JPH02450A - 抗原性蛋白質の製法 - Google Patents
抗原性蛋白質の製法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＤＮＡ運搬仲介物とそれにより形質−に特徴付
けられた疾病であった。１９６７年にプルムベルグおよ
び共同研究者はまず肝炎Ｂ型による感染と結合した抗原
を記載した。
けられた疾病であった。１９６７年にプルムベルグおよ
び共同研究者はまず肝炎Ｂ型による感染と結合した抗原
を記載した。
〔プルムベルグ、Ｂ、Ｓ、サイエンス、第１９７巻第１
７頁（１９７７年）参照〕その時以来広範囲な研究が疾
病について豊富な資料を寄与してきている。作因物質は
、肝炎Ｂウィルス（ｒｒｎｒ）として知られているＤＮ
Ａウィルスである。感染した患者の血清は感染と結合す
る穏々の粒子型を含有する。全ウィルス粒子は実質的に
エンベロブ、核およびＤＮＡからなる球形のそして直径
４２３ｍであると考えられ発見者によって１デインＩ粒
子と称される〔デイン（Ｄａｎｇ）、Ｄ、 ５．等、ラ
ンセット１９７０−１、第６９５頁（１９７０年）〕。
７頁（１９７７年）参照〕その時以来広範囲な研究が疾
病について豊富な資料を寄与してきている。作因物質は
、肝炎Ｂウィルス（ｒｒｎｒ）として知られているＤＮ
Ａウィルスである。感染した患者の血清は感染と結合す
る穏々の粒子型を含有する。全ウィルス粒子は実質的に
エンベロブ、核およびＤＮＡからなる球形のそして直径
４２３ｍであると考えられ発見者によって１デインＩ粒
子と称される〔デイン（Ｄａｎｇ）、Ｄ、 ５．等、ラ
ンセット１９７０−１、第６９５頁（１９７０年）〕。
エンベロブはプルムベルグによって発見された表面抗原
（ＨＢｐＡり）を含有する。核は免疫学的に異なる抗原
、ＩＩＥｃＡｙ を含有する。デイン粒子から分離さ
れるｒ）ＨＡは円形で長さが様々の単一成分領域を含有
する、サマー１、等、Ｐｒａｅ、 Ｈａｔ、 Ａｅａｄ
、 Ｓｅｉ ＵＳＡ ７２ ％ 第４５９７頁（１９７
５年）、ランダース、Ｔ、 Ａ、等、／、 ｗｉｒａｌ
、第２３巻、第３６８頁（１９７７年）、フリツシュ、
Ａｏ等、Ｃ０凡ＡｃａｔＬ、 Ｓｅｉ、パリスＤ２８７
、第１４５３頁（１９７８年）。表面抗原はｇＢＶで感
染し九人の血清中をてそして一定の担体の状態に見出さ
れる。放射線免疫検定はＨＢｚＡｙ、リング、Ｃ，Ｍ、
等、７． Ｉｔｓｍａｎｅｌ、第１０９巻、第８３４頁
（１９７２年）としてそして抗−ＨＢｚＡｙ、ホリンガ
ー Ｆ、等、／、 ＩｍｍｔＬｎｅ １．第１０７巻、
第１０９９頁（１９７１年）として展開している。
（ＨＢｐＡり）を含有する。核は免疫学的に異なる抗原
、ＩＩＥｃＡｙ を含有する。デイン粒子から分離さ
れるｒ）ＨＡは円形で長さが様々の単一成分領域を含有
する、サマー１、等、Ｐｒａｅ、 Ｈａｔ、 Ａｅａｄ
、 Ｓｅｉ ＵＳＡ ７２ ％ 第４５９７頁（１９７
５年）、ランダース、Ｔ、 Ａ、等、／、 ｗｉｒａｌ
、第２３巻、第３６８頁（１９７７年）、フリツシュ、
Ａｏ等、Ｃ０凡ＡｃａｔＬ、 Ｓｅｉ、パリスＤ２８７
、第１４５３頁（１９７８年）。表面抗原はｇＢＶで感
染し九人の血清中をてそして一定の担体の状態に見出さ
れる。放射線免疫検定はＨＢｚＡｙ、リング、Ｃ，Ｍ、
等、７． Ｉｔｓｍａｎｅｌ、第１０９巻、第８３４頁
（１９７２年）としてそして抗−ＨＢｚＡｙ、ホリンガ
ー Ｆ、等、／、 ＩｍｍｔＬｎｅ １．第１０７巻、
第１０９９頁（１９７１年）として展開している。
ＨＢｚＡｙ は免疫化学的にウィルスのエンペロブと結
合する物質をはっきりと示す°。以前の研究はＨＢｚＡ
りが大多数の成分としてグリコジル化およびグリコジル
化していない蛋白質を包含する様々な抗原性のいくつか
の成分を含有することを示している（ビーターラン、Ｄ
、Ｌ、等、Ｐｒｅｃ、Ｈａｔ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ
ｋ Ａ ７４、舘１５３０頁（１９７７年）、ビータ
ーラン、Ｄ、Ｌｏ等 ウィルス性肝炎［ｂける病因学、
疫学、発病学および予防の現代評価（Ｇ、 Ｎ、ヴイア
ス、Ｓ、Ｎ、 ：１−エンおよびＲ，シュミット、ａｄ
ｚ、）第５６９・−５７３頁、フランクリンインステイ
チュートプレス、フイラデルフイ７．１９７８年）。ざ
らに脂質およびいくつかの追加の蛋白質成分は表面抗原
標本中に存在するととカー報告されている。 Ｓｋｉ
、ＪＩｉ’、Ｋ。
合する物質をはっきりと示す°。以前の研究はＨＢｚＡ
りが大多数の成分としてグリコジル化およびグリコジル
化していない蛋白質を包含する様々な抗原性のいくつか
の成分を含有することを示している（ビーターラン、Ｄ
、Ｌ、等、Ｐｒｅｃ、Ｈａｔ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ
ｋ Ａ ７４、舘１５３０頁（１９７７年）、ビータ
ーラン、Ｄ、Ｌｏ等 ウィルス性肝炎［ｂける病因学、
疫学、発病学および予防の現代評価（Ｇ、 Ｎ、ヴイア
ス、Ｓ、Ｎ、 ：１−エンおよびＲ，シュミット、ａｄ
ｚ、）第５６９・−５７３頁、フランクリンインステイ
チュートプレス、フイラデルフイ７．１９７８年）。ざ
らに脂質およびいくつかの追加の蛋白質成分は表面抗原
標本中に存在するととカー報告されている。 Ｓｋｉ
、ＪＩｉ’、Ｋ。
およびゲリン、／、 Ｌ、 ／、 ｖｉｔａｌ、第２１
巻、第３４７頁（１９７７年）。多数の蛋白質成分は各
々ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動、ビ
ーターラン等（１９７７年）上記に基づくグリコジル化
していないおよびグリフシル蛋白質として分子−１ＣＭ
、Ｗ’、）２２．０００および２８．０００ダルトンを
有するとして報告されていた。標本のＳＤＳゲル電気泳
動によってＦＩＢｐｌｙのヒトの担体の血漿から分離さ
れる２ ２．ｏ ｏ ｏ ｙ、ｒｒ、蛋白質のＮ−末端
配列の９アミノ酸はＭａｔ−ＧムーＡｐｎ−Ｉｔａ−Ｔ
ｈｒ−（Ｓａｒ） ｉたは（ＣｙＩ）−Ｇｌｙｏ−Ｐｅ
ａ −Ｌａｕであると報告されていた（上記ビーターラ
ン等、１９７７年）。
巻、第３４７頁（１９７７年）。多数の蛋白質成分は各
々ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動、ビ
ーターラン等（１９７７年）上記に基づくグリコジル化
していないおよびグリフシル蛋白質として分子−１ＣＭ
、Ｗ’、）２２．０００および２８．０００ダルトンを
有するとして報告されていた。標本のＳＤＳゲル電気泳
動によってＦＩＢｐｌｙのヒトの担体の血漿から分離さ
れる２ ２．ｏ ｏ ｏ ｙ、ｒｒ、蛋白質のＮ−末端
配列の９アミノ酸はＭａｔ−ＧムーＡｐｎ−Ｉｔａ−Ｔ
ｈｒ−（Ｓａｒ） ｉたは（ＣｙＩ）−Ｇｌｙｏ−Ｐｅ
ａ −Ｌａｕであると報告されていた（上記ビーターラ
ン等、１９７７年）。
（以下余白）
アミノ酸配列を示す葆準の省略がここで用いられる。
Ａｌａ クアラニシ Ｃｙｚ −シス
ティンａｔｙ−グリシン Ｈｈｌｌ１１ヒス
チジンＧムーグルタミン酸 Ｌｙｅ −リジン
ＧＬｎ−グルタミン Ｌａｕ 瞠ロイシン
Ａｓｐ ＝アスパラギン酸 Ｉｔｍ −インロイ
シンＡｐｔｓ悶アスパラギン ＶａＬ −バリ
ンＡｒｙ−フルギニン ＭまたはＭ ａ ｔ−メチ
オニンＳ−τ瞑セ盲ノン ７” ｙ ｒ
露チロシン？’Ａｒ−スレオニン ＰＡａ
−フェニルアラニンＴｒｐ ＝ トリプトファン
Ｐｒ ｏ １１Ｍプロリンすべてのアミノ酸は別の
方法で安定でない限りＬ−配置で存在する。とこである
場合ｌｃｔまメチオニンは翻訳の開始で可能な役割を示
すためにＫＫよって示される。同様に分離される蛋白質
に対するＮ−末端配列の１９アミノ酸はＭａｔ Ｇム
ーＡｚ３−１１．ａ −ＴＡｒ−５ａｒ−Ｇｔｙ−Ｐｈ
ａ −Ｌａｗ−Ｇ１．ｙ −Ｐｒａ −Ｌａｕ−Ｌａｗ
−Ｖａｔ−５ａｙ−ＧムーＡｌ ａ−Ｇｔｙ −ＰＡ−
であるととが報告されていた。（上記ピーターラン等１
９７８年）グリコジル化されていない蛋白質は免疫遺伝
子であると報告されているが上記ビーターラン等１９７
７年に記載されているように分離したグリコジル化した
ペプチドはそうではない。
ティンａｔｙ−グリシン Ｈｈｌｌ１１ヒス
チジンＧムーグルタミン酸 Ｌｙｅ −リジン
ＧＬｎ−グルタミン Ｌａｕ 瞠ロイシン
Ａｓｐ ＝アスパラギン酸 Ｉｔｍ −インロイ
シンＡｐｔｓ悶アスパラギン ＶａＬ −バリ
ンＡｒｙ−フルギニン ＭまたはＭ ａ ｔ−メチ
オニンＳ−τ瞑セ盲ノン ７” ｙ ｒ
露チロシン？’Ａｒ−スレオニン ＰＡａ
−フェニルアラニンＴｒｐ ＝ トリプトファン
Ｐｒ ｏ １１Ｍプロリンすべてのアミノ酸は別の
方法で安定でない限りＬ−配置で存在する。とこである
場合ｌｃｔまメチオニンは翻訳の開始で可能な役割を示
すためにＫＫよって示される。同様に分離される蛋白質
に対するＮ−末端配列の１９アミノ酸はＭａｔ Ｇム
ーＡｚ３−１１．ａ −ＴＡｒ−５ａｒ−Ｇｔｙ−Ｐｈ
ａ −Ｌａｗ−Ｇ１．ｙ −Ｐｒａ −Ｌａｕ−Ｌａｗ
−Ｖａｔ−５ａｙ−ＧムーＡｌ ａ−Ｇｔｙ −ＰＡ−
であるととが報告されていた。（上記ピーターラン等１
９７８年）グリコジル化されていない蛋白質は免疫遺伝
子であると報告されているが上記ビーターラン等１９７
７年に記載されているように分離したグリコジル化した
ペプチドはそうではない。
しかしながら他の研究者は免疫遺伝子であるグリコジル
化ペプチド成分を報告してい石、上記ゲリン、Ｇ、Ｌ、
等ウィルス性肝炎第１４７〜１５３頁（１９７８年）中
で。矛盾は十分には説明されていない。表面抗原蛋白質
の免疫遺伝は形態変化に感受性があるととが知られてい
る。血清および血漿から表面抗原蛋白質の分離およびａ
ＩＡに卦ける洗浄剤の使用が恐らく免疫学的反応性を減
少ぢせるのである。
化ペプチド成分を報告してい石、上記ゲリン、Ｇ、Ｌ、
等ウィルス性肝炎第１４７〜１５３頁（１９７８年）中
で。矛盾は十分には説明されていない。表面抗原蛋白質
の免疫遺伝は形態変化に感受性があるととが知られてい
る。血清および血漿から表面抗原蛋白質の分離およびａ
ＩＡに卦ける洗浄剤の使用が恐らく免疫学的反応性を減
少ぢせるのである。
表面および核抗原を検出する能力は輸血が発達した国に
おいてＨＢＶ伝搬のより普通の方法の一つであることか
ら特に可能な供血者の選別として非常に臨床上価値があ
る。現在部分的に精製し九ＨＥｚＡｙ Ｋ対するデイン
粒子の利用源は生産される抗体の質および量を制限する
。ウィルスは培養で増殖できないそして感染したヒトの
患者からまたは高級霊長類の感染後得ることができるだ
けである。それ故１１ＥＶのストックを維持しまたは所
望量のウィルスまたはあらゆるウィルスを帰港手段はな
い。ウィルスは培養細胞または組織に細胞病理作用がな
いため感染したウィルス粒子の測定手段は一般に利用で
きない。遺伝学的に純粋ＦＩＢＶストックは本発明以前
には利用でれていない。とれらの制限は受動免疫法ので
らに敏感な免疫分析に適した抗体および自動免疫法に対
する抗原の生産のために改良された量および質でＨＢｚ
Ａｙを供給するだけＫかなシ制限している。ざらＫその
上ヒトまたは高級霊長類から外にウィルスを通過するこ
とができないことはワクチンの生産に対して十分な抗原
を得ることを不可能にする。ＨＢＶの限定ぐれた宿主範
囲および組織培養細胞を感染するととまでの失敗はウィ
ルスの研究を徹底的に制限しそしてそれが原因の重病に
対するワクチンの開発を妨害しているのである。
おいてＨＢＶ伝搬のより普通の方法の一つであることか
ら特に可能な供血者の選別として非常に臨床上価値があ
る。現在部分的に精製し九ＨＥｚＡｙ Ｋ対するデイン
粒子の利用源は生産される抗体の質および量を制限する
。ウィルスは培養で増殖できないそして感染したヒトの
患者からまたは高級霊長類の感染後得ることができるだ
けである。それ故１１ＥＶのストックを維持しまたは所
望量のウィルスまたはあらゆるウィルスを帰港手段はな
い。ウィルスは培養細胞または組織に細胞病理作用がな
いため感染したウィルス粒子の測定手段は一般に利用で
きない。遺伝学的に純粋ＦＩＢＶストックは本発明以前
には利用でれていない。とれらの制限は受動免疫法ので
らに敏感な免疫分析に適した抗体および自動免疫法に対
する抗原の生産のために改良された量および質でＨＢｚ
Ａｙを供給するだけＫかなシ制限している。ざらＫその
上ヒトまたは高級霊長類から外にウィルスを通過するこ
とができないことはワクチンの生産に対して十分な抗原
を得ることを不可能にする。ＨＢＶの限定ぐれた宿主範
囲および組織培養細胞を感染するととまでの失敗はウィ
ルスの研究を徹底的に制限しそしてそれが原因の重病に
対するワクチンの開発を妨害しているのである。
最近Ｅｌｌｌｌｆおよび原発性の肝細胞の癌との関連が
極めて明白に示てれている。疫学的研究は原発性肝細胞
癌を有する患者ＫＨＢｐＡりまたはＨＥｃＡりの高い相
関を示している、トリコポウロス、Ｄ等、ランセット、
１９７８娠第８１０２頁。さらに重大なことＫは培養し
た肝細胞の癌細胞いアレキサンダー’！胞）の菌株はＨ
ＢｚＡｆを産生することが知られている。それ故これら
の細胞はＩＩＥＶゲノムの少なくとも一部を含有してい
る。さらに肝細胞発癌におけるＨＥＶの役割の説明およ
び癌の形質転換の分子機構はウィルスまたはそのゲノム
の保持および操作に対する適当な生物学系の発達に依存
する。
極めて明白に示てれている。疫学的研究は原発性肝細胞
癌を有する患者ＫＨＢｐＡりまたはＨＥｃＡりの高い相
関を示している、トリコポウロス、Ｄ等、ランセット、
１９７８娠第８１０２頁。さらに重大なことＫは培養し
た肝細胞の癌細胞いアレキサンダー’！胞）の菌株はＨ
ＢｚＡｆを産生することが知られている。それ故これら
の細胞はＩＩＥＶゲノムの少なくとも一部を含有してい
る。さらに肝細胞発癌におけるＨＥＶの役割の説明およ
び癌の形質転換の分子機構はウィルスまたはそのゲノム
の保持および操作に対する適当な生物学系の発達に依存
する。
（以下余白）
片の遺伝学上純粋な株を維持、変性および複製するため
の生物学体系を初めて提供するものである。系はワクチ
ンに適した外膜および核蛋白質のような遺伝学上純粋な
ウィルス性成分を生成しそしてウィルス感染および複製
方法の分子画物学の研究の際に使用するウィルス性ＤＮ
Ａを生成する方法を提供するもの的に引起こす慢性疾患
の誘発を理解するのに有効なため特に価値がある。
の生物学体系を初めて提供するものである。系はワクチ
ンに適した外膜および核蛋白質のような遺伝学上純粋な
ウィルス性成分を生成しそしてウィルス感染および複製
方法の分子画物学の研究の際に使用するウィルス性ＤＮ
Ａを生成する方法を提供するもの的に引起こす慢性疾患
の誘発を理解するのに有効なため特に価値がある。
本発明はＦＩＢＶ−ＤＮＡのクロン化
（ｔｓｌｏｔｓｉｎｌ ）および発現によって具体化さ
れる。新規なりＮＡ運搬仲介物はＩＩＢＦ’ゲノムの全
部およびその一部を含有している。運搬ベクトルは適当
な宿主を転換するため忙使用嘔れ、それによってクロン
化ウィルス性ＤＮＡまたはその一部の実施を可能にしそ
してまた所望量でＨＢｚＡｔ の免疫学的に有効な蛋
白質成分を包含するウィルス性蛋白質の生物学的の産生
のためのワクチンとして有用であり、ざらに臨床の選別
試験および受動免疫を供給するために有用である。Ｓ蛋
白質と称嘔れるＨＢｚＡｆ のｎ製された免疫学的忙有
効な蛋白質成分およびその原核蛋白質断片を有する融合
蛋白質は微生物によって合成されている。
れる。新規なりＮＡ運搬仲介物はＩＩＢＦ’ゲノムの全
部およびその一部を含有している。運搬ベクトルは適当
な宿主を転換するため忙使用嘔れ、それによってクロン
化ウィルス性ＤＮＡまたはその一部の実施を可能にしそ
してまた所望量でＨＢｚＡｔ の免疫学的に有効な蛋
白質成分を包含するウィルス性蛋白質の生物学的の産生
のためのワクチンとして有用であり、ざらに臨床の選別
試験および受動免疫を供給するために有用である。Ｓ蛋
白質と称嘔れるＨＢｚＡｆ のｎ製された免疫学的忙有
効な蛋白質成分およびその原核蛋白質断片を有する融合
蛋白質は微生物によって合成されている。
Ｓ−蛋白質およびその誘導体はＩＩＥＶＫ対するワクチ
ンを生成する抗原として有用である。
ンを生成する抗原として有用である。
全部ＨＢＶゲノムからなる新規なりＮＡ運搬仲介物およ
びそこで転換される微生物は原出願の提出とともＩＣ１
９７９年５月２３日付でアメリカンタイプ力ルチュアコ
レクション、１２３０１パークラウンドライブ、ロツク
ウ゛イル、Ｍ、１．２０Ｂ５２１Ｃおいて寄託せられた
。
びそこで転換される微生物は原出願の提出とともＩＣ１
９７９年５月２３日付でアメリカンタイプ力ルチュアコ
レクション、１２３０１パークラウンドライブ、ロツク
ウ゛イル、Ｍ、１．２０Ｂ５２１Ｃおいて寄託せられた
。
寄託した運搬仲介物はＡＴＣＣ受託番号第４０００９号
を有するｐＥｃａ６３ とことで称される。寄託した
微生物大腸菌Ｅ、 ｅａｌｉＨＥ １０１／ｐＥｃｏ
６３ は、４７ＣＣ受託番号第３１５１８号を有する。
を有するｐＥｃａ６３ とことで称される。寄託した
微生物大腸菌Ｅ、 ｅａｌｉＨＥ １０１／ｐＥｃｏ
６３ は、４７ＣＣ受託番号第３１５１８号を有する。
１１１１’−ＤＮＡは一定のヒトのｇＢｚＡｆ担体の血
漿中に存在するデイン粒子から得ることができる。デイ
ン粒子は特異遠心法によって部分的＜ｎ製することがで
きる。デイン粒子から直接抽出されたＤＮＡの多くは単
一成分領域を含有するのでＤＮＡは単一成分空隙をふさ
ぐととＫよって初めに直される。普通のＤＮＡポリメラ
ーゼ反応はデイン粒子から抽出されたＤＮＡ上で作用し
て使用するととができる。しかし表から好ましい方法は
ホルスカ、Ｊ、Ｆｏ等、７． ｖｉｒａｌ、第２１巻、
第６６６頁（１９７７年）Ｋ記載される通りそれ自体粒
子中固有のｒ）ＨＡポリメラーゼ作用を利用するもので
ある。好ましい方法ｌＣおいてＤＮＡがまず回復され、
次いで粒子から抽出される。希望するならば放射性標示
がポリメラーゼ反応中に入れることができる。
漿中に存在するデイン粒子から得ることができる。デイ
ン粒子は特異遠心法によって部分的＜ｎ製することがで
きる。デイン粒子から直接抽出されたＤＮＡの多くは単
一成分領域を含有するのでＤＮＡは単一成分空隙をふさ
ぐととＫよって初めに直される。普通のＤＮＡポリメラ
ーゼ反応はデイン粒子から抽出されたＤＮＡ上で作用し
て使用するととができる。しかし表から好ましい方法は
ホルスカ、Ｊ、Ｆｏ等、７． ｖｉｒａｌ、第２１巻、
第６６６頁（１９７７年）Ｋ記載される通りそれ自体粒
子中固有のｒ）ＨＡポリメラーゼ作用を利用するもので
ある。好ましい方法ｌＣおいてＤＮＡがまず回復され、
次いで粒子から抽出される。希望するならば放射性標示
がポリメラーゼ反応中に入れることができる。
クロンの目的に対して円形ＥＥＩ’−ＤＮＡはＤＮＡ運
搬仲介物に次の共有付加できる一つまたはそれ以上の部
位で内部分割しなければならない。付加処理はＤＨ，ｔ
−リガース酵素によって接触作用を及ぼし結紮と称され
る。
搬仲介物に次の共有付加できる一つまたはそれ以上の部
位で内部分割しなければならない。付加処理はＤＨ，ｔ
−リガース酵素によって接触作用を及ぼし結紮と称され
る。
内部分割はその多くが技術において公知である非特異性
エンドヌクレアーゼを使用して行なわれ、ＤＮＡ上の任
意部位でＤＮＡのフォスフオシエステル結合の加水分解
に接触作用を及ぼすことがてきる。しかしながら好まし
くは分割は制限部位として公知の一定のデオキシヌクレ
オチド塩基配列内圧あるフォスフオシエステルだけの加
水分解に接触作用を及ぼす一種またはそれ以上の制限エ
ンドヌクレアーゼを使用して行なわれるべきである。ロ
ベルツ、Ｒｏ、Ｃｒ１ｔ、Ｒａｗ、 Ｂｉａｃｈａｔｐ
ｈ、第４巻、第１２３頁（１９７６年）お照。極めて様
々な制限エンドヌクレアーゼが市販されている。
エンドヌクレアーゼを使用して行なわれ、ＤＮＡ上の任
意部位でＤＮＡのフォスフオシエステル結合の加水分解
に接触作用を及ぼすことがてきる。しかしながら好まし
くは分割は制限部位として公知の一定のデオキシヌクレ
オチド塩基配列内圧あるフォスフオシエステルだけの加
水分解に接触作用を及ぼす一種またはそれ以上の制限エ
ンドヌクレアーゼを使用して行なわれるべきである。ロ
ベルツ、Ｒｏ、Ｃｒ１ｔ、Ｒａｗ、 Ｂｉａｃｈａｔｐ
ｈ、第４巻、第１２３頁（１９７６年）お照。極めて様
々な制限エンドヌクレアーゼが市販されている。
ＨＥＶゲノムの大きざのＤＮＡの一定部分中の一定の制
限部位の存在は非常く偶然の物質である。いくつかの部
位はしばしば見い出すことができるが他のものは全熱な
い。我々はＨＥＶ−ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｔｓＲＩに対する単一部位を含有することを見出した
。ＥｅｏＲＩＩｆニーよるＨＥＶ−ＤＮＡの温浸は円形
ＤＮＡを分子量の重大な変化を伴わない線状ＤＮＡに転
換する。制限エンドヌクレアーゼを使用する結果として
線状温浸生成物のナベては末端に同一塩基配列を有する
。同様に酵素ＢｔｘｍＨＩ Ｋよる温浸は二つの線状Ｄ
Ｎ、４断片を生成しゲル電気泳動による分子の長さく従
って分別することができる。ＥｏａＲｉ およびＥａｙ
ＬＦｌｌ 両酵素での温浸はゲル電気泳動くよって定量
した大きざがＥａｏＲ１部位および二つのＥａｒｐａｌ
１１部位の相対位置について一定の結論を可能にする三
つの線状ＤＮＡ断片を生成する。生成した断片の大きＩ
ｃついて種々の組合わせの制限エンドヌクレアーゼの結
果を分析することＫよってお互いに関して相対位置の制
限を示す１Ｉ８Ｖ−ＤＮＡの限定図を作ることができる
。かかる図はＦＩＢＶ−ＤＮＡＶＣ対する第１図中に示
される。
限部位の存在は非常く偶然の物質である。いくつかの部
位はしばしば見い出すことができるが他のものは全熱な
い。我々はＨＥＶ−ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｔｓＲＩに対する単一部位を含有することを見出した
。ＥｅｏＲＩＩｆニーよるＨＥＶ−ＤＮＡの温浸は円形
ＤＮＡを分子量の重大な変化を伴わない線状ＤＮＡに転
換する。制限エンドヌクレアーゼを使用する結果として
線状温浸生成物のナベては末端に同一塩基配列を有する
。同様に酵素ＢｔｘｍＨＩ Ｋよる温浸は二つの線状Ｄ
Ｎ、４断片を生成しゲル電気泳動による分子の長さく従
って分別することができる。ＥｏａＲｉ およびＥａｙ
ＬＦｌｌ 両酵素での温浸はゲル電気泳動くよって定量
した大きざがＥａｏＲ１部位および二つのＥａｒｐａｌ
１１部位の相対位置について一定の結論を可能にする三
つの線状ＤＮＡ断片を生成する。生成した断片の大きＩ
ｃついて種々の組合わせの制限エンドヌクレアーゼの結
果を分析することＫよってお互いに関して相対位置の制
限を示す１Ｉ８Ｖ−ＤＮＡの限定図を作ることができる
。かかる図はＦＩＢＶ−ＤＮＡＶＣ対する第１図中に示
される。
限定エンドヌクレアーゼの適当な選択釦よってＥＩＢＰ
’の全ゲノムまたはあらゆる部分な転移することができ
そして適当な宿主生体中で転移したＨＥｒ−ＤＨ，４を
複製するととができるＤＮＡ運搬仲介物に組合わせ部分
を重ねることができる。
’の全ゲノムまたはあらゆる部分な転移することができ
そして適当な宿主生体中で転移したＨＥｒ−ＤＨ，４を
複製するととができるＤＮＡ運搬仲介物に組合わせ部分
を重ねることができる。
運搬仲介物および宿主の選択は所望の末端使用および関
連し九生物の危険のようなある実際的な考察と相関しそ
して支配される。ウィルス性粒子の合成に対してまたは
ある間隔での発現の最大速度に対して真核生物 （ｇｕｃａｒｙｏｔｉａ’）宿主細胞がさらに適当であ
ることができる。選択された運搬仲介物は宿主中に入り
そして複製することが可能でなければならない。迅速な
りＮＡ実施・操作の容易さそして安全性に対して遺伝学
的純度の保持に対してそして手引研究に対して大腸菌の
ような微生物宿主が好ましい。多くのＤＮＡ運搬仲介物
が大腸菌として知られている。プラスミド運搬仲介物は
単に便宜上ここで使用している。
連し九生物の危険のようなある実際的な考察と相関しそ
して支配される。ウィルス性粒子の合成に対してまたは
ある間隔での発現の最大速度に対して真核生物 （ｇｕｃａｒｙｏｔｉａ’）宿主細胞がさらに適当であ
ることができる。選択された運搬仲介物は宿主中に入り
そして複製することが可能でなければならない。迅速な
りＮＡ実施・操作の容易さそして安全性に対して遺伝学
的純度の保持に対してそして手引研究に対して大腸菌の
ような微生物宿主が好ましい。多くのＤＮＡ運搬仲介物
が大腸菌として知られている。プラスミド運搬仲介物は
単に便宜上ここで使用している。
運搬仲介物へのＨＥＶ−ＤＮＡ付加は好ましくは一定位
置で運搬仲介物を円形ＤＮＡＫ開くことが必要であり、
次に線状運搬仲介物ＤＮＡで線状＃ＢＶ−ＤＮＡを結紮
して最初に分割した位置でヌクルオチド配列に挿入した
ＥＩＥＩ’−ＤＮＡを含有する円形組換え運搬仲介物を
生成する。好ましくは拡大に次いで挿入したＤＮＡの回
収するために運搬ＤＮＡおよびＨＢＶ−ＤＮＡの末端を
組換え運搬仲介物から１１８７’−ＤＮＡを特異的に除
去するための特定の手段を提供するために処理する。
置で運搬仲介物を円形ＤＮＡＫ開くことが必要であり、
次に線状運搬仲介物ＤＮＡで線状＃ＢＶ−ＤＮＡを結紮
して最初に分割した位置でヌクルオチド配列に挿入した
ＥＩＥＩ’−ＤＮＡを含有する円形組換え運搬仲介物を
生成する。好ましくは拡大に次いで挿入したＤＮＡの回
収するために運搬ＤＮＡおよびＨＢＶ−ＤＮＡの末端を
組換え運搬仲介物から１１８７’−ＤＮＡを特異的に除
去するための特定の手段を提供するために処理する。
処理方法の一つはベース連鎖が一つまたはそれ以上の制
限位置配列を包含する二重成分オリゴデオキシヌクレオ
チＦ！％結鎖Ｉ分子の添加を要する、シェラ−Ｒ，Ｉｌ
ｏ等、科学第１９６巻、第１７７頁（１９７７年）。１
末尾（ｔα１ｌｉｎｌ ） ’と称する第二の方法は末
端トランスフェラーゼによって接触作用を及ぼした反応
において各々エンドヌクレアーゼ−処理プラスミドおよ
びウィルス性Ｄ Ｎ Ａ ｔの末端でオリゴ−Ｇシよび
オリゴ−Ｃ配列の添加を包含する。（ＤＮＡ中の塩基配
列はデオキシリボヌクレオチドに属し、一方ＲＮ、ｌ中
の配列はりボヌクレオチドに属することは理解される。
限位置配列を包含する二重成分オリゴデオキシヌクレオ
チＦ！％結鎖Ｉ分子の添加を要する、シェラ−Ｒ，Ｉｌ
ｏ等、科学第１９６巻、第１７７頁（１９７７年）。１
末尾（ｔα１ｌｉｎｌ ） ’と称する第二の方法は末
端トランスフェラーゼによって接触作用を及ぼした反応
において各々エンドヌクレアーゼ−処理プラスミドおよ
びウィルス性Ｄ Ｎ Ａ ｔの末端でオリゴ−Ｇシよび
オリゴ−Ｃ配列の添加を包含する。（ＤＮＡ中の塩基配
列はデオキシリボヌクレオチドに属し、一方ＲＮ、ｌ中
の配列はりボヌクレオチドに属することは理解される。
）結合点でａｃｃｃ配列が生成し、それはＨａａＫＫ対
して特異的な制限位置配列である。挿入した部分は１１
ｍｍＭと消化作用によってプラスミドから放出すること
ができる〔つ゛イラーコマロフ、Ｌｌ等、Ｆｒｅｅ、
Ｈａｔ、Ａａａｔ、 Ｓｅｉ。
して特異的な制限位置配列である。挿入した部分は１１
ｍｍＭと消化作用によってプラスミドから放出すること
ができる〔つ゛イラーコマロフ、Ｌｌ等、Ｆｒｅｅ、
Ｈａｔ、Ａａａｔ、 Ｓｅｉ。
ＵＳＡ第７５巻、第３７２７頁（１９７８年）参照〕語
録方法は正確に定義される二つのＤＮＡｐ間の継ぎ目で
配列を可能くする。末尾方法は結合した分子のファミリ
ーを製造する。
録方法は正確に定義される二つのＤＮＡｐ間の継ぎ目で
配列を可能くする。末尾方法は結合した分子のファミリ
ーを製造する。
末尾忙つなぐととくよって結合した一定のクロンは運搬
仲介物遺伝子から通続翻訳によってクロン遺伝子の発現
を可能にする接合でれる運搬仲介物遺伝子として同様の
翻訳読み枠を有するバの確率がある。また挿入したＤＮ
Ａは同様の翻訳方向で接合するＺの確率があるので一定
クロンが発現すよることができる混成確率は％である、
ポリスキー Ｂｏ等、Ｆｒｅｖ。
仲介物遺伝子から通続翻訳によってクロン遺伝子の発現
を可能にする接合でれる運搬仲介物遺伝子として同様の
翻訳読み枠を有するバの確率がある。また挿入したＤＮ
Ａは同様の翻訳方向で接合するＺの確率があるので一定
クロンが発現すよることができる混成確率は％である、
ポリスキー Ｂｏ等、Ｆｒｅｖ。
Ｎａｔ、 ＡｃａｔＬ、 Ｓａｉ、 ＵＳＡ第７３巻、
第３９００頁（１９７６年）およびイタクラ、Ｋ等、科
学第１９８巻（第１０５６頁（１９７７年）参照。それ
故仲介物および挿入物が枠読むととＫｌ！Ａして相中に
ある証拠がなくて表示が希望される場合に末尾につなぐ
ことが好ましい。
第３９００頁（１９７６年）およびイタクラ、Ｋ等、科
学第１９８巻（第１０５６頁（１９７７年）参照。それ
故仲介物および挿入物が枠読むととＫｌ！Ａして相中に
ある証拠がなくて表示が希望される場合に末尾につなぐ
ことが好ましい。
希望される宿主への組換え運搬仲介物の移動は個々の宿
主−仲介物一組忙適当な手段によって達成される。プラ
スミドは転換によって微生゛物宿主に一般に移動する。
主−仲介物一組忙適当な手段によって達成される。プラ
スミドは転換によって微生゛物宿主に一般に移動する。
仲介物含有宿主は宿主細胞の増殖が組換え運搬仲介物の
随伴増加を生じる結果とともＫそれ自身の細胞分裂で行
なって運搬仲介物を複製する。宿主細胞を含有する特定
の組換え挿入は適当な選択手段によって確認することが
できる。例えばプラスミドｐＢＲ３２２のＰｅｔ １位
における外因性ＤＮＡ断片の挿入はアムビシリン耐性を
与える遺伝子を妨害するので組換えプラスミドによって
転換した宿主細菌はアムビシリン耐性ではない。転換さ
れない細胞は挿入によって作用されない適当な運搬仲介
物製造遺伝子によって選別することができる。単一宿主
細胞を含有する組換え運搬仲介物の子孫はその細胞菌株
の分枝と適当に称される。運搬仲介物によって生じ為挿
入ＤＮＡ部分はそれＫよってクロン化される。それから
出るコピーのすべては非常に稀な任意の突然変異がある
だけで同一塩基配列、を有する。組換え運搬仲介物を含
有する宿主細胞はコロンＤＮＡＫ対して実質的に無尽蔵
の供給源として働く。
随伴増加を生じる結果とともＫそれ自身の細胞分裂で行
なって運搬仲介物を複製する。宿主細胞を含有する特定
の組換え挿入は適当な選択手段によって確認することが
できる。例えばプラスミドｐＢＲ３２２のＰｅｔ １位
における外因性ＤＮＡ断片の挿入はアムビシリン耐性を
与える遺伝子を妨害するので組換えプラスミドによって
転換した宿主細菌はアムビシリン耐性ではない。転換さ
れない細胞は挿入によって作用されない適当な運搬仲介
物製造遺伝子によって選別することができる。単一宿主
細胞を含有する組換え運搬仲介物の子孫はその細胞菌株
の分枝と適当に称される。運搬仲介物によって生じ為挿
入ＤＮＡ部分はそれＫよってクロン化される。それから
出るコピーのすべては非常に稀な任意の突然変異がある
だけで同一塩基配列、を有する。組換え運搬仲介物を含
有する宿主細胞はコロンＤＮＡＫ対して実質的に無尽蔵
の供給源として働く。
クロンＤＭＡの表示はクロンｖ ｙ 、４ Ｋ相当する
ｒｇ ＲＮ Ａの合成を写すことによってまたはクロン
ＤＮＡから写されたｍ ＲＮ Ａ Ｋよってコードされ
た蛋白質の合成を翻訳することＫよって表わすことがで
きる。転写式の発生はクロンＤＮＡで特異的Ｋかけあわ
せることができるＲＮＡの出現によって発見することが
できる。翻訳式は予期した蛋白質に対して特異的な作用
の出現によって発見することができる。例えばかかる作
用は酵素活性、ホルモン性活性または免疫学的特異性で
ありそれはクロン遺伝子によってコードされた蛋白質の
特性である。ウィルス性遺伝子生成物の場合にはＨＥＦ
の場合Ｋかける１ＩＢｚＡｆまたはＦＩＢｃＡりのよう
”な免疫学的反応性蛋白質の出現が最も好適な実現性で
ある。特異性結合反応の他の穏類は一定の状況で適当で
あることができる。固体相の位置で感受性のある放射線
免疫検定は転換された細菌の単一集落から式を検出する
ために展開している、上記ヴイラーコマロフ、Ｌｏ等。
ｒｇ ＲＮ Ａの合成を写すことによってまたはクロン
ＤＮＡから写されたｍ ＲＮ Ａ Ｋよってコードされ
た蛋白質の合成を翻訳することＫよって表わすことがで
きる。転写式の発生はクロンＤＮＡで特異的Ｋかけあわ
せることができるＲＮＡの出現によって発見することが
できる。翻訳式は予期した蛋白質に対して特異的な作用
の出現によって発見することができる。例えばかかる作
用は酵素活性、ホルモン性活性または免疫学的特異性で
ありそれはクロン遺伝子によってコードされた蛋白質の
特性である。ウィルス性遺伝子生成物の場合にはＨＥＦ
の場合Ｋかける１ＩＢｚＡｆまたはＦＩＢｃＡりのよう
”な免疫学的反応性蛋白質の出現が最も好適な実現性で
ある。特異性結合反応の他の穏類は一定の状況で適当で
あることができる。固体相の位置で感受性のある放射線
免疫検定は転換された細菌の単一集落から式を検出する
ために展開している、上記ヴイラーコマロフ、Ｌｏ等。
ウィルス成分を維持、複製および合成するために上述し
た生物体系は感染し九ヒトまたは高級霊長類中に直接ま
たは間接に検出されるだけのウィルスの臨床、生化学的
および遺伝学研究を行なう手段を提供する。Ｘ 関連疾病の臨床、生化学、免疫学および遺伝学研究（対
して全く新しい分野を開発するものである。系は次の可
能性を提供する。ウィルス性ゲノムは遺伝学上純粋な形
で維持そして複製することができる。直接アミノ酸を配
列することＫよって得られる資料で関連のある場合、ウ
ィルス性蛋白質のアミノ酸連鎖に十分な資料を提供する
ヌクレオチド配列資料を得ることができる。逆にヌクレ
オチド配列はアミノ酸配列よりも決定が容易である。特
に蛋白質の末端における部分アミノ酸配列は出発点およ
び読み枠を確定するために有用である。標示されたウィ
ルス性遺伝物質は感染した縄胞ゲノムにおけるウィルス
性付着を探し出しそして定量するかけあわせ実験に使用
することができる。ウィルス性蛋白質は宿主細胞におい
て示され、それＫよって特徴、それらに対する抗体の産
生、検出および測定分析の開発シよびその付加物および
誘導体の製造を可能くする。ワクチンはウィルス性蛋白
質から生産することができる。ワクチンは完全なまたは
感染性ウィルス粒子によって全く感染しない記載し六方
法によって生産することができるのでかかるワクチンは
必要とされる量で利用されそして実質的安全因子を提供
することができる。ウィルス性蛋白質に対する抗体はウ
ィルス性感染の臨床診［Ｋ有用である。量的にウィルス
性蛋白質を生産する能力はそれらの生化学特性およびウ
ィルス性発病の一因となる作用の方法を研究することを
可能にする。前述の能力は本発明によって可能となる研
究の直接利益だけを説明するものである。捕え難いまた
は予知できない現象忙関するざらに長い言葉の発見もま
た非常に重要であると予想することができる。
た生物体系は感染し九ヒトまたは高級霊長類中に直接ま
たは間接に検出されるだけのウィルスの臨床、生化学的
および遺伝学研究を行なう手段を提供する。Ｘ 関連疾病の臨床、生化学、免疫学および遺伝学研究（対
して全く新しい分野を開発するものである。系は次の可
能性を提供する。ウィルス性ゲノムは遺伝学上純粋な形
で維持そして複製することができる。直接アミノ酸を配
列することＫよって得られる資料で関連のある場合、ウ
ィルス性蛋白質のアミノ酸連鎖に十分な資料を提供する
ヌクレオチド配列資料を得ることができる。逆にヌクレ
オチド配列はアミノ酸配列よりも決定が容易である。特
に蛋白質の末端における部分アミノ酸配列は出発点およ
び読み枠を確定するために有用である。標示されたウィ
ルス性遺伝物質は感染した縄胞ゲノムにおけるウィルス
性付着を探し出しそして定量するかけあわせ実験に使用
することができる。ウィルス性蛋白質は宿主細胞におい
て示され、それＫよって特徴、それらに対する抗体の産
生、検出および測定分析の開発シよびその付加物および
誘導体の製造を可能くする。ワクチンはウィルス性蛋白
質から生産することができる。ワクチンは完全なまたは
感染性ウィルス粒子によって全く感染しない記載し六方
法によって生産することができるのでかかるワクチンは
必要とされる量で利用されそして実質的安全因子を提供
することができる。ウィルス性蛋白質に対する抗体はウ
ィルス性感染の臨床診［Ｋ有用である。量的にウィルス
性蛋白質を生産する能力はそれらの生化学特性およびウ
ィルス性発病の一因となる作用の方法を研究することを
可能にする。前述の能力は本発明によって可能となる研
究の直接利益だけを説明するものである。捕え難いまた
は予知できない現象忙関するざらに長い言葉の発見もま
た非常に重要であると予想することができる。
実施例１
ウィルス性ＤＮＡゲノムのクロン
二重成分の円形ＨＢＶ−ＤＮＡを上記のフルスカ等によ
って記載された通り２５μ？ＤＮＡを含有するデイン粒
子から得た。ＤＮイな最初忙酵素の消化生成物のゲル電
気泳動によって制限エンドヌクレアーゼへの感受性に対
して選別した。ゲル電気泳動は核酸を分子量の長ざによ
り分別する、ヘリング、Ｒ０等！、 ｙｉｙａｌ 第
１４巻、第１２３５頁（１９７４年）。
って記載された通り２５μ？ＤＮＡを含有するデイン粒
子から得た。ＤＮイな最初忙酵素の消化生成物のゲル電
気泳動によって制限エンドヌクレアーゼへの感受性に対
して選別した。ゲル電気泳動は核酸を分子量の長ざによ
り分別する、ヘリング、Ｒ０等！、 ｙｉｙａｌ 第
１４巻、第１２３５頁（１９７４年）。
ＥａａＲＩ エンドヌクレアーゼでＺ）／／、４１Ｑ
Ｑルタの処理により約３２００ベース対（、ｂ ｐ ）
の長ざに相当する一つの鋭い帯を得た。
Ｑルタの処理により約３２００ベース対（、ｂ ｐ ）
の長ざに相当する一つの鋭い帯を得た。
Ｅ ａ ｍ Ｈ／ エンドヌクレアーゼのＰＪ磯の処理
により約１２００およびｚｏｏｏＰ邊長ざに相当する二
つの断片を得た。制限エンドヌクレアーゼをマサチュセ
ッッ州のビバリーのニューイングランド生物研究所から
得た。単位は生産者によって定義した。限定エンドヌク
レアーゼを使用する全反応を生産者の勧める緩衝液中で
行なった。各々の場合に得た断片の数から一つのＥａａ
ＲＩ位［ｂよび二つのＥａｍＨ１位置を含有することを
推定した。選択されたＤＮＡ運搬仲介物はプラスミドｐ
ＢＲ２３５であつ九（ボリヴア、Ｆ、Ｇａｎｇ第４巻、
第１２１頁（１９７８年）これはプラスミドＰＢＲ３２
２から誘導され（ボリゲア、７０等Ｃ１−第２巻、第９
５頁（Ｉ９７７年）そして大腸菌プラスミドｐＥＥ３２
５を＠換することができ、転換細胞にクロラフェニフー
ル耐性（ｃ’ｍ’″）およびアムビシリン耐性ＣＡｐ”
）を与える遺伝子を運ぶ。ＥｃｏＲ１位置はＥａａＲｒ
位背での外因性ＤＮＡの挿入がＣｒｘ’遺伝子を無効に
させその間７Ｐｒ遺伝子は未変化のままであるようＫＣ
ｒｓ’遺伝子中に存在する。転換した大腸菌の組換えク
ロンなりロラムフエニコール感受性およびアムビシリン
耐性として確認し、一方クロラムフエニコールおよびア
ムビシリンに感受性のある転換されない細胞は抗生物質
の存在下では増殖しない。
により約１２００およびｚｏｏｏＰ邊長ざに相当する二
つの断片を得た。制限エンドヌクレアーゼをマサチュセ
ッッ州のビバリーのニューイングランド生物研究所から
得た。単位は生産者によって定義した。限定エンドヌク
レアーゼを使用する全反応を生産者の勧める緩衝液中で
行なった。各々の場合に得た断片の数から一つのＥａａ
ＲＩ位［ｂよび二つのＥａｍＨ１位置を含有することを
推定した。選択されたＤＮＡ運搬仲介物はプラスミドｐ
ＢＲ２３５であつ九（ボリヴア、Ｆ、Ｇａｎｇ第４巻、
第１２１頁（１９７８年）これはプラスミドＰＢＲ３２
２から誘導され（ボリゲア、７０等Ｃ１−第２巻、第９
５頁（Ｉ９７７年）そして大腸菌プラスミドｐＥＥ３２
５を＠換することができ、転換細胞にクロラフェニフー
ル耐性（ｃ’ｍ’″）およびアムビシリン耐性ＣＡｐ”
）を与える遺伝子を運ぶ。ＥｃｏＲ１位置はＥａａＲｒ
位背での外因性ＤＮＡの挿入がＣｒｘ’遺伝子を無効に
させその間７Ｐｒ遺伝子は未変化のままであるようＫＣ
ｒｓ’遺伝子中に存在する。転換した大腸菌の組換えク
ロンなりロラムフエニコール感受性およびアムビシリン
耐性として確認し、一方クロラムフエニコールおよびア
ムビシリンに感受性のある転換されない細胞は抗生物質
の存在下では増殖しない。
組換えしない、ＥＲ３２５で転換した分枝なりロラムフ
エンコール耐性およびアムビシリン耐性として確認した
。、姐換え菌株の増殖および選択に使用される微生物学
方法はコールドスプリングハーバ−研究所のシェフレイ
Ｅ。
エンコール耐性およびアムビシリン耐性として確認した
。、姐換え菌株の増殖および選択に使用される微生物学
方法はコールドスプリングハーバ−研究所のシェフレイ
Ｅ。
ミラーによる分子遺伝学の実験（１９７２年）で記載し
た標準方法であった。
た標準方法であった。
挿入法に対して精製、ＢＲ３２５，５０ｎ？および３０
０％ｆ ＩＩＢＶ−７ＤＮＡをまず３７Ｃで１時間Ｅ
ｅｏＲＩエンドヌクレアーゼ１ｏ単位（１０μを全容量
）で共に処理し、線状プラスミドＤＮＡを生成した。反
応混合物をＥａａＲＩエンドヌクレアーゼを不活性化す
るために５分間８５ＣＫ加熱した。
０％ｆ ＩＩＢＶ−７ＤＮＡをまず３７Ｃで１時間Ｅ
ｅｏＲＩエンドヌクレアーゼ１ｏ単位（１０μを全容量
）で共に処理し、線状プラスミドＤＮＡを生成した。反
応混合物をＥａａＲＩエンドヌクレアーゼを不活性化す
るために５分間８５ＣＫ加熱した。
ＤＮＡを２サイクルのエタノール沈殿によって反応混合
物から分離した。沈殿物を緩衝濃縮液が５０風Ｍトリー
１α、ｐＨ８，０゜ｌ ｍＭＡＴＰ 、 １０ ｍＭＭ
ｆα２および２０ ｒｈＭジチオスレイトールを得るよ
うに添加されたｌＯμｔｇ、ｏ中に再懸濁した。混合液
を３７Ｃ５分間次いで室温で５分間保温して前処理した
。次いで混合液を水浴中で冷却しそして１単位Ｔ４リガ
ーゼ（ｐ−ｒ、生化学、１１．０００単位／ＩＩＥｊ）
で１４Ｃ１５時間保温した。反応混合液を標準技術によ
って転換のために一調製した大腸菌細胞の懸濁液に直接
添加した。選択された宿主細胞菌株はボイエル、ｇ、ｒ
ｒ、ｓｐよびローランドーデュソイクス、Ｄ、 ／、
Ｍａｌ。
物から分離した。沈殿物を緩衝濃縮液が５０風Ｍトリー
１α、ｐＨ８，０゜ｌ ｍＭＡＴＰ 、 １０ ｍＭＭ
ｆα２および２０ ｒｈＭジチオスレイトールを得るよ
うに添加されたｌＯμｔｇ、ｏ中に再懸濁した。混合液
を３７Ｃ５分間次いで室温で５分間保温して前処理した
。次いで混合液を水浴中で冷却しそして１単位Ｔ４リガ
ーゼ（ｐ−ｒ、生化学、１１．０００単位／ＩＩＥｊ）
で１４Ｃ１５時間保温した。反応混合液を標準技術によ
って転換のために一調製した大腸菌細胞の懸濁液に直接
添加した。選択された宿主細胞菌株はボイエル、ｇ、ｒ
ｒ、ｓｐよびローランドーデュソイクス、Ｄ、 ／、
Ｍａｌ。
Ｂｉｏｌ、第４１巻、第４５９〜４７２頁（１９６９年
）Ｋよって記載された大腸菌ｆｆＢ１０１であった。個
別菌株の選択は普通のものに基づいた。菌株ｆｆＢ１０
１は他のプラスミドを含有せずクロラムフェニコールお
よびアムピシリンに感受性があり相対的に微生物の株の
増殖および維持が容易である。
）Ｋよって記載された大腸菌ｆｆＢ１０１であった。個
別菌株の選択は普通のものに基づいた。菌株ｆｆＢ１０
１は他のプラスミドを含有せずクロラムフェニコールお
よびアムピシリンに感受性があり相対的に微生物の株の
増殖および維持が容易である。
組換えプラスミドを含有する転換細胞の単一集落をクロ
ラムフェニコールｓ受ｎｂよびアムビシリン耐性によっ
て判断されるように培養中に増殖してプラスミドＤＮＡ
源を与える。
ラムフェニコールｓ受ｎｂよびアムビシリン耐性によっ
て判断されるように培養中に増殖してプラスミドＤＮＡ
源を与える。
培養を五−肉汁中で通゛気により増殖させそしてレイト
ログ（１ａｔｅ ｌｏｇ） ”＆たけ定常相中で採集し
た。次に転換した細胞を上述のポリヴア、Ｆｌ等および
上述のボリヴアのよう忙ｌｃ！Ｒクウ゛エツトを使用し
て適当な最小培地中で１．０の６６０１ｓＸＩＩの光学
密度に生長ぐせた。
ログ（１ａｔｅ ｌｏｇ） ”＆たけ定常相中で採集し
た。次に転換した細胞を上述のポリヴア、Ｆｌ等および
上述のボリヴアのよう忙ｌｃ！Ｒクウ゛エツトを使用し
て適当な最小培地中で１．０の６６０１ｓＸＩＩの光学
密度に生長ぐせた。
クロムフェニコール１７０μり／ｄを次忙添加しそして
培養を一晩保温した。いずれの場合もプラスミドＤＮＡ
を細胞溶解質からスーパーコイルとしてフレウェル、Ｄ
、 Ｂ、 オよびへリンスキー Ｄ、Ｒ，Ｆｒｅｅ、
Ｎａｔ、 Ａｃａｒｉ、Ｓｅｉ 。
培養を一晩保温した。いずれの場合もプラスミドＤＮＡ
を細胞溶解質からスーパーコイルとしてフレウェル、Ｄ
、 Ｂ、 オよびへリンスキー Ｄ、Ｒ，Ｆｒｅｅ、
Ｎａｔ、 Ａｃａｒｉ、Ｓｅｉ 。
ＵＳＡ第６２巻、第１１５９頁（１９６９年）Ｋ記載で
れた臭化エチジウムＣＩα密度勾配遠心法を使用して分
離した。転換細胞から調製したプラスミドＤＮＡなＥｅ
ｒａＲＩエンドヌクレアーゼで処理しそして前述の通り
ゲル電気泳動によって分別した。一つの集落をバーンス
、ＩＩ’０Ｍ０、科学第１９５巻、第３９３頁（１９７
７年）Ｋよって記載されたトウースビック検定により大
挿入物で生じるプラスミドを確認するために選別した。
れた臭化エチジウムＣＩα密度勾配遠心法を使用して分
離した。転換細胞から調製したプラスミドＤＮＡなＥｅ
ｒａＲＩエンドヌクレアーゼで処理しそして前述の通り
ゲル電気泳動によって分別した。一つの集落をバーンス
、ＩＩ’０Ｍ０、科学第１９５巻、第３９３頁（１９７
７年）Ｋよって記載されたトウースビック検定により大
挿入物で生じるプラスミドを確認するために選別した。
約１２００ｈｐの長ざの挿入を含有する二つの独立して
分離された組換えプラスミドを次の研究のために選択し
た。これらをｐ Ｅ ｅ ａ −３ｂよびｐｉｃａ−６
３と称した。
分離された組換えプラスミドを次の研究のために選択し
た。これらをｐ Ｅ ｅ ａ −３ｂよびｐｉｃａ−６
３と称した。
同様の方法でＩＩ Ｂ Ｆ −Ｄ ／／ Ａ （Ｄ Ｂ
ａｍＦＩＩ 断片を挿入のためにプラスミドｐＢＲ３２
２のＢａｍＨ１位置を使用して別個に分枝した。刻み目
翻訳法（リグバイ、Ｐ、 Ｆ、 Ｊ、等、！、Ｍｏｌ。
ａｍＦＩＩ 断片を挿入のためにプラスミドｐＢＲ３２
２のＢａｍＨ１位置を使用して別個に分枝した。刻み目
翻訳法（リグバイ、Ｐ、 Ｆ、 Ｊ、等、！、Ｍｏｌ。
Ｆｌｉｏｌ、第１１３巻、第２３７頁（１９７７年）に
よって３２Ｐ で標示したデイン粒子ＤＮＡ（２００ｓ
ｒ）を標示されないデイン粒子ＤＮＡ２００ｒｈタシよ
び１０倍濃度Ｅ ａ ｒ＆ＩＩ １温浸緩衝液２μｔと
混合した。ＤＮＡを５単位ＢａｍＨＩ エンドヌクレ
アーゼと１時間３７Ｃで温浸した。混合液を６５Ｃで５
分間加熱処理し酵素卦よび２サイクルエタノール沈殿に
よって回収したＤ Ｈ−４を不活性化した。運搬仲介物
、ｐＥＲ３２２を同様ＫＥａｍＨＩエンドヌクレアーゼ
で温浸しざらにウルリツチ、Ａ０等科学第１９６巻、第
１３１３頁（１９７７年）で記載された油性リン酸酵素
で処理しｆｃ。
よって３２Ｐ で標示したデイン粒子ＤＮＡ（２００ｓ
ｒ）を標示されないデイン粒子ＤＮＡ２００ｒｈタシよ
び１０倍濃度Ｅ ａ ｒ＆ＩＩ １温浸緩衝液２μｔと
混合した。ＤＮＡを５単位ＢａｍＨＩ エンドヌクレ
アーゼと１時間３７Ｃで温浸した。混合液を６５Ｃで５
分間加熱処理し酵素卦よび２サイクルエタノール沈殿に
よって回収したＤ Ｈ−４を不活性化した。運搬仲介物
、ｐＥＲ３２２を同様ＫＥａｍＨＩエンドヌクレアーゼ
で温浸しざらにウルリツチ、Ａ０等科学第１９６巻、第
１３１３頁（１９７７年）で記載された油性リン酸酵素
で処理しｆｃ。
デインＤＮＡを温浸した１３ａｙｔｌｌｌ （２５０ｓ
’ ）をｐＥＲ３２２６８０１％２と保温し、前述の通
り５０ ｍＭ トリス−〃α％ ｐｕ ｓ、ｏ 、
１ ｙｈＭＡＴＰ 。
’ ）をｐＥＲ３２２６８０１％２と保温し、前述の通
り５０ ｍＭ トリス−〃α％ ｐｕ ｓ、ｏ 、
１ ｙｈＭＡＴＰ 。
ｌＱｎ！／埼αス、２０ ｍＭジチオスレイトール〉よ
びＴ４ＤＮＡリガーゼを含有し次に１４Ｃで１５時間前
加熱処理する反応混合液中で前述の通り処理した。結紮
反応混合液を大腸菌を転換するために使用しそして転換
物なアムビシリン耐性およびテトラサイクリン感受性に
対して選択した。約２１００ ｐＡ ８６ｍ ／７１断
片を生じる組換えプラスミドなｐＥα−１−１３２と称
した。より小ざい断片的１１００ ｈｐ を生じるプラ
スミドもまた得られｐＢａｙ＊−６９と称した。Ｅｅｅ
Ｒｌ 位置が約２１ＯＯｈｐＥ口＋ｌＩ！断片内にある
ので（第１図か照）、フロンＥａａＲＩ−処理１１ＢＶ
−ＤＮＡから１１００ ｐｈＥ ａ ｍ Ｉｆ Ｉ断片
をコロンすることが可能となっている。ｐＥｅｏ−６３
からＩＩＢＶ−ＤＮＡの調製をＨＢＶ−ＤＡＭを放出す
る特異分裂により得そしてｐＢＲ３２５のＰａｔ １位
置で挿入した。
びＴ４ＤＮＡリガーゼを含有し次に１４Ｃで１５時間前
加熱処理する反応混合液中で前述の通り処理した。結紮
反応混合液を大腸菌を転換するために使用しそして転換
物なアムビシリン耐性およびテトラサイクリン感受性に
対して選択した。約２１００ ｐＡ ８６ｍ ／７１断
片を生じる組換えプラスミドなｐＥα−１−１３２と称
した。より小ざい断片的１１００ ｈｐ を生じるプラ
スミドもまた得られｐＢａｙ＊−６９と称した。Ｅｅｅ
Ｒｌ 位置が約２１ＯＯｈｐＥ口＋ｌＩ！断片内にある
ので（第１図か照）、フロンＥａａＲＩ−処理１１ＢＶ
−ＤＮＡから１１００ ｐｈＥ ａ ｍ Ｉｆ Ｉ断片
をコロンすることが可能となっている。ｐＥｅｏ−６３
からＩＩＢＶ−ＤＮＡの調製をＨＢＶ−ＤＡＭを放出す
る特異分裂により得そしてｐＢＲ３２５のＰａｔ １位
置で挿入した。
この操作においてプラスミドｐＥｃｏ ６３ （３μり
）をまずＥｃｏＲＩ エンドヌクレアーゼで温浸し次
いで各反応に対して前述した条件下でＤＮＡリガースで
処理した。次いで円形ｐＥＲ３２５およびＨＢＶ−ＤＮ
Ａの生成混合物をＰｚｔｌエンドヌクレアーゼと保温し
ＤＮＡＮカリスを使用して再接合した。ｐＢＲ３２５お
よびＦＩＥＶ−ＤＮＡが共に一つのＰｚｔＬ位置な有す
るので全！ＩＥＶ−ＤＮＡをｐＢＲ３２５のＰｚｔ１位
置で挿入することができる。生成組換えプラスミドをｐ
Ｐｚｔ−７と称した。
）をまずＥｃｏＲＩ エンドヌクレアーゼで温浸し次
いで各反応に対して前述した条件下でＤＮＡリガースで
処理した。次いで円形ｐＥＲ３２５およびＨＢＶ−ＤＮ
Ａの生成混合物をＰｚｔｌエンドヌクレアーゼと保温し
ＤＮＡＮカリスを使用して再接合した。ｐＢＲ３２５お
よびＦＩＥＶ−ＤＮＡが共に一つのＰｚｔＬ位置な有す
るので全！ＩＥＶ−ＤＮＡをｐＢＲ３２５のＰｚｔ１位
置で挿入することができる。生成組換えプラスミドをｐ
Ｐｚｔ−７と称した。
実施例２
ｐＢａｍ３、ｐＥｃｏ−６３、ｐＢａｍ−１３２ｂよび
ｐＰｚｔＶ組換えプラスミドを転換細胞を増殖し、それ
からＤＮＡを分離し、そして臭化エチジウムの存在下平
衡密度勾配遠心分離によって組換えプラスミドＤＮＡか
ら宿主細胞ＤＮＡを分離することによって調製した。次
いで組換えプラスミドＤＮＡを各挿入位置く特異の限定
エンドヌクレアーゼで処理した。
ｐＰｚｔＶ組換えプラスミドを転換細胞を増殖し、それ
からＤＮＡを分離し、そして臭化エチジウムの存在下平
衡密度勾配遠心分離によって組換えプラスミドＤＮＡか
ら宿主細胞ＤＮＡを分離することによって調製した。次
いで組換えプラスミドＤＮＡを各挿入位置く特異の限定
エンドヌクレアーゼで処理した。
ＤＮＡなゲル電気泳動によって分別し、サウザン、Ｅｏ
Ｍ、 ／、 Ｊ／６１．Ｅｉｏ！、第９８巻、第５０３
頁（１９７５年）の方法例よって分析した。
Ｍ、 ／、 Ｊ／６１．Ｅｉｏ！、第９８巻、第５０３
頁（１９７５年）の方法例よって分析した。
サウザン法に卦いてＤＮＡをまずアガロースゲル７江気
泳動によって分別し次いでこの位置で変性しそしてニト
ロセルロースフィルターにゲルから直接移動した。従っ
てゲルのバンドパターンをニトロセルロースフィルター
上に複製する。変性したＤＮＡはニトロセルロースフィ
ルターに結合する。フィルター結合ＤＮＡを公知の元の
３２．−標示ＤＮＡとの混成によって固定する。ＥＩＢ
Ｖ−ＤＮＡクロンの場合にはデイン粒子からの３２Ｐ−
標示ＤＮＡを混成プローブとして使用した。結果を第２
図国示した。レーン１，２．３ｉ−よび４は各々ｐＥａ
ｏ−３、ｐＨｅａ−６３、ｐＥａｍ−１３２およびｐＰ
ｚｔ−７を示す。第２Ａ図（暗い面に鮮明な線）は混成
の前のＤＮＡのゲル電気泳動パターンを示す。各場合に
二つのバンドが見られ、臭化エチジウムで染色する螢光
によって可視が出来る。最上部のバンドはレーン１．２
および４の線状運搬仲介物ＤＮＡ、 ｐＥＲ３２５およ
びレーン３のｐＥＲ３２２であり、低部のバンドは推定
のＨＢＶ−ＤＮＡである。（小さい方のＤＮ、４断片は
図が示すように下方に移動する。）レーンＡはＨｉｎｅ
ＬＫ−処理バクチリアファージＤＮＡから調製した標準
である。
泳動によって分別し次いでこの位置で変性しそしてニト
ロセルロースフィルターにゲルから直接移動した。従っ
てゲルのバンドパターンをニトロセルロースフィルター
上に複製する。変性したＤＮＡはニトロセルロースフィ
ルターに結合する。フィルター結合ＤＮＡを公知の元の
３２．−標示ＤＮＡとの混成によって固定する。ＥＩＢ
Ｖ−ＤＮＡクロンの場合にはデイン粒子からの３２Ｐ−
標示ＤＮＡを混成プローブとして使用した。結果を第２
図国示した。レーン１，２．３ｉ−よび４は各々ｐＥａ
ｏ−３、ｐＨｅａ−６３、ｐＥａｍ−１３２およびｐＰ
ｚｔ−７を示す。第２Ａ図（暗い面に鮮明な線）は混成
の前のＤＮＡのゲル電気泳動パターンを示す。各場合に
二つのバンドが見られ、臭化エチジウムで染色する螢光
によって可視が出来る。最上部のバンドはレーン１．２
および４の線状運搬仲介物ＤＮＡ、 ｐＥＲ３２５およ
びレーン３のｐＥＲ３２２であり、低部のバンドは推定
のＨＢＶ−ＤＮＡである。（小さい方のＤＮ、４断片は
図が示すように下方に移動する。）レーンＡはＨｉｎｅ
ＬＫ−処理バクチリアファージＤＮＡから調製した標準
である。
第２Ｂ図は３２Ｐ−ＦＩＥＶ−ＤＮＡで混成後のニトロ
セルロースフィルターの自動レントゲン写真である。混
成りＮＡのバンドが各場合に推定のＥｒＢＶ−コロンＤ
ＮＡに相当すると観察され、一方極めて小ざな３２Ｐ−
ＤＨ，ｉがプラスミドＤＮＡバンドに混成したと観察さ
れる。
セルロースフィルターの自動レントゲン写真である。混
成りＮＡのバンドが各場合に推定のＥｒＢＶ−コロンＤ
ＮＡに相当すると観察され、一方極めて小ざな３２Ｐ−
ＤＨ，ｉがプラスミドＤＮＡバンドに混成したと観察さ
れる。
プラスミドに混成した３２Ｐ−ＤＮＡが、ＢＲ３２５で
わずかに感染したことがわかった。恐らくプラスミドバ
ンドで観察された程度の混成と評価する。この様に全で
の分校系を同定のために試験した。従って試験した四つ
のプラスミドはＩＩＢＶ−ＤＮＡを運ぶことを示した。
わずかに感染したことがわかった。恐らくプラスミドバ
ンドで観察された程度の混成と評価する。この様に全で
の分校系を同定のために試験した。従って試験した四つ
のプラスミドはＩＩＢＶ−ＤＮＡを運ぶことを示した。
Ｋ２Ｏ図はプローブとして独立してｙ４製した３２Ｐ−
標示デイン粒子ＤＮＡ試料を使用する独立した実験の結
果を示すものである。
標示デイン粒子ＤＮＡ試料を使用する独立した実験の結
果を示すものである。
レーン１はＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで温浸し臭化
エチジウム螢光染色（暗い面に鮮明なバンド）によって
可視化したｐＥｃｏ ６３を示す。レーン２は放射能写
真によって可視化した（明るい面に暗いバンド）、
Ｐ−標示デイン粒子ＤＮＡＫ対するレーン１のＤＮＡの
混成を示す。レーン３は入ＤＮＡのＥＩｉｎｔＬＭ温浸
によって調製した分子量標準を示す。レーン４はＢａｍ
ｆｌエンドヌクレアーゼで温浸したｐＢａ萬１３２ＤＮ
Ａを示す。レーン５は３２、−標示デイン粒子ＤＮ、ｌ
とレーン４ ＤＮＡのとの混成を示す。レーン６はＰＪ
Ｐｔ ｌエンドヌクレアーゼで温浸したｐＰｚｔ ７
ＤＮＡ を示す。そしてレーン７は３２Ｐ−標示デイ
ン粒子ＤＨ，４とレーン６ ＤＮＡの混成を示す。
エチジウム螢光染色（暗い面に鮮明なバンド）によって
可視化したｐＥｃｏ ６３を示す。レーン２は放射能写
真によって可視化した（明るい面に暗いバンド）、
Ｐ−標示デイン粒子ＤＮＡＫ対するレーン１のＤＮＡの
混成を示す。レーン３は入ＤＮＡのＥＩｉｎｔＬＭ温浸
によって調製した分子量標準を示す。レーン４はＢａｍ
ｆｌエンドヌクレアーゼで温浸したｐＢａ萬１３２ＤＮ
Ａを示す。レーン５は３２、−標示デイン粒子ＤＮ、ｌ
とレーン４ ＤＮＡのとの混成を示す。レーン６はＰＪ
Ｐｔ ｌエンドヌクレアーゼで温浸したｐＰｚｔ ７
ＤＮＡ を示す。そしてレーン７は３２Ｐ−標示デイ
ン粒子ＤＨ，４とレーン６ ＤＮＡの混成を示す。
実施例３
転写発現
組換え運搬仲介物によって転換した宿主細胞から分離し
たｍ ＲＡ’ Ａがウィルス性ＤＮＡで補充することを
示すととくよって転写発現を示した。ここで使用した実
験方法はアルウィン、／、 Ｃ，等Ｐｒｏｅ、にａｔ、
ＡａａｅＬ、Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ第７４巻、第５３
５０頁（１９７７年）である。アルウィン等の方法でゲ
ル電気泳動くよって分別したＲＮＡをゲルバンドパター
ンを保存固体相支持体に直接移動する。 Ｐ−標示Ｄ
ＮＡプローブに対する混成を固体相支持体上で実施する
。この方法は実施例２で記載した技術に類似しているが
ＲＮＩがニトロセルロースフィルターに結合しないので
詳細では異なるものである。アルウィンの方法ではジア
ゾベンジルオキシメチルＦ紙を電気泳動ゲルから移動し
たＲＮＡを結合するために使用する。ＲＮＡを結合した
後、誘導された紙を過剰のジアゾ基を３２Ｐ−標示プロ
ーブの非特異性結合を防ぐために加水分解処理する。
たｍ ＲＡ’ Ａがウィルス性ＤＮＡで補充することを
示すととくよって転写発現を示した。ここで使用した実
験方法はアルウィン、／、 Ｃ，等Ｐｒｏｅ、にａｔ、
ＡａａｅＬ、Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ第７４巻、第５３
５０頁（１９７７年）である。アルウィン等の方法でゲ
ル電気泳動くよって分別したＲＮＡをゲルバンドパター
ンを保存固体相支持体に直接移動する。 Ｐ−標示Ｄ
ＮＡプローブに対する混成を固体相支持体上で実施する
。この方法は実施例２で記載した技術に類似しているが
ＲＮＩがニトロセルロースフィルターに結合しないので
詳細では異なるものである。アルウィンの方法ではジア
ゾベンジルオキシメチルＦ紙を電気泳動ゲルから移動し
たＲＮＡを結合するために使用する。ＲＮＡを結合した
後、誘導された紙を過剰のジアゾ基を３２Ｐ−標示プロ
ーブの非特異性結合を防ぐために加水分解処理する。
この実施例において使用した標示Ｄ Ｈ，４プローブを
宿主菌株の増殖中３２Ｐで標示されたＦＡ’ｌ？６−３
またはｐＥｃｏ ６３ ＯＮ’を分枝した。
宿主菌株の増殖中３２Ｐで標示されたＦＡ’ｌ？６−３
またはｐＥｃｏ ６３ ＯＮ’を分枝した。
標示したプローブのｐＢＲ’３２５部分とそのｙｈ Ｒ
Ｎ Ａとの間の混成を除くため（標示されないｐＥＲ３
２５の５０倍量を混成混合液に添加した。
Ｎ Ａとの間の混成を除くため（標示されないｐＥＲ３
２５の５０倍量を混成混合液に添加した。
ＲＮＡを１００ｄバツ、チ中中間（ｔｎｉｒＬ−１ｏｇ
）工程相に生長したｐＥｅｏ−３、ｐＥｃｅｒ ６３
、ｐＢａｍ ６９、ｐＢａｍ １３２、ｐＰｚｔ ７
またはｐＢＲ３２５を運ぶ宿主細胞から分離した。
）工程相に生長したｐＥｅｏ−３、ｐＥｃｅｒ ６３
、ｐＢａｍ ６９、ｐＢａｍ １３２、ｐＰｚｔ ７
またはｐＢＲ３２５を運ぶ宿主細胞から分離した。
ＧＳＡローター（デュポンインスッルメント、ニュート
ン、コネチヵット）中で６００Ｏｒｐｍで１０分間遠心
分離で細胞を収集した。ペレットを１０＋ｘＪ／トリス
、ｐｌｉ７．６．５ｒＩＬＡｆ酢酸マグネシウムおよび
１０ ｒｇＭＫｃＬ中で再懸濁させ、次いで１〜リゾチ
ームを含有する管に移した。次いで細胞を急速冷凍し、
２．５−の１０％（、／、）ドデシル硫酸ナトリウムを
添加し、解凍して十分く混合した。酢酸ナトリウム、Ｉ
Ｊ／、ｐｌＪ５．２．０．２５ ｍを攪拌しながら添加
した。
ン、コネチヵット）中で６００Ｏｒｐｍで１０分間遠心
分離で細胞を収集した。ペレットを１０＋ｘＪ／トリス
、ｐｌｉ７．６．５ｒＩＬＡｆ酢酸マグネシウムおよび
１０ ｒｇＭＫｃＬ中で再懸濁させ、次いで１〜リゾチ
ームを含有する管に移した。次いで細胞を急速冷凍し、
２．５−の１０％（、／、）ドデシル硫酸ナトリウムを
添加し、解凍して十分く混合した。酢酸ナトリウム、Ｉ
Ｊ／、ｐｌＪ５．２．０．２５ ｍを攪拌しながら添加
した。
ＲＮＡを３７Ｃで３０分間断続的に混合するととくよっ
て水飽和フェノール２．５コで抽出した。水相を除去し
、新しい水飽和フェノールで再抽出し九。次いで水相を
エーテルで抽出した。５０００ ｒｐｍで５分間遠心分
離が相の分離に有効であった。界面のゴム状物質を放棄
した。ＲＮＡを５ＭＮαＣｔの％容量およびエタノール
２．５容量の添加で沈殿させ−２ＱＣで一晩培養した。
て水飽和フェノール２．５コで抽出した。水相を除去し
、新しい水飽和フェノールで再抽出し九。次いで水相を
エーテルで抽出した。５０００ ｒｐｍで５分間遠心分
離が相の分離に有効であった。界面のゴム状物質を放棄
した。ＲＮＡを５ＭＮαＣｔの％容量およびエタノール
２．５容量の添加で沈殿させ−２ＱＣで一晩培養した。
沈殿物を１０．０００ｒ７）１％で（Ｈ，、Ｂ４０−タ
ー、デュポンインスツルメント社、ニュータウン、コネ
チカット）−２０Ｃで２０分間遠心分離して収集し、エ
タノールで１回洗浄し次いでｌ Ｑ ｗｈＭ Ｆ’リス
、ｐＨ７，４，１薄ＭＥＤＴＡに再溶解した。溶液を１
１Ｂ４０−ターで１０．ＯＯＯｒ３ｍにおいてＯＣで１
０分間遠心分離しペレットを捨てた。
ー、デュポンインスツルメント社、ニュータウン、コネ
チカット）−２０Ｃで２０分間遠心分離して収集し、エ
タノールで１回洗浄し次いでｌ Ｑ ｗｈＭ Ｆ’リス
、ｐＨ７，４，１薄ＭＥＤＴＡに再溶解した。溶液を１
１Ｂ４０−ターで１０．ＯＯＯｒ３ｍにおいてＯＣで１
０分間遠心分離しペレットを捨てた。
上澄み溶液に４．５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６，８ｘｌを
添加し、−２００で８時間選択的にＲＮＡを沈殿した。
添加し、−２００で８時間選択的にＲＮＡを沈殿した。
沈殿物をＦＩＥ４０−ター中−２０Ｃで２０分間１０．
００ Ｏｒｐｗｇ で遠心分離することによって収集し
た。前述の沈殿は約７０′ｓのＩ）ＨＡを一般に除いた
。沈殿物を３．５ｔｘｔのトリス、１０ ｍＭ、 ｐ
ｕ ７．４．１ｍＭＥＤＴイ、ｎｚｌの酢酸ナトリウム
中に再懸ｇ４させ、再び沈殿チせた。最終ペレットを０
．４ｘｌのトリスＥＤＴＡ中に再懸渇妊せ冷凍貯蔵した
。
００ Ｏｒｐｗｇ で遠心分離することによって収集し
た。前述の沈殿は約７０′ｓのＩ）ＨＡを一般に除いた
。沈殿物を３．５ｔｘｔのトリス、１０ ｍＭ、 ｐ
ｕ ７．４．１ｍＭＥＤＴイ、ｎｚｌの酢酸ナトリウム
中に再懸ｇ４させ、再び沈殿チせた。最終ペレットを０
．４ｘｌのトリスＥＤＴＡ中に再懸渇妊せ冷凍貯蔵した
。
前述の通り調製し７たＲ ＮＡをレーンに対してｌＯμ
ｆＲＮＡ を使用するアルウィン等によって記述された
通り混成分析のためにゲル電気泳動によって分別した。
ｆＲＮＡ を使用するアルウィン等によって記述された
通り混成分析のためにゲル電気泳動によって分別した。
結果を第３図に示ス。第３Ａ図は螢光染色によって可視
化されるようにゲル電気泳動結果を示すものである。い
ずれの場合も二つの主要なＲＮＡバンドが１６５によび
２３５リボゾームＲにＡに相当すると見られる。第３Ｂ
図は各々のゲル中でＲＮＡに混成できるｐＥｃｅｓ ６
３、ｌＱ”ｅ７＋ｎ／μ２から３２ｐ−ｇｒｙ−Ｚ）／
／、（ｏ自動レント’ｆン写真を示すものである。レー
ン１〜６は次のプラスミドで感染した細胞から抽出し九
ＲＮイでの結果を示すものである。レーン１はｐＥａｔ
ｘ−６９、レーン２はｐＢＥ ３２５、レーン３はｐＰ
ｚｔ−７、レーン４はｐＥｃｏ ６３、レーン５はｐ
Ｅ ｃ ｏ −３、レーン６はｐＢａｒｎ １３２
を示す。レーンＡおよびレーンＢは各々精製したバクテ
リアファージＭＳ−２ＲＮＡおよび大腸菌リボゾームＲ
ＮＡの標準である。
化されるようにゲル電気泳動結果を示すものである。い
ずれの場合も二つの主要なＲＮＡバンドが１６５によび
２３５リボゾームＲにＡに相当すると見られる。第３Ｂ
図は各々のゲル中でＲＮＡに混成できるｐＥｃｅｓ ６
３、ｌＱ”ｅ７＋ｎ／μ２から３２ｐ−ｇｒｙ−Ｚ）／
／、（ｏ自動レント’ｆン写真を示すものである。レー
ン１〜６は次のプラスミドで感染した細胞から抽出し九
ＲＮイでの結果を示すものである。レーン１はｐＥａｔ
ｘ−６９、レーン２はｐＢＥ ３２５、レーン３はｐＰ
ｚｔ−７、レーン４はｐＥｃｏ ６３、レーン５はｐ
Ｅ ｃ ｏ −３、レーン６はｐＢａｒｎ １３２
を示す。レーンＡおよびレーンＢは各々精製したバクテ
リアファージＭＳ−２ＲＮＡおよび大腸菌リボゾームＲ
ＮＡの標準である。
混成物質は各場合に見出でれ、混成範囲は組換えプラス
ミドの場合に大きい方が重要であることがわかる。ざら
にその上混成物質の大きさに比べて、大なる分校ｐ Ｅ
ｅ ｏ −６３およびｐＥｃａ ３がより広範囲のＲ
ＮＡの大きさくそしてより短い挿入、ＰＨ６購−６９お
よびｐｌａｎ １３２がするよりもさらに長い最大の長
さのＲＮ Ａ ＆ｃ上昇を与えるととが見られる。
ミドの場合に大きい方が重要であることがわかる。ざら
にその上混成物質の大きさに比べて、大なる分校ｐ Ｅ
ｅ ｏ −６３およびｐＥｃａ ３がより広範囲のＲ
ＮＡの大きさくそしてより短い挿入、ＰＨ６購−６９お
よびｐｌａｎ １３２がするよりもさらに長い最大の長
さのＲＮ Ａ ＆ｃ上昇を与えるととが見られる。
前述のデータから分枝ＨＥＶ−ＤＮＡの転写表現が大腸
菌に生じることが明らかである。
菌に生じることが明らかである。
実施例４
ＨＢＶ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
全ＦＩＢＶゲノムの配列を実施例ＩＫ記載したプラスミ
ドｐＥｃａ−３、ｐＥｃｅ−６３”＆たけｐＰｚｔ ７
に運ばれた分枝ＨＥＶ−ＤＮＡから得た。それはマキサ
ム１．（、ｉ−よびギルベルト、Ｆ、 Ｐｒａａ、 Ｍ
ａｔ、 、イｅａｒＬ、 Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ ｇ
７４巻、第５６０頁（１９７７年）の方法によって得た
。表ＩＫ配列を示した。配列なＥｃａＲＩ分割位置で始
まる線状配列のように’Ｆいている。
ドｐＥｃａ−３、ｐＥｃｅ−６３”＆たけｐＰｚｔ ７
に運ばれた分枝ＨＥＶ−ＤＮＡから得た。それはマキサ
ム１．（、ｉ−よびギルベルト、Ｆ、 Ｐｒａａ、 Ｍ
ａｔ、 、イｅａｒＬ、 Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ ｇ
７４巻、第５６０頁（１９７７年）の方法によって得た
。表ＩＫ配列を示した。配列なＥｃａＲＩ分割位置で始
まる線状配列のように’Ｆいている。
両成分の配列を示し、各線の上部配列を５′から３′ま
で左から右に読まれ、低（補充）配列は３′から５′壕
で左から右に読まれる。
で左から右に読まれ、低（補充）配列は３′から５′壕
で左から右に読まれる。
使用した略号はデオキシヌクレオチド配列のベースを示
し、アデニンに対してはＡ１チミーンに対してはＴ１グ
アニンに対してはＧｂよびシトシンに対してはＣを示す
。
し、アデニンに対してはＡ１チミーンに対してはＴ１グ
アニンに対してはＧｂよびシトシンに対してはＣを示す
。
実施例５
ＨＥＶ−ＤＮＡのヌクレオチド配列をベース圧して実施
例４で定量した通υ、Ｓ−蛋白質に対してコードしてい
る配列位置ｇ Ｂ ｚ Ａ Ｆの免疫学的に有効な蛋白
質成分は上記ビーターラン、Ｄ、 Ｌ、等（１９７８年
）から知られている。約１，１０９ ｈｐ長さの小さい
方の５ａｎＬｅｒ 断片は蛋白質成分のＮ−末端１９ア
ミノ酸に類似の配列に対してコードしているヌクレオチ
ド配列を含有することが見出されそしてまた同様の三つ
のＣ−末端アミノ酸に対してＮ−末端配列を有する相に
卦いて正にＴＡＡ末端フドコド先立ってコードするビー
ターランによって記載された。この配列によつてエンコ
ードされた蛋白質は、２２６のアミノ酸の長さで２５，
３９８の分子量を有しゲリン、Ｊ−Ｌ、およびＳｋｉ
、 Ｊ、 Ｆ、 Ｋによってまたは上記ピーターラン等
（１９７８年）Ｋよって分離し九ＨＢｚＡタ の他の蛋
白質成分のドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動で定−
！にされた物質（２２，０００〜２４，０００ ）とよ
く一致している。ここで記載した２２６アミノ酸蛋白質
をＳ蛋白質と称す。参考のために配列をコードしている
Ｓ蛋白質の読みとり構成物を構成物１と称す。構成物２
および３を各々１およびヌクレオチドの方に移動する。
例４で定量した通υ、Ｓ−蛋白質に対してコードしてい
る配列位置ｇ Ｂ ｚ Ａ Ｆの免疫学的に有効な蛋白
質成分は上記ビーターラン、Ｄ、 Ｌ、等（１９７８年
）から知られている。約１，１０９ ｈｐ長さの小さい
方の５ａｎＬｅｒ 断片は蛋白質成分のＮ−末端１９ア
ミノ酸に類似の配列に対してコードしているヌクレオチ
ド配列を含有することが見出されそしてまた同様の三つ
のＣ−末端アミノ酸に対してＮ−末端配列を有する相に
卦いて正にＴＡＡ末端フドコド先立ってコードするビー
ターランによって記載された。この配列によつてエンコ
ードされた蛋白質は、２２６のアミノ酸の長さで２５，
３９８の分子量を有しゲリン、Ｊ−Ｌ、およびＳｋｉ
、 Ｊ、 Ｆ、 Ｋによってまたは上記ピーターラン等
（１９７８年）Ｋよって分離し九ＨＢｚＡタ の他の蛋
白質成分のドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動で定−
！にされた物質（２２，０００〜２４，０００ ）とよ
く一致している。ここで記載した２２６アミノ酸蛋白質
をＳ蛋白質と称す。参考のために配列をコードしている
Ｓ蛋白質の読みとり構成物を構成物１と称す。構成物２
および３を各々１およびヌクレオチドの方に移動する。
配列をコードしているＳ蛋白質の最初の９ヌクレオチド
に基づく次の図式で関係を説明する。
に基づく次の図式で関係を説明する。
ヌクレオチド配列から予想されるＳ蛋白質のアミノ酸組
成物は上記ビーターラン等（１９７８年）Ｋよって記載
され九ＨＢ ＪＦ Ａ ｆの蛋白質成分として報告され
たものと極めて一致している。しかしながらＮ−末端ア
ミノ酸配列はセリンの代りＫ１５の位置にロイシン残渣
を有することＫよって前に報告したものと異なる。領域
をコードしているＳ蛋白質の地図位置を第４図に示す。
成物は上記ビーターラン等（１９７８年）Ｋよって記載
され九ＨＢ ＪＦ Ａ ｆの蛋白質成分として報告され
たものと極めて一致している。しかしながらＮ−末端ア
ミノ酸配列はセリンの代りＫ１５の位置にロイシン残渣
を有することＫよって前に報告したものと異なる。領域
をコードしているＳ蛋白質の地図位置を第４図に示す。
真核生物遺伝子、ロバートラン、Ｍ、Ｓ、等、ネイチュ
ア第２７８巻、第３７０頁（１９７９年）の中間配列の
優勢の為、蛋白質生成物のアミノ酸配列を有する遺伝子
のコリネアリティ（ｅａｌｉｎａａｒｉｔｙ ）を推定
することは不可能である。しかしながらＳ蛋白質遺伝子
中の中間配列の証明はない。それはＤＮＡ配列によって
予想される分子が表面抗原の免疫学的に有効な成分の特
徴に近似しているからである。
ア第２７８巻、第３７０頁（１９７９年）の中間配列の
優勢の為、蛋白質生成物のアミノ酸配列を有する遺伝子
のコリネアリティ（ｅａｌｉｎａａｒｉｔｙ ）を推定
することは不可能である。しかしながらＳ蛋白質遺伝子
中の中間配列の証明はない。それはＤＮＡ配列によって
予想される分子が表面抗原の免疫学的に有効な成分の特
徴に近似しているからである。
あらゆる中間配列が小さく （１５０以下のベース）構
造遺伝子のほとんどの中間配列は長い。分子のＮ−末端
およびＣ−末端の末端は相中にあり、従ってあらゆる中
間配列もまた相を維持しなければならない。それ故結論
として同定したＳ蛋白質のコード領域がｍＲＮＡとコリ
ニア （ｃａｌｉｔｓａａｒ）であると判断される。
造遺伝子のほとんどの中間配列は長い。分子のＮ−末端
およびＣ−末端の末端は相中にあり、従ってあらゆる中
間配列もまた相を維持しなければならない。それ故結論
として同定したＳ蛋白質のコード領域がｍＲＮＡとコリ
ニア （ｃａｌｉｔｓａａｒ）であると判断される。
ＤＮＡヌクレオチド配列に基づくＳ−蛋白質の完全なア
ミノ酸配列を表２に示す。蛋白質化学において使用され
る標準略記をアミノ酸を表わすのく使用する。Ｓ−蛋白
質に対して同定される出発点は表２中のヌクレオチド１
５６４〜１５６６によってコードされたメチオニン残基
である。Ｍ４図および表２中に示した通りＳ−蛋白質コ
ード領域はヌクレオチド１０４２〜１０４４によってコ
ードされたメチオニン次にヌクレオチド１０７５〜１０
７７またはヌクレオチド１３９９〜１４０１によってコ
ードされたメチオニンに始まるアミノ酸の付加Ｎ−末端
配列に対して実質的なコード領域を包含する。これらの
領域によってコードされた蛋白質はＥ Ｂ ｒの成分と
して認められなかった。しかしながらかかる蛋白質は感
染方法でまだ未知としての生物学作用の役目をすること
ができる。さらに記載した出発点から開始した蛋白質は
ヌクレオチド配列を自然に生じることによってコードぐ
れ九Ｎ−末端アミノ酸配列を有する有用なＳ−蛋白質誘
導体であり、Ｓ−蛋白質自体よυ分子量が大きくそして
高い抗原性を有する。
ミノ酸配列を表２に示す。蛋白質化学において使用され
る標準略記をアミノ酸を表わすのく使用する。Ｓ−蛋白
質に対して同定される出発点は表２中のヌクレオチド１
５６４〜１５６６によってコードされたメチオニン残基
である。Ｍ４図および表２中に示した通りＳ−蛋白質コ
ード領域はヌクレオチド１０４２〜１０４４によってコ
ードされたメチオニン次にヌクレオチド１０７５〜１０
７７またはヌクレオチド１３９９〜１４０１によってコ
ードされたメチオニンに始まるアミノ酸の付加Ｎ−末端
配列に対して実質的なコード領域を包含する。これらの
領域によってコードされた蛋白質はＥ Ｂ ｒの成分と
して認められなかった。しかしながらかかる蛋白質は感
染方法でまだ未知としての生物学作用の役目をすること
ができる。さらに記載した出発点から開始した蛋白質は
ヌクレオチド配列を自然に生じることによってコードぐ
れ九Ｎ−末端アミノ酸配列を有する有用なＳ−蛋白質誘
導体であり、Ｓ−蛋白質自体よυ分子量が大きくそして
高い抗原性を有する。
これらのＳ−ペプチド類似物は免疫および検出目的に対
してＳ−蛋白質に対して向けられた抗体を引出すのに有
用である。
してＳ−蛋白質に対して向けられた抗体を引出すのに有
用である。
Ｓ−蛋白質コード領域の両端の近くに位置した二つのＴ
α、Ｉ限定位置がある。小ざい方のＢａｍＥＩＩ断片を
鈍感な末端を与えるためＴｅ１ｅ Ｔエンドヌクレアー
ゼで処理した。
α、Ｉ限定位置がある。小ざい方のＢａｍＥＩＩ断片を
鈍感な末端を与えるためＴｅ１ｅ Ｔエンドヌクレアー
ゼで処理した。
ＥＩｉｔｓｔＬ＊結鎖を鈍感な末語録紮によってＴａｃ
Ｉ断片の鈍感な末端に付けた〔スギノ、１６等、ムＥ
ｉｏ１．Ｃｈｕｍ、第２５２巻、第３９８７頁（１９７
７年）〕。次いで断片をプラスミドｐｔｒｐ ＥＤ５０
から誘導された〔マーシアル、！１等、科学、第２
０５巻（１９７９年〕〕表示プラスミドｐｔｒｐＥ ３
０に挿入した。プラスミドｐｔｒｐＥ ３０は技術者、
助触媒減衰器およびトげブトファンオペロンの配列を結
合するりボゾームを通常の翻訳の方向にｌｌｉ％ｄ１位
置によってＭ （ｔｒｐ Ｅ蛋白質の７アミノ酸に対し
てフードしているヌクレオチド配列を伴って含有する。
Ｉ断片の鈍感な末端に付けた〔スギノ、１６等、ムＥ
ｉｏ１．Ｃｈｕｍ、第２５２巻、第３９８７頁（１９７
７年）〕。次いで断片をプラスミドｐｔｒｐ ＥＤ５０
から誘導された〔マーシアル、！１等、科学、第２
０５巻（１９７９年〕〕表示プラスミドｐｔｒｐＥ ３
０に挿入した。プラスミドｐｔｒｐＥ ３０は技術者、
助触媒減衰器およびトげブトファンオペロンの配列を結
合するりボゾームを通常の翻訳の方向にｌｌｉ％ｄ１位
置によってＭ （ｔｒｐ Ｅ蛋白質の７アミノ酸に対し
てフードしているヌクレオチド配列を伴って含有する。
このプラスミドをＨｉｎｄＮ位置の挿入の際に５蛋白質
の表示に適合する公知の読み枠を与えるのに便利に使用
した。
の表示に適合する公知の読み枠を与えるのに便利に使用
した。
表示プラスミドｐｔｒｐＥ３０をＩＩｉ」ｄＫエンドヌ
クレアーゼで前処理した。次いで処理したＳ−蛋白質を
コードしている断片を接合反応に触媒作用を及ぼすＤＮ
Ａリガーゼによって処理したプラスミドに挿入した。ｐ
ｔｒｐＥ３０のＩＩｉｎｒｌｇ 位置は挿入したＳ−蛋
白質をコードしている配列を有する相中の読み枠を与え
る配列データから知られる。大腸菌ＥＩＢ１０１の転換
はトリプトファンオペロン制御下でｔｒｐＥｓ蛋白質融
合蛋白質の表示だ導きそして次に記載する通りβ−イン
ドリルアクリル酸で誘導することができる。この苗株を
大腸菌ＨＢ１０１／Ｐｉτｐ Ａ’ ３０ ＨＥ ｚ
Ａ ｆと称した。
クレアーゼで前処理した。次いで処理したＳ−蛋白質を
コードしている断片を接合反応に触媒作用を及ぼすＤＮ
Ａリガーゼによって処理したプラスミドに挿入した。ｐ
ｔｒｐＥ３０のＩＩｉｎｒｌｇ 位置は挿入したＳ−蛋
白質をコードしている配列を有する相中の読み枠を与え
る配列データから知られる。大腸菌ＥＩＢ１０１の転換
はトリプトファンオペロン制御下でｔｒｐＥｓ蛋白質融
合蛋白質の表示だ導きそして次に記載する通りβ−イン
ドリルアクリル酸で誘導することができる。この苗株を
大腸菌ＨＢ１０１／Ｐｉτｐ Ａ’ ３０ ＨＥ ｚ
Ａ ｆと称した。
ｐｔｒｐＥ３０／ｇＢｚＡ？によって転換された細菌細
胞をロイシン、プロリン、ビタミンＥｌ ｂよびアムビ
シリンで補充した標準最小培地（Ｍｅ）中３７Ｃで増殖
した。初期のログ相でｔｒｐオペロンをβ−インドリル
アクリル酸（培地ｔｘｔ当り３０μ？ ）の添加によっ
て誘導した。コントロール培養は誘導しないままにした
。３時間以上の増殖後、細胞１．５ｄを２０μＣ：３５
５−Ｌ−メチオニンの添加および１０分間温浸して放射
性を標示した。次に細胞を遠心分離によって収集し洗浄
してそして０．０６２５ Ｍ ）−リスｐＨ６，８中グ
リコ一ル１０％（、／Ｉ＋）、β−メルカプトエタノー
ル５％（ｙ／ｙ）ＴｈよびＳ Ｄ Ｓ ２．３％（、／
、）を含有する緩衝液２５０μを中に再懸濁した。
胞をロイシン、プロリン、ビタミンＥｌ ｂよびアムビ
シリンで補充した標準最小培地（Ｍｅ）中３７Ｃで増殖
した。初期のログ相でｔｒｐオペロンをβ−インドリル
アクリル酸（培地ｔｘｔ当り３０μ？ ）の添加によっ
て誘導した。コントロール培養は誘導しないままにした
。３時間以上の増殖後、細胞１．５ｄを２０μＣ：３５
５−Ｌ−メチオニンの添加および１０分間温浸して放射
性を標示した。次に細胞を遠心分離によって収集し洗浄
してそして０．０６２５ Ｍ ）−リスｐＨ６，８中グ
リコ一ル１０％（、／Ｉ＋）、β−メルカプトエタノー
ル５％（ｙ／ｙ）ＴｈよびＳ Ｄ Ｓ ２．３％（、／
、）を含有する緩衝液２５０μを中に再懸濁した。
懸濁液を５分間沸騰させ、次いで１０頭（ｗ／ｖ） Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用しセして区気泳
動で分別した。蛋白質バンドが放射能写真によって可視
化された。結果を第５図に示す。
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用しセして区気泳
動で分別した。蛋白質バンドが放射能写真によって可視
化された。結果を第５図に示す。
転換されたＥＢ１０１ｐｔｒｐＥ３０／ｆｌＢｐＡ９の
個々の分離物を各々Ｐ１２６、ｐ１３５、Ｐ１４６、Ｆ
１５０１ Ｐ１５５＞よびｐ １６６と称した。誘導し
たおよび誘導されない培養の蛋白質を並行して各々例え
ばｐ １２６ ｉｎｄまたはＰ１２６を標示した対照と
して示す。
個々の分離物を各々Ｐ１２６、ｐ１３５、Ｐ１４６、Ｆ
１５０１ Ｐ１５５＞よびｐ １６６と称した。誘導し
たおよび誘導されない培養の蛋白質を並行して各々例え
ばｐ １２６ ｉｎｄまたはＰ１２６を標示した対照と
して示す。
標準は挿入物のないｐｔｒｐ Ｅ ３０で転換した細胞
訃ヨヒ各り分子ｆｌ （Ｊ／、Ｆ、 ） ６９，０００
（％６９ｒ＃）、４３．０００ （％ ４３ Ｋ Ｉ）
、３０．０００（％３０に＃）ｂよび１４，３００ （
’１４．３Ｋｚ）を有する牛の血清アルブミン、オバル
ビン、炭酸脱水酵素、およびリゾチームである公知の大
きざの混合物または蛋白質を包含する。
訃ヨヒ各り分子ｆｌ （Ｊ／、Ｆ、 ） ６９，０００
（％６９ｒ＃）、４３．０００ （％ ４３ Ｋ Ｉ）
、３０．０００（％３０に＃）ｂよび１４，３００ （
’１４．３Ｋｚ）を有する牛の血清アルブミン、オバル
ビン、炭酸脱水酵素、およびリゾチームである公知の大
きざの混合物または蛋白質を包含する。
ｔ ｒ ｐ Ｅ −５蛋白質融合蛋白質の表示を誘導さ
れた培養に独特な、分子、量的２７．０００を有する蛋
白質の第５図中に小ざな矢で示したバンドの出現によっ
て示した。１ｒｐＥ−５蛋白質融合生成物の計算分子量
は２７，４５８である。融合蛋白質はｔｒｐＥ蛋白質の
Ｎ−終点から７アミノ酸およびｇｉｎｃＬ＊結鎖シよび
語録ａ １位置とＳ−蛋白質コード領域の開始の間に−
あるヌクレオチドによってコード堰れた１２アミノ酸を
包含する。融合蛋白質のアミノ酸配列はＭｅ ｈＧｌｔ
ｓ −Ｔ Ａ ｒ−ＧムーＬｙＪＰ−Ｐｒｏ −Ｔｋｒ
−Ｐｒｙ Ｓｉｒ Ｌｇｕ −Ａｌａ−１ｒｆ−Ｔｈｒ
−にｔｙ −Ａｚ ｐ−Ｐｒ ６−Ｖａ ｌ−７’Ａ
ｒ−Ａｔ ｎ−５であり、ＳはＳ−蛋白質のアミノ酸配
列を表わす。
れた培養に独特な、分子、量的２７．０００を有する蛋
白質の第５図中に小ざな矢で示したバンドの出現によっ
て示した。１ｒｐＥ−５蛋白質融合生成物の計算分子量
は２７，４５８である。融合蛋白質はｔｒｐＥ蛋白質の
Ｎ−終点から７アミノ酸およびｇｉｎｃＬ＊結鎖シよび
語録ａ １位置とＳ−蛋白質コード領域の開始の間に−
あるヌクレオチドによってコード堰れた１２アミノ酸を
包含する。融合蛋白質のアミノ酸配列はＭｅ ｈＧｌｔ
ｓ −Ｔ Ａ ｒ−ＧムーＬｙＪＰ−Ｐｒｏ −Ｔｋｒ
−Ｐｒｙ Ｓｉｒ Ｌｇｕ −Ａｌａ−１ｒｆ−Ｔｈｒ
−にｔｙ −Ａｚ ｐ−Ｐｒ ６−Ｖａ ｌ−７’Ａ
ｒ−Ａｔ ｎ−５であり、ＳはＳ−蛋白質のアミノ酸配
列を表わす。
Ｓ−蛋白質コード領域の表示なＨＢｚＡりに対する抗体
で免疫化学反応性によって、標示されたＨＩ３ｚＡ？で
競合放射線免疫検定において（Ａｖｓｎｒｉ、商標アボ
ットラボラトリーノースシカゴイリノイ州）検出した。
で免疫化学反応性によって、標示されたＨＩ３ｚＡ？で
競合放射線免疫検定において（Ａｖｓｎｒｉ、商標アボ
ットラボラトリーノースシカゴイリノイ州）検出した。
また表示を免疫法ＲＫよって検出する。大腸菌ＦＩＢ１
０１／ｐｄデｐＥ３０−ＨＥｔＡりの培養をβ−インド
リルアクリル酸で誘導し、１３コ試料パルスを２μＣｉ
の１４Ｃ−標示アミノ酸または３５ｓ−メチオニンで
一定時間誘導後種々の間隔で標示する。０および４時間
誘導された培養からの試料をマーシャル、／、 Ａ、等
Ｐｒａｙ、 Ｍａｔ、 Ａｃａｄ。
０１／ｐｄデｐＥ３０−ＨＥｔＡりの培養をβ−インド
リルアクリル酸で誘導し、１３コ試料パルスを２μＣｉ
の１４Ｃ−標示アミノ酸または３５ｓ−メチオニンで
一定時間誘導後種々の間隔で標示する。０および４時間
誘導された培養からの試料をマーシャル、／、 Ａ、等
Ｐｒａｙ、 Ｍａｔ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ第７４巻、第１８１６頁（１９７７年）
に記載した通り抗原抗体コンプレックスを収集するため
にホルムアルデヒド処理スタフイロコツ力スオーレウス
を使用してＨＢｚＡｆＫ対して抗体と反応後、免疫沈殿
する。沈殿した蛋白質を８％しそしてＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル中で電気泳動によって分別する。
に記載した通り抗原抗体コンプレックスを収集するため
にホルムアルデヒド処理スタフイロコツ力スオーレウス
を使用してＨＢｚＡｆＫ対して抗体と反応後、免疫沈殿
する。沈殿した蛋白質を８％しそしてＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル中で電気泳動によって分別する。
結果は免疫沈殿出来る蛋白質が誘導後のみ実質量で出現
しトリプトファンオペロン制御下でＳ−蛋白質コード領
域の表示を確証しセしてＨＢｚＡりに対して抗体でＳ−
蛋白質の免疫牛皮・応性な確証することを示す。個々の
細菌集落によるＳ−蛋白質の表示をブルーム、Ｓおよび
ギルバー Ｆ、 Ｐｒｏｅ＊ Ｎａｔ、 ＡｃａｃＬ、
Ｓｅｉ。
しトリプトファンオペロン制御下でＳ−蛋白質コード領
域の表示を確証しセしてＨＢｚＡりに対して抗体でＳ−
蛋白質の免疫牛皮・応性な確証することを示す。個々の
細菌集落によるＳ−蛋白質の表示をブルーム、Ｓおよび
ギルバー Ｆ、 Ｐｒｏｅ＊ Ｎａｔ、 ＡｃａｃＬ、
Ｓｅｉ。
ＵＳＡ第７５巻、第３７２７頁（１９７８年）のポリビ
ニル円板法の変性によって検出する。
ニル円板法の変性によって検出する。
十分に洗浄したポリビニル円板を未標示のＩｙＧの溶液
Ｋ（この場合ＨＢ ＪＦ Ａ ｔｉｃ対する抗体からな
る） Ｏ−２Ｍ Ｎ ａ ＥＣＯｓ 中１０〜６０μ
２／ｄ 濃度、ｐ）１９．２で３分間浮かべる。次いで
円板を洗浄緩衝液中で（１０ツ／ｄゼラチン、１％血清
（ヒト、ウサギまたはギネア豚）０．１％ｙｐ４ｏ、０
．０２％Ｎ ａ Ｋｇのリン酸塩緩衝塩中）２回洗浄す
る。円板を次いで溶解した細菌集落または寒天に吸収し
た小さな液体試料を含有する寒天板に適用する。細菌集
落の溶解を三つの方法のいずれか一つで達成することが
できる。
Ｋ（この場合ＨＢ ＪＦ Ａ ｔｉｃ対する抗体からな
る） Ｏ−２Ｍ Ｎ ａ ＥＣＯｓ 中１０〜６０μ
２／ｄ 濃度、ｐ）１９．２で３分間浮かべる。次いで
円板を洗浄緩衝液中で（１０ツ／ｄゼラチン、１％血清
（ヒト、ウサギまたはギネア豚）０．１％ｙｐ４ｏ、０
．０２％Ｎ ａ Ｋｇのリン酸塩緩衝塩中）２回洗浄す
る。円板を次いで溶解した細菌集落または寒天に吸収し
た小さな液体試料を含有する寒天板に適用する。細菌集
落の溶解を三つの方法のいずれか一つで達成することが
できる。
１）乾燥話中で１０〜２０分間ｃｇα３に露出する
２）リゾチーム、ＥＤＴＡおよびトリス−ＥＩαｐｕ
９を含有する寒天板に細菌集落を移動する。
９を含有する寒天板に細菌集落を移動する。
３） リゾチーム、ｇｏｒＡ、）−リス−ｇα、１０％
洗浄緩衝液および１％アガロース溶液と共に集落を含有
する寒天板を置く。重塁を固化した後、被覆したポリビ
ニル円板を直接に適用することができる。
洗浄緩衝液および１％アガロース溶液と共に集落を含有
する寒天板を置く。重塁を固化した後、被覆したポリビ
ニル円板を直接に適用することができる。
三方法はすべて同様の感受性を有するようである。重塁
技術は溶解操作後陽性集落から細菌を回収することがで
きる利点を有する。
技術は溶解操作後陽性集落から細菌を回収することがで
きる利点を有する。
４Ｃで１〜４時間温浸した後、ポリビニル円板を再び洗
浄緩衝液中で２回洗浄する。現在ポリビニル円板を４０
で一晩洗浄緩衝液（２×１０＠ｅｐｄｌ中１２５、−．
２Ｇ（抗−１１ＢｐＡｙ） ２Ｘ／で温浸する。ポリ
ビニル円板を個々に１５分間洗浄緩衝液中４２Ｃで２回
洗浄し、次いで室温で蒸留水中２゛回洗浄する。
浄緩衝液中で２回洗浄する。現在ポリビニル円板を４０
で一晩洗浄緩衝液（２×１０＠ｅｐｄｌ中１２５、−．
２Ｇ（抗−１１ＢｐＡｙ） ２Ｘ／で温浸する。ポリ
ビニル円板を個々に１５分間洗浄緩衝液中４２Ｃで２回
洗浄し、次いで室温で蒸留水中２゛回洗浄する。
次いで円板を−７００に１８〜４８時間Ｘ−線フイルム
ブイ出する。抗原を有する区域は現像したＸ−線ブイ、
ルム上に暗点として現われる。抗原を有する集落をＳ−
ｉ白質コード領域を表示するものとして同定する。培養
を大規模ＶＣ５−蛋白質を生産する目的で選択した集落
から増殖する。ｔｒｐＥ Ｓ蛋白質融合生成物をゲル
濾過および親和クロマトグラフィを包含する普通の手段
で（細胞）溶解質から精製する。
ブイ出する。抗原を有する区域は現像したＸ−線ブイ、
ルム上に暗点として現われる。抗原を有する集落をＳ−
ｉ白質コード領域を表示するものとして同定する。培養
を大規模ＶＣ５−蛋白質を生産する目的で選択した集落
から増殖する。ｔｒｐＥ Ｓ蛋白質融合生成物をゲル
濾過および親和クロマトグラフィを包含する普通の手段
で（細胞）溶解質から精製する。
実施例６
実施例５の表示生成物はＳ−蛋白質およびｔｒｐＥ蛋白
質１初に一終点から７アミノ酸）、Ｅｌ ｉ ＋ｓ ｔ
Ｌ璽結語録次３アミノ酸）シよびＴａＩ−Ｉ位置とＳ−
蛋白質を開始するメチオニンの間のＨＢＶゲノムの一部
（９アミノ酸）から誘導ぢれる１９アミノ酸Ｎ−末端配
列からなる融合蛋白質である。ヒトのワクチン注射を含
む多くの適用に対して、表２に示した通り、Ｓ−蛋白質
自体の合成または性質でコードした誘導体の−の合成を
達成することが好ましい。エクソペプチダーゼ（アミノ
ペプチダーゼ）で限定した処理によって１９アミノ酸Ｎ
−末端配列を除去することが可能であるがＳ−蛋白質の
生産は低いことが予想される。
質１初に一終点から７アミノ酸）、Ｅｌ ｉ ＋ｓ ｔ
Ｌ璽結語録次３アミノ酸）シよびＴａＩ−Ｉ位置とＳ−
蛋白質を開始するメチオニンの間のＨＢＶゲノムの一部
（９アミノ酸）から誘導ぢれる１９アミノ酸Ｎ−末端配
列からなる融合蛋白質である。ヒトのワクチン注射を含
む多くの適用に対して、表２に示した通り、Ｓ−蛋白質
自体の合成または性質でコードした誘導体の−の合成を
達成することが好ましい。エクソペプチダーゼ（アミノ
ペプチダーゼ）で限定した処理によって１９アミノ酸Ｎ
−末端配列を除去することが可能であるがＳ−蛋白質の
生産は低いことが予想される。
Ｓ−蛋白質自体の表示を融合蛋白質の宿主部分に対して
コードして、いるヌクレオチドを形成物から除去しセし
てＳ−蛋白質組織遺伝子の出発コドンに先立つ後者のあ
らゆるヌクレオチドから除去するために表示プラスミド
およびＳ−蛋白質コード断片の両方を変性することによ
って達成することができる。あらゆる表示プラスミドを
好ましくはｐｔｒｐ Ｅ３０またはｐＥＦＩ２０（イタ
クラ等、科学第１９８巻、第１０５６頁（１９７７年）
のような翻訳のはじまりに近い挿入位置を有するものを
使用することができる。
コードして、いるヌクレオチドを形成物から除去しセし
てＳ−蛋白質組織遺伝子の出発コドンに先立つ後者のあ
らゆるヌクレオチドから除去するために表示プラスミド
およびＳ−蛋白質コード断片の両方を変性することによ
って達成することができる。あらゆる表示プラスミドを
好ましくはｐｔｒｐ Ｅ３０またはｐＥＦＩ２０（イタ
クラ等、科学第１９８巻、第１０５６頁（１９７７年）
のような翻訳のはじまりに近い挿入位置を有するものを
使用することができる。
短いヌクレオチドセグメントを除去する処理をエキソヌ
クレオチック（ａｘｏｎｕｅｌｇｏｌｙｔｉｃ）酵素を
使用して達成する。好ましい酵素はＴ４ポリメラーゼで
あり、添加したデオキシヌクレオチドトリフオスフェー
トなしで二重成分ＤＮＡのエキソヌクレオチック（１＆
６−ｎｕｃｌａｏｌｙｔｉｃ ）消化を３′〜５′接触
作用を及ぼす（イングランド、Ｐ、 Ｔ、 、／、 Ｅ
ｉｏｌ。
クレオチック（ａｘｏｎｕｅｌｇｏｌｙｔｉｃ）酵素を
使用して達成する。好ましい酵素はＴ４ポリメラーゼで
あり、添加したデオキシヌクレオチドトリフオスフェー
トなしで二重成分ＤＮＡのエキソヌクレオチック（１＆
６−ｎｕｃｌａｏｌｙｔｉｃ ）消化を３′〜５′接触
作用を及ぼす（イングランド、Ｐ、 Ｔ、 、／、 Ｅ
ｉｏｌ。
Ｃｈａｍ、第２４６巻、第３２６９頁（１９７１年）。
温浸の範囲を技術において公知の原理に従って適当な温
度、反応時間および酵素量の選択によって制御する。最
適反応条件を酵素の各ロフトおよび変性した各ＤＮＡに
対して決定しなければならないので各場合に実験法が必
要となる。これらの方法で温浸の範囲を制御することが
できる。前決定中止点で温浸の終末を一つのデオキシヌ
クレオサイドトリフオスフェートを反応混合液中に包含
し、所望の中止点く対応することによって得る。
度、反応時間および酵素量の選択によって制御する。最
適反応条件を酵素の各ロフトおよび変性した各ＤＮＡに
対して決定しなければならないので各場合に実験法が必
要となる。これらの方法で温浸の範囲を制御することが
できる。前決定中止点で温浸の終末を一つのデオキシヌ
クレオサイドトリフオスフェートを反応混合液中に包含
し、所望の中止点く対応することによって得る。
具体的にはｄ Ａ７’Ｐの存在下、ＤＨ，４をポリメラ
ーゼがｃｔＡ残渣に達するまで３′〜５′温浸し、その
点でさらに正味の温浸を止める。
ーゼがｃｔＡ残渣に達するまで３′〜５′温浸し、その
点でさらに正味の温浸を止める。
各々前決定される中止点を有するいくつかの温浸サイク
ルを前決定終末点を有するＤＮＡ分子を構成するために
層成実施することができる。Ｔ４ポリメラーゼを有する
エキソヌクレオチック（ｇ：ｔｏｎｕｃ１ｇｏ！ｙｔｉ
ｃ）消化は３′終点を有する成分だけに作用する。補充
成分は対でない単一成分末尾として残存しそれもまた除
去しなければならない。Ｓ１ヌクレアーゼはこの目的に
対して好ましい酵素である。
ルを前決定終末点を有するＤＮＡ分子を構成するために
層成実施することができる。Ｔ４ポリメラーゼを有する
エキソヌクレオチック（ｇ：ｔｏｎｕｃ１ｇｏ！ｙｔｉ
ｃ）消化は３′終点を有する成分だけに作用する。補充
成分は対でない単一成分末尾として残存しそれもまた除
去しなければならない。Ｓ１ヌクレアーゼはこの目的に
対して好ましい酵素である。
Ｔ４ボリメラーゼシよびＳ１ヌクレアーゼで結合した処
理の生成物は鈍感な終末の二重成分ＤＮＡである。
理の生成物は鈍感な終末の二重成分ＤＮＡである。
上述した処理を今の表示プラスミドを処理するために使
用され、融合蛋白質の宿主部分に対してコードしている
ヌクレオチドを除去する。保護される本質的な要素を表
示単位と称す。表示単位は助触媒および宿主生体中で作
用することができるリボゾーム結合位置を包含する。実
際の問題として融合蛋白質の宿主部分に対してコードす
るヌクレオチドを正確に除去することは必要ではない。
用され、融合蛋白質の宿主部分に対してコードしている
ヌクレオチドを除去する。保護される本質的な要素を表
示単位と称す。表示単位は助触媒および宿主生体中で作
用することができるリボゾーム結合位置を包含する。実
際の問題として融合蛋白質の宿主部分に対してコードす
るヌクレオチドを正確に除去することは必要ではない。
リボゾーム結合位置と開始コドン（Ａｖｐ）間の関係は
出発コドンなリボゾーム結合位面の３〜１１ヌクレオチ
ド内のどこにでも位置することができることである、シ
ン等、Ｐｒｏｃ。
出発コドンなリボゾーム結合位面の３〜１１ヌクレオチ
ド内のどこにでも位置することができることである、シ
ン等、Ｐｒｏｃ。
Ｈａｔ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ ４第７１巻、第
１３４２頁（１９７４年）、ステイク、Ｊ６等、Ｐｒｏ
ｃ。
１３４２頁（１９７４年）、ステイク、Ｊ６等、Ｐｒｏ
ｃ。
Ｈａｔ、イｒａｄ、 Ｓｅｉ、 Ｕ Ｓ Ａ、第７２巻
、第４７３４頁（１９７５年）。この３〜１１ヌクレオ
チド領域において出会うべき最初のＡＵＧは翻訳のため
によみとり構成物を定める。実施例５に記載した通りｐ
ｔｒｐ Ｅ ３０ の場合にはＦｌｉｎｔＩから２３
〜２９ヌクレオチドの最小限の除去はトリプトファンオ
ペロン制御下、表示単位に挿入のために位置を与える。
、第４７３４頁（１９７５年）。この３〜１１ヌクレオ
チド領域において出会うべき最初のＡＵＧは翻訳のため
によみとり構成物を定める。実施例５に記載した通りｐ
ｔｒｐ Ｅ ３０ の場合にはＦｌｉｎｔＩから２３
〜２９ヌクレオチドの最小限の除去はトリプトファンオ
ペロン制御下、表示単位に挿入のために位置を与える。
ＨｉｎｃＬＭエンドヌクレアーゼによるｐｔｒｐＥ３０
の消化を実質的に限定酵素でプラスミドＤＮＡの分割に
対して実施例ＩＫ記載された条件下で実施する。処理Ｄ
ＮＡをニサイクルのエタノール沈ＪＷＫよって反応混合
液から回収する。一つの最適Ｔ４ポリメラーゼ温浸反応
ＫｂイーＣＤ Ｎ Ａ １５ 、ｌをＩＩ、 ｏ中に再
懸濁させそして濃縮した塩溶液を全容量２５０μを中７
０！ｌＩＭトリスｐｔ１８．１３．７０溝ｙｐ、６α２
．１０＋ｓＮ ジチオスレイトールおよび１３．７５単
位の１４ポリメラーゼ（ｐ−ｘバイオケミカルス、ミル
ウオーキーｔｒｉ、）を含有する反応混合液を与えるた
めに添加する。反応混合液を３７Ｃで３．３分保温する
。反応を水浴に保温混合液を早く移すことＫよって終結
し次いで６５Ｃで５分加熱処理によって酵素を不活性化
する。ＤＮＡをエタノール沈殿によって回収する。Ｓ１
ヌクレアーゼ処理を上記ウルリツヒ、Ａ１等によって記
ａされた通り実施する。
の消化を実質的に限定酵素でプラスミドＤＮＡの分割に
対して実施例ＩＫ記載された条件下で実施する。処理Ｄ
ＮＡをニサイクルのエタノール沈ＪＷＫよって反応混合
液から回収する。一つの最適Ｔ４ポリメラーゼ温浸反応
ＫｂイーＣＤ Ｎ Ａ １５ 、ｌをＩＩ、 ｏ中に再
懸濁させそして濃縮した塩溶液を全容量２５０μを中７
０！ｌＩＭトリスｐｔ１８．１３．７０溝ｙｐ、６α２
．１０＋ｓＮ ジチオスレイトールおよび１３．７５単
位の１４ポリメラーゼ（ｐ−ｘバイオケミカルス、ミル
ウオーキーｔｒｉ、）を含有する反応混合液を与えるた
めに添加する。反応混合液を３７Ｃで３．３分保温する
。反応を水浴に保温混合液を早く移すことＫよって終結
し次いで６５Ｃで５分加熱処理によって酵素を不活性化
する。ＤＮＡをエタノール沈殿によって回収する。Ｓ１
ヌクレアーゼ処理を上記ウルリツヒ、Ａ１等によって記
ａされた通り実施する。
同様の方法で実施例５に記載したＳ−蛋白質コード領域
からなるＩＩＢＶ−ＤＮＡのＴａｃＴ断片を各３′の終
りから約３０デオキシヌクレオチドを除去するために１
４ポリメラーゼで処理する。ＢａｍＩＩＩ結鎖な鈍い語
録結紮によって付加する。
からなるＩＩＢＶ−ＤＮＡのＴａｃＴ断片を各３′の終
りから約３０デオキシヌクレオチドを除去するために１
４ポリメラーゼで処理する。ＢａｍＩＩＩ結鎖な鈍い語
録結紮によって付加する。
語録は一成分上配列５’ −ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ−３
′を有し、そして他の成分上補充配列を有する。ＣＧＧ
を生成するために配列ＣＣＧＧを分割するＦｌｐａｌエ
クソスクレアーゼでの処理は５′−終末ＣＧ、例えばｆ
ｆｐａ（カットＤＮＡまたはαα■ カットＤＮＡを有
す、るあらゆる位置に接合することができるＤＮＡ断片
を生じる。
′を有し、そして他の成分上補充配列を有する。ＣＧＧ
を生成するために配列ＣＣＧＧを分割するＦｌｐａｌエ
クソスクレアーゼでの処理は５′−終末ＣＧ、例えばｆ
ｆｐａ（カットＤＮＡまたはαα■ カットＤＮＡを有
す、るあらゆる位置に接合することができるＤＮＡ断片
を生じる。
記載した通り処理したＴｅｔｅｌ断片をまた記載した通
り処理したｐｔｒｐ Ｅ ３０ Ｉ’ｍ速かに挿入しそ
して同様につ゛アレンツエラ等ネイチ７第２８０巻、第
８１５頁（１９７９年）Ｋよって記載した反応に接触作
用を及ぼすＤＮＡリガース中に＃Ｐａ１−特異連鎖で生
じる。細菌細胞をプラスミドを有する挿入物で転換する
。転換物を実施例５に記載した通りアムピシリン耐性に
よって選択する。単一集落分離物から増殖した培養なβ
−インドリルアクリル酸で誘発し実施例５に記載した３
５Ｓ−メチオニンでパルス標示する。標示した蛋白質を
ゲル電気法＠ｂよび放射能写真で可視化する。
り処理したｐｔｒｐ Ｅ ３０ Ｉ’ｍ速かに挿入しそ
して同様につ゛アレンツエラ等ネイチ７第２８０巻、第
８１５頁（１９７９年）Ｋよって記載した反応に接触作
用を及ぼすＤＮＡリガース中に＃Ｐａ１−特異連鎖で生
じる。細菌細胞をプラスミドを有する挿入物で転換する
。転換物を実施例５に記載した通りアムピシリン耐性に
よって選択する。単一集落分離物から増殖した培養なβ
−インドリルアクリル酸で誘発し実施例５に記載した３
５Ｓ−メチオニンでパルス標示する。標示した蛋白質を
ゲル電気法＠ｂよび放射能写真で可視化する。
２７．０００ Ｍ、ｒＦｒ、領域Ｃ（蛋白質バンドを生
じる分枝は前駆物配列なしでＳ−蛋白質を合成している
はほぼ間違いない。
じる分枝は前駆物配列なしでＳ−蛋白質を合成している
はほぼ間違いない。
仲介物ＤＮＡの宿主蛋白質コード領域の除去が不完全の
場合、挿入したＤＮＡを融合蛋白質として表示する％の
チャンスがある。しかしながらアマリに多くのヌクレオ
チドを仲介物ＤＮ、４から除去する場合、挿入物ＤＮＡ
Ｋよってコードされた蛋白質を形成しないことは有シう
ることであり、一方処理された挿入物が開始コドンから
離れたりボゾーム結合位置の１１ヌクレオチド以上のよ
うＫあまりに長い場合には蛋白質をほとんどまたは全く
形成しない。仲介物がコード配列の一部を保持しあるい
は挿入処理が５−蛋白質コード領域の一部を除去してい
る場合忙だけ間違った蛋白質合成のあらゆる可能性があ
る。それ故、一定の分枝によって生じた蛋白質を末端基
分析具体的にはエドマン分解によって同定し、に−末端
配列Ｋｇ ｆ−Ｇｔｕ−１ｚ３−Ｉｌ、−のＳ−蛋白質
を確認する。正しいプラスミド構成をＤＮ、４塩基配列
分析（実施例４）Ｋよって確認する。表示されたＳ−蛋
白質の構造の証明を完全なアミノ酸配列分析によって達
成する。
場合、挿入したＤＮＡを融合蛋白質として表示する％の
チャンスがある。しかしながらアマリに多くのヌクレオ
チドを仲介物ＤＮ、４から除去する場合、挿入物ＤＮＡ
Ｋよってコードされた蛋白質を形成しないことは有シう
ることであり、一方処理された挿入物が開始コドンから
離れたりボゾーム結合位置の１１ヌクレオチド以上のよ
うＫあまりに長い場合には蛋白質をほとんどまたは全く
形成しない。仲介物がコード配列の一部を保持しあるい
は挿入処理が５−蛋白質コード領域の一部を除去してい
る場合忙だけ間違った蛋白質合成のあらゆる可能性があ
る。それ故、一定の分枝によって生じた蛋白質を末端基
分析具体的にはエドマン分解によって同定し、に−末端
配列Ｋｇ ｆ−Ｇｔｕ−１ｚ３−Ｉｌ、−のＳ−蛋白質
を確認する。正しいプラスミド構成をＤＮ、４塩基配列
分析（実施例４）Ｋよって確認する。表示されたＳ−蛋
白質の構造の証明を完全なアミノ酸配列分析によって達
成する。
細菌菌株によって合成した真のＳ−蛋白質をゲル濾過お
よび親和クロマトグラフィーのような標準方法によって
精製し、ざらに免疫化学試験およびトリブチツク（ｔｒ
ｙｐｔｉｃ ）分解物分析ＥＣよって特徴付けられる。
よび親和クロマトグラフィーのような標準方法によって
精製し、ざらに免疫化学試験およびトリブチツク（ｔｒ
ｙｐｔｉｃ ）分解物分析ＥＣよって特徴付けられる。
精製したＳ−蛋白質は免疫遺伝性で、ｉＳ＃）１１Ｂｊ
Ａｆ に対して抗体と交叉反応性である。
Ａｆ に対して抗体と交叉反応性である。
５−蛋白質コード領域の塩基配列によって決定されるア
ミノ酸配列は次の通りである。
ミノ酸配列は次の通りである。
絢 ψ
但 汐
ψ ｄ
む 責
曽 ０
む ダ
ｏＩ づ
む 四
＝ 汁
切 ト
０ 冑
１、Ｉｅｌ
Φ 細
、Ｉ：０
Ｄ４１／Ｉ
Ｊ、Ｉ ０
ａｌｌ−＋
工 山
−〇
〇−
α０
…−
＜自
＞Φ
Ｈ
く情
Ｏ
づ鈎
Ｈ淵
く ト
０ψ
Ｎ
〜Ｑ
絢α
＋：ψ
日べ
細Ｘ
一
ψ山
む 足
胸−
Ｊ：≦
ｈ
ＩＩ＋１０
＞鈎
＞諷
○４
技術上公知の方法と共に所望の技術の適用は一般式
％式％
（式中ＳはＳ−蛋白質のアミノ酸配列である。
Ｘはアミノ酸、ペプチド、蛋白質またはアミノ保護基で
ある。それは表２に示ぐれる性質上コードされたアミノ
酸配列を包含するがそれに限定されるものではないそし
てまたチロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファ
ンのような主として芳香族アミノ酸からなるペプチドを
包含し、該ペプチドはそれらが付着する蛋白質の抗原性
を増加する特性を有するセラ、Ｍｏ、科学、第１６６巻
、第１３６５頁（１９６９年）およびセラ、Ｍ、定量生
化学についてのコールドスプリングハーバ−シンポジウ
ム第３２巻（１９６７年）Ｋ記載されたアミノ酸残基の
長き約４以下である。およびＹはアミノ酸、ペプチド、
蛋白質またはエステルまたはアミド結合にかけるカルボ
キシル保護基であり既（述べた芳香族アミノ酸からなる
ペプチドを包含するがそれに限定されるものではない。
ある。それは表２に示ぐれる性質上コードされたアミノ
酸配列を包含するがそれに限定されるものではないそし
てまたチロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファ
ンのような主として芳香族アミノ酸からなるペプチドを
包含し、該ペプチドはそれらが付着する蛋白質の抗原性
を増加する特性を有するセラ、Ｍｏ、科学、第１６６巻
、第１３６５頁（１９６９年）およびセラ、Ｍ、定量生
化学についてのコールドスプリングハーバ−シンポジウ
ム第３２巻（１９６７年）Ｋ記載されたアミノ酸残基の
長き約４以下である。およびＹはアミノ酸、ペプチド、
蛋白質またはエステルまたはアミド結合にかけるカルボ
キシル保護基であり既（述べた芳香族アミノ酸からなる
ペプチドを包含するがそれに限定されるものではない。
）を有するＳ−蛋白質誘導体系を構成することを可能く
する。それ故誘導体は２５，３９８より分子１が大きい
。記載したＳ−蛋白質日導体は蛋白質分解温浸に対して
抗原性シよび安定性を高めている。それ故誘導体はワク
チン注射および検定目的に対する抗原として有用である
。
する。それ故誘導体は２５，３９８より分子１が大きい
。記載したＳ−蛋白質日導体は蛋白質分解温浸に対して
抗原性シよび安定性を高めている。それ故誘導体はワク
チン注射および検定目的に対する抗原として有用である
。
技術上公知の種々のアミノ保護基はＳ−蛋白質およびそ
のペプチド誘導体の誘導体を生成する用途に適している
。適当なアミノ基の選択は保護されるアミノ酸の性質、
除去の比較的な容易さ、溶媒、温度などのような普通の
反応条件のような因子に依存する。適当な７ミノ保護基
はベンジルオキシカルボニル（カルボベンゾキシ）基、
置換されたカルボベンゾキシまたは他のウレタン保護基
、トリフルオロアセチル基、フタリル（またはフタロイ
ル）基、ジフェニルメチル（ベンツヒドジル）基、トリ
フェニルメチル（トリチル）基、ホルミル基、ラクタム
、シッフ塩基およびＮ−アミン、ベンジルスルホニル基
、トリチルスルフェニル基およびアリールスルフェニル
基を包含する。通常使用されるアミノ保護基はｔａｒｔ
ブチルオキシカルボニル基、Ｏ−ニトロフェニルスルフ
ェニル基およびトシル基を包含する。ボダンスツキー
Ｏ０等ペプチド合成、ＣＨ，４、インターサイエンス発
行（１９６６年）、シュロエダー、ペプチド第１巻、第
ＸＸＩＩＩ〜ＸＸＩＸ頁、アカデミツクプレス（１９６
５年）および有機化学における保護基（１，Ｆ、 Ｆ、
Ｈｅｒｎｉａ 、ｇｄ、 ）プレヌムプレス（１９７
３年）などがペプチド化学の標準研究に参考となる。
のペプチド誘導体の誘導体を生成する用途に適している
。適当なアミノ基の選択は保護されるアミノ酸の性質、
除去の比較的な容易さ、溶媒、温度などのような普通の
反応条件のような因子に依存する。適当な７ミノ保護基
はベンジルオキシカルボニル（カルボベンゾキシ）基、
置換されたカルボベンゾキシまたは他のウレタン保護基
、トリフルオロアセチル基、フタリル（またはフタロイ
ル）基、ジフェニルメチル（ベンツヒドジル）基、トリ
フェニルメチル（トリチル）基、ホルミル基、ラクタム
、シッフ塩基およびＮ−アミン、ベンジルスルホニル基
、トリチルスルフェニル基およびアリールスルフェニル
基を包含する。通常使用されるアミノ保護基はｔａｒｔ
ブチルオキシカルボニル基、Ｏ−ニトロフェニルスルフ
ェニル基およびトシル基を包含する。ボダンスツキー
Ｏ０等ペプチド合成、ＣＨ，４、インターサイエンス発
行（１９６６年）、シュロエダー、ペプチド第１巻、第
ＸＸＩＩＩ〜ＸＸＩＸ頁、アカデミツクプレス（１９６
５年）および有機化学における保護基（１，Ｆ、 Ｆ、
Ｈｅｒｎｉａ 、ｇｄ、 ）プレヌムプレス（１９７
３年）などがペプチド化学の標準研究に参考となる。
技術上公知の適当なカルボキシル保護基は低級アルキル
エステル、フェニル−置換低級アルキルエステル、例え
ばベンジルおよびベンツヒドリルエステル、Ｐ−ニトロ
ベンジルエステル、アーメトキシベンジルエステル、フ
タールイミドメチルエステル、ｔ−ブチルエステル、シ
クロペンチルエステル、メチルチオエチルエステル、ト
リメチルシリル基、およびヒドラジドを包含する。特定
基の選択はアミノ保護基の選択に対して先に述べたよう
な変化に依存する。通常使用されるカルボキシル保護基
はメチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルおよびベンジ
ルであふ。
エステル、フェニル−置換低級アルキルエステル、例え
ばベンジルおよびベンツヒドリルエステル、Ｐ−ニトロ
ベンジルエステル、アーメトキシベンジルエステル、フ
タールイミドメチルエステル、ｔ−ブチルエステル、シ
クロペンチルエステル、メチルチオエチルエステル、ト
リメチルシリル基、およびヒドラジドを包含する。特定
基の選択はアミノ保護基の選択に対して先に述べたよう
な変化に依存する。通常使用されるカルボキシル保護基
はメチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルおよびベンジ
ルであふ。
−〇Ｈｂよびグアニジノ基のような他の作用基は所望忙
より公知の方法で保護することができる。
より公知の方法で保護することができる。
記載したＳ−蛋白質誘導体の合成は上記セラ等に記載し
たようＫまたは所望の出発点く近いＤＮＡの分割のため
に適当な制限位置を使用しそして１４ポリメラーゼを使
用する短い末端セグメントを選択的に除去する実施例１
〜６に記載した組換えＤＮＡ技術の変形によって達成で
れる。限定エンドヌクレアーゼ分割が希望するよりも短
い生成物を生じる場合には希望したデオキシヌクレオチ
ド配列な化学合成によって提供することができる。
たようＫまたは所望の出発点く近いＤＮＡの分割のため
に適当な制限位置を使用しそして１４ポリメラーゼを使
用する短い末端セグメントを選択的に除去する実施例１
〜６に記載した組換えＤＮＡ技術の変形によって達成で
れる。限定エンドヌクレアーゼ分割が希望するよりも短
い生成物を生じる場合には希望したデオキシヌクレオチ
ド配列な化学合成によって提供することができる。
（例えばゴエデル、Ｄｌ等、ネイチュア第２８１巻、第
５５４頁（１９７９年）参照）可能なＳ−蛋白質誘導体
の範囲はメチオニン残基で開始する性質上コードされた
配列のペプチドに制限でれるのではなくて表２に示した
性質上コードされた可能な限りの配列を包含する。
５５４頁（１９７９年）参照）可能なＳ−蛋白質誘導体
の範囲はメチオニン残基で開始する性質上コードされた
配列のペプチドに制限でれるのではなくて表２に示した
性質上コードされた可能な限りの配列を包含する。
ざらＫＳ−蛋白質のグリコジル化誘導体は抗原性であり
抗体の生産に有用である。予期されるグリコジル化の位
置は−Ａｚｎ−Ｍ−（Ｓｓｒ）または（ｒｈｒ）−（ｕ
はあらゆるアミノ酸である）配列中のアスパラギン残基
である。Ｓ−蛋白質のアミノ酸位ｆ！ｉ３，５９ｂよび
ｌ ４６における三つの位置がある。ざらに有用なＳ
−ペプチド誘導体を与える性質上コードされた配列内に
二つの位置があり、それＫよって同様にグリコジル化誘
導体として提供する。
抗体の生産に有用である。予期されるグリコジル化の位
置は−Ａｚｎ−Ｍ−（Ｓｓｒ）または（ｒｈｒ）−（ｕ
はあらゆるアミノ酸である）配列中のアスパラギン残基
である。Ｓ−蛋白質のアミノ酸位ｆ！ｉ３，５９ｂよび
ｌ ４６における三つの位置がある。ざらに有用なＳ
−ペプチド誘導体を与える性質上コードされた配列内に
二つの位置があり、それＫよって同様にグリコジル化誘
導体として提供する。
実施例７
Ｓ−蛋白質コード領域の表示を上記ツバイ、Ｇ、によっ
て記載されたＤＮＡ−指向蛋白質合成系を使用して試験
管内で実施する。合成シ〔おいて使用したＤＮＡはＳ−
蛋白質の表示のために実施例６で記載した組換えプラス
ミドｐ ｔ ｒ ｐ Ｅ ３ ｏ／ ＢＢｚＡｆ ま
たは変性した組換えプラスミドである。ざらＫＳ−蛋白
質コード領域を包含するＴａｒ Ｉ断片のよりなＨＢＶ
−ＤＮＡの限定エンドヌクレアーゼカット断片をツバイ
系で使用することができる。系において提供されるアミ
ノ酸の一８！またはそれ以上を生成物蛋白質に対する感
受性検出を可能にするために放射性で標示する。Ｓ−蛋
白質の合成を先に記載した検出系のいずれかで抗−ＨＢ
ｚＡｆ 抗体または抗−５−蛋白質抗体への放射性で標
示した物質の結合によって検出する。
て記載されたＤＮＡ−指向蛋白質合成系を使用して試験
管内で実施する。合成シ〔おいて使用したＤＮＡはＳ−
蛋白質の表示のために実施例６で記載した組換えプラス
ミドｐ ｔ ｒ ｐ Ｅ ３ ｏ／ ＢＢｚＡｆ ま
たは変性した組換えプラスミドである。ざらＫＳ−蛋白
質コード領域を包含するＴａｒ Ｉ断片のよりなＨＢＶ
−ＤＮＡの限定エンドヌクレアーゼカット断片をツバイ
系で使用することができる。系において提供されるアミ
ノ酸の一８！またはそれ以上を生成物蛋白質に対する感
受性検出を可能にするために放射性で標示する。Ｓ−蛋
白質の合成を先に記載した検出系のいずれかで抗−ＨＢ
ｚＡｆ 抗体または抗−５−蛋白質抗体への放射性で標
示した物質の結合によって検出する。
実施例８
ＨＢＶ−ＤＮＡおよびその制限断片をバクテリオファー
ジ運搬仲介物中で分枝した。この目的に対してファージ
λＣ１１６Ａが適当であるフラットナー１す８９等サイ
エンス、第１９６巻、第１６１頁（１９７７年）。ファ
ージは１ａｃ５置換に位置した一つのＥｃｏＲ１位置を
包含する。Ｌａｅ５領域への挿入は有用な選択技術を提
供する。色素生成基質５−クロロ−４−ブロモ−３−イ
ンドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトサイド（ＸＧ）を平板培養
培地で培養する場合、λＣｈ１６Ａは鮮明な青い斑点を
示し一方ＥｃσＲ１位置で挿入物を運ぶλ（Ｚ’Ａ１６
．（はＬαＣ−細菌宿主上で平板培養する場合無色の斑
点を示する。なおざらにＥｃ ｏ Ｒ１位置はβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子のＮ−末端部分を運ぶ融合蛋白質と
してコード領域の表示に適した作用オペレーター提供領
域に近い挿入座位を提供する。
ジ運搬仲介物中で分枝した。この目的に対してファージ
λＣ１１６Ａが適当であるフラットナー１す８９等サイ
エンス、第１９６巻、第１６１頁（１９７７年）。ファ
ージは１ａｃ５置換に位置した一つのＥｃｏＲ１位置を
包含する。Ｌａｅ５領域への挿入は有用な選択技術を提
供する。色素生成基質５−クロロ−４−ブロモ−３−イ
ンドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトサイド（ＸＧ）を平板培養
培地で培養する場合、λＣｈ１６Ａは鮮明な青い斑点を
示し一方ＥｃσＲ１位置で挿入物を運ぶλ（Ｚ’Ａ１６
．（はＬαＣ−細菌宿主上で平板培養する場合無色の斑
点を示する。なおざらにＥｃ ｏ Ｒ１位置はβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子のＮ−末端部分を運ぶ融合蛋白質と
してコード領域の表示に適した作用オペレーター提供領
域に近い挿入座位を提供する。
実施例９
実施例５に記載したｔｒｐＥ−５蛋白質融合蛋白質およ
び実施例６に記載したＳ−蛋白質は抗体を誘発する十分
な抗原性である。抗体はＨＥ ｚ Ａ ９ と交叉反応
する。ギネア豚を９．１４および５６日間隔で実施例５
および６で記載した通り各々精製した５０μタ Ｓ−蛋
白質またはｔｒｐＥ−５蛋白質融合生成物を含有する１
０ｄの生理的食塩またはフォスフェート緩衝食塩で皮下
注射する。試験動物の血清が０，２８．５６および８４
における試料であり感染血清から部分的に精製したデイ
ン粒子またはＨＢ ｚ Ａタ に対して抗体力価を検定
する。上記ホリングレン、Ｆ９等の放射線免疫検定を使
用する。大部分の動物は蛋白質の投与後８４日間ＨＢｐ
ｉｆと交叉反応性抗体を示す。
び実施例６に記載したＳ−蛋白質は抗体を誘発する十分
な抗原性である。抗体はＨＥ ｚ Ａ ９ と交叉反応
する。ギネア豚を９．１４および５６日間隔で実施例５
および６で記載した通り各々精製した５０μタ Ｓ−蛋
白質またはｔｒｐＥ−５蛋白質融合生成物を含有する１
０ｄの生理的食塩またはフォスフェート緩衝食塩で皮下
注射する。試験動物の血清が０，２８．５６および８４
における試料であり感染血清から部分的に精製したデイ
ン粒子またはＨＢ ｚ Ａタ に対して抗体力価を検定
する。上記ホリングレン、Ｆ９等の放射線免疫検定を使
用する。大部分の動物は蛋白質の投与後８４日間ＨＢｐ
ｉｆと交叉反応性抗体を示す。
同様の結果をサルの注射で得ている。従ってＨＢＶの免
疫学的活性蛋白質成分は該蛋白質エンコードＤＮＡ運搬
仲介物によって移動した微生物によって表示され、ウィ
ルスの免疫学的に活性な成分と交叉反応する抗体を誘発
することができる。
疫学的活性蛋白質成分は該蛋白質エンコードＤＮＡ運搬
仲介物によって移動した微生物によって表示され、ウィ
ルスの免疫学的に活性な成分と交叉反応する抗体を誘発
することができる。
記載した蛋白質はデイン粒子または保菌者の血清から得
られたＨＥｚＡｆよシ重要にも大量に利用できる利点を
有する。ざらにその上、ｔｒｐＥ−５蛋白質表示生成物
またはＳ−蛋白質に完全なウィルスがないので偶然的な
感染の危険がない。対照により血清から精製したウィル
ス性蛋白質はウィルス性感染の危険を疫学的反応成分と
交叉反応する抗体を誘発することができる。ざらＫまた
蛋白質を合成し反応成分と交叉反応する抗体を誘発する
ことができる。それ故記載した通り精製しそして生理的
に使用し碍る媒質中で投与される場合、かかる蛋白質お
よび蛋白質誘導体がウィルスによる感染に対して保護す
るワクチンとなることは理解される。
られたＨＥｚＡｆよシ重要にも大量に利用できる利点を
有する。ざらにその上、ｔｒｐＥ−５蛋白質表示生成物
またはＳ−蛋白質に完全なウィルスがないので偶然的な
感染の危険がない。対照により血清から精製したウィル
ス性蛋白質はウィルス性感染の危険を疫学的反応成分と
交叉反応する抗体を誘発することができる。ざらＫまた
蛋白質を合成し反応成分と交叉反応する抗体を誘発する
ことができる。それ故記載した通り精製しそして生理的
に使用し碍る媒質中で投与される場合、かかる蛋白質お
よび蛋白質誘導体がウィルスによる感染に対して保護す
るワクチンとなることは理解される。
１６匹のチンパンジーを三つのグループに分けた。グル
ープ、（（６匹の動物）をＢ、 Ｏ，Ｂ。
ープ、（（６匹の動物）をＢ、 Ｏ，Ｂ。
肝炎Ｂウィルス１．０ｄで静脈内に接種した。
グループＢ（４匹の動物）を生理的食塩水中実施例５に
記載した通り合成および精製したｔｒｐＥ−５蛋白質融
合蛋白［５ｎｐを含有する１−Ｏｒｔｌで静脈内に接覆
し走。グループｃ（６匹の動物）はコントロールグルー
プであり接穏を受けない。グループＡのチンパンジーは
４０週以内に臨床上肝炎Ｂ（アンチゲネミア、酵素高位
および／または抗体応答）であることは明白である。グ
ループＢまたはＣの動物はいずれも同様に４０週間にわ
たって臨床上肝炎Ｂを示さなかった。グループＢのチン
パンジーなり、 ０． Ｂ、肝炎Ｂウィルス１．０ｄで
静脈内圧接種した場合、次の攻撃に対して免疫する。
記載した通り合成および精製したｔｒｐＥ−５蛋白質融
合蛋白［５ｎｐを含有する１−Ｏｒｔｌで静脈内に接覆
し走。グループｃ（６匹の動物）はコントロールグルー
プであり接穏を受けない。グループＡのチンパンジーは
４０週以内に臨床上肝炎Ｂ（アンチゲネミア、酵素高位
および／または抗体応答）であることは明白である。グ
ループＢまたはＣの動物はいずれも同様に４０週間にわ
たって臨床上肝炎Ｂを示さなかった。グループＢのチン
パンジーなり、 ０． Ｂ、肝炎Ｂウィルス１．０ｄで
静脈内圧接種した場合、次の攻撃に対して免疫する。
実施例６で記載したＳ蛋白質またはその誘導体を同様の
方法で使用することができ所望の免疫学的応答を与える
。
方法で使用することができ所望の免疫学的応答を与える
。
本発明はその特定の態様と関連して記載される一方さら
に変更することができるそして本出願は本発明のいかな
る変化、用途または適用をも包含しようとするものであ
わ、一般に本発明の原理圧機い、そして本発明が係る技
術内で公知または慣例的な実施内に入るようなそして土
窯に説明した本質的な特徴に適用できるようなそして特
許請求の範囲に従うような本発明の説明から離脱を包含
することは理解される。
に変更することができるそして本出願は本発明のいかな
る変化、用途または適用をも包含しようとするものであ
わ、一般に本発明の原理圧機い、そして本発明が係る技
術内で公知または慣例的な実施内に入るようなそして土
窯に説明した本質的な特徴に適用できるようなそして特
許請求の範囲に従うような本発明の説明から離脱を包含
することは理解される。
ｊＬ上＝
Ｅａ’ｏＲ１位置で開始するＨＢＶ−ＤＮＡのヌクレオ
チド配列（表２のヌクレオチド１４０６）全塩基対＝３
２２１ 表 ＨＥＷ−ＤＮＡの塩基配列および翻訳。
チド配列（表２のヌクレオチド１４０６）全塩基対＝３
２２１ 表 ＨＥＷ−ＤＮＡの塩基配列および翻訳。
第４図におてい出発点は０を示す。
Ｍ−メチオニン出発シグナル
・−終末コトン
Ａ＝Ａ′ＩＲ白質
Ｂ＝Ｂ蛋白質
Ｃ＝核抗原
Ｄ＝Ｄ蛋白質
Ｓ＝Ｓ蛋白質
第１図はＰＥｏ。６．３ＤＨＡの制限地図（、、ＢＲ５
２５／デイン）を示す。 第２Ａ図は交＠ （ｈｙｂｒｉｃｌｉｚａｔｉｏｎ ）
の前のＤＮＡ のゲル電気泳動パターンを示す。 第２Ｂ図ハ” Ｐ−ＨＢＶ−ＤＮＡ テ交雑後ノニトロ
セルロースフィルターのオートラジオグラフである。 第２Ｃ図はプローブとして別個！ニ調製したｎＰ−標識
デイン粒子ＤＮＡ試料を使用する独立した実験結果を示
す・ 第３Ａ図は螢光染色によって可視化されたゲル電気泳動
結果を示す。 第３Ｂ図は各々のゲル中でＲＮＡ ｉ＝交雑できるＰＥ
ｏ。６３，１０’ ｃｐａ／、ａｇから” 、−ＨＢＶ
−Ｄｗｈのオートラジオグラフを示す。 第４図はＳ蛋白質コード領域の地図位置ｌ示す。 第５図はオートラジオグラフによって可視化された蛋白
質バンドを示す。 Ａ ■ ＦＩＧ、２ Ａ 日Ｇ、２Ｂ ＦＩＧ、３Ｂ ＦＩＧ、４
２５／デイン）を示す。 第２Ａ図は交＠ （ｈｙｂｒｉｃｌｉｚａｔｉｏｎ ）
の前のＤＮＡ のゲル電気泳動パターンを示す。 第２Ｂ図ハ” Ｐ−ＨＢＶ−ＤＮＡ テ交雑後ノニトロ
セルロースフィルターのオートラジオグラフである。 第２Ｃ図はプローブとして別個！ニ調製したｎＰ−標識
デイン粒子ＤＮＡ試料を使用する独立した実験結果を示
す・ 第３Ａ図は螢光染色によって可視化されたゲル電気泳動
結果を示す。 第３Ｂ図は各々のゲル中でＲＮＡ ｉ＝交雑できるＰＥ
ｏ。６３，１０’ ｃｐａ／、ａｇから” 、−ＨＢＶ
−Ｄｗｈのオートラジオグラフを示す。 第４図はＳ蛋白質コード領域の地図位置ｌ示す。 第５図はオートラジオグラフによって可視化された蛋白
質バンドを示す。 Ａ ■ ＦＩＧ、２ Ａ 日Ｇ、２Ｂ ＦＩＧ、３Ｂ ＦＩＧ、４
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）肝炎Ｂ表面抗原配列とその直前の１７４アミノ酸
までの配列から成る蛋白質又はその免疫活性ペプチド成
分をエンコードするヌクレオチド配列を有し、肝炎Ｂ核
抗原をエンコードするヌクレオチド配列を実質的に有さ
ないプラスミドから成るＤＮＡ運搬仲介物。（２）免疫
活性ペプチド成分をエンコードするヌクレオチド配列の
少なくとも一部が翻訳により発現することを特徴とする
特許請求の範囲第１項に記載したＤＮＡ運搬仲介物。 （３）肝炎Ｂ表面抗原配列とその直前の１７４アミノ酸
の配列と一致する免疫活性蛋白質をエンコードし、肝炎
Ｂ核抗原をエンコードするヌクレオチド配列を実質的に
有さないヌクレオチド配列を単離し、 前記ヌクレオチド配列をＤＮＡ運搬仲介物に組み入れて
、組換運搬仲介物を形成し、 前記組換運搬仲介物により宿主細胞を転換し、前記組換
運搬仲介物を維持、複製そして発現しうる宿主細胞菌株
を選択し、 増殖に適した条件下で前記選択宿主細胞を増殖して 肝炎Ｂ表面抗原とその直前の１７４アミノ酸の配列の少
なくとも一部をエンコードするヌクレオチド配列を維持
、複製そして発現する方法。 （４）肝炎Ｂ表面抗原配列とその直前の１７４アミノ酸
までの配列から成る蛋白質又はその免疫活性ペプチド成
分をエンコードするヌクレオチド配列を有し、肝炎Ｂ核
抗原をエンコードするヌクレオチド配列を実質的に有さ
ないプラスミドから成るＤＮＡ運搬仲介物を含み、それ
により形質転換された微生物。 （５）式Ｘ−Ｓで表わされ、Ｓは肝炎Ｂ表面抗原であり
、Ｘは存在しないか、肝炎Ｂ表面抗原の直前の１７４ア
ミノ酸から成る配列の少なくとも一部である抗原性蛋白
質をエンコードし、肝炎Ｂ核抗原をエンコードするヌク
レオチド配列を実質的に含まないようなヌクレオチド配
列から成るＤＮＡ運搬仲介物により形質転換された微生
物であって、前記ＤＮＡ運搬仲介物は、オペロンの翻訳
発現が前記ヌクレオチド配列の翻訳発現になるように枠
相及び方向を規制して発現できるようなオペロンのある
部分に、前記ヌクレオチド配列が挿入されていることを
特徴とする微生物。 （６）Ｘが肝炎Ｂ表面抗原の直前の１６３アミノ酸から
成る配列であることを特徴とする特許請求の範囲第５項
に記載した微生物。 （７）Ｘが肝炎Ｂ表面抗原の直前の５５アミノ酸から成
る配列であることを特徴とする特許請求の範囲第５項に
記載した微生物。 （８）Ｓが 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載し
た微生物。 （９）Ｘがアミノ保護基、一個のアミノ酸、又はそのＣ
末端部が 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 のアミノ酸配列から成るペプチドであることを特徴とす
る特許請求の範囲第５項に記載した微生物。 （１０）Ｘが 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載し
た微生物。 （１１）Ｘが 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載し
た微生物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4190979A | 1979-05-24 | 1979-05-24 | |
| US10726779A | 1979-12-26 | 1979-12-26 | |
| US107267 | 1979-12-26 | ||
| US41909 | 1979-12-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55069516A Division JPH0659221B2 (ja) | 1979-05-24 | 1980-05-24 | Ｄｎａ運搬仲介物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02450A true JPH02450A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2543751B2 JP2543751B2 (ja) | 1996-10-16 |
Family
ID=26718684
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55069516A Expired - Lifetime JPH0659221B2 (ja) | 1979-05-24 | 1980-05-24 | Ｄｎａ運搬仲介物 |
| JP63198756A Expired - Lifetime JP2543751B2 (ja) | 1979-05-24 | 1988-08-09 | 抗原性蛋白質の製法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55069516A Expired - Lifetime JPH0659221B2 (ja) | 1979-05-24 | 1980-05-24 | Ｄｎａ運搬仲介物 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5436139A (ja) |
| EP (1) | EP0020251B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0659221B2 (ja) |
| CA (2) | CA1341643C (ja) |
| DE (2) | DE20251T1 (ja) |
| DK (1) | DK226680A (ja) |
| ES (1) | ES491832A0 (ja) |
| GR (1) | GR68524B (ja) |
| IE (1) | IE52036B1 (ja) |
| PT (1) | PT71296B (ja) |
| YU (1) | YU46343B (ja) |
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| US4953930A (en) * | 1989-03-15 | 1990-09-04 | Ramtech, Inc. | CPU socket supporting socket-to-socket optical communications |
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| US6297355B1 (en) | 1978-12-22 | 2001-10-02 | Biogen, Inc. | Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity |
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| FR2480780B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1985-12-06 | Pasteur Institut | Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un adn circulaire tel que celui du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn |
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| EP0062574A3 (en) * | 1981-03-31 | 1982-12-29 | The Regents Of The University Of California | Virus protein synthesis |
| GB2102006B (en) * | 1981-06-16 | 1984-11-28 | Takeda Chemical Industries Ltd | Deoxyribonucleic acids, their production and use |
| US4769238A (en) | 1981-08-04 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Synthesis of human virus antigens by yeast |
| GR76274B (ja) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
| EP0340806B1 (en) * | 1981-08-04 | 1995-05-31 | The Regents Of The University Of California | Synthesis of human virus antigens by yeast |
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| NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
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| US4888170A (en) * | 1981-10-22 | 1989-12-19 | Research Corporation | Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes |
| US4741901A (en) * | 1981-12-03 | 1988-05-03 | Genentech, Inc. | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
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