JPH02308798A - 糖転移反応生成物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は食品素材・食品添加物の製造、医薬品・医薬品
中間体の製造、有機合成化合物・有機合成化合物中間体
の製造などに用いられる糖転移反応生成物の製造法に関
する。さらに詳しくは、本発明は酵素反応という温和で
消費エネルギーの少ない方法によってアルコール類、糖
アルコール類、単糖類、オリゴ糖類、カテコールなどの
水酸基を有する種々の物質のガラクトシル誘導体または
均一にβ−１，４結合したガラクトオリゴシル誘導体を
直接かつ選択性よく製造する方法に関する。

［従来の技術およびその課題］ 乳糖などの・β−ガラクトシド結合を加水分解するはた
らきを有する酵素であるβ−ガラトシダーゼ類は、その
起源により多少の効率の相違はあるが、ガラクトースの
転移反応の触媒として用いられることは周知であり、こ
の酵素を利用してオリゴ糖などを製造することに関する
報告や特許は枚挙にいとまがない（バイオケミストリー
（Ｂｌｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ）、　　１５．　１９９４
（Ｉ９７Ｂ）、　　特開昭５８−１９０３８８号公報な
ど）。

しかしながら、β−ガラクトシダーゼ類は、その反応の
本質においてつぎのような欠点を有する。すなわち、 ■ββ−ガラクトシダーゼ類、乳糖のような低分子量の
基質を用いたばあいの反応効率が大きいが、分子量が大
きい多糖類などは該β−ガラクトシダーゼ類の基質とな
りえないか、または基質となりえたとしてもその分解反
応の効率が非常に小さい。したがって、β−ガラクトシ
ダーゼ類を用いては多糖類をガラクトシル洪与体として
転移反応をすることができない。

■β−ガラクトシダーゼ類はいわゆるエキソ型の酵素で
あり、基質の非還元末端からガラクトース単位で加水分
解する。いいかえるとβ−ガラクトシダーゼ類はガラク
トース単位の転移反応の触媒となりうるが、ガラクトー
ス数個を一度に転移するオリゴ糖単位の転移反応の触媒
とはなりえない。その結果、高重合度のガラクトオリゴ
糖をその構造中に含む転移生成物をうるためには、一旦
生じた転移生成物が順次受容体となり、ガラクトース単
位ずつの糖鎖の延長が起こらねばならない。

■既知のβ−ガラクトシダーゼを用いた転移反応のばあ
い、ガラクトース残基は受容体分子の第一級水酸基に結
合する傾向が大きく、その結果、たとえば乳糖にこの酵
素を作用させたばあいの転移生成物の糖鎖間の結合とし
てはβ−１，８結合がもっとも多く生成し、かかるβ−
１，６結合以外にはβ−１，４、β−１，３結合が生成
する（「ジ・エンザイムズ（−Ｔｈｅ　Ｈｎｚｙｒａｅ
ｓ”）　Ｊ　、Ｖｏｌ、７．ビー・ディー・ボーイヤー
（Ｐ、Ｄ、Ｂｏｙｅｒ）編、アカデミツクやプレス（Ａ
ｃａｄｏｌｃ　Ｐｒｅｓｓ）、　＝　ニーヨーク（Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ）、　　１９７２．８１９頁）。したがっ
て、従来のβ−ガラクトシダーゼを用いた方法では、そ
の糖鎖部分が均一にβ−１，４ガラクトシド結合したオ
リゴ糖のみをうろことはできない。前記と同様にして、
たとえばグリセロールを受容体としたばあいには、その
１位（α位）の１級水酸基にガラクトース１残基のみが
結合したものがほぼ優先的に合成される。

従来、植物細胞壁の多糖を加水分解する酵素としてガラ
クタナーゼの研究が行われている。

ガラクタナーゼとしてはエンド型のものがよく知られて
おり、かかるガラクタナーゼは分解される多糖類のガラ
クトシド結合によってつぎの２種類に分類されている。

すなわち、１つはβ−１，４結合したガラクタン主鎖を
分解するエンド１．４−β−Ｄ−ガラクタナーゼであり
、もう１つはβ−１，３結合を有するガラクタン主鎖を
分解するエンド−１，３−β−Ｄ−ガラクタナーゼであ
る。

しかしながら、これらの研究は、基質となる多糖類の構
造の推定、種々の成分の抽出効率や濾過効率の上昇、ペ
クチンの製造などを目的としてなされたものであり（ジ
ャーナル・オブφバイオロジカルｅケミストリー（Ｊ、
Ｂｌｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）、２５１．５９０４　　（Ｉ９７Ｂ）、日
本農芸化学会誌。

４３．８３１　（Ｉ９８９））、酵素の糖転移反応を積
極的に利用して転移生成物をつるということを目的とし
てなされたものではない。

そこで本発明者らは前記従来技術に鑑みてアスペルギル
スーニガ−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｌｇｅｒ）に
属するカビが生産するエンド−１，４−β−Ｄ−ガラク
タナーゼ（以下、単にガラクタナーゼという）に着目し
て鋭意研究を重ねた結果、かかるガラクタナーゼが強い
転移活性を有し、しかもその受容体特異性が広いことを
見出し、本発明を完成するにいたった。

［課題を解決するための手段］ すなわち、本発明はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｃ
ｒＨｌｌｌｕｓ　ｎｌｇｏｒ）が生産するガラクタナー
ゼを触媒として用いることを特徴とする糖転移反応生成
物の製造法に関する。

［作用および実施例］ 本発明で用いられるアスペルギルス拳ニガーが生産する
ガラクタナーゼは、同じβ−ガラクトシド結合を加水分
解する酵素であってもβ−ガラクトシダーゼとはまった
く異なる作用を呈するものである。その特徴としては以
下の２点があげられる。

■前記ガラクタナーゼはアラビノガラクタンのような多
糖類を速やかに分解する性質を有するため、多糖類を基
質として利用することができる。

■前記ガラクタナーゼはいわゆるエンド型酵素であり、
基質である多糖類のガラクトシド結合を、適当な長さで
（ランダムに）分解する。

本発明においては、ガラクタナーゼが前述の特徴を有す
るだけではなく、さらに以下の特徴を育することが本発
明者らによって見出された。

■前記ガラクタナーゼは糖鎖がβ−１，４ガラクトシド
結合のみからなる転移生成物を収率よく生成する。また
、受容体の２級水酸基へ選択的に糖を転移させることが
できる。たとえば、以下の実施例にも示すように、グリ
セロールを受容体としたばあいには、グリセロールの２
位（β位）にガラクトースやガラ、クトオリゴ糖が結合
した転移物のみかえられる。

■前記ガラクタナーゼが受容体とすることができる物質
の桟類、すなわち受容体の特異性は広く、β−ガラクト
シダーゼにまったく劣りをとらない。

したがって、本発明の方法は従来のβ−ガラクトシダー
ゼと呼ばれている一群の酵素を利用して糖転移生成物を
うる方法とはまったく異なり、ガラクタナーゼの新たな
特性を利用して糖転移生成物をうる方法であり、とりわ
け、ガラクトシルまたはβ−１，４結合したガラクトオ
リゴシル誘導体を収率よく製造することができる方法で
ある。

また、ガラクタナーゼは、（イ）ｐＨ３，５〜４．５、
とくに４で強い相対活性を示し、（口Ｈ５℃で２４時間
放置という条件に対するｐＨ安定域は４〜７であり、四
温度４５〜Ｂ５℃、とくに６０℃でもつとも高い活性を
示し、に）５０℃以下の温度で安定であり、またｆｆ４
１１ｇ”、Ｃｕ”、Ｐｅ２＋によって阻害されるが、そ
の他の金属イオンや薬剤に対して安定であるという種々
の理化学的性質を有する。

以下、本発明の方法について、具体的に説明する。

本酵素を用いて転移反応を行なうに際して使用されうる
基質としては、たとえば大豆種子や柑橘類の皮に含まれ
る多糖類などが代表例としてあげられるが、本発明にお
いてはこれら以外にもガラクタンを含有するものであれ
ばいかなるものも基質として使用することができる。ま
たかかる多糖類の純度はとくに高くなくてもよい。なお
、通常はオカラより１０％ＮａＯＨ水溶液で抽出し、た
とえばエタノールなどの溶媒を用いて沈澱させることに
よりえられる大豆アラビノガラクタンを主成分とする多
糖類標品が用いられる。また、本発明においては基質に
はこのような多糖類だけではなく、β−１，４位にガラ
クトシド結合したガラクトオリゴ糖やその含宵物、さら
に０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドなどの人
工、２！質を用いることもできる。

酵素生産菌には、本発明においてはアスペルギルス・ニ
ガーが用いられるが、ガラクタナーゼの生産能を有する
かぎりその変異株を利用することもできる。

受容体原料には、たとえばメタノール、エタノール、エ
チレングリコール、■−プロパツール、１．２−プロパ
ンジオール、■、３−プロパンジオール、グリセロール
、■−ブタノール、１，２−ブタンジオール、１．３−
ブタンジオール、１．４−ブタンジオール、２．３−ブ
タンジオール、メソ−エリスリトール、ジグリセロール
、スチレングリコール、モノアセチン、モノブロビオニ
ン、モノカプロン、モノカプリン、カテコール、Ｄ−リ
ビトール、Ｄ−キシリトール、Ｌ−アラビトール、Ｄ−
グルチトール、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−マンニトール
、ミョーイノシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース
、し−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−ガラクトー
ス、Ｄ−グリコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−クロース、
Ｄ−アロース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−ガ
ラクシロン酸、メチル−β−グリコシド、メチル−β−
ガラクシド、ラクトースなどの通常市販されている純度
（約９５％以上）のものを用いることかできる。

本発明は酵素を触媒とした反応であるから、温和な条件
で反応を行なうことができるのは言うまでもない。すな
わち、ｐＨは４〜５、温度は２０〜５０℃、好ましくは
４０〜５０℃が適当である。

本酵素を用いた転移反応のばあい、反応初期より種々の
重合度の転移生成物が認められるが、これらのうち高重
合度の転移生成物は一旦生じたのち、さらに本酵素によ
り分解され、反応経過とともに順次減少する。その結果
、反応後期には低重合度の転移生成物が多く生成する。

したがって、反応時間、酵素濃度などの条件は反応液中
の転移生成物のガラクトース残基の平均重合度に大きな
影響を及ぼす。すなわち、反応時間は長いほど、また一
定反応時間のばあいには、高い酵素濃度を使用するほど
、えられる転移生成物の平均重合度は小さくなる。

たとえば、反応温度４０℃、ｐＨ４，５の条件下で、酵
素濃度０，５単位／　ｍｌ　、基質濃度１％、受容体濃
度２．５％としたばあい、反応時間３０分間では、一般
式（Ｉ）： （ｕ　　−（Ｇ２　　）ｎ−Ａ　　　　　　　　　　　
（Ｔ）（式中、Ｇｌ　およびＧ２はそれぞれガラクトー
ス残基、Ａは水酸基含有の受容体分子、ｎは０〜ｌＯの
整数を示し、ガラクトース残基どうしの結合はβ−１，
４結合である）において、重合度（ｎ）が３以上である
転移物が約５０％生成し、残りはそれ以下の重合度を有
するものとなる。また、反応時間２時間では、重合度（
ｎ）が０．１および２のものがそれぞれほぼ等量ずつ生
成する。さらに反応時間２０時間では重合度（ｎ）が主
に０および１のものがそれぞれほぼ等量ずつ生成する。

また、使用する受容体が本酵素の活性を阻害しないかぎ
り、受容体濃度が高いほど基質あたりの転移生成物の収
率は大きくなる。一般に受容体濃度５％以上であれば、
転移生成物は薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと
いう）で確認することができる。このばあい、えられる
転移生成物の収量は、使用する受容体の種類によって異
なるのは言うまでもない。また、受容体をある程度以上
添加しても転移生成物の収量（こは顕著な増加は認めら
れなくなる。このばあ０の濃度も受容体によって異なる
が、たとえば比較的受容体としての効率が高いグリセロ
ールのばあい、１５％以上の濃度ではえられる転移生成
物量の増加はほとんどない。

基質濃度は高いほど、一定の酵素および受容体濃度で一
定時間反応させたばあいにえられる転移生成物の平均重
合度は大きく、またそれらの収量も大きい。しかし、使
用する基質あたりの転移生成物の収率としては、低い基
質濃度のばあいとほぼ同じである。一般に、大豆アラビ
ノガラクタンの濃度１％において、一般式（Ｉ）中の重
合度（ｎ）がＯおよび１の転移生成物のみが主に生成す
る本反応の最終段階までに要する時間は、たとえば４０
℃、ｐＨ４，５、酵素濃度０．５単位／　ｍｌの条件下
では、１５時間で充分である。このばあい、受容体が本
酵素の活性を阻害しなｔｌかぎり、受容体濃度の影響は
小さい。

以上、本反応のための条件を述べたが、いろいろな受容
体について目的とするある重合度の転移生成物を収率よ
くうるための最適なこれらの諸条件は、さらにつぎのよ
うな実験により詳細に決定することができる。すなわち
、ＴＬＣまたはＢｉｏ−Ｇｅｔ　Ｐ−２（バイオラド社
製）などを用いたゲル濾過法で種々の条件下でえられた
反応液を分画後、フェノール−硫酸法などを用いて各重
合度の生成物を定量する。

酵素反応は、反応液を沸騰水中で１０〜１５分間加熱す
ることにより完全に停止させることができる。

酵素反応液から目的とする転移生成物を分離するには、
種々の方法を採用することができる。

その−例をあげれば、たとえば活性炭クロマトグラフィ
ーを行ない、目的物をカラムに吸着させ、エタノールな
どの低級アルコールの水溶液で溶出させる方法がある。

なお、反応液に濃度が５０％となるようにたとえば、メ
タノール、エタノール、アセトン、エチルエーテルなど
の宵機溶媒を添加すれば、残存する未反応多糖類は沈澱
物として除くことができる。

また、転移生成物が非還元糖であるばあい、反応液中に
共存する加水分解物である還元糖は、アニリン処理（日
本農芸化学会誌８１，３３９（Ｉ９８７）参照）と活性
炭クロマトグラフィーを併用することによって除去する
ことが可能である。

すなわち、反応液に酢酸アニリンをその１０分の１の口
（重量）程度を加え、８０℃で３時間処理し、還元糖の
みをアニリン誘導体に変える。このアニリン誘導体およ
び残存する酢酸アニリンは、活性炭カラムに強力に吸着
されるため、比較的吸着力の弱い転移生成物とは容易に
分離することができる。また、ＴＬＣにおいて、上記ア
ニリン処理後の液を分析すれば加水分解物である還元糖
はアニリン誘導体となることにより易動度が大きく増大
するので、そうでない転移生成物と容易に識別すること
ができる。

かくしてえられる糖転移反応生成物は一般式（）： ％式％（） （式中、Ｇ１およびＧ２はそれぞれガラクトース残基、
Ａは水酸基含有の受容体分子、ただし、Ｇ１はオリゴ糖
鎖における非還元末端のガラクトース残基、Ｇ２はＧ１
　と受容体分子間に結合するガラクトース残基、またｎ
はＯ−１０の整数を示し、ガラクトース残基どぅしの結
合はβ−■、４結合である）で表されるガラクトシル誘
導体またはガラクトオリゴシル誘導体である。ここで、
反応液中のｎの平均値は前述したようにその反応条件に
よって異なりうる。

以下に製造例および実施例をあげて本発明の方法をさら
に詳細に説明するが、本発明はかがる製造例および実施
例のみに限定されるものではない。

製造例１　〔ガラクタナーゼの生産〕 アスペルギルス・ニガーの保存菌株を麦芽寒天斜面培地
に植え継いだのち、温度２８℃で３日間静置培養した。

つぎに、工業用フスマ１００ｇに水８０ｇを加え、これ
を　１００ｍ１容の三角フラスコ１０本にそれぞれ１８
ｇずつ分注した。これをオートクレーブで温度１２０℃
、１５分間加熱して滅菌したあと、前記の静置培養した
アスペルギルス・ニガーを植菌し、温度２８℃で２〜３
日間静置培養した。

フスマ４ｋｇに水３．２ｋｇを加え、これを７２０ｇず
つ綿布袋に詰め、オートクレーブで温度１２０℃、１５
分間加熱して滅菌した。これを、滅菌処理済のアルミバ
ット（３５Ｘ　５５Ｘ　５ｃ１１）　１（Ｉ枚に無菌的
にまき、前記の培養したアスペルギルス・ニガーをバッ
ト上に無菌的に均一にまいてふたをし、温度２８℃で４
０間静置培養した。

培養後、２０ｇの水で抽出し、遠心分離によって抽出液
をえた。これに３５％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを加え、−晩冷所（Ｉ５℃）で放置後、生じた沈澱物
をン濾過して除き、さらに炉液に８５％飽和となるよう
に硫酸アンモニウムを加え、−晩冷所（Ｉ５℃）で放置
した。生じた沈澱物を濾過によって集め、その沈澱物を
５０ｍＭ　。

酢酸緩衝液（ｐｉｔ　５．５）に溶解し、°遠心分離ま
たはン濾過によって不溶物を除き、粗酵素液をえた。

この粗酵素液をゲルｉ濾過によって脱塩し、５０ｇ１Ｍ
の酢酸緩衝液（ｐＨ１５，５）で平衡化したＤＥＡＨ−
９ｏｐｂａｄｏｘ＾−５０（ファルマシア社製、陰イオ
ン交換体）に吸着させ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５゜
５）で洗浄後、５０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）とＩ
ＭＮａ（Ｊを含んだ５０ａ＋Ｍ酢酸緩衝液の直線勾配法
で溶出した。

つぎに、この活性画分を集め、ポリエチレングリコール
で濃縮後、５０ｍＭＮａＣ＃を含んだ５０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５，５）で平衡化した。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａ
ｃＡ４４のカラムでゲルを濾過を行ない、活性画分を回
収した。

これを５ＩＩＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で透析後（５
℃、−晩）、５１１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で平
衡化したアフィ÷ティーカラム（担体はＥｐｏｘｙ−Ａ
ｃｔｌｖａｔｏｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ−リガン
ドはアラビノース）に吸着させ、ｌｏｍＭの酢酸緩衝液
（ｐＨ５，５）と１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ１５，
５）との直線勾配法で溶出し、精製酵素をえた。

実施例１ 大豆アラビノガラクタン２％、第１表に示した濃度の種
々の化合物、製造例１でえられた精製ガラクタナーゼ（
２，５単位）を含む２００μ史の５０５Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ４，５）を４０℃で１５時間保温した。この反応液
を直接またはアニリン処理したのち、ＴＬＣで分析した
。このようにしてえられたクロマトグラムを受容体を添
加しない対照のものと比較し転移物の有無を確認した。

その結果を第１表に示す。

この結果、本酵素は、種々の一級アルコール類、ジオー
ル類、グリセロールやその誘導体、糖類、糖アルコール
類およびカテコールなどを受容体としうる広い受容体特
異性を有していることが明らかとなった。しかし、調べ
た物質の範囲内では、２−プロパツール、２−ブタノー
ル、モノラウリンおよびフラクトースは受容体となりえ
なかった。

実施例２ 大豆アラビノガラクタン０．８ｇおよびグリセロール５
ｇを含む１００ｍ１の５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ＋４．
５）に製造例１でえられた精製ガラクタナーゼ２０単位
を加えて４０℃で４８時間反応させた。残留する未反応
多糖類はエタノール２００　ｍｌを加えることにより沈
澱物として回収し、除去した。上清をさらに１００　ｍ
ｌに減圧濃縮したのち、転移生成物の単離を容易にする
ために、酢酸アニリン１０ｇを加えて８０℃で３時間加
熱し、共存するガラクトースなどの還元糖をアニリン誘
導体に変換した。この液をＴＬＣで分析したところ、最
終的に蓄積すると考えられる２種類の転移生成物が認め
られた。そこで前記アニリン処理液から活性炭クロマト
グラフィーでこれら２Ｐ］ｉ類の転移生成物（Ａおよび
Ｂ）を単離した。生成物ＡおよびＢの収量はそれぞれ１
５１Ｂと１２９ｍｇであり、用いたアラビノガラクタン
に対する収率は生成物ＡとＢをあオ〕せて約３４％であ
った。

これらの生成物は、β−ガラクトシダーゼにより完全に
加水分解され、生成物Ａではガラクトースとグリセロー
ルが等モルで、また生成物Ｂではグリセロール１モルに
対してガラクトース２モルの割合で検出された。さらに
＋３０−核磁気共鳴スペクトルで内部標準としてアセト
ン（δ３１．４ｐｐｍ）を用い、これらの生成物を同定
した。その結果、生成物Ａでは８２．０Ｂ　、　６２．
１７．８２．７１　、８９．７Ｇ　、７２゜１４．７３
．８２．７８．２６、Ｈ，０５、１０３，８１ｐｐｍｌ
ご共鳴線が認められた。とくに８２．Ｏ５ｐｐｍの共鳴
線により、化合物Ａはガラクトース残基がグリセロール
の２位に転移した２−ガラクトピラノシルグリセロール
であることを確認した。化合物ＢではＢ１．８０　、Ｂ
２．０７、Ｂ２．７１．１３９．８２．７２．８４．７
３．９９．７４．３１．７５．５１　、７６．２６．７
８．３２．８２．ＯＬ　、　　１０３．８２．１０５．
４１ｐｐｍに共鳴線が認められた。８２．０１ｐｐａ＋
の共鳴線によりこの化合物は、グリセロールの２位に転
移した化合物であることを確認した。またβ−ガラクト
シダーゼにより完全に分解されることおよび７８ｙ３２
ｐｐｍの共鳴線１とよりガラクト−ス残基間の結合はβ
−１，４結合であることが確認された。

これらの結果から、化合物Ｂは２−β−ガラクトビオシ
ルグリセロールであることが確認された。

実施例３ 大豆アラビノガラクタン１．Ｏｇおよび乳糖２．５ｇを
含む１００ｍ１の５０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）に
、製造例１でえられた精製ガラクタナーゼ２０単位を加
え、４０℃で１０時間反応させた。残留する未反応多糖
をエタノール２００　ｍｌを加えることにより沈澱物を
回収して除去し、上清を３０ｍ１に減圧濃縮した。これ
を活性炭カラム（Ｉ５ｃｍφ×５０ｃ＋ｎ）にかけ、水
１ｇおよび５％エタノール５００ｍ１で順次カラムを洗
浄したのち、５〜４０％の範囲でエタノール濃度を直線
的に上昇させ、オリゴ糖を分画した。これらのうち、主
転移生成物の両分を集め、さらにペーパークロマトグラ
フィーで単離し、転移生成物ＣＩ２４ｍｇをえた。

転移生成物Ｃを常法にしたがってメチル化分析を行なっ
たところ、２．３．８−トリメチル−グリコース、２．
３．６−ドリメチルーガラクトースおよび２．３，４．
８−テトラメチルガラクトースが約１：１１の割合（重
量比）で検出された。またこの化合物は、β−ガラクト
シダーゼにより完全に分解され、ガラクトースとグルコ
ースが２：１の割合（重量比）で生じた。これらの結果
から、転移生成物Ｃは４−β−ガラクトシル１．４−ラ
クトースであることが確認された。

実施例４ 大豆アラビノガラククン　１．Ｏｆ、Ｄ−フコース２．
５ｇを含む１００ｍ１の５０ａＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
５）に、製造例１でえられた精製ガラクタナーゼ２０単
位を加え、４０°Ｃで１０時間反応させた。残留する未
反応多糖類をエタノール２００　ｍｌに加えることによ
り沈澱物を回収して除去し、上清を３０ｍ１に減圧濃縮
した。これを活性炭カラム（Ｉ５国φＸ５０ｃａ＋）に
かけ、水ＩＮおよび５％エタノール５００　ｍｌで順次
カラムを洗浄したのち、５〜５０％の範囲でエタノール
濃度を直線的に上昇させ、オリゴ糖を分画した。２Ｆ！
類の転移生成物の画分を集め、それぞれベーパークロマ
トグラフィでさらに精製し、転移生成物０１０３ＩＩｇ
およびＥ４０ｏ＋ｇをえた。えられた転移生成物りおよ
びＥはともにβ−ガラクトシダーゼで完全に分解され、
ｉ！！離されるガラクトースとフコースの量は、それぞ
れ約１：１および２：１であった。また、常法によりメ
チル化を行ない、ガスクロマトグラフィー（カラム：　
ＥＣＮ５５−ＭガスクロームＱ（ガスクロ工業■製）　
（２ｍ＋）　：温度１８０℃）を用いて各構成メチル化
糖を定量したところ、転移生成物りでは２，３，４．６
−テトラメチルガラクトースと２．３−ジメチルフコー
スが約１：１の比で、また転移生成物Ｅでは２，３．４
．６−テトラメチルガラクトース、　２，３．６−ドリ
メチルガラクトースおよび２．３−ジメチルフコースが
約１：１：１の割合（モル比）で検出された。

これらの結果から、前記転移生成物りおよびＥは、それ
ぞれ含まれる結合がすべてβ−１，４ガラクトシド結合
であるガラクトシルフコースおよびガラクトビオシルフ
コースであることが確認された。

比較例１ 大豆アラビノガラクタン０．８ｇ、グリセロール５ｇお
よび塩化マグネシウム　０．０４５ｉを含む１００ｍ１
の５０ｍＭ（ｐＨ７，０）リン酸緩衝液に、それぞれエ
シェリヒア争コリ（Ｅｓｃｈｅｒｔｃｈｌａ　ｃｏｉｌ
）、サツカロミセスφフラギリス＜Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃａｓｆｒａｇ！Ｉｔｓ）、牛の肝臓に由来のβ−ガ
ラクトシダー・ゼ（いずれもシグマ薬品■製）６０単位
を加えて４０℃で５０時間反応させた。そののち、各反
応液をＴＬＣで分析したが、ガラクトースなどの加水分
解反応生成物もグリセロールへの転移生成物もまったく
検出されなかった。

比較例２ ０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．
８０２ｇ　、グリセロール６．０「および塩化マグネシ
ウム０．０９５ｇを含む２００ｍ１の５０ｍＭ（ｐｉｔ
７．３）リン酸緩衝液に前記エシェリヒア・コリに由来
のβ−ガラクトシダーゼ１２０単位を加え、４０℃で３
０分間反応させたのち、１０分間煮沸して酵素を失活さ
せた。つぎに反応液に酢酸アニリン２０ｆを加え、８０
℃で３時間加熱し、反応液中のガラクトースなどの還元
糖をアニリン誘導体とした。これを、ＴＬＣを用いて分
析したところ、実施例１と異なり、ただ１種類の転移生
成物のスポットしか観察されなかった。そこで実施例１
と同様に活性炭カラムクロマトグラフィーを行ない、こ
の転移生成物Ｆ　５０２Ｂを単離した。

この生成物Ｆを実施例１と同様に１３　Ｃ−核磁気共鳴
スペクトルを用いて同定した。その結果、８２．０６．
６３．４７．８９．７０　、７１．５４．７１．８１．
７３．７Ｂ　、７６．２０．１０４．１０ｐｐｍに共鳴
線が認められた。しかしながら、実施例１で観測された
８２、Ｏ５ｐｐｍの共鳴線は存在せず、７１５４ｐｐａ
ｌこグリセロールの２位炭素に起因する共鳴線が観察さ
れ、化合物が１位にガラクトースが転移した１−ガラク
トシルグリセロールであることを確認した。さらに前記
転移生成物Ｆは、β−ガラクトシダーゼで完全に水解さ
れるこ、とから、結合はβ−ガラクトシド結合であるこ
とが確認された。

［発明の効果］ 本発明の製造法には基質として多糖類を利用することが
でき、しかもえられる化合物は高重合度の糖鎖を存する
β−１，４結合したガラクトース糖鎖の転移生成物であ
り、グリセロールを受容体としたばあいにえられるβ−
ガラクトシダーゼと異なる水酸基に特異的に糖を結合す
ることができるなど、従来の方法にはない特性を呈する
。したがって、本発明の製造法によれば、新規な構造を
有する化合物や、新しい生理活性を発現する可能性のあ
る化合物を合成することができ、また水酸基を特異的に
保護しうるなどの効果が奏される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
   ｎｉｇｅｒ）が生産するガラクタナーゼを触媒として用
   いることを特徴とする糖転移反応生成物の製造法。 ２　糖転移反応生成物が一般式（ I ）： Ｇ＿１−（Ｇ＿２）ｎ−Ａ（ I ） （式中、Ｇ＿１およびＧ＿２はそれぞれガラクトース残
   基、Ａは水酸基含有の受容体分子、ｎは０〜１０の整数
   を示し、ガラクトース残基どうしの結合はβ−１，４結
   合である）で表されるガラクトシル誘導体またはガラク
   トオリゴシル誘導体である請求項１記載の糖転移反応生
   成物の製造法。