JPH02149527A

JPH02149527A - 抗血栓剤

Info

Publication number: JPH02149527A
Application number: JP1217857A
Authority: JP
Inventors: Koichiro Tsuji; 紘一郎辻; Masayoshi Ono; 尾野　雅義
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-24
Publication date: 1990-06-08
Anticipated expiration: 2014-06-21
Also published as: JP2907447B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下ヒトＧ−Ｃ
８Ｆと略記する）を有効成分とする抗血栓剤に関する。〔従来の技術〕本発明は人の体にもともと備わった造血の促進、特に好
中球系の分裂、増殖、成熟化を促進する液性因子の１つ
であるヒ）Ｇ−ＣＳ　Ｆを用いて。動、静脈血栓の治療に役立てようとするものであって、
直接これに関連する報告は見当たらない。ヒトＧ−Ｃ８Ｆは　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験系において
顆粒球の前駆細胞に働き顆粒球への分化増進を促す機能
を有している液性の造血因子〔例えばＭｅｔｃａｌｆ、
　　ｅｔ、ａｌ：Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、１．１８５
．＜１９ｆｆ３）等参照〕として知られている。ところがこのヒトＧ−Ｃ９Ｆは今迄入手するのがきわめ
て困難であったため、医薬としての有用性または有効性
についての検討が充分進展せず。本発明の目的とする血栓の治療への可能性についても全
（知られていなかった。

【発明が解決りようとする問題点］従来、抗血栓剤としては血液の凝固を阻止させる薬物と
してベパリン製剤、　シグマロール製剤などが使われて
いたが、−度形成されたフィブリン塊（ｖＡＩＩ！素）
を溶解する薬物も望まれていた。最近になって線溶系活性化作用を有するウロキナーゼ、
およびプラスミノゲン・アクチベータ−（ＰＡ）が大量
生産されるようになり、抗血栓剤として使われるように
なった。一方、遺伝子工学等の技術進歩によりヒ）Ｇ−ＣＳＦの
製造方法が開発され、純粋均質でしかも大量のヒトＧ−
Ｃ３Ｆが入手できるようになつた、　（特開昭６１−２
２７５２６号、特開昭６２−２３６４９７号、特開昭６
２−２３６４８８号）この結果をふまえて、線溶系活性
化作用を有するＰＡを産生ずる血管内皮細胞に対するヒ
）Ｇ−Ｃ３Ｆの影！＃等を研究した結果、ヒトＧ−ＣＳ
Ｆが、線溶系活性化作用を有するＦＡの産生を増強させ
ることから、副作用の少ない優れた抗血栓剤として用瀞
ことを見いだした。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは上記目的を達成するため、鋭意研究を重ね
た結果、哺乳動物の内皮細胞例えばウシ頚動脈内皮細胞
を用いて検討した結果■ヒトＧ−ＣＳ　Ｆ存在下で前岬
賓したウシ頚動脈内皮細胞（以後内反細胞）は非存在下
で前装置した内皮細胞に比べて約５倍のＰＡの合成分泌
増加が認められた。 ■Ｇ−Ｃ３Ｆの添加濃度は約Ｓｏｎｇ／ｍｌでＰＡ産生
の最大値を得られることから、はぼ造血系の標的細胞に
対する至適濃度と同じである。 ■ヒトＧ−Ｃ３Ｆとの前装置による内皮細胞のＰＡ−合
成分泌促進の程度は、Ｇ−Ｃ８Ｆの添加濃度と前装置の
時間とに明かな相関がある。 ■ベトリ皿中にフィブリンゲルを形成させ。そのゲル上で血管内皮細胞を培養するとき、ＧＣ３Ｆの
添加をすると細胞の増殖に伴いＦＡが分泌され、培養液
中のプラスミノゲンをプラスミンに換え、これがフィブ
リンゲルを溶解する。 ■ヒトＧ−Ｃ９Ｆをヒトに近縁の７カゲザルに連投・す
ると、２週間後のその新鮮面をトロンボエラストグラム
で分析すると線溶系活性化に起因すると考えられる血液
凝固直後のフィブリンの溶解が認められたという事実を
確認し、この結果からヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆは血管内皮細胞に
作用し、そのＰＡの合成分泌を促進し、血中に大量に存
在するプラスミノゲンをプラスミンに変換し、生じたプ
ラスミンは選択的に血管に蓄積したフィブリン塊を溶解
することを著しく亢進させることが考えられ、本発明に
到達した。すなわち本発明は、ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆを有効成分とする抗
血栓剤を提供するものである。以下本発明の詳細な説明する。本発明の抗血栓作用の有効成分であるヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆは
純度の高いヒトＧ−Ｃ３Ｆであればその由来が制限され
るものではなく１例えば人の生体試料から抽出１分離、
精製したもの、　ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ産生細胞を培養し、そ
の培養上清がら単離したもの、細胞融合法を用いてヒ）
Ｇ−Ｃ３Ｆ産生ハイブリドーマを形成しそれから取得し
たもの遺伝子組換えによって、大腸菌、動物細胞等の宿
主を形質転換して得た形質転換体がら産生せしめ単離精
製したもの、又は天然のヒトＧ−Ｃ９Ｆのアミノ酸配列
に化学修飾を施したもの等のいずれも使用することがで
きる。しかし、それらの中でも純度よ（均質大量に入手できる
次の（１）（２）で示すヒトＧ−ＣＳＦが特に好ましい
ものである。（１）次の理化学的性質を有するヒ）　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ
。 ■分子Ｉｌ：　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法による測定で１９，０００±　
１．０００゜ ■−等電点：ｐｌ＝５．５　　±　０．１．　　ｐ　　
Ｉ　　＝５．８　　±０．１．　ｐ　＋　＝６．１±　
０．１の３つの等電点のうち少な（とも１つを有する。 ■紫外部吸収：　２１１０ｎｍに極大吸収を有し、２５
０ｎ−に極小値をもつ。［４］Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
くである。Ｈ，Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｓｅｔ−Ｓｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒ。 −Ｇ　ｌ　ｎ−５ｅｔ−１’　ｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ
−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　１ｎ−ｖ
ａ　１（２）下記のアミノ酸配列またはその一部であら
れされるヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチド又は
これとＮ鎖部を有する糖蛋白質からなるヒト−Ｃ３Ｆ（Ｍｅｔ）ｎ　　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐ
ｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｇｌｎ
　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＧｉｎＶａｌ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌ
ｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ
　ＬｅｕＧｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　（Ｖａｌ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｕ）＊　　Ｃｙｓ　Ａｌａ　ＴｈｒＴｙｒ
　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ旧ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　
Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａ
ｌａ　Ｐｒ。Ｌｅａ　　Ｓ、ｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　
Ｓｅｒ　　Ｇｌｉ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ｌ
ｅｕＡｌａ　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　　Ｓａｒ　Ｇ
ｌｎ　　Ｌｅｕ　１ｌｉｓ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ
Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｌａｕ　　
ＧｌｕＧｌｙ　ｌｌａ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　（ｉｌｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＴｈｒ
　　Ｌａｕ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｔ　　
Ａｌａ　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　Ａｌａ　ＴｈｒＴｈｒ　　
ｌｌａ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　ＭｅｔＧｌｕ　Ｇｌ
ｕ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＭｅｔＡｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
　　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　　Ｇｌ
ｙ　Ａｌａ　ＭｅｔＰｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　
Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａ
ｌａＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ＾ｌａ　
Ｓａｒ旧ｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　５ｅｒＰｈａ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｕ　Ｍａｌ　Ｓｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌ
ｅｕ　Ａｒｔ　ＨｉｓＬ＠ｕ　Ａｌｉ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ
　　（但し−は０またはｌを表し。ｎは０またはｌを表す）上記のヒ）Ｇ−Ｃ９Ｆは例えば後述する参考例に示す方
法によって製造することができる。即ち。上記（１）のヒトＧ−ＣＳ　Ｆは参考例１によって、又
（２）のヒトＧ−Ｃ３Ｆは参考例２に示す方法により得
ることができる。　（ｍ−ｏの場合を−ＶＳＥｍｌｌ１
１１）場合を＋ＶＳ　Ｅ、！：いう）な・おこれらの方
法の詳細な製造条件については。本出願人が先に出願した特開昭６１−２２７５２６号、
特開昭６２−２３６４９７号、　特開昭６２−２３６４
８８号の各明細書を参照されたい。又、その他の方法としてＧ−Ｃ９Ｆ産生細胞と自己増殖
能を有する悪性腫瘍とを細胞融合して得られるハイプリ
ドーマをマイトジェンの存在または非存在下で培養する
ことによって得ることもできる。これらの方法で得たヒ
トＧ−Ｃ３Ｆは全て本発明に含まれる。得られたヒトＧ−Ｃ３Ｆ含有液は必要により公知の手段
でさらに精製、濃縮した後、　ミリポアフィルタ−等で
無ｍ濾過して凍結保存とするかまたは凍結乾燥、真空乾
燥などの手段により水分を除去して保存することができ
る。また所望によりヒトＧ−ＣＳＦを蒸留水または適当な緩
衝液に溶解した後注射液として用いることもできる。さらに本発明の抗血栓剤はヒトまたは動物医薬用に適し
た医薬製剤としての形態を取るために必・要な製薬担体
や賦形剤を５　さらには安定化剤、吸着防止剤を含ませ
ることができる。本発、明の抗血栓剤に含まれるヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆの投与量
、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めるこ
とができるが１通常成人−人当り０゜１−１０００μｇ
、好ましくは　１〜５００ｕｇのと）Ｇ−Ｃ３Ｆを含有
する製剤を１週間に１〜７回投与すればよい。しかし本発明はヒトＧ−Ｃ５Ｆの含有量によって限定さ
れるものではない。【実施例】以下本発明を参考例（ヒトＧ−Ｃ３Ｆの製造例）実験例
（薬理効果）、実施例（製剤例）をあげて説明するが９
本発明はこれらに限定されるものではない。参考４１１１１（Ｇ−Ｃ９Ｆ産生細胞の培養によるヒトＧ−Ｃ３Ｆの製
造例）特開昭６１−２２７５２６号の実施例１に示す方法で樹
立したヒドロ腔底癌細胞由来のＧ−Ｃ５Ｆ産生細胞株Ｃ
ＨＵ　−１（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ受託番号「！−３１５」）
また同様の方法で樹立した細胞株ＣＨＵ−２（Ｃ，Ｎ−
Ｃ，Ｍ受託番号ｊｌ−４８３Ｊ）をウシ胎児血清を含有
するＲＰＭＩ　　１６４０培養液に浮遊した後、ローラ
ーボトルにいれて回転培養を行った。細胞がローラーボ
トル内壁に密に増殖したところで培養液を血清不含ＲＰ
ＭＩ　　１６４０　　にかえ、４日間培養後上清を回収
１次いで血清含有ＲＰＭＩ　　１６４Ｇ　　を加えて３
日間培養した後。培養液を血清不含ＲＰＭ１１６４０　　に液替し。４日間培養後上漬、を回収する。以下これを繰り返し培
養上清を回収した。得られた血清不含培養上清を限外ろ
過で約１０００倍に濃縮し精製１次いで検定を行った。精製および検定は前記特開昭６１−２２７５２６号明細
書の実施例と同じ方法で行った。参考例２（遺伝子組換えによるヒ）　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ　ノ製造例
）以下の製造列は、前述の７ミノ酸配列における＋ＶＳ
　Ｅまたは−ＶＳＥの各々を製造する方法である。本出願人によって微工研に寄託されているエシエリヒ了
・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）１１７７６株（−ＶＳＥの場合
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−９５５、または＋ＶＳ　Ｅの場合Ｂ
Ｐ−９５４）から切り出してきたヒトＧ−Ｃ３Ｆ遺伝子
を有するｃ　ＤＮＡ断片をベクターｐｄＫＣＲに４ｆｌ
み込みｐＨＧＶ２（−ＶＳＥの場合）または、ｐＨＧＧ
４　（＋ＶＳＥの場合）プラスミドとした後これを５ａ
ｌｌで処理し。次いでＤＮＡポリメラーゼＫ　１ｅｎｏｖ断片を反応さ
せる。このＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカ−を付加し、再びＥｃｏ
ＲＩで部分消化した後、アガロースゲル電気泳動にて約
２．７Ｋｂのフラグメントを回収する。一方、　　ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミド（１：ａｕ
ｆｓａｎ、Ｒ，Ｇ、＆　５ｈａｒｐ、　　Ｐ、Ａ、（１
９８２）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｌｏ＋、　　２巻１３０
４〜１３１９）をＥｃｏＲＩで処理し、ＢＡＰ処理し、
脱リン酸する１次いでフェノール処理後電気泳動でｐＡ
ｄＤ２６ＳＶｐＡのＥｃｏＲＩ断片を回収した。上記１７）　２．ＩＫｂ断片とｐＡｄＤ２６ｓＶｐＡ断
片を７ニール化し、Ｅ、ｃｏｉｌ　　ＤＨＩ株に塩化ル
ビジウム法により形質転換してｐ）（ＧＶ２　（−ＶＳ
Ｅ１７１場合）または、ｐＨＧＧ４　（＋ＶＳＥの場合
）−ｄｈｆｒプラスミドを得た。つぎにＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、コロンビア大学Ｄｒ
、　Ｌ、　Ｃｈａｓｉｎより入手）を９ｃｍのプレート
　（Ｎｕｎｃ社製）中ｌＯ％仔牛血清を含むα最小必須
培地（α−Ｍ　Ｅ　Ｍ、　　アデノシン、デオキシアデ
ノシン、チミンン添加）で培養増殖ル、これをリン酸−
カルシウム法−（Ｗｉｇｌｅｒ等、　　Ｃａ１１１４巻
７２５頁（１９７１１））によって形質転換した。即ち、前記のｐＨＧＶ２　（−ＶＳＥ１７）場合）また
は、ｐＨＧＧ４　（＋ＶＳＥの場合）−ｄｈｆｒプラス
ミド１μｇにキ中リア　−ＤＮＡ　（仔牛胸線ＤＮＡ）
を適量加えて、ＴＥ溶液３７５μｌに溶解し１Ｍ塩化カ
ルシウム水溶液１２５μｌを加える。３〜５分水上で冷
やし　５００μｍの２ｘＨＢＳ　（ＳＯｓＭ　Ｈｅ　ｐ
　ｅ　ｓ、　　２８ＱａＭ塩化ナトリウム、　１．１１
　リン酸緩衝液）を加え再び水冷後、上記のＣＨＯ細胞
培養液ｌ脂ｌと混合し、プレートに写し、炭酸ガス存在
下インキュベーター中で９時間培養する。以下先浄、２０％グリセロール含有Ｔ　Ｂ　Ｓ　（Ｔｒ
ｉｓｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）添加、再び洗浄
した後非選択培地（前出α−ＭＥＭ培地、ヌクレオシド
添加）を添加して２日間インキコベートし１選択培地で
ｌ：ｌＯに細胞を分割した１次いで２日毎に選択培地（
ヌクレオシド無添加）にて培地交換を行いながら培養を
続行し生じた集塊（ｆｏｃｉ）を選別して新しいプレー
トに移した。新しいプレートでは　０．０２μＭメトトレキセート（
ＭＴＸ）存在下で増殖し再びｏ、ｌμｘ　　ＭＴＸ存在
下で増殖させてクローニングを行った。更にクローニングを続けた結果ｌＯ曽ｇハ以上（−ＶＳ
　Ｅの場合）または、１　ｍ　ｇ　／　１以上（＋ＶＳ
Ｅの場合）のヒトＧ−Ｃ３Ｆの生産を確認した。なお、精製、検定は特開昭６２−２３６４８８号明細書
の実施例記載の方法によって行った。実験例１ＣＧ−Ｃ９Ｆによるウシ頚動脈内皮細胞のプラスミノゲ
ンアクチベータ−（ＰＡ）の産生亢進〕ウシ頚動脈より
採取した血管内皮細胞塊を２０％０％ラン児血清、　　
５Ｏｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、　　ｓａｐｇ／ｓｌス
トレプトマイシンを含むイーグル最小必須培地に分散さ
せ、ベトリ皿中で、９５％空気、５％炭酸ガス、３７℃
の培養条件で初代培養を行う、細胞がペトリ皿−面に増
殖した後、　　Ｏ，ＯＳ％トリプシン溶液で分散させて
から植え継ぎを行う０次にウシ胎児血清を１０％に替え
た初代培養と同一条件で継代培養を行い、多量の細胞を
得る。これらの細胞をペトリ皿で培養して、参考例２に
よって得られたＧ−Ｃ３ＦをＯから３００　ｎｇ／ｍｌ
まで濃度変動をさせ添加し、既述のウシ胎児血清ｌＯ％
を含む培地中で２日間培養を行った。このあと細胞をＧ
−Ｃ３Ｆ及び血清を含まない培地で洗浄した後、さらに
８時間同様の培地中で培養し、これを条件培地とした。この条件培地中に分泌されたＰＡをプラスミノゲンに作
用させ生じたプラスミンを合成Ｍ質　ｔ−ブチルオキシ
カルボニル−し−バＩＪ　ルーム−ロイシル−リジン−
４−メチルクマリル−７−ア　ミ　　ド　　（ＢＯＣ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ）を用いて二段階反応
により測定し、ウロキナーゼ国際単位で表記した。１ｉ１１から明らかなようにＰＡ活性はＧ−ＣＳＦの添
加ｄＡ度の増加と共に劇的に上昇し、　　ＳＯｎｇ／ｍ
ｌでプラトーに達した。また、図２に示したごとく、前
瞬置時間の経過と共にＰＡ住生は増加し、１２時間後に
はほぼ最大に達した。これは対照群のＰＡ活性の５倍に
相当した。これらの結果はＧ−Ｃ３Ｆが血管内皮細胞に
作用し、著しくそのＰＡ産生を促進していることを示し
たものである。さらに表１ではこのＰＡ産生が細胞内で
も増加していることを確認するため、２日間Ｇ−ＣＳＦ
添加で培養した後、細胞を洗浄し、半分の細胞を０．Ｓ
％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を添加してホモゲナイズし
、その抽出液について細胞内ＰＡ活性を検討すると共に
残りの半分の細胞は、８時間既述のように培養し。この培養液について細胞外に分泌されたＰＡ活性を測定
した。この結果、細胞内ＰＡ活性も細胞外のそれと同様
に上昇していた。また、このとき蛋白台、成阻害剤であ
るサイクロへキシミドを２日間の培養中に添加すると、
これに続（８時間培養後の細胞内外のＰＡの産生は完全
に抑えられた。以上の事実は、培地中にＧ−Ｃ３Ｆを添加することによ
り、血管内皮細胞によるＰＡ産生が明らかに促進したこ
とを示したものである。表１ヒ）Ｇ−Ｃ８Ｆを添加培養後のウシ血管内皮細胞内外に
産生、放出されたプラスミノゲンアクチベータープラス
ミノゲンアクチベーター活性（ウロキナーゼ１．Ｕ、／１０ＰＣｅ　ｌ　Ｉｓ）添加
物対照 −ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）細胞外上清細胞内１．８５±０．４５　　　２．５９±１．２９９．０９
±１．０８　　　９．４０±３．３０実験例２（Ｇ−Ｃ３Ｆによる血管内皮細胞の線溶活性の促進）培養皿に入れたフィブリノゲン溶液（１３，５１ｇ／糖
ｌ）　２．４ｍｌにスロンビン（Ｓｕ／＠ｔ）ｌＱＱｕ
　ｌを加え、３１℃３時間インキュベイジョンしてフィ
ブリンゲルを形成させた。このゲル上でウシ頚動脈内皮
細胞を、ｌＯ％ウシ胎児血清、ペニシリン（Ｓｏｕ／ｍ
ｌ）とストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むイ
ーグル最小必須培地を加えて参考例２によって得られた
Ｇ−Ｃ８Ｆを　ＳＯＯｎｇ／＋＋１の濃度になるように
添加し、無添加の対照群と共に４３時間培養した１図３
に示すように対照群では小さな溶解ゾーンが観察され。これは対照群の細胞かられずかなＰＡの分泌があうたこ
とを意味している。一方、Ｇ−Ｃ３Ｆ添加群でより太き
（かつ明確な溶解ゾーンが観察された。これは、Ｇ−Ｃ
３Ｆの刺激により細胞がより多くのＰＡ合成分泌を行い
、結果として培養液中に存在するプラスミノゲンを活性
化し、生じたプラスミンがフィブリンゲルを溶解したも
のである。これらの結果はヒ）Ｇ−ＣＳＦが血管内皮細胞に作用し
、ＰＡの合成分泌を促進し１分泌したＰＡはその周囲に
存在するプラスミノゲンを活性化し。生じたプラスミンが、血栓の主成分であるフイブリノを
溶解することを示したものである。以上結論すると、ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆは血管内皮細胞を刺激
してＰＡ放出を促進することにより、線溶活性の促進作
用を有することが確認できた。実験例３〔七トＧ−Ｃ！９Ｆ連続投与によるアカゲザルの線溶活
性促進〕ヒ）Ｇ−Ｃ５Ｆを７カゲザルに連続投与した後。その末梢血についてクロット・トレーサーＴＥ４００　
（エルマ社！りを用いたトロンボエラストグラフ（Ｔ　
Ｅ　Ｇ）において線溶活性を検討した。図４ａに示すように対照群では凝固が始まると共に振幅
が拡大し、その後線溶活性の発現により徐々にこのＴＥ
Ｇパターンの最大振幅（ＭＡ）が減少した。ところが１
図４ｂに示すようにヒトＧ−ＣＳＦをｌμｓ／ｋｇを皮
下投与しているサルでは投与開始後、最初に測定した２
週間後にはすてにＴＥＧパターンに線溶亢進作用が顕著
に出現しく参考文献１：実戦止血凝固学　藤巻道男（ｔ
！！編集　第１８９−１９１頁参照）、血液凝固過程で
は凝固塊、フィブリン塊の弾性度が低下しているのが明
らかとなった。この現象は図４Ｃに示すように。ヒトＧ−ＣＳＦをｌＯμｓ／ｋｇ連投しているサルでは
さらにこの線溶活性の亢進が゛より著しいことが明らか
となった。　（参考文献２：　基礎と臨床ｖｏｌ。１２、Ｎｏ、６．Ｊｕｎ、　　（１９７８）７６−７８
　ｒｃｌｏｔ　　ｔｒａｃｅｒパターンの解析Ｊ）参考
文献２に示されているように正常ヒト血液にウロキナー
ゼを添加した際のトロンボエラストグラフ、つまり一度
凝固後の血液が溶解するために一本の線状パターンに再
びなる現象と全く同じ傾向がほとんどのヒトＧ−Ｃ９Ｆ
ＩＱ与例で認められた。以上の現象はヒトＧ−Ｃ３Ｆがｉｎ　ＶｉｔｒＯばかり
テナ＜　　ｉｎ　ｖｉｖｏのレベルでも線溶活性の亢進
をしていることを示したものである。上記の実験の結果
をまとめると前述した通り。 ■ヒトＧ−Ｃ３Ｆ存在下で前装置した血管内皮細胞は非
存在下でＷ４置した血管内皮細胞に比べて約５倍のＰＡ
の合成分泌が認められた。 ■ヒトＧ−Ｃ９Ｆと血管内皮細胞をフィブリンゲル上で
培養すると、ＰＡの合成分泌が促進され。結果として共存しているプラスミノゲンカシ活性化プラ
スミンに変換し、血栓の主成分であるフィブリンゲルを
溶解することが明らかになった。つまり、　ヒ）Ｇ−Ｃ
３Ｆは血管内皮細胞を刺激して。ＰＡ放出をすることにより、線溶活性の亢進をする。 ■ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆを７カゲザルに連続投与することによ
り、末梢血でのトロンボエラストグラフを検討した結果
、線溶活性の亢進が認められる。したがってヒトＧ−Ｃ３Ｆは　ｉｎ　ｖｌｔｒｏの結果
トトモニ、　　Ｉｎ　ｖｉｖｏ　　投与実験においても
線溶活性を著しく亢進させることが確認された。実施例１（製剤例）実施例１（製剤例）参考例１によって得られ且つ精製されたヒトＧ−Ｃ８Ｆ
　（１０６ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７）５０μｇ／ｍｌに
非イオン界面活性剤であるポリなるように加え、ＮａＣ
１にて浸透圧比を１に合わせた後、０．２２μｍのポア
サイズを有するメンブランフィルタ−で濾過滅菌する。得られた本発明のヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆを有効成分とする抗血
栓剤は人の体にもともと存在しているヒト血管内皮細胞
のＰＡ産生能を増強し２　血液中に存在するプラスミノ
ゲンを活性型のプラスミンに変換し。このものがフィブリンを溶解する線溶活性を出現させる
。この結果、血栓を溶解させると共にさらにＧ−Ｃ３Ｆ
投与で増加する好中球がこれら血栓溶解物の処理に促進
的に動き、これらの作用にもとづいて血栓を溶解除去し
ようとするものであり。副作用の少ない抗血栓剤として有用なものである。ャプにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用
溶液製剤は１０°Ｃ以下の冷暗所に保存する。実施例２（製剤例）参考例２によって得られ且つ精製されたヒトＧ−Ｃ８Ｆ
　（１０６ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７）１００μｇ／ｍｌ
に非イオン界面活性剤であるポリ末坤シ１．７ノルヒ／モノオレート）をＯ，１ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに加え、ＮａＣ１にて浸透圧比を１に合わせた後、０
．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィルタ−
で濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバイ
アル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し
　ｎヤブにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注
射用溶液製剤は１０°Ｃ以下の冷暗所に保存する。実施例３（製剤例）参考例１によって得られ且つ精製されたヒトＧ−Ｃ８Ｆ
　（１０６ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７）５０μｇ／ｎｔに
非イオン界面活性剤であるボリシ幌佑警ンモノラウレー
ト）をＯ，１ｍｇ／ｍｌとｌＳＡ１０ｍｇ／ｍｌ及びマ
ンニトール５０ｍｇ／ｍｌとなるように加えて溶解した
後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィ
ルタ−で濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施し
たバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を
半打栓し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤を得た。この注射用凍結乾燥製剤は室温以下の温度条件に保存し
、注射用蒸留水にて用時溶解して使用する。実施例４（製剤例）参考例２によって得られ且つ精製されたヒトＧ−Ｃ８Ｆ
　（１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７）１００μｇ／ｍｌ
に非イオン界面活性剤であるポリソルベート８０　（Ｔ
ｗｅｅｎ”８０：ポリオキｇＹンモノオレート）を０．
１゜ｇ／ｍｌとゼラチンＬｏｍｇ／ｍｌ及びマンニトー
ル５０ｍｇ／ｍｌとなるように加えて溶解した後、０．
２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィルタ−で
濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバイア
ル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し
、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤を得た。この注射
用凍結乾燥製剤は室温以下の温度条件に保存し、注射用
蒸留水にて用時溶解して使用する。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明のヒトＧ−Ｃ３Ｆがウシ血管内皮細胞に
よるＰＡの産生に及ぼす影響を示す。図２は、本発明のヒトＧ−ＣＳＦがウシ血管内皮細胞に
及ぼすＰＡの産生と前瞬置時間の関係を示す。図３は、本発明のヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆが血管内皮細胞の線溶
活性の亢進に及ぼす影響を示す。図４は、本発明のヒトＧ−Ｃ３Ｆのアカゲザル１３週間
連続皮下投与における経時的ＴＥＧパターンを示す。図　　１ウノ血を内反細胞によるプラスミノゲンアクチベーター
の産生に及ぼすし）Ｇ−Ｃ３Ｆの１度ヒトＧ−Ｃ８Ｆ添加壜度（ｎｇ／ｍｌ）ヒ）Ｇ−ＣＳＦ
による血管内皮細胞の線溶活性の促進Ａ　：対照群Ｂ　：Ｇ−Ｃ８Ｆ添加群

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト顆粒球コロニー刺激因子を有効成分とする抗
血栓剤。
（２）生体内の全ての動、静脈血管内に形成される血栓
を対象とする特許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤。
（３）ヒト顆粒球コロニー刺激因子が動、静脈血管内皮
細胞のプラスミノゲンアクチベーターの合成分泌を促進
すること、およびこのプラスミノーゲンアクチベーター
がプラスミンを生成し、線溶活性の亢進をすることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤。
（４）ヒト顆粒球コロニー刺激因子がヒト顆粒球コロニ
ー刺激因子産生細胞の培養上清から得られたものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤
。
（５）ヒト顆粒球コロニー刺激因子が次の理化学的性質
を有するものであることを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の抗血栓剤。「理化学的性質」［１］分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による測定で１９，０００±１，
００００。［２］等電点：ｐＩ＝５．５±０．１、ｐＩ＝５．８±
０．１、ｐＩ＝６．１±０．１の３つの等電点のうち少
なくとも１つを有する。［３］紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５
０ｎｍに極小値をもつ。［４］Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
くである。【遺伝子配列があります】
（６）ヒト顆粒球コロニー刺激因子がヒト顆粒球コロニ
ー刺激因子活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子を含む組換えベクターを含有する形質転換体から産生
されたヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
プチドまたは糖蛋白質であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の抗血栓剤。
（７）ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
プチドが下記のアミノ酸配列またはその一部で表される
特許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤。【遺伝子配列があります】（但しｍは０または１を表し、ｎは０または１を表す）
（８）ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白
質が下記のアミノ酸配列またはその一部で表されるポリ
ペプチドと糖鎖部とを有するものである特許請求の範囲
第１項記載の抗血栓剤。【遺伝子配列があります】（但しｍは０または１を表し、ｎは０または１を表す）