JPH01300889A - 形質転換体及びこれを用いるＭＴＧａｓｅの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はＭＴＧａｓｅをコードする遺伝子を含有するプ
ラスミドにより形質転換された微生物及び該微生物によ
るリコンビナントＭＴＧａｓｅの製造法に関する。

〈従来技術〉 モルモット肝トランスグルクミナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ
−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：ａｍｉｎｅ　ｒ　−ｇｌｕｔａ
ｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。

ＥＣ２，３，２，１３、以下ＴＧａｓｅと略する）はタ
ンパク質の修飾酵素の一つであり、Ｃａ”依存性のアシ
ル転移酵素である。基質としては、アシル供与体として
ペプチド鎖中Ｇｌｎ残基のγ−カルボキシアミド基が、
アシル受容体としてアミン化合物の第１級アミノ基やペ
プチド鎖中Ｌｙｓ残基のε−アミノ基がそれぞれ反応す
る。

尚、反応機構は以下のとおりである。

＋＋＋ ｖｒ ； ＝＝　　　　　　　　　　　　　り＝　　　　　　　　
　　　　　＝０＝υ　　　　　　　ロ：　（ｊ　　　　
　　　　（：）：　（Ｊｌ　　　　　　　１　　　　　
　１ ｔ、、ＩＡ　　　み ０＝０ 即ち、この酵素が触媒する反応としては、ペプチド鎖中
Ｇｉｎ残基とペプチド鎖中Ｌｙｓ残基との間でのε−（
Ｔ−グルタミル）リジン架橋結合の形成、ペプチド鎖中
Ｇｉｎ残基へのアミン化合物の導入、あるいはアミン化
合物非存在下でのペプチド鎖中Ｇｉｎ残基の脱アミド反
応である。

このＴＧａｓｅは多くの動物の様々な部位で見つけられ
ているが、この生理機能として知られているものはほと
んどがタンパク質問架橋形成反であり、血液凝固カスケ
ード反応の最終ステップであるフィブリンモノマーの架
橋重合による安定化、表皮組織の角質層における不溶性
タンパク質の形成、毛タンパクの架橋形成、などである
。

ＴＧａｓｅを利用すれば、蛋白質の生化学的研究、新し
い酸素反応系の形成や、再利用可能な補酵素誘導体−カ
ゼイン複合体の形成、さらには必須アミノ酸を導入する
ことによって食品蛋白質の栄養価を改善することができ
、従って大量入手する方法の開発が望まれている。

さて、現在ＴＧａｓｅを利用するにあたって良質な酵素
の給源としてモルモットの肝臓のＴＧａｓｅ　　（以下
ＭＴＧａｓｅと略する）が用いられている。

しかしながら、ＭＴＧａｓｅは質的には良好であるが、
モルモット肝臓が供給源であることより取得できる量が
限られていること、及び精製法が非常に複雑で収率が極
めて悪いこと、更にはモルモット自体が非常に高価であ
ることなどの欠点がある。従って、以前よりＭＴＧａｓ
ｅを大量に、しかも安価に更には簡便に生産する方法の
提供が望まれていた。

〈本発明が解決しようとする課題〉 本解明が解決しようとする課題は、遺伝子工学的手法を
用いて、微生物から大量に目的とするリコンビナントＭ
ＴＧａｓｅを生産する方法の提供にある。

〈本発明の課題を解決する為の手段〉 本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結
果、ＭＴＧａｓｅをコードする遺伝子を含有するプラス
ミドにより形質転換された微生物を培養することにより
、目的とするリコンビナントＭＴＧａｓｅを多量に生産
せしめることができ、本発明を完成に至らしめた。

即ち、本発明は、ＭＴＧａｓｅをコードする遺伝子を含
有するプラスミドにより形質転換された微生物及び該微
生物によるリコンビナントＭＴＧａｓｅの製造法である
。

本発明を以下に詳細に説明する。

ＭＴＧａｓｅをコードするＤＮＡ配列及びＭＴＧａｓｅ
のアミノ酸配列を決定している（八ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、５１（３）。

９５７−９６１真（１９８７年））これによると、ＭＴ
ＧａｓｅをコードするＤＮＡは、開始コドン（ＡＴＧ）
　と６９０残基のアミノ酸からなるコドンを含むもので
ある（第２図ｒ。また本酵素の分子量は７６、６２０と
算定されている。さて、ＭＴＧａｓｅを生産する微生物
の調製であるが、まず、ＭＴＧａｓｅをコードする遺伝
子を微生物内で複製可能なプラスミドに組み込む。

この時、ＭＴＧａｓｅをコードする遺伝子を発現ベクタ
ーのプロモーター配列下流に挿入すればよい。

組み込む方法は、プラスミドを適当な制限酵素で切断し
、その切断部位に、目的とするＭＴ［；ａｓｅをコ−ド
する遺伝子を挿入し、接続すればよい。このようにして
得られた組み換えＤＮＡを原核生物宿主に導入し、得ら
れた形質転換微生物の中からＭＴＧａｓｅを生産する株
を選べば良い。本発明において、組み換えＤＮＡが導入
される微生物宿主としてはエシェリヒア・コリ、バチル
ス・ズブチリス等を用いることができるが、好ましくは
エシェリヒア・コリを用いるのが良い。

また、本発明に用いることができるエシェリヒア・コリ
用ベクターとしてはＥＫタイププラスミドベクター（リ
ラックス型）、ＥＫタイププラスミドベクター（ストリ
ンジェント型）、λｇｔタイプファージベクター等々の
種々のベクターを用いることができる。

またプロモーターとしてはｔｒｐプロモーター、Ｉａｃ
プロモーターを初めとするエシェリヒア・コリ中で機能
するすべてのプロモーターが利用可能である。

組み換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換には、通常
よく用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリの
如き原核生物が宿主の場合、このＤＮＡを取り込むこと
の出来るコンピテント細胞は対数増殖期における細胞を
回収後、良く知られているＣａＣ１，法によって形質転
換できる。形質転換反応液中にＭｇＣｊ２２又はＲｂＣ
Ａを共存させれば形質転換効率は向上する。また宿主細
胞のプロトプラスト調製後形質転換させることも可能で
ある。

形質転換された微生物を培養する培地および培養方法は
通常の培地、方法でよい。すなわち培地としては炭素源
、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じアミノ酸、ビ
タミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものである
。

炭素源としてはグルコース、シュクロース等及びこれら
を含有する澱粉加水分解物、糖蜜等が用いられる。窒素
源としてアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩、その他が使用できる。

より好ましくはペプトン、トリプトン、肉エキス、酵母
エキス等の天然素材なども使われる。

培養は好気的条件下で培地のｐＨ及び温度を適宜調節し
つつ行なえば良い。

培養菌体より、リコンビナントＭＴＧａｓｅを採取する
には、通常以下のような方法で行えば良い。

即ち、培養菌体を冷却遠心機等で集菌した後、適当なバ
ッファーに懸濁し、超音波あるいはダイノミルなどで菌
体を破砕して抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安沈澱
分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法
、抗体カラム法などを行ってリコンビナントＭＴＧａｓ
ｅの精製標品が得られるわけである。

〔効　果〕

本発明はモルモットの肝臓が供給源である為に■少量し
かＭＴＧａｓｅを提供できない、■高価である、■精製
操作が非常に煩雑である等の従来法の欠点を解消し得る
画期的な方法である。換言すれば、本発明の方法を用い
ると、大量に、しかも、安く、更に、簡便にＭＴＧａｓ
ｅを提供し得るのである。

このようにして得られたリコンビナントＭＴＧａｓｅは
従来の天然型ＭＴＧａｓｅと同様に、各種アミノ酸を食
品蛋白質に共有結合的に導入することにより、栄養価や
物性を改変することができる。また、本酵素は食品以外
の医薬品、化成品への応用も期待できる。

以下、本発明を実施例に従って説明する。

〔実施例１：発現プラスミドｐＫＴＧ　１の構築〕本発
明者等は既にＭＴＧａｓｅの部分重複ｃＤＮＡのクロー
ン５個を取得しており（第１国勢）、またこれを基にＤ
ＮＡ配列及びアミノ酸配列を決定している（第２国勢）
。

さて、まず第１図に示したプラスミドｐｉ、ＴＧ　１６
を含有するエシェリヒア・コ＋ＪＭＣ１０６１（以下、
Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１とする）及びプラスミドｐＬＴ
Ｇ２１を含有するＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１より以下
の方法に従ってプラスミドｐＬＴＧ１６及びプラスミド
ｐＬＴＧ２１を抽出した。

即ち、培養液１００ｍＩｌを遠心分離により菌体のみ集
め、５０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ　、　ｐＨ７，５の５
ｎ＋ｊ！に懸濁し一８０℃に凍結後、融解して次にリゾ
チーム（最終濃度、２ｍｇ／ｍ／）を加え”ｉ’ｏ’ｃ
で１０分間静置し、さらにＥＤＴＡ　（最終濃度０．１
Ｍ）を加え、０℃で１０分間静置する。その後、Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００（最終濃度０．１％）を加えて０℃で
６０分間静置する。ついで３０．ＯＯＯｒｐｍ　、３０
分間遠心分離し、その上清液を等量の水飽和フェノール
で処理する。その水層をさらに等量のクロロホルムで処
理し、その水層を抽出し、これに最終濃度２０μｇ／ｍ
／となるようにＲＮａｓｅを加え、３７℃で６０分間イ
ンキュベートした。

その後０．２容の５ＭＮａＣ１と１／３容のポリエチレ
ングリコールを加え、０℃に６０分間静置後、１０．０
０Ｏｒｐｍ　２０分間、遠心分離によりＤＮＡ沈殿を回
収する。

次にこの沈殿を３．８ｍｌ！の水に溶解し、４ｇのＣ５
Ｃ（ｌを加えて溶解後、１０ｍｇ／ｍｊ！のＥｔＢｒの
２００μｌを加えて４０，０００ｒｐｍ　、１６時間、
２０　’Ｃで超遠心分画を行う。

遠心終了後、プラスミドＤＮＡ画分を抽出し、水飽和ｎ
−ブタノールの１〜２容で４回抽出操作を行ってＥｔＢ
ｒを除く。その後ｎｚｏ中で透析を行ってＣｓＣｊ１！
を除去後、３Ｍ酢酸ソーダｐＨ５，６の１／１０容を加
え、さらに２容の冷エタノールを加えて、＝２０℃で一
晩静置する。このエタノール沈殿を遠心分離で集めて８
０％エタノール水溶液で洗浄後、よく乾燥し、この沈殿
物を５０μｌの１　ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ｔｌｃｊ！、　ｐＨ７，５に溶解しサンプルとし
た。

プラスミドｐＬＴＧ１６及びプラスミドｐＬＴＧ２１よ
りＭＴＧａｓｅ発現プラスミドｐＫＴＧ　１を構築した
（第３及び４図）。以下に、その詳細を示した。

ｉ）プラスミド　ＬＴＧ　１６２１Ａの　築（イ）さて
、プラスミドｐＬＴＧ１６を制限酵素Ｂｓｍ　１　ｓ旧
ｎｄＩ［［で切断し、アガロースゲル電気泳動分画によ
り大きい方のＤＮＡ断片を回収した。尚第３図及び第４
図において制限酵素で切断したＤＮＡ断片の内、使用し
たＤＮＡ断片は破線で示した。

（ロ）プラスミドｐＬＴＧ２１を制限酵素Ｂｓｍ　Ｉ及
びｔｌｉｎｄｌｌ［で切断し、アガロースゲル電気泳動
分画により、約７４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。

（ハ）上記（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片をＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させ、プラスミドｐＬＴＧ１６２
１　Ａを調製した。

ｉｉ）プラスミド　ＬＴＧ　１６２１Ｂの　築（イ）上
記ｉ）で得たプラスミドｐＬＴＧ１６２１　Ａを制限酵
素Ｓａｌ　ｒ及び旧ｎｄＩ［［で切断し、アガロース電
気泳動分画により小さいＤＮＡ断片（約１４４０ｂｐ）
を回収した。

（ロ）プラスミドｐＬＴＧ２１を制限酵素旧ｎｄＩ［Ｉ
及びＥｃｏＲｒで切断し、アガロース電気泳動分画によ
り、小さいＤＮＡ断片（約７４０ｂｐ）を回収した。

（ハ）プラスミドｐＵｃ９（ファルマシア社製）を制限
酵素５ａｌＴ及びＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気
泳動分画により、大きなりＮΔ断片を回収した。

（ニ）上記（イ）、（ロ）、（ハ）で得たＤＮＡ断片を
ＤＮＡリガーゼで連結させて、プラスミドｐＬＴＧ１６
２１　Ｂを構築した。

ｉｉｉ　）プラスミドＵＴＧ　１の　築（イ）上記ｉｉ
）で得たプラスミドｐＬＴＧ１６２１　Ｂを制限酵素Ｎ
ｃｏ　Ｉ及びＢｓｔＥＩＩで切断し、アガロース電気泳
動分画により約３７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。

（ロ）上記ｉｉ）で得たプラスミドｐＬＴＧ１６２１　
Ｂを制限酵素ＢｓｔＥｎ及びＳａｌ　Ｉで切断し、アガ
ロース電気泳動分画により小さい方のＤＮＡ断片（約１
７００ｂｐ）を回収した。

（ハ）プラスミドｐｕｃ　１）ＢＮ　（京大、ウィルス
研牧先生より分譲された）を制限酵素、Ｎｃｏ　Ｉ及び
５ａｌＴで切断し、アガロース電気泳動分画により、大
きい方のＤＮＡ断片を回収した。

（ニ）前記（イ）、（ロ）、（ハ）で得たＤＮＡ断片を
ＤＮＡリガーゼにより連結させてプラスミドρＵＴＧ　
１を構築した。

ｉｖ）プラスミドにＴＧＩの構築 （イ）上記ｉｉｉ　）で得たプラスミドｐＵＴＧ　ｉを
制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ及びＢｓｔＥＩＩで切断し、アガロ
ース電気泳動分画により約ａ７ｏｂｐのＤＮＡ断片を回
収した。

（ロ）上記ｉｉｉ　）で得たプラスミドｐｕｒｃ　１を
制限酵素ＢｓｔＥＩＩ及びＰｓ目で切断し、アガロース
電気泳動分画により小さい方のＤＮＡ断片（約１７００
ｂｐ）を回収した。

（ハ）　ｔｒｃプロモーター（ｔｒｐプロモーター及び
ｌａｃプロモーターの融合したもの）及びアンピシリン
抵抗性を有するプラスミドｐＫＫ２３３−２（ファルマ
シア社！！りを制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ及びＰｓｔＩで切断
し、アガロース電気泳動分画により、大きなりＮＡ断片
を回収した。

（ニ）上記（イ）、（ロ）、（ハ）で得たＤＮＡ断片を
ＤＮＡ　リガーゼを用いて連結させてＭＴＧａｓｅ発現
プラスミドｐＫＴＧ　１を構築した。

即ち、以上の操作を処することにより、２種類の重複す
るｃＤＮＡを有するプラスミドｐＬＴＧ１６及びｐＬＴ
Ｇ２１からＭＴＧａｓｅをコードする全ＤＮＡ配列（開
始コドンＡＴＧから終止コドンＴＡＡまで）を含有する
プラスミドｐＫＴＧ　１を構築したわけである。

〔実施例２　大腸菌によるリコンビナントＭＴＧａｓｅ
の生産〕 ｉ）実施例１で作成した プラスミドｐＫＴＧ　１を保持するエシェリヒア・コ’
ＪＪＭ１０３株（ＦＥＲＭ　　ｐ−１０００８）を５０
．ｃｏｇ／ｍ！！アンピシリンを含む２ＹＴ培地（１，
６％バタトトリプトン、１．０％酵母エキス、１．０％
Ｎａ（／！、ｐＨ６，７）１．Ｏｆｆ中で３７℃、１２
時間培養した。

その後、誘４剤として、イソプロピルチオガラクトシド
（ＩＰＴＧ）　０．２　ｍ　１添加して５時間培養した
。

培養菌体を遠心分離により集菌し、０．１５Ｍ　ＫＣＺ
２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．２　ｍＭ　ＤＴＴを含む゛
２０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄した
後、同じ緩衝液３０ｗ＋１に懸濁した。

この集菌菌体の一部をとり、１％ＳＯ３で溶菌し、その
抽出液の１部を５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供した。コントロールとして、モルモット肝より精
製したＭＴＧａｓｅ標品及びプラスミドｐＫＫ２３３−
２で形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０３株を
用いた。

この電気泳動したアクリルアミドゲルをニトロセルロー
ス膜に写しとり、抗ＭＴＧａｓｅ抗体で反応させた後に
パーオキシダーゼを結合した２次抗体と反応させた。こ
のウェスタンブロッティングの結果は第５図に示した。

これからも分るようにプラスミドｐＫＴＧ　１を含有す
るエシェリヒア・コリＪＭ１０３株（ＦＥＲＭ　Ｐ　−
１０００８）は菌体内にリコンビナントＭＴＧａｓｅを
生産していた。

ｉｉ）上記ｉ）により菌体内にＭＴＧａｓｅ蛋白が生産
されていることをｉｆ　ｔ＝したので、このリコンビナ
ントＭＴＧａｓｅを以下の方法で菌体より抽出した。即
ち、上述の懸濁液にソニック処理（２０キロサイクル、
３００秒）を行ない、抽出した。

この抽出液はトランスグルタミナーゼ活性を示した（第
６図）。尚、コントロールとして、プラスミドｐＫＫ２
３３−２で形質転換したエシェリヒア・コリＪＭ１０３
株より同様の方法で抽出した抽出液を用いた。

第６図より分るようにＭＴＧａｓｅはＣａ２＋依存性酵
素であるので、Ｃａ”″が存在しないと、たとえＦＥＲ
ＭＰ−１６ｏθ？の抽出液であってもトランスグルタミ
ナーゼ活性は示さない。

尚、トランスグルタミナーゼ活性の測定は以下の方法で
行った。

５ｍｇ／ｎ＊アセチルα１−カゼイン、　０．１３ｍＭ
〔３Ｈ〕プトレシン、５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，
５）　。

５ｍＭ　ＣａＣ１２，１０ｍＭ　ＤＴＴおよび抽出液を
含む反応１（１５０μＮ）を３７℃でインキュベートし
一定時間ごとに一定量、の反応液（２０μｌ）をペーパ
ーディスク上でスポットする。未反応の〔３Ｈ〕プトレ
シンをトリクロール酢酸で洗浄した後に、ペーパーディ
スク上に固着したアセチルα、ｌ−カゼインに取り込ま
れた放射能をシンチレーションカウンターで測定した。

（Ｌ、　　Ｌｏｒａｎｄ　　ｅｔ　　ａｌ、：　　八ｎ
ａ１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　　５０＋　　６２３−
６３１　（１９７２））に基本的にしたがっている。

〔実施例３　モノクロナール抗体カラムによるリコンビ
ナントＭＴＧａｓｅの精製〕 実施例２ｉｉ）で得た抽出液３０ｍ１ｌを抗ＭＴＧａｓ
ｅモノクロナール抗体カラム（１，４ｃｍＸ６ｃｍ）に
アプライした。

ＴＢＳバッフｙ　　（２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，
５）、０．１５Ｍ　ＭＣ２１０，２ｍＭ　ＤＴＴ、　２
　ｍＭ　ＩＥＤＴＡ）１００　ｍＡで洗浄した後、溶出
バッフ７　　　（２０ｍＭ　ＮａＨＣＯ：＋−ＮａＯＨ
（ｐＨ１０，４）　　、０．４ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　
ＥＤＴＡ　　。

２Ｍ　ＫＣｊ２＞　　４０ｍ＋２で目的とするリコンビ
ナントＭＴＧａｓｅを溶出した。

溶出液を２０ｍ１のカウンターバッファー（１Ｍトリス
−塩酸（ｐＨ７，５、０，４ｍＭ　ＤＴＴ、　　２ｍＭ
　ＥＤＴＡ）で中和した。

その後、限外が過処理を行うことにより、精製リコンビ
ナントＭＴＧａｓｅを得た。

確認の為にＳＯＳ　−ＰＡＧＥを行ったところ均一なバ
ンドが得られた。この単離したリコンビナントＭＴＧａ
ｓｅのトランスグルタミナーゼ活性を測定すると、その
比活性は１６９０ユニット／ｍｇ　Ｘ　１０’であった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＭＴＧａｓｅ　ＣＤＮＡの翻訳領域及び、各
遺伝子領域を含むクローンを示す。 第２図はＭＴＧａｓｅのアミノ酸配列及びＭＴＧａｓｅ
をコードするＤＮＡ配列を示す。 第３図はプラスミドｐＬｒｃ１６２１　Ｂの構築図を示
す。 第４図はプラスミドｐＫＴＧ　１の構築図を示す。 第５−図はプラスミドρＫＴＧ　１により形質転換させ
たエシェリヒア・コリＪＭ１０３株（ＦＥＲＭ　Ｐ　−
１０００８）のウェスタンブロッティングを示す。 第６図は培養したＦＥＲＭ　Ｐ−１０００８抽出液のト
ランスグルタミナーゼ活性を示す。 第 ＴＣＡｆｃ　ｙ２ｉ　ｃｅｃ　ｃＲｃ　Ｇ’ｉ。 ＩＬ　ＩＪＡ　ＧＸＣＧ！ｉＴ　ｃｅａ　ｄｃ　Ｃ’ｆ
ＣｄＧ　ＪＡ　ＴＥＴ　ＧＲＴ　ＴＡＧ　ＣＫＣｃ４ｃ
　！＋　　ＴＩＣＩＪＡ　晶？２Ｔ　ＣＥＧ二呈。ａｉ
ｉｙ　ｃｌｉｃ　Ｊｃ　ＣＫＣｃｆｆ。ＪＣＪＧ　ｃｅ
ｃ　ｃＲｃ　ｃ）ｃ　Ｔε。Ｊ。、鷲。！　　　：？、
　４Ｇ　Ａ！。ｄｃ　ＣＴＣＴｌ！ＡＣＬ　Ｃ’ＬＧ　
Ｔ’ｔＧ　ＪｌｒＪｃ　ｃｇａ　ｃＲｃ　ＣＥＣｔｆｃ
　ｔｌ’ｃ　Ｃ’ｆＧ　舖Ｇ　Ｃ１）Ｃｄｌ　　ＧＩＣ
ＧＩｉＡ　Ｊｔ　ｃ２ａ　ｃ８ｃ　ｔｉｃ！　ＣＥＣａ
ｇｔ　ｃＥｃ　ＴＸＣＪｃ　ＧＩＴ　ＧＥＴ　Ｇ？ｌＧ
　ＣＲＣＪｔ　ｃｋｃ　Ｊｃ　Ｊｃ　９ｈ　　ｆ　ｃＵ
ｃ　晶ＭＩＧ　Ａ’ｅ、Ｔ論、峰。。ＥＡｃＲｔ　ｃＵ
ｃＡ２ｔ　−Ｘｃ　＝ｔｒ、！ｃ　ｃｇａ　Ｊ−ｆ’−
ｄ５　　：Ｌ　ｃ￥７醒。晶？５．．．．．．．．．．
．．．−、、、　　　３９０　　、０．１）１８．。 ｃｃｃ　ｔｔｃ　Ｔ５Ａ　ｃＹｃ　Ｔｉｃ　Ａｔ丁ｃｅ
ｒ　ｃｅａ　ｃＸｃ　ｃｊｃ　ｃｌｉｃ　ａａｃ　ｔａ
ｃ　、ＴごＡ　ｇｉ６　　　　ｃｅａ　ｃｔｔ　ｔｆｃ
　ｃｆｃ　ｔｔｔ　ｃごｔ　ｃＸｃ　ｃｔｃ　＾Ｘｒ：
肱品晶Ｊ−ＪｃＡＪｒ−Ｙ。ｔＰｃｃ）、ｃＩ−）ｃ　
３ｊ５　　：’ｔ’＝晶翻Ｔ　ｃｇａ　ｔｆｉｃ　ｃｅ
ａ　Ｊｃｊｃ　ｃｈｉ　ｃｅｔ　ａｇｔ　ＧＩＣ＋Ｊｃ
　ａｆｔ　ｃｌｉｃ　ｃ）ｃ　ｔｂ　Ｊｃ　ｃ）ｃ　ａ
ｒｃ　ｃｅａ　ｄｉ　　ｊ、ｃＹｃ　Ｇ’ｔＧ　ｃｅａ
　ａｃ　Ａｒｃ　Ｊｔ　ａｃｔ　ａｌｃ二！’ｃ　Ｔｉ
ＩＣＡＩＴ　ｄＴ　ＴＸＣ山ｃ２ｃ　ｔｉｃ　ＡＩＣｔ
ｆｃ　市ｃ）ｃ　ｃｌｉｃ　ｃトｉｊ！ｉ　　　！：　
ｄｃ　Ｊｃ　ｄｃ　Ｊ。ｄＣＡＪＣｔＸｃ　ＡＬ二ｆｃ
　ｃ）ｃ　ｃｋｃ　ｔＸｃ　ａＴ　Ｊｔ　Ｊｃ　ｔｌ’
ｃ　ＣＥＡ　ｃｌｃ　ＪＴ　ＣＡＴ　ｃ￥ｏｔｘｔ　ｇ
７１　　　　！：　ｃＲｃ　ｃＩ−山−Ａｔ　ｔｈ　ｃ
Ｙｃ　Ａｌ’Ｇ　ｃｅ＋二！　？！Ａ　ｃｌ！ｃ　ＪＡ
ｓｆｆｉｃ　ＪＧ　ｃＲｃ　ＣＸＧ　ｔｂ　Ｇ￥−−ｋ
ＣＡＪ−Ｃ！−ｃ貨ｃ　ｇｐＨ二Ｌ　Ａ２Ａ　品賢Ａ　
ＪＧ　ＣＡＴ　Ｃ鵞。６！６山°Ｃと７ｃＸｃ　ｃｔｃ
　ｃｔｃ　ａＡｃ、陥；＾ｌ１ａｔεｅ　Ａｒｃ　Ａズ
ｃｃ！Ｉｔ、市：　ａｇｔ　ｃＹｃ　ＧＩ’ｃ　ｃＲｃ
　ｃｂ、ｓｖ！ｊｉ　ｄＣｃｇａ　ＧＸＣｃＲｃ　？！
丁、Ｉｆｉ：　Ａｒｃ　ｃｆｆｃ　ｃシＡ　ａＴ　ＡＷ
ＡＭ１＾ｘＣＧｇ＾Ｇ￥Ｇ　ＧｅＣＡマＧ１山第５図 甲 Ｎ） 第６図 抽出液中のＴＧａｓｅ活性 ｔｏ　　　　　２０　　　　３０ 時　　間　（ｍｉｎ）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）モルモット肝トランスグルタミナーゼ（以下ＭＴ
   Ｇａｓｅと略す）をコードする遺伝子を含有するプラス
   ミドにより形質転換された微生物。
2. （２）微生物がエシェリヒア・コリである請求項（１）
   記載の微生物。
3. （３）請求項（１）又は（２）項記載の微生物を培地中
   で培養して目的とするリコンビナントＭＴＧａｓｅを生
   産させ、該リコンビナントＭＴＧａｓｅを培地中から採
   取することを特徴とするリコンビナントＭＴＧａｓｅの
   製造法。