅速決定方法、並びに配列決定及び診断への適用

Info

Publication number: JPH08510898A
Application number: JP6521768A
Authority: JP
Inventors: ベンシモン，アーロン; ベンシモン，デビッド; クロケット，バンサン; シフォーデル，アルノー
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur
Priority date: 1993-04-06
Filing date: 1994-04-06
Publication date: 1996-11-19
Also published as: CA2160031A1; DE69423346D1; FR2703693B1; FR2703693A1; ATE190357T1; EP0693135B1; WO1994023065A1; EP0693135A1; DE69423346T2; US5866328A

Abstract

(57)【要約】ＤＮＡ又は決定されるべきＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列に相当する二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの各塩基対間の対化又は分離のエネルギーを測定する工程と、前記エネルギーを予め求めた値と比較する工程とを含んでなるＤＮＡ又はＲＮＡ配列の決定方法。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列の迅速決定方法、並びに配列決定及び診断への適用本発明は、特に未知のＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定や、診断のための特異的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出に有用な、核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列の迅速決定方法に関する。ＤＮＡ配列決定は、分子生物学の主要目的であり、ヒトゲノム配列決定プロジェクトの中心をなしている。さらに、生理学的試料中の特異的ＤＮＡ配列の存在を明かにすることは、現在、診断方法の開発の主要ラインを構成している。免疫学的手法の後、現在では、それに変わって、特に抗生物質耐性（Ｎａｔｕｒｅ、１９９２、３５８、第５９１頁参照）、遺伝的異常、遺伝的変性に関連した癌並びにウイルス感染、例えばＨＩＶ又は肝炎ウイルスに関連した感染の危険をを防止するために、ＤＮＡ自体の変性を示す診断方法が注目されつつある。これらの診断方法は、現在では、プローブと試料を直接ハイブリダイゼーションすることによりこの配列の存在を検出する、いわゆる「直接ハイブリダイゼーション」法を含んでなる。この方法は、特に、ゲル及び感光性フィルムへの暴露又は放射性カウントによる検出が必要であるので、めんどうであり且つ不正確である。増幅を用いた方法、特にハイブリダイゼーションにより配列を明かにする前に、最初に、例えばプライマー及びポリメラーゼを用いてＤＮＡの対応部を増幅するＰＣＲ法は、汚染に対して過剰に敏感である。さらに、これらの方法は、所望の配列がプローブの使用を介してのみ認識されるので間接認識システムである欠点を有している。本発明による方法により、必要に応じてハイブリダイゼーション又はヌクレオチド配列を明かにすることができる。したがって、先入観や不明確な点が入り込む余地はない。この重要な進歩は、初めて、例えばプローブを用いて間接的に所望の配列のヌクレオチド構造を明かにするのとほとんど同じ速度で直接的に明かにできることによる。本発明の方法の結果により、２つの相補的配列間のハイブリダイゼーションを、この配列の完全配列決定を要することなく直接的に明かにすることさえも可能である。核酸配列決定は、現在では、生物学者において周知のＳａｎｇｅｒ法により主に実施されている。この方法では、配列決定されるＤＮＡを、まず切断して小さな断片（約５ｋｂ）とした後、細菌株に挿入したプラスミドにクローニングする。このプラスミドを、この菌株で増幅し、抽出する。次に挿入ＤＮＡを、プラスミドプロモーターからコピーする。この転写は、ランダムな数のヌクレオチドを挿入した後中断する。この結果、初期ＤＮＡのすべての可能な中断コピーの集団を生じる。この集団は、数多くのコピーの分子量にしたがったゲル電気泳動により分離される。ＤＮＡに沿ったヌクレオチドの位置は、各ＤＮＡ断片ごとにゲル上で直接読み取られる。この方法は、極めて面倒である。約１５，０００塩基対（１５ｋｂｐ）のＤＮＡの場合、最終工程（プラスミドの抽出後）だけで、一週間かかる。その結果、ＤＮＡの配列決定は、本願の出願日時点で一塩基対当たり約５フランになることが一般的に言われている。物理的及び電子処理に基づく本発明による方法は、化学的又は生物学的である現在の手法とは異なる。本発明の方法の利点は、非常に多い。１）短い配列も、極めて長い遺伝子（１０ｋｂｐを超える）の配列も現在の方法の場合のように小さく断片化する必要なく同様に十分に配列決定できる。２）１０，０００倍速い。現在の生物学的方法では、一週間で１５，０００塩基が配列決定できる。本発明の方法は、約１００塩基を１秒、即ち、一週間で６０，０００，０００塩基を配列決定できる。３）ＤＮＡの必要量が、極めて少ない。４）容易に適合され、自由度が大きい。５）容易に自動化でき、配列決定信号がコンピュータにより直接処理できる。６）長くて面倒な生化学的操作を必要としないので、現在の手法よりもはるかに安価であることができる。配列決定時間がコストの決定的部分であるので、本発明の方法は、少なくとも１，０００倍安価なはずである。本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の決定方法であって、二本鎖ＤＮＡ又は決定されるべきＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列に相当する二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの各塩基対間の対化（pairing）又は不対化（分離：unpairing）のエネルギーを測定し、このエネルギーを予め求めた値と比較することを特徴とする方法に関する。この方法には、いくつかの実施態様がある。第一の実施態様では、各測定エネルギーに、対応の隣接塩基の存在下での塩基対に相当する予め求めた値を当てはめることができる。これにより、当該ＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレオチド配列が再構築される。本発明の方法の第二の実施態様では、公知の配列の存在を明かにすることが求められる。この場合、この所望の配列の必須要件は、その「フィンガープリントを作成するために、簡単に決定できることであり、次に決定されるＤＮＡ又はＲＮＡ試料が同じフィンガープリントを有するかどうかを確認するだけで十分である。本発明の方法の第三の実施態様では、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを不対化するのに必要とされる総エネルギーを測定し、この総エネルギーを、十分に対化された同じ配列に相当するこのエネルギーの限界値と比較することにより、不対化のエネルギーが限界値未満である十分に対化されていないＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を排除できる。当該「フィンガープリント」は、「総フィンガープリント」又は信号と称される。本発明の方法の後者の２つの実施態様は、よりとりわけ診断用、即ち、公知の配列が存在するか存在しないかを明かにするすることを意図するのに対して、第一の実施態様は、よりとりわけ配列決定に使用することを意図する。「対化又は不対化のエネルギー」は、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの２つの相補的鎖について対化される２つの塩基対を分離するか、再形成（「再対化）により回復するのに必要とするエネルギーを実質的に示すことが理解される。本発明は、迅速且つ正確に二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各塩基対の結合力を測定し、そして特定の配列をこれらの値の各々に割り当てることができることの実証に基づいている。上記結合力は、単に当該塩基対に依存するだけでなく、その環境、特に隣接塩基に依存し、且つ場合によっては、対化又は不対化が起きる実験条件にも依存する。実際、ＤＮＡは、核酸アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる二本鎖により形成される二重らせんであり、この結合は、一方では塩基対アデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）−２結合−及び対グアニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）−３結合 −；並びに一方では、異なる塩基対の積層エネルギーによる結合により生じる。表１に、ＤＮＡに関する対応のエネルギーの観念を示す。これらのエネルギーは、塩基対及び隣接塩基によって顕著に異なることが分かる。この表に示した結果は、２つの隣接塩基から形成されたダイマーを不対化するための測定エネルギーに相当する。また、Ｗ．Ｓａｅｎｇｅｒ（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１９８８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ発行）による研究も参照できる。表における矢印は、ＤＮＡの読取り方向を表す。本発明の方法には、２つの本質的な変更態様がある。第一の実施態様では、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各塩基対間の不対化のエネルギーを、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各鎖の少なくとも一つの塩基を支持体に付着させ、かつ各塩基対が次々に引き離されるように支持体を移動させるとともに、不対化に必要とされるエネルギーを各不対化について測定し、かつこのエネルギーを予め求めた値と比較することにより求める。第二の実施態様では、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各塩基対間の対化のエネルギーを、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各鎖の少なくとも一つの塩基を支持体に付着させ、かつ各塩基対が対化するように支持体を一緒にするとともに、対化に必要とされるエネルギーを各対化について測定し、かつこのエネルギーを予め求めた値と比較することにより求める。少なくとも一つの塩基による支持体への各ＤＮＡ鎖の付着は、前記塩基を前記支持体に直接付着させることにより実施できるだけでなく、例えば、ペプチド又は不活性炭素鎖であることができるアームを介して間接的に付着させることにより前記支持体の表面に関連した影響を回避することもできる。また、ＤＮＡ又はＲＮＡのセグメンをいくつかの塩基により支持体に付着することもできる。最後に、ＤＮＡの各鎖を隣接塩基によって付着することが好ましいであろうが、ある場合には、とりわけ「総フィンガープリント」に相当する信号のみが求められるときには、各ＤＮＡ鎖を、反対末端に位置する塩基により付着してもよい。当然のことながら、用語「対化又は不対化のエネルギー」を使用する時には、このエネルギーを、直接的にか、変数により間接的に求めることになることが理解されなければならない。後者は、特に対化又は不対化の力（特に重力又は磁力）又は時間若しくは温度であることができる。これらの変数のいくつかは、バネ又は膜の移動に関連させるか、ある場合には電気的若しくは磁気的パラメータの変化に関連させることができる。もし二本鎖ＤＮＡを本発明の面から概略して表すことが望まれるのならば、それを開く(opened)（又は閉じる(closed)）とともに、各要素に関して不対化（又は対化）に使用されるエネルギーを測定する「ジッパー」にたとえることができる。本発明による方法は、種々の用途に使用できる。まず最初に、未知の核酸の直接配列決定に使用できる。この場合、対化及び不対化のエネルギーの予め求めた値を、それらの環境に準じて各塩基対について予め測定し、次いで、可能性のある塩基の一つを、測定エネルギーに応じて各不対化又は対化に直接割り当てる。この種の配列決定では、二本鎖を引き離した後、再びそれらを再対化し、その後再び結合エネルギーの値を測定してデータを蓄積することにより、バックグランドを減少させることが有利である。また、再対化を容易にするために、二本鎖ＤＮＡに自由端を引き離す前に共有的又は疑似共有的に互いに結合するように構成して、特に対化と不対化のサイクルを行い、したがって、信号／ノイズ比を向上させることができるようにすることも可能である。二本鎖ＤＮＡの自由端を互いに結合することができる手法は公知であり、その一部を、以下でより詳細に説明する。また、本発明の方法は、診断目的に使用して、特に探索している異常に相当するＤＮＡの可変領域の配列決定をすることもできる。この手法は、配列決定について上記したものと同様である。しかしながら、力の値を、「フィンガープリント」又は信号の形態で記録し、塩基の順序及び性質を特別に測定することなく、探索しているフィンガープリント又は信号と比較する簡略化した手法を使用することもできる。もし探索しているフィンガープリントが異常の存在と対応するならば、他のいずれのフィンガープリントは陰性であると考えられ、これに対して、正常のＤＮＡに対応するフィンガープリントを採用して、他のフィンガープリントはいずれも陽性であると考えることもできる。診断目的の場合、上記した方法のより簡単な変更態様を使用できる。この場合、塩基対の不対化に必要なエネルギーを順次測定することはせず、２つのハイブリダイゼーションしたセグメントをこれらの末端を引っ張りながら不対化するのに必要とする総エネルギーを測定する。このために、ＤＮＡ／ＲＮＡ試料に求められる標的配列に相補のプローブを、支持体に公知の方法によりグラフトする。次に、試料の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡをプローブとハイブリダイゼーションし、その後、その末端の一つを、適当な第二表面（例えば、磁気ビーズにストレプトアビジンをコートして、前にビオチニル化ＤＮＡとの疑似共有結合を可能にしたもの）に固定する。２つのハイブリダイゼーションしたセグメントを「引き離す」のに必要とする総エネルギーは、ハイブリダイゼーションの同定を可能とする「フィンガープリント」として役立つ。本方法の実施は、特に、以下の説明から明かとなるであろう力を直接測定できるアトミックフォース顕微鏡（atomic force micrscope：ＡＦＭ）の存在により可能となった。アトミックフォース顕微鏡（ＡＦＭ）は、種々の会社（Ｐａｒｋ、Ｄｉｇｉｔａｌ等）から市販されている装置であり、一般的に、レバーの端部に配置した極めて微細な先端部で走査することにより表面を視覚化するのに使用される。即ち、ＤＮＡを引っ張り、加わる力を測定するための最も簡単な手段は、アトミックフォース顕微鏡（ＡＦＭ）を使用することにある。この場合、ＤＮＡ分子の末端の一方をＡＦＭの先端部かレバーに付着させ、他端を、ＡＦＭの可動圧電管にしっかりと固定した試料取り付け台表面に連結する。ＤＮＡを表面に付着することを可能とするこれらの方法は公知であり、使用できる方法の一部を、以下で再び触れる。Ｂｕｓｔａｍｅｎｔｅ等は、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２、第２５８巻、第１１２２頁）に、粘性及び磁力に基づいたＤＮＡを伸長する異なる手段を用いた二本鎖ＤＮＡの弾性を測定する方法を記載している。この方法では、２つのＤＮＡ鎖が分離せず、そして空間的分解能が不十分（１ミクロンのオーダー）であることから、この方法の原理をそのまま配列決定に適用できない。ＡＦＭの管に印加される電圧を変更することにより、管が移動し、したがって、もしＤＮＡを予めレバーに一方を付着させ、他方を支持体に付着させておくならば、それでＤＮＡの末端の一方を引っ張ることができる。対化塩基に課するけん引力がＡＦＭのレバーに伝達され、そのたわみにより、この力を正確に測定できる。ＡＦＭのレバーの典型的な弾性定数が約３ｘ１０^-2Ｎ／ｍであり、そしてレバーのたわみの測定における正確さが、例えば０．２オングストロームに到達できるので、測定力の精度は鎖間対化力（水素結合により生じる）よりも約１００倍低い０．６ｘ１０^-12Ｎよりもよい。これについては、Ｊ．Ｎ．Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ（ＩｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＳｕｒｆａｃｅＦｏｒｃｅ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ発行、１９８５）に記載の論文を参照できる。ＡＦＭはこの種の力を測定するための有用な道具であるが、必須ではなく、容量性検出法等の力測定のいずれか他の感受性法により置き換えるか、磁気浮揚による方法により置き換えてもよい。後者の方法による力の測定は、Ｂ．Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｍａｎｕｅｌ、Ｅｕｒｏｐｈｙｓ．Ｃｏｎｆ．１４Ｃ、Ｃ３４、１９９０）により記載されている。以下の説明は、ＡＦＭについて行うが、いずれか他の装置に適合させてもよい。ＤＮＡ分子に沿った塩基対の周期性は３．４オングストロームであり、疑似効果の影響を制限できる。ＤＮＡ鎖の２つの隣接末端を引っ張ると、測定力は、ＤＮＡにおける核酸の配列に反映する鎖間結合力により変調された周期成分（周期約６．８オングストローム）を有するであろう。したがって、この周期成分は、公知のＤＮＡ又はＲＮＡ配列でのこれらの変調の校正後ＤＮＡの配列決定に使用できるだけでなく、疑似効果を除去できる。実際、レバーのけん引力は、ＤＮＡの巻き戻しによるけん引力に加えて、種々の疑似効果（例えば、レバーと表面との間のファンデルワールス力等）に依存する。しかしながら、レバー上のＤＮＡ分子のけん引力のみは、周期約６．８オングストロームで周期的である。信号濾過法により、種々の周波数を有する疑似効果を除去できる。公知のＤＮＡ配列について測定した力信号を一度だけ校正することにより、周期力の振幅とＤＮＡ配列との間の対応が確立される。次に、周期信号の振幅を使用して、未知のＤＮＡ断片の配列決定できる。けん引サイクルの最後で、分子は表面に固定されたままであるので、２つの鎖を一緒にした時（「ジッパーを閉じる」）の塩基対の再対化に由来する周期力信号を測定することもできる。即ち、伸張／一緒にする（けん引／緩和）のサイクルを反復することにより、信号／ノイズ比及び配列決定の信頼性を向上できる。最後に、上記で指摘したように、利用するエネルギーを変化させるために、方法の実施条件、とりわけ対化及び不対化が起こる媒体の条件を変化させることが可能である。即ち、ｐＨ、温度、イオン強度又は添加する生成物の性質を変更することにより、同じ塩基対に利用されるエネルギーの値を変更することができる。この場合、勿論、校正のために同じ条件下で参照測定を行うことが必要のことがある。しかしながら、ある場合には、校正値は、計算、又はノモグラム若しくは表を用いて得ることもできる。ＤＮＡを表面又は支持体に付着するために、当該技術分野において公知の方法のいずれかを使用することができる。これらの方法は、実質的に２つの方法に分類できる。１）直接法この方法では、ＤＮＡは、支持体、例えばＡＦＭの先端部に直接固定された状態になる。これには、この表面の機能化、例えば、ＤＮＡの機能化末端と反応できるストレプトアビジン、ＣＯＯＨ基等による表面のコートによる機能化が含まれる。２）間接法ＤＮＡを、粒子、例えば適当な粉末又はミクロビーズ（適当な場合には、磁性）に固定し、次いでそれ自体を、支持体、例えばＡＦＭのレバーに連結する。この連結を可能にする方法の一つは、レバーの磁化からなる。これは、種々の直接法か、小さな磁石をその端部に粘着させることにより行うことができる。間接法により、特に可逆カップリングが可能となる。十分激しく引っ張ると、ミクロビーズがレバーから分離され、レバーは自由になって新たなミクロビーズをカップリングできる。この方法により、ＤＮＡ分子を次々と測定表面（ＡＦＭのレバー）にカップリングする（可逆的に）ことにより、ＤＮＡ分子（すでに可動性支持体に固定されている）の不均一集団を連続して配列決定するか試験できる。直接法では、一般的に、ＤＮＡ又はＲＮＡ、とりわけ３´及び５´端機能化すること、即ち、それらに適当な化学基をグラフトすることが必要である。さらに、ループにより分子の他の２つの自由端を接合して、鎖が操作の終りで分離するのを防止することにより、必要に応じて後者を反復できるようにするのが好ましい。このために、異なる方法を採用できる。最も簡単なのは、合成オリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡの末端の一つを、２つの異なる官能基（例えば、ビオチン及びアミン）で官能化して、２つの異なる前処理表面に固定できるようにすることである。二本鎖の他端を、ループの形態で部分的に対化された合成ヌクレオチドを用いて結合してよい。このように、対化した一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡから生成できる（第２ａ図参照）。この方法の利点は、（遺伝子又は染色体の分別化により得られるような）大きなＤＮＡ断片の不均一集団を機能化する能力による。これにより、同時分析が可能となる。この場合、ＤＮＡ試料を、全ての断片で同じである末端に２つの異なる制限部位を有する副集団を得ることを可能にする二種（又はそれ以上）の制限酵素を用いて分別化する。これにより、２つの末端が異なるように処理（例えば、末端に適当な制限部位を有するループの形態のオリゴヌクレオチドによりそのうちの一つを接合することにより）できる。この方法の欠点は、２つの隣接官能基間の立体干渉である。これにより、表面のカップリングが困難となる。この問題は、以下の方法により解決できる：二本鎖ＤＮＡ（ここでは、ａ／ａ´で表す）を、第２（ｂ）図に概略示すように、鎖の末端に相補的オリゴヌクレオチドを付加することにより、ダイマーａａ／ａ´ａに転化する。このために、２つのＤＮＡ集団ａ／ａ´が考えられる。一つには、鎖ａの５´端を反応基Ａで官能化し、その３´端をオリゴヌクレオチドｂで官能化する。他では、鎖ａ´の３´端をＡとは異なる反応基Ｂで官能化し、その５´端をｂ：ｂ´に相補的なオリゴヌクレオチドで官能化する。これらの２つの集団のハイブリダイゼーション及び結合により、ＤＮＡａｂａ´／ａ´ｂ´ ａを生成する。このうちの鎖（ａｂａ´）の一つはその末端の両方で２つの異なる反応基Ａ及びＢで官能化されており、２つの異なる表面に固定できる。前記の方法と同様の構成を得るためには、二本鎖（ａａ´及びａ´ａ）を、例えば、ＤＮＡを変性することにより分離しなければならない。一本鎖ＤＮＡ（ａａ´）（両方の表面にカップリングしている）のダイマーの２半分は相補的であるので（構成により）、最初のＤＮＡ（ａ／ａ´）と同様に自然に対化する（第１（ａ）図参照）。表面の一つを動かすことにより、ＤＮＡを解き（「ジッパーを開く」）、他の表面に加わった固定した力を測定する。実際の固定法に関して、数多くの手法があり、これらは、巨大分子（タンパク質、ＤＮＡ等）を市販の前処理表面に固定するための手法に由来する。これらの手法のほとんどは、免疫試験用に開発され、タンパク質（イムノグロブリン）を、タンパク質のカルボキシル（−ＣＯＯＨ）又はアミン（−ＮＨ₂）末端と反応できる表面担持基（−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＯＨ等）に連結する。ＤＮＡの共有固定は、第二アミン（Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨｓｕｒｆａｃｅ、ストラスブール、Ｐｏｌｙａｂｏ製）と反応して共有結合を形成できる分子の５´端の自由ホスフェートを介して、直接達成できる。また、ＤＮＡをアミン基で官能化した後、タンパク質と同様にすることもできる。また、ストレプトアビジンとビオチニル化ＤＮＡ分子とを疑似共有固定できるストレプトアビジンコート表面（Ｄｙｎａｌビーズ等）もある。最後に、ジゴキシゲニンに対する抗体を表面にグラフトすることにより（上記した方法により）、ジゴキシゲニンで官能化したＤＮＡを、そこに固定できる。この方法は、数多くの可能な固定法の一例にすぎない。付着及び固定法には、例えば、セルロース等の固体支持体にＤＮＡを付着させるための酵素的カップリングを用いたＥＰ特許第１５２，８８６号に記載されている手法も挙げられる。ＥＰ特許第１４６，８１５号にも、支持体にＤＮＡを付着させる種々の方法が記載されている。同様に、ＷＯ９２／１６６５９は、ＤＮＡを付着するためにポリマーを用いる方法を提案している。当然のことながら、ＤＮＡを支持体に直接付着してよいが、必要に応じて、とりわけ表面の影響を制限するために、例えばＥＰ特許第３２９，１９８号に記載されているように、ＤＮＡをペプチド又は他のものの不活性アームの端部に付着してよい。また、本発明は、以下の構成要素の一つ以上を含む診断キットにも関する： −公知のヌクレオチド配列（又は「プライマー」）であって、前記配列のすべて又は一部分を含有する試験一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、ストリンジェント条件下、他の核酸を含有するかまたは前記非ハイブリダイゼーション性核酸を分離した後の反応媒体中でハイブリダイゼーションすることができる公知のヌクレオチド配列（又は「プライマー」）、 −試料において求められているハイブリダイゼーション可能配列からなる参照標準要素としての二本鎖形態のＤＮＡ又はＲＮＡ、 −試験試料のＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はプライマーのＤＮＡ若しくはＲＮＡ（「公知のヌクレオチド配列」）が付着できる支持体、 −少なくとも一種の制限酵素、 −試験ＤＮＡ又はＲＮＡの末端を機能化するためのオリゴヌクレオチド、又はすでに官能化されたプライマー、 −ハイブリダイゼーションされるＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はプライマーの官能化末端に付着できる表面。また、本発明は、本発明の方法を校正するのに有用である中間体にも関する。この中間体は、通常隣接５´及び３´端が、一つの場合においてループの形態でオリゴヌクレオチドにより共有的又は疑似共有的に結合され、他方の場合に１つ以上の別個の固体支持体に結合されている二本鎖ＤＮＡである。以下の例により、本発明の他の特徴及び利点が明かになるであろう：添付図面において：第１図は、アトミックフォース顕微鏡を用いた方法を示す図である。第２図は、末端基でＤＮＡを官能化する２つの方法の概略図である。第３図は、ファージλＤＮＡに適用した２（ｂ）に記載のＤＮＡダイマーの構成の概略図である。第４図は、基質上約３と３μｍ間形成された磁気像である。像の底部の白色ビーズは直接接触（磁気引力）なしに観察され、一方、上部の黒色ビーズは直接接触（接触の反発力）により観察される。像化ビーズは、直径２．８μｍである。第５図は、ビーズ（ａ）又は未反応基質（ｂ）の中心に対して垂直に力センサーを用いた手法を示す。磁場を印加する。各グラフにおいて、連続した曲線は、基質から数ミクロン離れた位置からの手法を表す。点で表した曲線は、リターンを表す。（ａ）において、磁気引力は、自体、曲線が大きく上に上昇する形で現れる。（ａ）及び（ｂ）において、反発力（接触による）は、自体、力の値が急速に低下する形で現れる。第６図は、５分をわずかに超えるビーズの中心の運動を示す。上は、観察平面における運動であり、下は、Ｘにおけるビーズの位置の経時的タイムコースである。第７図は、アトミックフォース顕微鏡を用いた伸張によるλＤＮＡ分子の伸張図である。分子をほとんど完全に伸張した時、数ｎＮのオーダーの力が加わってから破断する。実施例１本実施例では、選択されるＤＮＡは、ファージλＤＮＡ（λＤＮＡ）であり、このλＤＮＡは４８５０２塩基対を含んでなり、この配列は公知である。このＤＮＡの二本鎖ａ及びａ´は、その線状（オープン）形態において、５´端に１２不対塩基を有する。このＤＮＡの末端は、第３図に概略して示すように、容易に官能化できる。このＤＮＡの不対末端に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、鎖ａの５´端と、相補鎖ａ´の３´端は、一方の場合ではビオチニル化され、他方の場合ではアミノ化される。次に、合成オリゴヌクレオチドｂ及びｂ´（これらのＤＮＡの自由端に部分的に相補的）を、対化し連結する。最後に、二つのＤＮＡを、ハイブリダイゼーションし連結する。オリゴヌクレオチドを太字で示し、それらの配列をイタリックで示す。これを行った後、官能化ＤＮＡを、前処理したポリスチレンビーズ（主に、商品名（Ｅｓｔａｐｏｒ）でＤｙｎａｌ及びＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃにより市販されている）の表面に（ビオチン、アミン又はジゴキシゲニン基を介して）固定する。後者に、下記の材料と方法において記載するように、ビオチンに対して疑似共有結合親和性を有するストレプトアビジンか、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）に対する別の抗体との結合を可能にするモノクローナル抗体か、あるいはアミン基（ＮＨ₂）と共有結合を形成するカルボキシル基（ＣＯＯＨ）でコートする。第１図に概略して示すように、ＤＮＡダイマー（ａａ´）の一本鎖を引っ張るために、その末端の一方を、アミン基Ａでの官能化による連結を介して、前処理した平坦面αに固定し、他端は、ストレプトアビジンコートＤｙｎａｌ磁気ビーズＢに固定する。ＡＦＭのレバーの末端に粘着した小さな磁石により、レバーとＤｙｎａｌビーズとの間の結合が維持される。二本鎖ａ及びａ´は相補的であるので、これらは部分的に対化する。表面αは速度ｖで駆動され、ＤＮＡについてのけん引力を、バネとして作用する表面βのたわみにより測定する（例えば、ＡＦＭのレバー）。ＤＮＡの塩基は、点Ｅで不対である。移動と力の測定は、ＡＦＭにより行うことができる。実施例２材料と方法 λＤＮＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ製である。ファージラムダＤＮＡのｃｏｓ端に相補的なオリゴヌクレオチドを、合成した（オリゴ１：５´−ＡＧＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣ−３´ １２−ｍｅｒ；オリゴ２：５´−ＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴ−３´ １２−ｍｅr）。使用する全ての酵素は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ及びＢｉｏ−Ｌａｂｓ製である。³² Ｐヌクレオチドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ製である。全ての磁気ビーズは、Ｄｙｎａｌ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０ストレプトアビジン：ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ-４５０ヒツジ抗ネズミＩｇＧ）製である。ラテックス粒子は、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ（Ｅｓｔａｐｏｒ）製である。抗ＤＩＧイムノグロブリン（モノクローナル抗体）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ製である。ＣｏｖａｌｉｎｋＮＨモジュールは、Ｎｕｎｃ製であり、異なるバッチのプレートを用いた。全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ製である。標識物質は、Ｐ−６スピンカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で精製した。ＤＮＡの末端の官能化 λＤＮＡ分子の二末端を異なる方法で官能化するために、以下の方法を用いた。１）分子の末端のクレノー断片での標識 λＤＮＡ０．０８ｎｍｏｌ（２．５μｇ）を、その末端で、ビオチン−ｄＵＴＰ（又はＤｉｇ−ｄＵＴＰ又はアミノ−ｄＵＴＰ）２ｎｍｏｌおよび放射性ヌクレオチド、ｄＣＴＰ又はｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、クレノー断片２単位を用いて標識し、異なる反応の収率を評価する。反応は、末端の標識に標準の条件下で行う。標識ＤＮＡは、スピンカラムにより、遊離ヌクレオチドから精製する。標識ＤＮＡを、制限酵素ＫＡＳ１４単位により３７℃で４〜６時間断片化して、２断片とする。２つの断片を、１．５％低融点アガロースで分離し、溶離し、Ｅｌｕｔｉｐカラムで濃縮した。これにより得られた断片は、二種の異なる末端を有している（一つは５´−ホスフェートを有し、別の末端は３´端近くにビオチン、ＤＩＧ又はアミノ基を有する）。これらは、下記で説明するようにして活性表面に結合するか、２つの断片を結合（一つをビオチン（例えば）末端と、他方は他末端のＤＩＧ基と）することによりダイマー構築に用いることができる。２）変性オリゴヌクレオチドによる末端の標識 λＤＮＡの２つのｃｏｓ末端に相同のオリゴヌクレオチド１０ｎｍｏｌを、それらの末端で変性する。全てのオリゴヌクレオチドを、キナーゼ反応により５´ 端でリン酸化する。オリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌを、３７℃で３〜４時間、ＡＴＰ（γ−ＡＴＰ³²−３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ１６ｐｍｏｌで放射性標識）２００ｎｍｏｌおよびＴ₄ポリヌクレオチドキナーゼ１０μｌの存在下でインキュベーションする。５´端をリン酸化したこれらのオリゴヌクレオチドを、スピンカラムにより遊離ヌクレオチドから精製する。つぎに、これらの３´端を、ビオチン−ｄＵＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ又はアミノ−ｄＵＰＴを組み込むことにより変更した。５´端をリン酸化したオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌを、３７℃で１〜２時間、ビオチン−ｄＵＴＰ、（ＤＩＧ−ＵＴＰ又はアミノ−ｄＵＴＰ）１０ｎｍｏｌと、デオキシトランスフェラーゼ末端酵素２単位の存在下でインキュベーションする。変更オリゴヌクレオチドを、スピンカラムにより、遊離ヌクレオチドから精製する。これらの変更オリゴヌクレオチド２ｐｍｏlを、Ｔ₄リガーゼ５単位の存在下で、１６℃で１２時間、反応容積２００μｌで連結する。未連結オリゴヌクレオチドを、酢酸アンモニウム／イソプロパノール混合物中で２回逐次析出させることにより、標識ＤＮＡから分離する。ＤＮＡを、冷７０％エタノールで清浄にし、 ”ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ”で乾燥し、蒸留水に懸濁した。表面の固定上記した官能化ＤＮＡは、市販の前処理表面と反応できる４つの異なる官能基（５´ホスフェート、ビオチン、ＤＩＧ及びＮＨ₂）を有することができる。１）ストレプトアビジンコート表面へのビオチン基の固定ストレプトアビジンコートＤｙｎａｌＭ−２８０を、１ｘＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄する。これらのビーズを、Ｄｙｎａｌ磁気粒子コンセントレータで集め、ＴE溶液＋ＮａＣｌ２ｍｏｌに再懸濁し、変性ＤＮＡ（ＤＮＡ分子／ビーズ比が異なる）とともに、室温で１〜２時間ローテータ中でインキュベーションする。２）抗ＤＩＧコート表面へのＤＩＧの固定ヒツジ抗マウスＩｇＧでコートしたＤｙｎａｌＭ−４５０を、Ｄｙｎａｌにより供給された情報に準じて清浄にする。ビーズ溶液１００ｍｌ（約４ｘ１０⁷ビーズ）を、抗ＤＩＧＩｇＧ（約１０^-10ｍｏｌ）１０μｇとともに、ローテータ中、４℃で１２時間インキュベーションする。これらのビーズを、次にＰＢＳ／ＢＳＡ溶液で清浄にし、ＰＢＳに再懸濁する。ＤＩＧ標識ＤＮＡを、次にビーズ（比が異なる）とともに、ローテータ中で室温で４時間インキュベーションする。３）ＣＯＯＨ酸表面へのアミノ基の固定ＣＯＯＨＥｓｔａｐｏｒラテックス粒子（粒径１．１及び２μｍ）を、蒸留水で遠心分離により２回清浄にし、３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＣＤＩ）で再活性化する。この工程を、清浄化ビーズ０．１ｍｌを、ＣＤ１０．１ｍｇとともに、５０℃で１時間インキュベーションすることにより行う。再活性化粒子を、モルホリノエタン硫酸［ｌａｃｕｎａ］（ＭＥＳ）の０．０５ｍｏｌ溶液ｐＨ５．５で遠心分離することにより３回清浄にする。沈殿ビーズを、ＴＰＧ（ＮａＨ₂ＰＯ₄．２Ｈ₂Ｏ０．０５ｍｏｌ；ＮａＣｌ０．１％；ゼラチン２％；ｐＨ６．６）１００μｌに再懸濁する。ビーズは、次にタンパク質に存在するアミノ基及び変性ＤＮＡのアミノ基と共有結合を形成できる。ラテックス溶液（約１０⁹ビーズ）１００μｌを、アビジン０．５ｍｇ（又はプロテインＡ０．５ｍｇ又はアミノ変性オリゴ２０．２５ｐｍｏｌ）の存在下、５０℃、１時間インキュベーション後、室温で１２時間回転を継続する。連結ビーズを、次にＴＰＧ緩衝液で３回清浄にし、ＴＰＧ１００ μｌに再懸濁し、４℃で維持する。アビジンコートビーズを、上記したようにして、ビオチン変性ＤＮＡに連結する。プロテインＡコートビーズを、抗体０．１ｍｇ／ｍｌとともに、室温、１２時間でインキュベーションすることにより、抗ＤＩＧＩｇＧでコートする。最後に、上記したようにして、ＤＩＧ変性ＤＮＡと連結する。４）第二アミン（ＮＨ）（ＮｕｎｃＣｏｖａｌｉｎｋモジュール）で活性化した表面への５´リン酸基の固定異なる量のλＤＮＡ（５０ｎｇ〜０．００５ｎｇ）を、１−メチルイミダゾール（１−ＭｅＩＭ）１０ｍｍｏｌ溶液７５μｌと０．２Ｍ１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）２５μｌに溶解する。この溶液を、ＮｕｎｃＣｏｖａｌｉｎｋｓウエルに導入する。モジュールを、５０ ℃で５〜６時間インキュベーションした後、５ｘＳＳＣ、０．２５％ＳＤＳ溶液（５０℃に予備加熱）で３回清浄にし、０．１ｘＴＥで３回清浄にする。ウエルの表面での予備活性ビーズの非特異的結合を回避するために、０．１％ＢＳＡ溶液を添加し、室温で１２時間インキュベーションする。ウエルを、０．１ｘＴＥで３〜５回清浄にする。ビオチン標識ＤＮＡを、ＮａＯＨ溶液０．２５ｍｏｌ中で変性して、ビオチン３´端を遊離させる。次いでストレプトアビジンコートＭ−２８０ビーズを、次に添加してビオチン末端と連結させて、室温で０．５時間インキュベーションする。未連結ビーズを、磁気的手段で採取する。５ ´ホスフェート末端によりウエルの表面に連結し、ビオチン標識３´端によりビーズ表面に連結したＤＮＡは、この時点では、操作のため近くにある。レバーの磁化結合したＭ−２８０常磁性ビーズを選択的に回収するために、ＡＦＭレバーを、以下のようにして磁化する：ミクロマニピュレータ（Ｌｅｉｔｚ）の端部および顕微鏡（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−ＪｕｎｇＰｏｌｙｖａｒ）下でミクロピペットを用いて、紫外線硬化接着剤（ＮｏｒｌａｎｄＯｐｔｉｃａｌＡｄｈｅｓｉｖｅ）の小一滴を、ＡＦＭ（Ｐａｒｋ）片持ち梁（cantilever）の先端に付着させた。小磁気粒子（半径約７μｍ）（コバルトビーズ又はＳｍＣｏ磁石粉末粒）を、ミクロピペットで取り、接着剤滴上に置き、ＵＶ照射を約２０分間行って重合させる。磁化レバーを用いて、Ｃｏｖａｌｉｎｋ表面に連結した粒子を回収し、倒立光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）又はＡＦＭ（ＰａｒｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔs、米国）磁場に配置する。実施例３結果長さ１００〜２００μｍ、厚さ０．６μｍの小さな弾性レバー（カンチレバー）から実質的になるアトミックフォース顕微鏡（ＡＦＭ）を使用する。レバーの固定端の位置を、、圧電管より試料に対して約１０^-11ｍで制御する。可動端のたわみを光学的に測定することにより、加えられた力が１０^-12Ｎ付近の感度で検出できる。後端のＡＦＭの通常のプローブ（曲率半径数１０ｎｍの窒化ケイ素製先端部）を、直径７μｍの強磁性コバルトビーズで置き換えた。このアセンブリーは、磁力センサーを構成する。この磁力センサーは、固体基材に結合した２．８μｍＤｙｎａｌビーズにより引き付けられて、バネのたわみを生じる。逆に、センサーが溶液中でＤｙｎａｌビーズを引き付けるか、部分的にＤＮＡ鎖の末端で遊離する。その時には、撓みがほとんどなく、ビーズがセンサーに自然に粘着する。第一の種類の相互作用は、ＡＦＭにより直接測定でき、第二の相互作用は、光学顕微鏡で視覚的に観察できる。Ｄｙｎａｌビーズは、活性化基質（ＮｕｎｃＣｏｖａｌｉｎｋモジュール）に、直接生化学的結合によるか、非特異的付着によりしっかりと固定できる。この付着は、基質下数ｍｍに位置する小磁石の場勾配により強化される。接触限界で最大であるセンサーとビーズとの引力は、１０^-8〜１０^-9Ｎに到達する。磁場の不存在下で、相互作用（永久双極子誘発双極子）の範囲は、ビーズの直径に対して極めて小さく、したがって測定困難である。これに対して、小さい場により誘発双極子が飽和することにより、範囲が増加して約４μに達成する。これにより、センサーによりビーズの１又は２μ上に位置する面を走査することにより像を得ることができる（第４図参照）。これにより、次に行われるビーズの極めて微細な局在化が可能となる。第５図は、ビーズ及び／又は未反応支持体の中央に関して垂直に行った方法を示している。（ａ）では、右から左に、ある距離での磁気引力後、センサーがビーズと接触することが分かる。（ｂ）では、センサーと支持体との接触のみが検出される。場の不存在下では、顕著な引力はこのスケールでは観察されず、接触相互作用のみが観察される。遊離ビーズを、ＡＦＭセンサーのコバルトビーズで顕微操作できる。これは、ＡＦＭ自体下では、操作を監視するための光学的アクセスの不足のために現在のところ行うことができないが、倒立光学顕微鏡の分野でミクロマニュピュレータに付属しているセンサーによりシミュレーションできる。倒立顕微鏡と一体化したＡＦＭは、現在検討中である。遊離ビーズは、半径１又は２μ内でセンサーにより引き付けられ、そこに粘着されることが実質的に観察される。これは、本発明者等がビーズ−ＤＮＡ系に適用する検出の最も原始的な手段である。２つのビーズの結合力は、上記した磁気的引力と、表面の状態に実質的に依存する接触力の合計である：この結合は、未反応センサーについてかなり強く容易には破壊できない。しかしながら、もしセンサーをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（約２％）の溶液に濡らすと、接触力が大きく減少し、ビーズが、センサーの突然の加速又は基質に対する軽い摩擦によって離れてしまう。配列決定を目的としたＤＮＡの分析のための操作装置は、典型的にはＤＮＡ分子をグラフトする透明基質（ＮｕｎｃＣｏｖａｌｉｎｋ）付近に作成する。この基質は、基質を空間の三方向に移動させる圧電又は等価系にしっかりと固定される。磁力センサー（ＡＦＭ）により定量測定でき、光学顕微鏡により、表面と力センサーがそれらの相対移動において観察できる。最後に、このアセンブリーは、電磁石の場の中にあり、加わる場に応じて、表面にビーズを層状にすることにより磁気画像形成を可能としたり、ビーズを表面から遠ざけたり（未グラフトビーズを除去してオペレータの選択を容易にする）、場ゼロでＤＮＡを自由に動き回らせて、センサーに粘着するようにすることができる。この構成では、力の定量測定及びＤＮＡの配列決定を実施できる。実施例４本実施例では、けん引中の分子についての力の定量測定について説明する。次の３つの条件を満足しなければならない：磁気ビーズをＤＮＡ分子によりガラス板に付着させること、ガラス板にビーズを結合する分子数を測定してビーズによって結合されるものを選択できること、そして最後にアトミックフォース顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて分子についてのけん引力を測定すること。ＤＮＡ分子のカップリングは、上記したものと類似のプロトコールに準じる。ＤＮＡ分子の末端の各々の結合は、別個の工程で生じる。この目的は、単一分子の両末端がビーズかガラス表面に連結してループを形成するのを防止するためである。磁気ビーズを結合することが望ましい末端に、まずビオチンを選択的にグラフトし、これが磁気ビーズを被覆しているストレプトアビジンに結合する。第二末端を、ジオキシゲニン分子（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）に付着し、抗ＤＩＧ抗体（これにより前にプロテインＡで処理したガラス板をコートした）と連結する。ＤＮＡ分子の伸張ミクロマニピュレータを用いて、コバルトビーズからなる磁化先端部を近付けることにより、多数のビーズが捕獲され、固定点から１５μｍの距離を超えて移動して離れることができないことが確認できた（これが、使用されるＤＮＡ分子の長さに正確に相当する）。試料の特徴付け試料の調製中に、ガラス板にビーズを結合するＤＮＡ分子数を変化できる。したがって、結合に関与する分子数を、後で測定しなければならない。この測定を干渉なしに実施できる装置が開発された：ビーズのブラウン運動を測定し、後者をガラス板に接合する分子数を、それから演繹する。実際、この分子数が大きいほど、ビーズがよりしっかりと表面に付着され、これらの変動の振幅がより小さい。ビーズを単一ＤＮＡ分子により結合する場合に相当する観察される変動の様子を、第６図に再現する。分子数を求めるために、＜ｘ²＞を測定し、以下の式を使用する：ｎｋ＜ｘ²＞＝ｋ_BＴ（式中、ｋはＤＮＡ分子の剛さであり、ｋ_Bはボルツマン定数であり、Ｔは温度であり、ｎは分子数である。ＤＮＡ分子の破断ミクロマニピュレータの先端に粘着したコバルトビーズの磁化を増加させることにより、次にビーズを１５μｍよりもさらに遠くに移動させることによりＤＮＡ分子を破断できる。アトミックフォース顕微鏡を用いてこの実験を反復することにより、後者の分子の破壊時の分子の引張力を測定した（第７図）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ベンシモン，デビッドフランス国パリ、アレ、マルク‐シャガール、５ (72)発明者クロケット，バンサンフランス国アントニ、リュ、ペルジル、３ (72)発明者シフォーデル，アルノーフランス国アントニ、アブニュ、エルネスト‐ルナン、17

Claims

【特許請求の範囲】１．ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の決定方法であって、二本鎖ＤＮＡ又は決定されるべきＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列に相当する二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの各塩基対間の対化又は不対化のエネルギーを測定し、このエネルギーを予め求めた値と比較することを特徴とする方法。２．ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各塩基対間の不対化のエネルギーを、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各鎖の少なくとも一つの塩基を支持体に付着させ、かつ各塩基対が次々に不対化するように支持体を移動させるとともに、不対化に必要とされるエネルギーを各不対化について測定し、かつこのエネルギーを予め求めた値と比較することによって求めることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各塩基対間の対化のエネルギーを、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの各鎖の少なくとも一つの塩基を支持体に付着させ、かつ各塩基対が対化するように支持体を一緒にするとともに、対化に必要とされるエネルギーを各対化について測定し、かつこのエネルギーを予め求めた値と比較することによって求めることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．二本鎖部を含むＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを不対化するのに必要とする総エネルギーを測定し、この総エネルギーを対化標準配列に相当するこのエネルギーの限界値と比較することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。５．前記方法が未決定構成のＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの配列決定に使用され、予め求めた値がその環境に準じて各塩基対について予め測定されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。６．対化又は不対化の前に支持体に付着していない二本鎖ＤＮＡ又はハイブリッドの末端を、共有的又は疑似共有的に結合することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。７．二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド配列を、二本鎖の不対化の後に、再対化し、次いで再び数回引っ張って離して測定値を累積し、かつ信号／ノイズ比を増加することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。８．ＤＮＡ又はハイブリッドの各鎖をいくつかの隣接塩基により付着させることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。９．ＤＮＡ又はハイブリッドの鎖の一方の塩基の一つを可動表面に直接又は間接的に付着させること、ＤＮＡ又はハイブリッドの他方の鎖の塩基を力センサーに付着させること、及び可動表面を動かして離すとともに塩基の不対化について力センサーにより測定される力の値を求めることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。１０．塩基の一つを可動表面に間接的に付着させるために、その表面に付着させた磁石及び塩基に付着させた磁化性粒子を使用することを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．前記力センサーがアトミックフォース顕微鏡のレバーであり、可動表面がナノメータ移動装置であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．前記力センサーが磁石であり、その位置が磁場により制御されることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。１３．前記力センサーが、レバーであるか、または膜を移動センサーと組み合わせたものであることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。１４．予め支持体に付着させた、特異的配列の存在についての被試験ＤＮＡ又はＲＮＡ試料を、それ自体支持体に付着させた前記特異的配列に相補的な配列を有する容器に配置すること、及びインキュベーション後、形成される可能性のある二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド間の結合のエネルギーを測定して、総ハイブリダイゼーションの不対化のエネルギーに相当する特異的ＤＮＡ配列の存在を検出することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。１５．未知のＤＮＡの配列決定に関する請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法の適用。１６．試験試料における特定のＤＮＡ配列を明かにするための請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法の適用。１７．請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を実施するための診断キットであって、以下の要素を一つ以上を含むことを特徴とする診断キット： −公知のヌクレオチド配列（又は「プライマー」）であって、前記配列のすべて又は一部分を含有する試験一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、ストリンジェント条件下、他の核酸を含有するかまたは前記非ハイブリダイゼーション性核酸を分離した後の反応媒体中でハイブリダイゼーションすることができる公知のヌクレオチド配列（又は「プライマー」）、 −試料において求められているハイブリダイゼーション可能配列からなる参照標準要素としての二本鎖形態のＤＮＡ又はＲＮＡ、 −試験試料のＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はプライマーのＤＮＡ若しくはＲＮＡ（「公知のヌクレオチド配列」）が付着できる支持体、 −少なくとも一種の制限酵素、 −試験ＤＮＡ又はＲＮＡの末端を官能化するためのオリゴヌクレオチド、又はすでに官能化されたプライマー、 −ハイブリダイゼーションされるＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はプライマーの官能化末端に付着できる表面。１８．請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法の実施において及び請求項１５又は１６に記載の適用において、又は請求項１７に記載に診断キットの構成要素として有用である中間体としての、通常隣接５´及び３´端が、一つの場合においてループの形態でオリゴヌクレオチドにより共有的又は疑似共有的に結合され、他方の場合において、一つ以上の別個の固体支持体に結合されている二本鎖ＤＮＡ。