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JPH09510875A - Culture and isolation of fetal cells from maternal peripheral blood - Google Patents

Culture and isolation of fetal cells from maternal peripheral blood

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JPH09510875A
JPH09510875A JP7525275A JP52527595A JPH09510875A JP H09510875 A JPH09510875 A JP H09510875A JP 7525275 A JP7525275 A JP 7525275A JP 52527595 A JP52527595 A JP 52527595A JP H09510875 A JPH09510875 A JP H09510875A
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JP
Japan
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cells
fetal
peripheral blood
erythroid
cell
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Pending
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JP7525275A
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Japanese (ja)
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パベルカ，カレン
マール，アンナ
クリンガー，キャサリン・ダブリュー
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Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 妊婦から得た末梢血試料からの胎児細胞、例えば、胎児赤血球系細胞を培養し、単離する方法を開示する。末梢血試料からの細胞を、細胞増殖因子、例えば、赤血球系細胞増殖因子、例えばエリスロポエチンを含有する培地中で培養して胎児細胞を培養する。培養の前に、末梢血試料から無核細胞を除去することができ、さらに／あるいは胎児細胞を豊富化させることができる。中期スプレッドを培養胎児細胞から調製することができる。胎児細胞マーカーまたは対象核酸配列を培養胎児細胞において検出することができる。培養胎児細胞を用いて胎児の性別を決定し、胎児における疾病を引き起こす変異および染色体異常を検出することができる。   (57) [Summary] Disclosed is a method of culturing and isolating fetal cells, eg, fetal erythroid cells, from a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman. Fetal cells are cultured by culturing cells from a peripheral blood sample in a medium containing a cell growth factor such as an erythroid cell growth factor such as erythropoietin. Prior to culturing, anucleated cells can be removed from peripheral blood samples and / or fetal cells can be enriched. Metaphase spreads can be prepared from cultured fetal cells. The fetal cell marker or nucleic acid sequence of interest can be detected in cultured fetal cells. Cultured fetal cells can be used to determine the sex of the fetus and to detect disease-causing mutations and chromosomal abnormalities in the fetus.

Description

【発明の詳細な説明】 母親の末梢血からの胎児細胞の培養および単離発明の背景 すべての造血細胞は多能性幹細胞由来であり、それは適当な条件下で造血系統 のうちの１つから数種の可能性のある系統へと分化する。これらの系統の１つで ある赤血球系細胞の系統は赤血球の産生へとつながる。無核赤血球または赤血球 への成熟の進行は多能性幹細胞の赤血球系細胞系統になる性質から生じ、多能性 幹細胞は赤血球系前駆細胞となり、発達中の細胞により受け取られるシグナルに 応答して赤血球系前駆細胞のさらなる分化により成熟細胞となる。初期の赤血球 系前駆細胞はブラスト・フォーミング・ユニット−エリスロイド（blast formin g unit-erythroid）（以後、ＢＦＵ−Ｅという）であり、それは発達してより成 熟した赤血球系前駆細胞であるコロニー・フォーミング・ユニット−エリスロイ ド（colony forming unit-erythroid）（以後、ＣＦＵ−Ｅという）になる。特 別な増殖因子であるエリスロポエチンにより剌激された場合、ＣＦＵ−Ｅは増殖 し、成熟した無核赤血球の前駆体である有核赤血球（以後、ｎＲＢＣｓという） へと分化する。成人において、赤血球系細胞前駆体細胞は主に骨髄中に存在し、 成人においてはそこで造血が起こり、赤血球系細胞前駆体細胞は末梢血中に循環 しない。赤血球系細胞の分化に関するレビューについては、ベック,ダブリュ・ エス（Beck,W.S.）、「ヘマトロジー（Hematology）第４版」マサチューセッツ 州ケンブリッジ：ＭＩＴ・プレス（MIT Press）（第５版、１９９１年）ぼスタ マトイアノプーロス,ジー（Stamatoyannopoulos,G.）、「ザ・モレキュラー・ベ イシス・オブ・ブラッド・ディジージズ（The Molecular Basis of Blood Disea ses）、ペンシルベニア州フィラデルフィア：ダブリュ・ビー・サウンダース（W .B.Saunders）（第２版、１９９４年）、６６〜１０５頁参照。 蛋白であるエリスロポエチンは、赤血球系細胞の発達に必要な増殖因子であっ て、主として腎臓により生産されるものである。もともとエリスロポエチンは貧 血患者の尿から単離精製された（ミヤケ,ティー（Miyake,T.）ら、ジャーナル・ オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２５２巻、５５５８〜 ５５６４頁（１９７７年））。より最近になって、エリスロポエチンは分子的に クローン化され、特徴づけられた（ジャコブス,ケイ（Jacobs,K.）ら、ネイチャ ー（Nature）第３１３巻、８０６〜８０９頁（１９８５年）；リン,ピー(Lin,P. )ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ ズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８２巻、７５８０〜７５８４頁 （１９８５年））。インビトロ培養中の赤血球系前駆細胞の増殖を支持するため にエリスロポエチンが用いられてきた。例えば、骨髄由来のヒト・成人赤血球系 前駆細胞およびへその尾の血液由来または胎児肝臓外移植物由来の胎児赤血球系 前駆細胞が、エリスロポエチン含有培地中で細胞を培養することによりインビト ロで増殖させられている（サザーランド,エイチ・ジェイ（Sutherland,H.J.）ら 、ブラッド（Blood）第７４巻、１５６３〜１５７頁（１９８９年）；ボジャー, エム・ピー（Bodger,M.P.）、エクスペ・ヘマトロ（Exp.Hematol.）第１５巻、 ８６９〜８７６頁（１９８７年）；ペシュレ,エイ・アール（Peschle,A.R.）ら 、ブラッド第５８巻、５６５〜５７２頁（１９８１年））。 妊娠中、胎児起源の細胞は母親の末梢循環系に現れる。レビューのために、ビ アンキ,ディー・ダブリュ（Bianchi,D.W.）およびクリンガー,ケイ・ダブリュ(K linger,K.W.)、ジェネティック・ディスオーダーズ・アンド・ザ・フェタス：プ リベンション・アンド・トリートメント（Genetic Disorders and the Fetus:Pr evention and Treatment）第３版、ボルチモア／ロンドン：ザ・ジョン・ホプキ ンス・ユニバーシティー・プレス（The John Hopkins University Press）（１ ９２２年）参照。これらの細胞は、発達中の胎児の性および遺伝的性質に関する 可能性のある情報源である。母親の末梢血試料中のこれらの胎児細胞の検出、単 離および取り扱いは、出産前の診断および性の同定のための非侵入的手段を提供 する。しかしながら、かかるアプローチの実行可能性は多くの要因により妨げら れている。最も重要なことには、胎児細胞は母親の血液中に非常に限られた数し か存在せず、胎児細胞および母親の細胞の混合物中で豊富化することが必要で あり、あるいは何らかの方法で胎児細胞を母親の細胞から分離する必要がある。 胎児細胞の豊富化または分離を行うために用いられている１のアプローチは、特 定の胎児細胞タイプに特異的な抗体を用いるものである。例えば、胎児特異的抗 体を用いて、母親の成分からの胎児細胞のフローサイトメトリーによる分離を容 易にすることができる（ハーゼンバーグ,エル・エイ（Herzenberg,L.A.）ら、プ ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー エスエイ第７６巻、１４５３〜１４５５頁（１９７９年）；イバーソン,ジー・ エム（Iverson,G.M.）ら、プレナタル・ダイアグノシス（Prenatal Diagnosis） 第１巻、６１〜７３頁（１９８１年）；ビアンキ,ディー・ダブリュ（Bianchi,D .W.）ら、プレナタル・ダイアグノシス第１１巻、５２３〜５２８頁(１９９１年) ）。しかしながら、このアプローチは非常に特殊な試薬を必要とし、費用と労力 がかかる可能性がある。診断目的に母親の末梢血由来の胎児細胞を用いることに おけるもう１つの制限は、中期の細胞は分析に好ましいのであるが、母親の末梢 循環系におけるすべての胎児細胞が分裂しているとは限らないということである 。発明の概要 本発明は、胎児細胞の培養ならびに単離のための、および単離胎児細胞中の対 象核酸配列の検出のための非侵入的方法を提供する。本発明は、少なくとも一部 には、胎児細胞、例えば、胎児前駆細胞が妊婦の末梢血中に存在し、細胞増殖因 子の存在下で該細胞を培養することにより選択的にインビトロで増殖させること ができるという知見に基づく。 １の具体例において、本発明は、胎児赤血球系細胞細胞の培養ならびに単離の ための、および単離胎児赤血球系細胞細胞中の対象核酸配列を検出するための非 侵入的方法を提供する。本発明は、少なくとも一部には、胎児前駆細胞が妊婦の 末梢血中に存在し、細胞増殖因子、例えば、エリスロポエチンの存在下で該細胞 を培養することにより選択的にインビトロで増殖させることができるという知見 に基づく。本発明方法は、診断的に用いるに十分な数の胎児細胞を得るための非 侵入的方法であって、モノクローナル抗体のごとき特殊な試薬またはフローサイ トメーターのごとき高価な装置を必要としない方法を提供する。赤血球系細胞増 殖因子、例えば、エリスロポエチンの存在下での胎児赤血球系前駆細胞の培養は 、細胞を増殖分化させて赤血球系細胞にする。次いで、胎児赤血球系細胞を単離 し、さらなる分析に使用することができる。本発明は、末梢血試料中で母親の細 胞よりも胎児細胞を豊富化させ、もとの試料中にあった総数よりも存在する胎児 細胞の総数を膨大化させ、有糸分裂的に活性のある細胞を単離することを可能に する方法を提供する。このアプローチは、さらなる分析のために胎児細胞を得る 単純で非侵入的な手段を提供するので、母親の末梢血由来の胎児赤血球系前駆細 胞を培養することができることは大きな価値を有する。このアプローチの利点は 、分析のために多数の胎児細胞を単離することが可能であり、他の方法よりも単 純かつ経済的に母親の血液から分離されうるということである。なぜなら、これ らの細胞は増殖しており、診断試験に用いる中期の胎児細胞の単離を可能にする からである。 したがって、本発明は、分析および診断のために胎児細胞を得る手段としての 、母親の末梢血試料からの胎児赤血球系細胞細胞の培養ならびに単離に関する。 本発明方法は、母親の末梢血試料を得て、赤血球系前駆細胞を増殖させて赤血球 系細胞に分化させる赤血球系細胞増殖因子、例えば、エリスロポエチンを含有す る培地中で細胞を培養し、次いで、胎児赤血球系細胞を単離することを包含する 。この方法は、少なくとも一部には：１）母親の末梢循環系における胎児赤血球 系前駆細胞の存在；２）母親の末梢循環系において母親の赤血球系前駆細胞がめ ったに存在しないこと；および３）母親の赤血球系前駆細胞よりも胎児赤血球系 前駆細胞のほうがエリスロポエチンに対して高い感受性があることに基づく。 培養の前に、末梢血試料を処理してある種の細胞タイプを除去し、そして／ま たはより少ない細胞数を培養工程に用いることができるようにある種の細胞タイ プを豊富化することができる。例えば、培養前に、選択的溶解または密度勾配遠 心分離により無核赤血球を試料から除去することができる。例えば、異なる密度 勾配を用いる二重密度勾配遠心分離を行い、次いで、培養前に赤血球系前駆細胞 を含む細胞層を単離することにより、赤血球系前駆細胞を試料中で豊富化するこ とができる。 培養後、例えば、細胞を取り扱うためにピペットを用いることにより、培地か ら１個またはそれ以上の別々の細胞コロニーをピックアップすることにより赤血 球系細胞を単離することができる。次いで、コロニーの細胞を新鮮培地に移し、 さらなる分析のために顕微鏡スライド上に置くか、ＤＮＡ源として用いるか、あ るいは何らかの適当な方法でさらに分析を行うことができる。 本発明のもう１つの態様は、赤血球系細胞増殖因子、例えば、エリスロポエチ ン中で母親の末梢血試料の細胞を培養した後の胎児赤血球系細胞細胞の同定方法 に関する。この方法は、胎児起源であると細胞を同定するする手段としての赤血球 系細胞上の胎児細胞マーカーを検出することを包含する。本発明のさらなる態様 は、培養後の胎児赤血球系細胞の胎児核酸中の対象核酸配列の検出を包含する。培 養した赤血球系細胞由来のＤＮＡにおけるＹ染色体ＤＮＡ、疾病を引き起こす変 異に関連した遺伝子、または染色体異常の検出はすべて本発明の範囲内である。 また、本発明は、母親の血液試料から中期の胎児細胞を単離する方法に関する 。この方法において、エリスロポエチン中での細胞培養後、細胞周期による細胞 分裂の進行を抑制する薬剤、または細胞増殖を同調させる薬剤に細胞を曝露する 。中期の細胞は顕微鏡で検出され、単離されうる。次いで、中期の細胞をさらな る分析および診断試験のために用いることができる。 さらに本発明は、妊婦から得た末梢血試料由来の胎児赤血球系前駆細胞を培養 することにより、経産妊婦において現在の妊娠に由来する胎児細胞を優先的に単 離する方法を提供する。この方法は、赤血球系前駆細胞の短いライフスパン（約 ３カ月）に基づくものであり、培養後単離されたいずれの胎児赤血球系細胞も、 いずれかの以前の胎児由来というよろはむしろ現在の胎児由来のはずである。図面の簡単な説明 図１は、密度勾配に沿った赤血球系前駆細胞および有核赤血球の相対的分布を 示すスキーム的ダイヤグラムである。 図２は、エリスロポエチン含有メチルセルロース培地において増殖中のＣＦＵ −Ｅコロニーの写真である。 図３は、エリスロポエチン含有メチルセルロース培地において増殖中の初期Ｂ ＦＵ−Ｅコロニーの写真である。発明の詳細な説明 本発明は、母親の末梢血試料由来の胎児細胞の培養方法に関する。該方法は、 妊婦から末梢血試料を得て、次いで、増殖因子含有培地にて試料中の細胞を培養 することを包含する。胎児細胞を培地から単離し、対象核酸配列を胎児ＤＮＡに おいて検出する。 １の具体例において、本発明は、母親の末梢血試料由来の胎児赤血球系細胞細 胞の培養方法に関する。該方法は、胎児赤血球系前駆細胞を増殖させて胎児赤血 球系細胞に分化させる赤血球系細胞増殖因子、例えば、エリスロポエチンを含有 する培地中でインビトロで血液試料に存在する胎児赤血球系前駆細胞を培養する ことを包含する。培養後、胎児赤血球系細胞細胞を単離することができる。１の 具体例において、本発明方法は、妊婦から末梢血試料を得て、赤血球系細胞増殖 因子、例えば、エリスロポエチンを含有する培地にて末梢血試料中の細胞を培養 し、次いで、胎児赤血球系細胞を培地から単離することからなる。 用語「妊婦由来の末梢血試料」は、母親の血液試料をも意味し、胎児のいる妊 婦由来の末梢血ソース（例えば、腕の静脈からのもの）から得た（例えば、注射 器で）血液試料を包含する。本発明方法において使用する前に、ヘパリンのごと き血液凝固を抑制する剤で末梢血試料を処理することができる。好ましくは、末 梢血試料は約５〜２０ｍｌの血液を含有する。より好ましくは、試料は約１０ｍ ｌの血液を含有する。妊娠６週程度で試料を得てもよく、あるいは２回目の３カ 月の中期あたりで得てもよいが、好ましくは、妊娠約８週ないし１６週の間に得 る。最も好ましくは、試料を妊娠約１２週で得る。妊娠１２週において、胎児血 液中１ミリリットルの循環血液あたり約５００００個のｎＲＢＣｓが存在するが 、妊娠２０週までには胎児血液１ミリリットルあたりわずか約１０００個しか存 在しなくなることが知られている（ホルツグレーブ,ダブリュ（Holzgreve,W.） ら、 ザ・ジャーナル・オブ・リプロダクティブ・メディシン（The Journal of Repro ductive Medicine）第３７巻、４１０〜４１８頁（１９９２年））。 用語「培地」で「細胞を培養」とは、一般的には、細胞の生存に適する培地に 細胞を接触させ、一定時間細胞の生存に適する条件下で培地中の細胞をインキュ ベーションして細胞を増殖およびおそらくは分化させることをいう。用語「培地 」は、胎児細胞、例えば、赤血球系前駆細胞の生存および増殖を可能にする液体 もしくは半固体溶液または材料を包含する。一般的には、適当な培地は、炭水化 物のごとき栄養源（例えば、糖）、血清（例えば、ウシ・胎児血清）中に見いだ されるような一般的な増殖因子、および補足されるＬ−グルタミンのごときアミ ノ酸を含有する。培地は、ペニシリンおよびストレプトマイシンのごとき抗生物 質、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール）、付加的な蛋白（例えば、ウ シ・血清アルブミン）、緩衝化剤（例えば、重炭酸ナトリウム）および／または ｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッド）を含有してもよい。一般的には、培養 中の哺乳動物細胞の生存に適した条件は、３７℃、４％〜５％ＣＯ2である。培 養時間の長さは、所望細胞数（すなわち、所望細胞数を得るに必要な増殖の程度 ）および／または所望の細胞分化により変更されるが、一般的には少なくとも約 ４８時間である。好ましくは、細胞を約４日間培養する。より好ましくは、細胞 を約６日間培養する。 好ましい具体例において、さらに培地は半固体マトリックス材料を包含する。 用語「半固体マトリックス材料」は、液体培地に添加された場合、液体培地をゼ ラチン性の半固体状態に変化させる物質を包含する。半固体培地は、やはり細胞 が増殖するが（すなわち、細胞増殖を阻害しない程度には固くない）、培地中の 単離細胞が増殖位置から移動できない培地である。半固体マトリックス材料は増 殖中の細胞を該マトリックス材料に付着させ、そのことにより、培地中での細胞 の移動を防止する。半固体培地中の単一細胞の増殖は、もとの単一細胞からの分 裂により生じる個別の細胞コロニーを生じる。半固体培地の光学顕微鏡試験によ り１の細胞コロニーを他の細胞コロニーから識別することができる。適当な半固 体マトリックスは、メチルセルロース、寒天ゲルおよび血漿クロットを包含する 。 例えば、ステファンソン,ジェイ・アール（Stephenson,J.R.）ら、プロシーディ ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第 ６８巻、１５４２〜１５４６頁（１９７１年）；イスカブ,エヌ・エヌ（Iscove, N.N.）ら、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー（J.Cell Physiol.）第８ ３巻、３０９〜３２０頁（１９７４年）；およびパイク,ビー・エル（Pike,B.L. ）とロビンソン,ダブリュ・エイ（Robinson,W.A.）、ジャーナル・オブ・セル・ フィジオロジー第７６巻、７７頁（１９７０年）参照。 母親の血液試料からの胎児細胞の分離にとり好ましい培地は、１.１％メチル セルロース、３０％ウシ胎児血清、１％ ＢＳＡ、１％ペニシリン−ストレプト マイシン、１％Ｌ−グルタミン、１０-4Ｍの２−メルカプトエタノールを添加し たイスカブの改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）（ ＩＭＤＭ；市販品；ホイティカー（Whitaker）のシグマ（Sigma）社製）である 。好ましい培養条件は、３７℃、４％〜５％ＣＯ2で約９６時間の細胞のインキ ュベーションである。典型的には、培養ディッシュまたは培養フラスコのごとき 培地のための適当な容器中で細胞を培養する。 母親の血液試料の細胞が培養される培地は細胞増殖因子をも含有する。用語「 細胞増殖因子」は胎児細胞の増殖または分化を刺激する因子を包含する。細胞増 殖因子の例は：リンパ球前駆細胞の分化を刺激する因子、例えば、インターロイ キン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）ならびにインターロ イキン−７（ＩＬ−７）、および造血前駆細胞を刺激する因子、例えば、造血細 胞増殖因子（赤血球系細胞増殖因子を含む）、例えばインターロイキン−３（Ｉ Ｌ−３）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球− マクロファージコロニー−刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー−刺激因子 （Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびヒト・組み換え幹細胞因 子（ｒｈＳＣＦ）包含する。 母親の血液試料中の細胞が培養される培地は、赤血球系細胞増殖因子を含有し てもよい。用語「赤血球系細胞増殖因子」は、ヒト・赤血球系前駆細胞の成長お よび増殖を支持する因子を包含する。例は：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およ びバースト促進活性（ＢＰＡ）包含する。これらの赤血球系細胞増殖因子を単独 で、あるいは互いに組み合わせて与えることができる。 用語「エリスロポエチン」は、ヒト・赤血球系前駆細胞の成長および増殖を支 持する蛋白エリスロポエチンの調製物を包含する。天然ソースからのエリスロポ エチン蛋白の精製によりエリスロポエチンを調製してもよく、あるいは組み換え ＤＮＡ法によるエリスロポエチン遺伝子の発現によりエリスロポエチンを調製し てもよい。ヒトの尿から単離されたエリスロポエチンの粗調製物を用いることが でき、シグマから市販されている（カタログ番号Ｅ５０１１、５０Ｕ／ｍｇ）。 他の市販調製物は、シグマＥ９７６１番（ヒト・組み換え型；１０００００Ｕ／ ｍｇ）、Ｅ９７５７番（ヒト・尿由来；８００００Ｕ／ｍｌ）、Ｅ２６３９番（ ヒト・尿由来；５００Ｖ／ｍｇ）およびＥ２５１４（ヒト・尿由来；１００Ｕ／ ｍｇ）を包含する。好ましくは、エリスロポエチンはヒト由来であるが、ヒト・ 赤血球系前駆細胞の増殖および分化を支持できる別の種由来のエリスロポエチン を用いてもよい。例えば、ヒトおよびマウスの細胞はともに、ヒツジまたはヒト のエリスロポエチンにより刺激された（イスカブ,エヌ・エヌら、ジャーナル・ オブ・セル・フィジオロジー第８３巻、３０９〜３２０頁（１９７４年）参照） 。所望の赤血球系前駆細胞の増殖および／または分化の結果を得るに十分な濃度 のエリスロポエチンを用いる。培地中のエリスロポエチンの好ましい濃度範囲は 約０.２５Ｕ／ｍｌないし１Ｕ／ｍｌである。 培地中のエリスロポエチンに曝露された赤血球系前駆細胞は刺激されて増殖し 分化するであろう。多くの理由により、エリスロポエチンは、母親の血液試料由 来の細胞中の胎児赤血球系前駆細胞の増殖および分化を優先的に刺激する。第１ に、ヒト・胎児肝臓由来の胎児赤血球系前駆細胞は、ヒト・成人由来の赤血球系 前駆細胞よりもエリスロポエチンの刺激効果に対して感受性があることが示され ている（ペシュレ,シー（Peschle,C.）ら、ブラッド（Blood）第５８巻、５６５ 〜５７２頁（１９８１年）参照）。第２に、使用エリスロポエチン濃度（例えば 、０.２５Ｕ／ｍｌないし１Ｕ／ｍｌ）は成人赤血球系前駆細胞の最適刺激濃度 （２〜４Ｕ／ｍｌ）よりも低い（リンチ（Linch）ら、ブラッド第５９巻、９７ ６〜 ９７９頁（１９８２年）参照）。最後に、ヒト・成人における赤血球系前駆細胞 は成人の造血部位である骨髄にのみにほぼ限られて見いだされ、それゆえ、もし 存在してもわずかの母親の赤血球系前駆細胞しか母親の末梢血に存在しないはず である。 ２つのタイプの胎児赤血球系前駆細胞がエリスロポエチンの刺激効果に応答し うる。それらは：成熟もしくは後期ＢＦＵ−Ｅ（以後、Ｍ−ＢＦＵ−Ｅという） およびＣＦＵ−Ｅである。顕微鏡で調べることのできるそれらの形態により、Ｍ −ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅ由来のコロニーを互いに識別することができ、さ らに他の細胞タイプから識別することができる。ＢＦＵ−Ｅ由来のコロニーは通 常は１００個以上の細胞を含み、数千個の細胞を含むことができ、細胞の拡散し た「バースト」または散在パターンに配列されている。ＣＦＵ−Ｅ由来のコロニ ーは、より小型でよりコンパクトなコロニーに配列された約２０ないし１５０個 の細胞を含む。ＣＦＵ−Ｅ由来のコロニーは培養の最初に１週間で成熟するが、 ＢＦＵ−Ｅ由来のコロニーは発達により長時間を要する。さらに、ＣＦＵ−Ｅ由 来のコロニーはさらに成熟し、分化して有核赤芽球のごとき赤血球系細胞を形成 し、顕微鏡で同定できる可視的なヘモグロビン形成を示す。 赤血球系細胞増殖因子、例えば、エリスロポエチンを含有する培地中で細胞を 培養した後、赤血球系細胞を培地から単離する。用語「単離」は、他の細胞およ び／または培地からの１個またはそれ以上の細胞もしくは細胞コロニーの分離を いう。細胞を十分に低密度で半固体培地にて増殖させて個別の識別可能な細胞コ ロニーを形成させる場合、これらの細胞コロニーはすでに半固体培地中の他の細 胞から単離されている。培地から細胞を取ることにより細胞または細胞コロニー をさらに単離することができる。例えば、光学顕微鏡下で培養物を試験すること により個別の細胞コロニーを同定し、培地から細胞を取り出すことにより培地か ら取ることができる。吸い出しパスツールピペットまたは他の適当なピペットの ごとき器具を用いて細胞を効率的に取り出して細胞を取り扱うことができる。例 えば、ピペットで取ることにより培地から細胞を分離したならば、細胞を保持容 器（例えば、試験管）、固体支持体（例えば、顕微鏡スライド）、新鮮培地、ま たは細胞のさらなる増殖、取り扱いもしくは分析に適した他の場所に移すことが できる。好ましい具体例において、細胞の単一コロニーを培地から取り、顕微鏡 スライドに移す。 用語「胎児細胞」は、母親の末梢循環血液中に存在する胎児細胞を包含する。 胎児細胞は、細胞増殖因子とのインキュベーション後に成熟細胞、例えば、顆粒 球、単球または白血球に分化しうる胎児前駆細胞を包含する。例えば、胎児リン パ球前駆細胞をＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−４とともに培養して成熟Ｔまた はＢ−リンパ球に分化させることができる。Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−Ｃ ＳＦのごとき因子とともに他の胎児前駆細胞を培養して成熟顆粒球に分化させる ことができる。 用語「赤血球系細胞」は、赤血球系細胞増殖因子、例えば、エリスロポエチン とともに培養することにより赤血球系前駆細胞から由来する細胞を包含する。赤 血球系細胞増殖因子、例えば、エリスロポエチンとともに赤血球系前駆細胞を培 養することは、前駆細胞をより成熟した赤血球系統の発達段階へと分化させる。 よって、培養後に存在する細胞は異なる段階の赤血球系の発達経路にある細胞タ イプの混合物であってもよい。異なる段階の赤血球系の発達経路にある細胞は互 いに形態学的に異なる可能性がある。ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅコロニーのご とき赤血球系前駆細胞の形態を有する細胞もしくは細胞のコロニー、または有核 赤芽球のごとき可視的なヘモグロビン形成を伴う細胞を包含するより発達した赤 血球系細胞は、赤血球系細胞増殖因子、例えばエリスロポエチン中での赤血球系 前駆細胞の培養後に検出でき、培地から単離することができる。 妊婦から得た末梢血試料由来の細胞を培養する前に、試料中の１またはそれ以 上のタイプの細胞を豊富化するように試料を処理することができる。母親の血液 試料は、リンパ球、単球、顆粒球、ならびに潜在的には胎児細胞、例えば赤血球 系前駆細胞のごとき有核細胞、および無核成熟赤血球の両方を含有する。無核成 熟赤血球は末梢血試料中の大部分の細胞を構成し、培養前にこれらの細胞を試料 から除去することがしばしば望ましい。有核細胞に富む試料を得る豊富化の前の 末梢血試料中に存在する有核細胞の割合に対して末梢血試料中に存在する有核細 胞の割合を増加させることができる。次いで、有核細胞を豊富化した試料を培養 に用いる。用語「有核細胞の割合」は、試料中の全細胞、すなわち、有核および 無核細胞の数に対する有核細胞のパーセンテージをいう。用語「豊富化の前の.. ....に存在する割合に対して増加」は、試料中に存在する有核細胞のパーセンテ ージが、豊富化処理前の試料中に存在した有核細胞のパーセンテージよりも豊富 化処理後において大きいことを意味する。試料から無核細胞を除去することによ り、および／または無核細胞から有核細胞を分離することにより、有核細胞およ び無核細胞の両方を含有する末梢血のごとき試料中の有核細胞のパーセンテージ を出発試料に対して増加させることができる。用語「有核細胞を豊富化した試料 」は、試料中の有核細胞のパーセンテージが豊富化手順前の母親の血液試料に存 在するパーセンテージに対して増加している母親の血液試料から得られる試料を 包含する。 １の具体例において、妊婦から得た末梢血試料中の有核細胞から無核細胞を分 離することにより、有核細胞を豊富化した試料を得る。用語「分離」は、無核細 胞よおび有核細胞を互いに単離することを意味する。密度勾配遠心分離により、 無核細胞を有核細胞から分離することができる。用語「密度勾配遠心分離」は、 細胞混合物、例えば、血液試料の細胞を遠心チューブのごとき容器に入れて遠心 分離し、特定の密度の特定の物質を通過させて異なる細胞タイプを含む層を形成 させる方法をいう。遠心分離条件下では、細胞は、それらの細胞サイズおよび密 度の関数として密度勾配物質中を移動する。それゆえ、密度勾配遠心分離を用い て、細胞サイズおよび密度の相違に基づいて細胞を分離することができる。無核 赤血球は有核細胞とは異なるサイズおよび密度を有するので、密度勾配遠心分離 により有核細胞から分離されうる。密度勾配遠心分離により無核細胞と有核細胞 とを分離するのに適したいくつかの物質が市販されている。これらは、フィコー ル（Ficoll）（スゥエーデンのウプサラのファルマシア（Pharmacia）社製）、 ヒストパーク（Histopaque）(ミズーリ州セントルイスのシグマ（Sigma）社製) 、ニコデンズ（Nycodenz）（ノルウェーのオスロのニコメド・ファーマ（Nycome d Pharma）社製；米国においてギブコＢＲＬ（Gibco BRL）から市販）、ポリモ ル フプレプ（Polymorphprep）（ノルウェーのオスロのニコメド・ファーマ社製； 米国においてギブコＢＲＬから市販）を包含する。適当な遠心速度および時間が 製造者により決定されている。一般的には、適当な遠心速度および時間は４００ 〜５００ｇで室温において２０〜３５分である。 遠心分離後、典型的には、材料血液試料は少なくとも３層に分離する。該３層 とは、血清および血漿板を含有する上清層；単核細胞層；および無核赤血球えお 含有する凝集ペレットである。有核細胞を含み、大部分の無核赤血球を欠く１ま たはそれ以上の細胞層（例えば、単核細胞層）をグラジエントから取って、有核 細胞が豊富化した試料を得る。 もう１つの具体例において、無核細胞の選択的溶解により、無核細胞を有核細 胞から分離することができる。用語「選択的溶解」は、他の細胞タイプ、例えば 、有核細胞に対して１の細胞タイプ、例えば、無核細胞の優先的破壊をいう。有 効であることが知られており、慣用的には無核赤血球の溶解に使用される多くの 低張バッファーの１つ、例えば、０.１７Ｍ ＨＮ4Ｃｌ,０.０１Ｍ Ｔｒｉｓ, ｐＨ７.３の中で母親の血液試料中の細胞をインキュベーションすることができ る（例えば、チイリカイネン（Tiilikainen）ら、トランスプランテイション（T ransplantation）第１７巻、３５５頁（１９７４年）およびマセラ（Macera）ら 、リューケミア・リサーチ（Leukemia Research）第１３巻、７２９〜７３４頁 （１９８９年）参照）。また、この目的に適するバッファーは市販されている（ 例えば、ジェントラック（GenTrak）の「ライズ・アンド・フィックス（Lyse an d Fix））。無核細胞の選択的溶解に適した適切なバッファー中でのインキュベ ーション後、得られる細胞試料は有核細胞を豊富化した試料である。 好ましい具体例において、試料中の胎児細胞、例えば、胎児赤血球系前駆細胞 を豊富化するために、培養する前に母親の血液試料を取り扱う。末梢血試料中に 存在する胎児細胞、例えば、胎児赤血球系前駆細胞の割合を、胎児細胞、例えば 、胎児赤血球系前駆細胞が豊富化された試料を作成する豊富化前の末梢血中に存 在する胎児細胞、例えば、胎児赤血球系前駆細胞の割合に対して増加させること ができる。次いで、胎児細胞が豊富化された試料を培養に用いる。用語「胎児細 胞、 例えば、赤血球系前駆細胞の割合」は、試料中の全細胞、すなわち、有核細胞お よび無核細胞の数に対する胎児細胞のパーセンテージをいう。用語「豊富化前.. ....存在する割合に対して増加」は、試料中に存在する有核細胞のパーセンテー ジが、豊富化処理前の試料中に存在した有核細胞のパーセンテージよりも豊富化 処理後において大きいことを意味する。他の細胞タイプ、例えば、無核細胞およ び他のタイプの有核細胞を試料から除去することにより、および／または特定の タイプの細胞、例えば、赤血球系前駆細胞を無核細胞および他のタイプの有核細 胞から分離することにより、他の細胞タイプを含有する末梢血のような試料中の 特定のタイプの胎児細胞、例えば赤血球系前駆細胞のパーセンテージを出発試料 に対して増加させることができる。用語「胎児細胞、例えば、赤血球系前駆細胞 が豊富化された試料」は、胎児細胞、例えば、試料中に存在する赤血球系前駆細 胞が豊富化処理前の母親の血液試料中に存在するパーセンテージに対して増加し ている母親の血液試料由来の試料を包含する。 選択された細胞タイプおよび他の細胞タイプの細胞サイズおよび密度の相違に 基づく密度勾配遠心分離により、特定のタイプの胎児細胞、例えば、赤血球系前 駆細胞を無核細胞、例えば、成熟赤血球および他のタイプの有核細胞、例えば、 リンパ球および単核細胞から分離することができる。１の具体例において、「２ 重密度勾配遠心分離」を行う。用語「２重密度勾配遠心分離」は、細胞混合物、 例えば、血液試料の細胞を遠心チューブのごとき容器に入れ、異なる密度の２種 またはそれ以上の物質を通して異なる細胞タイプを含む層を形成させるか、ある いは別法として、ある密度の１の物質を通して細胞混合物を遠心分離し、１また はそれ以上の層を取り、取った細胞を第２の物質（好ましくは、第１の物質とは 異なる密度である）を通して再遠心分離して異なる細胞タイプを含む層を形成す る方法を包含する。１層の密度勾配遠心分離用と記載されたグラジエント物質（ 例えば、フィコール、ヒストパーク、ニコデンズ、ポリモルフプレプ）を用いて ２重密度勾配遠心分離を行うことができる。 ポリモルフプレプ（ニコメド；ギブコＢＲＬカタログ番号１００−１９７１） を用いる密度勾配遠心分離により、胎児細胞、例えば赤血球系前駆細胞が豊富化 された試料を得ることができる。希釈されていない抗凝集処理された母親の血液 試料の全血をグラジエント物質を通して遠心分離して以下の層（チューブの上か ら下へ）を形成させる：血清および血小板を含む上清層；リンパ球および単球を 含む単核細胞層（「バフィーコート（buffycoat）」）；多形核白血球、有核赤 血球および赤血球系前駆細胞を含む多形核細胞層；および無核赤血球ペレット。 多形核細胞層を取り、胎児赤血球系前駆細胞が豊富化された試料を得ることがで きる。 さらに、ヒストパークを用いる２層密度勾配遠心分離を用いて赤皿球系前駆細 胞が豊富化された試料を得ることができる。リン酸緩衝化セイライン中に１：１ 希釈された母親の血液試料を、ヒストパーク１１１９（密度＝１．１１９）上に 重層されたヒストパーク１０７７（密度＝１．０７７ｇ／ｍｌ）からなる２重密 度勾配を通して遠心分離して下記の層（チューブの上から下へ）を形成させる： 上清層；単核細胞層（「バフィーコート」）；グラジエント１.０７７と１.１１ ９との界面の赤血球系前駆細胞を含む有核赤血球細胞層；および無核赤血球ペレ ット。有核赤血球層を取り、赤血球系前駆細胞が豊富化された試料を得ることが できる。さらに、実施例１に記載のごとく、ヒストパーク１０７７および１１１ ９を連続的に用いて胎児細胞、例えば、胎児赤血球系前駆細胞が豊富化された試 料を得ることができる。 単一または２層密度勾配遠心分離を行う場合、細胞層は常に分離していて同定 可能であるとは限らない。それゆえ、数個の異なる細胞層を取り、胎児細胞、例 えば赤血球系前駆細胞が正しく選択されたことを確認し、かつ比較目的のために 、細胞増殖因子、例えば赤血球系細胞増殖因子、例えばエリスロポエチンを含有 する培地で別々に培養してもよい(すなわち、他の細胞層が対照として役立ち得 る)。 無核細胞および／または他の細胞タイプを母親の血液試料から除去する他の方 法、あるいは赤血球系前駆細胞を豊富化させる他の方法を用いて、胎児細胞、例 えば、胎児赤血球系前駆細胞が豊富化された試料を得ることもできる。例えば、 特定の細胞タイプ上に存在する細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いて母親の 血液試料中の特定の細胞タイプを除去または豊富化することができる。選択され た胎児細胞、例えば胎児赤血球系前駆細胞に特異的な抗体を用いて、例えば、フ ローサイトメトリー、パンニング（panning）または免疫磁気分離により赤血球 系前駆細胞を選択することができる（積極的な細胞の選択）。別法として、選択 された胎児細胞以外の細胞タイプ上に存在するマーカーに特異的な抗体を用いて 、例えば、フローサイトメトリー、パンニング（panning）または免疫磁気分離 により（消極的な細胞の選択）、あるい補体により媒介される抗体に結合した細 胞の溶解により、特定の細胞タイプを母親の血液試料から除去することができる 。 細胞増殖因子、例えば、赤血球系細胞増殖因子、例えばエリスロポエチンを含 有する培地中での、母親の血液試料、有核細胞が豊富化された試料または胎児細 胞、例えば赤血球系前駆細胞が豊富化された試料の培養により、好ましくは、胎 児細胞のコロニーが得られるが（例えば、末梢血中の材料赤血球系前駆細胞の不 足およびエリスロポエチンに対する胎児赤血球系前駆細胞の高感受性のため）、 赤血球系細胞または細胞コロニーを形態学的に胎児由来であると同定することは できない。それゆえ、胎児細胞を胎児由来であると同定するために、本発明方法 は、さらに、胎児細胞上またはその中の胎児細胞マーカーを検出することからな っていてもよい。用語「胎児細胞マーカー」は、胎児細胞を母親の細胞から識別 するのに用いることのできる、胎児細胞上またはその中に存在する細胞表面、細 胞質または核の構造もしくは分子を包含する。 用語「胎児細胞マーカーを検出」は、胎児細胞マーカーそれ自体の検出または 胎児細胞マーカーに結合する別の分子の検出を包含する。例えば、細胞またはそ の一部を胎児細胞マーカーに対して反応する抗体と接触させることにより、胎児 細胞マーカーを胎児細胞上またはその中において検出することができる。抗体を 検出可能な物質で標識することができ、あるいは別の分子、例えば、第１の抗体 に対して反応する、検出可能な物質で標識された第２の抗体とさらに反応させる ことができる。適当な検出可能物質は、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質 および放射性物質を包含する。適当な酵素の例は、セイヨウワサビ・ペルオキシ ダーゼ、ビオチン、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または アセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な酵素／補欠分子族複合体の例はス トレプトアビジンとビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロ ン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロ ロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリ ンを包含し；発光物質の例はルミノールを包含し；適当な放射性物質の例は、12 5 Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈを包含する。標準的な免疫組織化学的方法を用い、 胎児細胞マーカーに対する抗体を用いて胎児細胞マーカー発現を検出することが できる。 母親の細胞と比較すると胎児細胞上またはその中に優先的にあるいは専ら発現 される蛋白を胎児細胞マーカーとして用いることができ、該蛋白に対する抗体を 用いて検出することができる。胎児細胞マーカーとして用いることのできる適当 な蛋白は、胎児ヘモグロビンおよび胎児ヒストン蛋白Ｈ0１を包含する。胎児ヘ モグロビンは細胞質蛋白であるが、胎児Ｈ0１は核蛋白である。さらに、胎児赤 血球系細胞上またはその中に優先的にあるいは専ら発現される抗原決定基を胎児 細胞マーカーとして用いることができる。胎児細胞マーカーとして用いることの できる適当な抗原決定基の例はｉ抗原決定基である。ｉ抗原決定基は、胎児赤血 球系細胞上に存在する分枝していない膜炭水化物である。一般的には、成人の赤 血球はｉを発現しないが、むしろ分枝炭水化物であるＩ抗原決定基を発現する。 胎児細胞マーカーの他の例は、母親の細胞と比較して胎児細胞に独自の核酸配 列を包含する。男性の胎児由来の胎児細胞の場合には独自の核酸配列の例はＹ染 色体ＤＮＡ、および親の多型性またはＨＬＡ抗原アリールのごとき多型性アリー ルを含むＤＮＡを包含する。 胎児細胞の培養および単離後、本発明方法は、さらに、単離胎児細胞、例えば 胎児赤血球系細胞の胎児核酸中の対象核酸配列を検出することからなる。用語「 対象核酸配列」は、ＤＮＡ、例えば染色体ＤＮＡ、または染色体ＤＮＡもしくは 染色体ＤＮＡから増幅されたものに含まれる特定の遺伝子フラグメント、並びに ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡもしくは核ＲＮＡを包含する。用語「胎児核酸」は、胎 児ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えば、胎児染色体ＤＮＡおよび胎児ｍＲＮＡを包含す る。胎児細胞を胎児由来であると同定するために（すなわち、胎児核酸は胎児細 胞マ ーカーでありうる）、さらに胎児の性の決定のごとき分析、胎児における遺伝疾 患の検出および胎児における染色体異常の検出のために、胎児細胞中の核酸にお ける対象核酸の検出を用いることができる。診断または他の目的のために、本明 細書記載のごとく培養され単離された胎児細胞中の胎児核酸を対象核酸の存在に 関して分析することができる。 細胞中に存在する胎児核酸を検出に利用できるように培養された胎児細胞を処 理することができる。例えば、対象核酸を酵素的に増幅することにより、および ／または標識核酸プローブを対象核酸配列にハイブリダイズさせることにより、 対象核酸配列を利用可能な胎児核酸において検出することができる。対象核酸配 列を検出するのに用いる標識プローブは、例えば、標識ＤＮＡプローブ、標識Ｒ ＮＡプローブまたは標識オリゴヌクレオチドであってよい。胎児細胞を煮沸して それらを溶解することにより胎児ＤＮＡを利用可能とし、それにより、例えば胎 児ＤＮＡの増幅の前に胎児ＤＮＡを遊離させることができる。例えば、インシト ゥ（in situ）ハイブリダイゼーションの前に胎児赤血球系細胞または赤血球系 細胞核を顕微鏡スライドに固定することにより、胎児細胞を固体支持体、例えば 、顕微鏡スライドに付着させて胎児核酸を利用可能にすることができる。例えば 、対象核酸配列に相補的な標識核酸プローブのインシトゥハイブリダイゼーショ ンにより、胎児細胞またはその一部（例えば、核）における胎児核酸を直接検出 することができ、あるいは検出の前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のごとき 既知増幅方法を用いて胎児核酸を増幅することができる。胎児ＤＮＡ中の対象Ｄ ＮＡ配列を特異的に増幅するＰＣＲ増幅用プライマーを選択する。 胎児赤血球系細胞の胎児核酸中の検出されるべき核酸配列を、本明細書では「 対象核酸配列」という。１の具体例において、対象核酸配列はＹ染色体ＤＮＡ配 列である。用語「Ｙ染色体ＤＮＡ配列」は、繰り返し配列を含むＹ染色体に独自 のヌクレオチド配列を包含する。胎児細胞マーカーの検出および胎児の性の決定 の両方にＹ染色体ＤＮＡ配列の決定を用いることができる。 もう１つの具体例において、対象核酸配列は疾病を引き起こす変異に関連した 遺伝子の配列である。用語「疾病を引き起こす変異に関連した遺伝子の配列」は 、 疾病を引き起こすかまたは疾病に関連した変異を含む可能性のある遺伝子、ある いは疾病を引き起こすかまたは疾病に関連した変異を含む可能性のある遺伝子に 結合した遺伝子の全体または一部を含む核酸配列を包含する。すなわち、検出さ れた遺伝子配列または検出された遺伝子配列に結合した遺伝子配列は、変異が存 在する場合には、疾病を引き起こすかまたは疾病に関連した変異を含む可能性が ある。かかる配列の検出を用いて、胎児が変異により引き起こされる疾病または 変異に関連した疾病を有するかどうかを調べることができる。 さらにもう１つの具体例において、対象核酸配列は染色体異常を検出する。用 語「染色体異常を検出」は、染色体数の変化、染色体欠失、染色体転移および／ または染色体交代を検出しうるヌクレオチド配列を包含する。染色体異常を検出 しうる対象核酸配列は、例えば、特定の染色体由来の繰り返し配列のごとき特定 の染色体の特異的な核酸配列であってよい。染色体異常の検出について試験され る好ましい染色体は、染色体１３、１８、２１、ＸおよびＹを包含する。これら の特定の染色体に関して染色体の三染色体性は最も一般的である。標準的方法に より染色体異常の検出に適した核酸プローブの調製を行うことができる。例えば 、クリンガー・ケイ（Klinger,K.）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒュー マン・ジェネティクス（Am.J.Hum.Genet.）第５１巻、５５〜６５頁（１９９２ 年）参照。 １の具体例において、インシトゥハイブリダイゼーションにより胎児細胞の胎 児核酸において対象核酸を検出する。インシトゥハイブリダイゼーションを用い て染色体ＤＮＡを検出し、かつ、細胞質ｍＲＮＡを検出することができる。例え ば、リヒター，ピー（Lichter,P.）らヒューマン・ジェネティクス（Hum.Genet. ）第８０巻、２２４〜２３４頁（１９８８年）およびシンガー（Singer）らに付 与された米国特許第４,８８８,２７８号参照。インシトゥハイブリダイゼーショ ンを実行する場合、胎児細胞を顕微鏡スライドのごとき固体支持体上で分離して 胎児核酸が検出に使用可能になるようにする。実施例３により詳しく記載するよ うに、インシトゥハイブリダイゼーションを用いて、例えば、胎児ＤＮＡ中のＹ 染色体特異的配列を検出して胎児の性の決定を行うことができる。実施例５によ り 詳しく記載するように、インシトゥハイブリダイゼーションを用いて、三染色体 性のごとき染色体異数性、あるいは染色体転移または欠失を包含する胎児におけ る染色体異常を評価することができる。 もう１つの具体例において、対象核酸配列の検出の前に胎児ＤＮＡを酵素的に 増幅する。実施例４においてより詳しく記載するように、胎児ＤＮＡをＰＣＲに より増幅することができる。増幅を行う場合、胎児赤血球系細胞を煮沸により溶 解することができ、次いで、変性およびアニーリングの適当数（例えば、約２４ 〜６０）のサイクルで胎児ＤＮＡを増幅することができる。対照試料は、偽陽性 増幅をモニターするためのＤＮＡ添加しない試験管を包含する。ＰＣＲ条件を正 しく改変して、１種よりも多い胎児遺伝子を同時に増幅することができる。「マ ルチプレックス（multiplex）」として知られるこの方法は、デュシエンの筋ジ ストロフィー（Duchenne's Muscular Dystrophy）の診断において６セットのプ ライマーとともに用いられている（チャンバーレイン，ジェイ・エス（Chamberl ain,J.S.）ら、プレナタル・ダイアグノシス（Prenat.Diagnosis）第９巻、３４ ９〜３５５頁（１９８９年））。増幅を行う場合、得られた増幅生成物は、対象 配列（すなわち、その存在が検出および／または定量されるＤＮＡ）および他の ＤＮＡ配列からなる増幅された胎児ＤＮＡを含んでいる。既知方法、例えば、ゲ ル電気泳動を用いて、増幅された胎児対象ＤＮＡ配列および他のＤＮＡ配列を分 離することができる。制限エンドヌクレアーゼでの消化、臭化エチジウム染色ア ガロースゲルの紫外線による可視化、ＤＮＡ配列決定、または標識ＤＮＡプロー ブ、例えば特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション（サ イキ,アール・ケイ（Saiki,R.K.）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒュー マン・ジェネティクス第４３巻（補）：Ａ３５（１９８８年））のごとき既知方 法を用いて、引き続き増幅ＤＮＡの分析を行うことができる。アリール特異的配 列の増幅およびそれに対するハイブリダイゼーションは、増幅された「母親の」 試料と「胎児の」試料との間に多型性の相違が存在するかどうかを調べることが でき、さらに胎児ＤＮＡにおける父親の多型性の検出に基づいて女性の胎児を同 定するために該ハイブリダイゼーションを用いることができる。胎児 の常染色体性染色体において父親由来のＤＮＡ配列を同定することができる。し たがって、本発明方法を用いて、母親の血液から女性胎児細胞、並びに男性胎児 細胞を分離し同定することができる。よって、羊水穿刺のごとき他の方法で現在 行われているすべての核酸をベースとした診断手順に本発明方法を用いることが できる。 増幅後、増幅混合物を核酸フラグメントのサイズに基づいて分離することがで き、得られたサイズにより分離された胎児核酸を適当な選択核酸プローブまたは プローブ（対象核酸配列に対して十分に相補的であって、使用条件下で胎児核酸 中の対象核酸配列にハイブリダイズする核酸）と接触させることができる。一般 的には、核酸プローブを標識する（例えば、放射性物質、蛍光発色団または他の 検出可能な物質で）。サイズにより分離された胎児核酸および選択核酸プローブ を、相補的核酸配列のハイブリダイゼーションが起こるに適した条件下に十分な 時間維持し、胎児核酸／核酸プローブ複合体を生じさせた後、既知方法を用いて 該複合体の検出を行う。例えば、プローブが標識されている場合、胎児核酸／標 識核酸プローブ複合体を検出および／または定量することができる（例えば、オ ートラジオグラフィー、蛍光標識の検出により）。標準曲線（すなわち、検出さ れる標識量と存在する核酸の量との間の前以て調べられた関係）との比較によっ て標識された複合体の量（および胎児核酸の量）を決定することができる。 次いで、オートラジオグラフィーのごとき既知方法を用いて胎児ＤＮＡ／標識 プローブ複合体を検出する。対象核酸および胎児ＤＮＡに相補的な核酸プローブ のハイブリダイゼーションの有無を簡単に調べることができ、対象核酸配列を含 む胎児ＤＮＡ量を調べることができる。その結果は、母親の血液試料から得られ た胎児ＤＮＡの定性的または定量的評価である。疾病を引き起こす変異を有する 可能性のある多くの遺伝子に関して、遺伝子中の疾病を引き起こす変異の存在を 示す制限部位の多型性を検出するプローブが利用可能である。対象とする疾病に 関連した遺伝子に特異的な核酸プローブを用いる胎児ＤＮＡ中のかかる制限部位 の多型性の検出は、胎児ＤＮＡが遺伝子中に変異を有し、それゆえ、胎児が疾病 を有することを示す。 疾病または症状に関連した胎児核酸の存在を、本発明方法により検出および／ または定量することができる。例えば、プローブＳｔ１４（オベール,アイ（Obe rle,I.）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（NewEngl. J.Med.）第３１２巻、６８２〜６８６頁（１９８５年））、４９ａ（グエリン, ピー（Guerin,P.）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res .）第１６巻、７５５９頁（１９８８年））、ＫＭ−１９（ガスパリーニ,ピー（ Gasparini,P.）ら、プレナタル・ダイアグノシス第９巻、３４９〜３５５頁（１ ９８９年））、またはデュシエン筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子に関する欠 失傾向のエキソン（チャンバーレイン,ジェイ・エスら、ヌクレイック・アシッ ズ・リサーチ第１６巻、１１１４１〜１１１５６頁（１９８８年））に由来する 配列をプローブとして用いる。Ｓｔ１４は、母親のＤＮＡから女性胎児のＤＮＡ を識別するのに用いることのできるＸ染色体のロングアームから単離された非常 の多型性の配列である。それは因子VIII：Ｃに関する遺伝子の近くにマッピング され、よって、血友病Ａの出産前診断に用いることができる。ＤＭＤ遺伝子にお ける６種の最も通常に欠失したエキソンに隣接した配列に対応するプライマーで あって、ＰＣＲによりうまくＤＭＤの診断に用いられているプライマーを用いる こともできる（チャンバーレイン,ジェイ・エスら、ヌクレイック・アシッズ・ リサーチ第１６巻、１１１４１〜１１１５６頁（１９８８年））。本発明方法に より診断することのできる他の症状は、嚢胞性線維症（ニュートン，シー・アー ル（Newton,C.R.）ら、ランセット（Lancet）第２巻、１４８１〜１４８３頁（ １９８９年））；β−地中海貧血（カイ,エス−ピー（Cai,S-P.）ら、ブラッド （Blood）第７３巻：３７２〜３７４頁（１９８９年）；カイ,エス−ピーら、ア メリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス（Am.J.Hum.Genet. ）第４５巻：１１２〜１１４頁（１９８９年）；サイキ,アール・ケイ（Saiki,R .K.）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン第３１９巻、 ５３７〜５４１頁（１９８８年））、鎌状細胞貧血（サイキ,アール・ケイら、 ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン第３１９巻、５３７〜５ ４１頁（１９８８年））、フェニルケトン尿症（ディレラ,アイ・ジ ー（DiLella,A.G.）ら、ランセット第１巻、４９７〜４９９頁（１９８８年）） 。それぞれの症状の評価のために本発明方法において使用する適当なプローブ（ または複数のプローブ）が利用できる（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９１／０７６６ ０参照）。 もう１つの具体例において、本発明は、妊婦からの末梢血試料からの中期の胎 児赤血球系細胞の単離方法に関する。該方法は、妊婦から末梢血試料を得て、赤 血球系細胞増殖因子、例えばエリスロポエチンを含有する培地において末梢血試 料中の細胞を培養し、分裂中の細胞が細胞周期を経ることを抑制するかまたは細 胞の増殖を同調させる薬剤に培養細胞を曝露し、中期の胎児赤血球系細胞を単離 することを包含する。分裂中の細胞が細胞周期を経ることを抑制するかまたは細 胞の増殖を同調させる薬剤は当該分野において知られており、コルセミド、コル ヒチンおよびビンブラスチン塩を包含する。細胞の増殖を同調させる薬剤は当該 分野において知られており、ブロモデオキシウリジン、フルオロデオキシウリジ ンおよび臭化エチジウムを包含する。細胞培養後、標準的方法により中期のスプ レッドを調製することができ、さらなる分析に使用することができる（実施例２ 参照）。 もう１つの具体例において、本発明は、経産妊婦からの末梢血試料中の現在の 妊娠に由来する胎児細胞の優先的単離方法を提供する。該方法は、経産妊婦から 末梢血試料を得て、赤血球系細胞増殖因子、例えば、エリスロポエチンを含有す る培地中で末梢血試料中の細胞を培養し、次いで、胎児赤血球系細胞を単離して 現在の妊娠に由来する胎児細胞を単離することからなる。用語「経産妊婦」は、 その現在の妊娠のほかに１回またはそれ以上の妊娠をした妊婦いう。この方法は 、赤血球系前駆細胞の短い寿命に基づいている（ベック,ダブリュ・エス（Beck, W.S.）、ヘマトロジー（Hematology）、第５版、ＭＩＴプレス（MIT Press）： マサチューセッツ州ケンブリッジ（１９９１年）参照）。赤血球系前駆細胞の寿 命赤血球系前駆細胞の寿命は約３カ月であるので、経産妊婦の末梢血試料から得 た培養胎児赤血球系細胞は、以前の胎児由来ではなく現在の胎児由来であろう。 このことは、母親の血液試料中に存在しうる別の長寿命の胎児細胞タイプの単離 に 優る、胎児赤血球系細胞を単離することの利点である。例えば、胎児リンパ球も 母親の末梢血中に存在するが、末梢血中でリンパ球は数年程度生存しうる（シュ ローダー（Schroder）ら、トランスプランテイション（Transplantation）第１ ７巻、３４６頁（１９７４年）；チャランフィ（Ciaranfi）ら、シュバイツァー リッシェ・メディツィニッシェ・ボッヘンシュリフト（Schweizerische Medizin ische Wochenschrift）第１０７巻、１３４〜１３８頁（１９７７年））。よっ て、経産妊婦の母親の血液試料中に検出された胎児リンパ球は、現在の胎児由来 または以前の胎児由来のいずれかであり、性別の同定および／または現在の胎児 の診断を困難なものにする。 さらに本発明を下記実施例により説明するが、下記実施例は限定的なものと解 してはならない。本願全体にわたり引用されているすべての参考文献および公表 された特許ならびに特許出願の内容を、参照により本明細書に記載されているも のとみなす。実施例１： 妊婦から得た末梢血試料由来の赤血球系前駆細胞の培養 この実施例において、妊婦から得た末梢血試料由来の赤血球系前駆細胞を培養 した。まず、末梢血試料を密度勾配遠心分離（単層または２層）に供して末梢血 中に豊富にある無核赤血球細胞の大部分を除去し、さらに試料中の母親に由来す る多くの有核細胞タイプを除去しつつ、培養段階に先立って赤血球系前駆細胞を 豊富化させた。これにより、もとの末梢血試料中に存在するよりもはるかに少な い全細胞数での培養が可能となった。 妊娠ソノグラム（超音波）および遺伝学的羊水穿刺を行うというインフォーム ド・コンセントを行って妊婦から静脈穿刺により母親の末梢血試料を得た。各場 合において、羊水穿刺を行う前に母親の血液試料を得た。抗凝集剤としてアシッ ド・シトレート・デキストロース（Acid Citrate Dextrose）溶液Ａ（ＡＣＤ− Ａ）の入った２本のバクテイナー（Vacutainer）チューブに分注された１８ｍｌ の全末梢血を、各妊婦から得た。試料を得た翌日に速達便により母親の末梢血試 料を得た。数回転倒させて試料の混合を確実にし、３つの試料それぞれから ５ｍｌの希釈されていない血液を得て、後で説明するポリモルフプレプ（Polymo rphprep）グラジエントの上部に重層した。同体積のリン酸緩衝化セイラインで 残りの血液を希釈し、希釈血液のうち５ｍｌをフィコール−パーク（Ficoll-Paq ue）グラジエント、ヒストパーク（Histopaque）２層グラジエント、およびニコ デンズ（Nicodenz）２層グラジエントの上部に重層した。密度勾配に沿った赤血 球系前駆細胞および有核赤血球の典型的な相対的分配を説明するダイヤグラムを 図１に示す。フィコール−バークグラジエント １５ｍｌの円錐形遠心チューブ中のフィコール−プラーク（１.０７７ｇ／ｍ ｌ；スウェーデン、ウプサラ（Uppsala）のファルマシア（Pharmacia）製）３. ５ｍｌに５ｍｌの希釈末梢血を重層した。卓上遠心機でチューブを室温で４００ ｘｇで３０分遠心した。血漿とフィコール−パークとの界面のバフィーコート（ buffy coat）層（Ｆ１という）を抜き取り、濯ぎ、次いで、下記のごとく培養し た。ヒストパーク２層グラジエント １５ｍｌのチューブ中のヒストパーク１.１１９ｇ／ｍｌ（シグマ・ケミカル （Sigma Chemical）社製）２ｍｌにヒストパーク１.０７７ｇ／ｍｌ（シグマケ ミカル社製）１.５ｍｌを注意深く重層した。次いで、希釈血液５ｍｌをヒスト パークの上部に重層した。卓上遠心機でチューブを室温で４００ｘｇで３０分遠 心した。パスツールピペットを用いて、血漿と１.０７７ｇ／ｍｌグラジエント との界面のバフィーコート（Ｈ１という）を集めた。有核赤血球を含有する可能 性が最も高いと考えられる領域を集めるために、１.０７７／１.１１９界面から 下方の赤血球ペレットまでの全１.１１９層（Ｈ２という）をパスツールピペッ トで吸引した。これら２つの細胞フラクションをきれいな試験管に入れ、濯ぎ、 次いで、下記のごとく培養した。ポリモルフプレプグラジエント １５ｍｌのチューブ中のポリモルフプレプ１.１１３ｇ／ｍｌ（ニコメドギブ コ（NycomedGibco BRL）社製）３.５ｍｌに希釈されていない全血を重層した。 卓上遠心機でチューブを室温で５００ｘｇで３０分遠心した。全血試料中の赤血 球がポリモルフプレプ媒体と接触したので、それらはデキストラン５００により 凝集し、遠心力下でグラジエント中に沈降した。このグラジエント媒体は、高浸 透圧環境に入ると赤血球が水分を失う傾向を利用することにより、２種の細胞集 団を分離するように設計されている。予想どおり、母親の試料は２つの明確に異 なるバンドをポリモルフプレプ上に示した。それぞれの血液試料から得た血漿／ ポリモルフプレプ界面のバフィーコート（Ｐ１という）をパスツールピペットで 吸引し、きれいな試験管に移した。次いで、理論的には有核赤血球および赤血球 系前駆細胞を含有している多形核細胞層（Ｐ２という）を別のきれいな試験管に 移した。同体積の蒸留水中０.４５％ＮａＣｌを添加して正しい浸透圧に対して 細胞を回復させた。リン酸緩衝化セイラインで細胞を希釈して１２ｍｌとし、下 記のごとく培養した。ニコデンズ２層グラジエント ニコデンズ（ギブコ／ＢＲＬ）を粉末状態で得て、２７.６ｇのニコデンズ粉 末を、蒸留水中の５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、３ｍＭ ＫＣｌ、およ び０.３ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝化媒体中で全体積１００ｍｌにまで復元さ せた。この２７.６％溶液（密度１.１５０ｇ／ｍｌ）をオートクレーブにより滅 菌した。０.７５ｇのＮａＣｌを１００ｍｌの上記緩衝化媒体中に混合すること により等張ＮａＣｌ希釈物（密度１.００３ｇ／ｍｌ）を作成した。ＮａＣｌ希 釈物を０.２２μｍフィルターで滅菌した。２７.６％ニコデンズ溶液およびＮａ Ｃｌ希釈物を３：２および１：１の割合で希釈して、それぞれ密度１.０９０ｇ ／ｍｌおよび１.０７５ｇ／ｍｌの２種の溶液を得た。１５ｍｌチューブ中の２ ｍｌのニコデンズ１.０９０ｇ／ｍｌに１.５ｍｌのニコデンズ１.０７５ｇ／ｍ ｌを注意深く重層した。次いで、リン酸緩衝化セイライン中に １：１希釈された血液５ｍｌをニコデンズ１.０７５ｇ／ｍｌの上部に注意深く 重層した。卓上遠心機でチューブを室温で１５００ｘｇで３０分遠心した。この グラジエントの組み合わせにより、他のグラジエントによるものよりもずっと拡 散した細胞バンドが得られた。細胞層は多数の単核赤血球が混入していた。パス ツールピペットを用いて、血漿と１.０７５ｇ／ｍｌグラジエントとの界面の細 胞層（Ｎ１という）を集めた。１.０９０層の大部分（Ｎ２という）をパスツー ルピペットで集めた。非常に多くの細胞がこの層に存在していたので、それら全 部を用いることはなかった。これらの細胞フラクションをきれいな試験管に入れ た。培地の調製 使用基本培地は、イスカブの改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbec co's Medium）（ＩＭＤＭ；シグマ・ケミカル社製）中の１.１％メチルセルロー ス（４０００センチポアズ；シグマ・ケミカル社製）、３０％ウシ胎児血清（シ グマ・ケミカル社製）、０.１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（シグマ・ケミカ ル社製）、および１％ウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ，フラクションＶ；シグマ ・ケミカル社製）からなっていた。培養物に２ユニット／ｍｌのエリスロポエチ ン（シグマ・ケミカル社製）を補足して赤血球系細胞の増殖および成熟を促進し た。 ＩＭＤＭ中３.２％メチルセルロース溶液を調製するために、６.４ｇのメチル セルロースを、１９０ｍｌの滅菌済みＩＭＤＭを含有する１リットルのオートク レーブ瓶中に秤量した。スターラーバーを瓶に入れたまま溶液をオートクレーブ した。オートクレーブ後、メチルセルロースは堅いピンク色の栓を瓶中に形成し た。メチルセルロースが壊れてスラリーになるまで瓶を激しく振盪した。室温ま で冷却するとメチルセルロースは溶液に戻った。 １０ｇのＢＳＡを秤量し、スターラープレート上の小型ビーカー中の約６０ｍ ｌの蒸留水にゆっくりと添加することにより最終濃度１０％でｐＨ７.６のＢＳ Ａを調製した。一方、１０ｇのＮａＨＣＯ3を蒸留水中に溶解し、定容フラ スコ中で最終体積を１００ｍｌとし、０.２２μｍフィルターでフィルター滅菌 することにより１０％ＮａＨＣＯ3を調製した。ｐＨメーターで連続的に監視し ながらＢＳＡ溶液を１０％ＮａＨＣＯ3でｐＨ７.６に合わせた。この溶液を定容 フラスコ中に注ぎ、蒸留水で１００ｍｌとし、０.４５μｍフィルターで、次い で、０.２２μｍフィルターでフィルター滅菌した。 毒物フード内で１０μｌの２−メルカプトエタノールを１ｍｌのＩＭＤＭに添 加した。滅菌組織培養フード内で、この溶液０.７５ｍｌを４９.５ｍｌのＩＭＤ ＭＤに添加し、混合し、０.２２μｍフィルターでフィルター滅菌した。 オートクレーブされた瓶の３.２％メチルセルロース／ＩＭＤＭに、ペニシラ ン−ストレプトマイシン抗生物質（５０００ユニット／ｍｌ、５０００μｇ／ｍ ｌ；ギブコ／ＢＲＬ）５ｍｌ、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ；ギブコ／ＢＲＬ） ５ｍｌ、滅菌熱失活ウシ・胎児血清（シグマ・ケミカル社製）１８０ｍｌ、１０ ％ＢＳＡ（ｐＨ７.６）６０ｍｌ、および濾過済みエタノール／ＩＭＤＭ４０ｍ ｌを添加した。瓶内容物を完全に混合し、培地を１５ｍｌ試験管中に２.３ｍｌ ずつ分注した。必要になるまで試験管を−２０℃で凍結保存した。細胞のプレーティングおよび培養 ２層ヒストパークグエアジエント（１.１１９ｇ／ｍｌ上に１.０７７ｇ／ｍｌ ）またはポリモルフプレプグラジエントで密度勾配遠心により全血試料を分離し た後、所望細胞フラクションをリン酸緩衝化セイラインで２回すすぎ、ＩＭＤＭ で１回すすぎ、ＩＭＤＭ中に再懸濁して全体積０.５ｍｌとした。この細胞懸濁 液０.５ｍｌを、３０ユニット／ｍｌエリスロポエチン０.２ｍｌ（最終濃度２ユ ニット／ｍｌとなる）とともに１５ｍｌ円錐形遠心チューブ中のメチルセルロー ス培地２.３ｍｌに添加した。 チューブを激しくボルテックス撹拌して成分の完全混合を確実にし、同時に、 コロニー形成と紛らわしいすべての細胞クラスターを破壊した。最終生成物は濃 密粘性シロップであった。細胞含有培地１.５ｍｌを、１００ｍｍファルコン（F alcon）プラスチックディッシュ（ベクトン・ディクソン（Becton Dickson） 社製、ニュージャージー州リンカーンパーク）中のカバーのある２個の３５ｍｍ ファルコンプラスチック組織培養ディッシュ（ベクトン・ディクソン）のそれぞ れに入れた。カバーのない第３の３５ｍｍファルコンディッシュを該１００ｍｍ ファルコンディッシュ中に置き、２ｍｌの滅菌蒸留水で部分的に満たして湿度を 提供した。１００ｍｌファルコンディッシュにカバーをして、ディッシュ全体を 、５％ＣＯ2を満たした３７℃のインキュベーションに移した。より成熟したＣ ＦＵ−Ｅ前駆細胞は１５０個までの細胞からなるはっきりとしたコロニーを４日 以内に形成し、８日目までには培養物中の実質的にすべてのこれらの成熟細胞は 目に見えるヘモグロビンを含有していた。ＢＦＵ−Ｅが高レベルの分化を達成す るまではエリスロポエチン受容体は発現されないので、ＢＦＵ−Ｅは培養物中に おいてすぐには増殖を開始しなかった。培養８〜１０日目までには、大型の分散 したＢＦＵ−Ｅコロニーが見え、１４日目までにはこれらのコロニーは強力にヘ モグロビン化した。 ＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ−Ｅコロニーの典型例を、それぞれ図２および３に示 す（図示したコロニーは胎児肝臓から単離された）。表１は、妊婦からの血液試 料の各細胞フラクションを培養することにより得られたＢＦＵ−ＥならびにＣＦ Ｕ−Ｅコロニーの数をまとめる。フィコール−プラーク（Ｆ）、２層・ヒストバ ーク（Ｈ）、ポリモルフプレプ（Ｐ）、およびニコデンズ（Ｎ）密度勾配を用い て試料を分画した。培養物をぼんやりとさせる多数の赤血球の存在のため、フラ クションＮ２からの細胞を観察し、あるいは計数することはできなかった。 実施例２： 培養赤血球系細胞コロニーの単離および中期スプレッドの調製 この実施例において、実施例１記載のごとく培養された赤血球系細胞コロニー を単離し、さらなる分析のために顕微鏡スライド上に赤血球系細胞の中期スプレ ッドを調製するために用いた。スライド調製 ラジェンドラ（Rajendra）ら（ヒューマン・ジェネティクス（Human Genetics ）（１９８０年）第５５巻：３６３〜３６６頁）およびデューブ（Dube）ら（キ ャンサー・ジェネティクス・アンド・サイトジェネティクス（Cancer Genetics and Cytogenetics）（１９８１年）第４巻：１５７〜１６８頁）の基本的方法に より、赤血球系細胞コロニーをテフロン裏打ちされたガラス製スライド（セルー ライン・アソシエイション・インコーポレイテッド（Cel-Line Assoc.Inc.）,ニ ューフィールド（Newfield）,ＮＩ）上に直接集めた。通常は、これらの赤血球 系細胞は非付着性であるので、まずスライドを０.１％ポリ−Ｌ−リジンで被覆 してスライドへの細胞付着を誘導し、収集工程において損失がないようにした。 ポ リ−Ｌ−リジン処理のために、１００ｍｇのポリ−Ｌ−リジン（シグマ・ケミカ ル社製）を１０ｍｌの蒸留水に溶解して１％ストック溶液を調製した。それぞれ １ｍｌを使用するまで凍結保存した。０.１％ワーキング溶液を調製するために 、１％ストック溶液１００μｌを９００μｌの蒸留水で希釈した。１滴のワーキ ング溶液を各スライドの５ｍｍの部位にそれぞれ置いた。スライドを横しにて覆 いをせずに加湿チャンバー（湿度を提供するための湿ったペーパータオルおよび スライドをペーパータオルに接触させないでおくためのラックを有する密閉プラ シチック箱）に入れ、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーシ ョン後、スライドを個々にビーカー中の蒸留水ですすぎ、室温で風乾した。被覆 されたスライドを使用準備ができるまで−２０℃で凍結保存した。コロニーの収穫 増殖のピークが早いので、ＣＦＵ−Ｅコロニー由来の細胞は２〜６日目に最も よく収集された。この時期を過ぎると、核が突出しているかまたは濃密、緻密に なっており、分析がさらに困難となった。非常な均質化が起こる前の増殖状態の １０日目において、あるいは多数の非分裂性有核赤血球が所望の場合にはその後 に、ＢＦＵ−Ｅ由来の細胞を収集することができた。コロニーを、ポリ−Ｌ−リ ジン被覆スライド上の５ｍｍの部位（スライド１枚あたり４〜６個の部位）にコ ロニーを集めた。多数のコロニーが培養物中に生じ、１つの部位あたり３個また はそれ以上の小さなコロニーが時々得られる場合を除き、コロニーを１個だけ各 部位に置いた。試料間の細胞増殖の相違のため、１試料あたり収集されたコロニ ー総数は３個ないし３１４個の範囲となった。 倒立顕微鏡下でコロニーを同定し、４μｌにセットされた、１０μｌチップを 装備したギルソン（Gilson）ピペットマン（レイニン・インストルメント（Rain in Instrument）社製、マサチューセッツ州ウォーバーン（Woburn））で培地か ら取り出した。ポリ−Ｌ−リジンスライド上の０.１μｇ／ｍｌコルセミド（ギ ブコ／ＢＲＬ）を含有する１５μｌのＩＭＤＭ液滴中にピペッティングにより１ ０〜２０回出し入れすることにより各コロニーを分散させた。スライドを 加湿チャンバー中に横にして置き、３７℃で１５分インキュベーションし、次い で、２０μｌの０.０７５Ｍ ＫＣｌ低張溶液を各液滴中に静かに浸透させた。 加湿箱中で３７℃でさらに１５分インキュベーション後、３０％ ３：１メタノ ール：氷酢酸固定液／７０％ ０.０７５Ｍ ＫＣｌからなる溶液４０μｌを各部 位に静かに添加した。スライドを室温で５〜１０分インキュベーションし、次い で、スライドに付着した細胞をかき乱すことなく過剰の液体を横に取りのけた。 スライドを乾燥する前に、新鮮な３：１メタノール：氷酢酸固定液をパスツール ピペットから各スライドに滴下し、濡れたスライドに風を当てて細胞のスプレッ ディング（spreading）およびをフラットニング（flattening）を容易ならしめ た。スライドを風乾後、スライドをオプチステインII−Ａ（Optistain IIA）（ ガム・レッド（Gam Red）社製、カリフォルニア州カピストラノ（Capistrano） ）中に５分間浸漬し、次いで、３：１メタノール：氷酢酸固定液中に１０分間浸 漬した。スライドをエタノールシリーズで脱水するか、または即座にさらなる分 析に使用するか、あるいは研究できるようになるまで−２０℃で凍結保存した。 このようにして調製した顕微鏡スライド上の赤血球系細胞を、核酸プローブに対 する細胞のハイブリダイゼーション、ライト（Wright's）染色、バンディング（ banding）または保存に用いることができる。細胞含有溶液にコルセミドを添加 しないことにより、同じやり方で、中期段階で停止していない赤血球系細胞を顕 微鏡スライド上に調製した。実施例３： インシトゥ（in situ）ハイブリダイゼーションによる培養赤血球系細胞中の 胎児ＤＮＡの検出この実施例において、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション （ＦＩＳＨ）を用いて、培養され単離さた赤血球系前駆細胞中の胎児ＤＮＡを検 出した。赤血球系細胞由来のＤＮＡのハイブリダイゼーションを、Ｙ染色体特異 的プローブおよびＸ染色体特異的プローブの両方を用いて行った。２つのプロー ブを異なる蛍光マーカーで標識し、異なる色によりそれらを識別できるようにし た。赤血球系細胞由来のＤＮＡにおけるＹ特異的配列は胎児由来でなければなら ないので、このプローブの赤血球系細胞由来のＤＮＡへのハイブリダイゼーショ ンは胎児起源の細胞のインジケーターとして用いられる。蛍光インシトゥハイブリダイゼーション 赤血球系前駆細胞を実施例１のごとく培養し、実施例２のごとくコロニーを単 離し、顕微鏡スライド上に置いた。Ｘ染色体のセントロメア周辺の繰り返し配列 を含むコスミド由来のＸ染色体特異的プローブおよび反復配列を含むコスミドｐ ＤＰ９７由来のＹ特異的プローブを用いてＦＩＳＨを行った。該プローブは、ク リンガー（Klinger）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネ ティクス（Am.J.Hum.Genet.）第５１巻、５５〜６５頁（１９９２年）において さらに詳細に記載されている。Ｘ特異的プローブをビオチンで標識したが、Ｙ特 異的プローブをジゴキシゲニンで標識した。ビオチン化Ｘ染色体プローブを２. ５ｎｇ／μｌの濃度で使用し、ジゴキシゲニン標識Ｙ染色体プローブを５ｎｇ／ μｌの濃度で使用した。 用いたハイブリダイゼーション、洗浄、および検出のプロトコールは、クリン ガーら、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス第５１巻 、５５〜６５頁（１９９２年）の変法であり、以下のごとし。ハイブリダイゼー ション直前に、７０％−８０％−９０％−１００％エタノールシリーズ（１分浸 漬、次いで、１分風乾）によりスライドを脱水した。８μｇ／μｌの超音波処理 したサケ・精子ＤＮＡ（シグマ・ケミカル社製）および２μｇ／μｌのヒト・Ｃ ｏｔ−１ ＤＮＡ（ギブコ／ＢＲＬ）を含有する５０％ホルムアミド／１０％デ キストラン硫酸／６Ｘ ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）中にＸおよびＹ両染 色体に対するプローブＤＮＡを懸濁した。２．５μｌのプローブカクテル液滴を スライドの５ｍｍの部位に添加し、ガラスカバースリップをかぶせた。カバース リップをスライドに密封固定しなかった。スライドを８０℃のスライドウォーマ ー上に５〜６分置くことにより、スライドガラス上のプローブおよび標的核ＤＮ Ａを同時に変性させた。スライドを加湿箱中、３７℃で一晩インキュベーション した。翌日、カバースリップを取り、スライドを、４２℃において５０％ホルム アミド ／２Ｘ ＳＳＣ（ｐＨ７.０）で１０分間、１回洗浄し、６０℃において０.１Ｘ ＳＳＣで１０分間、１回洗浄した。４２℃において、３％ ＢＳＡ／４ＸＳＳＣ ／０.１％ ツイン２０(ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウレート；シグ マ・ケミカル社製）中、５分間のブロッキング工程後、μｇ／ｍｌの抗ジゴキシ ゲニンフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗体（ジゴキシゲニンを 認識し、緑色蛍光を発する）（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannhei m）社製、インディアナ州（ＩＮ）、インディアナポリス(Indianapolis)）およ び２μｇ／ｍｌのＣｙ−３ストレプトアビジン（ビオチン標識プローブに強固に 結合し、赤色蛍光を発する）（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ・ インコーポレイテッド（Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.）、ペンシルベニア 州ウェスト・グローブ（West Grove））を含有する１％ ＢＳＡ／４Ｘ ＳＳＣ 中、３７℃で１５分インキュベーションすることによりスライド上の核にハイブ リダイゼーションした標識プローブを検出した。次いで、スライドを、４２℃に おいて、４Ｘ ＳＳＣ／０.１％ ツイン−２０で１０分間、１回洗浄して除去し なければ偽のシグナルバックグラウンドを生じる過剰の未結合フルオロクローム を除去した。 ２.３３％ＤＡＢＣＯアンチフェード（１,４−ジアザビシクロ［２.２.２］オ クタン；シグマ・ケミカル社製）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、および ０.１μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ（４,６−ジアミノ−２−フェニル−インドール；シ グマ・ケミカル社製）を含有する、スライド上の９０％グリセロールの薄層の上 にカバースリップを置いた。フルオロクロームであるＤＡＰＩは、インタクトな ＤＮＡの小さな溝のＡＴ豊富領域に結合した場合、紫外光下で青色蛍光を発し、 それゆえ、核対比染色剤として有用である（シュバイツァー（Schweizer）、ア ムブローズ（Ambrose）およびアンドルル（Andrle）、１９７８年）。適当な蛍 光フィルター（オメガ・オプチカル・インコーポレイテッド（Omega Optical In c.）、ブラットルボロ（Brattleboro）、ＶＴ）を装備したツァイス・アキシオ プラン（Zeiss Axioplan）エピ蛍光顕微鏡（カール・ツァイス,インコーポレイ テッド（Carl Zeiss,Inc.））で４０倍および１００倍の油浸レンズを用いて スライドを観察した。ＤＡＰＩ蛍光に使用するフィルターは３６５ｎｍ励起フィ ルター、４１０ｎｍ二色フィルター、および４２０ＬＰｎｍエミッションフィル ターであり；ＦＩＴＣ用には、４８５／２０ｎｍ励起フィルター、５１０ｎｍ二 色フィルター、および５２０〜５６０ｎｍエミッションフィルターを用い；Ｃｙ −３蛍光用には、５１５〜５６０ｎｍ励起フィルター、５８０ｎｍ二色フィルタ ー、および５９０ＬＰｎｍエミッションフィルターを用いた。コダック・ゴール ド４００フィルムを用い、１００倍油浸対物レンズ、顕微鏡に直接固定された３ ５ｍｍカメラを用いてハイブリダイゼーションした核を写真にとった。母親の血液試料の分析 全部で３７個の末梢血試料を、同意を得た妊婦から、妊娠１０ ５／７ないし ２２週の間において採取した。２層ヒストパーク１.０７７／１.１１９ｇ／ｍｌ 密度勾配（２１個の試料）またはポリモルフプレプグラジエント（１４個の試料 ）のいずれかを用いて細胞を全血から分画した。２つの試料（試料１１および１ ２）を、２層ヒストパーク、ポリモルフプレプ、フィコールーパークおよび２層 ニコデンズグラジエントで分画した。分画された細胞を実施例１記載のごとくエ リスロポエチンとともに培養した。大部分の場合、Ｈ１またはＰ１およびＨ２ま たはＰ２細胞フラクションを培養した。ＣＦＵ−Ｅ形態のコロニーがＨ２または Ｐ２フラクションから収集されたが、時々、Ｈ１またはＰ１フラクションからも 収集された。コロニーを上記のごとくＦＩＳＨにより分析した。細胞遺伝学的分 析により決定される胎児の実際の核型を最終欄に示す（４６,ＸＹ＝男性、４６, ＸＸ＝女性）。結果を表２にまとめる。 超音波および／または細胞遺伝学的分析により胎児が男性であると証明された 妊婦からの２１個の培養試料のうち（一方が男性でもう一方が女性である双生児 である試料１７を含む）、７個の試料においてＦＩＳＨによりＸＹコロニーが同 定され、男性検出率は３３.３％となった。１つの試料あたりのＸＹコロニー数 は１ないし８個であった（これらの場合については、分析されたコロニー総数の ２.１％ないし３３.３％）。細胞遺伝学的分析により実際に女性の胎児を有して いる１６人の妊婦からは（一方が男性でもう一方が女性である双生児である試料 １７を含まず）、ＸＹコロニーは検出されず、偽陽性率は０％であった。分析し た３７人の妊婦の妊娠期間は１０ ５／７週ないし２２週の範囲であった。 １０５／７週の試料１は、分析した男性の胎児を有する最も初期の妊娠であり、 １２０個のコロニーのうち４個において男性細胞を示した。試料から男性コロニ ーが培養された最もおそい妊娠期間は１７週であった（試料１８）。 表３は、血液試料が得られた妊娠期間（週）を、培養コロニーが得られたグラ ジエントフラクション、収集前に細胞が培養された期間（日）、およびＦＩＳＨ により男性細胞を示した収集コロニーの総数とそのパーセント値と関連づける。 実施例４： 培養赤血球系前駆細胞における遺伝子配列を増幅するためのポリメ ラーゼ連鎖反応の使用 この実施例において、母親の末梢血由来の培養胎児赤血球系前駆細胞中に存在 するＹ特異的ＤＮＡ配列を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた。１ ０6コピーの標的遺伝子配列を作る能力のあるポリメラーゼ連鎖反応、あるいは ＰＣＲを用いて、培養赤血球系前駆細胞中に存在する遺伝子配列を増幅する。胎 児の性別の決定のために、Ｙ染色体上に存在する繰り返し配列に特異的なＰＣＲ プライマーを用いる。まれに存在する男性胎児細胞から、より強力な増幅シグナ ルを生じるという理由で、繰り返し配列を選択する。プローブＹ４１１（マサチ ューセッツ州ボストンのチルドレンズ・ホスピタル（Children's Hospital）の ウルリヒ・ミュラー（Ulrich Muller）博士により提供された）によって包含さ れるＹ染色体の短アームの領域にハイブリダイゼーションするプライマーを使用 する。Ｙ４１１はＹ１５６（ミュラー,ユー（Muller,U.）ら、ヌクレイック・ア シッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第１４巻、１３２５〜１３２９頁（ １９８６年））と同一であり、１０〜６０回反復されており、サザンブロットに おいて絶対的にＹ特異的である。Ｙ染色体特異的プローブＹ４１１を用いて検出 可能な２２２塩基対（ｂｐ）の配列を増幅するために設計された２つのＹ４１１ 領域特異的プライマー、プライマー４１１−０１および４１１−０３を用いる。 該プライマー配列は、ビアンキ,ディー・ダブリュ(Bianchi,D.W.)ら、プロシー ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエ イ、第８７巻、３２７９〜３２８３頁（１９９０年）に記載されている。他の適 当なプライマーは、バハテル,エス（Wachtel,S.）ら、ヒューマン・リプロダク ション（Hum.Reprod.）、第６巻、１４４６〜１４６９頁（１９９１年）に記載 されている。 細胞試料中の検出可能なＤＮＡの最小量を決定するために、一連の標準化実験 を行う。男性および女性の個体からのＤＮＡを１０倍希釈で調製し（１ｐｇ〜１ ｍｇ）、反応バッファーを包含する標準的試薬を用い、パーキン−エルマーＤＮ Ａサーマルサイクラー（Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler）によるジーン アンプキット（GeneAmpkit）（パーキン−エルマー・シタスのカタログ番号Ｎ８ ０１−００５５）において増幅する。測定値を得て、男性ＤＮＡについての試料 のエアロゾルコンタミネーションを防止する。滅菌条件下で、手袋をはめて、交 換可能ピペットを用いてすべてのＰＣＲを行った。すべての試薬を滅菌的方法で 調製し、ＰＣＲ前に、標的配列中の１の消化部位を有する制限エンドヌクレアー ゼとともに一晩インキュベーションする。これらの予防措置は、ＤＮＡを用いず にすべての試薬を用いて対照実験を行った場合に、偽陽性増幅の有意な減少およ び実質的な不存在を提供する。増幅サイクル数は１８ないし３０の間で変更され る。各増幅サイクルは、９４℃１分、６０℃２分、次いで、７２℃３分からなり 、最後のサイクルにおいては１０分の鎖伸長を伴う。増幅されたＤＮＡ試料をア ガロースゲル電気泳動し、ナイロンフィルターに移し、次いで、32Ｐ標識Ｙ４１ １プローブとハイブリダイゼーションさせる。 実施例１のごとく赤血球系前駆細胞を培養し、単離する。増幅の前に、細胞を 煮沸により溶解し、それにより赤血球系細胞ＤＮＡが増幅に使用可能となる。細 胞が男性の妊娠胎児に由来することのデモンストレーションとして、プローブＹ ４１１中の２２２ｂｐの配列に関して赤血球系細胞ＤＮＡを増幅する。使用した 上記条件は、最小１００ｐｇの胎児ＤＮＡ、または１５個の細胞の等価物を検出 することを可能にする。ＰＣＲに使用するサイクル数を増加させることにより感 度限界を改善することができる。さらに偽陽性増幅を減少させ、アガロースゲル 上で単一細胞レベルでの胎児ＤＮＡの検出を可能にするためには、Ｙ染色体の長 アームに特異的な配列の単一コピーに由来するプライマー、ＰＹ４９ａ（グエリ ン,ピー（Guerin,P.）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１６巻、７７ ５９頁（１９８８年））を用いてＰＣＲを行う。実施例５ ： 母親の血液由来の培養赤血球系前駆細胞における染色体異常の検出 この実施例において、母親の血液由来の培養胎児赤血球系前駆細胞について、 染色体特異的プローブのセットを用いるインシトゥハイブリダイゼーションを行 って胎児細胞中の染色体異常を検出する。ノイズに対する良好なシグナル比およ び 蛍光シグナルの良好な空間的変化を提供する特定の染色体に対するＤＮＡプロー ブのセットをインシトゥハイブリダイゼーションに用いる。特別なプローブのセ ットを、しばしばライブボーン（liveborn）異数体として見られる５個の染色体 （染色体１３、１８、２１、Ｘ、およびＹ）用に開発した。染色体１用プローブ を対照として使用する。プローブの構築において、一般的方法は、多くの遺伝学 的ならびに物理学的方法によって所望染色体にマッピングされる出発クローンを 同定し、次いで、そのクローンを用いて、さらにハイブリダイゼーションプロー ブとして用いられる合致コスミド「整列群」を同定することである。染色体２１ 用プローブセットは、８０ｋｂの重複していないＤＮＡを含む３つのコスミド整 列群である。染色体１８用プローブセットは、１０９ｋｂの重複していないＤＮ Ａを含む３つのコスミド整列群である。染色体１３用プローブセットは、約９７ ｋｂの重複していないＤＮＡを含む３つのコスミド整列群である。Ｘ染色体用プ ローブはセントロメア周辺の繰り返し配列を含むコスミドである。Ｙ染色体用プ ローブはｐＤＰ９７であり、反復配列のクローンである（ｐＵＣ−１３のＥｃｏ ＲＩ部位中にサブクローン化されたコスミドＹ９７由来の５.３ｋｂのＥｃｏＲ Ｉ Ｙフラグメント）。すべてのプローブは、クリンガーら、アメリカン・ジャ ーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス、第５１巻、５５〜６５頁（１９９ ２年）にさらに詳細に記載されている。 胎児における染色体異常を診断するために、実施例１に記載のごとく赤血球系 前駆細胞を母親の血液から得て培養し、上記のごとき染色体特異的プローブを用 いてインシトゥハイブリダイゼーションを行うことにより染色体異常を評価する 。インシトゥハイブリダイゼーションを、抑圧条件下（クレマー（Cremer）ら、 ヒューマン・ジェネティクス（Human Genet.）、第８０巻、３２５〜２４６頁（ １９８８年）；リヒター（Lichter）ら、ヒューマン・ジェネティクス、第８０ 巻、２２４〜２３４頁）にて、実施例３およびクリンガーら、アメリカン・ジャ ーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス、第５１巻、５５〜６５頁（１９９ ２年）に記載のごとく行う。高コピー数の繰り返し配列のハイブリダイゼーショ ンを、全ゲノムヒト・ＤＮＡの包含により抑圧し、染色体特異性を中期 スプレッドへのハイブリダイゼーションにより証明する。プローブをビオチン− ＵＴＰで標識し、抑圧条件下でハイブリダイゼーションさせ、次いで、結合した ストレプトアビジン−ＦＩＴＣにより特異的ハイブリダイゼーションを検出し、 それは顕微鏡分析においてＦＩＴＣイメージ中の単一「小点」として示される。 別法として、複数のプローブを用いてインシトゥハイブリダイゼーションを行う 場合には、個々のプローブを別個に標識してそれらが蛍光により識別されるよう にすることもできる。例えば、１のプローブをビオチン−ＵＴＰで標識し、もう １つのプローブをジゴキシゲニン−ＵＴＰで標識することができる。前者のプロ ーブをＣｙ−３ストレプトアビジンで検出し、後者のプローブを抗ジゴキシゲニ ン−ＦＩＴＣで検出することができる。プローブは、容易に識別され計数される 間期細胞において鋭敏かつ厳密な蛍光シグナルを生じる。 胎児赤血球系細胞由来のＤＮＡに対する染色体特異的プローブのハイブリダイ ゼーションを、正常細胞由来のＤＮＡに対する同じプローブのハイブリダイゼー ション（正常対照）と比較することにより、染色体異常の診断を行う。例えば、 母親の細胞を正常対照として使用することができる。別法として、前以て確立さ れた正常対照を比較のために使用することもできる。胎児赤血球系細胞における 特定の染色体、例えば、通常には染色体２１、１８または１３についての３つの 蛍光シグナルを正常対照の同じ染色体についてのわずか２つの蛍光シグナルと比 較することにより、ありふれた染色体異常である三染色体性（特定染色体の３つ （２つではなく）のコピーが細胞中に存在する）を診断することができる。十分 な数のハイブリダイゼーションした細胞を試験して、細胞１個あたりに存在する 蛍光シグナル数について統計学的に有意な測定を行う。均等物 もはや日常的実験を行うことなく、当業者は、本明細書記載の発明の特別な具 体例に対する多くの均等物を認識するであろうし、あるいは確認することができ よう。かかる均等物は下記請求の範囲に包含されると思われる。Detailed Description of the Invention                 Culture and isolation of fetal cells from maternal peripheral bloodBackground of the Invention   All hematopoietic cells are derived from pluripotent stem cells, which under appropriate conditions Differentiate from one of these into several potential lineages. In one of these lines A line of erythroid cells leads to the production of red blood cells. Anucleated red blood cells or red blood cells Maturation progresses to the pluripotency due to the nature of pluripotent stem cells to become erythroid cell lineages Stem cells become erythroid progenitor cells, which are responsible for the signals received by developing cells. In response, further differentiation of the erythroid progenitor cells results in mature cells. Early red blood cells Lineage progenitor cells are blast forming unit-blast formin g unit-erythroid) (hereinafter referred to as BFU-E), which is more developed and Ripe erythroid progenitor colony forming unit-Erythroy It becomes a colony forming unit-erythroid (hereinafter referred to as CFU-E). Special CFU-E proliferates when stimulated by another growth factor, erythropoietin And nucleated red blood cells that are precursors of mature anucleated red blood cells (hereinafter referred to as nRBCs) Differentiate into. In adults, erythroid progenitor cells are mainly present in the bone marrow, In adults, hematopoiesis occurs there, and erythroid cell precursor cells circulate in the peripheral blood. do not do. For a review on the differentiation of erythroid cells, Beck, W. Beck, W.S., "Hematology 4th Edition" Massachusetts Cambridge, MI: MIT Press (5th Edition, 1991) Stomatonopoulos, G., "The Molecular Bed The Molecular Basis of Blood Disea Philadelphia, PA: W Bee Sounders (W) B. Saunders) (2nd edition, 1994), pp. 66-105.   The protein erythropoietin is a growth factor required for the development of erythroid cells. It is mainly produced by the kidney. Originally erythropoietin is poor Isolated and purified from blood patient urine (Miyake, T., et al., Journal. Of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) Volume 252, 5558- 5564 (1977)). More recently, erythropoietin is molecularly Cloned and characterized (Jacobs, K. et al., Nature) (Nature) Volume 313, 806-809 (1985); Lin, P. ) Et al., Proceedings of National Academy of Sciences Volume 82, 7580-7584, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1985)). To support the proliferation of erythroid progenitor cells in in vitro culture Erythropoietin has been used for. For example, human and adult red blood cells derived from bone marrow Fetal erythroid system from progenitor cells and umbilical tail blood or from fetal liver explants Progenitor cells can be isolated by incubating the cells in medium containing erythropoietin. Propagated in Russia (Sutherland, H.J.) and others , Blood, Vol. 74, pp. 1563-157 (1989); Boger, Vol. 15 (Bodger, M.P.), Exp. Hematol. 869-876 (1987); Peschle, A.R. et al. , Blood 58, 565-572 (1981)).   During pregnancy, cells of fetal origin appear in the mother's peripheral circulation. For review, Anki, D.W. and Klinger, K.W. linger, K.W.), Genetic Disorders and the Fetas: Pu Genetic Disorders and the Fetus: Pr evention and Treatment) 3rd Edition, Baltimore / London: The John Hopki The John Hopkins University Press (1) 922). These cells are related to the sex and genetic traits of the developing fetus A potential source of information. Detection of these fetal cells in maternal peripheral blood samples Separation and handling provide a non-invasive means for prenatal diagnosis and sex identification I do. However, the viability of such an approach is hindered by many factors. Have been. Most importantly, fetal cells are a very limited number in the mother's blood. Is absent or required to be enriched in the mixture of fetal and maternal cells. Yes, or somehow the fetal cells need to be separated from the mother's cells. One approach that has been used to effect fetal cell enrichment or isolation is It uses an antibody specific for a given fetal cell type. For example, fetal specific Use the body to permit flow cytometric separation of fetal cells from maternal components. Easy to use (Herzenberg, L.A.) et al. Losseedings of National Academy of Sciences You S.A. Vol. 76, pp. 1453-1455 (1979); Iverson, G. Iverson, G.M. et al., Prenatal Diagnosis Volume 1, pp. 61-73 (1981); Bianchi, D .W.) Et al., Prenatal Diagnostics Vol. 11, pp. 523-528 (1991). ). However, this approach requires very specific reagents, is costly and labor intensive. It may take. Using fetal cells derived from the mother's peripheral blood for diagnostic purposes Another limitation is that metaphase cells are preferred for analysis, Not all fetal cells in the circulatory system are dividing. .Summary of the invention   The present invention provides a pair for culturing and isolating fetal cells and in isolated fetal cells. A non-invasive method for the detection of quadratic nucleic acid sequences is provided. The present invention is at least partly Fetal cells, such as fetal progenitor cells, are present in the peripheral blood of pregnant women and cause Selectively growing in vitro by culturing the cells in the presence of the offspring Based on the knowledge that   In one embodiment, the invention provides for the culturing and isolation of fetal erythroid cells. For detecting a nucleic acid sequence of interest in isolated fetal erythroid cells Provide an intrusive method. The present invention is, at least in part, for fetal progenitor cells to be present in pregnant women. Cells present in peripheral blood in the presence of a cell growth factor, eg erythropoietin That it can be selectively grown in vitro by culturing based on. The method of the present invention can be used to obtain sufficient numbers of fetal cells for diagnostic use. Invasive methods that require specialized reagents such as monoclonal antibodies or flow cytometry It provides a method that does not require expensive equipment such as a tomometer. Erythroid cell expansion Of fetal erythroid progenitor cells in the presence of growth factors, such as erythropoietin , Proliferate and differentiate the cells into erythroid cells. Then isolate fetal erythroid cells And can be used for further analysis. The present invention is directed to a mother blood sample in a peripheral blood sample. Fetuses that are richer in fetal cells than in the vesicles and are more present than the total number in the original sample Enlarging the total number of cells and allowing the isolation of mitotically active cells Provide a way to do. This approach obtains fetal cells for further analysis It provides a simple, non-invasive means, so fetal erythroid progenitor cells derived from maternal peripheral blood. Being able to culture cells is of great value. The advantages of this approach are It is possible to isolate large numbers of fetal cells for analysis, It can be separated purely and economically from the mother's blood. Because this Cells are proliferating and allow isolation of metaphase fetal cells for diagnostic testing Because.   Therefore, the present invention provides a means to obtain fetal cells for analysis and diagnosis. , Cultivation and isolation of fetal erythroid cells from maternal peripheral blood samples. According to the method of the present invention, a peripheral blood sample of a mother is obtained, and erythroid progenitor cells are expanded to produce red blood cells. Containing erythroid cell growth factors, such as erythropoietin, that differentiate into lineage cells Culturing the cells in a medium, and then isolating the fetal erythroid cells . This method involves, at least in part: 1) fetal red blood cells in the mother's peripheral circulation. The presence of progenitor cells; 2) the maternal erythroid progenitor cells in the maternal peripheral circulation Absent; and 3) fetal erythroid rather than maternal erythroid progenitor cells. It is based on the higher sensitivity of progenitor cells to erythropoietin.   Prior to culture, peripheral blood samples are processed to remove certain cell types and / or Or certain cell types so that fewer cell numbers can be used in the culturing process. Can be enriched. For example, prior to culturing, selective lysis or density gradient centrifugation Anucleated red blood cells can be removed from the sample by cardiac separation. For example, different densities Perform double density gradient centrifugation using a gradient, then pre-culture erythroid progenitor cells Enrich the erythroid progenitor cells in the sample by isolating the cell layer containing Can be.   After culturing, the culture medium can be removed, for example by using a pipette to handle the cells. Red blood by picking up one or more individual cell colonies from Sphere cells can be isolated. The cells of the colony are then transferred to fresh medium, Either place it on a microscope slide for further analysis or use it as a source of DNA. Further analysis can be carried out by any suitable method.   Another aspect of the invention is the use of erythroid cell growth factors such as erythropoieti. Method for identification of fetal erythroid cells after culturing cells of a mother's peripheral blood sample in culture About. This method uses red blood cells as a means of identifying cells as of fetal origin. Detecting fetal cell markers on lineage cells. Further aspects of the invention Includes the detection of nucleic acid sequences of interest in fetal nucleic acids of fetal erythroid cells after culture. Cultivation Y-chromosome DNA in erythroid cell-derived DNA, a disease-causing mutation Detection of differentially associated genes, or chromosomal abnormalities, is all within the scope of the present invention.   The invention also relates to a method of isolating metaphase fetal cells from a maternal blood sample. . In this method, after culturing cells in erythropoietin, cells by cell cycle Expose cells to drugs that inhibit the progression of division or that synchronize cell growth . Metaphase cells can be detected microscopically and isolated. Then leave the metaphase cells Can be used for analytical and diagnostic tests.   Further, the present invention is directed to culturing fetal erythroid progenitor cells derived from a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman. By doing so, fetal cells derived from the current pregnancy are preferentially isolated in pregnant women. Provide a way to separate. This method uses a short lifespan of erythroid progenitor cells (approximately 3 months) and any fetal erythroid cells isolated after culture are It must be from the present fetus rather than from any previous fetus.Brief description of the drawings   Figure 1 shows the relative distribution of erythroid progenitor cells and nucleated red blood cells along the density gradient. It is a scheme-like diagram shown.   FIG. 2 shows CFU growing in methylcellulose medium containing erythropoietin. -A photograph of an E colony.   Figure 3 shows early B growing in erythropoietin-containing methylcellulose medium. It is a photograph of a FU-E colony.Detailed description of the invention   The present invention relates to a method for culturing fetal cells derived from a mother peripheral blood sample. The method comprises: Obtain a peripheral blood sample from a pregnant woman and then culture the cells in the sample in a growth factor-containing medium It includes doing. Fetal cells are isolated from the culture medium and the nucleic acid sequence of interest is transformed into fetal DNA. To detect.   In one embodiment, the invention relates to fetal erythroid cell lines derived from a maternal peripheral blood sample. Cell culture method. The method involves proliferating fetal erythroid progenitor cells to produce fetal red blood cells. Contains erythroid cell growth factors, such as erythropoietin, that differentiate into sphere cells Fetal erythroid progenitor cells present in blood samples in vitro in a culture medium It is included. After culturing, fetal erythroid cells can be isolated. One In a specific example, the method of the present invention involves obtaining a peripheral blood sample from a pregnant woman and performing erythroid cell proliferation. Culturing cells in peripheral blood samples in medium containing factors such as erythropoietin And then isolating fetal erythroid cells from the medium.   The term "peripheral blood sample from a pregnant woman" also means a mother's blood sample, which is a pregnant fetus. Obtained (eg, by injection) from a peripheral blood source (eg, from a vein in the arm) from a woman Blood sample). Prior to use in the method of the invention, heparin The peripheral blood sample can be treated with an agent that suppresses blood coagulation. Preferably, the end Topical blood samples contain approximately 5-20 ml of blood. More preferably, the sample is about 10 m It contains 1 blood. Samples may be obtained at around 6 weeks of gestation, or 3 times for the second time. It may be obtained around the middle of the month, but is preferably obtained between about 8 and 16 weeks of gestation. You. Most preferably, the sample is obtained at about 12 weeks gestation. Fetal blood at 12 weeks gestation There are about 50,000 nRBCs per milliliter of circulating blood in the fluid, By the 20th week of pregnancy, there are only about 1000 blood cells per milliliter of fetal blood. It is known to disappear (Holzgreve, W.) , The Journal of Reproducible Medicine Inductive Medicine) 37: 410-418 (1992)).   The term "culturing cells" in the term "medium" generally refers to a medium suitable for the survival of cells. Contact the cells and incubate the cells in the medium under conditions suitable for the survival of the cells for a certain period of time. Aptation to allow cells to proliferate and possibly differentiate. The term "medium "Is a liquid that allows the survival and proliferation of fetal cells, eg, erythroid progenitor cells. Alternatively, it includes a semi-solid solution or material. Generally, a suitable medium is charcoalized Found in nutrient sources (eg sugar), serum (eg fetal bovine serum) Common growth factors as well as supplemented amino acids such as L-glutamine. No acid is contained. The medium should contain antibiotics such as penicillin and streptomycin. Quality, reducing agents (eg 2-mercaptoethanol), additional proteins (eg Serum albumin), buffering agents (eg sodium bicarbonate) and / or A pH indicator (eg, phenol red) may be included. In general, culture The conditions suitable for the survival of the mammalian cells inside are 37 ° C, 4% to 5% CO2It is. Cultivation The length of the incubation period depends on the desired cell number (ie, the degree of proliferation necessary to obtain the desired cell number. ) And / or is altered by the desired cell differentiation, but is generally at least about 48 hours. Preferably, the cells are cultured for about 4 days. More preferably cells Are cultured for about 6 days.   In a preferred embodiment, the medium further comprises a semi-solid matrix material. The term "semi-solid matrix material", when added to a liquid medium, depletes the liquid medium. It includes substances that transform into a latin semi-solid state. Semi-solid medium is still a cell Grows (ie, is not stiff to the extent that it does not inhibit cell growth), but A medium in which isolated cells cannot move from the growth position. More semi-solid matrix materials Attaching growing cells to the matrix material, thereby allowing the cells in the medium to Prevent the movement of. The growth of single cells in semi-solid medium is It gives rise to individual cell colonies that result from rupture. By light microscopy examination of semi-solid medium One cell colony can be distinguished from other cell colonies. Suitable semi-solid Body matrix includes methylcellulose, agar gel and plasma clot . For example, Stephenson, J.R. et al., Proceedy Kings of National Academy of Sciences USA 68, 1542-1546 (1971); Iscove, N. N.N.) et al., Journal of Cell Physiology (J. Cell Physiol.) No. 8 3, 309-320 (1974); and Pike, B.L. ) And Robinson, W.A., Journal of Sell. See Physiology Vol. 76, p. 77 (1970).   The preferred medium for separating fetal cells from a maternal blood sample is 1.1% methyl. Cellulose, 30% fetal bovine serum, 1% BSA, 1% penicillin-strept Mycin, 1% L-glutamine, 10-FourAdd 2-mercaptoethanol from M Iscove's Modified Dulbecco's Medium ( IMDM; commercially available product; Whitaker Sigma) . Preferred culture conditions are 37 ° C., 4% to 5% CO2About 96 hours of cell ink It is a tubation. Typically a culture dish or culture flask Incubate the cells in a suitable container for the medium.   The medium in which the cells of the maternal blood sample are cultured also contains cell growth factors. the term" "Cell growth factor" includes factors that stimulate the growth or differentiation of fetal cells. Cell expansion Examples of replication factors are: factors that stimulate the differentiation of lymphocyte progenitor cells, such as interleukins. Kin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4) and interlo Ikin-7 (IL-7), and factors that stimulate hematopoietic progenitor cells, such as hematopoietic cells. Cell growth factor (including erythroid cell growth factor), such as interleukin-3 (I L-3), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), monocyte- Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), erythropoietin (EPO), and human recombinant stem cell factor Child (rhSCF) included.   The medium in which the cells in the mother's blood sample are cultured contains erythroid cell growth factor. May be. The term "erythroid cell growth factor" refers to the growth and growth of human / erythroid progenitor cells. And factors that support growth. Examples are: Erythropoietin (EPO), and And burst promoting activity (BPA). These erythroid cell growth factors alone Or in combination with each other.   The term "erythropoietin" supports the growth and proliferation of human erythroid progenitor cells. Included are preparations of the protein erythropoietin possessed. Erythropo from natural sources Erythropoietin may be prepared by purification of the ethine protein, or recombinant Erythropoietin was prepared by expression of erythropoietin gene by DNA method May be. Using a crude preparation of erythropoietin isolated from human urine Available and commercially available from Sigma (catalog number E5011, 50 U / mg). Other commercial preparations are Sigma E9761 (human recombinant; 100000 U / mg), E9757 (derived from human / urine; 80000 U / ml), E2639 ( Human / urine-derived; 500 V / mg) and E2514 (human / urine-derived; 100 U / mg). Preferably, the erythropoietin is of human origin, Erythropoietin from another species capable of supporting proliferation and differentiation of erythroid progenitor cells May be used. For example, human and mouse cells are both sheep or human. Stimulated by erythropoietin (Isukab, N.N. et al., Journal (See Of Cell Physiology Vol. 83, 309-320 (1974)). . Sufficient concentration to obtain desired erythroid progenitor cell proliferation and / or differentiation results Erythropoietin is used. The preferred concentration range of erythropoietin in the medium is It is about 0.25 U / ml to 1 U / ml.   Erythropoietic progenitor cells exposed to erythropoietin in culture are stimulated to proliferate. Will differentiate. For many reasons, erythropoietin is derived from maternal blood samples. It preferentially stimulates the proliferation and differentiation of fetal erythroid progenitor cells in native cells. First In addition, fetal erythroid progenitor cells derived from human / fetal liver are erythroid cells derived from human / adult. Has been shown to be more sensitive to the stimulatory effects of erythropoietin than progenitor cells (Peschle, C.) et al., Blood, Volume 58, 565 Pp. 572 (1981)). Second, the erythropoietin concentration used (eg, , 0.25 U / ml to 1 U / ml) is the optimum stimulating concentration of adult erythroid progenitor cells. Lower than (2-4 U / ml) (Linch et al. Blood 59, 97 6 ~ Pp. 979 (1982)). Finally, erythroid progenitor cells in humans and adults Is found almost exclusively in the bone marrow, the site of adult hematopoiesis, and therefore, if Few maternal erythroid progenitor cells, if present, should be present in maternal peripheral blood It is.   Two types of fetal erythroid progenitor cells respond to the stimulatory effects of erythropoietin sell. They are: mature or late BFU-E (hereinafter referred to as M-BFU-E). And CFU-E. Due to their morphology that can be examined under a microscope, M -BFU-E and CFU-E derived colonies can be distinguished from each other, Furthermore, it can be distinguished from other cell types. BFU-E-derived colonies are It usually contains 100 or more cells, can contain thousands of cells, Arranged in a "burst" or scattered pattern. Colonies derived from CFU-E -About 20 to 150 arranged in smaller and more compact colonies Including cells. CFU-E derived colonies mature at the beginning of the culture for 1 week, BFU-E derived colonies require a long time to develop. In addition, CFU-E Native colonies mature and differentiate to form erythroid cells such as nucleated erythroblasts And show visible hemoglobin formation identifiable microscopically.   Cells in a medium containing an erythroid cell growth factor, such as erythropoietin. After culturing, erythroid cells are isolated from the medium. The term "isolated" refers to other cells and And / or separation of one or more cells or cell colonies from the medium Say. Cells are grown at a sufficiently low density in semi-solid medium to allow for the identification of When forming ronnies, these cell colonies are already present in other cells in the semi-solid medium. Is isolated from the cell. Cells or cell colonies by taking cells from the medium Can be further isolated. For example, examining the culture under a light microscope To identify individual cell colonies by Can be taken from Aspiration Pasteur pipette or other suitable pipette It is possible to efficiently take out cells and handle the cells using a device such as this. An example For example, if the cells were separated from the medium by pipetting, retain the cells. Vessel (eg, test tube), solid support (eg, microscope slide), fresh medium, or Or other cells suitable for further growth, handling or analysis. it can. In a preferred embodiment, a single colony of cells is taken from the medium and Transfer to slide.   The term "fetal cells" includes fetal cells present in the peripheral blood of the mother. Fetal cells are mature cells, such as granules, after incubation with cell growth factors. It includes fetal progenitor cells that can differentiate into spheres, monocytes or leukocytes. For example, fetal phosphorus Papillary progenitor cells were cultured with IL-2, IL-7 or IL-4 to mature T or Can be differentiated into B-lymphocytes. G-CSF and / or GM-C Differentiate into mature granulocytes by culturing other fetal progenitor cells with factors such as SF be able to.   The term "erythroid cells" refers to erythroid cell growth factors such as erythropoietin. It includes cells derived from erythroid progenitor cells by being co-cultured. Red Culture erythroid progenitor cells with hematopoietic cell growth factors, such as erythropoietin. Feeding causes the progenitor cells to differentiate into the developmental stages of the more mature erythroid lineage. Therefore, the cells that exist after culturing are the cells that are in different stages of erythroid development. It may be a mixture of ips. Cells in different stages of erythroid development are It may be morphologically different. For BFU-E and CFU-E colonies Sometimes cells or colonies of cells having the morphology of erythroid progenitor cells, or nucleated A more developed red containing cells with visible hemoglobin formation such as erythroblasts Hematopoietic cells are erythroid cells in erythroid cell growth factors such as erythropoietin. It can be detected after culturing the progenitor cells and isolated from the medium.   Prior to culturing cells from a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman, one or more of the The sample can be treated to enrich for the above types of cells. Mother's blood Samples include lymphocytes, monocytes, granulocytes, and potentially fetal cells such as red blood cells. It contains both nucleated cells, such as lineage progenitor cells, and anucleated mature red blood cells. Seedless Mature red blood cells make up the majority of cells in peripheral blood samples, and these cells are sampled before culturing. Is often desirable. To obtain a sample enriched in nucleated cells before enrichment The percentage of nucleated cells present in the peripheral blood sample versus the nucleated cells present in the peripheral blood sample. The proportion of cells can be increased. Then culture the sample enriched with nucleated cells Used for The term “percentage of nucleated cells” refers to all cells in a sample, ie nucleated and It refers to the percentage of nucleated cells with respect to the number of anucleated cells. The term "before enrichment .. "Increased relative to the proportion present in ...." means the percentage of nucleated cells present in the sample. Is more abundant than the percentage of nucleated cells present in the sample prior to enrichment It means that it is large after the chemical treatment. By removing the anucleated cells from the sample And / or by separating nucleated cells from anucleated cells, Percentage of nucleated cells in a sample such as peripheral blood containing both cells and anucleated cells Can be increased relative to the starting sample. Term "Sample enriched with nucleated cells Is present in the maternal blood sample before the enrichment procedure for the percentage of nucleated cells in the sample. The sample obtained from the mother's blood sample that is increasing relative to the percentage present Include.   In one specific example, the non-nucleated cells are separated from the nucleated cells in a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman. Upon separation, a sample enriched with nucleated cells is obtained. The term “separation” refers to Means to isolate cells and nucleated cells from each other. By density gradient centrifugation, Anucleated cells can be separated from nucleated cells. The term "density gradient centrifugation" Centrifuge a cell mixture, for example, cells of a blood sample, in a container such as a centrifuge tube. Separate and pass specific substances of specific density to form layers containing different cell types The method of making Under centrifugation conditions, the cells are It moves through a density gradient material as a function of degree. Therefore, using density gradient centrifugation Thus, cells can be separated based on differences in cell size and density. Seedless Since red blood cells have a different size and density than nucleated cells, density gradient centrifugation Can be separated from nucleated cells. Anucleated cells and nucleated cells by density gradient centrifugation Several substances suitable for separating and are commercially available. These are Fiko Ficoll (made by Pharmacia of Uppsala, Sweden), Histopaque (Sigma, St. Louis, MO) , Nycodenz (Nycome Pharma, Oslo, Norway) d Pharma); commercially available from Gibco BRL in the United States), Le Polymorphprep (Nikomed Pharma, Oslo, Norway; Commercially available from Gibco BRL in the United States). Appropriate centrifugation speed and time Determined by the manufacturer. Generally, a suitable centrifugation speed and time is 400 ~ 500g for 20-35 minutes at room temperature.   After centrifugation, the material blood sample is typically separated into at least three layers. The three layers Is a supernatant layer containing serum and plasma plates; a mononuclear cell layer; It is the agglomerated pellets contained. 1 containing nucleated cells and lacking most of the anucleated red blood cells Or more cell layers (eg, mononuclear cell layers) are taken from the gradient to nucleate Obtain a sample enriched in cells.   In another embodiment, the anucleated cells are nucleated by selective lysis of the anucleated cells. Can be separated from the cell. The term "selective lysis" refers to other cell types, such as , Refers to the preferential destruction of one cell type relative to nucleated cells, eg, anucleated cells. Existence Are known to be effective and are commonly used in the lysis of anucleated red blood cells. One of the hypotonic buffers, eg 0.17M HNFourCl, 0.01M Tris, Cells in maternal blood samples can be incubated in pH 7.3 (For example, Tiilikainen et al., Transplantation (T ransplantation 17: 355 (1974) and Macera et al. , Leukemia Research, Vol. 13, 729-734. (1989)). Also, buffers suitable for this purpose are commercially available ( For example, GenTrak's “Ryse and Fix” d Fix)). Incubate in an appropriate buffer suitable for selective lysis of anucleated cells After the incubation, the cell sample obtained is a sample enriched with nucleated cells.   In a preferred embodiment, fetal cells in the sample, such as fetal erythroid progenitor cells. Treat the mother's blood sample before culturing in order to enrich it. In the peripheral blood sample The percentage of fetal cells present, such as fetal erythroid progenitor cells, is To produce a sample enriched in fetal erythroid progenitor cells in peripheral blood prior to enrichment To increase the proportion of existing fetal cells, eg fetal erythroid progenitor cells Can be. The sample enriched in fetal cells is then used for culture. The term "fetal details Vesicle, For example, "percentage of erythroid progenitor cells" refers to all cells in the sample, i.e. nucleated cells. And the percentage of fetal cells to the number of anucleated cells. The term "Before Enrichment .. .... increase relative to the percentage present is the percentage of nucleated cells present in the sample Enriched more than the percentage of nucleated cells present in the pre-enrichment sample It means large after processing. Other cell types, such as anucleated cells and And / or other types of nucleated cells from the sample, and / or specific Types of cells, such as erythroid progenitor cells, and anucleated cells and other types of nucleated cells. By separating it from the vesicles in a sample such as peripheral blood containing other cell types. The percentage of starting cells of a certain type of fetal cells, eg erythroid progenitor cells Can be increased against. The term “fetal cells, eg erythroid progenitor cells A “enriched sample” refers to a fetal cell, eg, an erythroid precursor present in the sample. Vesicles increased relative to the percentage present in the mother's blood sample before enrichment. Including samples derived from a mother's blood sample.   Due to differences in cell size and density of selected cell types and other cell types Based on density gradient centrifugation, specific types of fetal cells, such as Carcinoma cells can be anucleated cells such as mature red blood cells and other types of nucleated cells such as It can be separated from lymphocytes and mononuclear cells. In the specific example of 1, “2 Heavy density gradient centrifugation "is performed. The term "dual density gradient centrifugation" refers to cell mixtures, For example, put cells of a blood sample in a container such as a centrifuge tube, Or through different substances to form layers containing different cell types, or Alternatively, centrifuge the cell mixture through a density of 1 material and Takes more layers, and the taken cells are treated with a second substance (preferably, the first substance is Centrifuge through different densities) to form a layer containing different cell types Methods. Gradient material described for single-layer density gradient centrifugation ( For example, using Ficoll, Histopark, Nicodenz, Polymorph Prep) Double density gradient centrifugation can be performed.   Polymorph Prep (Nikomed; Gibco BRL Catalog No. 100-1971) Fetal cells, eg erythroid progenitor cells, are enriched by density gradient centrifugation using The sample can be obtained. Undiluted anticoagulated maternal blood Centrifuge the whole blood of the sample through a gradient material to separate the following layers (on the tube Down): a supernatant layer containing serum and platelets; lymphocytes and monocytes Containing mononuclear cell layer (“buffycoat”); polymorphonuclear leukocytes, nucleated red A polymorphonuclear cell layer comprising blood cells and erythroid progenitor cells; and an anucleated red blood cell pellet. It is possible to take a polymorphonuclear cell layer and obtain a sample enriched in fetal erythroid progenitor cells. Wear.   In addition, using a two-layer density gradient centrifugation with Histopark, the red dish sphere precursor A sample enriched in vesicles can be obtained. 1: 1 in phosphate buffered saline Diluted maternal blood sample on Histopark 1119 (density = 1.119) Double dense consisting of layered Histopark 1077 (density = 1.077 g / ml) Centrifuge through a gradient to form the following layers (tube top to bottom): Supernatant layer; mononuclear cell layer (“buffy coat”); gradients 1.077 and 1.11 A nucleated red blood cell layer comprising erythroid progenitor cells at the interface with 9; and an anucleated red blood cell pellet And It is possible to take the nucleated red blood cell layer and obtain a sample enriched in erythroid progenitor cells it can. Further, as described in Example 1, Histopark 1077 and 111. 9 was used continuously to enrich for fetal cells, eg, fetal erythroid progenitor cells. You can get a fee.   Cell layers are always separated and identified when performing single or two-layer density gradient centrifugation Not always possible. Therefore, it takes several different layers of cells, fetal cells, eg For example, to confirm that the erythroid progenitor cells were selected correctly and for comparison purposes , Containing cell growth factors such as erythroid cell growth factors such as erythropoietin May be cultured separately in different media (i.e. other cell layers may serve as controls) ).   Others removing anucleated cells and / or other cell types from a maternal blood sample Method, or other methods of enriching erythroid progenitor cells, using fetal cells, eg For example, a sample enriched with fetal erythroid progenitor cells can be obtained. For example, Using an antibody specific for a cell surface marker present on a particular cell type, maternal Specific cell types in blood samples can be removed or enriched. Selected Fetal cells, for example, fetal erythroid progenitor cells, are used to detect, for example, Red blood cells by low cytometry, panning or immunomagnetic separation Lineage progenitor cells can be selected (aggressive cell selection). Alternatively, select Using antibodies specific for markers present on cell types other than fetal cells , Eg, flow cytometry, panning or immunomagnetic separation By (passive cell selection) or complement-mediated binding of antibody to the antibody. Cell lysis can remove certain cell types from maternal blood samples .   Cell growth factors, such as erythroid cell growth factors, such as erythropoietin. Mother's blood sample, nucleated cell-enriched sample or fetal cell in culture medium. Culturing a sample enriched in cells, for example erythroid progenitor cells, preferably results in Fetal cell colonies are obtained (for example, the absence of material erythroid progenitor cells in peripheral blood). Because of the high sensitivity of fetal erythroid progenitor cells to the foot and erythropoietin), Identifying erythroid cells or cell colonies morphologically as fetal Can not. Therefore, the method of the present invention is used to identify fetal cells from the fetus. Further consists in detecting fetal cell markers on or in fetal cells. You may The term "fetal cell marker" distinguishes fetal cells from maternal cells Cell surfaces present on or in fetal cells, which can be used to Includes cytoplasmic or nuclear structures or molecules.   The term "detect fetal cell marker" refers to the detection of the fetal cell marker itself or Includes detection of another molecule that binds to a fetal cell marker. For example, cells or Of a fetus by contacting a portion of the Cellular markers can be detected on or in fetal cells. Antibody It may be labeled with a detectable substance, or another molecule, eg a first antibody. React further with a second antibody that is labeled with a detectable substance that reacts with be able to. Suitable detectable substances are enzymes, prosthetic groups, fluorescent substances, luminescent substances And radioactive materials. An example of a suitable enzyme is horseradish peroxy. Or biotin, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or Examples include suitable enzyme / prosthetic group complexes including acetylcholinesterase; Includes treptavidin and biotin; examples of suitable fluorophores include umbellifero , Fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorine Lotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythri Examples of luminescent materials include luminol; examples of suitable radioactive materials include12 Five I,131I,35S orThreeIncludes H. Using standard immunohistochemical methods, Antibody to fetal cell marker can be used to detect fetal cell marker expression it can.   Expressed preferentially or exclusively on or in fetal cells as compared to maternal cells The resulting protein can be used as a fetal cell marker. Can be used to detect. Suitable that can be used as a fetal cell marker Proteins are fetal hemoglobin and fetal histone protein H01 is included. To the fetus Moglobin is a cytoplasmic protein, but fetal H01 is a nuclear protein. In addition, the fetus red Fetal antigenic determinants that are preferentially or exclusively expressed on or in blood cells It can be used as a cell marker. Use as fetal cell marker An example of a suitable antigenic determinant that can be is the i antigenic determinant. i antigen determinant is fetal red blood It is an unbranched membrane carbohydrate that is present on sphere cells. Generally, adult red Blood cells do not express i, but rather the branched carbohydrate I antigenic determinant.   Another example of fetal cell markers is that fetal cells have a unique nucleic acid sequence compared to maternal cells. Includes columns. In the case of fetal cells derived from a male fetus, an example of a unique nucleic acid sequence is Y staining. Chromosomal DNA and polymorphic alleles such as parental polymorphisms or HLA antigen aryls DNA containing the same.   After culturing and isolating fetal cells, the method of the present invention further comprises isolated fetal cells, such as Detecting the nucleic acid sequence of interest in the fetal nucleic acid of fetal erythroid cells. the term" "Nucleic acid sequence of interest" is DNA, such as chromosomal DNA, or chromosomal DNA or A specific gene fragment contained in one amplified from chromosomal DNA, and It includes RNA such as mRNA or nuclear RNA. The term "fetal nucleic acid" refers to a fetus Includes infant DNA and RNA, such as fetal chromosomal DNA and fetal mRNA You. To identify fetal cells from the fetus (ie, fetal nucleic acid Cell Can be a marker), and further analyzes such as sex determination of the fetus, genetic disease in the fetus. Nucleic acid in fetal cells was used to detect disease and chromosomal aberrations in the fetus. Detection of the target nucleic acid can be used. For diagnostic or other purposes Fetal nucleic acid in fetal cells cultured and isolated as described in the detailed description Can be analyzed.   Treat fetal cells cultured so that fetal nucleic acids present in the cells can be used for detection. Can be managed. For example, by enzymatically amplifying the nucleic acid of interest, and / Or by hybridizing the labeled nucleic acid probe to the nucleic acid sequence of interest, The nucleic acid sequence of interest can be detected in the available fetal nucleic acid. Target nucleic acid distribution Labeled probes used to detect rows include, for example, labeled DNA probes, labeled R It may be a NA probe or a labeled oligonucleotide. Boil fetal cells Fetal DNA is made available by lysing them, thereby allowing, for example, fetal DNA. Fetal DNA can be released prior to amplification of the infant DNA. For example, insit Fetal erythroid cells or erythroid cells prior to in situ hybridization By fixing the cell nuclei to a microscope slide, the fetal cells are transferred to a solid support, such as Fetal nucleic acids can be made available by attaching them to microscope slides. For example In situ hybridization of labeled nucleic acid probe complementary to the target nucleic acid sequence Direct detection of fetal nucleic acids in fetal cells or parts of them (eg nuclei) Prior to detection, such as polymerase chain reaction (PCR) Fetal nucleic acids can be amplified using known amplification methods. Object D in fetal DNA A PCR amplification primer that specifically amplifies the NA sequence is selected.   The nucleic acid sequence to be detected in the fetal nucleic acid of fetal erythroid cells is herein referred to as " The target nucleic acid sequence ". In one embodiment, the nucleic acid sequence of interest is the Y chromosome DNA sequence. It is a column. The term "Y chromosomal DNA sequence" is unique to the Y chromosome that contains repetitive sequences. The nucleotide sequence of Detection of fetal cell markers and determination of fetal sex Y chromosome DNA sequencing can be used for both.   In another embodiment, the nucleic acid sequence of interest is associated with a disease-causing mutation. This is the sequence of the gene. The term "a sequence of genes associated with a disease-causing mutation" , A gene that may cause a disease or contain a mutation associated with a disease, Or genes that may cause disease or contain mutations associated with disease It includes nucleic acid sequences that include all or part of the linked genes. Ie detected Gene sequence linked to the detected or detected gene sequence has mutations. If present, may contain mutations that cause or are associated with the disease. is there. Detection of such sequences can be used to detect diseases or diseases caused by mutations in the fetus. It can be investigated whether or not it has a disease associated with the mutation.   In yet another embodiment, the nucleic acid sequence of interest detects chromosomal abnormalities. for The term "detecting chromosomal abnormalities" refers to changes in the number of chromosomes, chromosomal deletions, chromosomal transfers and / or Alternatively, it includes a nucleotide sequence capable of detecting chromosomal alteration. Detects chromosomal abnormality Possible target nucleic acid sequences are, for example, specific sequences such as repetitive sequences derived from specific chromosomes. It may be a specific nucleic acid sequence of the chromosome. Tested for detection of chromosomal abnormalities Preferred chromosomes include chromosomes 13, 18, 21, X and Y. these Chromosomal trisomy is most common for a particular chromosome of. In a standard way A nucleic acid probe more suitable for detecting chromosomal abnormalities can be prepared. For example , Klinger, K. et al., American Journal of Hughes Man Genetics (Am.J.Hum.Genet.) 51: 55-65 (1992) Year).   In one embodiment, the fetal cells are fetal by in situ hybridization. The target nucleic acid is detected in the infant nucleic acid. Using in situ hybridization Can detect chromosomal DNA and cytoplasmic mRNA. example For example, Lichter, P. et al. Human Genetics (Hum.Genet. ) 80, 224-234 (1988) and Singer et al. See U.S. Pat. No. 4,888,278 issued. In-situ hybridization Fetal cells should be separated on a solid support such as a microscope slide when performing Make fetal nucleic acid available for detection. More details will be described in Example 3. In situ hybridization can be used, for example, to isolate Y in fetal DNA. Chromosomal-specific sequences can be detected to determine fetal sex. According to Example 5 R Using in situ hybridization, as described in detail, In fetuses containing chromosomal aneuploidy, such as sex, or chromosomal transfer or deletion Chromosomal abnormalities can be evaluated.   In another embodiment, the fetal DNA is enzymatically treated prior to detection of the nucleic acid sequence of interest. Amplify. The fetal DNA was subjected to PCR as described in more detail in Example 4. It can be amplified more. When performing amplification, fetal erythroid cells are lysed by boiling. And then a suitable number of denaturations and anneals (eg, about 24 The fetal DNA can be amplified in a cycle of ~ 60). Control samples are false positives Includes tubes without added DNA to monitor amplification. Correct PCR condition Can be modified to amplify more than one fetal gene simultaneously. "Ma Known as "multiplex," this method 6 sets of diagnostic tools for diagnosis of strophy (Duchenne's Muscular Dystrophy) Used with Limer (Chamber Rain, Jay S ain, J.S.) et al., Prenat. Diagnosis, Vol. 9, 34 9-355 (1989)). When performing amplification, the obtained amplification product is Sequences (ie, DNA whose presence is detected and / or quantified) and other It contains amplified fetal DNA consisting of a DNA sequence. Known methods, such as Gel electrophoresis to analyze the amplified fetal subject DNA sequences and other DNA sequences. Can be separated. Digestion with restriction endonuclease, ethidium bromide staining Ultraviolet visualization of gelose gel, DNA sequencing, or labeled DNA probe Hybridization with a specific oligonucleotide probe (such as Iki, R.K. et al., American Journal of Hughes Man Genetics Vol. 43 (supplement): A35 (1988)) The method can be used to subsequently analyze the amplified DNA. Aryl-specific configuration Amplification of a row and hybridization to it results in amplified "mother's" To determine whether polymorphic differences exist between the sample and the "fetal" sample In addition, female fetuses can be identified based on the detection of paternal polymorphisms in fetal DNA. The hybridization can be used to determine. Fetus A paternally derived DNA sequence can be identified on the autosomal chromosome of. I Therefore, using the method of the present invention, female fetus cells as well as male fetuses can be obtained from mother's blood. The cells can be separated and identified. Therefore, other methods such as amniocentesis are currently used. The method of the invention can be used in all nucleic acid based diagnostic procedures that have been performed. it can.   After amplification, the amplification mixture can be separated based on the size of the nucleic acid fragments. Then, the fetal nucleic acid separated according to the obtained size is appropriately selected with a nucleic acid probe or Probe (fetal nucleic acid that is sufficiently complementary to the Nucleic acid which hybridizes to the nucleic acid sequence of interest therein). General Typically, the nucleic acid probe is labeled (eg, radioactive material, fluorophore or other With a detectable substance). Fetal nucleic acids separated by size and selected nucleic acid probes At a temperature sufficient for hybridization of complementary nucleic acid sequences to occur. After maintaining for a time to generate the fetal nucleic acid / nucleic acid probe complex, using known methods Detection of the complex is performed. For example, if the probe is labeled, fetal nucleic acid / label The nucleic acid probe complex can be detected and / or quantified (eg, Radiography, detection of fluorescent labels). Standard curve (ie detected The relationship previously investigated between the amount of label present and the amount of nucleic acid present). The amount of labeled complex (and the amount of fetal nucleic acid) can be determined.   The fetal DNA / label is then labeled using known methods such as autoradiography. Detect the probe complex. Nucleic acid probe complementary to target nucleic acid and fetal DNA Presence of the target nucleic acid sequence The amount of fetal DNA can be investigated. The results were obtained from a mother's blood sample Qualitative or quantitative evaluation of fetal DNA. Have mutations that cause disease For many potential genes, the presence of disease-causing mutations in the gene Probes are available that detect the polymorphisms of the restriction sites shown. For the target disease Such restriction sites in fetal DNA using nucleic acid probes specific for related genes Of polymorphism in the fetal DNA has a mutation in the gene, and Is shown.   The presence of fetal nucleic acid associated with a disease or condition can be detected and / or detected by the method of the invention. Or it can be quantified. For example, the probe St14 (Ober, Eye (Obe rle, I.) et al., New England Journal of Medicine (NewEngl. J. Med.) 312, 682-686 (1985)), 49a (Guerin, Guerin, P. et al., Nucleic Acids Res .) Vol. 16, pp. 7559 (1988)), KM-19 (Gasparini, P. ( Gasparini, P.) et al., Prenatal Diagnostics Vol. 9, 349-355 (1 989)), or a deficiency in the Dusien muscular dystrophy (DMD) gene. Losing exons (Chamber Rain, Jay S, et al., Nucleic Acid Research, Vol. 16, pp. 11141-11156 (1988)). The sequence is used as a probe. St14 is the DNA of the female fetus from the DNA of the mother A long arm of the X chromosome that can be used to identify Is a polymorphic sequence of. It maps near the gene for Factor VIII: C Therefore, it can be used for prenatal diagnosis of hemophilia A. In the DMD gene With the primers corresponding to the sequences flanking the 6 most commonly deleted exons Therefore, use the primers that are successfully used for the diagnosis of DMD by PCR You can also do it (Chamber Rain, JS, Nucleic Acids Research Vol. 16, pp. 11141-11156 (1988)). In the method of the present invention Other conditions that may be more diagnosed are cystic fibrosis (Newton, Shear). Newton, C.R., et al., Lancet Volume 2, pp. 4881-1483 ( 1989)); β-Mediterranean anemia (Cai, S-P., Et al., Brad. (Blood) 73: 372-374 (1989); Kai, SP et al. Merikan Journal of Human Genetics (Am.J.Hum.Genet. ) Vol. 45: 112-114 (1989); Saiki, R .K.) Et al., New England Journal of Medicine, Volume 319, 537-541 (1988), sickle cell anemia (Saiki, Earl Kay et al., New England Journal of Medicine, Volume 319, 537-5 41 (1988), Phenylketonuria (Dillera, Ai Ji) -(DiLella, A.G.) et al., Lancet Volume 1, 497-499 (1988)) . A suitable probe (for use in the method of the present invention for the evaluation of each condition) Alternatively, multiple probes) can be utilized (eg, PCT application WO 91/0766). 0).   In another embodiment, the invention relates to a midterm fetus from a peripheral blood sample from a pregnant woman. The present invention relates to a method for isolating infant erythroid cells. The method involves obtaining a peripheral blood sample from a pregnant woman and Peripheral blood tests in media containing hematopoietic cell growth factors, such as erythropoietin The cells in culture are cultured to prevent the dividing cells from undergoing the cell cycle or to be disrupted. Exposure of cultured cells to agents that synchronize cell growth and isolation of metaphase fetal erythroid cells It includes doing. Inhibits or regulates the division of cells in the cell cycle Agents that synchronize cell growth are known in the art and include colcemid, col Includes hytin and vinblastine salts. Drugs that synchronize cell growth are Known in the field, bromodeoxyuridine, fluorodeoxyuridine And ethidium bromide. After cell culture, use standard methods to Red can be prepared and used for further analysis (Example 2 reference).   In another embodiment, the present invention relates to the present invention in peripheral blood samples from pregnant women. A method of preferential isolation of fetal cells from pregnancy is provided. The method is from a pregnant woman Obtaining a peripheral blood sample containing erythroid cell growth factors such as erythropoietin Culturing the cells in the peripheral blood sample in the following medium and then isolating the fetal erythroid cells It consists of isolating fetal cells from the current pregnancy. The term "maternal pregnant woman" Pregnant women who have had one or more pregnancies in addition to their current pregnancies. This method , Based on the short lifespan of erythroid progenitor cells (Beck, W W.S.), Hematology, 5th Edition, MIT Press: Cambridge, Mass. (1991)). Life of erythroid progenitor cells Since the lifespan of life-producing erythroid progenitor cells is about 3 months, it was obtained from peripheral blood samples of multipartum pregnant women. The cultured fetal erythroid cells will be from the present fetus rather than from the previous fetus. This indicates the isolation of another long-lived fetal cell type that may be present in the maternal blood sample. To The advantage of isolating fetal erythroid cells is superior. For example, fetal lymphocytes Although it is present in the mother's peripheral blood, lymphocytes can survive in the peripheral blood for several years. Schroder et al., Transplantation No. 1 7, 346 (1974); Ciaranfi et al., Schweizer. Riche Medicinisch Bochenschrift (Schweizerische Medizin ische Wochenschrift) 107, 134-138 (1977)). Yo Fetal lymphocytes found in blood samples from mothers of pregnant women were Or from a previous fetus, sex identification and / or current fetus Make the diagnosis of.   The present invention will be further described by the following examples, which are considered to be limited. should not be done. All references and publications cited throughout this application The contents of the granted patents and patent applications are also incorporated herein by reference. To be considered.Example 1   Culture of erythroid progenitor cells from peripheral blood samples obtained from pregnant women   In this example, erythroid progenitor cells from a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman were cultured. did. First, the peripheral blood sample is subjected to density gradient centrifugation (single layer or two layers) to obtain peripheral blood. Removes most of the annuclear red blood cells that are abundant in the Erythroid progenitor cells prior to the culturing step while removing many nucleated cell types Enriched. This results in much less than present in the original peripheral blood sample. It became possible to culture with a large number of cells.   Informs for performing pregnancy sonogram (ultrasound) and genetic amniocentesis A mother's peripheral blood sample was obtained from a pregnant woman by venipuncture after deconcentration. Each place In this case, a maternal blood sample was obtained before performing the amniocentesis. As an anti-aggregating agent Acid Citrate Dextrose Solution A (ACD- 18 ml dispensed into two Vacutainer tubes containing A) , Whole peripheral blood was obtained from each pregnant woman. The day after the sample was obtained, the mother's peripheral blood test was performed by express delivery. Got paid. Invert several times to ensure sample mixing from each of the three samples Obtain 5 ml of undiluted blood and use the Polymorph Prep (Polymo rphprep) overlayed on top of the gradient. With the same volume of phosphate buffered saline The remaining blood is diluted and 5 ml of the diluted blood is diluted with Ficoll-Paq. ue) gradient, Histopaque two-layer gradient, and Nico Overlaid on top of a Nicodenz bilayer gradient. Red blood along the density gradient A diagram illustrating the typical relative partitioning of sphere precursors and nucleated red blood cells As shown in FIG.Ficoll-Burk gradient   Ficoll-plaque (1.077 g / m in a 15 ml conical centrifuge tube) 1; manufactured by Pharmacia of Uppsala, Sweden) 3. 5 ml of diluted peripheral blood was overlaid on 5 ml. 400 tubes at room temperature in a tabletop centrifuge It was centrifuged at xg for 30 minutes. Buffy coat at the interface between plasma and Ficoll-Park ( Remove the buffy coat layer (referred to as F1), rinse, and then incubate as follows. Was.Histopark 2-layer gradient   Histopark in a 15 ml tube 1.119 g / ml (Sigma Chemical (Sigma Chemical) 2 ml, Histopark 1.077 g / ml (Sigma Make) 1.5 ml (manufactured by Mikaru) was carefully overlaid. Next, hist 5 ml of diluted blood Layered on top of the park. Centrifuge tubes at room temperature for 30 minutes at 400 xg at room temperature. I thought Plasma and 1.077 g / ml gradient using a Pasteur pipette The buffy coat (referred to as H1) at the interface with was collected. Can contain nucleated red blood cells In order to collect the regions that are considered to have the highest properties, from the 1.077 / 1.119 interface Paste the entire 1.119 layer (called H2) to the red blood cell pellet below with a Pasteur pipette. I sucked in. Place these two cell fractions in a clean tube, rinse, Then, it was cultured as described below.Polymorph prep gradient   Polymorph prep 1.113 g / ml in a 15 ml tube (Nikomedgib Undiluted whole blood was overlaid in 3.5 ml of Co (Nycomed Gibco BRL). The tubes were centrifuged at 500 xg for 30 minutes at room temperature in a tabletop centrifuge. Red blood in a whole blood sample Since the spheres were in contact with the polymorph prep medium, they were Aggregated and settled in a gradient under centrifugal force. This gradient medium has a high immersion By taking advantage of the tendency of red blood cells to lose water when entering a permeable environment, Designed to separate gangs. As expected, the mother's sample had two distinct differences. The different bands are shown on the polymorph prep. Plasma obtained from each blood sample / Use a Pasteur pipette to apply a buffy coat (called P1) on the polymorph prep interface. Aspirate and transfer to a clean test tube. Then theoretically nucleated red blood cells and red blood cells Put the polymorphonuclear cell layer (called P2) containing the progenitor cells into another clean test tube Moved. For correct osmotic pressure, add 0.45% NaCl in the same volume of distilled water. The cells were allowed to recover. Dilute cells to 12 ml with phosphate buffered saline and Cultured as described.Nicodens 2-layer gradient   Obtained Nicoden's (Gibco / BRL) in powder form, 27.6 g of Nicoden's flour The powder was treated with 5 mM Tris-HCl, pH 7.5, 3 mM KCl in distilled water, and And a total volume of 100 ml was reconstituted in a buffered medium consisting of 0.3 mM EDTA. I let you. The 27.6% solution (density 1.150 g / ml) was autoclaved. Bacteria. Mixing 0.75 g of NaCl in 100 ml of the above buffered medium To prepare isotonic NaCl dilution (density 1.003 g / ml). NaCl rare The preparation was sterilized with a 0.22 μm filter. 27.6% Nicoden's solution and Na Cl dilutions were diluted in a ratio of 3: 2 and 1: 1 to give densities of 1.090 g each. / Ml and 1.075 g / ml of two solutions were obtained. 2 in a 15 ml tube 1.5 ml of Nicoden's 1.075 g / m per ml of Nicoden's 1.090 g / ml 1 was carefully overlaid. Then in the phosphate buffered saline Carefully add 5 ml of 1: 1 diluted blood to the top of Nicodens 1.075 g / ml. Layered. The tubes were centrifuged at 1500 xg for 30 minutes at room temperature in a tabletop centrifuge. this The combination of gradients provides a much wider spread than other gradients. Scattered cell bands were obtained. The cell layer was contaminated with a large number of mononuclear red blood cells. path Using a tool pipette, measure the interface between plasma and 1.075 g / ml gradient. The cell layer (designated N1) was collected. Most of the 1.090 layers (called N2) are pass-through Collected with Lupet. There were so many cells in this layer that all of them No part was used. Place these cell fractions in a clean tube. Was.Preparation of medium   The basic medium used is Iscove's Modified Dulbec medium. 1.1% methyl cellulos in co's Medium (IMDM; Sigma Chemical Co.) Su (4000 centipoise; manufactured by Sigma Chemical Co.), 30% fetal bovine serum (Si Guma Chemical Co., Ltd., 0.1 mM 2-mercaptoethanol (Sigma Chemica) Le, and 1% bovine serum albumin (BSA, fraction V; Sigma) ・ Chemical company). 2 units / ml erythropoiechi in culture (Sigma Chemical Co.) to enhance the proliferation and maturation of erythroid cells. Was.   To prepare a 3.2% solution of methylcellulose in IMDM, 6.4 g of methylcellulose was prepared. Cellulose was added to 1 liter of oat containing 190 ml of sterilized IMDM. Weighed into a Reeve bottle. Autoclave the solution with the stirrer bar still in the bottle did. After autoclaving, methylcellulose formed a hard pink stopper in the bottle. Was. The bottle was shaken vigorously until the methylcellulose broke into a slurry. To room temperature Upon cooling with, the methylcellulose returned to solution.   Weigh 10 g of BSA, about 60 m in a small beaker on a stirrer plate BS of pH 7.6 at a final concentration of 10% by slowly adding to 1 liter of distilled water. A was prepared. On the other hand, 10 g of NaHCOThreeDissolved in distilled water and Make the final volume 100 ml in the flask and filter sterilize with 0.22 μm filter 10% NaHCOThreeWas prepared. Continuously monitor with a pH meter While adding BSA solution to 10% NaHCOThreeThe pH was adjusted to 7.6. Constant volume of this solution Pour into a flask, make up to 100 ml with distilled water, and filter with a 0.45 μm filter. Then, it was sterilized with a 0.22 μm filter.   Add 10 μl of 2-mercaptoethanol to 1 ml of IMDM in the poison hood. Added. In a sterile tissue culture hood, add 0.75 ml of this solution to 49.5 ml of IMD. Added to MD, mixed and filter sterilized with a 0.22 μm filter.   Add 3.2% methylcellulose / IMDM in an autoclaved bottle with penicilla N-streptomycin antibiotic (5000 units / ml, 5000 μg / m 1; Gibco / BRL) 5 ml, L-glutamine (200 mM; Gibco / BRL) 5 ml, sterilized heat-inactivated fetal bovine serum (manufactured by Sigma Chemical Co.) 180 ml, 10 % BSA (pH 7.6) 60 ml, and filtered ethanol / IMDM 40 m 1 was added. Thoroughly mix the contents of the bottle with 2.3 ml of medium in a 15 ml test tube. We dispensed each. Test tubes were stored frozen at -20 ° C until needed.Cell plating and culture   Two-layer histopark guarient (1.077 g / ml on 1.119 g / ml) ) Or a polymorph prep gradient to separate whole blood samples by density gradient centrifugation. Then rinse the desired cell fractions twice with phosphate buffered saline and IMDM Rinse once and resuspend in IMDM to a total volume of 0.5 ml. This cell suspension 0.5 ml of the liquid was added to 0.2 units of 30 units / ml erythropoietin (final concentration: 2 units). Knit / ml) with methylcellulose in a 15 ml conical centrifuge tube Medium to 2.3 ml.   Vortex the tube vigorously to ensure complete mixing of the ingredients while at the same time All cell clusters confusing with colony formation were destroyed. The final product is concentrated It was a dense viscous syrup. 1.5 ml of cell-containing medium was added to 100 mm falcon (F alcon) plastic dish (Becton Dickson) Two 35mm with covers in Lincoln Park, NJ) Falcon plastic tissue culture dishes (Becton Dixon) I put it in it. The third 35mm Falcon dish without cover is Place in a Falcon dish and partially fill with 2 ml of sterile distilled water to keep humidity Offered. Cover the 100ml Falcon dish and cover the entire dish. 5% CO2And transferred to a 37 ° C. incubation filled with More mature C FU-E progenitor cells show clear colonies of up to 150 cells for 4 days. Within 8 days, virtually all of these mature cells in culture had formed. It contained visible hemoglobin. BFU-E achieves high levels of differentiation Erythropoietin receptor is not expressed until It did not start growing immediately. Large dispersion by 8-10 days of culture BFU-E colonies were visible, and by day 14, these colonies were strongly damaged. It became moglobin.   Typical examples of CFU-E and BFU-E colonies are shown in Figures 2 and 3, respectively. (The illustrated colony was isolated from fetal liver). Table 1 shows blood tests from pregnant women. BFU-E and CF obtained by culturing each cell fraction of Summarize the number of U-E colonies. Ficoll-Plaque (F), Double Layer, Histova (H), polymorph prep (P), and nicodens (N) density gradients And fractionated the sample. Due to the presence of numerous red blood cells that obscure the culture, It was not possible to observe or enumerate the cells from Slice N2. Example 2:  Isolation of cultured erythroid cell colonies and preparation of metaphase spreads   In this example, erythroid cell colonies cultured as described in Example 1. Of the erythroid cells were isolated on a microscope slide for further analysis. It was used to prepare the pad.Slide preparation   Rajendra et al. (Human Genetics ) (1980) 55: 363-366) and Dube et al. Cancer Genetics and Cytogenetics) (1981) Volume 4: 157-168) Teflon-lined glass slide (cell Line-Associated Inc. (Cel-Line Assoc. Inc.), Ni Collected directly on Newfield, NI. Usually these red blood cells Since the lineage cells are non-adherent, the slides were first coated with 0.1% poly-L-lysine. To induce cell attachment to the slides so that there is no loss during the collection process. Po For treatment with Li-L-lysine, 100 mg of poly-L-lysine (Sigma Chemica) 1 ml stock solution was dissolved in 10 ml of distilled water to prepare a 1% stock solution. Respectively 1 ml was stored frozen until used. To prepare a 0.1% working solution 100 μl of 1% stock solution was diluted with 900 μl distilled water. 1 drop of work Solution was placed on each slide at a 5 mm site. Cover the slide sideways Humidification chamber without damaging (wet paper towels and Closed plastic with a rack to keep slides out of contact with paper towels It was placed in a cytotic box) and incubated at 37 ° C. for 2 hours. Incubation After that, the slides were individually rinsed with distilled water in a beaker and air dried at room temperature. Coating The resulting slides were stored frozen at -20 ° C until ready for use.Colony harvest   CFU-E colony-derived cells are most prominent on days 2-6 because of the rapid growth peaks. Well collected. After this time, the nucleus is protruding or dense, dense Which made the analysis even more difficult. Of the proliferative state before the extreme homogenization At day 10, or afterwards if a large number of non-dividing nucleated red blood cells are desired In addition, cells derived from BFU-E could be collected. Colonies were poly-L-ly Coat the 5 mm area (4 to 6 areas per slide) on the gin-coated slide. Collected Ronnie. A large number of colonies formed in the culture, three per site or Only gives one colony each, unless sometimes smaller colonies are obtained. I put it on the site. Colonies collected per sample due to differences in cell growth between samples -The total number ranged from 3 to 314.   Colonies were identified under an inverted microscope and a 10 μl tip set to 4 μl Equipped with Gilson Pipetman (Rain Instrument in Instrument, Woburn, Mass.) I took it out. 0.1 μg / ml colcemid (guidure) on poly-L-lysine slides 1 by pipetting into a 15 μl IMDM droplet containing Buko / BRL) Each colony was dispersed by putting it in and out 0 to 20 times. Slide Place it sideways in a humid chamber and incubate at 37 ° C for 15 minutes, then At this time, 20 μl of 0.075 M KCl hypotonic solution was gently infiltrated into each drop. After an additional 15 minutes of incubation at 37 ° C in a humidified box, 30% 3: 1 methano : Glacial acetic acid fixative / 40 μl of a solution consisting of 70% 0.075M KCl It was added gently. Incubate slides at room temperature for 5-10 minutes, then Then, the excess liquid was set aside without disturbing the cells attached to the slide. Prior to drying the slides, pasteurize fresh 3: 1 methanol: glacial acetic acid fixative. Drop a pipette onto each slide and apply air to the wet slide to spread the cells. Facilitates spreading and flattening Was. After air-drying the slide, slide the slide into Optistain II-A (Optistain IIA) ( Made by Gam Red, Capistrano, California ) For 5 minutes, then 10 minutes in 3: 1 methanol: glacial acetic acid fixative. Pickled. Dehydrate the slides with an ethanol series or immediately add more It was either stored for analysis or stored frozen at -20 ° C until ready for study. The erythroid cells on the microscope slide thus prepared were paired with the nucleic acid probe. Cell hybridization, Wright's staining, banding ( banding) or storage. Add colcemid to cell-containing solution Not doing so reveals erythroid cells that are not arrested at mid-stage in the same way. Prepared on a microscopic slide.Example 3   In cultured erythroid cells by in situ hybridization Detection of Fetal DNA In this example, fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect fetal DNA in cultured and isolated erythroid progenitor cells. Issued. Hybridization of DNA derived from erythroid cells is specific to Y chromosome Was performed using both a specific probe and an X chromosome-specific probe. Two pros Labels the different fluorescent markers so that they can be identified by different colors. Was. Y-specific sequences in DNA from erythroid cells must be of fetal origin Since this probe is not present, hybridization of this probe to DNA derived from erythroid cells was performed. Is used as an indicator of cells of fetal origin.Fluorescence in situ hybridization   Erythroid progenitor cells were cultivated as in Example 1 and colonies were cultivated as in Example 2. Separated and placed on a microscope slide. Repetitive sequence around the centromere of X chromosome X-chromosome-specific probe derived from a cosmid containing and a cosmid p containing a repetitive sequence FISH was performed using a Y-specific probe derived from DP97. The probe is Klinger et al., American Journal of Human Gene Tics (Am. J. Hum. Genet.) 51: 55-65 (1992) It is described in more detail. Although the X-specific probe was labeled with biotin, The heterologous probe was labeled with digoxigenin. Biotinylated X chromosome probe 2. It was used at a concentration of 5 ng / μl and 5 ng / μg of digoxigenin labeled Y chromosome probe was used. Used at a concentration of μl.   The hybridization, washing, and detection protocols used were clean Garr et al., American Journal of Human Genetics, Vol. 51 55-65 (1992), modified as follows. Hybridize Immediately before the application, 70% -80% -90% -100% ethanol series (1 minute immersion The slides were dehydrated by pickling and then air drying for 1 minute). Ultrasonic treatment of 8 μg / μl Salmon sperm DNA (Sigma Chemical Co.) and 2 μg / μl human C 50% formamide / 10% deionate containing ot-1 DNA (Gibco / BRL) X and Y dyeing in kisstran sulfate / 6X SSC (standard sodium citrate) The probe DNA for the chromophore was suspended. 2.5 μl of probe cocktail drop Add to 5 mm site on slide and cover with glass coverslip. Covers The lip was not sealed to the slide. Slide the slide warmer at 80 ℃ -On the slide for 5-6 minutes, probe and target nucleus DN on the slide glass A was denatured at the same time. Incubate slides in humidified box overnight at 37 ° C did. The next day, remove the coverslips and slide the slides at 42 ° C in 50% form. Amide Washing once with 2X SSC (pH 7.0) for 10 minutes, 0.1X at 60 ° C Wash once with SSC for 10 minutes. 3% BSA / 4XSSC at 42 ° C /0.1% Twin 20 (polyoxyethylene-sorbitan monolaurate; sig Ma Chemical Co., Ltd.), after 5 minutes of blocking step, μg / ml anti-digoxi Genin fluorescein isothiocyanate (FITC) antibody (digoxigenin Recognizes and fluoresces green) (Boehringer Mannhei m) company, Indiana (IN), Indianapolis) And 2 μg / ml Cy-3 streptavidin (strongly attached to biotin-labeled probe Binds and fluoresces red) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc.), Pennsylvania 1% BSA / 4X SSC with West Grove, PA Hive the nuclei on the slide by incubating for 15 minutes at 37 ° C in The redistributed labeled probe was detected. Then slide the slides to 42 ° C. Remove by washing once with 4X SSC / 0.1% Twin-20 for 10 minutes. Excess unbound fluorochrome that would otherwise give a false signal background Was removed.   2.33% DABCO antifade (1,4-diazabicyclo [2.2.2] o Kutan; manufactured by Sigma Chemical Co., Ltd.), 100 mM Tris pH 8.0, and 0.1 μg / ml DAPI (4,6-diamino-2-phenyl-indole; On a thin layer of 90% glycerol on slides containing (Guma Chemical) Put a coverslip on. Fluorochrome DAPI is intact When it binds to the AT-rich region of the small groove of DNA, it fluoresces blue under ultraviolet light, Therefore, it is useful as a nuclear counterstain (Schweizer, Ambrose and Andrle, 1978). Suitable firefly Optical filter (Omega Optical In c.), Brattleboro, VT equipped with Zeiss Axio Zeiss Axioplan Epi-fluorescence microscope (Carl Zeiss, Incorporated 40x and 100x oil immersion lenses with Ted (Carl Zeiss, Inc.) The slide was observed. The filter used for DAPI fluorescence is a 365 nm excitation filter. Luther, 410nm dichroic filter, and 420LPnm emission fill 485/20 nm excitation filter, 510 nm filter for FITC. Using a color filter and a 520-560 nm emission filter; Cy -For fluorescence, 515-560nm excitation filter, 580nm dichroic filter -, And a 590 LPnm emission filter were used. Kodak Goal 100x oil-immersion objective lens using a 400D film The hybridized nuclei were photographed using a 5 mm camera.Analysis of maternal blood samples   A total of 37 peripheral blood samples were collected from pregnant women with consent to 10 5/7 or more pregnancies. Collected during 22 weeks. Two-layer Histopark 1.077 / 1.119g / ml Density gradient (21 samples) or polymorph prep gradient (14 samples) Cells were fractionated from whole blood using either of Two samples (Samples 11 and 1 2), 2 layers Histopark, polymorph prep, Ficoll-park and 2 layers Fractionation was performed with a Nicodens gradient. The fractionated cells were treated as described in Example 1. Incubated with lyspopoietin. In most cases, H1 or P1 and H2 or Alternatively, the P2 cell fraction was cultured. CFU-E type colonies are H2 or Was collected from the P2 fraction, but occasionally from the H1 or P1 fractions Was collected. Colonies were analyzed by FISH as described above. Cytogenetic content The actual karyotype of the fetus determined by analysis is shown in the last column (46, XY = male, 46, XX = female). The results are summarized in Table 2.   Ultrasonography and / or cytogenetic analysis proves the fetus to be male Of 21 culture samples from pregnant women (twins, one male and one female) (Including sample 17), the XY colonies were the same in 7 samples by FISH. The male detection rate was 33.3%. Number of XY colonies per sample Was 1 to 8 (in these cases, the total number of colonies analyzed 2.1% to 33.3%). Having a female fetus actually by cytogenetic analysis From 16 pregnant women (samples of twins, one male and the other female) No XY colonies were detected, and the false positive rate was 0%. Analyze The pregnancy duration of 37 pregnant women ranged from 105/7 to 22 weeks. 105/7 week sample 1 is the earliest pregnancy with a male fetus analyzed, Male cells were shown in 4 out of 120 colonies. Sample from male colony The slowest gestation period in which the cells were cultured was 17 weeks (Sample 18).   Table 3 shows the gestational period (week) when the blood sample was obtained, and the time when the culture colony was obtained. Dient fraction, period of time cells were cultured before harvest (days), and FISH Correlate the total number of collected colonies that showed male cells with the percentage value. Example 4: Polymers for amplifying gene sequences in cultured erythroid progenitor cells Use of the Lase chain reaction   In this example, it is present in cultured fetal erythroid progenitor cells derived from maternal peripheral blood. Polymerase chain reaction was used to amplify the Y-specific DNA sequences that 1 06A polymerase chain reaction capable of producing a copy of the target gene sequence, or PCR is used to amplify the gene sequences present in cultured erythroid progenitor cells. Womb PCR specific for repetitive sequences present on the Y chromosome to determine the sex of the offspring Use primers. More potent amplification signa from rare male fetal cells Repeat sequences are selected because they result in Probe Y411 (Masachi Of Children's Hospital, Boston, Boston Included by Dr. Ulrich Muller) Use a primer that hybridizes to the short arm region of the Y chromosome I do. Y411 is Y156 (Muller, U. et al., Nucleic A Shids Research (Nucleic Acids Res.), Volume 14, pp. 1325-1329 ( 1986)), repeated 10 to 60 times, It is absolutely Y-specific. Detected using Y chromosome-specific probe Y411 Two Y411 designed to amplify a possible 222 base pair (bp) sequence Region specific primers, primers 411-01 and 411-03 are used. The primer sequences are described in Bianchi, D.W. et al., Procedure Dings of National Academy of Sciences USE B, Vol. 87, pp. 3279-3283 (1990). Other suitable Suitable primers are Bachtel, S. et al., Human Reproduct Hum. Reprod., Vol. 6, pp. 1446-1469 (1991). Have been.   A series of standardization experiments to determine the minimum amount of detectable DNA in a cell sample. I do. DNA from male and female individuals was prepared at a 10-fold dilution (1 pg-1 mg), using standard reagents including reaction buffer, Perkin-Elmer DN Gene by A thermal cycler (Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler) Amp Kit (Perkin-Elmer Citas Catalog Number N8 01-0055). Samples for male DNA with measurements obtained Prevent aerosol contamination of. Wear gloves and mix under sterile conditions. All PCRs were performed with a replaceable pipette. All reagents in a sterile manner Restriction endonuclease with one digestion site in the target sequence, prepared and prior to PCR Incubate overnight with ze. These precautions do not use DNA A control experiment with all reagents in And provide a substantial absence. The number of amplification cycles varies between 18 and 30 You. Each amplification cycle consisted of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 2 minutes, then 72 ° C for 3 minutes. , With a 10 minute chain extension in the last cycle. Amplified DNA sample Galose gel electrophoresis, transfer to nylon filter, then32P label Y41 Hybridize with 1 probe.   Erythroid progenitor cells are cultured and isolated as in Example 1. Cells before amplification It is lysed by boiling, which makes the erythroid cell DNA available for amplification. Fine Probe Y as a demonstration that the cell originated from a male pregnant fetus Amplify erythroid cell DNA for the 222 bp sequence in 411. used The above conditions detect a minimum of 100 pg fetal DNA, or the equivalent of 15 cells To be able to By increasing the number of cycles used for PCR, The degree limit can be improved. Further reduce false positive amplification and agarose gel In order to enable detection of fetal DNA at the single cell level above, the length of the Y chromosome must be A primer derived from a single copy of the arm-specific sequence, PY49a (gueri Guerin, P. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 16, 77. PCR is performed using page 59 (1988).Example 5 : Detection of chromosomal aberrations in maternal blood-derived cultured erythroid progenitor cells   In this example, for cultured fetal erythroid progenitor cells derived from maternal blood, Perform in situ hybridization using a set of chromosome-specific probes To detect chromosomal abnormalities in fetal cells. Good signal to noise ratio and And DNA probes for specific chromosomes that provide good spatial variation of fluorescent signal The set of lobes is used for in situ hybridization. Special probe center 5 chromosomes, often seen as liveborn aneuploids (Chromosomes 13, 18, 21, X, and Y). Chromosome 1 probe Is used as a control. A common method in constructing probes is that of many genetics A starting clone that maps to the desired chromosome by both physical and physical methods. Identified and then used the clones for further hybridization Is to identify a matching cosmid "alignment group" to be used as a group. Chromosome 21 The probe set for 3 cosmid preparations containing 80 kb non-overlapping DNA. It is a group of columns. The probe set for chromosome 18 is a 109 kb non-overlapping DN 3 is a cosmid alignment group including A. The probe set for chromosome 13 is about 97 3 cosmid alignment groups containing kb non-overlapping DNA. For X chromosome The lobe is a cosmid containing a repeating sequence around the centromere. Y chromosome The lobe is pDP97, a clone of repetitive sequences (Eco of pUC-13. 5.3 kb EcoR from cosmid Y97 subcloned into RI site I Y fragment). All probes are based on Klinger et al., American Jar. Journal of Human Genetics, Vol. 51, pp. 55-65 (199 2 years).   To diagnose chromosomal abnormalities in the fetus, the erythroid system as described in Example 1 Progenitor cells are obtained from maternal blood and cultured, and the chromosome-specific probe as described above is used. Chromosomal abnormalities by performing in situ hybridization . In situ hybridization was performed under suppressed conditions (Cremer et al., Human Genet., 80, 325-246 ( 1988); Lichter et al., Human Genetics, 80th. Vol. 224-234), Example 3 and Klinger et al., American Ja. Journal of Human Genetics, Vol. 51, pp. 55-65 (199 2 years). Hybridization of high copy number repetitive sequences And suppresses chromosomal specificity by including whole-genome human DNA. Prove by hybridization to spreads. Biotin- UTP labeled, hybridized under repressing conditions, then bound Detecting specific hybridization by streptavidin-FITC, It is shown in microscope analysis as a single "dot" in the FITC image. Alternatively, perform in situ hybridization with multiple probes In some cases, the individual probes are labeled separately so that they can be identified by fluorescence. You can also For example, label 1 probe with biotin-UTP and One probe can be labeled with digoxigenin-UTP. Former pro Probe with Cy-3 streptavidin and the latter probe with anti-digoxigeni. -FITC. Probes are easily identified and counted It produces a sensitive and tight fluorescent signal in interphase cells.   Hybridization of a chromosome-specific probe for DNA derived from fetal erythroid cells Hybridization of the same probe to DNA from normal cells Diagnosis of chromosomal abnormalities is made by comparing with normal control. For example, Maternal cells can be used as a normal control. Alternatively established in advance Normal controls can also be used for comparison. In fetal erythroid cells Three chromosomes for a particular chromosome, eg, usually chromosome 21, 18, or 13 Ratio of fluorescent signal to only two fluorescent signals for the same chromosome in normal controls By comparison, trisomy which is a common chromosomal abnormality (specific chromosome 3 (Rather than two) copies are present in the cell). sufficient Tested per number of hybridized cells, present per cell Make a statistically significant measurement of the number of fluorescent signals.Equivalent   Without undue experimentation, one of ordinary skill in the art would be able to use the special tools of the invention described herein. Many equivalents to a body example will be recognized or can be identified Like. Such equivalents are considered to be within the scope of the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリンガー，キャサリン・ダブリュー アメリカ合衆国01776マサチューセッツ州 サッドベリー、ボーディッチ・ロード54 番────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (72) Klinger, Catherine W. Inventor             United States 01776 Massachusetts               Sudbury, Boditch Road 54             Turn

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．妊婦から得た末梢血試料中の胎児細胞の胎児ＤＮＡにおける対象核酸配列 を検出する方法であって、 妊婦から末梢血試料を得て； 細胞増殖因子を含有する培地中で末梢血試料中の細胞を培養し； 培地から胎児細胞を単離し；次いで、 培地から単離された胎児細胞の胎児ＤＮＡにおける対象核酸配列を検出するこ とからなる方法。 ２．細胞増殖因子が造血細胞増殖因子である請求項１の方法。 ３．細胞増殖因子が赤血球系細胞増殖因子である請求項１の方法。 ４．妊婦から得た末梢血試料中の胎児赤血球系細胞の胎児ＤＮＡにおける対象 核酸配列を検出する方法であって、 妊婦から末梢血試料を得て； エリスロポエチンを含有する培地中で末梢血試料中の細胞を培養し； 培地から胎児赤血球系細胞を単離し；次いで、 培地から単離された胎児赤血球系細胞の胎児ＤＮＡにおける対象核酸配列を検 出することからなる方法。 ５．対象核酸配列がＹ染色体ＤＮＡ配列である請求項４の方法。 ６．対象核酸配列が、疾病を引き起こす変異に関連した遺伝子の配列である請 求項４の方法。 ７．対象核酸配列が染色体異常を検出するものである請求項４の方法。 ８．妊婦から得た末梢血試料から胎児細胞を単離する方法であって、 妊婦から末梢血試料を得て； 細胞増殖因子を含有する培地中で末梢血試料中の細胞を培養し；次いで、 培地から胎児細胞を単離することからなる方法。 ９．細胞増殖因子が造血細胞増殖因子である請求項８の方法。 １０．細胞増殖因子が赤血球系細胞増殖因子である請求項８の方法。 １１．妊婦から得た末梢血試料から胎児赤血球系細胞を単離する方法であって 、 妊婦から末梢血試料を得て； エリスロポエチンを含有する培地中で末梢血試料中の細胞を培養し；次いで、 培地から胎児赤血球系細胞を単離することからなる方法。 １２．妊婦から得た末梢血試料中に存在する有核細胞の割合が、有核細胞に富 む試料の培養の前に、有核細胞に富む試料を得る豊富化以前の末梢血試料中に存 在する有核細胞の割合と比較すると増加させられている請求項１１の方法。 １３．有核細胞に富む試料を得る末梢血試料中の有核細胞から無核細胞を分離 することにより有核細胞に富む試料が得られる請求項１２の方法。 １４．密度勾配遠心分離により無核細胞が有核細胞から分離される請求項１３ の方法。 １５．フィコールを用いて密度勾配遠心分離を行う請求項１４の方法。 １６．ヒストパークを用いて密度勾配遠心分離を行う請求項１４の方法。 １７．ニコデンズを用いて密度勾配遠心分離を行う請求項１４の方法。 １８．ポリモルフプレプを用いて密度勾配遠心分離を行う請求項１４の方法。 １９．無核細胞の選択的溶解により無核細胞が有核細胞から分離される請求項 １３の方法。 ２０．妊婦から得た末梢血試料中に存在する赤血球系前駆細胞の割合が、赤血 球系前駆細胞に富む試料の培養前に、赤血球系前駆細胞に富む試料を得る豊富化 前の末梢血試料中に存在する赤血球系前駆細胞の割合と比較すると増加させられ ている請求項１１の方法。 ２１．赤血球系前駆細胞に富む試料を得る末梢血試料中の無核細胞および他の 有核細胞から赤血球系前駆細胞を分離することにより赤血球系前駆細胞に富む試 料が得られる請求項２０の方法。 ２２．密度勾配遠心分離により、末梢血試料中の無核細胞および他の有核細胞 から赤血球系前駆細胞が分離される請求項２１の方法。 ２３．２層密度勾配を用いて密度勾配遠心分離を行う請求項２２の方法。 ２４．フィコールを用いて密度勾配遠心分離を行う請求項２２の方法。 ２５．ヒストパークを用いて密度勾配遠心分離を行う請求項２２の方法。 ２６．ニコデンズを用いて密度勾配遠心分離を行う請求項２２の方法。 ２７．ポリモルフプレプを用いて密度勾配遠心分離を行う請求項２２の方法。 ２８．培地が半固体マトリックス材料を含有している請求項１１の方法。 ２９．半固体マトリックス材料が、該半固体マトリックス材料へ細胞を付着さ せるものである請求項２８の方法。 ３０．半固体材料がメチルセルロースである請求項２９の方法。 ３１．半固体材料が寒天ゲルまたは血漿クロットである請求項２９の方法。 ３２．さらに、胎児赤血球系細胞上または胎児赤血球系細胞中の胎児細胞マー カーを検出してそれらを胎児由来であると同定することからなる請求項１１の方 法。 ３３．胎児細胞マーカーが胎児ヘモグロビンである請求項３２の方法。 ３４．胎児細胞マーカーが胎児ヒストン蛋白Ｈ１0である請求項３２の方法。 ３５．胎児細胞マーカーが胎児抗原決定基である請求項３２の方法。 ３６．胎児抗原決定基が抗原決定基ｉである請求項３５の方法。 ３７．１個またはそれ以上の胎児赤血球系細胞のコロニーを培地からピックア ップすることにより胎児赤血球系細胞が培地から単離される請求項１１の方法。 ３８．１個またはそれ以上の赤血球系細胞のコロニーを培地から顕微鏡スライ ドへと移すことにより、胎児赤血球系細胞がさらに単離される請求項３７の方法 。 ３９．さらに、単離された胎児赤血球系細胞の胎児核酸中の対象核酸配列を検 出することからなる請求項１１の方法。 ４０．対象核酸配列がＹ染色体ＤＮＡ配列である請求項３９の方法。 ４１．対象核酸配列が、疾病を引き起こす変異に関連した遺伝子の配列である 請求項３９の方法。 ４２．対象核酸配列が染色体異常を検出するものである請求項３９の方法。 ４３．妊婦から得た末梢血試料から中期の胎児赤血球系細胞を単離する方法で あって、 妊婦から末梢血試料を得て； エリスロポエチンを含有する培地中で末梢血試料中の細胞を培養し； 分裂中の細胞が細胞周期を経ることを阻害するかまたは細胞の増殖を同調させ る薬剤に細胞を曝露し；次いで、 中期の胎児細胞を単離することからなる方法。 ４４．分裂中の細胞が細胞周期を経ることを阻害する薬剤がコルセミドである 請求項４３の方法。 ４５．分裂中の細胞が細胞周期を経ることを阻害する薬剤がコルヒチンである 請求項４３の方法。 ４６．分裂中の細胞が細胞周期を経ることを阻害する薬剤がビンブラスチン塩 である請求項４３の方法。 ４７．細胞の増殖を同調させる薬剤がブロモデオキシウリジンまたはフルオロ デオキシウリジンである請求項４３の方法。 ４８．細胞の増殖を同調させる薬剤が臭化エチジウムである請求項４３の方法 。 ４９．経産妊婦からの末梢血試料における現在の妊娠に由来する胎児細胞を優 先的に単離する方法であって、 経産妊婦から末梢血試料を得て； エリスロポエチン含有する培地中で末梢血試料中の細胞を培養し；次いで、 胎児赤血球系細胞を単離して現在の妊娠に由来する胎児細胞を優先的に単離す ることからなる方法。[Claims] 1. A method for detecting a nucleic acid sequence of interest in fetal DNA of a fetal cell in a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman, the peripheral blood sample being obtained from the pregnant woman; cells in the peripheral blood sample in a medium containing cell growth factor. Culturing; fetal cells from the medium; and then detecting the nucleic acid sequence of interest in the fetal DNA of the fetal cells isolated from the medium. 2. The method of claim 1, wherein the cell growth factor is a hematopoietic cell growth factor. 3. The method of claim 1, wherein the cell growth factor is an erythroid cell growth factor. 4. A method for detecting a nucleic acid sequence of interest in fetal DNA of fetal erythroid cells in a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman, wherein a peripheral blood sample is obtained from the pregnant woman; cells in the peripheral blood sample in a medium containing erythropoietin Culturing; fetal erythroid cells from the medium; and then detecting the nucleic acid sequence of interest in the fetal DNA of the fetal erythroid cells isolated from the medium. 5. The method of claim 4, wherein the nucleic acid sequence of interest is a Y chromosome DNA sequence. 6. The method of claim 4, wherein the nucleic acid sequence of interest is the sequence of a gene associated with a disease causing mutation. 7. The method according to claim 4, wherein the nucleic acid sequence of interest detects a chromosomal abnormality. 8. A method for isolating fetal cells from a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman, comprising: obtaining a peripheral blood sample from a pregnant woman; culturing cells in the peripheral blood sample in a medium containing cell growth factor; A method comprising isolating fetal cells from. 9. The method of claim 8, wherein the cell growth factor is hematopoietic cell growth factor. 10. The method of claim 8, wherein the cell growth factor is an erythroid cell growth factor. 11. A method for isolating fetal erythroid cells from a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman, wherein a peripheral blood sample is obtained from the pregnant woman; culturing the cells in the peripheral blood sample in a medium containing erythropoietin; A method comprising isolating fetal erythroid cells from. 12. The percentage of nucleated cells present in a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman is present in the peripheral blood sample prior to enrichment to obtain a nucleated cell-rich sample prior to culture of the nucleated cell-rich sample. The method of claim 11, wherein the percentage is increased compared to the percentage of nuclear cells. 13. Obtaining a sample enriched in nucleated cells The method of claim 12, wherein a sample enriched in nucleated cells is obtained by separating anucleated cells from nucleated cells in a peripheral blood sample. 14． The method according to claim 14, wherein the anucleated cells are separated from the nucleated cells by density gradient centrifugation. 15. 15. The method of claim 14, wherein density gradient centrifugation is performed using Ficoll. 16. 15. The method of claim 14 wherein density gradient centrifugation is performed using Histopark. 17． 15. The method of claim 14, wherein density gradient centrifugation is performed using Nicodens. 18. 15. The method of claim 14, wherein density gradient centrifugation is performed using a polymorph prep. 19. 14. The method of claim 13, wherein the anucleated cells are separated from the nucleated cells by selective lysis of the anucleated cells. 20. The percentage of erythroid progenitor cells present in a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman is present in the pre-enriched peripheral blood sample before the erythroid progenitor cell enriched sample is obtained before the erythroid progenitor cell enriched sample is obtained. 12. The method of claim 11, wherein the percentage of erythroid progenitor cells is increased. 21. 21. The method of claim 20, wherein a sample enriched in erythroid progenitor cells is obtained by separating erythroid progenitor cells from anucleated cells and other nucleated cells in a peripheral blood sample to obtain a sample enriched in erythroid progenitor cells. 22. 22. The method of claim 21, wherein density gradient centrifugation separates erythroid progenitor cells from anucleated cells and other nucleated cells in a peripheral blood sample. 23. The method of claim 22, wherein the density gradient centrifugation is performed using a 23.2 layer density gradient. 24. 23. The method of claim 22, wherein density gradient centrifugation is performed using Ficoll. 25. 23. The method of claim 22, wherein density gradient centrifugation is performed using Histopark. 26. 23. The method of claim 22, wherein density gradient centrifugation is performed using Nicodens. 27. 23. The method of claim 22, wherein the density gradient centrifugation is performed using a polymorph prep. 28. The method of claim 11, wherein the medium contains a semi-solid matrix material. 29. 29. The method of claim 28, wherein the semi-solid matrix material attaches cells to the semi-solid matrix material. 30. 30. The method of claim 29, wherein the semi-solid material is methyl cellulose. 31. 30. The method of claim 29, wherein the semi-solid material is an agar gel or plasma clot. 32. 12. The method of claim 11, further comprising detecting fetal cell markers on or in fetal erythroid cells to identify them as being of fetal origin. 33. 33. The method of claim 32, wherein the fetal cell marker is fetal hemoglobin. 34. The method of claim 32 fetal cell markers is a fetus histone proteins H1 0. 35. 33. The method of claim 32, wherein the fetal cell marker is a fetal antigenic determinant. 36. 36. The method of claim 35, wherein the fetal antigenic determinant is antigenic determinant i. 13. The method of claim 11, wherein the fetal erythroid cells are isolated from the medium by picking up from the medium a colony of one or more fetal erythroid cells. 38. The method of claim 37, wherein the fetal erythroid cells are further isolated by transferring a colony of one or more erythroid cells from the medium to a microscope slide. 39. The method of claim 11, further comprising detecting the nucleic acid sequence of interest in the fetal nucleic acid of the isolated fetal erythroid cells. 40. 40. The method of claim 39, wherein the nucleic acid sequence of interest is a Y chromosome DNA sequence. 41. 40. The method of claim 39, wherein the nucleic acid sequence of interest is the sequence of a gene associated with a disease causing mutation. 42. 40. The method of claim 39, wherein the nucleic acid sequence of interest is one that detects chromosomal abnormalities. 43. A method for isolating metastatic fetal erythroid cells from a peripheral blood sample obtained from a pregnant woman, which comprises obtaining a peripheral blood sample from a pregnant woman; culturing cells in the peripheral blood sample in a medium containing erythropoietin; Exposing the cells to an agent that inhibits the cells therein from undergoing the cell cycle or synchronizes cell proliferation; and then isolating the metaphase fetal cells. 44. 44. The method of claim 43, wherein the agent that inhibits dividing cells from undergoing the cell cycle is colcemid. 45. 44. The method of claim 43, wherein the agent that inhibits dividing cells from undergoing the cell cycle is colchicine. 46. 44. The method of claim 43, wherein the agent that inhibits dividing cells from undergoing the cell cycle is vinblastine salt. 47. 44. The method of claim 43, wherein the agent that synchronizes cell proliferation is bromodeoxyuridine or fluorodeoxyuridine. 48. 44. The method of claim 43, wherein the agent that synchronizes cell proliferation is ethidium bromide. 49. A method for preferentially isolating fetal cells derived from the current pregnancy in a peripheral blood sample from a pregnant woman, wherein the peripheral blood sample is obtained from the pregnant woman; in a medium containing erythropoietin Culturing the cells of E. coli; then isolating fetal erythroid cells to preferentially isolate fetal cells from the current pregnancy.
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