JPH01153087A - マリーゴールドの組織培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明はマリーゴールドの組繊培養法に関するもので
あり、本発明方法によってえられた培養物は、線虫類に
対して特に優れた殺虫性を示すものである。

従来の技術 マリーゴールドはキク科の植物で、殺線虫力を備えた下
式 で示されるα−ターチェニル及びその類縁物質を含有す
ることが知られている。〔例えばレキュレエ　デス　ト
ラパックス　キミーク　デス　ベイズ−パス（Ｒｅｃｕ
ｅｉｌｌｅ　ｄｅｓ　Ｔｒａｖｅａｕｘ　Ｃｈｉｍｉｑ
ｕｅ　ｄｅｓ　Ｐａｙｓ−Ｂａｓ）第７７巻　１００４
頁ないし１００９頁（１９５８）及び同第７９巻３８２
頁ないし３９０頁（１９５９）　）α−ターチェニルを
化学的に合成する方法も研究されているが（例えば特開
昭５２−１１８４６２号公報）、未だ実用化されるには
至っていない。

発明が解決しようとする問題点 マリーゴールドを直かに田畑に植えて土壌中の線虫密度
を低減させる方法は広く知られており、化学薬品に較べ
ｔ残留毒性の心配がなく且つ効果が長時間持続するなど
のメリットを備えているが、反面マリーゴールドを植え
た田畑では同時に野菜類を栽培し難いので、その間休耕
あるいは減産することを余儀なくされていた。

問題点を解決するための手段 本発明者等は、このような事情に鑑みマリーゴールドを
組織培養によって量産する方法について、種々の試験研
究を重ねた結果、組織培養においてオーキシンあるいは
オーキシンとサイトカイニンを含有するカルス化培地で
カルス誘導したのち、オーキシンを０．０１ｍｇ／　ｌ
ないし１ｍｇ／ｌの低い濃度に規制した増殖培地で増殖
することによって、特に強い殺線虫力を示す培養物が出
来ることを見い出したものである。

本発明方法の実施に適する代表的なマリーゴールド（Ｔ
ａｇｅｔｅｓ属）は、フレンチマリーゴールド（Ｔａｇ
ｅｔｅｓ　ｐａｔｕｒａ）　、アフリカンマリーゴール
ド（Ｔａｇｅｔｅｓ　ｅｒｅｃｔａ）等であり、本発明
においては、これらマリーゴールドの葉、茎、根、苫な
どから採取された組織片を常法により殺菌処理したのち
、植物ホルモンとしてオーキシンあるいはオーキシンと
サイトカイニンを含有するカルス化培地においてカルス
誘導を行う。

なお、本発明の実施に適する代表的なオーキシンは、イ
ンドール酢酸、ナフタレン酢酸、　　２．４−ジクロロ
フェノキシ酢酸等であり、サイトカイニンの代表的なも
のは、カイネチン、ベンジルアデニン、ゼアチン等であ
る。

カルス化培地としては、ムラシゲ・スクーグの培地、リ
ンスマイヤー・スクーグの培地、ガンボルグの培地、ニ
ラチエの培地などの基本培地に、前記植物ホルモンの他
にショ糖、ぶどう糖等の炭素源などを適当量添加したも
のが好適であり、例えばムラシゲ・スクーグの基本培地
にショ糖を１〜５重量％、寒天を０．５〜１．０重量％
、オーキシンとしてナフタレン酢酸を０．０１〜２０ｍ
ｇ／　Ｒ、サイトカイニンとしてベンジルアデニンを０
〜２０ｍｇ／ｌの範囲で加えた培地にあっては、２〜３
週間の培養によって良好なカルス形成が認められる。カ
ルス化培養の条件としては、通常の植物組織培養と同じ
であり、温度は１５〜３５°Ｃ１好ましくは２０〜３０
°Ｃ，ｐＨは４〜８、好ましくは５〜６の範囲が夫々適
当である。

カルス誘導されたマリーゴールドは、引き続き前記と同
じオーキシンあるいはオーキシンとサイトカイニンを他
の添加物と共に含む増殖培地において増殖されるが、本
発明の実施においては、特　１に強い殺線虫力を有する
培養物を得るために、増殖培地におけるオーキシンの添
加量を０．０１ｍｇ／　１ないし１ｍｇ／ｌの低濃度と
し、且つサイトカイニンについても不存在若しくは３ｍ
ｇ７１以下の低濃度とすべきである。

増殖培地におけるオーキシンの添加量及びサイトカイニ
ンの添加量が所定量より多くなると、培養物を抽出して
得られる殺線虫剤の効力が著しく低下する。

また、増殖培養の方法としては、寒天を含んだ固体培地
による静置培養、寒天を除いた液体培地による振盪培養
のいずれでも可能である。

なお、本発明方法によって培養されたマリーゴールドか
ら殺線虫剤を製造するには、培養したマリーゴールドを
乾燥したのち、ｎ−ヘキサン、ア七トン、アセトニトリ
ル等の有機溶媒を用いて抽出し、抽出液から有機溶媒を
除去すれば良い。

以下本発明方法を実施例及び比較例によって具体的に説
明する。

起施例１及び比較例１ フレンチマリーゴールド（品種名：ボレロ）の発芽後２
週間経過した無菌苗の子葉を概略５ｍｍ角の大きさに切
り、これをムラシゲ・スクーグの基本培地にショ塘３重
量％、寒天０．８重量％、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／
４２．ベンジルアデニン０．１ｍｇ／ｌを加え、常法に
より滅菌したカルス化培地に置床した。この状態で２５
゛Ｃの温度に保ち連続照明下でカルス誘導を行い、１ケ
月後に前記培養物をカルス化培地からベンジルアデニン
を除いた組成の増殖培地に継代し、同じ条件で再び１ケ
月培養し、増殖を行った。その後１ケ月間隔で２回継代
して増殖させた。

このようにして得られた培養物は、濃緑色の固いカルス
であり、１回当りの増殖によって、生重量比で約１５倍
の増加を示した。

本例によって培養したマリーゴールド培養物を常温、無
菌下で乾燥し、軽く砕き、乾燥した培養物１μ当たりｎ
−ヘキサンを５０ｍ　ｌの割合に混合し３０分間抽出を
行い、固形物を濾別して抽出液を得た。

このようにして得られた抽出液を用いて殺線虫試験を実
施した。

ｔｌ線虫試験にはキタネグサレ線虫（Ｐｒａｔｙｌｅｎ
ｃｈｕｓ　ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）及びセノルハブディテ
ス　エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌ
ｅｇａｎｓ以下Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓと略記する）を用い
た。

キタネグサレ線虫（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｐｅｎ
ｅｔｒａｎｓ）を用いた試験は以下の通りである。すな
わち、抽出液及びその希釈液並びにコントロールとして
純ｎ−ヘキサンを夫々５０μｌずつ別のスライドグラス
上に落として風乾させ、その上にルーサンカルスにて培
養したキタネグサレ線虫（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓρ
ｅｎｅｔｒａｎｓ　）をベルマン法で脱イオン水中に集
めた液を各々５０μｌ（この中に線虫は２０〜４０匹い
る。）落とし、そのスライドグラスを、温室にしたシャ
ーレの中に置き、２５°Ｃの照明付インキュベーター中
８時間静置した後、顕微鏡観察を行い、線虫の生死を判
定した。

Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓを用いた試験も概略同様であり、抽
出物及びその希釈液並びにコントロールとして純ｎ−ヘ
キサンを各々２０μβずつ別のスライドグラス上に落と
して風乾し、そめ上に、ＮＧ培地にて大腸菌を餌として
培養したＣ、ｅｌｅｇａｎｓを２０〜１００匹移し、こ
の上にＮＧ培地を３０μ！加え、そのスライドグラスを
温室にしたシャーレの中に置き、２５°Ｃの照明付イン
キュベーター中で８時間静置したのち、顕微鏡観察を行
い、線虫の生死を判定した。

なお、比較例として、天然栽培法によるフレンチマリー
ゴールド（品種名：ポレロ）の根を乾燥し、前記と同様
の抽出処理を行って得た抽出液及びその希釈液について
、Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓを用いた殺線虫試験を行った。

これらの試験結果は第１表に示したとおりであり、本発
明方法によって培養されたマリーゴールドの抽出液は、
天然栽培の根から得られたものに匹敵する強い殺線虫力
が認められた。

第　１　表　　（生存率二％） また本実施例及び比較例の抽出液を夫々高速液体クロマ
トグラフ法によりＦｌｕｋａ社製のα−ターチェニルを
用いて分析した結果、本実施例の抽出液は０．５μｇ／
ｌｅ１．の割合でα−ターチェニルを含有し、比較例の
抽出液には０．４μｇ７ｍｌのα−ターチェニルが含ま
れていた。

比較例２及び３ 実施例１においてフレンチマリーゴールドの子葉を、ム
ラシゲ・スクーグの基本培地にショｔＪＡｉ３重量％、
寒天０．８重量％、ナフタレン酢酸３ｍｇ／１、ベンジ
ルアデニン３ｍｇ／ｌを加えたカルス化培地でカルス誘
導を行い、カルス培地と成分及び濃度が同じである増殖
培地を用いて同様の培養処理を行い、その培養物を前記
と同じように抽出処理してキタネグサレ線虫に対する殺
線虫試験を行った。（比較例２） また、カルス化培地及び増殖培地におけるナフタレン酢
酸を３ｔｓｇ／ｌ、ベンジルアデニンを１０ｍｇ／ｌに
して同様の培養を行い、このようにして得た培養物の抽
出液についてＣ，ｅｌｅｇａｎｓに対する殺線虫試験を
行った。（比較例３） これらの試験結果は第２表に示したとおりであり、オー
キシン濃度が高い増殖培地で組織培養したマリーゴール
ドから得られる抽出液の殺線虫力第　２　表　　（生存
率二％） 実施例２ないし４及び比較例４ フレンチマリーゴールド（品種名：ポレロ）の発芽後２
週間経過した子葉（実施例２）を採取し、常法に従い７
０％エタノール及びアンチホルミン液で殺菌後、よく滅
菌精製水で水洗し、これをムラシゲ・スクーグの基本培
地に、シー！糖３重量％、寒天０．８重量％、ナフタレ
ン酢酸１ａｇ／ｊ！を加え、常法により滅菌したカルス
化培地に置床してカルスを誘導し、また、同じく前記マ
リーゴールドの根（実施例３）及び蕾（実施例４）につ
いても同様の条件によってカルスを誘導した。

培養はいずれも２５°Ｃの温度で連続照明下にて行い、
１ケ月後に培養物を前記と同組成の増殖培地に継代し、
さらに同一培養条件下で１ケ月間増殖を行い、さらに１
ケ月間隔で２回継代して増殖させ、このようにして得た
培養物は、いずれも黄緑色から褐色のカルスに多数の短
い根の分化を起こしたものであった。

このようにして培養されたマリーゴールドを常温、無菌
下で乾燥し、軽く砕き、Ｉｇ当たり５０ｍ　ｊ２のｎ−
ヘキサンを加えて３０分間抽出を行い、固形物を濾別し
て抽出液を形成し、高速液体クロマトグラフ法による分
析の結果、いずれの実施例における抽出液も０．０４μ
ｇ７ｍｌのα−ターチェニルを含有していた。

また、比較のため合成されたα−ターチェニル（Ｆｌｕ
ｋａ社製）をｎ−ヘキサン溶液に０．０４１１ｇ／　ｒ
ｍｌの割合で加えた試料をつくり、前記各抽出液と共に
殺線虫試験を行った。（比較例４） これらの試験結果は第３表に示したとおりであり、マリ
ーゴールドはいずれの組織部位から組織培養したものも
同じように殺線虫性を有しており、且つα−ターチェニ
ルの濃度が同じであっても、マリーゴールド培養物から
の抽出液は合成α−ターチェニルを含むものに較べて明
らかに強い殺線虫性を有していることがわかった。

実施例５及び６ フレンチマリーゴールド［品種名：ボレロ（実施例５）
］及びアフリカンマリーゴールド〔品種名ニオレンジハ
ワイ（実施例６）〕の発芽後２週間経過した子葉を採取
し、エタノール及びアンチホルミン液で殺菌したのち滅
菌精製水で水洗し、これらをムラシゲ・スクーグの基本
培地にシヨ糖３重量％、寒天０．８重量％、ナフタレン
酢酸１ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン３ｍｇ／ｌを加え、
常法により滅菌したカルス化培地に置床してカルスを誘
導した。カルス化培養はどちらも２５°Ｃの温度で連続
照明を行い、１ケ月後に得られた培養物を前記と同一組
成の増殖培地に継代し、さらに同一培養条件で１ケ月間
増殖を行った。その後さらにもう一度同一組成の培地及
び同一条件で１ケ月間増殖を行った。

このようにして得られた培養物は、いずれも黄緑色のカ
ルスであり、また１回当りの増殖によって、生重量比で
約２０倍の増加を示した。

前記培養されたマリーゴールド培養物を常温。

無菌下で乾燥し、軽く砕いたのち、Ｉｇ当たり５０ｍ１
の割合のｎ−ヘキサンと混合し、３０分間抽出を行い、
固形物を濾別して抽出液を得た。

このようにして得られた抽出液及びその希釈液を用い、
前記実施例１と同様にして殺線虫試験を行った。

試験の結果は第４表に示したとおりであり、フレンチマ
リーゴールド及びアフリカンマリ−のいずれもその培養
物から得られた抽出液は優れた殺線虫性を示すものであ
った。

第　４　表　（生存率二％） 実施例７及び８ フレンチマリーゴールド（品種名：ボレロ）の発芽後２
週間目の子葉を採取し、常法に従って７０％エタノール
及びアンチホルミン液で殺菌し、よく滅菌精製水で水洗
し、これをムラシゲ・スクーグの基本培地にシｇＬ３重
量％、寒天０．８重量％、インドール酢酸ｌｔａｇ／ｌ
、ベンジルアデニン１ｍｇ／ｌを加え常法により滅菌し
た培地（実施例７）及びムラシゲ・スクーグの基本培地
にシｇ糖３重量％、寒天０．８重量％、ナフタレン酢酸
ｌｌ１ｇ／ｉ、カイネチンｌａｇ／ｌを加え常法により
滅菌した培地（実施例８）に置床し、カルスを誘導した
。

培養はどちらも２５℃の温度で連続照明を行い、１ケ月
後に得られた培養物をそれぞれ前記と同じ組成の培地に
継代し、同一培養条件でさらに１ケ月間増殖を行い、そ
の後１ケ月間隔で２回継代して増殖させて黄緑色のカル
スを得た。

このようにして培養したマリーゴールド培養物を常温、
無菌下で乾燥し、軽く砕いたのち、１ｇ当たす５０＋／
！のｎ−ヘキサンを加えて３０分間抽出を行い、固形物
を濾別して抽出液を得た。前記抽出液及びその希釈液を
用いて実施例１に示したと同じ方法で殺線虫試験を行っ
た。

試験結果は第５表に示したとおりであり、オーキシン及
びサイトカイニンの種類に関係なく、これらの培養物の
抽出液には優れた殺線虫性が認められた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）マリーゴールドの組織培養において、オーキシン
   あるいはオーキシンとサイトカイニンを含有するカルス
   化培地でカルス誘導したのち、オーキシンを０．０１ｍ
   ｇ／ｌないし１ｍｇ／ｌの低い濃度に規制した増殖培地
   で増殖させることを特徴とするマリーゴールドの組織培
   養法。
2. （２）マリーゴールドの種類がフレンチマリーゴールド
   である特許請求の範囲（１）に記載の方法。
3. （３）マリーゴールドの種類がアフリカンマリーゴール
   ドである特許請求の範囲（１）に記載の方法。