JPH09511250A - 核酸治療に有用な修飾オリゴヌクレオチド及び中間体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸治療及び診断分野で使用できるヌクレアーゼ耐性３’−炭素修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合の３’位置で二価酸素部分が４価炭素部分で置換されている修飾ヌクレオチド間結合を少なくとも１個有する。３’−炭素修飾ヌクレオチド間結合は好ましくは３’−メチレン又は３’−ヒドロキシメチレン結合である。本発明の修飾オリゴヌクレオチドを製造するための方法並びに単量体ヌクレオシド及びヌクレオチド中間体も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸治療に有用な修飾オリゴヌクレオチド及び中間体 発明の分野 本発明は治療の分野、特に核酸治療の分野に関する。背景 在来の薬剤開発方法は、疾患またはその他の不健康な状態に関与するタンパク 質と直接的に相互作用し得る治療薬の使用という１点に集中している。このよう な在来方法から生まれた薬剤として、例えば、合成ホルモン類（体内に存在する のが望ましいタンパク質主体のホルモンの機能を模倣する）、抗生物質類（外来 タンパク質、即ち微生物を攻撃する）、及び、ビタミン類（ある種のタンパク質 が体内で正常機能を果たすために必要とする構造単位をこれらのタンパク質に提 供する）がある。もっと新しいオリゴヌクレオチドの形態の治療薬は、あらゆる タンパク質の合成をコントロールする設計図または機構を遺伝子レベルで改変す ることによってタンパク質の機能を間接的に調節もしくはコントロールしたりま たはその他の影響を与えたりするように設計されている。各遺伝子が特定タンパ ク質の多数コピーの作製に必要な情報を含んでいるので、これらの核酸 治療薬の各々は、標的タンパク質との直接的相互作用に依存する在来の高分子薬 に比べてより多い数のタンパク質分子に対してその間接的相互作用を介して影響 を与え得る。 核酸治療化合物は多くの異なる方法で作用し得るであろうが、極めて一般的に は、２つの種類のいずれか一方に所属するように分類されている。第一の種類は 、所望の遺伝子効果を何らかの方法で模倣または増強するオリゴヌクレオチドを 包含する。この種の核酸治療化合物によって刺激される活性は一般に「遺伝子治 療」と呼ばれている。第二の種類の核酸治療化合物は抑制性オリゴヌクレオチド を包含し、この核酸治療化合物は不都合なタンパク質の産生を阻害する。アンチ センスオリゴヌクレオチドは抑制性核酸治療化合物のサブクラスを形成している が、一般にこのサブクラスに所属する化合物が常に正しい「アンチセンス」方法 で作用するとは限らない。これらの２種類の治療用オリゴヌクレオチドに加えて 、在来治療薬と極めて類似した方法で標的タンパク質と直接的に相互作用し得る 核酸治療化合物が存在することにも注目されたい。 正確なアンチセンス相互作用は、相補的オリゴヌクレオチド（従って、「アン チセンス」と命名されている）とその選択さ れた核酸標的（例えば、ウイルスＤＮＡまたは他の不都合な遺伝メッセージ）と の配列特異的なハイブリダイゼーションを含み、その結果、単独でまたは他の（ １種または複数の）試薬（例えば、ＲＮアーゼのような酵素）と組合わせて形成 された複合体は遺伝情報をタンパク質に翻訳する鋳型としてはもはや機能しない 。他の抑制性オリゴヌクレオチドは、標的配列に必ずしも相補的でないがアンチ センスオリゴヌクレオチドと同様に不都合な遺伝物質の発現（例えば、複製及び ／または翻訳）を妨害する潜在能力を有する配列を有している。アンチセンスオ リゴヌクレオチドは、外来遺伝子（例えば、ＨＩＶのようなウイルス遺伝子）の 発現または内在性遺伝子の異常発現（例えば、突然変異した癌遺伝子として異常 発現する正常遺伝子）を妨害するように設計され得る。これらの不都合な遺伝メ ッセージは、ウイルス感染症及び癌腫のような多くの疾病状態に関与する。抑制 性オリゴヌクレオチドは、在来薬剤のように疾病進行の後期に生じたタンパク質 を攻撃するのでなく、複製及び発現の初期に疾病状態を治療的に阻止する可能性 を増大する。 遺伝子治療に使用されるオリゴヌクレオチドは、所望の効果を有する筈である が患者の体内では欠如しているかまたは損傷 されているオリゴヌクレオチドまたは合成遺伝子を提供するように設計されてい る。ヒトの体内に正常に存在する遺伝子の各々は、身体の構造または機能を担当 する特定のタンパク質を製造するという任務を有している。この遺伝子の欠陥ま たは欠損が生じたとき、タンパク質合成にも欠陥または欠損が生じ、奇形または 遺伝病につながる。核酸治療化合物はレトロウイルスのようなビヒクルによって 患者の細胞の遺伝物質に取り込まれ、その結果として、必要なタンパク質の産生 を可能にする。 核酸治療化合物が遺伝子治療もしくはアンチセンス療法を対象として設計され ているかまたは遺伝レベルもしくは他のレベルでタンパク質に影響を与えること が望まれる他の何らかの状態を対象として設計されているかに関わりなく、これ らの合成オリゴヌクレオチドの設計は、達成可能な成功のレベルを握る基幹要因 である。重視すべきは、これらのオリゴヌクレオチドがヒトまたは動物の身体に 内在する種々のヌクレアーゼの存在下で生存できるように、通常はオリゴヌクレ オチドを修飾してオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を与えなければならな いことである。血清サンプルの分析に使用されるオリゴヌクレオチドプローブに 関しても事情は同じである。何故なら、人体 内に存在したときに非修飾の治療用オリゴヌクレオチドを分解させ得る外因性の 同じヌクレアーゼは、ヒト血清中にも存在して血清サンプル中の非修飾のオリゴ ヌクレオチドプローブをも分解させるからである。 より詳細には、非修飾（即ち「野生型」）オリゴヌクレオチドは、完成オリゴ ヌクレオチド中の個々のヌクレオチド単位を互いに結合しているヌクレオチド間 結合の３′−位及び５′−位の双方でヌクレアーゼ分解に感受性である。従って 、治療用オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を与える研究はこのヌクレオチ ド間結合を修飾することを目的としており、得られた成功は主として天然に産生 するホスホジエステル結合中の「非架橋」酸素原子の修飾に関しては好結果が得 られている。（例えば、１つの非架橋酸素がイオウ原子で置換されたホスホロチ オエート修飾オリゴヌクレオチド（米国特許第３，８４６，４０２号）及び双方 の非架橋酸素原子がイオウ原子で置換されたホスホロジチオエート修飾オリゴヌ クレオチド（米国特許第５，２１８，１０３号））。しかしながら、これらのイ オウ含有オリゴヌクレオチドはタンパク質に結合し、許容できないレベルの非特 異的活性を示すことが判明している。更に、ホスホロチ オエート修飾オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合の３′−位でヌク レアーゼ分解に感受性であり、特にヌクレオチド間結合の開裂後に５′−ホスフ ェートを脱離させるヌクレアーゼによるヌクレアーゼ分解に感受性である。その 理由は、ホスホジエステル結合中の「非架橋」酸素原子のうちの１つだけが修飾 されているからである。 修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドを作製するために使用され得る常 用のオリゴヌクレオチド合成方法は多数存在する。これらの方法として、溶液合 成法または固相合成法がある。より伝統的な溶液主体の合成方法は、モノヌクレ オチドシントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）試薬の必要量が比較的少ないにもかかわらず 、有意量の所望最終産物を提供し得る。しかしながら溶液合成法には、モノヌク レオチドサブユニットを添加する度毎に中間生成物の単離及び精製という冗長な 処理が伴うという欠点がある。その結果、溶液主体のホスホトリエステル化学法 は、核酸治療で使用するために必要なより長いオリゴヌクレオチド（即ち、長さ ６塩基を上回るオリゴヌクレオチド）の実用的な合成には適さない。固相合成法 の場合には、全反応連鎖が固体支持体上で行われ、モノヌクレオチドサブユニッ トを順次 付加することによって、一端がポリマー系支持体に結合された成長鎖を形成する 。従って、固相法では試薬を容易に分離できる。この方法は、過剰量のモノヌク レオチドシントン試薬（溶液合成法における必要量の数倍）及び他の高価な試薬 を要するという物的な欠点だけを有している。 核酸治療化合物または診断用プローブとして使用するための適当な長さを有し ており且つ修飾オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を与える十分な数の修飾 結合を有しているイオウ非含有の修飾オリゴヌクレオチドが要望されている。更 に、このようなイオウ非含有の修飾オリゴヌクレオチドのポリマー支持法による 合成方法が要望されている。イオウ非含有修飾の例としては、非修飾ホスホジエ ステル結合の３′−位のＰ−Ｏ結合をＰ−Ｃ結合によって置換して、３′−炭素 修飾ヌクレアーゼ間結合を形成させるものがある。この修飾ホスホジエステル結 合を溶液主体の方法で調製するための中間体として必要な低分子３′−メチレン ホスホネートヌクレオチドは溶液化学法を用いて調製されている。例えば、Ａｌ ｂｒｅｃｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４０，７９−８５（１９８４）；Ａ ｌｂｒｅｃｈｔら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９２，５５１ １−５５１３（１９７０；Ｍｏｒｒら，ＧＢＦ Ｍｏｎｏｇｒ．Ｓｅｒ．，Ｃｈ ｅｍ．Ｓｙｎ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８，１０７−１１３（１９８７）。 在来のホスホジエステル溶液相合成法では、これらの単量体の修飾オリゴヌク レオチドサブユニットが、完全修飾リボヌクレオチド３′−メチレンホスホネー トダイマー及びトリマーに取込まれる。Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ ．Ｓｏｃ．，９２，５３１０−５５１１（１９７０，ａｎａｌｏｇ ｉｎｃｏｒ ｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｄｉｍｅｒ）；Ｍａｚｕｒら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ，４０（２０），３９４９−３９５６（１９８４）（ａｎａｌｏｇ ｉｎｃ ｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｒｉｍｅｒ）。更に、Ｍｏｒｒら，ＧＢＦ Ｍｏｎｏｇｒ．Ｓｅｒ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｙｎ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，前出，は、 同じ単量体の３′−メチレンホスホネートヌクレオシドから修飾デオキシリボヌ クレオチド３′−メチレンホスホネートダイマーを合成し、次いで、修飾ダイマ ー（２つの単量体サブユニット間に１つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む ）をより長いオリゴヌクレオチドに組込む方法を報告している。Ｈｅｉｎｅｍａ ｎｎ ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，４２７（１９９１）。しか しながら、これらの手順は余りにも繁雑であるため、修飾オリゴヌクレオチドの 量産には向かない。 ホスホトリエステル化学法には固有の制約があるので、オリゴヌクレオチドに ヌクレアーゼ耐性を与えるために必要な多数３′−修飾が三量体よりも長いデオ キシオリゴヌクレオチド中で観察されたことはない。更に、従来技術の溶液相法 の方法論は、より迅速で効率のよいポリマー支持法によるオリゴヌクレオチド合 成法の方法論に応用できない。その理由は、ホスホトリエステル法で使用される ホスホネートシントンは溶液相の外部で有効に作用できる十分なカップリング効 率を有していないからである。 従って、本発明の１つの目的は、ポリマー支持法による３′−炭素修飾オリゴ ヌクレオチドの合成に有用な単量体オリゴヌクレオチド中間体を提供することで ある。 本発明の別の目的は、多数３′−炭素修飾を有するオリゴヌクレオチドのポリ マー支持法による合成方法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、核酸治療及び／または核酸診断に 有用な３′−炭素修飾を少なくとも１つ有しているオリゴヌクレオチドを提供す ることである。発明の概要 本発明は、核酸治療及び核酸診断の分野で使用できるヌクレアーゼ耐性３′− 炭素修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、 少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を有し、ヌクレオチド間結合の３′− 位の二価の酸素部分が四価の炭素部分によって置換されている。また、本発明の 修飾オリゴヌクレオチドの作製方法及びその作製に用いる中間体が提供される。発明の詳細な説明 本発明は、核酸治療及び核酸診断に有用なヌクレアーゼ耐性の３′−炭素修飾 オリゴヌクレオチドを提供する。本発明によれば、オリゴヌクレオチドの１つま たはそれ以上のヌクレオチド間結合の３′−位の二価の酸素原子が四価の炭素原 子によって置換され、その結果として、３′−位に追加の２つの置換基が存在す る。本発明はまた、これらの修飾オリゴヌクレオチドの作製方法を包含する。３ ′−炭素修飾オリゴヌクレオチドの作製に有用な新規な単量体のヌクレオシド及 びヌクレオチドの ような中間体も本発明の範囲内に包含される。 本発明の３′−炭素修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオ チド間結合を有しており、かかる結合においては、天然に産生するホスホジエス テル結合の３′−位のＰ−Ｏ結合がＰ−Ｃ結合で置換されている。天然に産生す るホスホジエステル結合の３′−位のＰ−Ｏ結合と違って、３′−炭素修飾結合 のＰ−Ｃ結合は正常な生理的条件下でヌクレアーゼによって開裂されない。この Ｐ−Ｃ結合は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の３′−酸素を、３′−メ チレン（−ＣＨ₂−）、３′−ヒドロキシメチレン（−ＣＨＯＨ−）または他の 修飾炭素官能基（−ＣＸＹ−）で置換することによって得られる。 本発明の理解を容易にするために、本文中で使用した用語を以下に定義する。 「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つのヌクレオシド単位を有し、個々 のヌクレオシド単位の各々が少なくとも１つの他のヌクレオシド単位に１つのリ ン部分を介して共有結合しているポリマーを意味する。天然に産生するオリゴヌ クレオチドの場合、ヌクレオシド単位間の共有結合はホスホジエステル 結合である。しかしながら、本文中で使用した「オリゴヌクレオチド」なる用語 は、（天然に産生するオリゴヌクレオチドに比較して）以下のいずれか１つ以上 に関して修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。（１）ヌクレオシド単位間 のホスホジエステル結合、（２）個々のヌクレオシド単位自体、及び／または（ ３）ヌクレオシド単位のリボースまたは糖部分。 特に注釈がない限り、「塩基」または「核塩基(nucleobase)」なる用語は、ア デニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルのようなプリンまたはピリ ミジンを示し、また、５−メチルシトシン及び５−プロピニルピリミジンのよう なこれらの塩基の修飾形を意味する。 「ヌクレオシド」は、５炭素糖の１′−位に共有結合した塩基からなる個々の 単量体ヌクレオシド単位を意味する。代表的な５炭素糖はデオキシリボース、リ ボースまたはアラビノースのような天然糖であるが、いかなる５炭素糖またはそ の修飾形でもよく、その非限定例としては２′−フルオロ−２′−デオキシリボ ースがあり、または糖環の酸素原子が炭素官能基で置換された炭素環糖（即ち６ 炭素アナローグ）がある。一般に、塩基は、アデニン、グアニン及び他のプリン 類のＮ９またはシ トシン、ウラシル及び他のピリミジン類のＮ１のような従来の位置で糖部分に結 合するであろう。 「ヌクレオチド」は、糖の３′−位または５′−位でヌクレオシドの糖部分に 共有結合したリン部分を更に有する単量体ヌクレオシド単位を意味する。 「修飾ヌクレオチド間結合」は、天然に産生するオリゴヌクレオチド中で個々 のヌクレオシド単位を接合しているホスホジエステル結合の修飾を意味する。 「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を 有するオリゴヌクレオチドを特定的に意味する。 「部分修飾オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド間結合の少なくとも１つが 修飾されているが全部は修飾されていない修飾オリゴヌクレオチドを意味する。 「完全修飾オリゴヌクレオチド」は、全部のヌクレオチド間結合が修飾されて いる修飾オリゴヌクレオチドを意味する。 「３′−炭素ヌクレオチド間結合」または「３′−炭素結合」または「３′− 炭素修飾結合」は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合の３′−位の二価の酸 素部分が四価の炭素部分によ って置換されているヌクレオチド間結合を意味する。 「３′−メチレンヌクレオチド間結合」または「３′−メチレン結合」または 「３′−メチレン修飾結合」は、３′−炭素結合の３′位の四価の炭素原子が２ 個の水素原子に独立に共有結合している３′−炭素ヌクレオチド間結合を意味す る。 「３′−ヒドロキシメチレンヌクレオチド間結合」または「３′−ヒドロキシ メチレン結合」または「３′−ヒドロキシメチレン修飾結合」は、３′−炭素結 合の３′位の四価の炭素原子が水素原子及びヒドロキシル基に独立に共有結合し ている３′−ヒドロキシメチレンヌクレオチド間結合を意味する。 「３′−炭素修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの３′−炭素結合 を有するオリゴヌクレオチドを意味する。 「３′−メチレン修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの３′−メチ レン結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。 「３′−ヒドロキシメチレン修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの ３′−ヒドロキシメチレン結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。 「標的配列」は、オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌク レオチドとハイリブリダイズするように設計されたヌクレオチド配列を意味する 。抑制性オリゴヌクレオチドの場合には、「標的配列」は、ウイルスタンパク質 、癌関連タンパク質または疾病状態に関与する他のタンパク質をコードする天然 産生メッセンジャーＲＮＡを意味するが、必ずしもこれらに限定はされない。 より詳細には、本発明の３′−炭素修飾オリゴヌクレオチドは、以下に示すよ うな３′−炭素修飾ヌクレオチド間結合を少なくとも１つ有している。 この構造中のＣ１及びＣ２は夫々、オリゴヌクレオチド中で本発明の３′−炭 素修飾ヌクレオチド間結合を介して互いに接合されているヌクレオシド単位の３ ′−位及び５′−位を示す。 この３′−炭素修飾ヌクレオチド間結合を以下の構造に基づいてより十分に説 明する。以下の構造は、この特定の結合を包囲する個々のヌクレオシド単位をよ り詳細に示している。 このオリゴヌクレオチド構造中、Ｂは、プリンまたはピリミジン塩基、代表的 にはアデニン、グアニン、シトシンもしくはチミン（ＤＮＡの場合）またはウラ シル（ＲＮＡの場合）を示す。Ｚは、Ｂがオリゴヌクレオチドの末端塩基である 場合に水素（−Ｈ−）原子を示し、または、オリゴヌクレオチドの次のヌクレオ チド間結合中のリン原子を示す。Ｒ⁴は、代表的には水素（−Ｈ−）原子（ＤＮ Ａの場合）またはヒドロキシル（−Ｈ−）部分（ＲＮＡの場合、または、主鎖に アラビノース単位を有するオリゴヌクレオチドの場合）を示すが、オリゴヌクレ オチドの主鎖中に他の５炭素糖が使用されている場合にはフッ素（−Ｆ−）のよ うな他の原子または部分であってもよい。 Ｒ⁵は、ヌクレオチド間結合中の負に荷電した単結合酸素原子に対する適当な 対イオンを示す。３′−炭素結合中の好ましいＲ⁵官能基は、本発明の３′−炭 素修飾オリゴヌクレオチドの選択された特定用途次第で違っており、本文中で提 供した教示に基づいて当業者に明らかであろう。例えば、普通はＲ⁵がナトリウ ム、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムのような適当な対イオンであるの が好ましく、その理由は、この種の部分はオリゴヌクレオチドの天然構造を最も 破壊し難いからである。また、これらは塩の形態で存在するので野生型オリゴヌ クレオチド中に最も頻出する対イオンである。しかしながら、オリゴヌクレオチ ドの化学合成においては、Ｒ⁵は、ヌクレオチド間結合が比較的苛酷な化学的条 件下に置かれているときに該結合を保護する適当な保護基であってもよい。 −ＣＸＹ−で示されている３′−官能基は炭素官能基を示しており、このＸ及 びＹは、一般には（１）ヌクレオチド間結合の構造の最小限の分裂しか生じさせ ないように設計され、またはいくつかの場合には（２）修飾オリゴヌクレオチド を同定またはターゲッティングするラベルまたは他の手段を直接または間接に（ 即ち、誘導体化を介して）提供するように設計されて いる一価のリガンドの組合わせを示す。前者の場合には、３′−修飾結合の−Ｃ ＸＹ−官能基は、得られた３′−炭素修飾オリゴヌクレオチドが、天然に産生す る核酸の能力、例えばその予定標的に強力にハイブリダイズする能力を効率よく 模倣できるように十分に小さくなければならない。この点で好ましいＸ部分及び Ｙ部分は、水素（−Ｈ−）及びフッ素（−Ｆ−）原子並びにヒドロキシル（−Ｏ Ｈ−）基である。また、水素原子はオリゴヌクレオチドの天然構造に最少量の分 裂を生じさせると予測できるので、Ｘ部分及びＹ部分の双方が水素原子である（ 即ち、３′−炭素結合が３′−メチレン結合である）のが更に好ましい。 しかしながら、ＲＮアーゼＨが３′−炭素修飾を含む核酸二重鎖を認識するこ とが必要であるようないくつかの場合には、ヒドロキシル（−Ｈ−）基またはフ ッ素（−Ｆ−）原子のような親水性官能基を３′−修飾ヌクレオチド間結合の３ ′−炭素に組込んで、天然に発生するヌクレオチド間ホスホジエステル結合の電 気陰性３′−酸素のより有効な置換を得るのが望ましい。その理由は、３′−炭 素（−ＣＸＹ−）官能基に親水性を与える修飾は、３′−メチレン（−ＣＨ₂− ）修飾中の２つの 水素原子のようなより疎水性の修飾よりも野生型オリゴヌクレオチドのより有効 な模倣であると予測されるからである。従って、好ましい３′−炭素修飾はまた 、ＸまたはＹの一方がヒドロキシル基である３′−ヒドロキシメチレン結合でも よい。この場合、多数の修飾結合を含むオリゴヌクレオチドはヌクレオチド間結 合の周囲でより有効な水和を示し、これらの核酸アナローグは天然に産生する対 応化合物と同様の溶液構造を示すと予測される。 オリゴヌクレオチドの化学合成中、成長するオリゴヌクレオチドに付加される 各ヌクレオシド単位のカップリング反応の効率は反応の総効率に多大な影響を与 える。例えば、各カップリング反応の効率が９５％であるような塩基の逐次付加 によって合成された１８量体の理論的収率は僅か４２％である。効率が９０％で あるような逐次カップリング反応で得られる同じ１８量体の理論的収率はたった １７％である。効率９５％を有するカップリング反応を用いて作製された６量体 でさえも理論的収率は７４％に過ぎない。各カップリング反応後に成長するオリ ゴヌクレオチド産物をバックグラウンド材料から分離することが極めて難しく、 時間がかかり、溶液主体の合成の場合には効 率も悪いので、これらの旧式のオリゴヌクレオチド合成方法は、診断目的及び治 療目的に一般に必要な長さの修飾オリゴヌクレオチドを作製するために有効に使 用することができない。更に、溶液主体の合成は時間がかかり目的産物のコスト を高騰させるので、この合成方法を実際にオリゴヌクレオチドの大量生産に使用 することはできない。勿論例外はあり、タンパク質と直接に相互作用するように 設計され得る二量体を代表例とする短いオリゴヌクレオチドの場合は例外と考え られる。これらの短いオリゴヌクレオチドの作製においては溶液主体の合成法の 時間浪費性は致命的な要因にはならない。 本発明は更に、上記のような３′−炭素修飾結合を含むオリゴヌクレオチドを ポリマー支持法(polymer-supported method)で作製する迅速で効率的な方法を提 供する。この高速全自動方法は、在来のポリマー支持法によって作製された非修 飾オリゴヌクレオチドの長さと同等の長さの３′−炭素修飾オリゴヌクレオチド の作製に適している。この方法が重要な理由は、大腸菌のような簡単なゲノムの 配列特異的プローブとして使用するために必要なオリゴヌクレオチドの長さが一 般に約１０〜１２塩基またはそれ以上であると考えられるからである。約６０ヌ クレオチド塩基という上限を定温過程で確認した。その理由は、より長いオリゴ ヌクレオチド産物の溶融温度（Ｔｍ）はこの点またはその周囲の同じ値に収束す るからである。他方、アンチセンスオリゴヌクレオチドは生理温度で有効である ことが必要であり、一般には約１５〜２５ヌクレオチドの長さである。大きいゲ ノム中で偶発する確率が低いという理由から、概してこの範囲内のより長いアン チセンスオリゴヌクレオチドが望ましい。例えば、１７量体オリゴヌクレオチド は哺乳類ゲノムに特有であろう。他方、アンチセンスオリゴヌクレオチドが過度 に長いとき（即ち、実質的に２５ヌクレオチドを上回るとき）、他の非標的配列 に非特異的にハイブリダイズすることがある。緊縮性を増すために患者の生理的 体温を調節することはできないので、この種の非特異的ハイブリダイゼーション は不可避である。 本発明の方法では、所望の目的産物である３′−炭素修飾オリゴヌクレオチド に到達する途中で多数のヌクレオシド中間体の合成が必要である。基幹的な単量 体中間体としては、ヌクレオシド基質、３′−アルケニルヌクレオシド、３′− アルデヒドヌクレオシド及びヌクレオチドシントンがある。簡単に説明 すると、アルデヒドヌクレオシドはアルデヒド保護されたヌクレオチドシントン に結合して、ポリマー支持合成法の最終カップリング段階で３′−炭素修飾ヌク レオチド間結合を形成する。第二のシントン、即ちヒドロキシ保護されたヌクレ オチドシントンも提供される。この第二のシントンは、溶液合成中に３′−炭素 修飾結合を生成させるためまたはポリマー支持合成中に被修飾３′−位を提供す るために使用され得る。後で図示するこれらの構造中で、本発明のヌクレオシド 中間体及びヌクレオチド中間体はデオキシリボヌクレオシド及びデオキシリボヌ クレオチドとして示されているが、リボースのような他の糖を含有するヌクレオ シド及びヌクレオチドも修飾オリゴヌクレオチドに至る中間体として本文中の教 示を逸脱することなく使用し得ることも理解及び認識されよう。 通常は、本発明の多段階合成手順の出発材料として市販のヌクレオシドを使用 するのが好ましい。合成を開始するために、先ず市販のヌクレオシド単位のリボ ース環またはデオキシリボース環の５′−位を保護し、次いで環の３′−位を誘 導体化して、フェニルチオノカーボネートのような適当な反応性基を形成するこ とによってヌクレオシド基質を形成するのが好ましい。 デオキシリボヌクレオシド基質を以下に示す。式中のＢは塩基を示し、Ｒは５′ −位の保護基を示し、Ｒ¹はヌクレオシドの３′−位の反応性基を示す。 上掲のヌクレオシド基質の化学式に基づいて、市販のヌクレオシドであるチミ ジン（“Ｔ”、ピリミジン、化合物１〜３）及びＮ⁶−ベンゾイル−２′−デオ キシアデノシン（“Ａ^Bz”、塩基保護プリン、化合物４〜６）からヌクレオシド 基質を調製する一連の段階を示すためにいくつかの例を表Ｉに示す。 表Ｉの化合物１は市販のチミジンヌクレオシド試薬の非誘導体化形態を示し、 化合物４は市販の２′−デオキシアデノシン試薬のアミノ保護形態を示す。化合 物２及び５は夫々、３′−ヒドロキシル基を所望のチオノカーボネート（化合物 ３及び６）に変換する前に５′−ヒドロキシル基をｔ−ブチルジメチルシリル官 能基で誘導体化することによって保護した同じチミジン及びＮ⁶−ベンゾイル− ２′−デオシアデノシンヌクレオシド試薬を示す。個々のヌクレオシド単位の糖 部分の５′−ヒドロキシル基を保護するために、ｔ−ブチルジメチルシリル以外 の保護基（例えばジヒドロピラノシル）を使用してもよい。誘導 体化が要求される特定のヌクレオシド、他の化学的方法との適合性、他の実用上 及び経済上の要件などの要因を考慮に入れて好ましい保護基は当業者に明らかで あろう。 第二の基幹的な中間体は、糖環の３′−位に二重結合炭素官能基を有し、３′ −アルケニルヌクレオシドと呼ばれるヌクレオシドアナローグである。この第二 の中間体は、上記のヌクレオシド基質から調製される。より詳細には、これらの ３′−アルケニルヌクレオシド中間体は、表Ｉの化合物３及び６のような対応す るチオノカーボネートから調製され得る。３′−アルケニルヌクレオシドは以下 の一般式を有している。 適当なヌクレオシド基質（例えばチオノカーボネート）から所望の３′−炭素 誘導体化ヌクレオシドを生成させるためには、アルキル化反応が必要である。ヌ クレオシド化学法でアルキル 化を行うためには一般にシアノ基（−ＣＮ）アルキル化試薬が使用されている。 しかしながら、反応条件及び使用されるヌクレオシド基質次第では、この種のア ルキル化試薬は、得られる３′−炭素誘導体化ヌクレオシドの光学的に不純なラ セミ混合物を生成し得る。ラセミ混合物はオリゴヌクレオチドの作製に使用でき ない。その理由は、３′−炭素結合の立体化学が正しくないのでヌクレオチド間 結合が不正確になり、従ってオリゴヌクレオチドの生物活性に必要な適正な螺旋 構造が阻止されるからである。しかしながら意外にも、以下の一般式で示される 炭素−炭素二重結合を有するエチレン型のスズ含有アルキル化試薬を使用すると ヌクレオシド基質から光学的に純粋な３′−アルケニルヌクレオシドを作製し得 ることが知見された。 アルキル化試薬のＲ²及びＲ³は、アルキル化試薬の反応性または反応産物の立 体化学を妨害しないいかなる有機基であってもよい。しかしながら、以下の表II の好ましいトリブチルス ズエチルアクリレートに示すように、Ｒ²はエチルカルボキシレート基（ＣＯ₂Ｅ ｔ）であり、Ｒ³はブチル基であるのが好ましい。アルキル化試薬がシス形であ るのが更に好ましい。 アルキル化試薬のスズ部分はラジカル化学作用を促進すると考えられている。 スズアルキル化試薬は従来技術のシアノラジカルアルキル化試薬よりも嵩高いの で、スズアルキル化試薬は立体障害という利点を有し、全部の置換を強制的にヌ クレオシドのリボース環またはデオキシリボース環（または他の糖）の一方側か ら生じさせるので、光学的に純粋な中間体を生成させると考えられる。言い換え ると、得られた３′−アルケニルヌクレオシドの３′−位に新しく形成された炭 素−炭素結合は完全にリボースまたはデオキシリボース環の一方の面に存在する であろう。 上述のように、適当なヌクレオシド基質を好ましいシス形ｔ−ブチルスズエチ ルアクリレートアルキル化試薬と接触させることによって生成された３′−アル ケニルヌクレオシドの例を表IIIに示す。 この種のスズアルキル化試薬は、Ｂａｌｄｗｉｎら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１３３−１３４（１９８４）及びＢａｌｄｗｉｎら，Ｊ ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，６８２−６８４（１９８５）によ って記載されたように非ヌクレオチド合成に関して記載した手順に対する変更に 由来し、これらの手順は本文中に教示したヌクレオシド化学に適応し得る。更に 、有効なビニル伝達基であると報告されたこの一般構造の更に別の誘導体を適応 させることも可能であろう。Ｃｒｉｓｐ ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ，Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１，１３４７−１３５０（１９９０）；Ｆｌ ｙｎｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１０， ７６３−７７９（１９９１）。 表IIIに示した化合物９及び１０のような化合物は、第三の基幹的な中間体、 即ち以下に示す化学式を有し表IVに例示するヌクレオシド３′−アルデヒド誘導 体及び等価の化合物に有効に変換されるので、修飾オリゴヌクレオチドを合成す るための適当な中間体である。 これらのヌクレオシドアルデヒドは本発明の３′−炭素修飾オリゴヌクレオチ ドを合成するための直接中間体または基質として機能する。これらの３′−炭素 修飾オリゴヌクレオチドを生成させる基本的反応は新しいカップリング反応を介 して生じ、この反応においては、上記の３′−アルデヒドヌクレオシド中間体と 以下に示す一般式を有するカップリング試薬とが塩基性触媒の存在下で反応する 。 オリゴヌクレオチドを合成する場合、Ｒ⁵は保護基であり、Ｒ⁶は通常はヌクレ オチド成分であろう。言い換えると、カップリング試薬は更に十分に後述するよ うなヌクレオチドシントンであろう。Ｒ⁶がヌクレオチド成分でない状況では、 Ｒ⁶は一般にはオリゴヌクレオチドの最終修飾に有用な部分であろう。 以下の表Ｖに示す化合物１２、１３及び１４は、３′−アルデヒドヌクレオシ ド前駆物質をオリゴヌクレオチドに組込むために使用されるカップリング試薬の 特定例である。この表において、化合物１２は市販のジメチルホスファイトであ る。化合 物１３及び１４は３′−ヒドロキシ保護されたヌクレオチドシントンである。 カップリング試薬と３′−アルデビトヌクレオシド中間体との反応の結果とし て、以下の一般式を有する修飾ヌクレオチドが形成される。 以下の表VIは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル保護されたチミジン３′−ア ルデヒドデオキシリボヌクレオシドとカップリング試薬１３とから生成した修飾 ヌクレオチド（化合物１５）を示す。 ３′−アルデヒドヌクレオシド中間体と３′−ヒドロキシ保護されたヌクレオ チドシントン（例えば、上記のカップリング試薬１３及び１４）との間のカップ リング反応は、本発明の３′−炭素修飾結合を含むより短いオリゴヌクレオチド の溶液主体の合成に直接応用可能である。更に、ジメチルホスファイト（化合物 １２）のようなジアルキルホスファイトは、３′−アルデヒドヌクレオシド中間 体に結合して、ヌクレオシド３′−モノホスフェート及びジヌクレオシド３′− モノホスホネートを生成し得る。 しかしながら、ポリマー支持法によって３′−炭素修飾ヌクレオチド間結合を 連続的に合成するためには、３′−アルデヒド保護ヌクレオチドシントンが必要 である。この３′−アルデヒド保護ヌクレオチドシントンを得るためには、先ず ３′−アルデヒドヌクレオシドのアルデヒド官能基を、慣用のオリゴヌクレオチ ド合成中のジメトキシトリチル基のトリクロロ酢酸による開裂と同様に比較的穏 やかな条件を用いて開裂できる保護基によって保護する。この種の保護基の例は 、ジチオアセタール官能基及び以下に示すＮ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジン官 能基である。 ３′−アルデヒドヌクレオシドのアルデヒド官能基の保護に適した他の保護基 は、本発明の教示に従って当業者に明らかであろう。その例としては、アセター ル、オキサチオラン及びその他の公認のアルデヒド保護基がある。以下の表VII はＮ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノアルデヒド保護ヌクレオシドの変種を示す 。 化合物１６及び１８は５′−位に追加の基（Ｒ）を有している。化合物１６の アルデヒド保護ヌクレオシドの場合には、５′−位の脱保護によって、遊離５′ −ヒドロキシル（化合物１７）が生成され、このヒドロキシルは更に誘導体化さ れてヌクレオシドアルキルホスファイト（化合物１８）を生成し得る。このアル デヒド保護ヌクレオチドシントンは、固体支持体上で ３′−炭素修飾ヌクレオチド間結合を段階的に構築する合成サイクルで使用され 得る。 ３′−アルデヒド保護ヌクレオチドシントン中の活性リン部分は５′−位に結 合しているので、ポリマー支持法による修飾オリゴヌクレオチドの合成は、慣用 の非修飾オリゴヌクレオチドの合成法と対照的に、５′から３′の方向に進行し なければならない。ポリマー支持法による非修飾オリゴヌクレオチド合成に関し ては、慣用でない５′から３′への合成方向は公知であるが、この方向の合成が 緩慢であることは周知であり、従って商業的環境では不利である。しかしながら 意外にも、本発明のアルデヒド保護ヌクレオチドシントンは５′から３′の方向 で３′−炭素修飾結合を迅速に合成し得ることが知見された。 通常は、オリゴヌクレオチドのポリマー支持合成法は、固体支持体に結合され たヌクレオシドを出発点として開始される。本発明方法はこの点では全く違って いない。より詳細には、化合物１７のような、保護アルデヒド官能基を含むが５ ′−位が非保護のヌクレオシドアナローグを先ず、確立された合成方法に従って 非保護５′−位を誘導体化することによって適当な固 体支持体に結合させる。好ましい固体支持体はＣＰＧ（コントロールドポアガラ ス）であるが、他の固体支持体が当業界で公知であり本発明方法による合成に好 適であり得ることは理解されよう。最初のヌクレオシドを固体支持体に結合する ためには、慣用のスクシニルまたはサルコシニルリンカーを使用し得るが、これ らの反応に限定はされない。次に、得られた適正に誘導体化された固体支持体を 用い、慣用のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを以下の方法に従って使用して５′ から３′の方向の固相合成を開始し３′−炭素修飾オリゴヌクレオチドを得る。 先ず、最初に結合したヌクレオシドからアルデヒド保護基を開裂する酸によっ て支持体を処理する。次に、この結合ヌクレオシドの遊離アルデヒドを化合物１ ８のような３′−アルデヒド保護ヌクレオチドシントンと結合させて、固体支持 体上にヒドロキシメチレン修飾ダイマーオリゴヌクレオチドを生成させる。ポリ マー支持されたオリゴヌクレオチドの数回の洗浄段階後、支持体を再び酸処理し て、修飾オリゴヌクレオチド鎖を成長させるアルデヒド官能基を再生する。カッ プリング段階の反復によってオリゴヌクレオチド鎖は毎回１塩基ずつ延長される 。 しかしながら、合成すべき特定のオリゴヌクレオチド産物の要件次第では、こ のサイクルに多くの異なる変更を加えることが可能であることは理解されよう。 （例えば、部分修飾オリゴヌクレオチドの合成）。これらの変更を以下に要約す る。 慣用のオリゴヌクレオチド合成においては、不適格な配列の不都合なカップリ ングが進行することを防止するために“キャッピング”段階が必要である。本発 明の合成方法の場合、不適格な配列の不都合な副反応を防止するために、ジメチ ルホスファイト（化合物１２）を用いて樹脂のキャッピングを行い、不適格な配 列の成長鎖を終止させる。 本文中に記載されたカップリング反応は、化合物１８のような３′−アルデヒ ド保護されたヌクレオチドシントンの結合に限定されない。例えば、化合物１４ のような３′−ヒドロキシ保護されたヌクレオシドも一連のカップリング反応の 終端段階として結合し、オリゴヌクレオチドの３′−端の保護された３′−ヒド ロキシを脱離し得る。これは特に、以後の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）によるオリゴヌクレオチドの精製を容易にするであろう。または、化合物１ ２を３′−末端に結合させてもよい。同様に、他のホスファイトシントンはオ リゴヌクレオチドの３′−末端に結合し得る。例えば、表Ｖに示すカップリング 試薬のＲ⁶部分の非限定例としては、３′−ジデオキシヌクレオシドまたはコレ ステロールのような分子またはフルオレセインのようなある種の蛍光分子または この化学作用と適合する任意の望ましい分子がある。 本発明のカップリング反応は、修飾オリゴヌクレオチドの３′−炭素に遊離ヒ ドロキシル基を生成する。従って、３′−ヒドロキシメチレン結合が望まれる場 合、３′−炭素をそれ以上修飾する必要はない。しかしながら、他の３′−炭素 修飾結合が望まれる場合には、オリゴヌクレオチドの合成中または合成後にヒド ロキシル官能基を修飾し得る。例えば、ヒドロキシル基を水素原子によって置換 してもよく（３′−メチレン結合の場合）またはフッ素原子または他の原子もし くは基によって置換してもよい。修飾オリゴヌクレオチドが３′−修飾結合だけ を含むことが望ましい場合（即ち、完全３′−炭素修飾オリゴヌクレオチド）、 遊離ヒドロキシル基の置換は所望のオリゴヌクレオチド配列の構築後に１段階で 行う。しかしながら、非修飾（ホスホジエステル）結合のような異なるヌクレオ チド間結合を部分修飾オリゴヌクレオチド産物に組込む必要がある場 合、３′−炭素修飾結合の遊離ヒドロキシル基の置換は、合成サイクル中で個々 の３′−炭素修飾結合の各々を構築した後に行わなければならない。 本発明の合成方法は、当業界で現行のポリマー支持法によるオリゴヌクレオチ ドの全自動合成法に適合する。従って、ホスホジエステル合成においてホスホジ エステル結合が３′−炭素修飾ヌクレオシドの組込みに使用されるのと同じ慣用 でない５′から３′の方向で行われる限り、３′−炭素修飾結合と非修飾（ホス ホジエステル）結合とから成る部分修飾オリゴヌクレオチドの合成は容易に行わ れ得る。例えば、３′−炭素修飾結合の組込みに関して上述したように最初にホ スホネートの合成を開始させると仮定した場合、先ず所望数の３′−炭素修飾結 合が合成され、次いで鎖中に生成した最終の３′−アルデヒドが、上記の化合物 １４のような５′−アルキル−３′−ジメトキシトリチル化−ホスファイトに結 合される。このカップリング反応後に、遊離ヒドロキシメチレンホスホネートを 上述のように修飾するかまたは例えば無水酢酸で「キャッピング」することによ って保護し得る。最後に３′−末端ジメトキシトリチル官能基を酸脱保護するこ とによって、３′−ヒドロキシル 基が生成する。この基は適当な５′−ホスホルアミダイトとカップリングするこ とによってホスホジエステル結合を合成し得る。ホスホネート化学作用に戻るこ とが望ましい場合には、末端３′−ヒドロキシル基を化合物１９のような保護さ れたアルデヒド官能基を含む５′−ホスホルアミダイトシントンと反応させ得る 。 このようにして、所望の任意の位置に少なくとも１つの修飾ホスホネート結合 をもつオリゴヌクレオチドアナローグを構築し得る。同様にして、これらの化学 作用を、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホノチオエー ト及びメチルホスホネートのような他のホスホルアミダイト主体の方法と組合わ せることも可能である。 また、Ｒ⁵官能基が必ずしもメチル基（ＭｅすなわちＣＨ₃）に限定されないこ とも理解されよう。この場合、化学作用と適合性の任意の保護基を使用し得る。 または、適正なホスファイト／ホスホルアミダイト（該当するＲ⁵を含む化合物 １２、１４、１８、１９）の合成によって、修飾ヌクレオチド間結合の非架橋原 子を介して他の生物学的に望ましい部分を修飾オリゴヌクレオチドに結合させ得 る。 修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドに関して確立されたプ ロトコルに従って脱保護され得る。例えば、リン部分にメチル保護を使用した場 合、保護されたオリゴヌクレオチドを先ずチオフェノールまたは公認の等価試薬 によって処理してメチル官能基を除去する。この反応後に、オリゴヌクレオチド をアンモニアで適当な時間処理して、オリゴヌクレオ チド産物を固体支持体から開裂させ、塩基保護基を除去し、ＨＰＬＣまたはポリ アクリルアミドゲル電気泳動のような公認の標準法に従って精製する。 以下の実施例は本発明の理解を助けるために提示したものであり、本発明の適 正な範囲は請求の範囲に記載されている。本発明の要旨を逸脱することなく記載 の手順の変更が可能であることは理解されよう。 特段の注釈がない限り、溶媒及び試薬は市販ソースから入手した。３′−Ｑ− ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジンは、市販の５′−Ｑ−（４，４′−ジ メトキシトリチル）チミジンとｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドとを反 応させ、次いでｐ−トルエンスルホン酸によってトリチル基を除去することによ って調製した。３′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）チミジンは、５′ −Ｑ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（実施例１で調製）と４，４′ −ジメトキシトリチルクロリドとを反応させ、次いでシリル基をテトラブチルア ンモニウムフルオリドで除去することによって調製した。 実施例１ ５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（化合物２）の合成） ５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（化合物２、表Ｉ）を下 記の手順で製造した。チミジン（２５ｇ、０．１０ｍｏｌｅ）、４−Ｎ，Ｎ−ジ メチルアミノピリジン（３．１５ｇ、０．０２６ｍｏｌ）及びトリエチルアミン （１３．５ｇ、１８．６ｍｌ、０．１３ｍｏｌ）をアルゴン流下で２００ｍｌの 乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。該溶解混合物に１９．４ｇ（０ ．１３ｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシランを加え、混合物全体を ６時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。得られたゴム状物質を３０ｍｌの酢酸エ チルに溶解し、該溶液を重炭酸ナトリウム飽和溶液１０ｍｌ、水３０ｍｌ及びブ ライン３０ｍｌで抽出した。有機層を乾燥した後、残渣を、ジクロロメタン／エ タノール（５０／１）を溶離剤として用いるフラッシュクロマトグラフィーで精 製した。生成物含有フラクションを蒸発させると、所望の５’−Ｏ−ｔｅｒｔ− ブチルジメチルシリルチミジンが白色泡状物質として３１．５ｇ得られた（収率 ８６％）。 実施例２ ５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−フェノキシチオカルボ ニルチミジン（化合物３）の合成 下記の手順で５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−フェノ キシチオカルボニルチミジン（化合物３、表Ｉ）を製造した。実施例１の５’− Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン７．２９ｇ（２０．４ｍｍｏｌ） を１００ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、次いで３．８９ｇ（３１．８ｍｍ ｏｌ）の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン及び３．５８ｇ（２０．７４ｍｍ ｏｌ）のフェニルクロロチオノホルメートを加え、その後室温で４時間撹拌し、 その時点で１０ｍｌの水を加え、有機層を水で抽出した。有機層を蒸発させ、残 渣を、ジクロロメタン中２％エタノールを溶離剤として用いるクロマトグラフィ ーで精製した。生成物含有フラクションから溶媒を蒸発させると、保護されたヌ クレオシド５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−フェノキシ チオカルボニルチミジンが白色泡状物質として７．９ｇ得られた（収率７９％） 。 実施例３ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキ シアデノシン（化合物５）の合成 実施例１に記載の５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジンの製造 に使用したものと類似の手順で、但しＮ⁶−ベンゾイル−２’−デオキシアデノ シン（１０ｇ、２６．９ｍｍｏｌ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０ ．８６ｇ、７．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３．６ｇ、４．９６ｍｌ、３ ５．４ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（５．３３ｇ、３ ５．４ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して 、Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオ キシアデノシン（化合物５、表１）を製造した。反応混合物を２時間撹拌してか ら実施例１に記載のように処理した。ジクロロメタン／エタノール（２０／１） を溶離剤として用いてクロマトグラフィーを実施した結果、Ｎ⁶−ベンゾイル− ５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシアデノシンが白色 泡状物質として９．６ｇ得られた（収率７３％）。 実施例４ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキ シ−３’−Ｏ−フェノキシチオカルボニルアデノシン（化合物６）の合成 実施例２に記載の５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−フ ェノキシチオカルボニルチミジンの製造に使用したものと類似の手順で、但し実 施例３のＮ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’ −デオキシアデノシン０．５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ ノピリジン（０．２６ｇ、２．１ｍｍｏｌ）及びフェニルクロロチオノホルメー ト（０．２４ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解して 、Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオ キシ−３’−Ｏ−フェノキシチオカルボニルアデノシンを製造した。この場合は 、反応混合物を通常のように処理する前に１６時間撹拌した。トルエン中酢酸エ チルを溶離剤として用いてクロマトグラフィーを実施した結果、保護されたヌク レオシドＮ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’ −デオキシ−３’−Ｏ−フェノキシチオカルボニル アデノシンが０．３９ｇ得られた（化合物６、収率６１％）。 実施例５ エチル−３−トリブチルスタンニル−２−プロペノエート（化合物７及び８）の 合成 アルキル化試薬として使用するためのエチル−３−トリブチルスタンニル−２ −プロペノエート（シス及びトランス形態、化合物７及び８、表II）を下記の手 順で製造した。エチルプロピオレート（５７．１８ｇ、０．５８ｍｏｌ）、水素 化トリブチルスズ（１４０ｇ、１２９ｍｌ、０．４８ｍｏｌ）及びアゾ−ビス− イソブチロニトリル（１ｇ、０．００７ｍｏｌ）を１ｌ丸底フラスコ内で混合し た。この混合物を凍結−ポンプ−解凍脱ガス(freeze-pump-thaw degassed)に３ 回かけ、次いで油浴中８０℃で４時間撹拌し（この反応は潜在的に爆発性である ため十分な注意を要する）、４時間が経過した時点で反応混合物を油浴から取り 出し、室温に冷却する。冷却した混合物を１００ｍｌの酢酸エチルと一緒に蒸発 させ、得られた残渣を、ヘキサン／ジクロロメタン（９９／１）を溶離剤として 用いるカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物含有フラクションを蒸発さ せた結果、７３．５ｇのシス−エチル−３−トリブ チルスタンニル−２−プロペノエートアルキル化試薬（化合物７、収率３２％） 、及び６６．８ｇのトランス−エチル−３−トリブチルスタンニル−２−プロペ ノエートアルキル化試薬（化合物８、収率２９％）が得られた。 実施例６ ５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ−３’−エチルア クリルイルチミジン（化合物９）の合成 下記の手順で５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ− ３’−エチルアクリルイルチミジンを製造した。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジ メチルシリル−３’−Ｏ−フェノキシチオカルボニルチミジン（１．４ｇ、２． ８ｍｍｏｌ）、ヘキサメチルジチン（０．４６ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を１００ｍ ｌ丸底フラスコ内でシス−エチル−３−トリブチルスタンニル−２−プロペノエ ート（３．０６ｇ、７．９ｍｍｏｌ）に懸濁し、該溶液に０．１４ｇ（１ｍｍｏ ｌ）のアゾ−ビス−イソブチロニトリルを加えた。該混合物を凍結−ポンプ−解 凍脱ガスに３回かけ、次いで油浴中に８７℃で２日間配置した。約１２時間毎に 別の０．１４ｇアリコートのアゾ−ビス−イソブチロニトリル（０．１４ｇ）を 反応混合物に加えた。２日間 インキュベートした後、反応混合物を冷却し、溶媒を蒸発によって除去した。ジ クロロメタン／エタノール（１００／１）を用いて残渣をクロマトグラフィーに かけると、適当なフラクションの蒸発後に、０．９０ｇの５’−Ｏ−ｔｅｒｔ− ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ−３’−エチルアクリリルチミジン（化 合物９、表III）が白色泡状物質として得られた（収率７２％）。 実施例７ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’，３’− ジデオキシ−３’−エチルアクリルイルアデノシン（化合物１０）の合成 下記の手順でＮ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル −２’，３’−ジデオキシ−３’−エチリアクリルイルアデノシン（化合物１０ 、表III）を製造した。Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル シリル−２’−デオキシ−３’−Ｏ−フェノキシチオカルボニルアデノシン（５ ０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、シス−エチル−３−トリブチルスタンニル−２− プロペノエート（９２ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ）及びヘキサメチルジチン（１ ３ｍｇ、 ０．０４ｍｍｏｌ）を４０ｍｌシュレンク管内で２ｍｌのトルエンに溶解し、次 いで該混合物に１５ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）のアゾ−ビス−イソブチロニトリ ルを加えた。得られた混合物を凍結−ポンプ−解凍脱ガスに３回かけ、次いで油 浴中８７℃で３日間加熱した。約１２時間毎に、新たに１５ｍｇのアゾ−ビス− イソブチロニトリルを反応混合物に加えた。３日間インキュベートした後、反応 混合物を冷却し、溶媒を蒸発させ、残渣を、ジクロロメタン中１％エタノールを 溶離剤としてクロマトグラフィーにかけた。適当なフラクションの蒸発後にＮ⁶ −ベンゾイル−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’，３’−ジデ オキシ−３’−エチルアクリルイルアデノシンが白色固体物質として１９ｍｇ得 られた（収率４２％）。 実施例８ ５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ−３’−ホルミル チミジン（化合物１１）の合成 下記の手順で５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ− ３’−ホルミルチミジン（化合物１１、表VII）を製造した。５’−Ｏ−ｔｅｒ ｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ−３’−エチルアクリルイルチミジ ン（１ｇ、 ２．３ｍｍｏｌ）及び４−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（０．５２ｇ、４． ４ｍｍｏｌ）をアセトン４０ｍｌと水４ｍｌとの溶液中に溶解して、透明薄黄色 溶液を形成した。次いで、四酸化オスミウム水溶液（１１．２ｍｌ、０．０５０ ｇ／ｍｌ、２．２．ｍｍｏｌ）を加え、得られた薄黄色混合物を２時間撹拌した 。２時間が経過した時点で、反応混合物に１．１７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ ５．４７ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を更に１時間続けた。次いで撹拌混合物を０． ６０ｇの重亜硫酸ナトリウムで処理し、該反応混合物を更に１時間撹拌した。１ 時間が経過した時点で溶媒を蒸発させ、残渣を３０ｍｌの酢酸エチルに再溶解し た。再溶解残渣を含む溶液を水（３×２０ｍｌ）で洗浄し、次いで無水硫酸ナト リウムで乾燥した。溶媒を蒸発させると、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル シリル−３’−デオキシ−３’−ホルミルチミジンが未精製の赤色泡状物質とし て０．５９ｇ得られた（収率７１％）。この生成物は通常、それ以上精製しない で使用する。 実施例９ ３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−Ｏ−メチル ホスフ ァイト（化合物１３）の合成 下記の手順で３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−Ｏ −メチルホスファイト（化合物１３、表VIII）を製造した。まず、３’−Ｏ−ｔ ｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（１．３ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ジ クロロメタン（１５ｍｌ）及びトリエチルアミン（２ｍｌ）に溶解し、この溶液 にＮ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホナミド酸クロリド（１．２８ｍｌ、６． ６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１５分間撹拌した後、酢酸エチル（５０ｍ ｌ）中に希釈した。有機層を重炭酸ナトリウム飽和溶液（５０ｍｌ）及び水（５ ０ｍｌ）で洗浄し、溶媒を蒸発させた。残渣をアセトニトリル（１５ｍｌ）に再 溶解し、該溶液に水（０．５３ｍｌ、２９ｍｍｏｌ）及びテトラゾール溶液（０ ．５Ｍ、７．３ｍｌ、３．６ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を２０分間撹拌 した後、ジクロロメタン（５０ｍｌ）中に希釈した。この有機溶液を重炭酸ナト リウム飽和溶液（５０ｍｌ）、炭酸ナトリウム１０％溶液（５０ｍｌ）及びブラ イン（５０ｍｌ）で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過及び溶媒の蒸発後に得られたゴム状物質を クロマトグラフィーカラムで精製した。まずカラムをクロロホルム及びクロロホ ルム中２％エタノールで順次溶離し、その後生成物をクロロホルム中４％エタノ ールで溶離した。溶媒の蒸発後に、生成物３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル シリルチミジン−５’−Ｏ−メチルホスファイトがゴム状物質として得られた（ １．１ｇ、６９％）。 実施例１０ ３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−５’−Ｏ−メチルホス ファイト（化合物１４）の合成 下記の手順で３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−５’− Ｏ−メチルホスフィト（化合物１４、表VIII）を製造した。３’−Ｏ−（４，４ ’−ジメトキシトリチル）チミジン（０．８５ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を乾燥ピ リジン（２０ｍｌ）と一緒に２回蒸発させ、乾燥ジクロロメタン（８．５ｍｌ） 及びトリエチルアミン（０．６８ｍｌ）に溶解した。該溶液をドライアイス／ア セトン浴中で−７８℃に冷却し、これにＮ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホナ ミド酸クロリド（０．４９ｍｌ、２．５２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合 物を２０分間撹拌した後、酢酸エチル（５０ｍｌ）中に希釈した。有機層を重炭 酸ナトリウム飽和溶液（５０ｍｌ）及び水（５０ｍｌ）で洗浄し、溶媒を蒸発さ せた。残渣をアセトニトリル（１５ｍｌ）に再溶解し、次いで該アセトニトリル 混合物に水（０．２５ｍｌ、１３．９ｍｍｏｌ）及びテトラゾール溶液（０．５ Ｍ、５．１ｍｌ、２．６ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を２０分間撹拌した 後、ジクロロメタン（５０ｍｌ）中に希釈した。この有機溶液を重炭酸ナトリウ ム飽和溶液（５０ｍｌ）、炭酸ナトリウム１０％溶液（５０ｍｌ）及びブライン （５０ｍｌ）で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過及び溶媒の 蒸発後に得られたゴム状物質を酢酸エチル（１０ｍｌ）に溶解して、生成物をペ ンタン（５００ｍｌ）中に沈殿させた。濾過し、真空下で一晩乾燥すると、生成 物３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジニル−５’−Ｏ−メチル ホスファイト（化合物１４、表VIII）が白色固体物質として０．７５ｇ、即ち収 率７７％で得られた。 実施例１１ ５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ−３’−メトキシ ホスホニルヒドロキシメチルチミジニル−（３’→５’）−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ −ブチルジメチルシリルチミジン（化合物１５）の合成 下記の手順で５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ− ３’−メトキシホスホニルヒドロキシメチルチミジニル−（３’→５’）−３’ −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（化合物１５、表IX）を製造し た。まず、未精製５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ −３’−ホルミルチミジン（化合物１１、０．７８ｇ、２．１１ｍｍｏｌ、実施 例８の１ｇの化合物９から得た）を乾燥ピリジン（１４ｍｌ）に溶解した。この 溶液をベンゼン（２０ｍｌ）中の３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチ ミジン−５’−Ｏ−メチル−Ｈ−ホスホネート（１．９１ｇ、４．４ｍｍｏｌ） 溶液と混合し、該混合物に１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７ −エン（ＤＢＵ、１６５μｌ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。該混合物を３０分間 撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残渣をクロマトグラフィーで精製した。 生成物の溶離は、ジクロロメタン中５％エタノールを溶離剤として用いて実施し た。その結果、所望の生成物（化合物１５、１．０２ｇ、化合物９から計算して ５６％）が黄色がかった白色の泡状物質として得られた。 実施例１２ ５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジン（化合物１６）の合成 下記の手順で５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ− ３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジン（化合物１６、表 Ｘ）を製造した。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオキシ −３’−ホルミルチミジン（１．３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのベンゼン に溶解し、次いで該溶液に１．５ｇ（７．０ｍｍｏｌ）の１，２−ジアニリノエ タンを加えた。得られた混合物を６０℃で一晩撹拌した。この時点で２０ｍｌの 重炭酸ナトリウム飽和水溶液を加え、該溶液を酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽 出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、有機層を蒸発させ、残渣を、エタノ ール／トリエチルアミン／ジクロロメタン （１／２／９７）を溶離剤としてクロマトグラフィーにかけた。適当なフラクシ ョンを蒸発させると、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−デオ キシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジンが淡褐色固 体物質として１．２５ｇ得られた（収率６３％）。 実施例１３ ３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジン （化合物１７）の合成 ３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジ ン（化合物１７、表Ｘ）を下記の手順で製造した。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル ジメチルシリル−３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリ ジノ）−チミジン（０．８ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、 撹拌し、次いで該撹拌溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＨＦ中１Ｍ溶 液、８．３ｍｌ、８．３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を３０分間撹拌し た。トリエチルアミン（２ｍｌ）を加えた後、溶媒を蒸発させた。エタノール／ トリエチルアミン／ジクロロメタン（２／２／９６）を溶離剤として用いるフラ ッシュクロマトグラフィーで残渣を精製した。 生成物含有フラクションを蒸発させ、残渣をペンタン中に沈殿させると、３’− デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジンが淡褐 色固体物質として０．６３ｇ得られた（収率９９％）。 実施例１４ ３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジン −５’−Ｏ−メチルホスファイト（化合物１８）の合成 ３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジ ン−５’−Ｏ−メチルホスファイト（化合物１８、表Ｘ）を下記の手順で製造し た。３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミ ジン（２００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２０ｍｌ）と一緒に２ 回蒸発させ、乾燥ジクロロメタン（５ｍｌ）及びトリエチルアミン（０．１７ｍ ｌ）に溶解した。該溶液をドライアイス／アセトン浴で−７８℃に冷却し、これ にＮ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホナミド酸クロリド（０．１４ｍｌ、０． ７２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を２０分間撹拌し、その時点でＮ，Ｎ−ジ イソプロピルメチルホスホナミド酸クロ リド（０．０２ｍｌ、０．０１ｍｍｏｌ）を更に加えた。更に１５分後、該混合 物を酢酸エチル（５０ｍｌ）中に希釈した。有機層を重炭酸ナトリウム飽和溶液 （５０ｍｌ）及び水（５０ｍｌ）で洗浄し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣をア セトニトリル（５ｍｌ）に溶解し、次いで該アセトニトリル混合物に水（０．１ ６ｍｌ、２．９ｍｍｏｌ）及びテトラゾール溶液（０．５Ｍ、１．０ｍｌ、０． ５ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を２０分間撹拌した後、ジクロロメタン（ ５０ｍｌ）中に希釈した。この有機溶液を重炭酸ナトリウム飽和溶液（５０ｍｌ ）、炭酸ナトリウム１０％溶液（５０ｍｌ）及びブライン（５０ｍｌ）で洗浄し 、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過及び溶媒の蒸発後に得られたゴム 状物質を酢酸エチル（３ｍｌ）に溶解した。ペンタン（４００ｍｌ）を加えて生 成物を沈殿させた。上澄みを静かに流し捨て、固体物質をペンタンで洗浄した後 、真空下で一晩乾燥すると、生成物が１８０ｍｇ得られた。これは収率７６％に 相当する。 実施例１５ ３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジン −５’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−メチルホスホルアミダイト（化合物１９ ）の合成 ３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジ ン−５’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−メチルホスホルアミダイト（化合物１ ９、表１０）を下記の手順で製造した。３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ− ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジン（２００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を乾 燥ピリジン（２０ｍｌ）と一緒に２回蒸発させ、次いで得られた固体を乾燥ジク ロロメタン（５ｍｌ）及びトリエチルアミン（０．１７ｍｌ）に溶解した。この 溶液に室温でＮ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホナミド酸クロリド（０．１２ ｍｌ、０．６２ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、該混合物を酢酸エチル（５０ｍ ｌ）中に希釈した。この有機溶液を重炭酸ナトリウム飽和溶液（５０ｍｌ）、炭 酸ナトリウム１０％溶液（５０ｍｌ）及びブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、次い で無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過及び溶媒の蒸発後に得られたゴム状物質 を酢酸エチル（３ｍｌ）に溶解した。ペンタン （４００ｍｌ）を加えて生成物を沈殿させた。上澄みを静かに流し捨て、固体物 質をペンタンで洗浄した後、真空下で一晩乾燥した（収率１６０ｇ、５９％）。 実施例１６ オリゴヌクレオチド類似体の合成 Ａ． 固体支持体への３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダ ゾリジノ）−ヌクレオシドの結合 類似体合成が５’→３’方向に進行し得るように５’−ヒドロキシルを介して 適当な固体支持体に誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）ヌクレオシドを結合す る。例えば、３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ ）チミジン（２００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）及び４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ ピリジン（７８．５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２×２０ｍｌ） と一緒に蒸発させた。得られた残渣を乾燥ピリジン（２０ｍｌ）に溶解し、該溶 液に無水コハク酸（３４．４ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合 物を一晩撹拌した。次いで溶媒を蒸発させ、残渣をトルエンと一緒に蒸発させた 後、ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解した。有機層を水（２０ｍｌ）で２回洗 浄し、無水硫酸ナトリウムで 乾燥した。濾過後に得られた透明溶液を約１０ｍｌに濃縮し、生成物をヘキサン ／エーテル（１／１、５０ｍｌ）中に沈殿させた。生成物３’−デオキシ−３’ −（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジン−５’−Ｏ−スクシネ ート（１９５ｍｇ、８０％）を濾過によって分離し、それ以上精製せずに使用し た。 スクシニル化ヌクレオシド（２４０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン （５ｍｌ）と乾燥ジオキサン（５ｍｌ）との混合物に溶解した。該溶液に１，３ −ジシクロヘキシルカルボジイミド（１７７ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）及び４− ニトロフェノール（６０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加え、該反応混合物を一晩 撹拌した。この時点で沈殿物を濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をトルエン（１ ０ｍｌ）と一緒に２回蒸発させ、未精製３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ− ジフェニルイミダゾリジノ）−チミジン−５’−Ｏ−スクシネート−（４−ニト ロフェニル）エステルをコントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐ ｏｒｅ ｇｌａｓｓ）の誘導体化に使用した。 長鎖アルキルアミン誘導体化コントロールドポアガラス （８９μｍｏｌ／ｇ）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、５ｍｌ）に懸濁し、 これに未精製３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノ ）−チミジン−５’−Ｏ−スクシネート−４−ニトロフェニルエステルをＴＨＦ （３ｍｌ）及びトリエチルアミン（２．３ｍｌ）中溶液の形態で加えた。この混 合物を一晩振盪し、誘導体化支持体を濾過によって分離した。該支持体をＮ，Ｎ −ジメチルホルムアミド（３×１０ｍｌ）、ジオキサン（３×１０ｍｌ）、メタ ノール（５×１０ｍｌ）及びエーテル（３×１０ｍｌ）で洗浄した。 下記の手順で樹脂のキャッピングを行った。コントロールドポアガラスを乾燥 ピリジンに懸濁し、無水酢酸（０．５ｍｌ）で処理した。この混合物を３０分間 振盪した。次いで、完全に官能化した支持体を濾過し、メタノール（６×１０ｍ ｌ）及びエーテル（３×１０ｍｌ）で洗浄した後、乾燥した。 Ｂ． オリゴヌクレオチドホスホネートの合成 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を用 いて、オリゴヌクレオチド類似体の合成を行った。前記装置を用いれば、前述の 試薬を使用して、均一な又は断続的なホスホネート官能基を含む類似体を合成し 得る。 Ｃ． 完全修飾オリゴヌクレオチドの合成 最も簡単な事例では、３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニルイミ ダゾリジノ）−ヌクレオシドで修飾した固体支持体を酸の存在下で脱ブロックし て、樹脂に結合した３’−ホルミルヌクレオシドを得る。酸を除去するために樹 脂を洗浄した後、ＤＢＵ（ピリジン中５３ｍＭ）を活性剤として用いて、化合物 １８（ベンゼン中０．１Ｍ）のような３’−修飾−５’−ホスファイトの存在下 でカップリングを生起させる。合成は５’→３’方向に進行する。更に別の洗浄 ステップ後に、化合物１８のような単量体構築ブロックを用いてサイクルを繰り 返し、適当な配列を形成する。１４（ベンゼン中０．１Ｍ）のような３’−Ｏ− ジメトキシトリチル化ホスファイトを配列中の最終（３’末端）ヌクレオチドと してカップリングさせた。例えば、核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）（約０．５ μＭのスケール）としてのチミジンとの間に６個の均一ヒドロキシメチレンホス ホネート結合を合成するのに必要とされる自動化ステップは下記の通りであった ： この方法で、６個の連続した３’−ヒドロキシメチレンホスホネートヌクレオ チド間結合を有する完全修飾７量体Ｔ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ（^*は３’−ヒドロキ シメチレン修飾ヌク レオチド間結合を表す）が合成され、収率は７１％であった（３１Ｐ ＮＭＲ（ Ｄ₂Ｏ）；δ１９−２０ｐｐｍ）。この修飾オリゴヌクレオチドを、トリチルを 保護基として用いて標準的ＨＰＬＣ法（例えば、Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓ ， Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ １３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ Ｉｎｃ．１９８７参照）で精製し、次いでＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ Ｄ ＮＡ，ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔ ｉｅｓ ，１９１−２０６（Ａｇｒａｗａｌ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９ ９３）に記載のＷｉｅｓｌｅｒらの方法で脱トリチル化した。 Ｄ． 部分修飾オリゴヌクレオチドの合成 この実施例は、ホスホネート結合を形成するために使用する化学を、ホスホル アミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学のようなオリゴヌクレオチ ド化学の一般的方法と一緒に使用する方法を説明する。一具体例を、修飾オリゴ ヌクレオ チドＴＴ^*ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（^*は３’−ヒドロキシメチレン修飾ヌクレ オチド間結合の位置を示す）の合成について示す。但し、実施例１６Ｃに記載の 完全修飾オリゴヌクレオチドの合成と同様に、合成は５’→３’方向に進行する 。この実施例では、市販の３’−ジメトキシトリチル化固体支持体を、標準的機 械プロトコルを用いて脱トリチル化し、テトラゾール（アセトニトリル中０．５ Ｍ）の存在下で５分間にわたり３’−デオキシ−３’−（２−Ｎ，Ｎ−ジフェニ ルイミダゾリジノ）−チミジン−５’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−メチルホ スホルアミダイト（化合物１９、アセトニトリル中０．１Ｍ）にカップリングし た。カップリング後は標準的キャッピング及び酸化プロトコルを適用する。この ジヌクレオチド単位の合成後、均一ヒドロキシメチレンホスホネートに関する前 記サイクルのセクション８で概要を説明したプロトコルを適用して、末端３’− ジメトキシトリチル官能基との単一ヒドロキシメチレンホスホネート結合を形成 した。この時点で、固体支持体を機械キャッピング溶液で５分間処理した。配列 の残りは、市販の５’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルア ミダイト（この実施例ではチミジンの）を使用して、これらのホスホ ルアミダイトに関する標準的機械プロトコルを用いて完成させる。 ヒドロキシメチレンホスホネート結合を一つ有する１４量体オリゴチミジレー ト（ｏｌｉｇｏｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ）（収率１８％：³¹Ｐ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ ）；δ１９−２０ｐｐｍヒドロキシメチレンホスホネート；０ｐｐｍホスホジエ ステル）。 Ｅ． 誘導体化ＣＰＧローディング能力の測定 単一カップリングサイクルを実施することにより、修飾デオキシリボヌクレオ シドのローディングを評価した。この場合は、樹脂をトリクロロ酢酸で処理し、 溶媒で洗浄し、ＤＢＵ（ピリジン中５３ｍＭ）の存在下で３’−Ｏ−（４，４’ −ジメトキシトリチル）チミジン−５’−Ｏ−メチルホスファイト（化合物１４ 、ベンゼン中０．１Ｍ）とカップリングした。次いで、固体支持体を塩化メチレ ン中トリクロロ酢酸で処理した時のジメトキシトリチルカチオン放出量の測定値 を用いて、ＣＰＧに対する修飾ヌクレオシドローディングを評価した。 トリチルフラクションを１０ｍｌメスフラスコ内に回収し、明るい橙色のトリ チルカチオン溶液を０．１Ｍｐ−トルエンス ルホン酸で１０ｍｌに希釈した。アセトニトリル中０．１Ｍｐ−トルエンスルホ ン酸８００μｌ中の前記溶液２００μｌは、下記のようなローディング能力の計 算を可能にする吸光度読取値を与えた： 前記式中、Ａ４９８は溶液の４９８ｎｍの吸光度を表し、Ｖは原液の総容量を表 し、Ｅはジメトキシトリチルカチオン（７×１０⁴ｌ／ｍｏｌ）の吸光係数を表 す。 この方法で得られた誘導体化固体支持体の修飾ヌクレオシドローディングは４ 〜１０μｍｏｌ／ｇであった。 Ｆ． ヌクレオチド間ホスホネートトリエステルの脱保護及び支持体からの開裂 オリゴヌクレオチドＣＰＧ（アルゴン乾燥）の１μｍｏｌ合成物に、ジナトリ ウム２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートの（ジメチ ルホルムアミド中）１Ｍ溶液を１ｍｌ加えた。脱保護を室温で一晩（１６時間） 生起させた。終了後、ＣＰＧを水で３回洗浄し、次いでアセトンで３回洗浄した 。次いでＣＰＧ結合ホスホジエステルをアルゴン下で 乾燥し、２ｍｌの３０％ＮＨ₄ＯＨの添加により支持体から開裂した。開裂は室 温で３時間後に完了した。真空乾燥後に得られた残渣は、１ｍｌの水中への溶解 及び２６０ラムダの吸光度測定よって定量が可能であった。 文献に記載の方法（Ｄａｈｌら，Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ，４４，６３９− ６４１（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ，１９９６））で、ジナトリウム２−カルバ モイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートを製造した。 ナトリウム（４．６ｇ、０．２ｍｏｌ）をエタノール（１２５ｍｌ）中に注意 深く溶解した。この溶液に、エタノール（５０ｍｌ）中のシアノアセトアミド（ １６．８ｇ、０．２ｍｏｌ）の懸濁液を滴下した。得られた懸濁液に二硫化炭素 （１２．２ｍｌ、０．２ｍｏｌ）を加え、該混合物を１時間撹拌した。ナトリウ ム（４．６ｇ、０．２ｍｏｌ）を更にエタノール（１２５ｍｌ）中溶液として加 えた。添加後、該混合物を一晩冷蔵して生成物を沈殿させた。固体を濾過し、次 いでエタノールで洗浄した。この粗物質を８０％メタノール水溶液（１００ｍｌ ）に再溶解し、該溶液にエタノール（３００ｍｌ）を加えた。生成物を４℃で一 晩結晶化させ、その後濾過によっ て回収した（収率３６．４ｇ、７０％）。 実施例１７ 修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性 この実施例は、３’−エキソヌクレアーゼ及び５’−エキソヌクレアーゼと接 触させた時の本発明の修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を、非修飾（ 野生型）オリゴヌクレオチドと比較して示す。実施例１６Ｃの３’−ヒドロキシ メチレン７量体を代表的３’−炭素修飾オリゴヌクレオチドとして使用した。配 列は同じであるが非修飾ホスホジエステル結合しか含んでいない対応する非修飾 ７量体オリゴヌクレオチドを、下記の操作で対照として使用するために、自動合 成器で、標準的ポリマー支持合成法に従って合成した。 ３’−メチレン修飾オリゴヌクレオチドを、二つの異なる方法で、ヌクレアー ゼ消化に対する感受性について分析した。第一の方法では、修飾オリゴヌクレオ チド及び非修飾対照の両方をそれぞれの５’末端で放射性リン（³²Ｐ）で標識し 、次いで安定性を、まずオリゴヌクレオチドを３’−エキソヌクレアーゼ、ヘビ 毒ホスホジエステラーゼと接触させ、次いで形成されたオリゴヌクレオチド生成 物の大きさをポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて標準的方法で測定することにより評価した。第 二の方法では、修飾オリゴヌクレオチド及び対応する非修飾オリゴヌクレオチド を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、５’−エキソヌクレア ーゼ子ウシ脾臓ホスホジエステラーゼの存在下でのヌクレアーゼによる分解につ いて分析した。 Ａ． ヘビ毒ホスホジエステラーゼに対する耐性 γ−³²Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて、当業者に公知の標 準的方法で、修飾オリゴヌクレオチド及び対応するホスホジエステルオリゴヌク レオチド（対照）の両方を標識した。過剰γ−³²Ｐ−ＡＴＰをＧ−５０Ｓｅｐｈ ａｄｅｘ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲル濾過によりオリゴヌクレ オチドから分離した。 ３．４ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを含む放射性オリゴヌクレオチド溶液を 、それぞれ０、０．３×１０^-5、０．６×１０^-5、１．２×１０^-5、２．４×１ ０^-5及び４．８×１０^-5単位のヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ドイツ、マンハイ ム、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で処理し、得られた溶液を３７℃で３０分間インキ ュベートした。インキュベーション後、ブロモ フェノールブルー、キシレンシアノール及び２５ｍＭ ＥＤＴＡを含む同量の９ ０％ホルムアミドを各オリゴヌクレオチド溶液に加え、該混合物を９０℃で５分 間加熱した。次いで、２０％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離することによ り試料を分析した。 ホスホジエステル（非修飾）オリゴヌクレオチドは、０単位反応を除く総ての 反応で分解した。１．２×１０^-5以上の単位の酵素を使用すると、分解は総ての 反応で完了した。これに対し、修飾（ヒドロキシメチレンホスホネート）オリゴ ヌクレオチドの有意な分解はどの反応でも観察されなかった。 Ｂ． 子ウシ脾臓ホスホジエステラーゼに対する耐性 ２５０μｌ単位のエキソヌクレアーゼ、子ウシ脾臓ホスホジエステラーゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）懸濁液を所期の各オリゴヌクレオチド 溶液（０．５Ａ₂₆₀単位）に加え、該溶液をトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（０．１Ｍ ）で総量３００μｌにした。室温で３０分間インキュベートした後、５０ｍＭリ ン酸ナトリウム、ｐＨ６、を水性相として使用し、２５分間にわたり０〜３０％ アセトニトリル勾配でＨＰＬＣにかけて、反応溶液を分析した。標準試料のクロ マトグラフとの 比較により、生成物を同定した。 これらの条件下で、ホスホジエステル（非修飾）オリゴヌクレオチドは酵素に より８０％分解したが、修飾オリゴヌクレオチドに関しては、約１６％の開裂生 成物が観察された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 19/16 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 19/16 21/04 8615−4Ｃ 21/04 Ｚ // Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＵ 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＵ ＡＤＹ 9284−4Ｃ ＡＤＹ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも１０個の塩基からなり、少なくとも２個の３’−炭素修飾ヌク レオチド間結合を含む、下記の構造： ［式中、Ｒ⁵は対イオンであり、Ｘ及びＹは水素（−Ｈ−）、フッ素（−Ｆ−） 又はヒドロキシル（−ＯＨ−）部分の中から選択される］ を有する修飾オリゴヌクレオチド。 ２． １０〜６０塩基の長さを有する請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド 。 ３． 少なくとも３個の３’−炭素修飾ヌクレオチド間結合を有する請求項２に 記載の修飾オリゴヌクレオチド。 ４． 前記３個の３’−炭素修飾ヌクレオチド間結合が前記修飾オリゴヌクレオ チドの３’−末端にある請求項３に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 ５． 前記ヌクレオチド間結合の総てが３’−炭素修飾ヌクレオチド間結合であ る請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。 ６． Ｘ及びＹが水素原子である請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 ７． １２〜１６塩基の長さを有する請求項６に記載の修飾オリゴヌクレオチド 。 ８． 少なくとも３個の３’−メチレン修飾ヌクレオチド間結合を有する請求項 ７に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 ９． 前記ヌクレオチド間結合の総てが３’−メチレン修飾ヌクレオチド間結合 である請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 １０． Ｘ及びＹが独立して水素原子及びヒドロキシル基を表す請求項１に記載 の修飾オリゴヌクレオチド。 １１． １２〜６０塩基の長さを有する請求項１０に記載の修飾オリゴヌクレオ チド。 １２． 少なくとも３個の３’−ヒドロキシメチレン修飾ヌクレオチド間結合を 有する請求項１１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 １３． 前記ヌクレオチド間結合の総てが３’−ヒドロキシメ チレン修飾ヌクレオチド間結合である請求項１２に記載の修飾オリゴヌクレオチ ド。 １４． ヌクレオシド基質を下記の構造： ［式中、Ｒ³及びＲ⁴は有機基である］ のアルキル化試薬でアルキル化することからなる３’−アルケニルヌクレオシド の製造方法。 １５． 前記アルキル化試薬のＲ³がエチルカルボキシレート基（ＣＯ₂Ｅｔ）で あり、前記アルキル化試薬のＲ⁴がブチル基である請求項１４に記載の方法。 １６． （ａ）ヌクレオシド基質をアルキル化して３’−アルケニルヌクレオシ ドを形成し、 （ｂ）前記３’−アルケニルヌクレオシドのアルケニル官能基を開裂し て３’−アルデヒドヌクレオシドを形成し、 （ｃ）前記３’−アルデヒドヌクレオシド上の３’−アルデヒド部分を 保護し、 （ｄ）前記保護３’−アルデヒドヌクレオシドの５’位置でヒドロキシ ル基を誘導体化して前記５’位置にホスファイト官能基を形成するステップから なる３’−アルデヒド保護 ヌクレオチドシントンの製造方法。 １７． ３’−アルデヒドヌクレオシドを３’−アルデヒド保護ヌクレオチドシ ントンとカップリングすることからなる修飾オリゴヌクレオチドの合成方法。 １８． 前記３’−アルデヒド保護ヌクレオチドシントンが下記の構造： ［式中、Ｐｈはフェニル基であり、Ｒは保護基であり、Ｂはアデニン、チミジン 、グアニン、シトシン及びウラシルの中から選択した塩基である］ を有する請求項１７に記載の方法。 １９． 下記の構造： ［式中、Ｐｈはフェニル基であり、Ｒは保護基であり、Ｂはアデニン、チミジン 、グアニン、シトシン及びウラシルの中から選択した塩基である］ を有するＮ，Ｎ−ジフェニルイミダゾリジノアルデヒド保護ヌクレオシド。