JPH09502866A - セリントレオニンキナーゼ族の新規一員のクローニング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、（ａ）配列番号１に表されるアミノ酸配列、または（ｂ）（ａ）の配列の変異体、を含んで成ることを特徴とするＰＬＫタンパク質に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 セリン トレオニン キナーゼ族の新規一員のクローニング 本発明は新規セリン トレオニン キナーゼ、それをコードする遺伝子、ならび にヒトの腫瘍中のこの遺伝子およびその産物の変化の検出に関する。 外部の刺激に反応する細胞間の生化学的ネットワークの活性化は、真核細胞の 成長および分化の調和した制御を導く。プロテインキナーゼは多くの信号伝達経 路の構成物として知られている。これと関係して、これらのキナーゼ類はそれら の通常の生理的基質をリン酸化し、そしてそれらの酵素活性は他のキナーゼおよ びホスファターゼとの相互作用により調節されている。哺乳類、酵母およびショ ウジョウバエの多くの真核細胞中の多数のプロテインキナーゼの同定から、基本 的な細胞の分化および成長過程は広範囲の生物において同一の機構により制御さ れているようである。 真核生物では、現在まですべての既知のプロテインキナーゼはヒドロキシアミ ノ酸であるセリン、トレオニンまたはチロシンをリン酸化する。これらのキナー ゼによるリン酸化は、有糸分裂および細胞分化の制御に重要な役割を果たす。数 多くのポリペプチド増殖因子のレセプターはトランスメンブレンチロシンキナー ゼであり、それらの一部がプロテインキナーゼＣ、ＭＰキナーゼおよびp74rafの ようなセリン／トレオニンキナーゼをリン酸化する。細胞周期機構の中心成分は 、初はシゾサッカロミセスポンベ由来の有糸分裂遺伝子cdc2(細胞分裂周期)の生 成物として単離されたセリン／トレオニンキナーゼp34cdc2、ならびにサッカロ ミセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のCDC28である。 p34cdc2の活性は、サイクリンとの相互作用により調節されている。Ｇ１期では 、細胞周期の開始にはp34cdc2はサイクリンと結合しておらず、キナーゼ活性を 持たない。細胞に十分な栄養が供給されると、Ｇ１サイクリンは結合により蓄積 し、p34cdc2のキナーゼ活性を示しはじめる。この“開始”という意味は限界を 越えて細胞周期の変化（ＤＮＡ複製、MTOCの形成、微小管の中心の組織化）が始 まることである。これと関連して、サイクリンＢの合成も始まり、次にこれがp3 4cdc2に結合する。サイクリンＢの結合がp34cdc2のチロシン15に対するリン酸化 を誘導し、それによりキナーゼ活性が阻害されるので、この複合体は不活性であ る。プレMPF(卵成熟促進因子)とも呼ばれる、この不活性複合体もトレオニン160 でリン酸化される。このリン酸化はMPF活性に必要であるが、チロシンリン酸化 の阻害効果を破壊するためには不十分である。続いて、細胞周期のＧ２後期中の p34cdc2の脱リン酸化がMPFを活性化し、そして有糸分裂（Ｍ期）誘導を引き起こ す。複雑な生理学的制御に応じた翻訳後の反応が、MPF活性の一時的な調節にお いて本質的役割を果たす。プロテインチロシンキナーゼウィール(weel)は初はシ ゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）から単離され、記載し たような機構を介して、有糸分裂に入ることを阻害し、一方、cdc25遺伝子の生 成物は有糸分裂の開始を促進する。活性なMPFはチロシンホスファターゼを活性 化し、そしてp34cdc2を修飾するプロテインチロシンキナーゼを阻害し、これに より細胞が大変迅速かつ不可逆的に有糸分裂へともたらされるように、MPFが爆 発的に完全に活性化される。 最新の細胞周期に関する調査では、細胞周期に必須な調節物が発癌に関与して いることを示している。細胞の定常的増殖が腫瘍の際立つ特徴 であるので、これは驚くことではない。p34cdc2およびp34cdc2-関連プロテイン キナーゼの両方に結合するサイクリンＡの変化は、細胞の形質転換を引き起こす ことがある。このサイクリンＡ遺伝子は、ヒト肝ガンではＢ型肝炎ウイルスゲノ ム断片の組換え部位である。さらにサイクリンＡは、アデノウイルス−形質転換 細胞中で形質転換タンパク質Ｅ１Ａと結合する。サイクリンＡは遊離のＥ２Ｆよ りも転写活性が低い複合状態の転写因子Ｅ２ＦとＳ期中に結合するので、サイク リンＡは恐らくＥ１Ａの標的タンパク質であろう。この複合体のさらなる構成物 はp34cdc2である。遺伝子発現との関連はこのように生じる。Ｅ１Ａはこの複合 体を破壊することができ、これによりＥ２Ｆが放出される。このように形質転換 した表現型に重要な特定の遺伝子を制御することができる。 さらに、発癌タンパク質、腫瘍抑制遺伝子生成物およびサイクリン−p34cdc2 複合体間の関係がある。mos発癌タンパク質は同様にセリン／トレオニン キナー ゼである。アフリカツメガエル由来のc-mosタンパク質は静細胞因子の成分であ り、これは増殖が抑制されたアフリカツメガエルの卵中の活性化されたサイクリ ンＢ-p34cdc2の安定化に必要である。しかしmosタンパク質はインビボで複合体 をリン酸化しないと思われるので、mosタンパク質の役割は未だ明らかではない 。一方、c−mosは活性化サイクリンＢ−p34cdc2複合体を安定化し、これにより 細胞の有糸分裂活性が抑制され、そして他方ではc−mosが細胞周期を促進する。 以前の研究では、細胞周期機構の分化挙動はmosタンパク質の量により制御され るという仮定が確認されている。 srcおよびablプロテイン チロシンキナーゼのような様々な発癌タンパク質は 、有糸分裂に関連してセリン／トレオニンキナーゼp34cdc2に より同様にリン酸化される。src族では、有糸分裂的リン酸化はキナーゼ活性の 上昇を伴う。腫瘍抑制遺伝子ＲＢおよびｐ５３の生成物も、同様にサイクリン− p34cdc2と複合体を形成し、そしてこの過程でリン酸化される。ＲＢの場合には 、リン酸化はＲＢ機能を不活性化してＧ１の細胞がＳ期に入るようするために必 要であるように思われる。サイクリン−p34cdc2複合体の異常な発現の結果、そ のような腫瘍抑制遺伝子生成物がリン酸化不活性状態で保護されることになり、 これは抑制されていない細胞分裂を生じる。 細胞周期のセリン／トレオニンキナーゼ機能と形質転換との間の関係は、有糸 分裂過程のわずかな妨害が発癌に決定的な役割を果たすといことを明らかに示し ている。発癌は多段階過程と思われるので、細胞周期調節物の突然変異が、前発 癌遺伝子を活性化するか、または腫瘍抑制遺伝子を不活性化する突然変異と協同 している。 セリン トレオニンキナーゼの多くの臨床的な重要性から、新たなセリン ト レオニン キナーゼおよびそれをコードする遺伝子を利用できるようにすること が必要であった。 したがって本発明はＰＬＫと呼ばれる新規セリン トレオニン キナーゼに関し 、これは、 （ａ）配列番号２に表すアミノ酸配列を含んで成り、または （ｂ）（ａ）の配列の変異体である、 ことが特徴である。 好ましくは、本発明のＰＬＫタンパク質はヒトから得られるタンパク質であり 、すなわち配列番号１および２に表され、あるいは天然に存在するそのヒトの変 異体である。 また本発明は、配列番号１および２に表されるアミノ酸配列の一部を含んで成 る新規タンパク質に関する。本発明は好ましくは配列番号１および２に表される アミノ酸配列を含むＰＬＫタンパク質に関するが、この配列の変異体も含むこと ができる。本発明が意味する“変異体”という用語は、個々のアミノ酸または短 いアミノ酸区分の置換、欠失および／または挿入の結果、配列番号１および２に 表されるアミノ酸配列とは異なる配列を意味すると理解される。 用語”変異体”には、ＰＬＫタンパク質の天然に存在するアレリック変異体、 ならびに組換えＤＮＡ法により生成されたタンパク質（特に、化学的に合成され たオリゴヌクレオチドを使用したインビトロ突然変異誘発法による）の両方を含 み、これらはその生物学的および／または免疫学的活性に関して、配列番号１が 表すタンパク質と一致する。 本発明のタンパク質は好ましくは、配列番号１および２に表すアミノ酸配列と 比較して、少なくとも95％の相同性を有するアミノ酸レベルで識別される。 本明細書に記載し、そして本発明のタンパク質をコードする遺伝子ＰＬＫ(pol o-様キナーゼ)は、ヒト肺癌ＲＮＡ（扁平細胞腫瘍）に基づいたｃＤＮＡバンク から単離した。増殖細胞および組織中でのＰＬＫ遺伝子の発現 ノーザンブロット調査については、ＲＮＡを以下の成人ヒト組織から単離した ：肺、肝臓、心臓、脳、膵臓、腎臓、胎盤、骨格筋、食道、結腸、胃および脾臓 。胎盤および結腸でのみ（すなわち増殖細胞を高い割合で含有する組織中で）、 ＰＬＫ発現が検出された。ＰＬＫ−ｍＲＮＡの長さは約2.3kbである。次にＰＬ Ｋの発現が細胞の増殖に相関してい るという仮定を調査した：このために、周辺の正常参照組織を含むヒト腫瘍を調 査した。以下の器官で腫瘍中に強い発現が見いだされた：肺、胸部、食道、胃お よび腸、ならびに平滑筋肉腫および非ホジキンリンパ腫。48の肺腫瘍の無作為な 試料群において、ＰＬＫは試料の84％で強く発現した。残りの16％の腫瘍では、 ＰＬＫはわずかに発現するか、または全く発現しなかった。腫瘍に由来する制限 処理ＤＮＡおよび正常参照組織のサザンブロット調査では、ＰＬＫ−特異的試料 との差異は表されなかった。 表１は腫瘍の種類およびＰＬＫ発現状態による分析を示す： ヒトの組織および主要細胞に加えて、以下の細胞株をＰＬＫ発現について試験し た： ＨＥＬＡ細胞株（細胞の種類：頸部ガン）、 肺上皮細胞株（細胞の種類：肺ガン）、 Ａ４３１細胞株（細胞の種類：類表皮ガン）、 ＨＥＰ−３８細胞株（細胞の種類：肝細胞性ガン）、 Ａ４９８細胞株（細胞の種類：腎臓ガン）、 ＢＴ２０細胞株（細胞の種類：乳ガン）、 Ｔ４７Ｄ細胞株（細胞の種類：胸部管ガン）、 ＳＫＢＲ３細胞株（細胞の種類：胸部腺ガン）、 ＮＣＦ７細胞株（細胞の種類：胸部腺ガン）および ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞株（細胞の種類：臍帯静脈内皮細胞）。 ＰＬＫ転写物は調査したすべての細胞で検出できた。 ＰＬＫ遺伝子の発現は増殖活性に相関していることが判明した。したがって細 胞の分割活性の尺度として、ならびにヒト新生腫の分析用増殖マーカーとして、 ＰＬＫ遺伝子生成物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）量を使用する可能性が生まれ る。表１から明らかに、調査した腫瘍の大変高い割合でＰＬＫ発現の増大が検出 される。したがってＰＬＫは増殖マーカーとして万能に利用できる。リンパ球中でのＰＬＫのマイトジェン−誘導発現 末梢血液由来の静止リンパ球はＰＬＫ遺伝子を発現しない。ＰＨＡ（フィトヘ マグルチニン）またはＰＨＡ／ＩＬ−２（インターロイキン−２）はリンパ球を 刺激し、ＰＬＫの発現が誘導される。それゆえにＰＬＫの発現をリンパ球活性化 の尺度とすることができる。さらなる実験では、 細胞株Ａ４３１を始めに血清−含有中で、そして次に無血清で培養した。ＰＬＫ の発現は無血清では５日間で減少した。血清を加えた後、ＰＬＫの発現は再度強 く増大した。ヒトマクロファージ中でのＰＬＫ発現の減少 末梢血液由来のマクロファージは、あるとしても大変低い増殖活性を有する細 胞である。ドナーに依存して、培養１５日後のマクロファージはＰＬＫを発現し ないか、または極めて少量発現するだけであった。ＬＰＳ（リポ多糖）の添加後 、ＰＬＫの発現は24時間以内に完全に消滅した。ＰＬＫ発現と腫瘍患者の予後との関連性 さらに、特に腫瘍患者の余命のような予後とＰＬＫの発現とが関連しているこ とが判明した。このために、比較的多数の肺ガン患者の集団が調査され、そして ＰＬＫ発現の増大で患者の余命が短くなることが判明した。したがってＰＬＫは 予後についての診断腫瘍マーカーとして使用することもできる。ＰＬＫの特徴は 、調査した患者の80％より多くで発現の増大が起こるという事実から判断するこ とができ、したがってＰＬＫは高い確率で腫瘍の存在を示す大変良い腫瘍マーカ ーである。 予後のマーカーとして使用されるＰＬＫの能力は、肺癌だけでなく、乳癌等の ような他の腫瘍に応用される。 したがって本研究は細胞の、特にヒト細胞の有糸分裂活性を測定するための方 法に関し、その方法はＰＬＫタンパク質をコードする遺伝子の発現潜在能力が目 的とする細胞中で測定される（例えばノーザンブロット法による転写計画および ／または活性測定法または免疫学的方法によるタンパク質計画について）。有糸 分裂活性について特別な細胞の状態 を測定するために、ヒト組織、主要細胞および細胞株中で上記に示すＰＬＫ発現 と細胞の有糸分裂活性との相関について、ＰＬＫ遺伝子の発現能力は適切な変数 を表すことが可能である。体外で行うことができるこの方法は、例えば腫瘍診断 または免疫診断のような分野で大いに利用できる。 配列番号１および２に表すアミノ酸配列は、全ＰＬＫタンパク質を表す。この タンパク質は603アミノ酸を有する。ＰＬＫ遺伝子またはその変異体をベクター 中に日常的にクローニングして、このベクターを発現のために適当な宿主細胞に 入れ、本発明のタンパク質を生成させることができる。好適な宿主細胞は大腸菌 または酵母のような微生物であるが、高等細胞（例えば哺乳類または昆虫細胞） もある。好適な発現ベクターは、例えば原核細胞にはプラスミド、バクテリオフ ァージ ラムダ、高等細胞（例えばＳＶ４０、ワクシニア、バキュロウイルス） には酵母ベクターまたはウイルスベクターである。ＰＬＫ遺伝子の発現に関して は、特にSambrookら(モレキュラークローニング。ア ラボラトリーマニュアル： Molecular Cloning.A Laboratory Manual(1989)、コールドスプリングハーバー ラボラトリー出版:Cold Spring Harbor Laboratory Press.)に述べられた方法を 、参照にすべきである。さらに関連キナーゼタンパク質の発現は、Crews,C.M.ら 、(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,8845-8849;Ben-David,Y.ら、(1991)EMBO J.10(2),317-325;Parker,L.L.ら、(1991)EMBO J.10(5),1255-1263;Parker,L.L. ら、(1992)Science 257,1955-1957;Colemann,T.R.ら、(1993)Cell,72,919-929の 研究に記載されており、これらの開示は、この目的のために参照される。 ＰＬＫ配列とＥＭＢＬデータバンクとの比較により、セリン／トレオ ニンキナーゼ族に高い相同性が生じる。本発明のタンパク質は、polo遺伝子との 相同性からＰＬＫ(polo-様キナーゼ)と呼ばれ、キイロショウジョウバエから単 離された。 以下のプロテインキナーゼ−特異的配列の特徴が存在する： １．ＡＴＰ結合パターン： GlyLysGlyGlyPheAla....（16アミノ酸）.....Lys(アミノ酸60-86) ２．プロテインキナーゼの触媒部位にある２つのアミノ酸パターンは、アミノ酸 配列および互いのパターンの距離に関して、すべてのプロテインキナーゼに高度 に保存されている： HisArgAspLeu (AA 174-177) AspPheGly (AA 194-196) さらに本発明は、本発明によるＰＬＫタンパク質またはその一部をコードする 核酸に関する。この核酸は、例えばゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであることができ る。しかし好ましくは、この場合は組換えＤＮＡ分子である。 さらに本発明は本発明の核酸に関し、その核酸は （ａ）配列番号１に表されるコーディング配列を含み、 （ｂ）遺伝子コードの縮重に関連して、（ａ）に由来する配列に対応する核酸配 列、または （ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）および／また は（ｂ）に由来する配列との配列ハイブリダイザーである。 本発明の意味においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下とは 、55℃で、好ましくは62℃で、そして特に好ましくは68℃で水性の低−塩緩衝液 中(例えば0.2×SSC、0.1％SDS)(Sambrook J.ら(1989) モレキュラークローニング．ア ラボラトリーマニュアルも参照にされたい)で洗 浄した後でも、ハイブリダイゼーションが起こることを意味すると考える。 また本発明は、配列番号１に表される配列の少なくとも20ヌクレオチド長の区 分を含む核酸に関する。好ましくはこの区分はＰＬＫ遺伝子に特異的なヌクレオ チド配列を有する。これらの核酸は、特に治療に使用できるアンチセンス核酸の 生成に適する。 さらに本発明は、本発明の核酸またはその一部の少なくとも１つのコピーを含 むベクターに関する。このベクターは真核細胞および原核細胞中で複製すること ができる。このベクターは宿主細胞のゲノムに組込まれるこができるベクター（ 例えばバクテリオファージ ラムダ）、あるいは染色体外に存在するベクター（ 例えばプラスミド）であることができる。本発明のベクターは基本ベクター中に ＰＬＫ遺伝子をサブクローニングすることにより得ることができる。この種類の 基本ベクター、特にタンパク質発現に必要な要素を含んでいるベクターは当業者 には周知である。 さらに本発明は、本発明の核酸または本発明のベクターを使用して形質転換さ せた細胞に関する。細胞は真核細胞または原核細胞のいずれかであることができ る。細胞の形質転換法は一般的な従来技術なので、説明する必要はない。 同様に本発明は腫瘍の診断において、ＰＬＫタンパク質またはそれをコードす る遺伝子、あるいはそのタンパク質に対する抗体の使用に関する。実験では、腫 瘍中で、および対応する腫瘍が無い参照組織中で、ＰＬＫ遺伝子の発現は異なる ことが示された。したがって細胞の有糸分裂 活性の結果を、遺伝子発現またはタンパク質レベルから引き出すことができる。 さらに本発明は、ＰＬＫタンパク質、それに対する抗体または本発明の核酸（ 例えば、遺伝子発現の抑制用のアンチセンス核酸として）に基づく診断用または 治療用組成物に関する。この種類の組成物は、場合によっては既知の医薬希釈剤 、増量剤、賦形剤および助剤を含むことができる。 細胞増殖の抑制は、アンチセンス構築物により、および優性−陰性突然変異体 により、実験的にＰＬＫ発現を阻害することにより表せることが示された。した がって本発明の特に好適な観点は、本発明の核酸の遺伝子治療的投与であり、こ れは例えば細胞中にアンチセンス核酸を生成するために、患者に核酸を繰り返し 投与する（例えば、ゲノム中に組み込むのに適当なベクターで）。あるいは、ア ンチセンス核酸を細胞に直接導入することもできる（例えば、マイクロインジェ クションにより）。 さらに本発明は、リンパ球の活性測定法に関し、その方法では本発明のタンパ ク質、本発明の核酸またはこのタンパク質に対する抗体が使用される。例えばこ の方法は採血試料について体外的に行うことができる。この方法は、特に免疫系 の不全、特に自己免疫不全またはＡＩＤＳを含む免疫不全症候群の検出に適する 。 最後に、本発明はＰＬＫタンパク質またはこのタンパク質の断片を、抗体生産 のための免疫原として使用することをさらに含んで成る。ＰＬＫタンパク質に対 する抗体の生産は、実験動物を完全なＰＬＫタンパク質またはその断片で免疫し 、続いて生成した（ポリクローナル）抗体を回収することにより、常法で行う。 KohlerおよびMilsteinの方法および その後の開発に従い、モノクローナル抗体を細胞融合による常法で実験動物のＰ ＬＫ抗体−生産細胞から得ることができる。ヒトモノクローナル抗体も得ること ができる。 配列番号７は2503bp長の核酸を表し、この核酸はＰＬＫ遺伝子の開始コドンの 5’-側に直接付く領域を含む。クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡ Ｔ）アッセイにより、示した配列がＰＬＫ遺伝子のプロモーターを含んでいるこ とを検出できた。配列番号７の転写開始点は2460ヌクレオチドである。プロモー ターの正の調節要素は、ヌクレオチド184と676の間、および1163と2503との間に 見いだされる。負の調節要素はヌクレオチド676と1163との間に見いだされる。 これらの調節要素は、欠失クローンを使用してＣＡＴアッセイの補助により同定 することができた。配列比較により、さらにＣＣＡＡＴボックスがヌクレオチド 2407と2411との間に位置し、そして２つのＳＰ１結合部位がヌクレオチド2375と 2384との間に位置していることがさらに判明した。 ＰＬＫプロモーターは、増殖している細胞中でのみ活性であるという性質をも っている。したがって、細胞に毒性である遺伝子（例えば、ジフテリアトキシン の遺伝子またはコレラトキシンの遺伝子）と組み合わせて、腫瘍の遺伝子治療処 置に使用することができる。アンチセンス方向でＰＬＫ遺伝子と組み合わせたＰ ＬＫプロモーターは、さらなる治療的使用の可能性を与える。このように、分裂 細胞の増殖の選択的抑制を達成することができる。 したがって本発明はまた、配列番号７に表される配列、またはその区分、好ま しくは同一の生物学的活性を有する区分を含む核酸に関する。この核酸は、例え ば毒性遺伝子と、またはアンチセンス方向でＰＬＫ遺 伝子と、または好ましくは20ヌクレオチドより長いその区分と、操作しうる連結 状態であることができる。これらの核酸は、例えば特に遺伝子治療に使用できる 。 本発明はさらに、以下の実施例と共に配列表および配列番号１から配列番号７ の図および図１により説明されるが、これらは本発明の範囲を制限するものでは ない。 配列番号１は2124bp長の核酸配列を表し、これはＰＬＫ遺伝子をコードする情 報を含み、 配列番号２はＰＬＫタンパク質の603 AA長のアミノ酸配列を表し、 配列番号３はオリゴヌクレオチドプライマーP6 DEAの核酸配列を表し、 配列番号４はオリゴヌクレオチドプライマーEco HRDLの核酸配列を表し、 配列番号５はオリゴヌクレオチドプライマーP12T⁺の核酸配列を表し、 配列番号６はオリゴヌクレオチドプライマーRAF2の核酸配列を表し、そして 配列番号７はＰＬＫプロモーターの2503bp長の核酸配列を表し、そして 図１はＰＬＫ発現の関数として、肺癌患者の術後生存率を表す。実施例１ ＰＬＫ遺伝子の部分配列の単離 １．１ Chirgwinら(Biochemistry 18(1979),5294)の方法に従い、ＲＮＡをヒト 肺癌組織から単離した。このＲＮＡを使用して、オリゴ(dT)-媒介ｃＤＮＡ合成 を行った。反応条件は次の通りである： 50mmol/lのtris/HCl、pH8.3(22℃) 75mmol/lのKCl 10mmol/lのジチオスレイトール(DTT) 3mmol/lのMgCl₂ 500μmol/lのdNTP溶液 0.2μmol/lのオリゴヌクレオチドプライマー P12T+(配列番号５に表す核酸配 列を有する) 3.0μgの全ＲＮＡ 100μg/mlのウシ血清アルブミン 10単位の逆転写酵素(モロニー ネズミ白血病ウイルス由来) 上記の反応混合物を37℃で１時間、20μlの反応容量でインキューベーション した。 １．２ １．１からのｃＤＮＡを、２つのプライマー、Eco HRDLおよびP6 DEA( ２つの高度に保存されたＰＬＫ遺伝子領域に相補的である)を使用して増幅した 。プライマーP6 DEAの核酸配列は、配列番号３に表されている。Eco HRDL配列は 配列番号４に表されている(この配列は配列番号１の588から601のヌクレオチド に相同的である)。 反応条件： 8.3mmol/lのtris/HCl、pH8.8(22℃) 41.7mmol/lのKCl 1.25mmol/lのMgCl₂ 0.01％のゼラチン 166.7μmol/lのdNTP溶液 0.6μmol/lのプライマー P6 DEAおよびEco HRDL 5単位のTaqポリメラーゼ 10μlのcDNA合成混合物 反応容量は60μlであった。ＰＣＲサイクルの条件は次の通りであった： 95℃で１分間変性、 40℃で２分間ハイブリダイゼーション、 72℃で３分間伸長。 全40サイクルを行った。 精製の目的で、生成した増幅物を2％アガロースゲルで電気泳動的に分離し、 そして約190bpから220bp長の範囲のＤＮＡを電気的に溶出し、再度上記の条件下 で30サイクル増幅させた。ＰＣＲの生成物をこのようにして得、そして精製し、 次に制限エンドヌクレアーゼEcoRIを使用して消化し、そして同様にEcoRIで開裂 したBluescript-KSベクター(ストラタジーン:Stratagene)中にクローン化した。 この方法で199bp長のＤＮＡ断片を単離し、そして配列決定した(Sambrook J. ら、モレキュラークローニング。ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリ ングハーバーラボラトリー 1989)。このＤＮＡ断片の核酸配列は、配列番号１に 表す配列のヌクレオチド588から787に対応する。実施例２ ＰＬＫ-ｃＤＮＡの単離 ヒト肺腫瘍組織のポリＡ＋ＲＮＡに由来するｃＤＮＡバンクを、1.8×10⁶組換 えクローンを使用して確立した。ｍＲＮＡの単離はAvivおよびLeder(Proc.Natl. Acad.Sci.USA 69(1972),1408)に従い行った。このｃＤＮＡクローニングはGuble rおよびHoffman(Gene 25(1983),263)に従い行った。この遺伝子バンクをＤＮＡ プローブにより調べた。このＤＮＡプロ ーブはＰＣＲにより調製した。オリゴヌクレオチドRAF2をＰＣＲのプライマーと して使用した。RAF2の核酸配列を配列番号６に表す(この配列は配列番号１に表 す配列のヌクレオチド746から767に対応する)。 反応条件： 20ngのＰＬＫ挿入物(実施例１から) 10mmol/lのtris/HCl、pH8.8(22℃) 50mmol/lのKCl 1.5mmol/lのMgCl₂ 0.01％のゼラチン 0.8μmol/lのα³²P-dCTP(6000Ci/mmol) 0.8μmol/lのdATP/dGTP/dTTP 0.2μmol/lのプライマー RAF2 2.5単位のTaqポリメラーゼ 反応容量は25μlであった。反応は上記のＰＣＲ条件下で20サイクル行った（ 実施例１）。 陽性クローンを検出するために、遺伝子バンクからのｃＤＮＡをフィルターに 固定化し、そして放射性標識ＤＮＡプローブ（1×10⁶dpm/ml溶液、5x10⁹dpm/μg ＤＮＡの特異的プローブ活性）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーショ ン温度は42℃であった。 ハイブリダイゼーション溶液： 5×ＳＳＣ 0.02mol/l tris/HCl、pH7.6(22℃) 1×デンハーツ溶液 10％の硫酸デキストラン 0.1％のＳＤＳ 100μg/mlのニシン精子ＤＮＡ 50％のホルムアミド 使用した洗浄溶液は２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳで、洗浄温度は42℃であった。 陽性クローンを見つけ、そして特性を決定した。それは配列番号１に表す配列を 含んでいた。実施例３ ＰＬＫ発現の抑制 1×10⁴のA431細胞を播種し、そして2−3日間、95％の集密度に成長させた。カ ルチャーを次に24時間、0.5％のウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地中で維持した 。細胞あたり2μg/μlのTKF アンチセンスＲＮＡを含む1−2×10^-12mlの液体を マイクロインジェクションにより注入した。TKFアンチセンスＲＮＡは、Ｔ３ま たはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、配列番号１に表す配列を逆方向に転 写することにより調製した。 細胞をさらに、0.5％または10％のウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地中で維持 した。18時間後、細胞に³H-チミジン(0.5μCi/ml;アマシャム:Amersham)を用い て3-4時間パルスをかけた。リン酸塩緩衝液(PBS)で洗浄した後、3.5％のホルム アルデヒド-PBS中で固定を行い、次にフィルム乳化剤(NTP-2、コダック：Kodak) を上層し、現像するために48時間インキューベーションした。ギムザに従い細胞 を染色し、計数し、そして写真を取った。ＰＬＫ発現および細胞の成長をアンチ センスＲＮＡを添加することにより抑制できることが示された。実施例４ 診断用の腫瘍マーカーとしてのＰＬＫ 手術を受けた肺腫瘍患者において、ＰＬＫ発現と患者の余命との間に明らかな 相関があることが判明した。ＰＬＫを高度に発現している患者は、ＰＬＫの発現 が低い患者と比較して、有意に早く死亡することが判明した。 この実験結果を以下の表２に示す。ＰＬＫ発現の分析については、各々の患者 の腫瘍組織に由来するｍＲＮＡがノーザンブロットにより調査された。表２に示 す値は、アクチンｍＲＮＡの発現に関して標準化されたものである。術後の患者 の余命は、月で示す。記号”★”は、示した時に患者が未だ生存していたことを 意味する。 図１は患者のデータに関連した統計的Kaplan-Meier評価を表す(E.L.Kaplanお よびP.Meier、J.Am.Stat.Assoc.53(1958)、457-481)。曲線１は１より大きい（＞ １：アクチンについて標準化した）絶対的なＰＬＫ発現を持つ23名の肺癌患者の 術後の生存率を表す。曲線２は１より小さい（＜１）絶対的なＰＬＫ発現を持つ 28名の肺癌患者の生存率を表す。図１から高いＰＬＫ発現を有する患者は、低い ＰＬＫ発現を有する患者に比べて有意に早く死亡することが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/09 0276−2Ｊ 33/574 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 8517−4Ｈ 16/32 33/574 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ０７Ｋ 16/18 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ 16/32 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ホルトリヒ，ウベ ドイツ連邦共和国デー―65779ケルクハイ ム・パルクシユトラーセ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号２に表されるアミノ酸配列、または （ｂ）（ａ）の配列の変異体、 を含んで成ることを特徴とするＰＬＫタンパク質。 ２．ヒトから得られることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のタンパク質 。 ３．請求の範囲第１または２項に記載されたＰＬＫタンパク質をコードすること を特徴とする核酸。 ４．組換えＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求の範囲第３項に記載の核酸 。 ５．（ａ）配列番号１に表されるタンパク質−コーディング配列、 （ｂ）遺伝子コードの縮重に関して（ａ）に由来する配列に対応する核酸配列、 または （ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）および／また は（ｂ）に由来する配列とハイブリダイズする配列、 を含むことを特徴とする、請求の範囲第３または４項に記載の核酸。 ６．配列番号１に表される配列の少なくとも２０ヌクレオチド長の区分を含むこ とを特徴とする核酸。 ７．請求の範囲第３ないし第６項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸 のコピー、またはその一部を含むことを特徴とするベクター。 ８．請求の範囲第３ないし第６項のいずれか１項に記載の核酸、または請求の範 囲第７項に記載のベクターを使用して形質転換させられたことを特徴とする細胞 。 ９．抗体生産のための免疫原としての、請求の範囲第１または第２項に 記載のタンパク質またはこのタンパク質の断片の使用。 １０．腫瘍診断および／または腫瘍治療のための、請求の範囲第１または２項に 記載のタンパク質、請求の範囲第３ないし第６項のいずれか１項に記載の核酸、 あるいはそのようなタンパク質に対する抗体の使用。 １１．腫瘍診断および／または腫瘍治療用の医薬品組成物を製造するための、請 求の範囲第１または２項に記載のタンパク質、請求の範囲第３ないし第６項のい ずれか１項に記載の核酸、あるいはそのようなタンパク質に対する抗体の使用。 １２．リンパ球活性を測定するための、請求の範囲第１または２項に記載のタン パク質、あるいは請求の範囲第３ないし第６項のいずれか１項に記載の核酸、あ るいはそのようなタンパク質に対する抗体の使用。 １３．免疫系、特に自己免疫不全症または免疫不全症候群において、リンパ球活 性の測定のための請求の範囲第１２項に記載の使用。 １４．遺伝子治療用の組成物を生産するための、請求の範囲第３ないし６項のい ずれか１項に記載の核酸の使用。 １５．有効成分として、請求の範囲第１または２項に記載のタンパク質、または そのようなタンパク質に対する抗体、あるいは請求の範囲第３ないし６項のいず れか１項に記載の核酸を含んで成ることを特徴とする、診断用組成物。 １６．有効成分として、請求の範囲第１または２項に記載のタンパク質、または そのようなタンパク質に対する抗体、あるいは請求の範囲第３ないし６項のいず れか１項に記載の核酸を、場合によっては医薬的に許容できる通常の助剤、賦形 剤、増量剤および希釈剤と一緒に含んで成ることを特徴とする、医薬品。 １７．目的の細胞中で請求の範囲第１または第２項に記載のタンパク質をコード する遺伝子の発現強度を測定することを特徴とする、細胞の、特にヒト細胞の有 糸分裂活性の測定法。 １８．発現強度が転写および／またはタンパク質計画について測定されることを 特徴とする、請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９．配列番号７に表される配列、またはその機能的区分を含むことを特徴とす る核酸。 ２０．毒性遺伝子と操作可能な連結状態にあることを特徴とする、請求の範囲第 １９項に記載の核酸。 ２１．アンチセンス方向でＰＬＫ遺伝子と、またはその区分と操作可能な連結状 態にあることを特徴とする、請求の範囲第１９項記載の核酸。 ２２．遺伝子治療用の組成物生産のための、請求の範囲第１９ないし２１項のい ずれか１項に記載の核酸の使用。