JPH09183797A

JPH09183797A - 生理活性タンパク質Ｒｈｏｔｅｋｉｎ

Info

Publication number: JPH09183797A
Application number: JP7354328A
Authority: JP
Inventors: Shu Narumiya; 宮周成
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1995-12-28
Publication date: 1997-07-15

Abstract

(57)【要約】【課題】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有するタン
パク質、およびＲｈｏタンパク質が関与する腫瘍形成等
を抑制する医薬組成物の提供。【解決手段】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、
かつＲｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性を阻害する、
タンパク質またはその改変タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有するタン
パク質に関する。

【０００２】背景技術生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３
万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク
質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のス
ーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですで
に５０種類以上のメンバーが見い出されている。低分子
量Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性から、Ｒａ
ｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別
することができる。さらに、Ｒｈｏファミリーは、Ｒｈ
ｏタンパク質、Ｒａｃタンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク
質のサブファミリーに大別される。この低分子量Ｇタン
パク質は種々の細胞機能を制御していることが明らかに
なってきており、例えば、Ｒａｓファミリーのタンパク
質は細胞の増殖や分化を、Ｒｈｏファミリーのタンパク
質は細胞の形態変化、細胞接着、細胞凝集、細胞運動、
細胞分裂等を制御していると考えられている。

【０００３】Ｒｈｏファミリーのタンパク質は、他の低
分子量ＧＴＰ結合タンパク質と同様に、ＧＤＰ／ＧＴＰ
結合能およびＧＴＰａｓｅ活性を示し、ＧＤＰと結合し
た不活性型またはＧＴＰと結合した活性型として存在
し、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応やＧＴＰａｓｅによる反応
によりに相互に変換される。ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応
は、ＳｍｇＧＤＳ（K.Kaibuchi et al.,Mol. Cell. B
iol.,11,2873-2880 (1991)、T. Mizuno et al.,Proc. N
atl. Acad. Sci.,USA,88,6442-6446(1991)) 、Ｄｂｌ
（M. J. Hart et al.,Nature,354,311-314(1991)）、Ｏ
ｓｔ（Y. Horii et al., EMBO J.,1354,4776-4786 (199
4)）、Ｔｉａｍ−１（G. G. Habets et al.,Cell,77,53
7-549 (1994)）のようなＧＤＰ／ＧＴＰ交換促進タンパ
ク質やＲｈｏＧＤＩ（Y. Fukumoto et al.、Oncogene,
5,1321-1328(1990)）のようなＧＤＰ／ＧＴＰ交換抑制
タンパク質により制御されている。ＧＴＰａｓｅ反応
は、ＲｈｏＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、
即ち、ＲａｓＧＡＰと結合しているｐ１９０（J. Set
tleman et al.,Nature,359,153-154(1992)）、Ｒｈｏ
ＧＡＰ（C. A. Lancaster et al.,J. Biol. Chem.,269,
1137-1142 (1994)）、およびＲｈｏＧＡＰｐ１２２
（Y. Homma & Y. Emori,EMBO J.,14, 286-291(1995) ）
により制御されている。

【０００４】ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク
質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ
２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏフ
ァミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０
％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパ
ク質は、リゾフォスファチジル酸や増殖因子のような細
胞外シグナルに応答して、ストレス繊維（stress fibe
r）やフォーカルコンタクト（focal contact ）の形成
を引き起こす反応に関与していると考えられている（A.
J. Ridley & A. Hall、Cell,70,389-399 (1992) ,A.
J. Ridley & A. Hall, EMBO J.,1353,2600-2610(199
4)）。また、Ｒｈｏファミリーのタンパク質は、細胞の
形態変化（H. F. Parterson et al., J. Cell Biol., 1
11, 1001-1007 (1990) ）、細胞凝集（Morii, N. et a
l.,J. Biol. Chem. 267, 20921-20926 (1992) 、T. Tom
inaga et al., J. Cell Biol., 120, 1529-1537(1993)
）、細胞運動（K. Takaishi et al.,Oncogene,9,273-2
79 (1994)）、細胞質分裂（cytokinesis ）（K. Kishi
et al.,J. Cell Biol.,120,1187-1195(1993) 、I. Mabu
chi et al.,Zygote,1,325-331(1993)）のような細胞骨
格の再編成をともなった生理機能にも関連があると考え
られている。更に、サブファミリーであるＲｈｏタンパ
ク質は、平滑筋収縮（K. Hirata et al.,J. Biol. Che
m.,267,8719-8722(1992)）、フォスファチジルイノシト
ール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）（J.Zhang
et al.,J. Biol. Chem.,268,22251-22254 (1993) ）、
フォスファチジルイノシトール４−リン酸５−キナ
ーゼ（ＰＩ４，５−キナーゼ）（L. D.Chong et al.,
Cell,79,507-513(1994)）やｃ−ｆｏｓの発現（C. S. H
ill et al.,Cell,81,1159-1170(1995) ）の制御にも関
与していることが示唆されている。

【０００５】ところで、細胞外シグナルの刺激により、
Ｒｈｏファミリーのタンパク質がＧＤＰ結合型の不活性
型からＧＴＰ結合型の活性型に変換され、ＧＴＰ結合型
Ｒｈｏタンパク質（以下「活性型Ｒｈｏタンパク質」と
いう）が特異的な標的タンパク質に結合することによ
り、固有の生理機能が引き起こされることが想定されて
いる（C. D. Nobes & A. Hall,Curr-Opin-Genet-Dev.,
4,77-81(1994)）。最近の研究によれば、Ｓｗｉｓｓ
３Ｔ３細胞株では、細胞運動のアクチン細胞骨格が、Ｃ
ｄｃ４２タンパク質からＲａｃタンパク質、Ｒａｃタン
パク質からＲｈｏタンパク質によるシグナル伝達のカス
ケードにより制御されていることが証明されている。例
えば、ブラディカイニンが、Ｃｄｃ４２タンパク質を介
してカスケードを促進してＣｄｃ４２タンパク質を活性
化（フィリポディア形成）し、次いでＲａｃタンパク質
が活性化（ラメリポディア形成）し、そしてＲｈｏタン
パク質が活性化（ストレス繊維形成とフォーカル・コン
タクト形成）すると考えられている（C. D. Nobes & A.
Hall,Cell,81,53-62 (1995) 、R. Kozma et al. , Mo
l. Cell. Biol.,15,1942-1952 (1995) ）。

【０００６】ＮＡＤＰＨオキシダーゼの系では、Ｒａｃ
タンパク質の標的タンパク質としてｐ６７−ｐｈｏｘ
（D. Diekmann et al.,Science,265,531-533(1994)）が
同定されている。Ｒａｃタンパク質やＣｄｃ４２タンパ
ク質の共通の標的タンパク質としては、セリン／スレオ
ニン・キナーゼのＰＡＫｐ６５（E. Manser et al.,Nat
ure,367,40-46(1994) 、G. A. Martin et al.,EMBO J.,
14,1970-1978 (1995) ）が知られている。また、ＰＩ
３−キナーゼのｐ８５サブユニットは活性型Ｒａｃタン
パク質やＣｄｃ４２タンパク質と直接結合していること
が知られている（Y. Zheng et al.,J. Biol. Chem.,26
9,18727-18730 (1994) ）。

【０００７】しかしながら、活性型Ｒｈｏタンパク質が
いかなるタンパク質を標的とし結合するのかは明らかに
されておらず、よってＲｈｏサブファミリーが関与する
細胞情報伝達機構、特に腫瘍形成に関する機構、は依然
として解明されていない。

【０００８】

【発明の概要】今般、本発明者らは、マウス胎児ｃＤＮ
Ａライブラリーを用いて酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムを実施し、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する
タンパク質の一部を同定した。そして、推定分子量６１
ｋＤａのタンパク質をオープン・リーディング・フレー
ムとしてコードするｃＤＮＡをマウス脳ｃＤＮＡライブ
ラリーから同定した。このｃＤＮＡによりコードされる
タンパク質のＮ末端部分は、オーバーレイ・アッセイに
おいて、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏタンパク質
とのｉｎｖｉｔｒｏ結合活性を示したが、Ｒａｃ１お
よびＣｄｃ４２とは結合活性を示さなかった。また、こ
のペプチドは内在性のＲｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ活
性およびＧＡＰに刺激されたＲｈｏタンパク質ＧＴＰａ
ｓｅ活性を抑制した。

【０００９】即ち、本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつＲｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活
性を阻害するタンパク質の提供をその目的とする。ま
た、本発明は、該タンパク質の部分タンパク質、部分タ
ンパク質を含む該タンパク質をコードする塩基配列、該
塩基配列を含んでなるベクター、該ベクターによって形
質転換された宿主細胞、該タンパク質等の製造法、該タ
ンパク質等を含んでなる腫瘍形成または転移抑制剤、お
よび活性型Ｒｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質
等との結合を阻害する物質等のスクリーニング法の提供
をその目的とする。

【００１０】そして、本発明によるタンパク質は、活性
型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつＲｈｏタンパク
質ＧＴＰａｓｅの活性を阻害するタンパク質（以下「Ｒ
ｈｏｔｅｋｉｎ」という）およびその改変タンパク質で
ある。

【００１１】

【発明の具体的説明】タンパク質Ｒｈｏｔｅｋｉｎは、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を
有する。ここで、Ｒｈｏタンパク質としては、ＲｈｏＡ
タンパク質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク
質、またはＲｈｏＧタンパク質等が挙げられる。本発明
において、「活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有するタ
ンパク質」とは、当業者により活性型Ｒｈｏタンパク質
との結合が認められたと評価されるタンパク質を意味す
るものとする。例えば、実施例１〜３と同様の条件にお
いて実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパク質との結合が
認められたと評価されるタンパク質を意味するものとす
る。

【００１２】Ｒｈｏｔｅｋｉｎは、また、活性型Ｒｈｏ
タンパク質ＧＴＰａｓｅの活性を阻害するとの性質を有
する。このＧＴＰａｓｅは活性型Ｒｈｏタンパク質に内
在するものである。本発明において、「活性型Ｒｈｏタ
ンパク質ＧＴＰａｓｅの活性を阻害するタンパク質」と
は、当業者により活性型Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ
の活性の阻害が認められたと評価されるタンパク質を意
味するものとする。例えば、実施例４と同様の条件にお
いて実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓ
ｅの活性の阻害が認められたと評価されるタンパク質を
意味するものとする。なお、本明細書においては、「活
性の阻害」は、活性亢進（ＧＡＰによる）の阻害を含む
意味で用いられるものとする。

【００１３】本発明において、「改変タンパク質」と
は、Ｒｈｏｔｅｋｉｎのアミノ酸配列についてアミノ酸
の付加、挿入、欠失または置換等の改変が生じたもので
あり、かつ少くとも活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およ
び活性型Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ活性阻害能のい
ずれかを有するものである。以下、「本発明によるタン
パク質」という場合は、改変タンパク質も包含されるも
のとする。

【００１４】本発明によるタンパク質の起源は特に限定
されず、マウスおよびヒトを含むホ乳類由来のものであ
っても、それ以外を由来とするものであってもよい。本
発明によるタンパク質は、その一つの態様において、配
列番号１に記載のアミノ酸配列の一部もしくは全部また
はその等価配列を含んでなるもの、であることができ
る。この配列番号１に記載のアミノ酸配列は、マウス脳
由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたＤＮＡ配列か
ら決定されたものである。本発明において「アミノ酸配
列の一部」としては、配列番号１の１〜８９番および７
〜１１３番に加え、７〜８９番のアミノ酸配列が挙げら
れる。マウス脳由来のＲｈｏｔｅｋｉｎは、そのアミノ
酸配列（配列番号１）から約６１ｋＤａの推定分子量を
有する。

【００１５】本発明において「その等価配列」とは、配
列番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部であっ
て、本発明によるタンパク質にとって本質的でないアミ
ノ酸の付加、挿入、削除、欠失または置換などの改変が
生じたアミノ酸配列を意味するものとする。このような
等価配列としては、例えば、アミノ酸の付加、挿入、削
除、欠失または置換などの改変が生じた配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部であって、依然とし
て活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有するアミノ酸配列
が挙げられる。

【００１６】本発明の別の面によれば、本発明によるタ
ンパク質の部分アミノ酸配列を含んでなるタンパク質で
あって、該部分アミノ酸配列が活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能および／または活性型Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａ
ｓｅ活性阻害能を有するタンパク質（以下「部分タンパ
ク質」という）が提供される。部分アミノ酸配列として
は、配列番号１の１〜８９番および７〜１１３番に加
え、７〜８９番のアミノ酸配列が挙げられる。

【００１７】本発明によるタンパク質は、主として脳お
よび腎臓において発現されるとする性質を有する。ここ
で「主として脳および腎臓において発現される」とは、
当業者により脳および腎臓においての発現が認められた
と評価されることを言い、例えば、実施例６と同様の条
件で実験した場合に脳および腎臓において発現が認めら
れたと評価されることをいう。

【００１８】本発明の更に別の面によれば、配列番号１
に記載のアミノ酸配列の一部もしくは全部またはその等
価配列を含んでなるタンパク質、および配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部もしくは全部またはその等価配
列からなるタンパク質が提供される。以下、「本発明に
よるタンパク質」および「部分タンパク質」という場合
には、更にこれらのタンパク質を含む意味で用いられる
ものとする。

【００１９】本発明によるタンパク質および部分タンパ
ク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有するもので
ある。また、Ｒｈｏタンパク質は血小板やリンパ球の凝
集、細胞形態、細胞運動、細胞質分裂等の細胞の機能発
現に密接に関わっている（前掲N. Morii et al., (199
2) 、T. Tominaga et al., (1993)、K. Takaishi et a
l., (1994)、T. Mabuchi et al., (1993) ）。また、Ｒ
ｈｏタンパク質を活性化するＧＤＰ／ＧＴＰ交換促進タ
ンパク質のうち、Ｄｂｌ（M. J. Hart et al., J. Bio
l. Chem. 269, 62-65 (1994) ）およびＯｓｔ（前掲Y.
Horii et al., (1994) ）はガン原遺伝子である。更
に、最近、Ｒｈｏタンパク質が細胞周期の促進（M. F.
Olson et al., Science, 1270-1272 (1995) ）、ガン原
遺伝子ｃ−ｆｏｓの発現（C. S. Hill et al., Cell, 8
1, 1159-1170 (1995) ）、腫瘍の形成（G. C.Prenderga
st et al., Oncogene 10,2289-2296 (1995) 、R. Khosr
avi-Faret al., Mol. Cell. Biol. 15, 6443-6453 (199
5) ）、ガンの浸潤および転移（K. Yoshioka et al., F
EBS Lett., 372, 25-28 (1995) ）に関与することが明
らかにされた。従って、本発明によるタンパク質は、細
胞の機能解明、特に腫瘍形成および転移、血小板凝集や
炎症の機序の解明、に有用である。

【００２０】塩基配列本発明によれば、本発明によるタンパク質または部分タ
ンパク質をコードする塩基配列が提供される。この塩基
配列の典型的配列は、配列番号２に記載のＤＮＡ配列の
一部または全部を含んでなるもの、である。配列番号２
に記載のＤＮＡ配列は、マウス脳由来のｃＤＮＡライブ
ラリーから得られたものである。このＤＮＡ配列は、５
９１〜５９３番のＡＴＧで始まり、２２４４〜２２４６
番のＴＧＡで終了するオープンリーディングフレームを
有する。

【００２１】更に、前記したように本発明によるタンパ
ク質および部分タンパク質は、配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列の一部または全部の等価配列をも包含するもの
である。従って、本発明による塩基配列には、更にこの
等価配列をコードする塩基配列も包含される。なお、本
明細書において「塩基配列」とは、ＤＮＡ配列およびＲ
ＮＡ配列のいずれをも意味するものとする。本発明によ
るタンパク質または部分タンパク質のアミノ酸配列が与
えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定ま
り、配列番号１に記載されるアミノ酸配列の一部もしく
は全部またはその等価配列をコードする種々の塩基配列
を選択することができる。従って、本発明によるタンパ
ク質または部分タンパク質をコードする塩基配列とは、
配列番号２に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加
え、同一のアミノ酸をコードする配列であって縮重関係
にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味す
るものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれ
る。

【００２２】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであっ
てもよい。ＤＮＡの典型的な取得方法としては、染色体
ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工
学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配
列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用
いてスクリーニングを行う方法、等が挙げられる。塩基
配列が天然由来のものである場合、その起源は特に限定
されず、マウスおよびヒトを含むホ乳類由来のものであ
っても、それ以外を由来とするものであってもよい。

【００２３】本発明によるタンパク質をコードする塩基
配列としては、例えば、配列番号２のＤＮＡ配列の５９
１〜２２４６番の配列（オープンリーディグフレームに
相当）を含んでなるもの、が挙げられる。また、本発明
による部分タンパク質をコードする塩基配列としては、
例えば、配列番号２のＤＮＡ配列の６０９〜８５７番の
配列（アミノ酸配列７〜８９番のＲｈｏタンパク質結合
領域に相当）を含んでなるものが挙げられる。

【００２４】ベクターおよび形質転換された宿主細胞本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主
細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタン
パク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供さ
れる。更に、本発明によれば、このベクターによって形
質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクタ
ー系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。融合タン
パク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパ
ク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラー
ゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ｍｙｃ、Ｆａｓ等を用
いたものが挙げられる。

【００２５】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞、動物細胞等での
発現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウ
イルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連
ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダ
イウイルスベクター、ＨＩＶベクター）、リポソームベ
クター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等
が挙げられる。本発明によるベクターは、これを実際に
宿主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるため
に、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制
御する配列や宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー
等を含んでいてもよい。また、このベクターは、本発明
による塩基配列を反復した形（タンデム）で含んでいて
もよい。これらは常法に従いベクターに存在させてよ
く、このベクターによる宿主細胞の形質転換の方法も、
この分野で慣用されているものを用いることができる。

【００２６】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。また、宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、
リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍
細胞等）、平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細
胞等が挙げられる。

【００２７】上記形質転換された宿主細胞を適当な培地
で培養し、その培養物から上記した本発明によるタンパ
ク質および部分タンパク質を得ることができる。従っ
て、本発明の別の面によれば、本発明によるタンパク質
および部分タンパク質の製造法が提供される。形質転換
された宿主細胞の培養およびその条件は、使用する細胞
についてのそれと本質的に同様であってよい。また、培
養液からの本発明によるタンパク質等の回収、精製も常
法に従って行うことができる。

【００２８】タンパク質の用途本発明によるタンパク質および部分タンパク質は、活性
型Ｒｈｏタンパク質を中和することにより、活性型Ｒｈ
ｏタンパク質から本発明によるタンパク質および部分タ
ンパク質を含む標的タンパク質へのシグナル伝達を遮断
することができると考えられる。また、Ｒｈｏタンパク
質が腫瘍の形成、転移に密接にかかわっていることが確
認されている（前掲G. C.Prendergast et al.,、R. Kho
sravi-Far et al., 、K. Yoshioka et al.）。従って、
本発明によるタンパク質または部分タンパク質を投与す
ることによって、あるいはこれらをヒトを含む生体内で
発現させることによって、活性型Ｒｈｏタンパク質がこ
れに結合し、その結果として活性型Ｒｈｏタンパク質か
らその下流のタンパク質へのシグナル伝達が遮断され、
Ｒｈｏタンパク質が関与する腫瘍の形成および転移を抑
制できると考えられる。

【００２９】従って、本発明のもう一つの面によれば、
本発明によるタンパク質または部分タンパク質を含んで
なる、腫瘍形成または転移抑制剤（以下「腫瘍形成等抑
制剤」ということがある）が提供される。

【００３０】上記腫瘍形成または転移としては、Ｒｈｏ
タンパク質が関与することが明らかとなっているＲａｓ
タンパク質が関与する腫瘍の形成（前掲C. Prendergast
etal. (1995)およびR. Khosravi-Far et al.(199
5)）、Ｒｈｏタンパク質と密接に関係した機能を有する
ことが明らかとなっている他の低分子量Ｇタンパク質
（例えば、Ｒａｃタンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質）
（前掲 C. D. Nobes & A. Hall, (1995)およびR. Kozma
et al.(1995) ）が関与する腫瘍の形成、低分子量Ｇタ
ンパク質の活性化タンパク質（例えば、Ｄｂｌ、Ｏｓｔ
等のガン遺伝子）が関与する腫瘍の形成（前掲M. J. Ha
rt et al., (1994) およびY. Horii et al., (1994)
）、受容体型チロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦ受
容体、ＥＧＦ受容体等）または転写制御タンパク質（ｍ
ｙｃ、ｐ５３等）が関与する腫瘍、Ｒｈｏタンパク質の
機能が亢進している腫瘍の形成および転移（前掲K. Yos
hioka et al., (1995)）、Ｒｈｏタンパク質の上流のシ
グナル伝達を担うリン脂質であるリソホスファチジン酸
（ＬＰＡ）（W.H.Moolenaar,J.Biol.Chem.270,12949-12
952(1995))が関与する腫瘍の形成および転移等が挙げら
れる。

【００３１】本発明による腫瘍形成等抑制剤は、また、
経口または非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投
与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）、好ましくは
経口投与することができ、薬剤として経口または非経口
投与に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動物
に使用される。

【００３２】腫瘍形成等抑制剤は、例えばその用途に応
じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒
剤、トローチ錠などの経口剤、静注および筋注などの注
射剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいず
れかの製剤形態に調製することができる。これらの各種
製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、
湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝
剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化
剤、安定化剤などを用いて常法により製造することがで
きる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば
乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネ
シウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレン
グリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノ
ール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウ
ム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが挙げられ
る。

【００３３】薬剤中における本発明によるタンパク質ま
たは部分タンパク質の含有量はその剤形に応じて異なる
が、通常全組成物中約０．１〜約５０重量％、好ましく
は約１〜約２０重量％濃度である。腫瘍形成または転移
の治療のための投与量は、用法、患者の年齢、性別、症
状の程度などを考慮して適宜決定されるが、通常成人１
日当り約０．１〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜
約５０ｍｇ程度とするのがよく、これを１日１回または
数回に分けて投与することができる。

【００３４】本発明の更にもう一つの面によれば、本発
明によるタンパク質または部分タンパク質をコードする
塩基配列を含んでなる、腫瘍形成または転移抑制用遺伝
子治療剤が提供される。この遺伝子治療剤は、本発明に
よるタンパク質または部分タンパク質をコードする塩基
配列を有する前記ベクターを用いて標的細胞を形質転換
し、腫瘍の形成または転移を抑制する様な態様で用いる
ことができる。形質転換される細胞としては、ガン患者
体内のガン細胞、例えば、骨髄性白血病細胞、リンパ性
白血病細胞、肺ガン細胞、大腸ガン細胞、胃ガン細胞、
膵臓ガン細胞、乳ガン細胞、腎ガン細胞、頭頸部ガン細
胞、肝臓ガン細胞、皮膚ガン細胞、脳腫瘍細胞等が挙げ
られる。

【００３５】前記の本発明によるタンパク質または部分
タンパク質をコードする塩基配列を有するベクターをヒ
トを含む生体内のガン細胞に適当な方法によって導入す
ることによって、悪性腫瘍等について遺伝子治療を行う
ことができる。遺伝子治療用のベクターについては、高
久史磨監修の実験医学（増刊号）第１２巻、第１５号
「遺伝子治療の最前線」（１９９４年）を参照すること
ができる。

【００３６】スクリーニング法本発明によれば、（１）スクリーニングの対象となる物
質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と本発明によるタンパク
質または部分タンパク質とを含むスクリーニング系に存
在させ、そして（２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、本発
明によるタンパク質または部分タンパク質との結合の阻
害の程度を測定することを含んでなる、活性型Ｒｈｏタ
ンパク質と、本発明によるタンパク質または部分タンパ
ク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法が提供
される。

【００３７】ここで、「結合の阻害の程度を測定する」
方法としては、例えば、無細胞系での組換え型ＧＴＰγ
Ｓ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質との結合をグルタチオ
ン・セファロースビーズまたはオーバーレイアッセイを
用いて測定する方法、および酵母ツー・ハイブリッド・
システムを用いて測定する方法が挙げられ、より具体的
には実施例１〜３に記載される方法に準じて結合の阻害
の程度を測定することができる。

【００３８】スクリーニング系は細胞系または無細胞系
のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵
母細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞（３Ｙ１
細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｒａｔ１細胞、Ｂａｌｂ／
３Ｔ３細胞等）、骨髄系細胞、リンパ系細胞、平滑筋細
胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト
等が挙げられる。また、スクリーニングは、酵母ツー・
ハイブリッド・システム（two hybrid system ）（M.Ka
wabata 実験医学13,2111-2120(1995)、 A.B.Vojtek et
al.Cell 74,205-214(1993) ）により行うことができ
る。

【００３９】酵母ツー・ハイブリッド・システムにおい
て活性型Ｒｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質等
との結合を測定した場合に、そのＣ末端領域を欠失した
活性型Ｒｈｏタンパク質は、欠失しないタンパク質と比
較して本発明によるタンパク質等とより強く結合するこ
とが示された（実施例２）。従って、スクリーニング系
として酵母ツー・ハイブリッド・システムを用いる場合
には、活性型Ｒｈｏタンパク質は、そのＣ末端領域を欠
失したものが好ましい。スクリーニングの対象となるも
のは、特に限定されないが、例えばペプチド、ペプチド
のアナログ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられ
る。

【００４０】本発明によるスクリーニング法において
は、スクリーニング系に更に、Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰ
ａｓｅ活性化タンパク質を存在させてもよい。この場
合、Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性の阻害の程度
を測定することによって活性型Ｒｈｏタンパク質と本発
明によるタンパク質または部分タンパク質との結合の阻
害の程度を測定することができる。ここで、「Ｒｈｏタ
ンパク質ＧＴＰａｓｅの活性化または活性亢進の阻害の
程度を測定する」方法としては、Ｒｈｏタンパク質に結
合したＧＴＰの加水分解の程度を測定する方法が挙げら
れ、例えば、実施例４に記載される方法に準じてＲｈｏ
タンパク質ＧＴＰａｓｅの活性の阻害の程度を測定する
ことができる。活性型Ｒｈｏタンパク質は、前記のよう
に、腫瘍の形成または転移に密接に関わっていることが
確認されている。従って、上記２つのスクリーニング法
は、腫瘍形成または転移の阻害物質のスクリーニング法
としても用いることができる。

【００４１】

【実施例】本発明を以下の実施例によって説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１酵母ツー・ハイブリッド・システム（two hy
brid system ）を用いたマウス活性型Ｒｈｏタンパク質
結合性タンパク質の遺伝子の単離本発明者らは、Ｒｈｏタンパク質の新規結合タンパク質
を同定するために、酵母ツー・ハイブリッド・システム
（two hybrid system ）を用いたライブラリー・スクリ
ーニングを実施した。ツー・ハイブリッド・システム
は、本質的にはA.B. Vojtek et al., Cell 74, 205-214
(1993)に記載の方法に従って実施した。最初のスクリ
ーニングはＣＡＡＸボックスおよびｐｏｌｙｂａｓｉｃ
領域を欠いた１８１残基までの欠失ＲｈｏＣ変異体を用
いて実施した。欠失は、オリジナルなＲｈｏＣｃＤＮ
Ａ（P. Chardin et al., Nucleic. Acid Res., 16, 271
7 (1988) ）を鋳型として用いて、ＰＣＲによる増幅を
介して実施した。このＰＣＲは、５’末端のコドン１の
前にＢａｍＨ１部位を、３’末端のコドン１８１の後に
ＥｃｏＲＩ部位を導入するために、５’末端プライマー
（ＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＴＣＣＧＡ
ＡＡＧＡＡＧ）および３’末端プライマー（ＣＣＡＧＡ
ＡＴＴＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡ
Ｇ）を用いて実施した。

【００４２】次に、このｃＤＮＡを改変ｐＢＴＭ１１６
（ｐＢＴＭ１１６Ｍ）のマルチクローニング部位中にサ
ブクローニングした（このベクターを「ｐＢＴＭ１１６
Ｍ−ＲｈｏＣΔＣ」と呼ぶ）。因に、ｐＢＴＭ１１６Ｍ
は、ｐＢＴＭ１１６（前掲A.B.Vojetk et al.(1993))の
クローニング領域のＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣ
からＧＡＡＴＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＧ
ＡＴＣＣまでをオリゴヌクレオチド・ストラテジーによ
り改変したもので、クローニング領域がマルチクローニ
ング部位としたものである。このベクターを用いて、Ｌ
ｅｘＡ転写因子とバイト（ｂａｉｔ）・タンパク質との
融合タンパク質（ＬｅｘＡ−ＲｈｏＣΔＣ融合タンパク
質）を発現させた。最初のスクリーニングのバイトとし
ては、ヒトＲｈｏＣよりＣ末端のｐｏｌｙｂａｓｉｃ領
域とＣＡＡＸボックスを欠いたもの（ＬｅｘＡ−Ｒｈｏ
ＣΔ）を用いた。その理由は、この領域を介してＲａｓ
タンパク質やその関連タンパク質が細胞膜に強く結合す
るという過去の知見（S. J. Leevers et al., Nature 3
69,411-414 (1994)、D. Stokoe et al., Science 264,
1463-1467 (1994) ）、およびこのアッセイではマーカ
ー遺伝子の転写が活性化されるためには核極在が必要な
ことを考慮したからである。

【００４３】バイト・ベクターｐＢＴＭ１１６のパート
ナーのプラスミドｐＶＰ１６（A.B.Vojtek et al.cell
、74:205-514(1993)）を用いて、核極在配列とＶＰ１
６転写活性化領域（ＶＡＤ）とランダム・プライムした
１０．５日齢マウス胎児ｃＤＮＡライブラリーとの融合
タンパク質を発現させた。即ち、ｐＶＰ１６中に挿入さ
れたマウス１０．５日齢胎児ｃＤＮＡライブラリーを、
ＬｅｘＡと欠失ＲｈｏＣ変異体に融合させたバイト・プ
ラスミド（ｐＢＴＭ１１６Ｍ−ＲｈｏＣΔＣ）を用いて
スクリーニングした。バイトとライブラリー・プラスミ
ドより発現させたタンパク質の結合が陽性の場合には、
転写を活性化する複合体が形成されるため、酵母のＨＩ
Ｓ３遺伝子とバクテリア由来のｌａｃ遺伝子が発現され
る。また、接合ストラテジー（mating strategy ）にお
いては、Ｌ４０株と共にＡＭＲ７０株を用いた。即ち、
マウス胎児ｃＤＮＡライブラリー由来の断片が挿入され
たｐＶＰ１６を含むＬ４０株を、ｐＢＴＭ１１６Ｍ中に
ＲｈｏＣΔＣのコンストラクトを発現するＡＭＲ７０株
とを接合させた。ディプロイド（Diploid ）を、両方の
プラスミドの選択培地にパッチとして培養し、フィルタ
ー紙（Whatman No.1）にトランスファーした。β- ガラ
クトシダーゼ活性はL. D. Chong et al., Cell 79, 507
-513 (1994) に記載の方法に従って決定した。

【００４４】本発明者らは、結合の特徴から同一のｃＤ
ＮＡをｐＶＰ１６中に有すると推測される幾つかのクロ
ーンを同定した。１．２×１０^７のイニシャル・トラン
スフォーマントより、ｌａｃＺ陽性−ヒスチジン非要求
性クローンを２５６クローン同定し、その内７９クロー
ンはｐＢＴＭ１１６Ｍ−ＲｈｏＣΔＣを保有していた。
様々なテスト・バイトを導入した酵母ＡＭＲ７０株と接
合させ、他のタンパク質との結合を評価した。７９クロ
ーンの内、２２クローンはイニシャル・スクリーニング
でｌａｃＺ陽性であったが、ラミニン融合構築物では陰
性であった。これらのクローンの内、１２クローンは、
同一のｃＤＮＡが挿入されたｐＶＰ１６を含んでいた。
挿入されていた２９１塩基対を含むプラスミド（ｐＶＰ
１６−Ｃ２１）より切り出した。この挿入断片の塩基配
列を決定したところ、新規の２９１塩基対のｃＤＮＡ
（以下「Ｃ２１」と呼ぶ）であることがわかった。

【００４５】実施例２酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムを用いたＣ２１および全長Ｒｈｏｔｅｋｉｎの結合
特異性の解析実施例１に準じて、下記の方法に従って、ツー・ハイブ
リッド・システムを用いたＣ２１および全長Ｒｈｏｔｅ
ｋｉｎの結合特異性の解析を実施した。ＲｈｏＣと同様
の欠失体を、ＲｈｏＡについては５’末端プライマー
（ＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＣＣＧＧ
ＡＡＧＡＡＡ）および３’末端プライマー（ＣＣＡＧＡ
ＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＧ）を用
いて、ＲｈｏＢについては５’末端プライマー（ＡＧＣ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧＡ
ＡＧ）および３’末端プライマー（ＣＣＡＧＡＡＴＴＣ
ＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧ）を用い
て、ＲｈｏＡｃＤＮＡ（N. Morii et al., J. Biol.
Chem. 268, 27160-27163 (1993) ）およびＲｈｏＢｃ
ＤＮＡ（P. Chardin et al., Nucleic. Acid. Res., 1
6, 2717 (1988) ）をそれぞれの鋳型として、ＰＣＲに
よって作製し、同様にｐＢＴＭ１１６Ｍに挿入した。全
長のＲａｃ１およびＣｄｃ４２ｃＤＮＡは、それぞれ
ｐＧＥＸ−Ｒａｃ１（T.Nishikawa et al.,Mol.Cell.Bi
ol.,14,2447-2456(1994)）およびｐＧＥＸ−Ｃｄｃ４２
（Y.Miura et al.,J.Biol Chem,268,510-515(1993)）よ
りＢａｍＨＩを用いて切り出し、ｐＢＴＭ１１６Ｍに挿
入することでＬｅｘＡ−Ｒａｃ１およびＬｅｘＡ−Ｃｄ
ｃ４２をそれぞれ作製した。その後、これらのクローン
はｌａｃＺ発現の解析に直接用いた。

【００４６】その結果、酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムでは、ＶＡＤ−Ｃ２１はＣＡＡＸボックスおよびｐ
ｏｌｙｂａｓｉｃ領域を欠いたＲｈｏＡΔＣおよびＲｈ
ｏＣΔＣと強い陽性の結合を示し、ＲｈｏＢΔＣとは弱
い陽性の結合を示した（図１）。Ｃ末端領域を欠失した
Ｒｈｏタンパク質は、全長のＲｈｏタンパク質に比べて
遥に強い結合を示した。この理由は、ＣＡＡＸボックス
が存在すると細胞膜へ極在する傾向があることによる
か、あるいは全長のバイトが内在性の酵母タンパク質と
より結合しやすいためであると考えられる。このため、
全長のバイトを使用した場合、転写を活性化する複合体
の形成に充分なバイト・タンパク質の量が得られないと
推測される。また、ＶＡＤ−Ｃ２１は、ＬｅｘＡ−Ｒａ
ｃ１ともＬｅｘＡ−Ｃｄｃ４２とも全く結合しないこと
も明かとなった。

【００４７】全長Ｒｈｏｔｅｋｉｎの結合を酵母ツー・
ハイブリッド・システムで解析するために、ｐＳＫのマ
ルチクローニング部位内のＦｓｐＩ部位から３’Ｘｈｏ
Ｉ部位までのＲｈｏｔｅｋｉｎｃＤＮＡの全長コーデ
ィング配列（実施例５参照）をｐＶＰ１６のＮｏｔＩ部
位中に挿入し、プラスミドｐＶＰ１６−Ｒｈｏｔｅｋｉ
ｎ（全長）を構築した。その結果、この場合もまた、酵
母ツー・ハイブリッド・システムで、オリジナルなｃＤ
ＮＡクローンで観察されたのと同様の結合が観察された
（図１）。このことより、ｉｎｖｉｖｏでのＲｈｏタ
ンパク質結合活性は、限定されたＮ末端断片ばかりでな
く、全長のタンパク質の性質でもあることが示された。

【００４８】実施例３リガンド・オーバーレイ・アッ
セイを用いたＲｈｏｔｅｋｉｎの結合特異性の解析次に、Ｃ２１ペプチドをバクテリアを用いてＧＳＴ−融
合タンパク質として発現させ、これと様々な低分子量Ｇ
タンパク質とのｉｎｖｉｔｒｏでの結合を、下記に記
載する様に、リガンド・オーバーレイ・アッセイによっ
て検討した。ｐＶＰ１６−Ｃ２１由来の挿入断片をｐＧ
ＥＸ−２Ｘ（ファルマシア・バイオテック社）へトラン
スファーして、ｐＧＥＸ−Ｃ２１とした。ｐＧＥＸ−Ｒ
ｈｏｔｅｋｉｎ（配列番号１のアミノ酸の７〜１１３
番）を、ＦｓｐＩとＢａｍＨＩ部位の間のＲｈｏｔｅｋ
ｉｎコーディング配列をｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア
・バイオテック社）に導入することにより作製した。こ
れらのプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株中でＧＳＴ−融合
タンパク質として発現させ、トータルの大腸菌ＤＨ５α
のライゼートのタンパク質５μｇ量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
にかけ、電気泳動的にニトロセルロース膜（Schleicher
& Schell 社）にトランスファーした。接着したタンパ
ク質をフィルター上でリネイチャーした後、E. Manser
et al., Nature 367, 40-46 (1994)に記載の方法に従っ
て、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳまたは［^３５Ｓ］ＧＤＰβＳ
（共に１，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Dupont-New Engla
nd Nuclear社）で標識した１０ｐｍｏｌの各低分子量Ｇ
タンパク質とインキュベートした。フィルターを短時間
洗浄し、迅速に乾燥させた。結合をオートラジオグラフ
ィーにより測定した。

【００４９】結果は図２に示される通りであった。発現
誘導をかけていないライゼート（ＵＢ）、ＧＳＴのみを
発現しているライゼート（ＧＳＴ）、ＧＳＴ−Ｃ２１融
合タンパク質を発現しているライゼート（Ｃ２１）、ま
た、全長Ｒｈｏｔｅｋｉｎのアミノ酸の７〜１１３番に
融合したＧＳＴを発現しているライゼート（Ｆｓｐ−Ｂ
ａｍ）について検討した。リネイチャーしたタンパク質
を、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（ＧＴＰ）または［^３５Ｓ］
ＧＤＰβＳ（ＧＤＰ）で標識したそれぞれの低分子量Ｇ
タンパク質で検出した。また、血小板ホモジェネート
（ＰＨ）をポジティブ・コントロールとして用いて、特
徴づけされていないＲｈｏ標的タンパク質（〜１８０ｋ
Ｄａ）およびｐ６５^ＰＡＫと推測されるＲａｃ／Ｃｄｃ
４２標的タンパク質（N. Morii et al., J. Biol. Che
m. 268, 27160-27160 (1993) ）を、それぞれ
［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ−ＲｈｏＡ（ＧＴＰ−ＲｈｏＡ）
および［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ−Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１
（ＧＴＰ−Ｃｄｃ４２およびＧＴＰ−Ｒａｃ１）を用い
て検出した。その結果、強く特異的な結合がＧＴＰ−Ｒ
ｈｏＡに対して、弱い結合がＧＴＰ−ＲｈｏＢに対して
見られたが、ＧＤＰ−ＲｈｏＡ、ＧＴＰ−Ｒａｃ１およ
びＧＴＰ−Ｃｄｃ４２とは全く結合が見られなかった
（図２）。

【００５０】この結果は、酵母ツー・ハイブリッド・シ
ステムで観察された結合プロフィールとよく一致し、Ｇ
ＴＰ結合型Ｒｈｏタンパク質との特異的な結合を明確に
証明するものである。しかしながら、ライブラリーの作
製方法にＰＣＲのステップが含まれるために、Ｃ２１に
は１塩基対のミスセンスＰＣＲ変異と２４塩基対の５’
非コーディング領域が含まれることが、全長のＲｈｏｔ
ｅｋｉｎｃＤＮＡ（実施例５参照）との比較から判明
した。これらの変異がＣ２１ペプチドのＲｈｏ結合活性
を高めたり抑制したりしないことを確認するために、全
長のＲｈｏｔｅｋｉｎｃＤＮＡ由来のＮ末端コーディ
ング配列（配列番号１のアミノ酸配列の７〜１１３番）
をコードするｃＤＮＡ断片を発現させた。その結果、こ
のペプチド（７〜１１３アミノ酸）もまた、ＧＴＰ−Ｒ
ｈｏＡを用いたオーバーレイ・アッセイにおいて陽性で
あることが見い出された（図２）。

【００５１】実施例４ＧＡＰ阻害アッセイによるＲｈ
ｏｔｅｋｉｎの結合特異性の解析ＧＳＴ−Ｃ２１を大腸菌より可溶性のタンパク質として
精製できたので、ＲｈｏＡの内在性およびＧＡＰ−刺激
下のＧＴＰａｓｅ活性に及ぼすＧＳＴ−Ｃ２１の効果
を、下記に記載する方法により検討した。組換え低分子
量Ｇタンパク質およびＲｈｏＧＡＰは、プラスミドｐＧ
ＥＸ−ＲｈｏＡ（N. Morii et al., J. Biol. Chem. 26
8, 27160-27163 (1993) ）、ｐＧＥＸ−Ｒａｃ１、ｐＧ
ＥＸ−Ｃｄｃ４２、ｐＧＥＸ−ＫＧ−ＲｈｏＧＡＰ（C.
A. Lanncaster et al., J. Biol. Chem., 269, 1137-1
142 (1994)）はＧＳＴ−融合タンパク質として大腸菌で
発現させた後、N. Morii et al., J. Biol. Chem.268,
27160-27163 (1993) に記載の方法に従って調製した。

【００５２】一方、ＧＡＰ阻害アッセイは本質的にはE.
Manser et al., Nature 367, 40-46 (1994)、N. Morii
et al., J. Biol. Chem., 266, 7646-7650 (1991)に記
載の方法に従って実施した。まず最初に、［γ-
^３２Ｐ］ＧＴＰ（３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Dupont-New Eng
land Nuclear社）をＧＳＴ−ＲｈｏＡ（８０〜１００
ｐｍｏｌ）に、バッファーＡ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ・
ＮａＯＨ，ｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
、１０ｍＭジチオスレイトール）中でロードした。
次に、内在性のＧＴＰ加水分解速度を、２０ｐｍｏｌ
のＲｈｏＡ−［^３２Ｐ］ＧＴＰを含む５０μｌのバッフ
ァーＢ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ・ＮａＯＨ，ｐＨ７．
５、１ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）中で
３０℃でインキュベートすることにより測定した。各５
μｌ（デュプリケート）を、反応開始後０、２．５、
５、１０、１５分後に取り出し、ＢＡ８５膜にアプライ
した。各反応後に加水分解されないで残っているＲｈｏ
Ａタンパク質に結合した［^３２Ｐ］ＧＴＰの量を、フィ
ルターに接着した放射能活性の量により決定した。

【００５３】ＧＡＰに触媒されたＧＴＰ加水分解速度を
１μｇの精製ＧＳＴ−ＲｈｏＧＡＰの存在下で測定し
た。内在性およびＧＡＰに刺激されたＧＴＰ加水分解速
度に対するＧＳＴ−Ｃ２１の効果は、［^３２Ｐ］ＧＴＰ
−ＲｈｏＡを５μｇのＧＳＴ−Ｃ２１と氷冷下で５分間
プレインキュベートした後、３０℃の反応槽に移すこと
で決定した。内在性およびＧＡＰに触媒されたＲｈｏＡ
のＧＴＰ加水分解酵素活性に対するＧＳＴ−Ｃ２１の容
量依存的効果は、０、１、２．５、５、７．５、１０μ
ｇのＧＳＴ−Ｃ２１を８ｐｍｏｌのＧＴＰ−ＲｈｏＡ
と、０．５μｇのＧＳＴ−ＲｈｏＧＡＰの存在下または
非存在下で、５０μｌのバッファーＢ中で５分間、氷冷
下でプレインキュベートした後、３０℃の反応槽に移し
て５分間インキュベートすることにより決定した。

【００５４】その結果、ＧＳＴ−Ｃ２１は内在性および
ＧＡＰ−刺激下のＧＴＰ加水分解を阻害し、その阻害が
濃度依存的に起きることがわかった（図３）。このこと
より、ＧＳＴ−Ｃ２１が既に知られたＲｈｏ結合タンパ
ク質（ＲｈｏＧＡＰ）とＲｈｏ結合に関して競合するば
かりでなく、Ｒａｃ１／Ｃｄｃ４２とｐ６５^ＰＡＫある
いはＲａｃ１とｐ１２０^ＡＣＫと同様の様式で、Ｒｈｏ
タンパク質ＧＴＰａｓｅの内在的な加水分解酵素活性に
影響を与えうることが示された（E. Manser etal., Nat
ure 367, 40-46 (1994)、E. Manser et al., Nature 36
3, 364-367 (1993)）。

【００５５】実施例５全長マウスＲｈｏｔｅｋｉｎ
ｃＤＮＡのクローニングＣ２１ｃＤＮＡをハイブリダイゼーション・プローブと
して用いたマウス脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ングを、下記に記載する方法に従って実施した。λＺＡ
Ｐ（Stratagene社）中に挿入されたマウス脳オリゴｄＴ
プライムドｃＤＮＡライブラリーを用いて全長のＲｈｏ
ｔｅｋｉｎｃＤＮＡを単離した。１．１×１０^６の独
立したクローンを、ナイロンフィルター膜（Dupont Pla
quescreen ）を用いて、^３２Ｐ−標識Ｃ２１ｃＤＮＡと
のハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
プローブのハイブリダイゼーションとそれに続くフィル
ターの洗浄は、J. Sambrook et al., Molecular Clonin
g (2nd edition), Cold Spring Harbour Laboratory Pr
ess, New York (1989)に記載の方法に従って実施した。
陽性のクローンは１回再スクリーニングした後、プラス
ミドＤＮＡはＸＬ−１Ｂｌｕｅ大腸菌とヘルパー・フ
ァージＶＣＳＭ１３（Stratagene社）を用いて、製造
企業の使用説明書に従って回収した。塩基配列の決定
は、両方のストランド（strand）について、ダイデオキ
シ・チェーン・ターミネーション法を用いて実施した。

【００５６】その結果、１．１×１０^６の独立したクロ
ーンより１５の陽性クローンが得られた。３クローンは
２．７ｋｂｐのｃＤＮＡを挿入断片として有し、これら
は同一のものであることがわかった（ｔｙｐｅ１ｃ
ＤＮＡ）（配列番号２）。しかしながら、複数のスプラ
イシングの構成が普通に見られ、全長では他の挿入断片
がいくつか認められた。Ｔｙｐｅ２ｃＤＮＡは、３
７６番目の塩基（配列ＧＡＧ／ＧＣ）および１９１１番
目の塩基（ＡＴＧ／ＧＣ）での、２つのエクソンの交換
を含んでいる。前者は５’の非コーディング領域中に位
置する。６６２番目の塩基（配列ＧＡＧ／ＧＡ）での第
３番目のエクソン交換がもうひとつのｃＤＮＡで見つか
った。Ｔｙｐｅ１ｃＤＮＡは、塩基配列５９１番目
のＡＴＧで始まり、５５１アミノ酸残基からなる計算上
の分子量が６１ｋＤａであり、本発明者らがマウスのＲ
ｈｏｔｅｋｉｎと命名したタンパク質をコードするひと
つのオープン・リーディング・フレームで特徴付けられ
る。２つのプロリン−リッチ・モチーフがＲｈｏｔｅｋ
ｉｎのＣ末端付近（配列番号１のアミノ酸配列の４２１
〜４２７番，ＰＡＰＲＫＰＰ、および同５２５〜５３３
番，ＰＬＰＰＱＲＳＰＫ）に見つかった。このような領
域は最近、非常に多くのＳＨ３グループが結合するリガ
ンドに一般的なモチーフとして記載されている（K. Ale
xandropouloset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
3110-3114 (1995)）。

【００５７】Ｃ２１ｃＤＮＡは配列番号２の塩基配列５
６７〜８５７番をカバーし、ＲｈｏｔｅｋｉｎのＮ末端
側のペプチド（配列番号１のアミノ酸配列の１〜８９
番）をコードすることがわかった。Ｒｈｏｔｅｋｉｎ断
片（同７〜１１３番）（実施例３）を用いて得られた知
見と考え合わせて、Ｒｈｏタンパク質結合領域は同アミ
ノ酸配列７〜８９番の間に位置すると推測される。

【００５８】実施例６ノザン・ブロッティングによる
ＲｈｏｔｅｋｉｎｍＲＮＡを発現する組織の検索全長ｃＤＮＡをプローブとして用いてＲｈｏｔｅｋｉｎ
ｍＲＮＡ発現をノザン・ブロッティングにより、下記
に記載する方法に従って解析した。

【００５９】トータルＲＮＡを、記載（J. Sambrook et
al., Molecular Cloning (2nd edition), Cold Spring
Harbour Laboratory Press, New York (1989)）の方法
に従って、切り刻んだマウスの組織より単離し、ポリ
（Ａ）^＋ＲＮＡをオリゴｄＴ−ラテックス・ビーズ（Ph
armacia 社）を用いて精製した。２μｇのポリ（Ａ）^＋
ＲＮＡを１．２％ホルムアミド−アガロース・ゲルを用
いた電気泳動により単離し、ナイロン膜にトランスファ
ーし、ＵＶによるクロス・リンキングによって固定化し
た。固定化した膜と、全長ＲｈｏｔｅｋｉｎｃＤＮＡ
を含む^３２Ｐ−標識したＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片を、５
０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭＴｒｉｓ・
ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．
１％ＳＤＳ、２００ｍｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ中で、４２
℃で１６時間ハイブリダイズした。フィルターを０．５
×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄し、Fuji Bas
2000 Bioimage Analyzerで解析した。その結果、脳およ
び腎臓組織に約３ｋｂの転写産物が存在することが明か
になった（図４）。また、弱い発現が、肺、精巣、骨格
筋、心臓および胸線に見られた。

【００６０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５５１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源：生物名：マウス配列の特徴特徴を表す記号：ｂｉｎｄｉｎｇ−ｓｉｔｅ存在位置：７．．８９特徴を決定した方法：Ｅ配列 Met Gln Asp Arg Leu Arg Ile Leu Glu Asp Leu Asn Met Leu Tyr Ile 1 5 10 15 Arg Gln Met Ala Leu Ser Leu Glu Asp Thr Glu Leu Gln Arg Lys Leu 20 25 30 Asp His Glu Ile Arg Met Arg Asp Gly Ala Cys Lys Leu Leu Ala Ala 35 40 45 Cys Ser Gln Arg Glu Gln Ala Leu Glu Ala Thr Lys Ser Leu Leu Val 50 55 60 Cys Asn Ser Arg Ile Leu Ser Tyr Met Gly Glu Leu Gln Arg Arg Lys 65 70 75 80 Glu Ala Gln Val Leu Glu Lys Thr Gly Arg Arg Pro Ser Asp Ser Val 85 90 95 Gln Pro Ala Gln His Ser Pro Cys Arg Gly Arg Val Cys Ile Ser Asp 100 105 110 Leu Arg Ile Pro Leu Met Trp Lys Asp Thr Glu Tyr Phe Lys Asn Lys 115 120 125 Gly Asp Leu His Arg Trp Ala Val Phe Leu Leu Leu Gln Ile Gly Glu 130 135 140 Gln Ile Gln Asp Thr Glu Met Val Leu Val Asp Arg Thr Leu Thr Asp 145 150 155 160 Ile Ser Phe Gln Asn Asn Val Leu Phe Ala Glu Ala Glu Pro Asp Phe 165 170 175 Glu Leu Arg Leu Glu Leu Tyr Gly Ala Cys Val Glu Glu Glu Gly Ala 180 185 190 Leu Ala Gly Ala Pro Lys Arg Leu Ala Thr Lys Leu Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Arg Ser Ser Gly Lys Arg Val Arg Ala Ser Leu Asp Ser Ala Gly 210 215 220 Ala Ser Gly Asn Ser Pro Val Leu Leu Pro Thr Pro Ala Val Gly Gly 225 230 235 240 Pro Arg Phe His Leu Leu Ala His Thr Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val 245 250 255 Gln Asp Gly Phe Arg Thr His Asp Leu Thr Leu Thr Ser His Glu Glu 260 265 270 Asn Pro Ala Trp Leu Pro Leu Tyr Gly Ser Val Cys Cys Arg Leu Ala 275 280 285 Ala Gln Pro Leu Cys Met Ile Gln Pro Thr Ala Ser Gly Ala Leu Arg 290 295 300 Val Gln Gln Ala Gly Glu Leu Gln Asn Gly Thr Leu Val His Gly Val 305 310 315 320 Leu Lys Gly Thr Asn Leu Phe Cys Tyr Trp Arg Ser Glu Asp Ala Asp 325 330 335 Thr Gly Gln Glu Pro Leu Phe Thr Ile Val Ile Asn Lys Glu Thr Arg 340 345 350 Val Arg Ala Gly Glu Leu Glu Gln Ala Pro Glu Trp Pro Phe Thr Leu 355 360 365 Ser Ile Ser Asn Lys Tyr Gly Asp Asp Glu Val Thr Asn Thr Leu Gln 370 375 380 Leu Glu Ser Arg Glu Ala Leu Gln Asn Trp Met Glu Ala Leu Trp Gln 385 390 395 400 Leu Phe Phe Asp Met Ser Gln Trp Arg His Cys Cys Asp Glu Val Met 405 410 415 Lys Ile Glu Thr Pro Ala Pro Arg Lys Pro Pro Gln Ala Leu Val Lys 420 425 430 Gln Gly Ser Leu Tyr His Glu Met Ala Ile Glu Pro Leu Asp Asp Ile 435 440 445 Ala Ala Val Thr Asp Ile Leu Ala Gln Arg Glu Gly Thr Arg Leu Glu 450 455 460 Pro Ser Pro Pro Trp Leu Ala Met Phe Thr Asp Gln Pro Ala Leu Pro 465 470 475 480 Ser Ser Cys Ser Pro Ala Ser Val Ala Pro Val Pro Thr Trp Met Gln 485 490 495 Pro Leu Pro Trp Gly Arg Pro Arg Thr Phe Ser Leu Asp Ala Ala Pro 500 505 510 Ala Asp His Ser Leu Gly Pro Ser Arg Ser Val Ala Pro Leu Pro Pro 515 520 525 Gln Arg Ser Pro Lys Ser Arg Gly Phe Tyr Ser Lys Ser Gln Leu Gly 530 535 540 Pro Trp Leu Gln Ser Pro Val 545 550

【００６１】配列番号：２配列の長さ：２６０２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源：生物名：マウス配列 GGCACGAGGT CATCCTCCCG CCCCAGCAAC TTAGACCCAA GGAACCCGCG CGTGGCCAGC 60 GTCGGGGAGT CAGGGGCGAG GTTGGGGACC TGGAGGAGGG CTCGTGTTCC TGAGCCTTGC 120 AAGGATATGC CAGGCCTTGG GAGCCATAGC TGAGGAGTCG GGGCGGAGCT GCTGGGCCAG 180 GCCTGCCGCC GGGTTGAGTG TGACTCCACG GTCCCGGAGT AGGGGGGTGG GGGACAGCCC 240 TGCAGCTGGC TGGGACCCGG GGCTGGTTTC CTGTCTGGAA GGGAAGGGGC CCCGAGAGGG 300 GATCAGGGCC AGCAGCAGCC AGGCACACCC CTGACTTTCT CCCTCTCTCT CTCCTCCCTT 360 CTGCTGGAAA AGCGAGGCCT TGGAACAGCG CTAGGAGAGA AACTTTTGTC ACAGAAGCCA 420 AAGGGGTCTA ACAGGACTGC AGAGGGACAG GGACAGACTC TGCATTCTGT CCCAGAGCTG 480 GACACCTCTC TCGAGCCCGG GGAGCAGTGG GAGGAGGAAC TGTGGGACAA CGTGGTGCCT 540 ACCTGGCCTC TCTCCGGGCA GCAAGGGAAG GGGCTTTAGG GGACACAGAG ATG CAG GAC 599 Met Gln Asp 1 AGA TTG CGC ATC CTG GAG GAC CTC AAT ATG CTC TAC ATC CGG CAG ATG 647 Arg Leu Arg Ile Leu Glu Asp Leu Asn Met Leu Tyr Ile Arg Gln Met 5 10 15 GCA CTC AGC CTG GAG GAC ACA GAG CTG CAG AGG AAA CTA GAT CAT GAG 695 Ala Leu Ser Leu Glu Asp Thr Glu Leu Gln Arg Lys Leu Asp His Glu 20 25 30 35 ATC CGG ATG AGG GAT GGG GCC TGC AAG CTG CTG GCA GCC TGC TCC CAG 743 Ile Arg Met Arg Asp Gly Ala Cys Lys Leu Leu Ala Ala Cys Ser Gln 40 45 50 CGA GAG CAG GCT CTG GAA GCC ACC AAG AGC CTG CTG GTG TGC AAC AGC 791 Arg Glu Gln Ala Leu Glu Ala Thr Lys Ser Leu Leu Val Cys Asn Ser 55 60 65 CGT ATT CTC AGC TAC ATG GGT GAG CTG CAG CGG CGA AAG GAG GCC CAG 839 Arg Ile Leu Ser Tyr Met Gly Glu Leu Gln Arg Arg Lys Glu Ala Gln 70 75 80 GTG CTG GAG AAG ACA GGC AGG CGA CCT TCG GAC AGT GTG CAG CCT GCT 887 Val Leu Glu Lys Thr Gly Arg Arg Pro Ser Asp Ser Val Gln Pro Ala 85 90 95 CAG CAC TCC CCT TGC CGT GGC CGG GTC TGC ATC TCT GAC CTC CGG ATC 935 Gln His Ser Pro Cys Arg Gly Arg Val Cys Ile Ser Asp Leu Arg Ile 100 105 110 115 CCA CTC ATG TGG AAG GAT ACA GAG TAT TTC AAG AAC AAA GGC GAC CTG 983 Pro Leu Met Trp Lys Asp Thr Glu Tyr Phe Lys Asn Lys Gly Asp Leu 120 125 130 CAC CGC TGG GCT GTG TTC CTG CTG CTG CAG ATT GGG GAA CAG ATT CAG 1031 His Arg Trp Ala Val Phe Leu Leu Leu Gln Ile Gly Glu Gln Ile Gln 135 140 145 GAC ACA GAG ATG GTC CTG GTA GAC AGG ACC CTC ACA GAC ATC TCC TTT 1079 Asp Thr Glu Met Val Leu Val Asp Arg Thr Leu Thr Asp Ile Ser Phe 150 155 160 CAG AAC AAT GTG CTT TTT GCT GAG GCA GAG CCT GAC TTT GAA CTG CGG 1127 Gln Asn Asn Val Leu Phe Ala Glu Ala Glu Pro Asp Phe Glu Leu Arg 165 170 175 CTG GAG CTG TAT GGG GCC TGT GTG GAA GAG GAG GGA GCC CTG GCT GGT 1175 Leu Glu Leu Tyr Gly Ala Cys Val Glu Glu Glu Gly Ala Leu Ala Gly 180 185 190 195 GCT CCC AAG AGG CTT GCC ACC AAA CTC AGT AGC TCC CTG GGC CGT TCC 1223 Leu Ala Gly Arg Leu Ala Thr Lys Leu Ser Ser Ser Leu Gly Arg Ser 200 205 210 TCG GGG AAG AGA GTC AGG GCA TCG CTG GAC AGT GCT GGG GCC TCC GGG 1271 Ser Gly Lys Arg Val Arg Ala Ser Leu Asp Ser Ala Gly Ala Ser Gly 215 220 225 AAC AGT CCC GTC CTG TTA CCT ACC CCA GCT GTG GGA GGT CCT CGA TTC 1319 Asn Ser Pro Val Leu Leu Pro Thr Pro Ala Val Gly Gly Pro Arg Phe 230 235 240 CAC CTC TTG GCC CAC ACC ACT CTT ACC CTA GAA GAA GTG CAA GAT GGA 1367 His Leu Leu Ala His Thr Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Gln Asp Gly 245 250 255 TTC CGT ACA CAT GAC CTC ACG CTC ACC AGT CAT GAG GAG AAC CCT GCC 1415 Phe Arg Thr His Asp Leu Thr Leu Thr Ser His Glu Glu Asn Pro Ala 260 265 270 275 TGG CTA CCC CTT TAT GGC AGC GTG TGT TGC CGC CTG GCA GCT CAG CCT 1463 Trp Leu Pro Leu Tyr Gly Ser Val Cys Cys Arg Leu Ala Ala Gln Pro 280 285 290 CTC TGC ATG ATC CAG CCC ACT GCA AGT GGT GCC CTT AGG GTG CAG CAA 1511 Leu Cys Met Ile Gln Pro Thr Ala Ser Gly Ala Leu Arg Val Gln Gln 295 300 305 GCC GGG GAG CTG CAG AAT GGG ACA CTG GTA CAT GGA GTC CTG AAA GGC 1559 Ala Gly Glu Leu Gln Asn Gly Thr Leu Val His Gly Val Leu Lys Gly 310 315 320 ACA AAC CTC TTT TGT TAC TGG AGA TCT GAG GAT GCA GAC ACT GGG CAA 1607 Thr Asn Leu Phe Cys Tyr Trp Arg Ser Glu Asp Ala Asp Thr Gly Gln 325 330 335 GAA CCA CTG TTC ACT ATC GTC ATC AAC AAG GAG ACT AGG GTC CGG GCA 1655 Glu Pro Leu Phe Thr Ile Val Ile Asn Lys Glu Thr Arg Val Arg Ala 340 345 350 355 GGT GAG TTG GAG CAG GCC CCA GAG TGG CCT TTC ACC CTC AGC ATC AGC 1703 Gly Glu Leu Glu Gln Ala Pro Glu Trp Pro Phe Thr Leu Ser Ile Ser 360 365 370 AAC AAG TAT GGG GAT GAT GAG GTG ACA AAC ACC CTC CAG CTG GAG AGC 1751 Asn Lys Tyr Gly Asp Asp Glu Val Thr Asn Thr Leu Gln Leu Glu Ser 375 380 385 AGA GAA GCC CTG CAG AAC TGG ATG GAG GCG CTT TGG CAG CTC TTC TTT 1799 Arg Glu Ala Leu Gln Asn Trp Met Glu Ala Leu Trp Gln Leu Phe Phe 390 395 400 GAC ATG AGC CAG TGG AGG CAC TGT TGT GAT GAA GTC ATG AAG ATC GAA 1847 Asp Met Ser Gln Trp Arg His Cys Cys Asp Glu Val Met Lys Ile Glu 405 410 415 ACT CCT GCG CCC CGG AAA CCA CCC CAA GCC CTG GTC AAG CAG GGG TCC 1895 Thr Pro Ala Pro Arg Lys Pro Pro Gln Ala Leu Val Lys Gln Gly Ser 420 425 430 435 TTA TAC CAC GAG ATG GCC ATT GAG CCG CTA GAC GAC ATC GCA GCT GTG 1943 Leu Tyr His Glu Met Ala Ile Glu Pro Leu Asp Asp Ile Ala Ala Val 440 445 450 ACA GAC ATC CTG GCC CAG CGG GAG GGC ACA AGG CTG GAG CCA TCC CCA 1991 Thr Asp Ile Leu Ala Gln Arg Glu Gly Thr Arg Leu Glu Pro Ser Pro 455 460 465 CCC TGG CTA GCA ATG TTT ACA GAC CAG CCT GCC TTG CCT AGC TCC TGC 2039 Pro Trp Leu Ala Met Phe Thr Asp Gln Pro Ala Leu Pro Ser Ser Cys 470 475 480 TCG CCT GCC TCA GTG GCC CCA GTC CCA ACC TGG ATG CAA CCC CTG CCC 2087 Ser Pro Ala Ser Val Ala Pro Val Pro Thr Trp Met Gln Pro Leu Pro 485 490 495 TGG GGA AGA CCC CGA ACC TTT TCC CTG GAT GCT GCC CCT GCA GAC CAC 2135 Trp Gly Arg Pro Arg Thr Phe Ser Leu Asp Ala Ala Pro Ala Asp His 500 505 510 515 TCC CTT GGG CCT TCT CGC TCG GTT GCA CCC CTT CCC CCG CAG AGA TCC 2183 Ser Leu Gly Pro Ser Arg Ser Val Ala Pro Leu Pro Pro Gln Arg Ser 520 525 530 CCC AAA TCC AGA GGT TTC TAC AGC AAA AGC CAG CTC GGC CCA TGG CTC 2231 Pro Lys Ser Arg Gly Phe Tyr Ser Lys Ser Gln Leu Gly Pro Trp Leu 535 540 545 CAG TCC CCA GTG TGAGAGGAAC CAGCAACAGG ATCTGGCCAA GAAAGAAAAT 2283 Gln Ser Pro Val 550 GACCCAAGGA CAACTGGGCT CTAGGTCCAG CACTGTGGGG CACCAGTTGG CCAGCCTGGG 2343 CTCCTCTTCC TCCACTGGAC TAGGACGGAA GGCTGGGGAG GGGTAATGGA AACCCCTCTT 2403 AAGTTGTGGC TATCATGGTA CAGAGGGGGA CCATTCCTGG AGCTGGCTAG GATTCCCCTA 2463 AGCGCTTCCT GGGAGAAAAC TGGAACAACT CTGCCCTATC TGCCTGCACT AACCAGCCTC 2523 CAGGGCGGCA ACGGAGAGTG GAGAGGAAAG CACCTCCCCC CGTGATCCCA ATATCAACCA 2583 TTAAAGTTAT TTAACAGCT 2602

【図面の簡単な説明】

【図１】酵母ツー・ハイブリッド・システムにより、Ｒ
ｈｏｔｅｋｉｎのＮ末端とＲｈｏファミリーのメンバー
との結合を示した図である。酵母ツー・ハイブリッド・
システムにおいて様々なＬｅｘＡ−融合タンパク質と
（ｉ）挿入断片を有しないＶＡＤ、（ii）ＶＡＤ−Ｃ２
１、（iii ）全長のＲｈｏｔｅｋｉｎを含むＶＡＤとの
結合を示した。

【図２】リガンド・オーバーレイ・アッセイにより、Ｒ
ｈｏｔｅｋｉｎのＮ末端および全長とＲｈｏファミリー
のメンバーとの結合を示した図である。ＵＢ：発現誘導
をかけていないライゼート、ＧＳＴ：ＧＳＴのみを発現
しているライゼート、Ｃ２１：ＧＳＴ−Ｃ２１融合タン
パク質を発現しているライゼート、Ｆｓｐ−Ｂａｍ：全
長Ｒｈｏｔｅｋｉｎ由来のアミノ酸配列７〜１１３番
（配列番号１）に融合したＧＳＴを発現しているライゼ
ート。ＰＨ：血小板ホモジェネート。

【図３】ＧＡＰ阻害試験の結果を示した図である。（ｉ）経時的な変化を示す。丸印：２０ｐｍｏｌの［γ
−^３２Ｐ］ＧＴＰ−ＲｈｏＡ単独、三角印：１μｇのＧ
ＡＰ存在下、四角印：５μｇのＧＳＴ−Ｃ２１存在下、
菱形印：１μｇのＧＡＰおよび５μｇのＧＳＴ−Ｃ２１
存在下。（ii）内在性およびＧＡＰ−刺激下のＲｈｏＡのＧＴＰ
ａｓｅ活性に及ぼすＧＳＴ−Ｃ２１の濃度依存的な影響
を示した図である。丸印：内在性のＲｈｏＡＧＴＰａｓ
ｅ活性、四角印：ＧＡＰ−刺激下のＲｈｏＡのＧＴＰａ
ｓｅ活性。結果は代表的な典型的結果であり、反復デー
タの変化率は〜７％以内であった。

【図４】マウスでのＲｈｏｔｅｋｉｎ転写産物の組織分
布を示した図である。Ｂ：脳、Ｈ：心臓、Ｔ：胸線、Ｌｕ：肺、Ｌ：肝臓、Ｓ
Ｉ：小腸、ＬＩ：大腸、Ｋ：腎臓、Ｓ：脾臓、Ｔ：精
巣、ＳＭ：骨格筋。

【手続補正書】

【提出日】平成８年４月１１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】酵母ツー・ハイブリッド・システムにおけるβ
−ガラクトシダーゼフィルターアッセイの写真である。
ＲｈｏｔｅｋｉｎのＮ末端とＲｈｏファミリーのメンバ
ーとの結合が示される。酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムにおいて様々なＬｅｘＡ−融合タンパク質と（ｉ）
挿入断片を有しないＶＡＤ、（ｉｉ）ＶＡＤ−Ｃ２１、
（ｉｉｉ）全長のＲｈｏｔｅｋｉｎを含むＶＡＤとの結
合を示した。

【図２】ＲｈｏｔｅｋｉｎのＮ末端および全長とＲｈｏ
ファミリーのメンバーとの結合を示したリガンド・オー
バーレイ・アッセイの写真（電気泳動写真）である。Ｕ
Ｂ：発現誘導をかけていないライゼート、ＧＳＴ：ＧＳ
Ｔのみを発現しているライゼート、Ｃ２１：ＧＳＴ−Ｃ
２１融合タンパク質を発現しているライゼート、Ｆｓｐ
−Ｂａｍ：全長Ｒｈｏｔｅｋｉｎ由来のアミノ酸配列７
〜１１３番（配列番号１）に融合したＧＳＴを発現して
いるライゼート。ＰＨ：血小板ホモジェネート。

【図３】ＧＡＰ阻害試験の結果を示した図である。（ｉ）経時的な変化を示す。丸印：２０ｐｍｏｌの［γ
−^３２Ｐ］ＧＴＰ−ＲｈｏＡ単独、三角印：１μｇのＧ
ＡＰ存在下、四角印：５μｇのＧＳＴ−Ｃ２１存在下、
菱形印：１μｇのＧＡＰおよび５μｇのＧＳＴ−Ｃ２１
存在下。（ｉｉ）内在性およびＧＡＰ−剌激下のＲｈｏＡのＧＴ
Ｐａｓｅ活性に及ぼすＧＳＴ−Ｃ２１の濃度依存的な影
響を示した図である。丸印：内在性のＲｈｏＡＧＴＰａ
ｓｅ活性、四角印：ＧＡＰ−剌激下のＲｈｏＡのＧＴＰ
ａｓｅ活性。結果は代表的な典型的結果であり、反復デ
ータの変化率は〜７％以内であった。

【図４】マウスでのＲｈｏｔｅｋｉｎ転写産物の組織分
布を示したノザン・ブロッティングの写真（電気泳動写
真）である。Ｂ：脳、Ｈ：心臓、Ｔ：胸線、Ｌｕ：肺、Ｌ：肝臓、Ｓ
Ｉ：小腸、ＬＩ：大腸、Ｋ：腎臓、Ｓ：脾臓、Ｔ：精
巣、ＳＭ：骨格筋。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/48 Ｚ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/48 9282−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
つＲｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性を阻害する、タ
ンパク質またはその改変タンパク質。
【請求項２】Ｒｈｏタンパク質が、ＲｈｏＡタンパク
質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク質、または
ＲｈｏＧタンパク質である、請求項１に記載のタンパク
質またはその改変タンパク質。
【請求項３】ホ乳類由来である、請求項１または２に記
載のタンパク質またはその改変タンパク質。
【請求項４】マウス由来である、請求項３に記載のタン
パク質またはその改変タンパク質。
【請求項５】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部も
しくは全部またはその等価配列を含んでなる、請求項１
〜４いずれか一項に記載のタンパク質またはその改変タ
ンパク質。
【請求項６】請求項１〜５いずれか一項に記載のタンパ
ク質またはその改変タンパク質の部分アミノ酸配列を含
んでなるタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が活
性型Ｒｈｏタンパク質結合能および／または活性型Ｒｈ
ｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ活性阻害能を有するものであ
る、タンパク質。
【請求項７】部分アミノ酸配列が、配列番号１の７〜８
９番のアミノ酸配列またはその一部からなるものであ
る、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部も
しくは全部またはその等価配列を含んでなる、タンパク
質。
【請求項９】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部も
しくは全部またはその等価配列からなる、タンパク質。
【請求項１０】請求項１〜９いずれか一項に記載のタン
パク質または改変タンパク質をコードする、塩基配列。
【請求項１１】ホ乳類由来である、請求項１０に記載の
塩基配列。
【請求項１２】マウス由来である、請求項１１に記載の
塩基配列。
【請求項１３】配列番号２に記載のＤＮＡ配列の一部ま
たは全部を含んでなる、請求項１０〜１２いずれか一項
に記載の塩基配列。
【請求項１４】請求項１０〜１３いずれか一項に記載の
塩基配列を含んでなる、ベクター。
【請求項１５】プラスミドベクター、ウイルスベクタ
ー、およびリポソームベクターからなる群から選択され
るものである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】請求項１４または１５に記載のベクター
によって形質転換された、宿主細胞（ただし、ヒト細胞
にあってはヒトから単離された細胞に限る）。
【請求項１７】大腸菌、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、
リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、お
よび腫瘍細胞からなる群から選択されるものである、請
求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】請求項１６または１７に記載の宿主細胞
を培養し、その培養物から請求項１〜９いずれか一項に
記載のタンパク質を単離することを含んでなる、請求項
１〜９いずれか一項に記載のタンパク質の製造法。
【請求項１９】請求項１〜９いずれか一項に記載のタン
パク質またはその改変タンパク質を含んでなる、腫瘍形
成または転移抑制剤。
【請求項２０】請求項１〜９いずれか一項に記載のタン
パク質またはその改変タンパク質をコードする塩基配列
を含んでなる、腫瘍形成または転移抑制用遺伝子治療
剤。
【請求項２１】（１）スクリーニングの対象となる物質
を、活性型Ｒｈｏタンパク質と請求項１〜９に記載のタ
ンパク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜９に記載
のタンパク質との結合の阻害の程度を測定することを含
んでなる、活性型Ｒｈｏタンパク質および請求項１〜９
に記載のタンパク質との結合を阻害する物質のスクリー
ニング法。
【請求項２２】スクリーニング系が細胞系または無細胞
系である、請求項２１に記載のスクリーニング法。
【請求項２３】スクリーニング系が、酵母ツー・ハイブ
リッド・システムである、請求項２１または２２に記載
のスクリーニング法。
【請求項２４】活性型Ｒｈｏタンパク質がそのＣ末端領
域を欠失したものである、請求項２３に記載のスクリー
ニング法。
【請求項２５】スクリーニング系に、更に、Ｒｈｏタン
パク質ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質を存在させる、請
求項２１または２２に記載のスクリーニング法。
【請求項２６】腫瘍形成阻害物質のスクリーニング法で
ある、請求項２１〜２５いずれか一項に記載のスクリー
ニング法。