JPH09509828A - 標的遺伝子損傷をした動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、コロニー刺激因子をコードする遺伝子が特定的に損傷されたトランスジェニック非ヒト動物を提供するものである。具体的実施例において、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ及び／又はＣＳＦ−１の発現が損傷されたマウスを提供する。これらの動物は、それぞれのタイプのどのような対生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ）ＣＳＦも産生しない。これらは、種々の条件のためのモデルとして、特に、治療方法のテスト用モデル、として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 標的遺伝子損傷をした動物 本発明は、既存の内生遺伝子座において特定構成の変質を有する動物、即ち、 特定の遺伝子が標的化損傷された動物に関する。詳しくは、本発明は、あるコロ ニー刺激因子のための遺伝子が損傷されて空白（ｎｕｌｌ）対立遺伝子を形成し 、これによって、検出可能なコロニー刺激遺伝子をなんら発現しない動物に関す る。前記コロニー刺激遺伝子は、顆粒球−マクロファージ刺激因子又は、顆粒球 コロニー刺激因子である。本発明の一好適実施例において、前記動物は、マウス 等のげっ歯動物である。発明の背景 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、骨髄細胞とそ の前駆体、特に、好中球及び好酸球顆粒球と単球／マクロファージの生存、増殖 、分化及び機能をインヴィトロで活性化する造血成長因子である（レビューとし ては、１を参照）。ＧＭ−ＣＳＦのインヴィヴォ効果は、ネズミモデルにおいて 、薬理投与量のＧＭ−ＣＳＦを注入すること（２）、ＧＭ−ＣＳＦトランスジェ ニックマウスを産生すること（３）、及び、 致死量の放射線を浴びたマウスをＧＭ−ＣＳＦを過剰生産する骨髄細胞によって 再構成すること（４）、によって研究されている。 これらの研究は、インヴィヴォでのＧＭ−ＣＳＦの造血活動を確認するもので あり、過剰レベルのＧＭ−ＣＳＦがいくつかの病理プロセスにおいて関連してい るかもしれないことを示唆するものである。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦの通常 の生理的役割については十分解明されていない（５）。内生的に産生されたＧＭ −ＣＳＦは、通常、血清中では検出不能であり（６）、ヒトにおいては、変化し た血清レベルと造血又は疾患プロセスとはまだはっきり相関付けられてない（１ ，６）。ＧＭ−ＣＳＦが産生されて、局所的に作用することが示唆されているが （１）、ＧＭ−ＣＳＦをインヴィヴォで産生する細胞はまだ同定されていない。 更に、ＧＭ−ＣＳＦが、顆粒球又はマクロファージの定常生産の重要な調節因子 であるのか否か、あるいは、それがバクテリア感染等の攻撃に対する緊急造血の ための調節因子として必要であるか否か、は明らかではない。更に、ＧＭ−ＣＳ Ｆが非造血組織の正常な成長に関与しているのかどうかも知られていない。 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、インヴィ トロで顆粒球形成をコントロールする造血成長因子である。これは、主として好 中球顆粒球の生存、増殖、分化及び機能を活性化する。ＧＭ−ＣＳＦの場合と同 様に、Ｇ−ＣＳＦのインヴィヴォ作用は、ネズミモデルにおいて、薬理投与量の Ｇ−ＣＳＦの注入、及び致死量の放射線を浴びたマウスの、Ｇ−ＣＳＦをコード するｃＤＮＡを有するレトロウィルスベクターによって形質転換された骨髄細胞 による再構成、によって研究されている（参考文献７を参照）。しかしながら、 ＧＭ−ＣＳＦの場合と同様に、Ｇ−ＣＳＦの通常の生理的役割は明白ではない。 これは定常の顆粒球形成における調節因子として作用しているか、又は、感染等 の好中球生産の増大を必要とする特定の攻撃に応答する緊急の顆粒球形成のため の調節因子として作用しているのかもしれない（７）。 Ｇ−ＣＳＦとその単離、キャラクタリゼーション、及び組換え産生については 、例えば、参考文献５及び７において引用されている論文において広範囲に検討 されている。 最近まで、遺伝子研究は、ランダムな突然変異（自発的又は誘発的）の発見、 又は、既存の遺伝子の多形性の発見とに依存していた。しかしながら、組換えＤ ＮＡ技術の急速な進歩と、他の種からの遺伝子に対する類似性 に基づく、あるいは、それらの遺伝子がコードするタンパク質生産物の生化学構 造に基づく、特にマウスに於ける特定遺伝子の同定に於ける急速な進歩によって 、遺伝子の特定標的化された欠失又は改造のための方法が開発された。選択され た遺伝子座のクローン化されたゲノム断片が入手可能であるならば、その遺伝子 を損傷することによって空白対立遺伝子を作り出し、転写パターン、ｍＲＮＡ又 はタンパク質成熟パターン等のその遺伝子の機能特性を変化させたり、あるいは 、そのタンパク質が、他の遺伝子生産物と相互作用する能力を変化させることが 可能である。これは、従来の組換えＤＮＡ法を使用して、所望の突然変異を、選 択された遺伝子のクローン化ＤＮＡ配列中に導入することによって行われ、次に 、その突然変異を、相同組換えによって、多能性胚幹細胞（ＥＳ細胞）のゲノム に転写される。このように生産されたＥＳ細胞は、生殖系（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ）キメラを産生するべく、マウスの胎盤胞にミクロ注入される。次に、その所望 の突然変異のためのホモ接合体の動物を、ヘテロ接合体姉妹細胞の交配によって 作り出す。 これらの技術は、現在、広く使用されており、種々の遺伝子が損傷されたマウ ス系列を作り出すのに利用されており、これらのマウスは、しばしば、「ノック アウト （”ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ”）」マウスと呼ばれている。これらの突然変異の多く は、致命的であり、胎児期、又は周産期に於ける早死をもたらす。この技術は、 特に、免疫的に重要な分子、あるいは、成長因子のための遺伝子が欠失した「ノ ックアウト」マウスを発生させるのに有効であった。これらの技術は十分に確立 しており、ＤＮＡのランダムな組み込みではなく、相同的な組換えを受けた細胞 の選択に役立つ種々のマーカ遺伝子及び遺伝子が入手可能である。多数の論評（ ７ないし１１）が出版されており、トランスジェニックマウス一般を生産するた めの技術は、ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサ ーチ（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ）による国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ９１／１３１１５０に記載されいる。 このような遺伝子の標的化は、可能性を有する治療方法をテストするためのモ デルとして使用可能な、遺伝学的に決定されるヒトの疾患のためのマウスモデル の発生においては有用であり、又、その技術は原理的に十分に確立されたもので はあるが、所与の標的化遺伝子損傷を行なった動物系を生産することが可能であ るか否か、又、もし可能であるならば、そのようなモデルの実用可能な 生産はどの程度迅速に行われるか、そして、使用されるべき最善の経験的アプロ ーチ、を前もって予想することは不可能である。特に、ＥＳ細胞の形質転換の頻 度は、最低で１／４０，０００から最高で１／１５０の範囲で大きく変化する。 形質転換の頻度の最適化に関与している因子のいくつかは知られているが、その 成功を予測することは容易ではない。 我々は、胚幹細胞においてＧＭ−ＣＳＦ遺伝子とＧ−ＣＳＦ遺伝子とをそれぞ れ標的損傷することによって、ＧＭ−ＣＳＦ欠失及びＧ−ＣＳＦ欠失マウスを発 生させた。我々は、ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスは造血に関してなんら大きな問題は 持たないものの、これらはすべて異常な肺を有し、肺の感染症にかかり易く、こ れはＧＭ−ＣＳＦが正常な肺疾患と局所感染に対して抵抗する際に必須であるこ とを示唆している、という驚くべき知見を得た。ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスは、肺 胞タンパク症症候群のモデルシステムとして有用であり、特に、日和見感染症と 、現在利用可能な治療法によっては処置が困難な感染症の研究のためのモデルシ ステムとして特に有効である。 Ｇ−ＣＳＦ欠失マウスは、好中球減少症を有しているが、その末梢に於ける単 球のレベルは正常である。これ らのマウスは、無症状感染症に感染しやすく、抗菌剤の有効性のテスト、特に、 無防備性が増加した環境下に於けるテストに、有効である。これらは、更に、微 生物の毒性の評価にも有用である。発明の要旨 本発明の一態様に依れば、コロニー刺激因子をコードする遺伝子が損傷された 非ヒト動物が提供される。 好ましくは、前記動物は、例えば、マウス、ラット、ラビット又はハムスタ等 のげっ歯動物であり、より好ましくは、マウスである。 一好適実施例において、本発明のこの態様は、顆粒球−マクロファージコロニ ー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子が損傷されており、ＧＭ−ＣＳ Ｆの発現が損傷された非ヒト動物を提供する。好ましくは、前記動物の脾臓細胞 は、検出可能なレベルの対生物活性ＧＭ−ＣＳＦを産生することが出来ない。 又、前記ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子は、完全に不活性化されていること が好ましい。最も好ましくは、前記動物は、前記ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝 子が、ＳｃａＩとＳｍａＩとの間のエキソン１と２及びイントロン１とが欠失す る突然変異を起こしたものである。 別実施例において、本発明のこの態様は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳ Ｆ）をコードする遺伝子が損傷され、前記コロニー刺激遺伝子の発現が損傷され た非ヒト動物を提供する。好ましくは、前記動物の肺細胞は、検出可能なレベル の対生物活性Ｇ−ＣＳＦを産生することが出来ないものである。又、好ましくは 、前記Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子は、完全に不活性化されているものである 。最も好ましくは、前記動物は、前記Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子の、エクソ ン１のＮｃｏＩ制限部位からエクソン３のＢａｍＨＩ制限部位までの欠失を生じ る突然変異をしたものである。 オプションとして、前記動物は、更に、特定の遺伝子の損傷をもたらす別の単 数又は複数の突然変異をしたものであってもよい。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ欠失動 物は、Ｇ−ＣＳＦのための遺伝子の損傷をもたらす突然変異を担持（ｃａｒｒｙ ）していてもよく、あるいはこの逆の構成でもよい。ここでも、前記動物は好ま しくはマウスであり、前記追加的遺伝子損傷は、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ− １）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）、及び腫瘍増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、 又はサイトカインから成るグループから選択された成長因子、サイトカインとし ては好ましくはインターロイキンであり、インター ロイキン−２，インターロイキン−３及びインターロイキン−６から成るグルー プから選択されるインターロイキンを非限定的に含む、をコードする遺伝子に対 して標的化することも可能である。このような二重又は多重ノックアウト動物は 、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子が損傷された動物と、所望の 他の遺伝子が損傷された動物とを交配させることによって発生することができる 。例えば、自発的突然変異によって発生する系である、大理石膏病のマウスは、 ＣＳＦ−１が欠失していることが知られており、その単球／マクロファージと破 骨細胞のレベルは低下している。好ましくは、前記動物は、ＧＭ−ＣＳＦとＧ− ＣＳＦとの両方、又は、ＧＭ−ＣＳＦとＣＳＦ−１との両方、あるいは、Ｇ−Ｃ ＳＦとＣＳＦ−１との両方が欠失したマウスである。 ここに記載した新規な動物から由来する骨髄間質細胞系等の細胞系も、本発明 の範囲に含まれる。 第２の態様に依れば、本発明の新規な動物、特にマウス、は、疾患の研究のた めの便利なモデルシステムを提供する。一実施例において、本発明のこの態様は 、先天的なものと、成体のものとの両方の、肺胞タンパク症の症候群のためのモ デルシステムを提供し、ここで、この病状の治療のために潜在的に可能な療法を テストするこ とが可能である。 別実施例において、本発明のこの態様は、感染性疾患、特に、肺のバクテリア 感染症の研究用のモデルシステムを提供する。特に、このモデルシステムは、免 疫無防備状態又は免疫不全状態の個体が感染しやすく、かつ、抗生物質治療を含 めて今日利用可能な治療方法によっては処置が困難なタイプの日和見性感染症の 研究に有用である。免疫無防備状態の個体には、癌患者、特に、化学療法及び／ 又は放射線療法を受けている者や、白血病患者、免疫抑制療法を受けている臓器 移植患者、更に、免疫抑制療法を受けている自己免疫疾患患者が含まれる。日和 見的感染症に感染しやすい個人の特に重要なグループは、後天性免疫不全症候群 （ＡＩＤＳ）の患者である。 本発明の動物は、バクテリア性又はウィルス性感染症のみならず、菌及びマイ コプラズマ感染症の研究のためにも有用であると予想される。本発明のモデルシ ステムでの研究に適した微生物としては、非限定的に以下のものが含まれる。即 ち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むＬｉＳｔｅｒｉａ、 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖ ｉｕｍ， Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ及びａｔｙｐｉｃａｌ Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉａを含むＭｙｃｘｏｂａｃｔｅｒｅｉａ、Ｐｓｅｄｏｍｊｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉを含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、サルモネラ種、Ｋ ｌｅｂｓｉｅｌｌａ肺炎とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａを含むＫｌｅ ｂｓｉｅｌｌａ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、ヒストプラズ マｃａｐｓｕｌａｔｕｍを含むヒストプラズマ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎ ｅｏｆｏｒｍａｎｓを含むＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｅｓｔｉｓとＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ（それぞれ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓとＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅ ｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとしても知られている）、更に、Ｐａｓｔｅｕ ｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｅｐｔｉｃａと しても知られている）とを含むＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、そしてマイコプラズマ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むマイコプラズマ。 本発明の第３の態様に依れば、肺感染症を治療する方 法が提供され、この方法は、このような治療を必要とする対象体に対して、有効 量のＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦを投与する工程を有する。好ましくは、前記Ｇ Ｍ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦは、肺に対して局所的に投与される。これは、エアゾ ール又は、例えば、超音波噴霧された薬剤等のネブライザによって可能である。 適当なキャリアと賦形剤とは当該技術において公知である。集中治療状況下にお いては、ＣＳＦを気管チューブを介して投与することができる。これに代えて、 ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦを、その特定の病状ための他の公知の治療法との併 用で、補助療法として投与することも可能である。本発明のこの態様は、更に、 肺胞タンパク症又は肺感染の治療方法を提供し、この方法は、このような治療を 必要とする対象体に対して、有効量のＧＭ−ＣＳＦを投与する工程を有する。 ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦが、例えば静脈経路又は皮下経路で、全身に投与 される場合には、癌の化学治療を受けている患者において顆粒菌形成を活性化す るのに使用されている公知の投与量範囲に対応する投与量範囲が適当であると考 えられる。ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦが肺に対して局所的に投与される場合に は、その投与量範囲は、体重に対して０．１μｇ／ｋｇから２０μｇ／ｋｇ の範囲になると考えられる。当業者は、通常の試行錯誤的な実験によって適当な 投与量範囲を容易に決めることが出来るであろう。特に、高い投与量に於ける毒 性の許容範囲は、治療されるべき状態によって異なるであろう。ＧＭ−ＣＳＦ又 はＧ−ＣＳＦの肺への投与用の組成物も、本発明の範囲に含まれる。 後に詳述するように、我々は、ＧＭ−ＣＳＦ発現が損傷されたマウスは、造血 に関しては実質的に正常であり、これはＧＭ−ＣＳＦ自身が、少なくとも定常状 況に於ては、顆粒球と単球／マクロファージの発達と成熟化とに必要とされない ことを示すという驚くべき知見を得たのである。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦが 欠失したマウスがより感染しやすいということは、ＧＭ−ＣＳＦが、「緊急の」 顆粒球とマクロファージの発達に必要であるということを示している。同様に、 Ｇ−ＣＳＦの発現が損傷されたマウスは、好中球減少症であるが、単球／マクロ ファージのレベルは実質的に正常である。従って、定常の造血には少なくとも一 つの他の因子が関連しているはずであり、本発明の新規な動物はこのような因子 の同定と単離とに使用することができる。 更に、本発明の別の態様において、定常造血の調節に関連し、かつ、ＧＭ−Ｃ ＳＦ及びＧ−ＣＳＦの両方の発 現が損傷された動物中において存在する因子が提供される。好ましくは、この因 子は、ＧＭ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦとの両方の発現が損傷された、又は、ＧＭ−Ｃ ＳＦとＣＳＦ−１との両方の発現が損傷された動物中にも存在するものである。 当該技術において周知のように、マウス中のこのような造血成長因子は、ヒト の対応の因子に対して高度なホモロジーを有しており、このホモロジーは、ネズ ミの因子をコードする遺伝子を、その対応のヒトの因子を単離するためのプロー ブとして使用することを可能にするのに十分なものである。たとえそのホモロジ ーの程度が比較的低い場合でも、低ストリンジェンシーでの相互作用スクリーニ ングを使用することが可能である。従って、本発明のこの態様は、更に、定常造 血の調節に関与し、かつ、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦの発現が損傷された動物 中において存在し、かつ、前記対応の遺伝子の単離に使用可能な因子をコードす る遺伝子を提供する。好ましくは、前記動物由来の遺伝子は、ヒトの遺伝子に対 して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは 少なくとも９０％のホモロジーを有しているものである。 先天性肺胞タンパク症を含めて、肺胞タンパク症を有 する個人の治療のためには、遺伝子治療が最も適当な方法である。このような遺 伝子治療のための方法は、その欠陥を有する遺伝子が知られており、かつ、その 適当なＤＮＡが既に単離されている場合には、当該技術において公知である。特 に好ましい態様において、例えば、ここに参考文献としてその内容を添付する、 エヌ・ズー（Ｎ．Ｚｈｕ），ディ・リギット（Ｄ．Ｌｉｇｇｉｔｔ）及びアール ・デブス（Ｒ．Ｄｅｂｓ）他、Ｓｉｃｅｎｃｅ，１９９３ ２６１ ２０９：” Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｆｔｅｒ Ｉｎｔｒａ ｖｅｎｏｕｓ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ Ａｄｕｌｔ Ｍｉｃｅ” によって記載されているように、ＧＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡのリボソー ム調合物の静脈経由投与を使用することが考えられる。 我々の研究結果から、コロニー刺激因子を遺伝子決定的に欠失させることによ って、感染、特にグラム陰性肺炎に対する感染度が高まることが明らかであるの で、本発明は、更に、コロニー刺激因子の欠失を診断する方法も提供し、この方 法は、そのような欠失に罹患していることが疑われる対象体からの組織又は細胞 のサンプルについて、前記因子をコードする遺伝子の不在をテストす る工程を有する。好ましくは、前記コロニー刺激因子は、ＧＭ−ＣＳＦである、 しかし、Ｇ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦとも本発明の範囲に含まれる。前記テストは、 末梢血液リンパ球を使用して行うことが出来るが、バイオプシーによって、例え ば肺から得られた組織を使用してもよい。テストは、それ自身公知の、ポリメラ ーゼ連鎖反応や、あるいは、インサイチュ・ハイブリダイゼーション等を使用し た、検出可能マーカによってラベル化されたプローブによる反応、等の方法を使 用して行うことができる。 第６の態様において、本発明は、前述したように、それぞれＧＭ−ＣＳＦとＧ −ＣＳＦとをコードする遺伝子を損傷するための標的コンストラクトを提供する 。図面の簡単な説明 図１は、ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスの生産に使用したスキームと、ＧＭ−ＣＳＦ 遺伝子の損傷のためのストラテジーとを示し、４つのエクソン（１，２，３及び ４）を有する無傷のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子と、制限酵素部位の位置（Ｅ＝ＥｃｏＲ Ｉ，Ｂ＝Ｂｇ１ＩＩ，ＳＣ＝ＳｃａＩ，ＳＭ＝ＳｍａＩ，Ｘ＝ＸｍｎＩ，Ｐ＝Ｐ βｔＩ，Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｓ１＝Ｓａ１Ｉ）と、プローブＡ（構造体に対し て外来、標的化損傷の診断用）及びプローブ Ｂ（欠失配列に対応）、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション（ａ＝Ｅｄ１ ２０，ｂ＝Ｅｄ１２１，ｃ＝ＮＥＢ＃１２２４、テキスト参照）とを示している 。前記損傷された対立遺伝子において、エクソン１及び２、そしてイントロン１ が欠失され、これらが、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ−ｚ遺伝子、ヒトβ−グロビン３ ’未翻訳及びポリＡ付加配列（βＧ）及びＰＧＫ−ｎｅｏ（テキスト参照）とに よって置換されている。 図２は、ＧＭ−ＣＳＦエクソンの欠失が、いかにして脾臓調整培地中において 、ＧＭ−ＣＳＦ免疫活性及び対生物活性の欠如をもたらすかを示している。先ず プローブＡ（図１Ａ参照）によってプローブされたＰＣＲ−ゲノタイプ化ＧＭ＋ ／十及び−／−マウスからのＢｇ１ＩＩ消化尾部（ｔａｉｌ）ＤＮＡのサザンブ ロッチングによって、前記欠失エクソンが野生タイプのマウスにのみ存在するこ とが確かめられ、次に、洗浄無しでのプローブＢによる再プローブによって、前 記−／−マウスが損傷されたＧＭ−ＣＳＦ対立遺伝子に対してホモ接合体であり 、欠失配列を有していないことが確かめられた。コンカナバリン−ＡとＩＬ−２ とによって活性化された脾臓細胞によって調整された培地中に於ける、個々のＧ Ｍ＋／＋及びＧＭ−／−マウスの、免疫活性（パネルＢ）と、対 生物活性（パネルＣ）ＧＭ−ＣＳＦ（塗りつぶしたカラム）と、対生物活性ＩＬ −３（無地のカラム）のレベルが、図示されている。パネルＣにおいて、塗りつ ぶしたカラムは、抗−ＧＭ−ＣＳＦ抗体による中和後のＧＭ−ＣＳＦ対生物活性 を示している。 図３は、ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスに於ける肺組織変化の典型的な外観を示して おり、ここで Ａ． 正常Ｃ５７Ｂ１／６肺中央領域（１３週、Ｈ＆ ＥＸ４０） ＢとＣ．中央及び末梢管の周囲に中程度（Ｂ）及び広範 囲（Ｃ）のリンパ球増殖を有するＧＭ−／−肺、 Ｄ． 大きな泡状マクロファージ、好中球及び好酸性 肺胞残屑を有するＧＭ−／−肺に於ける肺胞の 詳細、 Ｅ〜Ｈ．一次抗体によるＧＭ−／−マウス肺（１６週、 Ｘ２００）に於ける脈管周囲単核細胞のイムノ ペロキシダーゼ染色、［特異性］：Ｅ，ＰＢＳ ［陰性コントロール］；Ｆ，ＲＡ３−６Ｂ２ ［Ｂ２２０］；Ｇ，ＧＫ１．５［ＣＤ４］； Ｈ．５３．６−７［ＣＤ８］（各パネルにおい て同じ小節） Ｉ〜Ｋ．菌エレメントによるＧＭ−／−肺（１６週、 Ｘ４００）の感染の病巣；Ｉ，Ｇｒｏｃｏｔｔ 染色のための陽性コントロール；Ｊ，５− １９μｍＧｒｏｃｏｔｔ−陽性菌粒子；Ｋ，隣 接部分の同じ位置に於けるＰＡＳ−陽性菌粒子、 Ｌ〜Ｎ．ＧＭ−／−肺に於けるバクテリア感染、Ｌ，グ ラム陽性及びグラム陰性バチルスによるグラム 染色コントロール；Ｍ，肺炎の硬化 （ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ）領域（７週、 Ｘ４００）に於けるグラム陽性球好菌；Ｎ，４ 週で死亡したマウスの膿状急性パスツレラ肺向 性大葉性肺炎、 Ｏ〜Ｑ．２４週ＧＭ−／−肺の特徴：隣接肺胞に於ける 顆粒状屈折ＰＡＳ−陽性均質エオシン好性剤； Ｑ，持続性の気管支の周囲のリンパ球白血病を 有する肺気腫領域（矢印）。 図４は、ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスからの肺の超構造を示している。２４週のＧ Ｍ−／−肺（図３０−Ｑと同じマウス）の電子顕微鏡断面図、塗りつぶしカラム は１μｍを示す。 Ａ．特徴的な細胞質内層状体を有するタイプＩＩ表面活 性物質−生産肺胞細胞。隣接肺胞は、タイプＣ層状 体を有している。 Ｂ．特徴的な「玉葱」状外観を有する多数の内−肺胞タ イプＣ層状体。 Ｃ．タイプＣ層状体に類似の「玉葱」状構造を有する食 胞を備えた内−肺胞マクロファージ。 図５ａは、ＤＮＡのＸｂａＩ消化物（ｄｉｇｅｓｔｓ）のゲノムサザン分析に よる、野生タイプと損傷Ｇ−ＣＳＦ対立遺伝子との間の区別に使用されたスクリ ーニング・ストラテジーを示している。ハッチングされた領域は、前記Ｇ−ＣＳ Ｆ遺伝子に隣接するゲノム配列を示している。黒色領域は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の エクソンを示し、βＧは、ヒトβ−グロブリン遺伝子からの３’未翻訳配列とポ リＡ付加モチーフとを示す。 図５ｂは、前記Ｇ−ＣＳＦ欠失動物が誘導されたＥＳ細胞系５．４を産生する のに使用された標的コンストラクト、指定ｐＫＯＧＣＳＦ３ｂを示す。 図６は、基礎Ｇ−ＣＳＦ＋／−キメラが産出されたＥＳ細胞系５．４のサザン ブロッチング分析を示す。左側パネルにおいて使用されたプローブは、前記標的 化ベクターの外側の領域とハイブリダイゼーションし、一つのＧ−ＣＳＦ対立遺 伝子における前記標的化ベクターの相同組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を 診断する。右側パネルにおいて使用されたβ−ガラクトシダーゼの ためのプローブは、前記損傷された対立遺伝子内の領域のみとハイブリダイゼー ションする。 図７は、前記損傷されたＧ−ＣＳＦ対立遺伝子のためのＰＣＲに基づくスクリ ーニング・ストラテジーを示す。そのプライマーはテキストに記載されている。 図８は、Ｇ−ＣＳＦ＋／−キメラとその子孫との尾部組織からのＤＮＡのＰＣ Ｒ分析を示す。 図９は、異種Ｇ−ＣＳＦ＋／−親の交配から生まれた子を示す。 図１０は、Ｇ−ＣＳＦ−／＋キメラとその子孫からの尾部組織ＤＮＡのＰＣＲ 分析を示し、生殖系（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ）トランスミッションを示している。 図１１は、Ｇ−／−，ＧＭ−／−及び野生タイプのマウスの器官からの調整培 地上に於けるアッセイの結果を示している。 図１２は、Ｇ−／−マウスがＧ−ＣＳＦを産生するのに有用であることを示し ている。Ｇ＋／＋（野生タイプ）マウスの器官からの調整培地の結果が、Ｇ−／ −及びＧＭ−／−マウスの結果と比較されている。発明の詳細な説明 本発明を、下記の非限定的例と図面のみを参照して説 明する。略語 ここに使用された略語は以下の通りである。 ＣＳＦ コロニー刺激因子 Ｇ−ＣＳＦ 顆粒球コロニー刺激因子 ＧＭ−ＣＳＦ 顆粒球−マクロファージコロニー刺激 因子 Ｍ−ＣＳＦ マクロファージコロニー刺激因子 ＥＳ細胞 胚幹細胞 ＩＬ インターロイキン ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 Ｔａｑポリメラーゼ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ＥＬＩＳＡ 酵素連結免疫吸収剤アッセイ Ｈ＆Ｅ ヘマトキシリン及びエオシン染色 ＰＡＳ 周期酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色 ＳＣＭ 脾臓細胞調整培地 ＳＣＦ 幹細胞因子 Ｇ４１８ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ） ｂｐ 塩基対細胞系、ベクター、及び抗体 ここに使用した細胞系は以下の通りである。 ＣＯＳ細胞 ＳＶ４０起源の反復から成るベクター の反復のサポートが可能な猿由来の細 胞系、 Ｅ１４ 株１２９／ＯＬＡのマウス由来のＥＳ 細胞（参考文献１７参照）。 ＦＥＣ−Ｐ１ ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３に応答する細 胞系 ３２−Ｄ ＩＬ−３に特異的に応答する細胞系 これらの系のすべては当該技術において周知である。 ここで使用したベクターは以下の通りである。 ｐＩＣ２０Ｈ ここで使用した抗体は以下の通りである。 ＭＰ１−２２Ｅ９ ＧＭ−ＣＳＦに対して特異的 ＭＰ１−３１Ｇ６ ＥＬＳＡに使用した第２抗体 ＲＡ３−６Ｂ２ Ｂ細胞に対して特異的 １８７．１ Ｂ細胞に対して特異的 ＧＫ１．５ Ｔヘルパー細胞に対して特異的 ５９．６−７ Ｔ抑制細胞に対して特異的 ５３−７．８ パンＴ細胞マーカに対して特異 的物質及び方法 統計方法 データは平均＋標準偏差として示されている。統計的に重要な差をテストする ために、不対（ｕｍｐａｉｒｅｄ）Ｓｔｕｄｅｎ’ｓ ｔ−検定法とカイ二乗検 定法とを使用した。 標的化ＥＳ細胞コロニーとキメラマウスの発生 それぞれの態様において、それらの方法自身は公知である。マウスの胎盤胞の 単離と注入と、トランスジェニックマウスを生産するための宿主雌への移植の方 法は、ビー・ホーガン（Ｂ．Ｈｏｇａｎ），エフ・コスタティーニ（Ｆ．Ｃｏｓ ｔａｔｉｎｉ）及びイー・レイシー（Ｅ．Ｌａｃｙ）による”Ｍａｎｉｐｕｌａ ｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ−Ａ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ，１９８６）に詳しく記載されている。例１ ＧＭ−ＣＳＦ標的化ベクターと標的化されたＥＳ 細胞クローンの単離 ＧＭ−ＣＳＦ標的化ベクターは、図１に示されているように、プラスミドｐＩ Ｃ２０Ｈの５’から３’において、約９００ｂｐのＧＭ−ＣＳＦプロモータ（Ｒ ｓａＩ−ＳｃａＩ）（１３，１４）と、５’末端において変成されたＥ．ｃｏｌ ｉ ｌａｃ−ｚ遺伝子と、ヒトβ−グロビン遺伝子からの３’未翻訳領域とポリ Ａ付加モチーフとの約７００ｂｐの断片（ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ）と、ＰＧＫ− ｎｅｏ選択可能マーカ（１５）と、前に単離されたラムダクローン（１４）から の約１０ｋｂのＧＭ−ＣＳＦゲノム配列とを有していた。ＳｃａＩとＳｍａＩ部 位との間のＧＭ−ＣＳＦエクソン１と２及びイントロン１とを欠失させるために 標的化ベクターを構成した。というのは、前の研究において、この領域を欠失し たｃＤＮＡｓは、ＣＯＳ細胞において過剰発現された時にＧＭ−ＣＳＦ活性を示 さなかったからである（１６）。前記ベクターを、従来に記載されているように （１８）維持し、その後、抗菌Ｇ４１８を含有する培地中にて選択された、株１ ２９／ＯＬＡ（１７）のマウス由来のＥ１４胚幹細胞（ＥＳ）へのエレクトロポ レーションの前に、ｐＩＣ２０ＨポリリンカーのＳａ１Ｉ部位でリニ ア化した。８日間のＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；Ｇｉｂｃｏ）選択後、個々 の抗Ｇ４１８コロニーをクローン化し、再プレート化した。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、標的化ベクターの相同組換えに よる組み込み（ｉｎｔｅ−ｇｒａｔｉｏｎ）のために、各ＥＳ細胞コロニーから ＤＮＡをスクリーニングした。ＰＣＲプライマーは以下の通りであった。 ”ａ” ＧＭ−ＣＳＦプロモータのＲｓａＩ部位の５’ 配列に対応する５’−ＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧ ＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＡＴＣＣ−３’ ”ｂ” 標的化コンストラクト組み込み（ｉｎｔｅ− ｇｒａｔｉｏｎ）によって欠失されたＧＭ− ＣＳＦ遺伝子のエクソン２の配列に対応する ５’−ＧＴＴＡＧＡＧＡＣＧＡＣＴＴＣＴＡ ＣＣＴＣＴＴＣ−３’ ”ｃ” Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ−ｚ遺伝子の５’領域 に対応するＭ１３（−４７）２４量体配列決 定プライマー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂａｖｅｒｌｙ，ＭＡ ，＃１２２４） これは図１に示されている。ＰＣＲ反応混合物において、 プライマー”ａ”及び”ｂ”は、野生タイプＤＮＡからは１．２ｋｂの生産物を 産出し、”ａ”及び”ｃ”は、正しく組み込まれた標的化コンストラクトを含む ＤＮＡからは１．０ｋｂの生産物を産出する。ＰＣＲ反応混合物（２０μｌ）は 、約２５０μｇのＤＮＡと、６７ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）と、１ ６．６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄と、０．４５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と、２ ００μｇ／ｍｌのゼラチンと、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２と、２５０μＭの各デオ キシヌクレオシドトリフォスフェートと、１２．５ｎｇの各プライマと、１．５ ＵのＴａｑポリメラーゼとを含有していた。 最初の変性（９５℃、［１５０ｓ］）後、４０回の増幅サイクル（９５℃、［ ５０ｓ］，６０℃［５０ｓ］，７２℃［５０ｓ］）を行った。ＰＣＲによって同 定された標的化対立遺伝子の構造は、後記の例９に記載されているようにして産 生された、損傷ＧＭ−ＣＳＦ対立遺伝子についてのマウスホモ接合体の尾部組織 からのＤＮＡのサザンブロッチング分析によって確認された。Ｂｇ１ＩＩ消化Ｄ ＮＡを、前記標的化コンストラクトから欠失されたＧＭ−ＣＳＦゲノム配列に対 応するラジオラベル化ＤＮＡ断片でプローブし（プローブＡ，図１、ＰｓｔＩ− ＰｓｔＩ断片）、これらの配列が、推定ＧＭ−ＣＳＦホ モ接合空白マウスにおいて不在であることを確かめ、前記標的化構造の外部に位 置する配列（ＧＭ−ＣＳＦプロモータのＲｓａＩ部位のＢｇ１ＩＩ−ＸｍｎＩゲ ノム断片５’）に対応するプローブＢ（図１）で再プローブした。例２ キメラマウスの発生 標的化ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が損傷された二つのクローン的に独立したＥＳ細胞 系（それぞれＧＭ４及びＧＭ６とする）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胎盤胞への 注入用に選択した。これら両方の細胞系から得られた雄のキメラは、Ｃ５７ＢＬ ／６背景からの雌との交配で生殖系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）を通じて前記損傷的突 然変異を伝達し、ヘテロ接合の雄と雌の子孫を産出した。これらのヘテロ接合子 孫を交配させて、前記損傷的突然変異に関してホモ接合のマウスを産出した。マ ウスのＧＭ−ＣＳＦ遺伝子型を以下とした。 野生タイプ，ＧＭ＋／＋； ヘテロ接合体ＧＭ＋／−； ホモ接合体ＧＭ−／−。 マウスのＧＭ−ＣＳＦステータスを、これらのマウスの尾部組織からのＤＮＡ のＰＣＲ分析によってルーチン 的（日常的）に評価した。次に、ＧＭ−／−マウスを、ＧＭ−／−×ＧＭ−／− 交配から産出し、同様に異系交配された１２９／０ＬＡ×Ｃ５７ＢＬ／６ＧＭ＋ ／＋コントロールマウスを産出するために、ＧＭ＋／＋マウスを、第１及び第２ 世代ＧＭ＋／＋同腹子から産出した。マウスを従来式の飼育箱に保管した。銘記 する場合を除き、観察はＧＭ４系からのもである。例３ ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子損傷の確認 ＧＭ−／−マウスの前記標的化遺伝子の構造を確認するために、標的化ＧＭ− ＣＳＦ遺伝子において欠失したエクソン１及び２配列に対応するプローブを使用 して、予めＰＣＲによって遺伝子型分類（ゲノタイプ化）しておいたランダムに 選択されたＧＭ＋／＋及びＧＭ−／−マウスからのＢｇ１ＩＩ消化尾部ＤＮＡに 対してサザンブロッチング分析を行った。予想された通り、ＧＭ−／−ではなく 、ＧＭ＋／＋の尾部ＤＮＡが、前記エクソン１−２プローブとハイブリダイゼー ションする２．３ｋｂのスピーシーズを有していた。ＧＭ−／−ＤＮＡは、図２ Ａに示すように、前記標的化ベクターの外側に位置する配列に対応するプローブ でハイブリダイゼーションされた時に、予想された７．７ｋｂスピーシーズを有 していた。例４ 脾臓調整培地とＧＭ−ＣＳＦアッセイ 脾臓調整培地を、従来に記載されているように（１８）して調合した。但し、 ここでは、脾臓細胞は、コンカバリン（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）−Ａ（５μｇ／ ｍｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とインター ロイキン−２（１００Ｕ／ｍｌ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，Ｃ ａ）とで活性化した。免疫反応性ＧＭ−ＣＳＦをアッセイするために、ＥＬＩＳ Ａを、抗体ＭＰ１−２２Ｅ９とビオチニル化ＭＰ１−３１Ｇ６（Ｐｈａｒｍｉｎ ｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）とともに、アビジン−ビオチニル化ホーセ ラディシュペロキシダーゼ（Ｄａｋｏ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ ）検出システムを、５０ｐｇ／ｍｌの感度で使用した。対生物活性ＧＭ−ＣＳＦ のアッセイには、前述した方法（２０）を使用してインターロイキン−３（ＩＬ −３）の対生物活性を３２−Ｄ細胞に調節し、³Ｈ−チミジン導入により測定さ れるＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖反応が使用された。前記ＭＰ１−２２Ｅ９中和抗体 を使用して、前記推定ＧＭ−ＣＳＦの特異性を確認した。使用した標準は、組換 えネズミＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔ ｈ，ＮＪ）とＩＬ−３（１０⁷Ｕ／ｍｇ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ− Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であった。 ＧＭ−／−マウスからの組織にはＧＭ−ＣＳＦが欠如していることを確認する ために、ＧＭ＋／＋及びＧＭ−／−脾臓細胞から作られた脾臓細胞調整培地（Ｓ ＣＭ）の免疫反応及び対生物活性ＧＭ−ＣＳＦをアッセイした。ＧＭ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡを使用した時、ＧＭ−／−脾臓細胞からのＳＣＭには、免疫反応性Ｇ Ｍ−ＣＳＦは検出されなかったのに対し、ＧＭ＋／＋脾臓細胞からのＳＣＭには 、２７００ｐｇ／ｍｌ以上のＧＭ−ＣＳＦが含まれていた。これらの結果は図２ Ｂにまとめられている。対生物活性ＧＭ−ＣＳＦのアッセイのために、ＧＭ−Ｃ ＳＦとＩＬ−３とに応答するＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖反応を、ＩＬ−３のみに応 答する３２−Ｄ細胞と同様に、アッセイした。 ＧＭ−／−脾臓細胞からのＳＣＭにはなんら対生物活性ＧＭ−ＣＳＦが検出さ れなかったのに対して、ＧＭ＋／＋ＳＣＭは、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体によって少な くとも９５％が中和された１００ｐｇ／ｍｌ以上の対生物活性ＧＭ−ＣＳＦが含 まれていた。これらのＳＣＭの有効性を確かめるために、すべてが対生物活性Ｉ Ｌ−３を含有していることが示された。但し、ＧＭ−／−マウスからのＳＣＭは 、コントロールマウスからのＳＣＭよ りも少ないＩＬ−３しか含有していなかった（ＧＭ−／−，１６±２Ｕ／ｍｌ， ｎ＝４；ＧＭ＋／＋，４９±２０Ｕ／ｍｌ，ｎ＝４；ｐ＜０．０１）。ＧＭ−／ −組織がインヴィトロでＧＭ−ＣＳＦを産生することが出来ないことを、ＦＤＣ −Ｐ１細胞のマイクロウェルアッセイ（３）を使用して、筋肉及び腎臓調整培地 上での研究によって確認した。例５ 生存力及び繁殖力 ＧＭ＋／−マウスの最初の交配によって、１０±３の子からなる腹子（ｎ＝８ ，ＧＭ６）が得られ、離乳まで生存した出生に於けるおよそのメンデル比で示さ れた遺伝子型ＧＭ＋／＋，＋／−及び−／−は、ＧＭ−／−子において選択的胎 児又は周産期の損失が無かったことを示している。最初の腹子からのマウスの生 存は、そのＧＭ＋／＋同腹子（＞８８、ｎ＝１７）と比較して、ＧＭ−／−マウ ス子（＞９１％、ｎ＝３５）において正常であった。ＧＭ−／−のメジアンフォ ローアップは、２２０日［範囲０〜３３４日、ＧＭ＋／＋マウスは２０９日［範 囲０〜３１３日］であり、メジアン生存は得られていない。このコホートの２匹 の死亡ＧＭ−／−成体の検死は、１５３日後に死亡した一匹がリンパ白血病を有 し、１６７日後に死亡した他方が肝炎を有していたことを示し、これらは共に、 後に詳述する特徴的なＧＭ−ＣＳＦ欠失肺疾病を示した。雄及び雌のＧＭ−／− マウスの最初の交配から、９±１の子（ｎ＝５）から成る腹子が得られ、ＧＭ− ＣＳＦ欠失が生存力と繁殖力とを大きく損なうものであはないことが示された。例６ ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスの血液分析 ヘモグロビン、全白血球及び血小板の評価を、Ｓｙｓｍｅｘ−Ｋ１０００自動 カウンタ上で眼球出血サンプルの１：４希釈物に対して行い、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎ ｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａ染色しみに対して、マニュアルの１００−ｃｅｌｌ白血 球差計数（ｄｉｆ−ｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｕｎｔｓ）を行った。 原種細胞を、従来に記載されているように（１９，２１）、標準方法によって 、骨髄、脾臓又は腹膜細胞の半固体寒天培地中でアッセイした。コロニー形成を 、下記の最終濃度での、純化組換えバクテリア合成成長因子によって刺激した。 ：ヒトＧ−ＣＧＦ［１０ｎｇ／ｍｌ］，ネズミＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１）［１０ ｎｇ／ｍｌ］，ネズミＩＬ−３［１０ｎｇ／ｍｌ］，ネズミＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ −１）［１０ｎｇ／ｍｌ］，ラット幹細胞因子 ［１００ｎｇ／ｍｌ］，ネズミＩＬ−６［５００ｎｇ／ｍｌ］、及び脾臓細胞調 整培地（１０％）。これらのコロニーを、前述したように（２１）、染色化全プ レート調合物上でタイプ分けした。 表１に示されているように、６〜７週のＧＭ−／−マウスの末梢血液の血液パ ラメータは、ＧＭ＋／＋同腹子の血液のそれらと大きな違いが無いことを示した 。 ５〜７週のマウスの顆粒球レベル、ＧＭ−／−１．７±１．５×１０⁹／ｌ［ｎ ＝３３，範囲０．２−６．６］； ＧＭ＋／＋１．３±＋０．７ｘ１０⁹／ｌ［ｎ＝１５、範囲０．２９−３．１］ 、ＧＭ−／−Ｋのマウスの２４％が、１５％のＧＭ＋／＋と比較して、２ｘ１０⁹ ／ｌ以上の好中球を有する、によって示されているように、ＧＭ−／−マウス は、その顆粒白血球に於ける変化が大きい傾向があった。ＧＭ−／−マウスの脾 臓は、マスに於ける変化が大きいことを示した（例えば、６週のマウスの脾臓マ ス，ｎ＝６／グループ；ＧＭ＋／＋１０６±９［範囲９４−１２０］ｍｇ，ＧＭ −／−，１１４±４２［範囲６４−１９１］ｍｇ）。 ５対の６〜８週ＧＭ＋／＋及び−／−マウスにおいて造血を評価した。大腿細 胞質は均等であり（ＧＭ＋／＋３４．０±５．３×１０⁶，ＧＭ−／−２７．４ ±７．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｆｅｍｕｒ，ｎ＝３）であり、骨髄：赤血球比は 、等価であった（それぞれ２０±２及び１７±６％赤血球細胞）。種々の刺激に 対して反応する骨髄原種細胞の分析の結果は、表２にまとめられており、これは 、総原種細胞頻度において大きな相違が無いことを示しており、コロニーサブタ イプ化は、顆粒球、顆粒球−マクロファージ、マクロファージ、好酸球、巨核球 、赤血球及び芽骨髄原種細胞の頻度において差が無いことを示した。「自発的」 インヴィトロコロニー形 成現象に於けるＧＭ−ＣＳＦの役割を評価するために、最高で２ｘ１０⁵ＧＭ− ／−骨髄細胞／ｍｌの密集未刺激培地を構成したところ、コロニー形成は幾分減 少し、「自発的」コロニー形成が、インヴィトロＧＭ−ＣＳＦ産生にのみ依存す るものではないことを示した。 培地は以下によって活性化した。顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−Ｃ ＳＦ），顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ），ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ），インター ロイキン−３（ＩＬ−３），幹細胞因子（ＳＣＦ），インターロイキン−６（Ｉ Ｌ−６），脾臓細胞調整培地（ＳＣＭ），又はこれらの組合せ。 遺伝子型は、野生タイプ（ＧＭ＋／＋）又はＧＭ−ＣＳＦ欠失（ＧＭ−／−）と して示されている。 これらのマウスのグループの脾臓質量は：ＧＭ＋／＋，６４±８ｍｇ；ＧＭ− ／−，１１４±２２ｍｇ（ｐ＜０．００１）であった。 脾臓造血の分析は、ＧＭ−／−マウスに於ける原種細胞の頻度の３ないし６倍 の増加を示した。そして、ＧＭ−／−脾臓が遥かに大きかったので、これは、脾 臓原種細胞の数に於ける絶対的な増加（表２）を表すものであった。腹膜洗浄に よって、ＧＭ＋／＋とＧＭ−／−のマウスから、それぞれ、６．０±１．４ｘ１ ０⁶と５．１±１．４ｘ１０⁶の細胞が回収された。これらの洗浄は、ＧＭ＋／＋ マウスに於いては６５％のマクロファージ、ＧＭ−／−マウスに於いては６３％ のマクロフ ァージを有していた。例７ ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスの組織検査と、肺疾病の 特徴付け マウスの臓器のホルマリン固定パラフィン包埋切片を、標準技術を使用してヘ マトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、選択された切片を、Ｇｒｏｃｏ ｔｔメテナミン銀と周期酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色と、Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅ ｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｗａｄｅ−Ｆｉｔｅ酸ｆａｓｔ染色によって染色した。肺 組織のイムノペロキシダーゼ染色を、下記の抗体を使用して、４μｍの凍結標本 上にて標準方法（２２）を使用して行った：ＲＡ−３−６Ｂ２［Ｂ２２０に対し て特異的］（２３），１８７．１［Ｋ軽鎖に対して特異的］（２４），ＧＫ１． ５［ＣＤ４に対して特異的］（２５），５３．６−７［ＣＤ８に対して特異的］ （２６），及び５３−７．８［ＣＤ５に対して特異的］（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。電子顕微鏡用に、新鮮な肺組織のランダムな切 片を、１％のカコジル酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）中の２．５％グルタ ルアルデヒド中にて浸漬固定し、２％の水性四酸化オスミウム中にて後固定（ｐ ｏｓｔｆｉｘｅｄ）し、標準方法を使用 してＡｒａｌｄｉｔｅ−Ｅｐｏｎ樹脂中に包埋した。薄い切片を、アルカリクエ ン酸鉛と酢酸ウラニルとで染色し、Ｊｅｏｌ １２００ＥＸ電子顕微鏡にて観察 した。 １日ないし２４週齢のＧＭ−／−マウスと年齢を一致させたＧＭ＋／＋コント ロールとからの組織切片を検査した。造血組織において、これらＧＭ＋／＋とＧ Ｍ−／−との間に大きな相違は無く、骨髄細胞質は正常であり、幾つかのＧＭ− ／−の脾臓が赤色と白色の髄質の増生によって拡大していた。新生時においては 、ＧＭ−／−とＧＭ＋／＋の動物の肺は、互いに区別がつかなかったのに対して 、生後３週間内で、ＧＭ−／−マウスの肺には、はっきりとした異常が現れた。 ＧＭ−／−マウスからのそれぞれの肺は、常に、肺胞の隔膜の僅かな浸潤を除い て、気管支の周囲と脈管の周囲の領域においてリンパ細胞の局部的集合を示した 。典型的な結果を図３Ａ−Ｃに示す。１２〜１６週のＧＭ−／−肺のイムノペロ キシダーゼ染色によって、Ｂ２２０とＫ−軽鎖のはっきりとした染色により、こ れらの細胞が、主としてＢ−リンパ球であることが示された。これらリンパ球の 約２０％が、主にＣＤ４⁺タイプから成るＴ細胞であった（図３Ｅ〜Ｈ）。前記 リンパ球中心は、とりわけ大きな門管の周囲でマーキングされ、特に時として小 胞組織を形成してい たが、これらの細胞は、ほとんど有糸分裂活動を示さなかった。前記病巣は、小 さな細気管支と小動脈の周囲で特徴的に延出していた。 病巣の（ｆｏｃａｌ）硬化が優勢であり、これは、多数の成熟し断片化した好 中球とマクロファージとを有する高度に好酸性（エオシン好性）の肺胞滲出液か ら構成されていた（例えば、図３Ｄ，Ｍ，Ｎ）。関連する細気管支は、膿滲出液 を含有していた。６週齢までのＧＭ−／−マウスのほとんど全部において、その 肺葉の遠端片に炎症領域が観察された。葉部硬化がしばしば観察された（図３Ｍ ＆Ｎ）。より高齢のマウス（６〜１２週）の肺において、リンパ増殖が優勢であ り、肺胞は、大きな泡状マクロファージと顆粒状残屑とを有し、最高５０の好中 球と単核細胞との集合からなる急性炎症の病巣がときどき観察された（図３Ｄ） 。肺胞内の顆粒状、好酸性（エオシン好性）、ＰＡＳ陽性物質が、検査したすべ ての肺（例えば図３Ｄ＆Ｋ）において存在し、明らかに、わずか３週間以内に、 いくつかの肺胞において蓄積し融合しかけていた。この物質は、６カ月齢まで存 在し、１２〜２４週のＧＭ−／−の肺のいくつかの領域において、この物質を含 有する隣接肺胞の外観は、肺胞タンパク質の外観に類似していた（図３Ｏ＆Ｐ） 。 超構造的には、表面活性物質産出タイプ−ＩＩ肺胞細胞は、その特徴的な細胞 質層状体（図４Ａ）によって容易に同定可能であり、肺胞残屑は、多数のタイプ Ｃ層状体を有し（図４Ｂ）、そしてこれらの玉葱状体は、肺胞内マクロファージ のファゴソーム内に見られた（図４Ｃ）。 周囲において（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙ）、より高齢のマウス（２４週）か らの肺の肺胞空間はより大きく、肺気腫プロセスを示唆していた（図３Ｑ）。１ 匹の４週齢ＧＭ−／−は、ｆｌｏｒｉｄ ｌｏｂａｒ肺炎で死亡し（図３Ｎ）、 これから肺切片において明らかなグラム陰性組織に対応して、Ｐａｓｔｅｕｒｅ ｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａを単離した。ＧＭ−／−の肺を、Ｇｒｏｃ ｏｔｔ及びＰＡＳ染色によって調べることで、直径５〜１０μｍの菌エレメント が、３／１５のＧＭ−／−肺に於いて同定されたが、ＧＭ＋／＋肺においては０ ／７であった（例えば、図３Ｉ〜Ｋ）。切片のグラム染色による調査によって、 一つの肺炎領域において多数のグラム陽性ｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｉが同定され た（３Ｌ＆Ｍ）。Ｚｉｅｈｌ−Ｎｉｅｌｓｅｎ及びＷａｄｅ−Ｆｉｔｅ染色によ って、ミコバクテリア感染は検出されなかった。１匹の６週齢ＧＭ−／−マウス は、泡状マクロファージによって区画され、多量の好中球を 含む膿を有する組織化された壁を備えた慢性肺膿瘍を発現させていた。例８ ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスは、感染に対する宿主の応答のテストに使用可能 である。 １０匹の野生タイプと１０匹のＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスとを、静脈注射によっ て、１匹のマウス当り５ｘ１０³コロニー形成単位の投与量で、Ｌｉｓｔｅｒｉ ａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって、感染させた。感染後第１日目と第５ 日目に処理したマウスの肝臓及び脾臓に於ける血液パラメータとバクテリアカウ ント値とを、表３にまとめた。 ここで、血液パラメータの結果は、平均±標準偏差で示され、組織カウント値 の結果は対数平均±標準偏差として示されている。ブラケット内の数値は、各グ ループのマウスの数を表している。 第５日目に、脾臓又は肝臓の器官当りの微生物カウント値が１０⁸以上の２匹 のＧＭ−／−マウスが死亡した。生存したＧＭ＋／＋マウスは、５．６６±０． ９５の組織ｇ／脾臓値と、４．８１±１．０７の組織／肝臓値とを有し、これは ＧＭ＋／＋マウスのカウント値よりもまだ遥かに高かった。 血液的には、前記ＧＭ−／−マウスは、混乱した応答（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を示し、確定したＬｉｓｔｅｒｉａ感染の存在にも拘らず、 第１日目にその好中球の移動が、そした第５日目にその好中球の産生が損なわれ た。前記ＧＭ＋／＋マウスは、その同腹子コントロールと同様に、Ｌｉｓｔｅｒ ｉａ感染を制御することが出来ず、第１日目に肝臓において高いバクテリア感染 量を示すとともに、第５日目には肝臓と脾臓との両方において高いバクテリア感 染量を示した。従って、ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスは、感染に対する宿主の応答を テストするための有効なモデルを構成するのである。例９ ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスは、感染に対する無防備 性の好適なモデルである。 普通の条件下で飼育された年齢一致された３週齢のＧＭ−／−マウスの血液カ ウント値を、ミクロアイソレーション（”無特定病原感染防止条件”；ＳＰＦ） 環境において飼育されたマスウのカウント値と比較した。その結果を表４にまと める。 前記ミクロアイソレーション環境からのマウスの方は、好中球と単球レベルが 低く、普通の環境からのマウスがその最初の３週間中において種々の感染源に晒 されていたことを示唆した。Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔテストによって評価される統計 的重みが欠如しているにも拘らず、ミクロアイソレーション環境からのマウスが 低い好中球レベルと、より低い程度の感染を示唆するプロフィールとを有してい たということがはっきりと示されている。従って、これらのパラメータに対して 環境からの影響があるということの明白な証拠がある。議論 種々の造血調整因子の標的細胞に対する作用が互いにオーバーラップしている ように見えることから、これらの調節因子が、その全体又はその一部において重 複しているかもしれない（２７）という可能性がある。この命題は、それぞれの 調節因子又は調節因子の組合せが欠失したマウスを分析することによって最も直 接的に調べられる。３カ月齢までのＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスの我々の分析によっ て、骨髄又は血液において大きな造血個体群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の障害が 無いことが示された。この観察を解釈するのに二つの容易な方法がある。即ち、 ＧＭ−ＣＳＦは、正常な造血の必須の調節因子ではないかもしれないか、もしく は、ＧＭ−ＣＳＦは、定常の造血の維持に寄与するが、それが不在の場合には、 他の造血調節因子が、この調節因子によって通常行われる役割を取って代わるか もしれないということである。この後者の可能性は、もしも、ＧＭ−ＣＳＦ欠失 マウスにおいて捕捉的調整因子のレベルが増大していることが示されるならば更 に支持されるであろう。ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスにおいて脾臓原種細胞レベルは 増大したが、これは、部分的にこれらの動物に於ける無症状肺感染を反映してい るのかもしれない。肺病プロセスがどの程度まで、特に脾臓に於ける、「定常」 の造血に影響を与えているのかを調べることが重要であろう。 ＧＭ−ＣＳＦがその全部が重複する分子であるという可能性は、すべてのＧＭ −ＣＳＦ欠失マウスが異常な肺発達を示すという我々の観察に鑑みて明らかに排 除することが出来る。我々の最初の研究によって、内因的な肺欠陥の性質は同定 されなかった。しかし、コントロール動物には同じ病状が見られないことは、こ れがＧＭ−ＣＳＦ欠失に依るものであることを強く示唆している。顕著な病状の 特徴は、顆粒性好酸性（ｅｏｓｉｎｏ−ｐｈｉｌｉｃ）肺胞内物質であって、こ れは時に融合性 となる。これは、マクロファージの機能欠陥によって、過剰生産されるか、もし くは、ゆっくりと除去される肺表面活性リン脂質及びタンパク質等の局所的産生 物であるかもしれない。肺胞及びマクロファージ内に於ける多数のタイプＣ層状 体の存在は、表面活性物質成分の蓄積に一致している（２８）。いくつかの領域 において、ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスの肺の組織学的外観は、先天性で表面活性タ ンパク質の肺胞内蓄積によって特徴付けられ、しばしば、感染によって悪化する 外来グループである肺胞タンパク質症のいくつかの形状に顕著に類似している（ ２８〜３１）。ＧＭ−ＣＳＦ、又は、ＧＭ−ＣＳＦによって機能的に活性化され た細胞タイプの、ＩＩの肺胞細胞による表面活性物質の製造における表面活性物 質クリアランスに対する役割は、まだ研究されていない。より大きな気道に於け るムチン分泌物のクリアランスが欠陥を有しているかもしれないが、既に過剰な 肺胞物質を有しているより若年のＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスの肺において、保持 された分泌物は明らかではない。 ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスの肺疾患の顕著な特徴は、バクテリア性と菌性との両 方の因子を含む種々の日和見性微生物感染の存在である。興味深いことに、Ｐｎ ｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉによる ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｌｓｅｄＣＤ４＋Ｔ細胞欠失マウスの感染によって 、ＧＭ−／−マウスのそれに類似の外観を有する気管支管周囲のリンパ増殖が得 られ（３２）、これは、リンパ増殖が感染に対する一般的な肺応答の一面である 可能性があることを示唆している。感染が発生する時、宿主の応答は、通常、死 を避けるのに適当である。というのは、０．５％以下のＧＭ−／−マウスしか肺 感染から死亡しなかったからである。しかしながら、リンパ増殖、優勢（ｐｒｅ ｖａｌｅｎｔ）急性バクテリア性肺炎と、無症状多病巣菌性感染とは、その宿主 応答が欠陥を有していることを示唆している。Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａ ｒｉｎｉｉ肺炎は、ＡＩＤＳ患者において共通しており、しばしば最終的死因と なる。 ＧＭ−／−肺内に於ける多数の好中球とマクロファージの存在は、ＧＭ−ＣＳ Ｆが不在であっても、肺において炎症細胞が局在化して、組織内において急性及 び慢性の炎症プロセスを活性化させることがあることを示している。但し、この 応答に関連している細胞の数及び機能上の適切性についてはまだ評価されていな い。事実、肺胞マクロファージは、特にＧＭ−ＣＳＦに対して応答性が高く、肺 （上皮細胞を含む）に存在する多数の細胞タ イプは、ＧＭ−ＣＳＦ合成を行うことができる（３３，３４）。従って、内生的 肺欠陥の重要な要素は、表面活性物質のクリアランス又は感染コントロールのい ずれかに関連するマクロファージの局所的なＧＭ−ＣＳＦ依存活性化の不在であ る可能性がある。我々は、普通の動物飼育設備と無菌の動物飼育設備とにおいて それぞれ飼育されたＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスを互いに比較することによって、Ｇ Ｍ−ＣＳＦ欠失の肺発現に対する様々な環境要因の影響を研究している。 完全なＧＭ−ＣＳＦ欠失に伴う顕著な肺の病状は、ＧＭ−ＣＳＦが、肺胞タン パク質の蓄積や、感染によって特徴付けられる肺障害の治療に有効である可能性 があることを示している。肺タンパク症の後天的形状は、ＧＭ−ＣＳＦの局所的 相対的欠失を反映しているかものしれない。肺タンパク症の様々な先天的形状中 において、ＧＭ−ＣＳＦ置換療法が適当な、ネズミＧＭ−ＣＳＦ欠失に対するヒ トの対応物が存在するかもしれない。 ＧＭ−ＣＳＦが、バクテリア性及びウィルス性感染の治療又は予防に有効であ るかもしれず、又、これが寄生性感染に対する抵抗においてもなんらかの役割を 有しているかもしれない、というかなりの証拠がある（３４〜３８）。例１０ Ｇ−ＣＳＦ標的化ベクターと、標的化された ＥＳ細胞クローンの単離 Ｇ−ＣＳＦ標的化ベクターを、図５に示すように、翻訳開始コドンＡＴＧを含 むエクソン１のＮｃｏＩ部位と、エクソン３のＢａｍＨＩ部位との間の配列の欠 失からなる、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の損傷を行うように構成した（ツチヤ，エム（Ｔ ｓｕｃｈｉｙａ，Ｍ．），カジロ，ワイ（Ｋａｚｉｒｏ，Ｙ）及びナガタ，エス （Ｎａｇａｔａ，Ｓ．）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７ １６５ ７〜１２）。ＮｃｏＩ部位へのクローン化を容易にするための５’に於ける改質 と、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）によって駆動されるネオマイシンホ スホトランスフェラーゼ遺伝子と、ベクターｐＭＣＩＮｅｏ由来の３’未翻訳配 列とを有するＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃ−ｚ遺伝子を有する配列を、この欠失の部位 に挿入した。 このｐＫＯＧＣＳＦ３ｂとして指定する構造体（コンストラクト）は、５’か ら３’の、ベクターｐＢＲ３２２及びｐＳＰ７３由来のハイブリッドベクターバ ックボーン、５’隣接した、Ｇ−ＣＳＦプロモータ（Ａｓｐ７００−ＮｃｏＩ断 片）を含む上述Ｇ−ＣＳＦコード化配列の約１．１ｋｂのゲノム配列、上述のＥ ．ｃｏｌｉ ｌａｃ−ｚとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ配列、及び エクソン３のＢａｍＨＩ部位において始まり、３’末端においてＢａｍＨＩ部位 によって制限される約７ｋｂのゲノム配列とを有していた。この構造体は、図５ ｂに示されている。 この図において、ゲノム配列のおよそのｋｂ単位のサイズが、棒によって示さ れている。星印によって標識化したＮｃｏＩ部位は、前記ネズミＧ−ＣＳＦ遺伝 子のエクソン１の翻訳開始部位を含んでいる。Ｘによって標識化したＢａｍＨＩ 部位は、この遺伝子のエクソン３に有る。βＧは、前記ヒトβグロビン遺伝子か らの３’未翻訳領域とポリＡ付加モチーフの７００ｂｐの断片を示している。前 記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットに於ける配列は、ＰＧＫ −Ｎｅｏ（前記ＮｃｏＩ部位の配列５’）とｐＭＣ１Ｎｅｏ（前記ＮｃｏＩ部位 の配列３’）から由来したものである。前記ベクターバックボーンは、ｐＢＲ３ ２２とｐＳｐ７３とからの配列のハイブリッドである。これらの二つのベクター からの配列は、Ａｍｐ^R遺伝子のＸｍｎＩ部位の標的化構造体中において結合さ れ、機能性Ａｍｐ^R遺伝子を再構成している。模写の起源はｐＢＲ３２２より誘 導される。前記構造体の相同ゲノム配列の３’末端は、ゲノム配列中におけるＢ ａｍＨＩ部位によって規定されている。但し、 この部位は、前記標的化ベクターの構成中に除去された。 ＥＳ細胞の形質転換と選択とを、ほぼ例１に記載した要領で行った。ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、相同組換えによる標的化ベクターの組み込 みのための、各ＥＳ細胞コロニーからのＤＮＡをスクリーニングした。前記ＰＣ Ｒプライマーは後に記載の通りであった。 例２に記載した要領で、キメラマウスを生産し、維持した。銘記する場合を除 き、５．４系を使用して下記の観察結果が得られた。例１１ Ｇ−ＣＳＦ遺伝子損傷の確認 Ｇ−／−マウスに於ける標的化された対立遺伝子の構造を確認するために、標 準技術によって作られ、ＸｂａＩで消化された、ＥＳ細胞系又はマウス尾部組織 からのゲノムＤＮＡに対して、サザンブロッチング分析を行った。その結果は図 ６に示されている。この図は、前記構造体に対して外部的なものと内部的なもの との両方の配列に対応するプローブを使用した、前記損傷されたＧ−ＣＳＦ対立 遺伝子の予想構造を確証している。前記標的化構造体ｐＫＯＧＣＳＦ３ｂの配列 の外部に位置するＧ−ＣＳＦ配列に対応する前記プローブは、５’−ＳａｃＩ− Ｂｇ１ＩＩ断片であった。このプローブは、一つのＧ−ＣＳＦ対立遺伝子に於け る相同組み込み（ｉｎｔｅ−ｇｒａｔｉｏｎ）を診断するものであった。 下記のようにして損傷されたＧ−ＣＳＦ遺伝子を含有することが確認されたＥ Ｓ細胞系５．４からのＤＮＡは、前記野生タイプの対立遺伝子に対応する１４ｋ ｂのバンドと、前記損傷された対立遺伝子に対応する第２のより大きなバンドと を示した。この第２のバンドの正体を、前記サザンブロットを、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ−ｚ遺伝子からの３．２ｋｂの配列に対応する第２のプローブによって再 プローブすることによって確認し、これは、前記損傷された対立遺伝子のそれに サイズにおいて対応するバンドのみがｌａｃ−ｚ配列を含有していることを示し た。従って、これらの配列が損傷されたＧ−ＣＳＦ対立遺伝子においてゲノムＤ ＮＡに組み込まれていることが、確認されるととともに、前記標的化構造体の配 列の一つのコピーのみが、これらのＥＳ細胞のゲノム中に存在しているという事 実も確認された。例１２ ＰＣＲ分析 前記損傷されたＧ−ＣＳＦ対立遺伝子に対して特異的なＰＣＲプローブを使用 して、異種の親同士の交配によ って、その損傷されたＧ−ＣＳＦ対立遺伝子についてホモ接合な子孫が生まれる ことを証明した。これらの結果は図７に示されている。サザン分析によって、Ｇ １０５鋳型ＤＮＡが、遺伝子型Ｇ＋／−を有していることが示された。−，＋び ＋＋という符号は、０．２０ｎｇ／２０μＬの反応混合物と、４０ｎｇ／２０μ Ｌ反応混合物とのプライマー濃度を示している。プライマーの配列は以下の通り である。 ＧＬ＃２ ５’−ＴＣＣ．ＡＴＧ．ＡＣＡ．ＴＣＴ．ＧＴＧ．ＧＣＣ ．ＡＣＣ．ＡＧＡ−３’ ＥＳ＃１３２ ５’−ＣＴＧ．ＣＡＡ．ＧＧＣ．ＧＡＴ．ＴＡＡ．ＧＴＴ ．ＧＧＧ．ＴＡＡ−３’ ＧＬ＃４ ５’−ＣＧＧ．ＣＣＴ．ＣＴＣ．ＧＴＣ．ＣＴＧ．ＡＣＣ ．ＡＴＡ．ＧＴＣ−３’ 前記ＰＣＲ反応混合物は、ＭｇＣｌ₂の濃度は２．０ｍＭであり、２０ｎｇの 各プライマーを使用した以外は例２に記載した通りであり、３５サイクルの増幅 を行い、アニーリングは、６２℃５０秒間行った。 最高の感度が必要な場合には、野生タイプと損傷対立遺伝子とを同定するＰＣ Ｒを、それぞれ別々に行った。尾部組織からのＤＮＡをスクリーニングし、野生 タイプと損傷対立遺伝子ステータスを診断するためのＰＣＲを、 ４０ｍｇのプライマーＧＬ＃２と２０ｎｇの他の二つのプライマーとを含有する 一つの反応混合物中で行った。プライマーＧＬ＃２とＧＬ＃４とは、野生タイプ の対立遺伝子を含む鋳型ＤＮＡから１．２ｋｂのＰＣＲ生産物を産生するのに対 して、プライマーＧＬ＃２とＥＳ＃１３２とは、損傷ＧＳＦ対立遺伝子を含む鋳 型から１．１ｋｂのＰＣＲ生産物を産生する。 Ｇ−ＣＳＦ＋／−の親の交配から得られた第１腹子に対するＰＣＲ分析の結果 を図８に示す。このＰＣＲパターンは、損傷Ｇ−ＣＳＦ対立遺伝子についてホモ 接合の子孫が産生されたことを示している。従って、我々は、前記損傷対立遺伝 子の生殖系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）伝達を証明した。我々は、更に、前記損傷対立 遺伝子を有する動物が、生存能力があり、かつ、繁殖力があることも示した。例１３ Ｇ−ＣＳＦ欠失マウスからの細胞は、Ｇ−ＣＳＦ を生産するのに使用不可能である。 マウスＧ−ＣＳＦに対して特異的なアッセイを構成し、これを確証した。この アッセイにおいては、Ｇ−ＣＳＦに対するレセプタを発現するように変異させた ＢＡＦ３細胞を使用した。これらの細胞を、ＢＡＦ３−ＧＲとす る。マルチ−ＣＳＦに応答し、かつ、ＩＬ−２に対しても僅かに応答するコント ロール（非形質転換）ＢＡＦ３細胞を、コントロールとして使用した。胸腺、肺 、膀胱、骨幹及び脾臓からの調整培地を、１ｍｇ／ｍＬの純化Ｇ−ＣＳＦを含有 するコントロール調合物と比較した。これらの結果は図１１に図示され、前記Ｂ ＡＦ３−ＧＲが、３０ｐｇ／ｍＬを感度の下限として、Ｇ−ＣＳＦに特異的に応 答することを示している。ＢＡＦ３細胞で得られた結果は、マルチ−ＣＳＦとＩ Ｌ−２とのいずれもが、これらの器官からの調整培地中に存在しないことを示し ている。胸腺、肺、膀胱、骨幹及び脾臓からの調整培地を、Ｇ−ＣＳＦ欠失動物 と野生タイプ動物との器官から調合し、ＢＡＦ−ＧＲテストシステムで評価した 。野生タイプのマウスからの調整培地は、すべて、滴定可能なレベルの対生物活 性Ｇ−ＣＳＦを含有していたのに対して、Ｇ−／−動物からの調整培地には、対 生物活性Ｇ−ＣＳＦは検出出来なかった。これらの結果は図１２に示されている 。更に、Ｇ−／−及び野生タイプのマウスの血清をアッセイしたところ、Ｇ−Ｃ ＳＦを検出することは出来なかった。血清の場合、感度の下限は１２０ｐｇ／ｍ ｌである。例１４ Ｇ−ＣＳＦ欠失マウスの血液分析 ヘモグロビン、前記白血球及び血小板の推定を、例６に記載された要領で、Ｇ −ＣＳＦ欠失マウスからのサンプルに対して行った。その結果は表５に示され、 これは、Ｇ−ＣＳＦ欠失マウス（−／−）が、野生タイプ（＋／＋）、あるいは ヘテロ接合（＋／−）マウスと比較して、永続的なベースラインの好中球減少を 有していることを示している。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦ欠失マウスにおいて、 その他のパラメータは、正常範囲内であった。 例１６ Ｇ−ＣＳＦマウスは、慢性的好中球減少症のモ デルを構成する Ｇ−ＣＳＦ欠失マウスに於ける好中球減少症耐久性は、例１３において提供し たデータから明白である。慢性的好中球減少症のモデルは、慢性的な好中球減少 によって特徴付けられる疾患に適用可能な新規な療法をテストし、更に、相対的 に好中球が欠失している状況において、実験モデルの感染、炎症又は悪性腫瘍に 於ける、好中球の役割をテストするのに有用である。 例えば、１５４日齢の雌のＧ−／−マウスを、病気であるように見えたために 、殺したところ、拡大したｐａｒａ−ａｏｒｔｉｃリンパ節と、脾臓、肺、心臓 及び肝臓の拡大とを伴った、重度の子宮内膜炎を有していることが判った。組織 検査によって、骨盤炎症と、子宮内膜炎と、更に、肺の肺胞中に於ける多数の高 度に好酸性の多核性マクロファージの存在とが確認された。このマウスは、非常 に異常な血液プロファイル（ヘモグロビン１０８ｇ／Ｌ，全白血球カウント値２ ９ｘ１０⁹／Ｌ，及び血小板カウント値４１８ｘ１０⁹／Ｌ）を有しており、循環 白血球の７０％が、単球であった。子宮内膜炎は、マウスにおいてはまれな感染 であって、我々は、他の免疫的に無防備にされた動物においては過去１２カ月 間これを観察したことがない。この感染は、恐らく、交配中に誘発されたもので あり、好中球とＧ−ＣＳＦの欠失が、恐らく、動物のこの感染に対する感染性に 大きく影響したものと思われる。 バクテリア感染中においてこの動物に見られた深く（ｐｒｏｆｏｕｎｄ）過剰 な単球増加症は、非常に異常なものであって、Ｇ−ＣＳＦを作ることが出来ない ことが、感染に対して適当な顆粒球反応を作り出す能力を損なったように思える 。この単球増加症は、造血の他の無傷のメカニズムを介して、単球とマクロファ ージとを作り出すことによって、好中球の欠如を補償しようとする試みを示して いるのかもしれない。例１７ Ｇ−ＣＳＦ欠失マウスは、バクテリア感染に犯 されやすい Ｇ−ＣＳＦ欠失及び野生タイプのマウスを、１匹のマウス当り５ｘ１０³コロ ニー形成単位の投与量で、静脈注射によって、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙ ｔｏｇｅｎｅｓに感染させ、注射のそれぞれ１時間後、１日後、そして５日後に 、血液及びバクテリアｌｏａｄ ｅｎｄポイントを調べた。その結果を表６と７ とにまとめている。 表６に於て、Ｌｉｓｔｅｒｉａ注射の５日後に分析された、個々のマウスのバ クテリアカウント値（生データ）が示されている。 Ｇ−ＣＳＦ欠失マウスは、その好中球カウント値が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ注射の １時間後において、野生タイプのマウスと比較して、低いという事実によって示 されているように、好中球の容易に動員可能なプールを有していない。それらの 好中球レベルは、確かに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染において絶対値で増加してはい るが、この血液応答は、野生タイプのそれと比較して、明らかに損なわれており 、コントロールグループのベースラインレベルすら達成することがない。この損 なわれた血液応答は、感染の５日後のこれらのマウスの肝臓と脾臓とにおいて観 察される一般的に高いバクテリア数に相関している。例１６ ＧＭ−ＣＳＦとＣＳＦ−１との両方が欠失した マウスの発生 ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウス（遺伝子型ＧＭ−／−）と適当に異系交配されたＧＭ ＋／＋コントロールとを、上述したように発生させた。最初のＧＭ−／− Ｍ− ／−は、ＧＭ＋／−Ｍ＋とＧＭ＋／＋ Ｍ＋／−マウス（即ちｏｐ／＋）とを交 配し、交配用としてＧＭ＋／−Ｍ＋／− 子孫を選択することによって発生させた。これらの交配によって、ＧＭ−／− Ｍ−／−とＧＭ＋／＋ Ｍ−／−（即ち、ｏｐ／ｏｐ）とを含めて、適当な比率 で種々の遺伝子型が産生された。更に別のＧＭ−／− Ｍ−／−の動物を産生す るために、ＧＭ−／− Ｍ＋／−のマウスを交配させた。例１７ ＧＭ−／−Ｍ−／−マウスの生存力及び繁殖力 ＧＭ＋／− Ｍ＋／− × ＧＭ＋／− Ｍ＋／−のマウスの第１交配から、 ７±２の子（ｎ＝１５）から成る腹子が生まれた。表８にまとめられてるように 、９つの可能な遺伝子型が、離乳する１４４の子の間で、およその予想メンデル 比として示されている。 ４つのダブル−ヘテロ接合交配対の１４４のゲノタイプ化子孫からの結果。こ の期間中において、次のマウスはゲノタイプ化されなかった：３日で死亡した９ の子からなる一腹子、２ＧＭ？Ｍ−／−雄、２ＧＭ−／−Ｍ？雄、１ＧＭ？Ｍ？ 雌。 特に、ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスは、野生タイプマウスに対して大幅に過少 比率表示されることはなく、これは、ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスが生存力があ り、この遺伝子型において、雄のマウスが過剰比率表示されてはいたが、大きな 胎児又は新生死亡が無かったことを示している。その後、ＧＭ−／− Ｍ＋／− × Ｍ−／− Ｍ＋／−の交配によって、子の２５／１６４（１５％）がＧＭ −／− Ｍ−／−である腹子が産出され、これは予想よりも遥かに少なく（ｐ＜ ０．０５）、そしてここでも雄が優勢であった（１９／２５）（ｐ＜０．１）。 ＧＭ−／− Ｍ−／−の雄は繁殖力が強く、その１匹の雄をＧＭ−／− Ｍ＋／ −の雌と交配させることによって、５±３の子からなる５つの腹子が産出された 。我々は、他の者が遭遇した困難に鑑みて、Ｍ−／−の雌からは、そのＧＭ−Ｃ ＳＦステータスに拘らず、まだ交配を行っていない。 カイ２乗（Ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅｄ）テストを使用して、生存力及び繁殖力デ ータに於ける違いをテストした。非−対（ｕｎ−ｐａｉｒｅｄ）ｔ−テストを使 用して、組織データに於ける統計的に重みを有する相違をテストした。生存デー タを比較するためにＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｓｅｒ生存曲線を構成し、Ｍａｎｔｅ ｌ−Ｃｏｘ 統計を使用して、相違の平均生存数をテストした。生存データを採るために、見 掛ケ上の病気を有するマウスは非生存体であるとみなして、殺された。＜０．０ ５のｐ値を、統計的に重要であると見なした。 ＧＭ−／− Ｍ−／−の生存を、他のすべての無歯マウス（ＧＭ＋／− Ｍ− ／−およびＧＭ＋／＋ Ｍ−／−）と、ＧＭ−ＣＳＦのみが欠失しているマウス （ＧＭ−／− Ｍ＋／＋）と、野生タイプ（ＧＭ＋／＋ Ｍ＋／＋）マウスの生 存と比較した。すべての無歯（Ｍ−／−）マウスの生存率は、それらがＧＭ−Ｃ ＳＦ欠失であるか、あるいはＧＭとＭ−ＣＳＦとの両方が欠失しているかの違い に拘らず、いずれも野生タイプやＧＭ−ＣＳＦ欠失腹子に対して大幅に減少した （図２）。平均（メジアン）生存率は以下の通りであった。即ち、ＧＭ＋／＋ Ｍ＋／＋とＧＭ−／− Ｍ＋／＋、７カ月のフォローアップで平均値を達成出来 ず；Ｍ−／− ＧＭ＋／＋又は＋／−、２３１日間（ｎ＝２７）； ＧＭ−／− Ｍ−／−、７１日間（ｎ＝３８）。Ｍ−／−マウスのこれらの二つのグループ の死亡時に於ける平均年齢は、それぞれ３３日と４１日であった。Ｍ−／− Ｇ Ｍ＋／＋又は＋／−マウスの平均生存日数は、ＧＭ＋／＋ Ｍ＋／＋マウスのそ れよりも（ｐ＝０．０３）遥かに短く、ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスの生存日数は、他のＭ−／−マウスのそれよりも（ｐ＝０．０１ ）よりも遥かに短かかった。大半のＭ−／−マウスの死亡は、動物管理（ｈｕｓ ｂａｎｄａｒｙ）の困難に依るものであったが、組織検査に依れば、２４日から ３２４日の間に死亡するか殺された１９／１９のＧＭ−／− Ｍ−／−マウスは 、死亡時において、見掛ケ上、重度の肺疾病や急性肺葉肺炎を有していたことが 原因であった。苦痛が見られたために２４日から３２４日の間に殺されたマウス の内のいくつかは、頻呼吸を有していた。例１８ ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスの表現型特徴 ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスは、ｏｐ／ｏｐマウスの典型的な顕著な表現型特 徴、即ち、骨粗しょう症、歯の萠出不全、ドーム状の頭部形状、を示した。更に 、これらはすべて、ＧＭ−／−マウスにおいて観察される肺疾患に典型的な多く の特徴を備えた肺疾患を有していた。前記ＧＭ−／− Ｍ−マウスは、各年齢に おいて（ａｇｅ−ｆｏｒ−ａｇｅ）ＧＭ−／− Ｍ＋／＋マウスにおいて見られ る病状よりも、より重症でより永続的な病状を有している。例１９ ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦ遺伝子型のＰＣＲ 診断 ＧＭ−ＣＳＦ座に於けるマウスの対立遺伝子ステータスを、前述したＰＣＲに よって判定した。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子型は以下とした。野生タイプ、ＧＭ＋／＋ ，ヘテロ接合［野生タイプ／損傷］ＧＭ＋／−；及び、損傷対立遺伝子に関して ヘテロ接合、ＧＭ−／−。 ｏｐ／ｏｐ（上述のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子型に対応して、Ｍ−／−とされたＭ− ＣＳＦ遺伝子型）は、Ｍ＋／−× Ｍ＋／−の配合からの腹子において、その「 無歯」表現型によって容易に認識可能ではあるが、ヘテロ接合（Ｍ＋／−）と野 生タイプ（Ｍ＋／＋）との同腹子は、表現型の特徴によっては識別不能であり、 ｏｐ／ｏｐ（Ｍ−／−）による実験においては、一般に、Ｍ＋／−及びＭ＋／＋ の有歯の同腹子からランダムに選択したものを、その遺伝子型ステータスを正確 に明確化することなく、コントロールとして使用してきた（４０，４１）。この 不正確性と、特にＧＭ−ＣＳＦが欠失している場合において、遺伝子投与効果が 誘発するかもしれない異種混合とを避けるために、Ｍ−ＣＳＦ座に於ける対立遺 伝子ステータスを定義するためのＰＣＲに基づくストラテジーが考案された。ネ ズミｃＤＮＡ配列（４２，４３） と、公開されている不完全なヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子のゲノム構造（４４）とを比 較することによって、前記ｏｐ点突然変異（４５）が、ヒトエクソン３の相同的 なエクソンに位置することが予想された。ネズミｃＤＮＡ配列に対して相補的な プライマーを使用して、このエクソンのイントロン５’に対応するネズミゲノム ＤＮＡからの断片を増幅し、この１．６ｋｂのＰＣＲ産生断片の３’末端の３０ ０ｂｐを配列決定した。前記診断用ＰＣＲによって、このイントロン配列（５’ −ＴＧＴＧＴＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＴＴＡＣＡ−３’）からの５’センスプ ライマーを、３’アンチセンスプライマー（５’−ＧＧＴＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴ ＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＣＣＡＡＡＡ−３’）と組合せ、前 記ｏｐ突然変異のチミジン塩基挿入が、が鋳型ＤＮＡに存在するか否かに応じて 、１９５ｂｐ又は１９６ｂｐのＰＣＲ生産物を産生した。３’−アンチセンスプ ライマーにおける２ｂｐのミスマッチ（下線部）の後に、このＰＣＲ産生物は、 鋳型が前記ｏｐチミジン挿入を有しているか否かに依存して、第２のＢｇ１Ｉ部 位を有している。このＰＣＲ生産物を、Ｂｇ１Ｉによって消化し、これを、前記 イントロンＢｇ１Ｉ部位で切断して９６ｂｐの生産物を産生し（各ＰＣＲ反応に おいて制限酵素活動 を確認する）、又、ｏｐ鋳型から産生された生産物の場合には、その結果得られ た１００ｂｐのｏｐ−鋳型−依存断片を、診断用の７０及び３０ｂｐの断片に切 断した。但し、９９ｂｐの野生タイプ−依存断片には切断しなかった。ヘテロ接 合性（ｏｐ／＋，Ｍ＋／−）を、表現型と、更に、１００ｂｐの前記断片がＢｇ １Ｉによって完全に消化されたか否か、あるいは、切断されない９９ｂｐの断片 が残されたか否か、に基づいてホモ接合性（ｏｐ／ｏｐ，Ｍ−／−）から識別す ることが出来た。 野生タイプ、ｏｐ／ｏｐ及びｏｐ／＋ゲノムＤＮＡから産生されたＰＣＲ生産 物の臭化エチジウム染色アガロースゲルによって、ｏｐ含有鋳型からのＰＣＲ生 産物のＢｇ１Ｉ消化物中における診断用の７０ｂｐと３０ｂｐとの断片が示され た。後者の断片は、前記ｏｐ／ｏｐ鋳型の場合にのみ観察することが出来た。例２０ ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスの血液分析 ４種類の遺伝子型マウスのマウスに於けるヘモグロビン及び血小板レベルは、 ４〜５週齢においては大きく異なることが無かったが、１８〜２４週齢までに、 ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスのヘモグロビンレベルは大幅に上昇していた。これ らの結果は表８にまとめられている。はっき りとしたヘモグロビンレベルの増加が、数匹の比較的高齢のＧＭ−／− Ｍ−／ −マウスに見られた。例えば、苦痛が観察されたために殺された１匹の動物は２ ２０ｇ／ｌのヘモグロビンレベルを有していた。 １８〜２４週齢のＧＭ−／− Ｍ−／−マウスにおいて、既にＭ−／−マウス について報告したように（表２及び２）、主として相対的リンパ球減少症のため に、全白血球の数が大幅に減少していた。ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスの末梢血 液中には単球が存在していたが、この年齢のマウスにおいて、そのレベルは、野 生タイプ及びＧ−／− Ｍ＋／＋マウスや、ＧＭ＋／＋ Ｍ−／−マウスのそれ よりも遥かに低いものであった（表２）。ＧＭ−／− Ｍ−／−は、いずれか一 方のみの因子が欠失したマウスよりも遥かに多い好中球を有していた。但し、同 年齢の因子−充実（ｒｅｐｌｅｔｅ）コントロールよりも遥かに多いわけではな かった。この相対的好中球増加症は、その生涯を通じて持続した。４〜５週齢の ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスは、同年齢のＧＭ＋／＋ Ｍ＋／＋マウスの顆粒球 レベルが１．３±０．７ｘ１０⁹／Ｌであったのに対して、３．０±２．４ｘ１ ０⁹／Ｌ（ｎ＝４）の顆粒球レベルを有していた。又、２６週齢、３１週齢、及 び４７週齢のより高齢の３匹のマウスは、それぞれ、１．７４，４．３７及び７ ．７ｘ１０⁹／Ｌの顆粒球レベルを有していた。前記相対的単球減少状態にも拘 らず、ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスの疾患肺は、多数の泡状肺胞マクロファージ を含有しており、少なくとも 質的には、組織における宿主防御のために単球が利用可能であることを示した。 ４〜５週と、１８〜２４週と、更に２８週のマウスも比較した。その結果を表 ９にまとめる。これらの結果は、表８の結果と一致している。 遺伝子型ＧＭ−／−，Ｍ−／−のマウスは、骨粗しょう症や歯の前出不全等の ＣＳＦ−１−／−遺伝子型に典型的な特徴と、特にグラム陰性組織によって引き 起こされる肺炎等の感染に対する感染傾向等のＧＭ−ＣＳＦ−／−遺伝子型に典 型的な特徴との両方を示す。これらの肺炎は、通常、致命的である。例えば、４ 匹のＧＭ−／−，Ｍ−／−動物からなる一つのグループにおいて、一匹が、８週 齢で死亡しているのが見つかり、細菌学的に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔ ｏｃａによって起こされた肺炎が確認された。３匹の動物は、重症であることが 判った後、殺された。即ち、６週で殺された１匹はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘ ｙｔｏｃａ肺炎を有し、６週で殺されたもう１匹は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ種によって引き起こされた顔面腫瘍を有し、２０週で殺されたもう１匹は、Ｐ ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａによって引き起こされた肺 炎を有していた。 これらの二重に欠失したマウスは、ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスにおいて見られた のと同じ特徴を提示する肺疾患を有している。しかし、ＣＳＦ−１の欠失にも拘 らず、これらのマウスの単球／マクロファージレベルは、正常かあるいは正常に 近いレベルである。従って、その二重 の欠失にも拘らず、これらのマウスは、定常の顆粒球形成と単球形成とを維持す ることができる。 ここに引用した参考文献を以下のページにリストアップし、ここに添付する。 ここに使用した以下の単語、Ａｒａｌｄｉｔｅ，Ｅｐｏｎ，Ｇｅｎｅｓｃｒｅ ｅｎ Ｐｌｕｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｓｙｓｍｅｘ、は商標である。 本発明を、明確化と理解のために、いくらか詳細に記載したが、この明細書に 開示した本発明の概念の範囲から外れることなく、ここに記載した実施例及び方 法に対して種々の改変が可能であることを当業者は容易に理解するであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年６月５日 【補正内容】 Ｍ−／−マウスの生存日数は、他のＭ−／−マウスのそれよりも（ｐ＝０．０１ ）よりも遥かに短かかった。大半のＭ−／−マウスの死亡は、動物管理（ｈｕｓ ｂａｎｄａｒｙ）の困難に依るものであったが、組織検査に依れば、２４日から ３２４日の間に死亡するか殺された１９／１９のＧＭ−／− Ｍ−／−マウスは 、死亡時において、見掛ケ上、重度の肺疾病や急性肺葉肺炎を有していたことが 原因であった。苦痛が見られたために２４日から３２４日の間に殺されたマウス の内のいくつかは、頻呼吸を有していた。例１８ ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスの表現型特徴 ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスは、ｏｐ／ｏｐマウスの典型的な顕著な表現型特 徴、即ち、骨粗しょう症、歯の前出不全、ドーム状の頭部形状、を示した。更に 、これらはすべて、ＧＭ−／−マウスにおいて観察される肺疾患に典型的な多く の特徴を備えた肺疾患を有していた。前記ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスは、各年 齢において（ａｇｅ−ｆｏｒ−ａｇｅ）ＧＭ−／− Ｍ＋／＋マウスにおいて見 られる病状よりも、より重症でより永続的な病状を有している。例１９ ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦ遺伝子型のＰＣＲ 診断 ＧＭ−ＣＳＦ座に於けるマウスの対立遺伝子ステータスを、前述したＰＣＲに よって判定した。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子型は以下とした。野生タイプ、ＧＭ＋／＋ ，ヘテロ接合［野生タイプ／損傷］ＧＭ＋／−；及び、損傷対立遺伝子に関して ヘテロ接合、ＧＭ−／−。 ｏｐ／ｏｐ（上述のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子型に対応して、Ｍ−／−とされたＭ− ＣＳＦ遺伝子型）は、Ｍ＋／−ｘ Ｍ＋／−の配合からの腹子において、その「 無歯」表現型によって容易に認識可能ではあるが、ヘテロ接合（Ｍ＋／−）と野 生タイプ（Ｍ＋／＋）との同腹子は、表現型の特徴によっては識別不能であり、 ｏｐ／ｏｐ（Ｍ−／−）による実験においては、一般に、Ｍ＋／−及びＭ＋／＋ の有歯の同腹子からランダムに選択したものを、その遺伝子型ステータスを正確 に明確化することなく、コントロールとして使用してきた（４０，４１）。この 不正確性と、特にＧＭ−ＣＳＦが欠失している場合において、遺伝子投与効果が 誘発するかもしれない異種混合とを避けるために、Ｍ−ＣＳＦ座に於ける対立遺 伝子ステータスを明確化するためのＰＣＲに基づくストラテジーが考案された。 ネズミｃＤＮＡ配列（４２，４３） と、公開されているヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子の不完全なゲノム構造（４４）とを比 較することによって、前記ｏｐ点突然変異（４５）が、ヒトエクソン３の相同的 なエクソンに位置することが予想された。ネズミｃＤＮＡ配列に対して相補的な プライマーを使用して、このエクソンのイントロン５’に対応するネズミゲノム ＤＮＡからの断片を増幅し、この１．６ｋｂのＰＣＲ産生断片の３’末端の３０ ０ｂｐの配列決定を行った。前記診断用ＰＣＲによって、このイントロン配列（ ５’−ＴＧＴＧＴＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＴＴＡＣＡ−３’）からの５’セン スプライマーを、３’アンチセンスプライマー（５’−ＧＧＴＣＴＣＡＴＣＴＡ ＴＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＣＣＡＡＡＡ−３’）と組合せ 、前記ｏｐ突然変異のチミジン塩基挿入が、が鋳型ＤＮＡに存在するか否かに応 じて、１９５ｂｐ又は１９６ｂｐのＰＣＲ生産物を産生した。３’−アンチセン スプライマーにおける２ｂｐのミスマッチ（下線部）の後に、このＰＣＲ産生物 は、鋳型が前記ｏｐチミジン挿入を有しているか否かに依存して、第２のＢｇ１ Ｉ部位を有している。このＰＣＲ生産物を、Ｂｇ１Ｉによって消化し、これを、 前記イントロンＢｇ１Ｉ部位で切断して９６ｂｐの生産物を産生し（各ＰＣＲ反 応において制限酵素活動 １８〜２４週齢のＧＭ−／− Ｍ−／−マウスにおいて、既にＭ−／−マウス について報告したように（表２及び２）、主として相対的リンパ球減少症のため に、全白血球の数が大幅に減少していた。ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスの末梢血 液中には単球が存在していたが、この年齢のマウスにおいて、そのレベルは、野 生タイプ及びＧ−／− Ｍ＋／＋マウスや、ＧＭ＋／＋ Ｍ−／−マウスのそれ よりも遥かに低いものであった（表２）。ＧＭ−／− Ｍ−／−は、いずれか一 方のみの因子が欠失したマウスよりも遥かに多い循環好中球を有していた。但し 、同年齢の因子−充実（ｒｅｐｌｅｔｅ）コントロールよりも遥かに多いわけで はなかった。この相対的好中球増加状態は、その生涯を通じて継続した。４〜５ 週齢のＧＭ−／− Ｍ−／−マウスは、同年齢のＧＭ＋／＋ Ｍ＋／＋マウス（ ｎ＝３３）の顆粒球レベルが１．３±０．７×１０⁹／Ｌであったのに対して、 ３．０±２．４×１０⁹／Ｌ（ｎ＝４）の顆粒球レベルを有していた。又、２６ 週齢、３１週齢、及び４７週齢のより高齢の３匹のマウスは、それぞれ、１．７ ４、４．３７及び７．７×１０⁹／Ｌの顆粒球レベルを有していた。前記相対的 単球減少状態にも拘らず、ＧＭ−／− Ｍ−／−マウスの疾患肺は、多数の泡状 肺胞マクロファージを含 有しており、少なくとも質的には、組織における宿主防御のために単球が利用可 能であることを示した。 ４〜５週と、１８〜２４週と、更に２８週のマウスも比較した。その結果を表 ９にまとめる。これらの結果は、表８の結果と一致している。 遺伝子型ＧＭ−／−，Ｍ−／−のマウスは、骨粗しょう症や歯の前出不全等の ＣＳＦ−１−／−遺伝子型に典型的な特徴と、特にグラム陰性組織によって引き 起こされる肺炎等の感染に対する感染傾向等のＧＭ−ＣＳＦ−／−遺伝子型に典 型的な特徴との両方を示す。これらの肺炎は、通常、致命的である。例えば、４ 匹のＧＭ−／−，Ｍ−／−動物からなる一つのグループにおいて、一匹が、８週 齢で死亡しているのが見つかり、細菌学的に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔ ｏｃａによって起こされた肺炎が確認された。３匹ら動物は、重症であることが 判った後、殺された。即ち、６週で殺された１匹はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘ ｙｔｏｃａ肺炎を有し、６週で殺されたもう１匹は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ種によって引き起こされた顔面腫瘍を有し、２０週で殺されたもう１匹は、Ｐ ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａによって引き起こされた肺 炎を有していた。 これらの二重に欠失したマウスは、ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウスにおいて見られた のと同じ特徴を提示する肺疾患を有している。しかし、ＣＳＦ−１の欠失にも拘 らず、これらのマウスの単球／マクロファージレベルは、正常かあるいは正常に 近いレベルである。従って、その二重 の欠失にも拘らず、これらのマウスは、定常の顆粒球形成能と単球形成能とを維 持することができる。例２１ 肺胞タンパク症を患う患者に於けるＧＭ−ＣＳＦ 治療の臨床テスト 肺胞タンパク症の新しい治療方法の開発には、その発症率が非常に低いこと、 この疾病の重度の単純で正確なインデックスが無いこと、そして、最も重要なこ ととして、この疾病の症候群（ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）に関する理解 が初歩的であること、等の大きな障害がある。 確立した応答基準が無いために、この例におけるＧＭ−ＣＳＦの臨床的有効性 は、患者の徴候上および機能上の改善と、更に、肺胞−動脈酸素勾配と大幅で部 分的な放射線写真の解像度に於ける改善によって評価した。自発的に回復する肺 胞タンパク症患者が小数存在するが、この個体において、呼吸機能が連続的に低 下すること、ＧＭ−ＣＳＦの導入に対する時間関係、および、その投与の停止し た後の悪化、のいずれもがここに記載した改善に於けるＧＭ−ＣＳＦの因果関係 を支持している。 本発明の前記ＧＭ−ＣＳＦ欠失マウス（例７）の表現型によって、予想外に、 マウスの正常な肺表面活性物質 代謝においてＧＭ−ＣＳＦが絶対的に必要であることが確証された。ＧＭ−ＣＳ Ｆが欠乏しているマウスの肺疾患と、肺胞タンパク症とが非常に類似しているた め、我々は、後天性肺胞タンパク症を有する患者における、組換えヒトＧＭ−Ｃ ＳＦの効果をテストした。 前記患者は、以前は健康であった、呼吸障害の家族歴の無い、カフカス人の４ ９歳の男性であった。彼は２５年間１日当り４０本のタバコを吸っていたが１９ ９１年に喫煙をやめていた。彼によれば、工業的粉塵や風媒の粒子にされされた ことはないとのことであった。１９９３年の最初のプレゼンテーションにおいて 、彼は、進行性の運動呼吸困難（ｅｘｅｒｔｉｏｎａｌ ｄｙｓｐｎｅａ）と、 空咳とについて説明した。放射線画像化によって、肺胞の不透明部が広がってい ることが示された。肺胞タンパク症の診断が、胸腔鏡検査肺バイオプシーによっ て確定され、これは、肺胞空間が、エオシン好性顆粒球ＰＡＳ陽性物質と、分散 した泡状マクロファージとによって満たされていることを示した。彼は、研究に 入る前の２０カ月間に３回、徴候的な利点の有る治療用肺洗浄を受けた。１９９ ５年１０月における研究の開始時において、前記患者の運動許容性は、水平な地 面又は１つの階段での４００ｍの歩行が限界であった（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ 第３等級呼吸困難）。彼によれば、咳や、 痰、熱等は無いとのことであった。ベースライン動脈Ｐ_o2は、室内空気において ６４ｍｍＨｇであった（正常では７５〜１００ｍｍＨｇ）。肺活量と一酸化炭素 に対する拡散能力は、予想された正常範囲内であった。１００％のＯ₂を２０分 間呼吸した後に於ける動脈酸素含有量の測定によって、２．９％の心出力が右か ら左への流れていることが判った（正常な動脈−静脈酸素含有量差を５ｍｌ／１ ００ｍｌと仮定し、６５％以下を正常として）。 前記患者をオープン・ラベル フェーズＩＩに移し、ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ （Ｌｅｕｃｏｍａｘ^TM，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ ）の有効性を評価した。ＧＭ−ＣＳＦの投与量は、最初の５日間は、１日当り皮 下注射で３．０μｇ／ｋｇとし、その後、６日目から４９日目まで、５．０μｇ ／ｋｇにまで増加させた。患者の便宜のために、５０日目以後は、投与量を、一 瓶（４．０μｇ／ｋｇ）に減らした。患者を、最初の投与後、４時間、連続パル ス酸素濃度計でモニターし、その後のすべての投与は、モニターせずに自己投与 とした。毒性を、週毎の履歴及び身体検査と、最初の５日間の毎日の血液検査と 、その後の、週毎に３回 の血液検査と、週毎の肝臓酵素テストとによって評価した。有効性は、症候評価 及び呼吸困難標準（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙの評 価基準）、室内空気を呼吸している間の動脈血液ガスと仮想定常条件下における 肺胞ガス等式を使用した肺胞−動脈酸素勾配の計算、及び、薄断面高解像度技術 を使用した胸部のコンピュータ化トモグラフィーとによって測定した。データ傾 向を、最小二乗法を使用した線形回帰法によって分析した。 ＧＳ−ＣＳＦ投与終了の５週間後、殺菌技術を使用して骨髄を吸引し、コロニ ー形成細胞（ＣＦＣ）を、標準方法を使用して寒天培地中にてアッセイした。原 種細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子［Ｇ−ＣＳＦ］、及び幹細胞 因子［ＳＣＦ］（ＧＭ−ＣＳＣに対する）及びＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，イン ターロイキン−３［ＩＬ−３］，ＩＬ−６，及びエリトロポエチン（ＢＦＵ−Ｅ 用）（全て組換えヒトたんぱく質；Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ， ＣＡ）によって活性化した培地から計数した。単一の成長因子の滴定も行った。 コントロール骨髄細胞は、計画的骨髄採取を受けている正常な同系の骨髄提供者 から、インフォームド・コンセントに基づいて入手した。コロニーは、 ５０以上の細胞を含有していることを明確にし、そして１４日間の培養後に計数 した。ＧＭ−ＣＳＦレセプタ結合研究を、前に記載（４９）したように調合した 、骨髄細胞とヨウ素化ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）を使用して、マンソン（Ｍｕｎｓｏｎ）他（４８）の方法に よって行い、その結果を、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロットとして示した。 臨床評価 ＧＭ−ＣＳＦ治療の１０日後、患者は、白色の粒状物質を伴う咳がでることと 、運動能力が徐々に増加していることを報告した。治療の第１４日目と２８日目 とにおけるＣＴスキャンによって、僅かな改善が示された。第３５日目までに、 患者は休息無しで、水平地面上、又は４つの階段を無制限距離歩行することがで きるようになった（第０等級呼吸困難）。ＧＭ−ＣＳＦ投与を停止した７０日目 の胸部のＣＴスキャンによって、治療前の浸潤の程度と比較して、多数の領域に おいて肺胞浸潤が大幅に除去されていることが示された。新たな浸潤領域は観察 されなかった。その後、患者は無症状状態となり、その運動においてなんら呼吸 制限が無く、肺胞タンパク症の発病以来はじめてハイキングや山登りができるよ う になった。１０週間のＧＭ−ＣＳＦ投与において、肺胞−動脈酸素勾配が斬新的 かつ大幅に減少した（Ｒ＝−０．８３２；Ｐ＝０．０１０）。 治療を停止して１４日以内に、患者は、運動呼吸困難の再発と、疲労の増加（ 第２等級呼吸困難）とを訴えた。ＧＭ−ＣＳＦを停止して１０週間以内に、患者 は、自分の全般的状態が、ＧＭ−ＣＳＦを開始する前の悪化状態に戻ってしまっ たと報告した。この症状における低下は、動脈酸素化の悪化と一致した。 毒性及び血液反応 前記患者は、ＧＭ−ＣＳＦの第１回目の投与の４時間以内において、酸素化（ 血液中への酸素送り込み）に於ける急激な悪化はなかった。第１回目のＧＭ−Ｃ ＳＦ投与によって、呼吸の変化は無かったが、その後、患者は第２等級の吐き気 と嘔吐とを起こした。これらは、その後の投与では再発しなかった。唯一の再発 毒性は、注射箇所における第１等級の紅斑であった。 ＧＭ−ＣＳＦの公知の造血活動と一致して、前記患者は、好中球増加症と好酸 球増加症とを起こした。ベースライン好中球カウント値３．８９ｘ１０⁹／Ｌに 対して、得られた最高の好中球カウント値は、５．０μｇ／ｋｇ／ ｄａｙの投与を受けていた時の６．６５ｘ１０⁹／Ｌ（第２８日目）であった。 また、ベースライン好酸球カウント値０．２０×１０⁹／Ｌに対して、得られた 最高の好酸球カウント値は、５．０μｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与を受けていた時の ０．９０×１０⁹／Ｌであった。以下において議論するように、この造血反応は 比較的穏やかなものであった。 実験室評価 前記患者の細胞のＧＭ−ＣＳＦに対するインヴィトロの応答を記録するために 、コロニー形成アッセイを行った。骨髄形状と細胞質とは正常であった。最大に 刺激した培地（１０⁵の単核細胞当りの総ＧＭ−ＣＳＦとＢＦＵ−ＥＳＦとは、 それぞれ、１３６±３と１４７±１［平均＋標準偏差］）中における血液元祖（ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞の絶対数の減少は起こらなかった。ＳＣＦとＧＭ− ＣＳＦとに応答して形成されたコロニーの数は、コントロール個体（コントロー ルの平均プラトーレベルは、それぞれ、１１１％と１１３％）と比較して大差な かった。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦのみに応答して形成されたコロニーの最大 数（図４ｂ）とＩＬ−３のみに応答して形成されたそれとは、減少した（コント ロールの平均プ ラトーレベルは、それぞれ、４７％と４６％であった）。これによって、ＧＭ− ＣＳＦ又はＩＬ−３に応答しない造血細胞の副集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏ ｎ）が存在する可能性が高まった。しかし、ラジオラベル化ＧＭ−ＣＳＦによる 結合研究は正常であった。高親和性［Ｋ_D＝６〜４０ｐＭ；平均は２３０サイト ／ｃｅｌｌ（患者）と２２０サイト／ｃｅｌｌ（コントロール）］と低親和性［ Ｋ_D＝１ｎＭ；平均はそれぞれ１１００及び５６０サイト／ｃｅｌｌ）の両方の レセプタが発現された。これらのデータは、ＧＭ−ＣＳＦレセプタ複合体の細胞 外ドメインが通常、ＧＭ−ＣＳＦに結合し、増殖−分化信号を提供することが可 能であることを示している。 ＧＭ−ＣＳＦの肺胞タンパク症の治療における利用可能性を示すのに加えて、 この例は、潜在的病原性因子としてのＧＭ−ＣＳＦに対する応答性の減少を示唆 している。インヴィヴォにおいて、これは、和らげられた白血球増加として把握 された。他の病気のＧＭ−ＣＳＦ治療の過去の研究において、常に、ＧＭ−ＣＳ Ｆを３．０ないし７．５μｇ／ｋｇ／ｄａｙで１０ないし１４日間投与した後に おいて、好中球が３．１ないし１３．５倍増加したことが示されている。報告さ れた平均ピーク白血球カウント値は、１９．２ないし６５．９ｘ１０⁹／Ｌ の範囲である。更に、これらの研究において、白血球カウント値は、ＧＭ−ＣＳ Ｆ投与を通じて増加し続けた。これに対して、５．０μｇ／ｋｇ／ｄａｙの最初 の１４日間の投与（３．０μｇ／ｋｇ／ｄａｙでの５日間を含む、全部で１９日 間の治療）において、前記患者の最大白血球カウント値と好中球カウント値とは 、それぞれ、僅かに、８．７（１．３４倍の増加）と、６．０２ｘ１０⁹／Ｌ（ １．５５倍の増加）とであった。これまでの研究もまた、一貫して、平均してベ ースラインの４．８から１００倍以上の増加となる、著しい好酸球増加を報告し ている。５．０μｇ／ｋｇ／ｄａｙの最初の１４日間の治療中に、この患者は０ ．４９×１０⁹／Ｌ（ベースラインの２．３倍の増加）というピークの好酸球カ ウントを経過した。これらの結果は、この個体が、外来ＧＭ−ＣＳＦに対して比 較的に低応答であったことを示唆している。 ここに引用した参考文献を以下のページにリストアップし、ここに添付する。 ここに使用した以下の単語、Ａｒａｌｄｉｔｅ，Ｅｐｏｎ，Ｇｅｎｅｓｃｒｅ ｅｎ Ｐｌｕｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｓｙｓｍｅｘ、は商標である。 本発明を、明確化と理解のために、いくらか詳細に記載したが、この明細書に 開示した本発明の概念の範囲から外れることなく、ここに記載した実施例及び方 法に対して種々の改変が可能であることを当業者は容易に理解するであろう。 １１４。 ３７．モリッセー，ピー・ジェイ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｐ．Ｊ．），キャリア ー，ケイ（Ｃｈａｒｒｉｅｒ，Ｋ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９０ １４４ ５５７−５６１。 ３８．イイダ，ジェイ（Ｉｉｄａ，Ｊ．），サイキ，エル（Ｓａｉｋｉ，Ｌ．） ，イシハラ，シー（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｃ．），アズマ（Ａｚｕｍａ）Ｖａｃｃ ｉｎｅ，１９８９ ７ ２２９−２３３。 ３９．フロイント，エム（Ｆｒｅｕｎｄ，Ｍ．），クライネ，エイチーディ（Ｋ ｌｅｉｎｅ，Ｈ．−Ｄ．）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１９９２ ２０ Ｓｕｐｐｌ． ２ Ｓ８８−Ｓ９０。 ４０．マークス，エス・シー（Ｍａｒｋｓ，Ｓ．Ｃ．），レーン，ピー・ダブリ ュ（Ｌａｎｅ，Ｐ．Ｗ．）Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，１９７６ ６７ １１−１８ 。 ４１．ウィクター−ジェドゼザック，ダブリュ（Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊ ｃｚａｋ，Ｗ．），アーメド，エイ（Ａｈｍｅｄ，Ａ．），スジリック，シー（ Ｓｚｃｚｙｌｉｋ，Ｃ．），スケリー，アール・アール（Ｓｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｒ ．）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８２ １５６ １５１６−１５２７。 ４２．ラドナー，エム・ビー（Ｌａｄｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．），マーティン，ジー・ エイ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ａ．），ノーブル，ジェイ・エイ（Ｎｏｂｌｅ，Ｊ． Ａ．），ウィットマン，ヴィ・ピー（Ｗｉｔｔｍａｎ，Ｖ．Ｐ．），ウォーレン ，エム・ケイ（Ｗａｒｒｅｎ Ｍ．Ｋ．），マクグローガン，エム（ＭｃＧｒｏ ｇａｎ，Ｍ．），スタンレー，イー・アール（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．）Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８ ８５ ６７０ ６−６７１０。 ４３．デ・ラマーター，ジェイ・エフ（ＤｅＬａｍａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．），ヘ ッション，シー（Ｈｅｓｓｉｏｎ，Ｃ．），シモン，ディ（Ｓｅｍｏｎ，Ｄ．） ，ゴウ，エヌ・エム（Ｇｏｕｇｈ，Ｎ．Ｍ．），ローテンブーラー，アール（Ｒ ｏｔｈｅｎｂｕｈｌｅｒ，Ｒ．），マーモッド，ジェイ−ジェイ（Ｍｅｒｍｏｄ ，Ｊ−Ｊ．）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８７ １５ ２３８９−９０ 。 ４４．カワサキ，イー・エス（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｅ．Ｓ．），ラドナー，エム ・ビー（Ｌａｄｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．）Ｉｎ Ｄｅｘｔｅｒ ＴＭ，Ｇａｒｌａｎｄ ＪＭ Ｔｅｓｔａ ＮＧ ｅｄｓ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ １９９０ １５５−１７６ 。 ４５．ヨシダ，エイチ（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．），ハヤシ，エス−アイ（Ｈａｙ ａｓｈｉ，Ｓ−Ｉ．），クニサダ，ティ（Ｋｕｎｉｓａｄａ，Ｔ．），オガワ， エム（Ｏｇａｗａ，Ｍ．），ニシカワ，エス（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．），オ カムラ，エイチ（Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．），スドー，ティ（Ｓｕｄｏ，Ｔ．）， シュルツ，エル・ディ（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．），ニシカワ，エス−アイ（Ｎ ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ−Ｉ．）Ｎａｔｕｒｅ，１９９０ ３４５ ４４２−４４ ４。 ４６．スタンレー，イー（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．），レイシュケ，ジー・ジェイ （Ｌｅｉｓｃｈｋｅ，Ｇ．Ｊ．），グレイル，ディ（Ｇｒａｉｌ，Ｄ．）他Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４ ９１ ５５９ ２−５５９６。 ４７．ポラード，ジェイ・ダブリュ（Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．），ハント，ジ ェイ・エス（Ｈｕｎｔ Ｊ．Ｓ．），ウィクター−ジェドゼザック，ダブリュ（ Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋ，Ｗ．），スタンレー，イー・アール（ Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌ．，１９９１ １４８ ２７３−２８３ 。 ４８．マンソン，ピー・ジェイ（Ｍｕｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．）およびロッドバード ，ディ（Ｒｏｄｂａｒｄ，Ｄ．）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８０ １０ ７ ２２０−２３９。 ４９．ニコラ，エヌ・エイ（Ｎｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．）およびキャリー，ディ（ Ｃａｒｙ Ｄ．）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９２ ６ １１９−１２ ９。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年７月１日 【補正内容】 ２０．肺胞のタンパク症を治療する推定方法の有効性をテストするための方法で あって、クレーム２〜１１のいずれかの非ヒト動物を、前記推定治療法に適用す る工程を有する。 ２１．クレーム２０の方法であって、前記推定治療は、化学療法剤である。 ２２．クレーム２０又は２１のいずれかの方法であって、前記推定治療は、顆粒 球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）、白血 病抑制因子（ＬＩＦ）、及び腫瘍増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）から成るグル ープ、又はサイトカインから選択される。 ２３．クレーム２１の方法であって、前記化学治療剤はＧＭ−ＣＳＦである。 ２４．感染症のための推定治療法の有効性をテストする方法であって、クレーム １〜１９のいずれかの非ヒト動物を前記推定治療法に適用する工程を含むもので ある。 ２５．クレーム２４の方法であって、前記感染症は、バクテリア性、菌性、又は ウィルス性の肺の感染である。 ２６．クレーム２４又は２５の方法であって、前記バクテリア性感染は、免疫無 防備又は免疫疾患の個体が感染しやすいタイプの日和見性感染、あるいは、現在 利 用可能な治療方法によっては処置が困難な感染症である。 ２７．クレーム２６の方法であって、前記日和見性感染は、後天性免疫不全症候 群（ＡＩＤＳ）の患者が感染しやすい感染症である。 ２８．肺胞タンパク症の治療方法であって、その治療を必要とする対象体に対し て、有効量のＧＭ−ＣＳＦを投与する工程を含み、ＧＭ−ＣＳＦが肺に対して局 所的に投与される方法。 ２９．肺感染症の治療方法であって、その治療を必要とする対象体に対して、有 効量のＧＭ−ＣＳＦを投与する工程を含み、ＧＭ−ＣＳＦが肺に対して局所的に 投与される方法。 ３０．クレーム２８又は２９の方法であって、前記ＧＭ−ＣＳＦは、ネブライザ 又は気管支チューブを介して、エアゾールとして投与される。 ３１．クレーム２８〜３０のいずれかの方法であって、前記ＧＭ−ＣＳＦは、他 の治療方法に対する補助治療として投与される。 ３２．クレーム２９〜３１のいずれかの方法であって、前記ＧＭ−ＣＳＦの投与 量は、０．１μｇ／ｋｇ体重ないし２０μｇ／ｋｇ体重の範囲である。 ３３．グラム陰性バクテリアによって引き起こされた肺感染症の治療方法であっ て、その治療を必要とする対象体に対して、有効量のＧＭ−ＣＳＦを投与する工 程を含む方法。 ３４．クレーム３３の方法であって、Ｇ−ＣＳＦは、肺に対して局所的に投与さ れる。 ３５．クレーム３３又は３４の方法であって、前記Ｇ−ＣＳＦは、ネブライザ又 は気管支チューブを介して、エアゾールとして投与される。 ３６．クレーム３３〜３５のいずれかの方法であって、前記Ｇ−ＣＳＦは、他の 治療方法に対する補助治療として投与される。 ３７．クレーム３３〜３５のいずれかの方法であって、前記Ｇ−ＣＳＦの投与量 は、０．１μｇ／ｋｇ体重ないし２０μｇ／ｋｇ体重の範囲である。 ３８．定常造血の調節に関係する因子であって、ＧＭ−ＣＳＦの発現が損傷され た動物中に存在する因子。 ３９．クレーム３８の因子であって、検出可能なレベルの対生物活性ＧＭ−ＣＳ Ｆを産生することが出来ない脾臓細胞を有する動物中に存在する因子。 ４０．クレーム３８又は３９のいずれかの因子であって、ＧＭ−ＣＳＦとＧ−Ｃ ＳＦとの両方の発現が損傷され た動物にも存在するものである。 ４１．クレーム３８又は３９のいずれかの因子であって、ＧＭ−ＣＳＦとＣＳＦ −１との両方の発現が損傷された動物にも存在するものてある。 ４２．肺胞タンパク症を患う患者の治療方法であって、ＧＭ−ＣＳＦをコードす る遺伝子を、体細胞遺伝子治療によって、前記患者に投与する工程を含むもので ある。 ４３．クレーム４２の方法であって、前記体細胞遺伝子治療は、ＧＭ−ＣＳＦを コードするｃＤＮＡのリポソーム形成物を、静脈投与する工程を含むものである 。 ４４．コロニー刺激因子欠失を診断する方法であって、前記因子をコードする遺 伝子の不在のために、そのように欠失を患っていると疑われる対象体から得られ た組織又は細胞サンプルをテストする工程を含むものである。 ４５．ＧＭ−ＣＳＦ欠失又はＧ−ＣＳＦ欠失を診断する方法であって、ＧＭ−Ｃ ＳＦ又はＧ−ＣＳＦをそれぞれコードする遺伝子の不在のために、そのように欠 失を患っていると疑われる対象体から得られた組織又は細胞サンプルをテストす る工程を含むものである。 ４６．クレーム４４又は４５の方法であって、前記テス トは、末梢血液細胞を使用して行われるものである。 ４７．クレーム４４又は４５の方法であって、前記テストは、肺のバイオプシー から得られた組織を使用して行われるものである。 ４８．図１を参照してここに記載された、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子の損 傷のための標的化ベクター。 ４９．図５を参照してここに記載された、Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子の損傷 のための標的化ベクター。 ５０．クレーム１〜１９のいずれかの非ヒト動物由来の細胞系。 ５１．クレーム５０の細胞系であって、これは骨髄ストロマ細胞系である。 ５２．肺に対する局所的投与に適した組成物であって、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又は Ｇ−ＣＳＦと、薬剤的に許容可能なキャリア、とを含むものである。 ５３．エアゾール又は噴霧化調剤として構成されたクレーム５２の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＹ 48/00 ＡＤＹ 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/09 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/535 Ｃ１２Ｑ 1/68 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ０７Ｋ 14/535 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ (72)発明者 ダン，アシュレー，ロジャー オーストラリア国 ヴィクトリア 3050 パークヴィル ロイヤル・パレード（無番 地）ザ・ロイヤル・メルボルン・ホスピタ ル メルボルン・チューマー・バイオロジ ー・ブランチ ルードヴィッヒ・インステ ィテュート・フォア・キャンサー・リサー チ (72)発明者 スタンレー，エドアルド，ガイ イギリス国 ロンドン エヌダブリュ７ １エイエイ ミル・ヒル ザ・リッジウェ イ（無番地）ナショナル・インスティテュ ート・フォア・メディカル・リサーチ (72)発明者 リーシュケ，グラハム，ジョン オーストラリア国 ヴィクトリア 3050 パークヴィル ロイヤル・パレード（無番 地）ザ・ロイヤル・メルボルン・ホスピタ ル メルボルン・チューマー・バイオロジ ー・ブランチ ルードヴィッヒ・インステ ィテュート・フォア・キャンサー・リサー チ (72)発明者 グレイル，ディアンヌ オーストラリア国 ヴィクトリア 3050 パークヴィル ロイヤル・パレード（無番 地）ザ・ロイヤル・メルボルン・ホスピタ ル メルボルン・チューマー・バイオロジ ー・ブランチ ルードヴィッヒ・インステ ィテュート・フォア・キャンサー・リサー チ (72)発明者 ファウラー，ケリー，ジェイ オーストラリア国 ヴィクトリア 3050 パークヴィル ロイヤル・パレード（無番 地）ザ・ロイヤル・メルボルン・ホスピタ ル メルボルン・チューマー・バイオロジ ー・ブランチ ルードヴィッヒ・インステ ィテュート・フォア・キャンサー・リサー チ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】本発明を定義するクレームは以下の通りである ： １． コロニー刺激因子をコードする遺伝子の損傷を有する非ヒト動物。 ２． 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする 遺伝子が損傷され、ＧＭ−ＣＳＦの発現が損傷されたクレーム１の非ヒト動物。 ３． クレーム２の非ヒト動物であって、前記損傷によって、前記非ヒト動物か らの脾臓細胞が検出可能なレベルの対生物活性ＧＭ−ＣＳＦを産生することが出 来なくなったものである。 ４． マウスであるクレーム２又は３の非ヒト動物。 ５． クレーム２〜４のいずれかの非ヒト動物であって、前記ＧＭ−ＣＳＦコー ド遺伝子は、完全に不活性化されたものである。 ６． クレーム２〜５のいずれかの非ヒト動物であって、前記ＧＭ−ＣＳＦコー ド化遺伝子の、ＳｃａＩとＳｍａＩの制限部位間のエクソン１と２、及びイント ロン１との欠失を有する突然変異を含むものである。 ７． クレーム２〜６のいずれかの非ヒト動物であって、ある特定の遺伝子の損 傷をもたらす更に別の単数又は複数の突然変異を含むものである。 ８． クレーム７の非ヒト動物であって、前記別の突然 変異によって、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ ＣＳＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、及び腫瘍増殖因子−β１（ＴＧＦ− β１）から成るグループから選択される成長因子をコードする遺伝子、又はサイ トカインが損傷されたものである。 ９． クレーム８の非ヒト動物であって、前記サイトカインは、インターロイキ ンである。 １０．クレーム９の非ヒト動物であって、前記インターロイキンは、インターロ イキン−２，インターロイキン−３及びインターロイキン−６から成るグループ から選択されるものである。 １１．クレーム１０の非ヒト動物であって、該動物はマウスであり、このマウス において、ＧＭ−ＣＳＦとＣＳＦ−１とのための遺伝子が損傷されるとともに、 前記マウスは、クレーム２〜６のいずれかのマウスと、ｏｐ／ｏｐマウスとを交 配させることによって生産されるものである。 １２．顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子が損傷され、 Ｇ−ＣＳＦの発現が損傷されたクレーム１の非ヒト動物。 １３．クレーム１２の非ヒト動物であって、前記損傷によって、前記動物からの 肺細胞が検出可能なレベルの 対生物活性Ｇ−ＣＳＦを産生することが出来なくなったものである。 １４．マウスであるクレーム１２又は１３の非ヒト動物。 １５．クレーム１２〜１４のいずれかの非ヒト動物であって、前記Ｇ−ＣＳＦを コードする遺伝子は、完全に不活性化されたものである。 １６．クレーム１２〜１５のいずれかの非ヒト動物であって、前記Ｇ−ＣＳＦを コードする遺伝子の、翻訳開始コドンＡＴＧを含むエクソン１のＮｃｏＩ制限部 位から、エクソン３のＢａｍＨＩ制限部位までの欠失を含む突然変異を有したも のである。 １７．クレーム１２〜１６のいずれかの非ヒト動物であって、ある特定の遺伝子 の損傷をもたらす更に別の単数又は複数の突然変異を有したものである。 １８．クレーム１７の非ヒト動物であって、前記別の突然変異によって、顆粒球 コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）、白血病 抑制因子（ＬＩＦ）、及び腫瘍増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）から成るグルー プから選択される成長因子をコードする遺伝子、又はサイトカインが損傷された ものである。 １９．クレーム１８の非ヒト動物であって、前記サイトカインは、インターロイ キンである。 ２０．肺胞のタンパク症を治療する推定方法の有効性をテストするための方法で あって、クレーム２〜１１のいずれかの非ヒト動物を、前記推定治療法に適用す る工程を有する。 ２１．クレーム２０の方法であって、前記推定治療は、化学療法剤である。 ２２．クレーム２０又は２１のいずれかの方法であって、前記推定治療は、顆粒 球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）、白血 病抑制因子（ＬＩＦ）、及び腫瘍増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）から成るグル ープ、又はサイトカインから選択される。 ２３．クレーム２１の方法であって、前記化学治療剤はＧＭ−ＣＳＦである。 ２４．感染症のための推定治療法の有効性をテストする方法であって、クレーム １〜１９のいずれかの非ヒト動物を前記推定治療法に適用する工程を含むもので ある。 ２５．クレーム２４の方法であって、前記感染症は、バクテリア性、菌性、又は ウィルス性の肺の感染である。 ２６．クレーム２４又は２５の方法であって、前記バクテリア性感染は、免疫無 防備又は免疫疾患の個体が感染しやすいタイプの日和見性感染、あるいは、現在 利 用可能な治療方法によっては処置が困難な感染症である。 ２７．クレーム２６の方法であって、前記日和見性感染は、後天性免疫不全症候 群（ＡＩＤＳ）の患者が感染しやすい感染症である。 ２８．肺胞タンパク症及び／又は肺感染を治療する方法であって、このような治 療を必要とする対象体に対して、有効量のＧＭ−ＣＳＦを投与する工程を含むも のである。 ２９．クレーム２８の方法であって、ＧＭ−ＣＳＦは、肺に対して局所的に投与 される。 ３０．クレーム２８又は２９の方法であって、前記ＧＭ−ＣＳＦは、ネブライザ 又は気管支チューブを介して、エアゾールとして投与される。 ３１．クレーム２８〜３０のいずれかの方法であって、前記ＧＭ−ＣＳＦは、他 の治療方法に対する補助治療として投与される。 ３２．クレーム２９〜３１のいずれかの方法であって、前記ＧＭ−ＣＳＦの投与 量は、０．１μｇ／ｋｇ体重ないし２０μｇ／ｋｇ体重の範囲である。 ３３．肺感染症の治療法であって、その治療を必要とする対象体に対して、有効 量のＧ−ＣＳＦを投与する工 程を含むものである。 ３４．クレーム３３の方法であって、Ｇ−ＣＳＦは、肺に対して局所的に投与さ れる。 ３５．クレーム３３又は３４の方法であって、前記Ｇ−ＣＳＦは、ネブライザ又 は気管支チューブを介して、エアゾールとして投与される。 ３６．クレーム３３〜３５のいずれかの方法であって、前記Ｇ−ＣＳＦは、他の 治療方法に対する補助治療として投与される。 ３７．クレーム３３〜３５のいずれかの方法であって、前記Ｇ−ＣＳＦの投与量 は、０．１μｇ／ｋｇ体重ないし２０μｇ／ｋｇ体重の範囲である。 ３８．定常造血の調節に関係する因子であって、ＧＭ−ＣＳＦの発現が損傷され た動物中に存在する因子。 ３９．クレーム３８の因子であって、検出可能なレベルの対生物活性ＧＭ−ＣＳ Ｆを産生することが出来ない脾臓細胞を有する動物中に存在する因子。 ４０．クレーム３８又は３９のいずれかの因子であって、ＧＭ−ＣＳＦとＧ−Ｃ ＳＦとの両方の発現が損傷された動物にも存在するものである。 ４１．クレーム３８又は３９のいずれかの因子であって、ＧＭ−ＣＳＦとＣＳＦ −１との両方の発現が損傷され た動物にも存在するものである。 ４２．肺胞タンパク症を患う患者の治療方法であって、ＧＭ−ＣＳＦをコードす る遺伝子を、体細胞遺伝子治療によって、前記患者に投与する工程を含むもので ある。 ４３．クレーム４２の方法であって、前記体細胞遺伝子治療は、ＧＭ−ＣＳＦを コードするｃＤＮＡのリポソーム形成物を、静脈投与する工程を含むものである 。 ４４．コロニー刺激因子欠失を診断する方法であって、前記因子をコードする遺 伝子の不在のために、そのように欠失を患っていると疑われる対象体から得られ た組織又は細胞サンプルをテストする工程を含むものである。 ４５．ＧＭ−ＣＳＦ欠失又はＧ−ＣＳＦ欠失を診断する方法であって、ＧＭ−Ｃ ＳＦ又はＧ−ＣＳＦをそれぞれコードする遺伝子の不在のために、そのように欠 失を患っていると疑われる対象体から得られた組織又は細胞サンプルをテストす る工程を含むものである。 ４６．クレーム４４又は４５の方法であって、前記テストは、末梢血液細胞を使 用して行われるものである。 ４７．クレーム４４又は４５の方法であって、前記テストは、肺のバイオプシー から得られた組織を使用して 行われるものである。 ４８．図１を参照してここに記載された、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子の損 傷のための標的化ベクター。 ４９．図５を参照してここに記載された、Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子の損傷 のための標的化ベクター。 ５０．クレーム１〜１９のいずれかの非ヒト動物由来の細胞系。 ５１．クレーム５０の細胞系であって、これは骨髄ストロマ細胞系である。 ５２．肺に対する局所的投与に適した組成物であって、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又は Ｇ−ＣＳＦと、薬剤的に許容可能なキャリア、とを含むものである。ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ（ＬＵＤ ＷＩＧ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）