JPH02234679A - ヒトラミニンｂ１鎖ポリペプチド断片及びこれを生産するための発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトラミニンＢｌ鎖の細胞結合部位を含むポ
リペプチド、それを生産するための発現ベクター、この
発現ベクターによって形質転換された大腸菌に関する。

〔従来の技術〕

ラミニンは分子量約９０万の糖タンパク質であり、血管
、腎臓、筋など各種組織の基底膜を構成する成分の一つ
である。１９７９年マウスのＥＨＳ肉種からラミニンの
大量精製法が確立されて以来、ラミニンに関する研究が
著しく進展した（Ｒ．Ｔｉｍｐｌｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２５４：９９３３（１９７９）　）
　．ラミニン分子は分子量４４万のＡ鎖並びに分子量２
２万のＢｌ鎖とＢ２鎖の三本鎖から構成されており、電
子顕微鏡観察によれば十字形をとっている（第２図参照
｝。この中には、基底膜の他の構成成分であるタイプＩ
Ｖコラーゲンやヘパリンと結合するドメイン、上皮細胞
や内皮細胞の表面にあるラミニンレセブターと結合する
細胞結合ドメインが存在する。

ラミニンの生理活性についてはまだ不明な点も多いが、
細胞接着、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走などの促進と
言った多くの機能を有していることが示唆されている〔
ラミニンに関する総説、河野ら、蛋白質核酸酵素　３２
：３９７　（１９８７）、■．κ．ＫＩｅｉｎｍａｎ　
ｅｔ　ａｌ．，Ｊ，Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：
３１７（１９８５），Ｒ．Ｔｉｍｐｌ　ｅｔ　ａ＋．，
Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．８：２０７（
１９８３）　）。また自己免疫疾患、トリバノソーマ感
染症、糖尿病、癌の転移、細菌感染など各種病気との関
連も明らかにされつつある。このような多様な機能を有
し、各種疾患と関連があることから、ラミニンを医薬や
診断薬、細胞培養用添加剤、化粧品などへ応用しようと
する試みもなされている。例えば、プロテアーゼ処理し
て得られるラミニン１断片が癌細胞の転移を抑制する（
Ｓ．Ｈ．Ｂａｒｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．．Ｊ．ｃ１ｉｎ．
Ｉｎｖ．７４：８４３（１９８４）　）ことから、これ
を癌の転移防止剤として使用しようとする試みや、ある
種の細胞はラミニンを添加すると増殖が促進する（Ｈ．
Ｋ．Ｋ１ｅｉｒｖ＋ａｎ　ｅｔ　ａｌ．＋＾ｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６６：１（１９８７）　）ことから、
細胞培養時に添加する細胞増殖因子として用いる試みな
どが行われている。しかしまだ大量生産法が確立されて
おらず、遺伝子工学による生産が期待されている物質の
一つである 最近、マウスラミニンＢ１鎖のｃＤＮＡがクローン化さ
れ、全アミノ酸配列が決定されたＣＭ．Ｓａｓａｋｉ　
　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．［ｌＳＡ　　８４：９３５（１９８７）　）。この
アミノ酸配列の解析に基づいて、タンパク質化学及び電
子顕微鏡観察から推定されていたドメイン構造に対応す
る６個のドメインからなる構造モデルが提出された（第
２図）。その後の研究によりドメイン３に細胞結合部位
があることが示された（Ｊ．Ｇｒａｆ　ｅｔ　ａｌ．，
Ｃｅｌｌ　４８：９８９（１９８７）　）。さらにこの
ドメインの一部アミノ酸配列を有する合成ベプチドがイ
ン　ビボで癌の転移を抑制することも示されている（Ｙ
．Ｉｗａｍｏｔｏ　ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３
８：１１３２（１９Ｂ？）．ＷＯ−８８０６０３９　）
。

一方、ヒトラミニンに関する研究は大量の材料を得るこ
とが困難であることなどから余り進んでいない。最近、
Ｂ１鎖に対するｃＤＮＡクローンが報告され、このアミ
ノ酸配列解析の結果、ヒトラミニンＢ１鎖もマウスラミ
ニンＢ１鎖同様に６個のドメイン構造を有することが示
された（Ｔ．Ｐｉｋｋａｒａｉｎｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ
．，Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２６２：１０４５４（１
９８７））ので、今後ヒトラミニンについても研究の進
展が期待される。ｃＤＮＡクローンを用いてドメイン１
とドメイン２の一部を含むＣ末端を大腸菌で発現させた
例（ＢＰ−０２０４３０２Ａ２）も報告されているが、
発現産物の精製や活性の検討は行われていない。ヒトラ
ミニンＢ１鎖、特に細胞結合部位を含むドメイン３を遺
伝子工学技術を用いて大量生産できれば、先に述べたよ
うな多くの応用分野が開けてくるが、まだそのような報
告はない。

一般に分子量の大きなポリペプチドやＣｙｓ含量の高い
ポリペプチドを大腸菌内で大量発現させ、しかも生理活
性を有するものを得るのは困難であるとされている。こ
のような観点からすると、ヒトラミニンＢ１鎖の場合、
分子量が約２０万と大きく、Ｃｙｓが１２６残基も含ま
れており、大腸菌による大量発現には多くの困難が予想
される。

特に細胞結合部位が存在すると言われているドメイン３
のＣｙｓ含量は、４０８アミノ酸残基中６７残基と異常
に高い。このようにＣｙｓ含量の高いポリペプチドを大
腸菌で大量発現させた例は、これまで知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、ヒトラミニンＢ１鎖の細胞結合ドメインをコ
ードするｃＤＮＡの一部を大腸菌により発現させ、ヒト
ラ之ニンＢ１幀の細胞結合部位を含むポリペプチドを大
量生産しようとするものである。

すなわち、本発明は、ヒトラミニンＢ１鎖の細胞結合部
位を含み、細胞結合活性を有するポリペプチドを提供す
る。さらにまた、この発明は、上記発明のヒトラミニン
Ｂ１鎖ポリペプチド断片をコードするＤＮＡ領域を有し
、該ポリペプチド断片を発現することのできる発現ベク
ターを提供す〔課題を解決するための手段〕 ヒ１・ラミニンＢ１鎖ｃＤＮＡがコードしているタンパ
ク質は、１７６５アミノ酸残基からなり、第２図に示す
ような６個のドメイン構造に分けられる。細胞結合ドメ
インはドメイン３に相当し、第７５１番目から第１１５
８番目のアミノ酸残基からなるＣｙｓ含量の高い領域で
ある（第１図では第３３番目から第４４０番目のアミノ
酸残基に対応する）。本発明のポリベプチドは、このド
メインの全部あるいは一部を含むものである。細胞結合
活性を有するものであれば、この中の何れの部位でも構
わない。また一般にペブチドの生理活性は、一部のアミ
ノ酸が置換し、欠落しまたは少数のアミノ酸が付加され
た場合でも維持されることがあることは、当業者によっ
て良く認識されているところである。従って、このドメ
インの一部のアミノ酸が置換し、欠落しまたは少数のア
ミノ酸が付加されたものであっても、細胞結合活性を有
するものは本発明のポリペプチド断片に採用する事がで
きる。

ポリベブナドを遺伝子工学的に生産するためには、Ｎ末
端にＭｅｔを必要とする。従って、本発明のポリペプチ
ドのＮ末端にはＭｅｔから始まる−個以上のアミノ酸残
基が付加している。付加するアミノ酸残基は、本ポリペ
プチドの機能を著しく損なわないものであれば特に限定
されない。後述する実施例では、シュードモナス・プチ
ダ由来のカテコール酸化酵素であるメタビロ力テカーゼ
のＮ末端１２アミノ酸残基を有している。

本発明のポリペブチトはＣ末端に一個以上のアミノ酸残
基が付加していても細胞結合活性を著しく損なわないも
のであれば構わない。実施例では、発現一・クターのゾ
ン力一に由来するアミノ酸残基が付加している。

本発明は、上記したヒトラミニンＢ１鎖ｃＤＮＡの一部
をコー１・するＤ　Ｎ　Ａ　ｔ＋１域を有し、該ポリペ
プチドを発現することのできる発現ベクターを提供する
。この発現ベクターに組み込まれる、ヒトラミニンＢ１
鎖をコードするＤ　Ｎ　Ａ　領域は、公知の方法により
ヒト由来細胞からｍ　Ｒ　Ｎ　Ａを調製し、これから逆
転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、さらにこれを二本
鎖とすることにより得たものであっても良いし、合成さ
れた物であってもよい。

本発明の発現ベクターは、従来の通常の発現ベクターと
同様、複製に必要な複製開始点、制御可能なプロモータ
ー／オペレーター、リポソームが結合するためのＳＤ配
列、転写終結のだめのターミネーター及びオペレーター
に結合する制御タンパク質をコードする遺伝子を含む。

これらは各々の機能を有するものであれば公知の何れの
ものをも用いることができる。例えば、複製に必要な複
製開始点としては、ｐＢＲ３２２やｐＵＣ系ブラスミド
の複製開始点、プロモーター／オペレーターとしてはｌ
ａｃＵＶ５、ｔｒｐ．．ｔａｃ，ＰＬ，Ｐ，ｌ，１１）
！）などを、ＳＤ配列としてはメタピロカテカーゼのＳ
Ｄ配列〔特開昭６１−１５８７８７）、ｌａｃのＳＤ配
列（Ｄ．Ｖ．Ｇｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ．＋Ｎａｔｕｒ
ｅ２８１：５４４（１９７９）　）やコンセンサスＳＤ
配列ＣＧ．Ｊａｙ　ｅｔ　ａｌ　．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．υＳ＾７８：５５４３（１９８
１）　）などを、ターミネーターとしてはｒｒｎＢＴ＋
Ｔｚなどを採用することができる。また、プロモーター
／オペレーターとしてｌａｃ系の物を使用する場合には
、オペレーターに結合して転写を制御できるＩａｃリプ
レッサーをコードしているｌａｃｌ遺伝子あるいはｌａ
ｃｅＱ遺伝子を有していることが望ましい。また、薬剤
耐性のような適当な選択マーカーを有していることが好
ましい。

本発明の発現ベクターは、複製開始点、プロモーター／
オペレーター、ＳＤ配列、開始コドン、ポリリンカ一部
位、停止コドン、ターミネーター及び好ましくはオペレ
ーター制御遺伝子と選択マーカーを有するベクターにヒ
トラミニンＢｌ鎖の細胞結合活性を有するポリペプチド
をコードするＤ　Ｎ　Ａ　ｊｉｆｆ域をクローニングす
ることにより構築することができる。後述の実施例では
、ｐＵＣ９の複製開始点、ｔａｃプロモーター／オペレ
ーターメタピロカテカーゼのＳＤ配列とＮ末端１２アミ
ノ酸残基、ｒｒｎＢターミネーターを有するプラスミド
であるｐＭＫ３Ｃ（特願昭６３−１６４９３５記載）に
、ヒトフィブロザルコーマ細胞株ＨＴ−　１　０　８　
０のｍＲＮＡから調製したヒトラミニンＢ１鎖をコード
するｃＤＮＡの細胞結合部位を含む領域と、ｌａｃｌｑ
遺伝子（例えば特願昭６３−９３９６，　ｐ　Ｒ　Ｐ　
２由来）をクローニングすることにより本発明の発現ベ
クターを構築したが、構築方法はこれに限定されないこ
とは明らかである。

本発明のヒトラミニンＢ１鎖ボリペプチド断片は、上記
した発現ベクターで宿主微生物、好ましくは大腸菌、特
に例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）　Ｋ−１　２株に由来
する例えばＪＭＩＯＩ．ＪＭ１０３，ＪＭ１０５，　　
ＪＭ１０９，　　ＲＲＩ　　ＨＢＩＯＩ．ＲＢ７９１，
Ｗ３１］０，　　Ｃ６００，　　ＫＹ１４３６などのよ
うな腸管寄生性の無い大腸菌株を形質転換し、該形質転
換株を培養することにより形質転換株中に産生ずること
ができる。

培養した形質転換株から本発明のヒトラミニンＢ１鎖ボ
リペプチド断片の回収、精製は、大腸菌の菌体に生産さ
れるポリベプチドを回収、精製するための常法を用いる
ことができる。例えば、菌体を遠心により回収し、これ
を適当な手段により破砕して遠心分離により沈澱を集め
る。目的とするポリペプチドはこの沈澱中に回収される
。次にこの沈澱物を尿素またはグアニジンで処理するこ
とにより目的ポリペプチドを可溶化する。次にこのポリ
ペプチド溶液をリフォールディング後タンパク質精製の
常法である各種力ラムクロマトグラフィーを組み合わせ
ることによって精製することができる。本ペプチドの場
合、特に疎水カラムクロフトグラフィーにより一段で精
製できる。この具体例は、下記実施例７に記載されてい
る。

以下、実施例及び参考例に基づき本発明をさらに具体的
に説明するが，，本発明はこれらの例に限定されるもの
ではない。

ｎＮＡの組み換えに関する以下の基本的な操作及び反応
は文献（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８
２），”　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．＾Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌｌｌ＋Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）
に従って行った。制限酵素及び各種修飾酵素は特に記載
が無い場合宝酒造社製の物を用いた。制限酵素反応は付
属の説明書に記戟してある緩衝液組成及び反応条件で行
った。一般的には０．１μｇ−１００μｇのＤＮＡを用
い、１０倍濃度の緩衝液を１０分の１量と酵素１〜ＩＯ
ＯＵを加え、総量２０〜１００μｌで３７℃、１〜２４
時間反応を行った。制限酵素で切断したＤＮＡ断片は０
．Ｊ〜１．５％のアガロースゲル電気泳動にかけて分離
した後、目的とずる断片を含むバンドをゲルから切り出
し、透析チューブ内で電気溶出させた後フェノール抽出
を行いエタノール沈澱によりＤＮＡ断片を回収した。

５′一突出末端の平滑末端化はＤＮＡポリメラーゼ■ク
レノウ断片を用いて行った．ＤＮＡ断片をクレノウ緩衝
液（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ７．２．Ｉ　
ＯｍＭ　　ＭｇＳＯ＝．，０．１ｍＭジチオスレイトー
ル、５０，ｕｇ／ｍｌ牛血清アルブミン）と８０ｐＭ　
　ｄＮＴＰｓ　（ｄＡＴＰ．ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴ
ＴＰ）を含む２５μｌの反応液中で２単位のクレノウ断
片を加えて、３７℃、３０分間反応させた。反応液を５
分間７０℃で加熱し酵素を失活させた後、フェノール抽
出、エタノール沈澱を行った。

３′一突出末端の平滑末端化はＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて行った。ＤＮＡ断片を７４ＤＮＡボリメラーゼ
緩衝液（３３ｍＭ　　Ｔｒｉｓアセテート、ｐ　Ｈ　７
．９．　　６　６　ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍ　Ｍ酢酸
マグネシウム、０．５ｍＭジチオスレイ１・ール、１０
０μｇ　／　ｍ　ｌ牛血清アルプミン）と１００μＭｄ
ＮＴＰ５を含む反応液中で３７℃５分間反応させた後、
０　．５Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　１μβを添加してフ
ェノール抽出後、エタノール沈澱を行った。

５′一末端の脱リン酸化は子牛腸アルカリホスフブター
ゼ（ＣＩＰ）により行った。ＤＮＡ断片をＣＩＰ緩衝液
（５　０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ−ＨＣ　１ｐＩ｛９．０
．１ｍＭ　　ＭｇＣＩｚ，０．１ｍＭＺｎＣＬ＋１ｍＭ
スペルミジン）を含む総量５０μｌの反応液中で、２単
位のＣＩＰ　（ベーリンガーマンハイム社製｝を加え、
３７”Ｃ３Ｇ分間反応ざせた後、水５０，ｕｌ、ｌｏｘ
ｓＴＥ　（ＬＭ　　ＮａＣｌ１００ｍＭ　　Ｔｒｆｓ−
ＨＣＩ，ｐＨ８．０．１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）１　０７
ｊＣ　　ｌ　Ｏ％ＳＤＳ　　５１ＪＩｌを加えて６８℃
、１５分間加熱し、フェノール抽出を２回行った後、エ
タノール沈澱を行った。

ライゲーション反応は宝酒造社製ライゲーションキソト
を用い付属の説明書に従って総量２０μ！、１６℃、３
０分間〜２４時間反応という条件で行った。大腸菌の形
質転換はライゲーション反応液５μｌを用いてハナハン
法ＣＤ．Ｈａｎａｈａｎ，Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．１６
６，５５７（１９８３））によって行った。ブラスミド
の単離は、形質転換菌を５０ｐｅ／ｒｎＩアンビシリン
含有し−ブロス（１％バタトトリプトン、０．５％バク
トイーストエクストラクト〜　１％ＮａＣＩ，ｐＨ７．
５）２ｍｌ中で８〜２４時間培養した後、アルカリリシ
ス法により行った。

参考例１ ＨＴ−１０８０ポリ　（Ａ）”ＲＮＡの調製ヒトフィブ
口ザルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣより入手
可能）をＭＥＭ培地（４ｍＭＣＯ。気流下３７℃で培養
し、６ｇの細胞を得た６ｍＲＮＡ及びボリ　（Δ）”Ｒ
ＮＡＯ単離は上掲マニアチスらの文献に準じた。すなわ
ち、細胞ペレソトをグアニジウム溶液（６Ｍグアニジウ
ムイソチオシア翠−ト、５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０、０．５％ザルコシル、０．１ｍＭ　　２一メ
ルカブトエタノール）３０ｍｌに懸濁し、ホモジナイズ
した後、ヘソクマンＳＷ２　８用遠心管内の５．７ＭＣ
ｓＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５水溶液ＩＱｍ
ｌ上に重層し、２６．００Ｏｒｐｍ、１５℃、２０時間
遠心した。遠心管底部に沈澱したｍＲＮＡを８０％エタ
ノールで洗浄した後、１０ｍＭ　　Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ　
　ｐＨ７．５．５ｍＭＥＤＴＡ．Ｉ％ＳＤＳ溶液２ｍｌ
に溶解した。ついでクロロホルムーｎ−ブタノール（４
　：　１）抽出、エタノール沈澱後、水２ｍｌに溶解し
、２６０ｎｍの吸光度からｍＲＮＡの濃度を求めた。

グルタミン、１０％牛胎児血清を含む）中で５％ｍＲＮ
Ａの収量は１３．９■であった。これを２０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　　　ｐＨ７．６．　　０．５ｍＭＮａ
ＣＩ，１ｍＭ　　ＥＤ’ｌ”Ａ．０．１％ＳＤＳで飽和
したオリゴｄ　Ｔセルロース（コラボラティプ・リサー
チ社製、０．５ｇ）カラムにかけた後、吸着したポリ　
（Ａ）′″ＲＮＡをｌｏｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　
ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ＳＤＳｉ液で
溶出させた。これをエタノール沈澱後、水５００μＥに
溶解した。このようにして４９０μｇのポリ　（Ａ）”
ＲＮＡが得られた。

参考例２ ｃＤＮＡライブラリーの作製 二本ｔＮ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの作製はガブラー−ホフマン
の方法（Ｕ．Ｇｕｂｌａｒ　ａｎｄ　Ｂ．Ｊ．Ｈｏｆｆ
ｍａｎ＋Ｇｅｎｅ　２５：２６３（１９８３）　）に準
じた。ＨＴ−１０８０のポリ　（Ａ）９ＲＮＡ　　１μ
ｇから、オリゴ（ｄ　Ｔ）　＋ｚ−＋ａ（ファルマシア
社製）２μｇをプライマーとして逆転写酵素（ライフヅ
イエンス社製）２７．４Ｕと３７℃１時間反応させ、第
一鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成した。これに大腸菌ＲＮａｓ
ａＨ（宝酒造社製）０．８Ｕ，大腸菌ＤＮＡボリメラー
ゼＩ（ニューイングランドハイオラボス社製）３０Ｕ，
大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニューイングラントバイオラボ
ス社製）４Ｕを加えて１２゜ｃ，１時間、続いて２２℃
、１時間反応させ、第二鎖ｃＤＮＡを合成した。さらに
Ｔ’４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１．５Ｕを加
えて３７℃、１０分間反応させ、平滑末端化した後、Ｅ
ｃｏＲＩメチラーゼ（ニューイングランドバイオラボス
社製）２０Ｕ，８０μＭＳアデノシルメチオユン存在下
３７゜Ｃ１時間反応させ、ＥＣＯＲ１部位のメチル化を
行った。ついでリン酸化したＥｃｏＲＩリンカー（ｄＧ
ＧＡＡＴＴＣＣ、宝酒造社製）を付加し、ａ　ｒ　ｐ処
理したｐＵｃ９のＥｃｏＲＩ断片とライゲーション反応
を行った。得られたライゲーション混合物で大２〇一 腸菌ＲＲＩの形質転換を行い、形質転換菌を５０μｇ　
／　ｍ　１アンピシリン含有しプロス１００ｍｌ中で３
７℃一晩培養してライブラリーを増幅した後、一部を１
５％グリセロール溶液として−８０℃で保存した。

参考例３ スクリーニング ｃＤＮＡ形質転換菌の凍結グリセロール保存液２０＃ｌ
を、Ｌプロスで５，０００倍希釈し、希釈液をアンビシ
リン含有しブロス寒天培地プレート上に置いたニトロセ
ルロースフィルターの上に広げ、３７℃で一晩培養した
。ニトロセルロース上のコロニーを２枚のニトロセルロ
ース上に移した。

このレプリカをＬブロス寒天培地上で３時間培養した後
、２００μｊ！／ｍｌクロラムフェニコール含有寒天培
地上に移し、さらに一晩培養した。フィルターを順次５
分間ずつ１０％ＳＤＳ水溶液、アルカリ変性溶液（０．
５Ｎ　　ＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣ１）、中和溶液（１
．５Ｍ　　ＮａＣ１、０　．５ＭＴｒ　ｉ　ｓ−ＨＣＩ
　　ｐＨ８．０）上に置いた後、８０℃、３時間加熱処
理した。

クローンＩＩ）　２　４　（Ｍ．Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　
ａｌ．＋上掲文献）からマウスラミニンｃＤＮＡを含む
ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、ベセスダリサーチラボラト
リー社製ニソクトランスレーションキソトを用いて３２
Ｐで標議し、スクリーニング用ブローブを作製した。

このプローブを用いて先に調製したレプリカフィルター
とハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼー
ションの条件は、５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣ，１
０ｘデンハルト溶液中４２℃１６時間、洗浄の条件は、
２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃を用いた。スクリ
ーニングの結果、１個の陽性クローンが得られたので、
このクローンをｐＩ｛ＴＢｌｌと命名した。

プラスミドｐＨＴＢ１１の制限酵素地図を第３図に示す
。，ＨＴＢＩＩは３．４ｋｂのｃＤＮＡインサートを有
していた。ついで各種制限酵素で切り出したＤＮＡ断片
をｐＵｃ１９のＳｍａｒ部位にサブクローニングＵ７た
後、ジデオキシ法により５′及び３′両方向からシーケ
ンスを行った６その結果、このｃ　ＤＮＡはヒトラミニ
ンＢ１鎖のドメイン４の途中から始まるクローンである
ことが分かった。マウスに於いて細胞結合ドメイン（ド
メイン３）と推定されている、Ｃｙｓリノチなアミノ酸
配列を含むＸｔ＋：１１−Ｓｔｕｌ断片の塩基配列を、
第１図に示す。文献（Ｔ．Ｐｉｋｋａｒａｉｎｅｎ　ｅ
ｔ　ａｌ．，上掲文献）記載のｃＤＮＡと比較すると２
箇所に違いがみられた。第１図の第２１１番目の塩基Ｇ
が文献ではＡに〜まだ第８４８番目の塩基Ａが文献では
Ｇとなっている。その結果アミノ酸配列も異なり、第１
図に示すアミノ酸配列のうち、第７１番目のＡｌａ及び
第２８３番目のＧ　１　ｕが、文献一２３ ではそれぞれ’］”　ｈ　ｒ及びＡｒｇとなっている。

実施例ｌ ブラスミドｐＭＬＡＭｌの作製（第４図）ブラスミドｐ
ＨＴ８１１　　１０μ６を１２０ＵのＸｂａｌ、ついで
１２０Ｕの５Ｌｕｉで切断し、約１．４ｋｂｐのｃＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動にかけた後単離した。

このＤ　Ｎ　Ａ断片約１μｇをクレノウ断片で平滑末端
化した。

一方、メタピロ力テカーゼのＮ末端１２アミノ酸残基を
含む発現ベクターｐＭＫ３’（特願昭６３１６４９３５
号記載のｐＭＫ３作製時に生じた副産物の一つであり、
Ｓｍａ　Ｉ部位に続く４個のＧのうち１個が欠失したヘ
クター）１μｇを、１０Ｕの３　ｒｎ　ａ　Ｉで切断し
た後、ＣＩＰ処理を行い、これと上記で作製したラミニ
ンｃＤＮＡ断片をライゲーションさせた後、大腸菌ＪＭ
１０９の形質転換一２４ を行い、５０μｇ　／　ｍ　ｌのアンビシリン含有寒天
培地上で培養した。形質転換体コロニーをＬブロス中で
培養してから、アルカリリシス法によりプラスミドを単
離し、制限酵素切断地図により目的とするプラスミドで
あることを確認した物について、さらに融合部分の塩基
配列を決定して、フレームがあっていることを確認した
。融合部分の塩基配列及びアミノ酸配列を第７図に示す
。このようにして得られたブラスミドをｐＭＬＡＭ１と
命名した。

実施例２ ｐＭＬＡＭ５の作製（第５図） 発現ベクターｐＭＫ３　（特願昭６３−１６４９３５号
記載）１，ｃ＋ｇを３ｍａＩ　　ＩＯＵ１ついでＥｃｏ
ＲＶ１０Ｕで切断した後セルフライゲーションを行い、
ｐＭＫ７を作製した。ｐＭＫ７は、ｐＭＫ３の３ｍａｌ
からＥｃｏＲＶまでのポリリンカ一部分を除去したヘク
ターである。ｐＭＫ７、１μｇを１０ＵのＰｖｕ　Ｔ　
Ｉで切断した後、ＣＩＰ処理を行った。

実施例１で作製したχｂａｌ−ＳｔｕＩ断片約２μｇを
Ｄｄｅ＋（東洋紡社製）１５Ｕで消化した後、約５５０
ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動後単離し、さらに
クレノウ断片によって平滑末端化し、上記で作製したＰ
ｖｕ　Ｉ　Ｉ消化ｐＭＫ７０．１μｇとライゲーション
させた。実施例１と同様に大腸菌ＪＭ１０９の形質転換
を行い、目的とするブラスミドを得た。融合部の塩基配
列及びアミノ酸配列を第７図に示す。得られたプラスミ
ドをｐＭＬＡＭ５と命名した。

実施例３ 実施例４ ｐＭＬＡＭ６の作製（第６図） ｐＭＬＡＭｎ　（ｎ＝３．４．７．１　４）の作製実施
例１で作製したＸｂａｌ−Ｓｔｕｌ断片２ｐｇをＨａｐ
ｌｌ　　ＩＯＵで消化した後、約６５０ｂｐの断片をア
ガロースゲル電気泳動後単離し、さらにクレノウ断片に
よって平滑末端化した。この断片０．１μｇと実施例ｌ
で作製したＳｍａｒ消化ｐＭＫ３’のＣＩＰ処理物０．
１μｇをライゲーシジンさせた。実施例１と同様に大腸
菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、目的とするプラスミド
を得た。

融合部の塩基配列及びアミノ酸配列を第７図に示す。得
られたプラスミドをｐＭＬＡＭ６と命名し実施例１，２
．３と同様にして、ｐＨＴＢ１１のＸｂａｌ−Ｓｔｕｌ
断片から適当な制限酵素切断によってＤＮＡ断片を切り
出し、ベクターとフレームが合うようにクレノウあるい
はＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、ｐＭＫ
３’あるいはｐＭＫ７のポリクローニング部位に挿入し
、ｐＭＬＡＭ３、ｐＭＬＡＭ４、ｐＭＬＡＭ７、ｐＭＬ
ＡＭ１４を作製した。各々について、用いたベクターの
種類と切断部位、ラミニンｃ　ＤＮＡの５′側並びに３
′側の制限酵素部位、平滑末端化の方法、発現産物のア
ミノ酸残基数をまとめて第１表に示した。何れについて
も、制限酵素地図並びにベクターとの融合部位の塩基配
列は確認し実施例５ ｐ　Ｍ　ｌ．　Ａ　Ｍ　ｎ　Ｑ　（　ｎ　＝１．３，４
，５，６，７．１４）の作製（第８図） ｐＭＫ３Ｃ（特願昭６３−１６４９３５号記載）１μｇ
をＩＯＵのＣｌａＩで切断し、ＣＩＰ処理した。

一方、ｐＲＰ２　（特願昭６３−９６９６号記載）５μ
ｇを５０ＵのＥｃｏＲＴついで５　０　ＬｌのＨｉｎｄ
ｌｌｌで切断し、ｌａｑｌｑ遺伝子を含む２．５ｋｂｐ
のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により単離した
。この断片をクレノウ断片により平滑末端化した後、リ
ン酸化Ｃ１ａＩリンカーを付加した後、さらに２０Ｕの
Ｃ１ａＩで消化を行った。この断片を上記ヘクター０．
１μＣとライゲーションし、大腸菌ＨＢＩＯＩの形質転
換を行い、目的とするプラスミドを得た。制限酵素切断
（Ｃｌａｌ．Ｐｓｔｌ）によりｌａｑｌＱ遺伝子がｔａ
ｃプロモーターと同一方向に挿入された物をｐＭＫ３Ｑ
１と命名した。

ｐＭＬ．ＡＭｎ　（ｎ＝１．３，４．５．６，７．１４
）　５，ｌｊｇを５　０　ＵのＥｃｏＲｒついで５０Ｕ
の｝ｌｉｎｄｌｌｌで切断した後、アガロースゲル電気
泳動にかけ、ラミニンをコードするＤＮＡ断片を単離し
た。

方、上記で作製したｐＭＫ３Ｑ１　　５μｇを５０Ｕの
ＨｉｎｄｌＩＩ、ついで５０ＵのＭｌｕｌで切断後、約
４．３ｋｂｐの遺伝子断片を、また、同じくｐＭＫ３Ｑ
１　　・５μｇを５０ＵのＥｃｏＲＩ、ついで５０Ｕの
Ｍ　１　ｕ　Ｉで切断後、約１　．２ｋ　ｂ　ｐの遺伝
子断片を、それぞれアガロースゲル電気泳動により牟離
した。各遺伝子断片約０．１μｇづつをライゲーション
し、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、ブラスミドｐ
ＭＬＡＭｎＱ　（ｎ−１．３．４，５，６，７．　１４
）を得た。何れも制限酵素切断により目実施例６ ＫＹ１　４　３　６／ｐＭＬＡＭ５Ｑ及びＫ　Ｙ　］−
　４．　３　６　／遣伝子産物の発現 実施例５で作製した発現プラスミドｐ　Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｍ
　ｎ　Ｑ（ｎ・」，３，４，５，６，７．１４）で大腸
菌ＫＹ１４３６《′特開昭６３−１２９９８１号記載、
黴工研菌寄第８８１８号）の形質転換を行い、形質転換
体、ＫＹ１４３６／ｐ　Ｍ　Ｌ　ＡＭ　ｎ　Ｑ　（．ｎ
　＝］．３，４，５，６，７．１４）を得た。

ＫＹＩ　４　３　６／ｐＭＩ．Ａ．ＭＩＱ，ＫＹＩ　４
　３　６／’■！ＭＬＡＭ５Ｑ及ひＫＹＩ　４３６／ｐ
ＭＬＡＭ６Ｑを５０μｇ　／　ｘｎ　］アンビシリン含
有しブロス培地に懸濁し、一晩培養後、１５ｍ！を２Ｉ
．の三角フラスコＧこいれた５　０　０　ｍ　ｌの同培
地中にい丸でＯｒ）ａｏｏが約１．０になるまで培養後
、最終濃度１ｍＭになるようにＩＩ）ＴＧ（イソプロビ
ルチオガラクトビラノシド）を加え、４時間培養後菓菌
した。培養はすべて３０℃で行った。２ｌ培養すること
によりＫ　Ｙ　Ｉ　４　３　６　／　Ｉ）　Ｍ　Ｌ　Ａ
　Ｍ　Ｉ　Ｑ、一３１ ｐＭＬＡＭ６Ｑの培養液からそれぞれ１０．９ｇ．１　
３．４ｇ，１　３．６ｇの温菌体が得られた。

実施例７ 遺伝子産物の精製 ＫＹＩ　４３６／ｐＭＬＡＭｎＱ　（ｎ＝５．６）の湿
菌体約５ｇを、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ８．
０，１ｍＭＥＤＴＡ　（以下ＴＥと略す）１００ｍｌ拍
加えてよく懸濁した。これに０．１μｇ／ｍｌになるよ
うにリゾヂームを加え、２℃で１ｏ分間３回超音波破砕
（久保ロ」ＴＳＯＮＡＴＯＲ　ＭＯＤＥＬ２００旧吏用
）したのぢ、１　６，００　０　ｒ　ｐｍ、２０分間遠
心して上清を除き、沈澱に３０ｍｌの５０ｍＭ′ｒｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ８．０．１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ．０
．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えてよく懸濁して３
０分間室温で放置した。この溶液を１６．０００ｒｐｍ
、２０分間遠心して上清を捨て、そこに再び３０ｍｌの
１゛Ｅで沈澱をよく洗浄し、再び１６．００Ｏ　ｒ　ｐ
　ｍ、２０分間遠心し、沈澱画分を得た。

沈ｌ＃（不溶画分）と上滑（可溶画分）についてＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）を行ったところ、Ｉ　ＰＴＧ添加した場合の不溶画分
に、目的とするポリペプチド産物に期待される分子量の
位置にバンドが認められた。そこで沈澱を４ｍｌのＴＥ
を加えてよく懸濁し“ζから、ＩＯＭ尿素６　ｍ　ｌ及
びＬＭ　　２メルカプトエタノール１０μｌ加え（終濃
度　６Ｍ尿素、１．ｍＭ２−メルカプトエタノール）、
室温で１６時間放置した後、１　２．００　Ｏ　ｒ　ｐ
ｍ、１０分間遠心し、上清を６Ｍ尿素可溶画分として得
た。上滑には約３０■の蛋白が含まれていた。

この溶液を用いてリフォールディング操作を行った。リ
フォールディング溶液の組成は、蛋白濃度が、０　．５
ｍｇ／ｍ　ｌ　，　　２　Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡ，２
０ｍＭ　　Ｔｒ　　ｉ　　ｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８．５
）．　　０．４Ｍアルギニン、４ｍＭ還元型グルタチオ
ン、０．４ｍＭ酸化型グルクチオンである。リフォール
ディングは室温で１６時間行った。リフォールディング
操作後、１２．ＯＯＯｒｐｍ．１０分間遠心し、析出し
てきた沈澱を除いた。上清を回収し、これに７％になる
ように硫安を加え、あらかじめ５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　　ｐＨ８．０，ＩｍＭＥＤＴＡ，ＩＭ尿素、７
％硫安で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ　
（ファルマシア社製）１００ｍｌを用いて、カラムクロ
マトグラフィーを行った。７％硫安濃度に調整したりフ
ォールディング溶液の上清を５０ｍｌ／時間の流速でカ
ラム担体に循環吸着させた後、非吸着成分を除き、開始
緩衝液３００ｍｌで洗浄して、緩衝液中の硫安濃度を２
％に低下させて、溶出してきた画分を集めて回収した。

さらに硫安を含まない緩衝液で溶出を行った。回収した
２％ならびにθ％硫安溶出画分はそれぞれ限外濾過によ
り２　ｍ　ｌ程度まで濃縮し、ミニ力ラムＰＤ−１０（
ファルマシア社製）を用いて硫安を除き、限外濾過セン
トリコン１０　（アミコン社製）を用いて５００μｌに
濃縮した。この操作で得られた最終蛋白量は約１■であ
った。

実施例８ ラミニンボリペプチド断片の同定 ＫＹ　１　４　３　６／ｐＭＬＡＭｎＱ　　（ｎ　＝１
．３，４，５，６，７．１４）の発現産物の不溶画分を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、何れも目的とするポ
リベプチドに期待される分子量の位置にバンドが認めら
れた。

ｐ　Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｍ　ｎ　Ｑによってコードされ、大腸
菌で発現されるポリペプチドを以後Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｍ　ｎ
と呼ぶ。

ＭＬＡＭ５とＭＬＡＭ６の精製産物をＳＤＳＰＡＧＥに
かけたところ銀染色で単一バンドとなった。バンドの位
置から求められる分子量は、それぞれのポリベプチドの
予想分子量（ＭＬＡＭ５　：２２ｋＤａ，ＭＬＡＭ６　
：　２６ｋＤａ）と一致した。ＭＬＡＭ６について、Ｎ
末端アミノ酸配列を決定したところ、２０アミノ酸残基
まで決定でき、予想通りの配列をしている事が示された
。

ＭＬＡＭ５，ＭＬＡＭ６についてアミノ酸組成分析を行
ったところ、実測値と予想値は良い一致を示した。

ＭＬＡＭＩ，ＭＬＡＭ５，ＭＬＡＭ６のＳＤＳＰＡＧＥ
を行った後、常法に従い、ウェスタンプロテイングを行
いペプチドをニトロセルロースフィルターに移行し、つ
いで抗体染色を行った。抗体としてマウスラミニン細胞
結合部位のペプチドに対するウサギボリクローナル抗体
を用いた（Ｊ．Ｇｒａｆ　ｅｔ　ａｌ．，上掲文献〕。

その結果、それぞれの発現産物の位置に特異的な発色が
認められた。

実施例９ ラミニンボリペプチド断片の細胞結合活性精製したＭＬ
ＡＭ５，ＭＬＡＭ６各２０μｇづつをヨードジエン（ピ
アス社製）とエンザイモビーズ（バイオランド社製）を
用いてＩ！Ｓ■　（ヨード）標識を行った。

ＣＨＯ細胞を２４穴マイクロタイタープレートに１穴当
たり５ｘｌＯ’個（ｌｍｌ）入れて、１０％牛胎児血清
を含むＦ１２培地で２日間、３７℃、５％ＣＯｔ気流下
インキユベートした後、培養上清を除去し、Ａ培地（０
．１％牛血清アルブミン、２０ｒｒ＋ＭＨＥＰＥＳ　　
ｐＨ７．３を含むＭＥＭ培地）５００μｌを加え３７℃
、２時間インキユベートした。上清を除去した後、Ａ培
地で希釈したヨード標＠Ｍｌ．ＡＭ５あるいはＭＬＡＭ
６２００μｌを加え、さらに１０分、３０分、６０分間
インキユベートした。上清を除去した後、０．２％牛血
清アルブミンを含むリン酸緩衡液で３回洗浄し、２Ｎ　
　ＮａＯＨ　　３００μｌを加えて、１０分間以上放置
した。この溶液を回収した後リン酸緩衝液で２回洗浄し
、これらの液を合わせて、ガンマーカウンターにより放
射活性を測定した。

標識したサンプルに１００倍量の未標識サンプルを混合
した物についても同様の実験を行った。その結果、第９
図に示す様に何れのポリペプチドもＣＨＯ細胞に結合し
、その結合は未標識サンプルを大過剰添加することによ
って阻害されることが示された。すなわち、両ポリペプ
チドは、細胞に特異的に結合することが示された。

〔発明の効果〕

本発明により得られるヒトラミニンＢ１鎖ポリベプチド
断片は細胞結合活性を有することが示された。従って、
本発明により、癌の転移防止剤、傷治療薬、病原菌の感
染防止薬、細胞培養用細胞増殖因子、ラミニンアノセイ
用試薬、診断薬などの用途が期待ざれるヒ１・ラミニン
Ｂ１鎖ボリベブチド断片を大量に提供することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトラミニンＢｌ鎖の細胞結合ドメインの塩基
配列とアミノ酸配列を示す図、第２図はラミニンの構造
モデルを示す図、第３図はプラスミドｐＨＴＢ１１の制
限酵素切断地図を示す図、 第４図は本発明の実施例のプラスミドｐＭＬＡＭ１の作
製法を示す図、 第５図は本発明の実施例のプラスミドｐＭＬＡＭ５の作
製法を示す図、 ３９一 第６図は本発明の実施例のプラスミドｐＭＬＡＭ６の作
製法を示す図、 第７図は本発明で得られるポリベプチドのＮ末端とＣ末
端のアミノ酸配列並びにそれをコードする塩基配列を示
す図、 第８図は本発明の実施例のブラスミド ｐ　Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｍ　ｎ　Ｑの作製法を示す図、第９図
は本発明で得られるポリベプチドの細胞結合活性を示す
図である。 ８２冒＝２尾Ｎ二３寓Ｈ二Ｒ Ｑ 口り０コ ○ニフ ヒり　　０１ ０にや　イφ１

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトラミニンＢ１鎖の細胞結合部位を含むポリペ
   プチド。
2. （２）第１図のアミノ酸配列の全部あるいは一部を有す
   る請求項１記載のポリペプチド。
3. （３）請求項１ないし２の何れか１項に記載のヒトラミ
   ニンＢ１鎖の細胞結合部位を含むポリペプチドをコード
   するＤＮＡ領域を有し、該ポリペプチドを発現すること
   のできる発現ベクター。
4. （４）ｔａｃプロモーター／オペレーター、メタピロカ
   テカーゼのＳＤ配列及び１ａｑ I ＾ｑ遺伝子を含有す
   る請求項３記載の発現ベクター。
5. （５）ｐＭＬＡＭ１Ｑ、ｐＭＬＡＭ５Ｑ、 ｐＭＬＡＭ６Ｑである請求項４記載の発現ベクター。
6. （６）大腸菌ＫＹ１４３６／ｐＭＬＡＭ１Ｑ、ＫＹ１４
   ３６／ｐＭＬＡＭ５Ｑ、ＫＹ１４３６／ｐＭＬＡＭ６Ｑ
   。