JPH0236354A - 紛末状非特異的吸着防止剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は医薬分野等において免疫学的測定に用いられる
粉末状の非特異的吸着防止剤の製造方法に関するもので
ある。

（従来の技術） 近年、臨床検査、免疫学、生化学、分子生物学等の分野
において・酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫
測定法（ＲＩＡ）、或いはウェスタンブロッティング法
等の免疫学的手法が多用されるようになった。

これらの測定においては、プレートやニトロセルロース
膜のような固相に目的物質を固定し、次いでそれらの物
質と特異的に結合するアイソ）−プ又は酵素標識抗体（
ブローベ）を加え、放射線レベルや酵素活性を測定する
ことによって、目的物質を固定したり、定量したりする
。この時、プローベが目的物質とのみ反応することが重
要であり、固相に非特異的に吸着してはならない。

そのため、固相に目的物質を固定化した後に、ブロッキ
ング剤（非特異的吸着防止剤）を添加し、固相上の吸着
点を封鎖しなければならない。例えばＥＬＩＳＡにおい
ては、抗原をプレートに固定化した後にブロッキング剤
を添加し、その後にブローベを加える。ブロッキング剤
は抗原に特異的でない抗体がプレートに吸着したり、プ
ローへがプレートに非特異的に吸着するのを防ぐ働きを
している。

通常、ブロッキング剤として生血清アルブミン（ｓｓＡ
）ｉ８Ｍが用いられている。一般にはＢＳＡを１％以上
の濃度に、非特異的吸着を完全に防止するには２％以上
、好ましくは５％程度の濃度に）容解して用いなければ
ならない。ＢＳＡは比較的大量に入手し得る蛋白質では
あるが、溶解に時間がかかること、さらには価格が高い
こと等の理由で、分析コストを引き上げる要因の一つに
なっている。

しかし、理論的には目的物質やブローベとの相互作用が
なく、しかも固相によく吸着する物質であれば、どのよ
うな物質でもブロッキング剤となり得る訳であり、より
安価でかつ優れたブロッキング剤の開発が望まれていた
。

１９８４年ジョンソンらはサザンブロッティング法にお
いて、ＢＳＡのかわりに脱脂粉乳（ＳＭＰ）が有効であ
り、また、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいても５％ＳＭＰ溶液が
効果的にプロフキング作用をすることを報告した（ジー
ン・アナリティカル・テクノロジー；Ｇｅｎｅ　Ａｎａ
ｌ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、上、　３−８．１９８４）。

また、ミスキミンズらも５％ＳＭＰ溶液が有効なブロッ
キング剤となることを示しており（プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス：　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８
２゜６７４１〜６７４４．１９８５）　、さらに、太田
も発現へフタ−λｇｔｌｌを用いたクローニング法の紹
介の中でＳＭＰの有効性を述べている（細胞工学、５，
２６４〜２７０．１９８６）。

このような背景の中で乳蛋白質を有効成分とし、有機酸
および有機酸塩から選ばれる１種以上を主成分とする緩
衝液とを組合せた液状の滅菌非特異的吸着防止剤が開発
された（特願昭６３−４２１５４号）。

本孔は極めて優れた非特異的吸着防止効果を持っている
上に、原液のまま、或いは脱イオン水で適当に希釈する
だけで直ちに使用できるという簡便さがあり、しかも開
封しなければ長期に保存できる利点もある。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、液状の非特異的吸着防止剤は開封後はで
きるだけ早く使用するか、凍結保存をしなければならな
いこと、更に輸送にコストがかかるという欠点もある。

そこで、粉末状で、脱イオン水に所定量を溶解するだけ
で使用できる非特異的吸着防止剤が望まれてきた。

粉末状の非特異的吸着防止剤を製造する最も簡便な方法
は、粉末状の原料を粉−粉混合すればよい訳だが、この
場合には緩衝剤は容易に冷水に溶解するものの、乳蛋白
質の溶解性が悪い。一方、液状にした非特異的吸着防止
剤を濃縮した後に乾燥する方法では、ある濃縮度に達す
ると沈澱が生成してしまうことが判明した。

本発明は冷水に容易に溶解し、かつ非特異的吸着防止効
果も極めて優れ、前述の液状滅菌非特異的吸着防止剤と
同等の粉末状非特異的吸着防止剤の製造方法を提供する
ことを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は安価な、さらには液状滅菌非特異的吸着防止剤
と同等の非特異的吸着防止効果を有する粉末状非特異的
吸着防止剤の製造方法に関するものであって、１０〜４
０％となるように乳蛋白質を有効成分とする乳原料を、
０．１〜０．３モルの有機酸および有機酸塩から選ばれ
る１種以上を主成分とする緩衝液に溶解したものと、有
機酸および有機酸塩から選ばれる１種以上を主成分とす
る緩衝液とを別々に粉末状に乾燥し、混合することを特
徴とする。

本発明で用いる乳蛋白質はカゼイン、ホエー蛋白質濃縮
物（ＷＰＣ）、脱脂粉乳、或いは脱脂乳のうち１種類、
或いは２種類以上組合せて用いることができる。ＷＰＣ
を配合する場合は、乳固型分中、５０％以下とすること
が望ましい。５０％以上配合すると、加熱処理後に沈澱
を生じる場合がある。また、これらの乳蛋白質はプロテ
アーゼで限定分解をして用いてもよいが、分解度が高す
ぎると滅菌時に不安定となるので、部分加水分解にとど
めるべきである。

本発明で用いる緩衝液は、例えばクエン酸、マレイン酸
、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸等の有機酸および有機
酸塩から選ばれる１種以上を主成分とする。

ｐ　Ｈの調整は、例えばアルカリ溶液、例えば水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム等で行うか、酸溶液、例えば
塩酸、硫酸、酢酸等で行うか、あるいは上記の有機酸と
その塩基との組合せのうち１種又は２種以上を組み合わ
せて行うことができる。

乳蛋白質を主成分とする原料を溶解する緩衝液における
有機酸又は有機酸塩の濃度は０．１〜０．３モルの範囲
である。０．１モルより低い場合には、乳蛋白質成分が
冷水に溶解しにくくなり、０．３モルより高い場合には
沈澱が生成する。

緩衝液のｐＨは５．３〜７．０であることが好ましい。

ｐＨは、５．３以下では有効成分が溶解しにくいため、
５．３以上、特に好ましくは５．５以上に調整する。ｐ
Ｈの上限は７．０が好ましく、特に好ましくは６．５以
下である。ｐＨが７を超えると、前記有機酸の緩衝能力
がなくなる。

この緩衝液に溶解する乳蛋白質を主成分とする原料は固
形分換算で１０〜４０％濃度となるように調整する。、
１０％以下では乾燥効率が悪＜、４０％を超えると溶解
しにく（なる。特に好ましくは２０〜３０％である。

乾燥は凍結乾燥や噴霧乾燥等で行うことができ特に限定
されるものではないが、製造コストを考慮するならば、
噴霧乾燥が望ましい。乾燥条件も特に限定はされず、通
常の条件、例えば送風温度１８０°Ｃ、ノズルでの出口
温度９６℃で行えばよい。

この乾燥粉末（この粉末をＡ粉とする）そのものを、乳
蛋白質成分０．１％以上の濃度となるように脱イオン水
に溶解したものは、極めて優れた非特異的吸着防止効果
を示す。しかし、酵素結合免疫測定法（ＥＬｒＳＡ）に
おいて、表１に示すように酵素−基質反応による発色が
有意に抑制されることがわかった。これは有機酸又は、
有機酸塩の４度が低いためである。不足する有機酸およ
び有機酸塩から選ばれる１種以上を主成分とする粉末は
別に調製しなければならない（この粉末をＢ粉とする）
。有機酸および有機酸塩を所定のｐ　Ｈとなるように組
み合わせても良いし、有機酸と強塩基とを所定のｐＨと
なるように組合せても良い。

Ａ粉およびＢ粉を混合後０．１〜１０％となるように、
水に溶解したときｐＨは前述したようにｐＨ５，３〜７
．０である。

前記したＡ粉およびＢ粉の混合比は、Ａ粉とＢ粉の混合
物を水に溶解した時、以下の式で限定される。

乳固形分濃度（％）／有機酸換算濃度（ｍＭ）≦０．１
（但し、有機酸換算濃度≦５００ｍＭ）。

尚、Ｂ粉には増量剤として乳糖、でん粉、食塩等を混合
しても良い。

また、Ａ粉およびＢ粉を混合後、所定濃度に水に溶解し
た後に、殺菌或いは滅菌処理しても何ら問題はない。

（発明の効果） 本発明によると、従来から使用されているＢＳＡにかえ
て、透明感があり、かつ安価な非特異的吸着防止剤を提
供することができる。しかも、免疫学的測定において極
めてすぐれたブロッキング効果を得ることができる。さ
らに、常温で流通することが可能であり、冷水に容易に
溶解でき、取り扱いが簡便であると言う利点を有する。

（実施例） 以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。

実施例１ ０．２モルのマレイン酸−水酸化ナトリウム（ｐＨ６，
１）１０６に１５％となるようにナトリウムカゼイネー
トを溶解後、送風温度１６０℃、ノズル出口温度９０゛
Ｃにて噴霧乾燥し、１．２ｋｇのむ）末を得た。別にマ
レイン酸と水酸化ナトリウムを重量比で５：３に混合し
、粉砕した。前者の粉を１．１５ｋｓｒ、後者の粉を１
．６　ｋｇ混合し、粉末状非特異的吸着防止剤を調合し
た。

実施例２ 無水クエン酸３８４ｇと２５％水酸化ナトリウム溶液７
１８ｍ１を水ｉｏ！！に溶解した。ｐＨは６．２であっ
た。

この液に脱脂粉乳を２　ｋｇ溶解し、送風温度１８０℃
、ノズル出口温度９５℃にて噴霧乾燥し、２　ｋｇの粉
末を得た。別に、無水クエン酸５７．５ｇ、クエン酸ナ
トリウム（２水物）　１．２３５　ｋｇ、食塩６７ｇを
混合した。前者の粉を５１２．４ｇ、後者の粉を１．０
９ｋｇ混合し、粉末状非特異的吸着防止剤を調合した。

実施例３ ＥＬＩＳ工酊Δ夾施 ０．０５モル炭酸水素ナトリウムで１　、０００倍に希
釈した抗ヒトにおよび抗ヒトλＩｇＧ　（タボ社製）混
合液５０μｌを９６穴ＥＬ　Ｉ　ＳＡ用プレート　（イ
ミュロン４）に分注し、４℃にて一晩静置した。翌朝、
抗体溶液を捨て非特異的吸着防止剤で各ウェルを満たし
１時間放置した。洗浄用非特異的吸着防止液で２回洗浄
後、０〜１１０００ｎ　／　ｍｌのヒト血清１ｇＧ（ミ
ドリ十字社製）５０μ！を加え、１時間静置した。

６回洗浄後、ＡＢＴＳ　（２，２’　　−アジノビスー
（３−エチルベンゾチオアブリン−６−スルホン酸）を
加え、４０５ｎＩ１１における吸光度を測定した。

プレートのブロッキングには以下のものを使用した。

■　脱イオン水で４倍に希釈したブロックエース（大日
本製薬）、ｐＨ６，４゜ ■　実施例１で調合した粉末０．７ｇを１００ｍｊ！の
脱イオン水に溶解したもの、ｐＨ６，２゜ ■　実施例２で調合した粉末１ｇを１００＋＋＋ｊ！の
脱イオン水に溶解したもの、ｐＨ６，３゜ ■　０．１５モル食塩含有リン酸緩衝液、ｐＨ７，２、
リン酸綴衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）にＢＳＡを１％となるよう
に溶解したもの。

試料の希釈には以下のものを使用した。

■　脱イオン水で１０倍に希釈したブロックエース。

■　実施例１で調合した粉末０．３ｇを１００．ｄの脱
イオン水に７容解したもの。

■　実施例２で調合した粉末０．４ｇを１００−の脱イ
オン水に溶解したもの。

■　０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ プレートの洗浄には以下のものを使用した。

■　脱イオン水で１０倍に希釈したブロックエースにＴ
ｗｅｅｎ２０を０．０２％含有させたもの。

■　実施例１で調合した粉末０．３ｇを１００−の脱イ
オン水に溶解し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０２％含有させ
たもの。

■　実施例２で調合しまた粉末０．４ｇを１００−の脱
イオン水に溶解し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０２％含有さ
せたもの。

■　ＰＢＳにＴｗｅｅｎ２０を０．０２％含有させたも
の。

結果を第１図に示す。ＢＳＡを用いた場合には特に低濃
度側において吸光度が高くなっており、非特異的吸着を
抑制しきれていないが、実施例１および２で調合した粉
末を溶解した場合には、液状のブロックエースと同等の
ブロッキング効果を示した。

表１６ ＥＬ　Ｉ　ＳＡの吸光度に及ぼす有機酸濃度の影響有機
酸濃度　　　　　　　　　ＯＤ４０５ｎｍＡ　　　　　
　　　　　　０．１９±０．０１Ｂ　　　　　　　　　
　　０．５８±０．０１Ａ、実施例２において噴霧乾燥
された脱脂粉乳−クエン酸−水酸化ナトリウムからなる
粉末を脱脂粉乳濃度０．４％となるように溶解したちの
くクエン酸４ミリモル）でブロッキングし、０．１％と
なるように溶解したもの（クエン酸１ミリモル）で試料
（ヒトＩｇ　Ｇ　１１００ｎ／　ｍｌ、パーオキシダー
セ結合抗ヒトＩｇＧ抗体）の希釈を行った。

Ｂ、実施例２において調合された粉末、ブロッキングを
脱脂粉乳０．４％となるように溶解したもの（クエン酸
４０ミリモル）、試料の希釈は０．１％となるように溶
解したもの（クエン酸１０ミリモル）で行った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３におけるヒト１ｇＧ濃度と吸光度と
の関係を示すグラフであり、プレートのブロッキング条
件、試料の希釈条件およびプレートの洗浄条件が■の場
合は○印、■の場合は△印、■の場合は目印、■の場合
はＸ印を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、乳蛋白質を有効成分とし、有機酸および有機酸塩か
   ら選ばれる１種以上を主成分とする緩衝剤とを組合せた
   粉末状非特異的吸着防止剤を製造するに際し、１０〜４
   ０％となるように乳蛋白質を有効成分とする乳原料を０
   ．１〜０．３モルの有機酸および有機酸塩から選ばれる
   １種以上を主成分とする緩衝液に溶解したもの（Ａ）、
   および、有機酸および有機酸塩から選ばれる１種以上を
   主成分とする緩衝液（Ｂ）とを別々に粉末状に乾燥し、
   Ａ粉およびＢ粉を混合することを特徴とする粉末状非特
   異的吸着防止剤の製造方法。 ２、Ａ粉およびＢ粉を混合後０．１〜１０％となるよう
   に、水に溶解したときのｐＨが５．３〜７．０である請
   求項１記載の製造方法。 ３、Ａ粉とＢ粉の混合比が水に溶解した時、式：乳固形
   分濃度（％）／有機酸換算濃度（ｍＭ）≦０．１（但し
   、有機酸換算濃度≦５００ｍＭ）に従うことを特徴とす
   る請求項１記載の製造方法。