JPH025870A - タンパク質免疫原及び融合タンパク質の発現のための新規なベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コクシジウム症は、原生動物門の一分類である多数のコ
クシジウム種の１以上による感染によって生じる疾患で
ある。コクシジウムは、多種の宿主に感染してヒツジ、
ヤギ、ウシ、ブタ及び家禽産業に重大な経済的損害を与
えうる細胞内寄生虫である。実際にも、アイメリア（ｌ
Ｅｉｍｅｒｉａ）種による感染から生じるコクシジウム
症は家禽産業に対して経済的に壊滅的な損害を生じさせ
た。家禽とは、卵又は肉源として用いられかつ商業的に
重要な種類として鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロ
ホロ鳥、キジ、ハト及びクジャクを含む飼育鳥として本
明細書では定義される。飼育鳥の中では、鶏の生産物が
コクシジウム症による経済的損害を最もうけ易いが、但
し損害は七面鳥、ガチョウ、アヒル及びホロホロ鳥の場
合にも発生しうる。コクシジウム症は、捕獲状態で育て
られたキジ及びウズラの場合にも重大な損害を与える。

コクシジウム症は急性であってかつ壊滅的な群死亡率に
より特徴付けられるか、又はその疾患は慢性的であって
かつ体重増加の欠如により特徴付けられる。

家禽は、成長期の寄生虫、即ち胞子形成嚢胞体（ｏｏｃ
ｙｓ　ｔ）の摂取後にコクシジウムにより感染する。感
染期の挿出（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）はそれが上皮細胞
中に急速に侵入した場合に放出されるが、しかる後数世
代にわたる急速な細胞内無性増殖（多数分裂）を起こし
、次いで有性的分化及び交配期（有性生殖）に入って未
成熟嚢胞体を形成するが、これは糞中に排出され、しか
る後細胞外胞子形成過程（伝播生殖）に移行して成熟嚢
胞体を生じる。

いずれかのアイメリア種、即ちＥ、アセルブリナ（Ｅ、
ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、Ｅ、ミハ゛チ（Ｅ、ｍ１ｖａ
Ｌｉ）、Ｅ、ミチス（Ｅ、ｍ１ｔｉｓ）　、Ｅ、プラエ
コソクス（Ｅ、ｐｒａｅｃｏｘ）　、Ｅ。

ハガニ（Ｅ、　ｈａｇａｎ　ｉ）、Ｅ、ネカトリソクス
（Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘ）、Ｅ、マキシマ（ｌＥ、ｍａ
ｘｉｍａ）、Ｅ、プルネソティ（［！、ｂｒｕｎｅＬｔ
ｉ）及びＥ、テ不う（Ｉｔ、　ｔｅｎｅｌｌａ）による
低レベル感染の場合には、再感染に対する保護免疫を生
じる。寄生虫の発育に伴い１２もの多くの異なる細胞タ
イプが存在しうるが、各々形態学的及び抗原的に異なる
。これらの細胞タイプのうち少なくとも３種が宿主にお
いて保護免疫応答を生じることが明らかにされた〔ロー
ズ及びヘスケス、パラサイトロジー、第７３巻、第２５
−３７頁、１９７６年（Ｒｏｓｅ　ａｎｄ　Ｈｅ５ｋｅ
ｔｈ、ＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇＬ　７３　：　２５　３
７（１９７６））　　ｉマクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌ
ｄ）　　ら、パラサイトロジー、第９３巻、第１−７頁
、１９８６年；ハヌシャリ及びロング、リサーチ・イン
・エイビアン・コクシジオシス、プロシーディング・オ
プ・ザ・ジョーシア・コクシジオシス・コンファレンス
、アテオ、ジョーシア州、ＵＳＡ、第５２６−５３４頁
、１９８６年（［１ｈａｎｕｓｈａｌｉ　ａｎｄ　１．
ｏｎｇ＋Ｉｎ、ｌ１ｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ａｖｉａｎ
　Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ
　ｔｈｅ　Ｇｅｏｒｇｉａ　Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ　
Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ａｔｈｅｎｓ。

ＧＡ、ＵＳＡ、ｐｐ、５２６−５３４　（１９８６）　
）　）、挿出のみならず第−及び第二世代製出（ｓｃｈ
ｉｚｏｎｔ）のいずれもが、鶏において免疫作用を引き
出す抗原を含有しているようである。

単一の優性抗原からなるプラスモジウム・ファルシバラ
ム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の
ような他の寄生虫の挿出表面とは異なり〔サントロら、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２
５８巻、第３３４１−３３４５．１９８３年（Ｓａｎｔ
ｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ旧ｏ１ｏ
ｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５８　：　３３４
１−３３４５　（１９８３）））　、アイメリア種、特
にＥ、テネラ挿出表面は抗原的に複雑なようである〔ラ
イラシャ−、モレキュラー・アンド・バイオケミカル・
パラサイトロジー、第２１巻、第７−１５頁、１９８６
年（ｌＪｉｓｈｅｒ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、　
　２１　：　７−１５（１９８６）））。挿出段階では
生体外で培養されず、しかも多量の挿出物質が惧用的生
化学分析及びサブユニットワクチン評価のために必要で
あることから、これら抗原の精製が問題を提起した。

本明細書で用いられているサブユニットワクチンは、い
ずれかのアイメリア種の生育期の１以上から単離される
か又は組換えＤＮＡ技術によって産生され、しかも単独
で又は他のかかるペプチド、ポリペプチドもしくはタン
パク質との組合せでワクチン接種後に家禽において保護
免疫を生じさせるようなペプチド、ポリペプチド又はタ
ンパク質として定義される。組換え抗原又は免疫原は、
１以上の生育期のアイメリアから単離されるペプチド、
ポリペプチド又はタンパク質と同一であるか又は類催し
ている。免疫原は、微生物に対して免疫を生じるワクチ
ンの使用のような、体内に導入された場合に自然的な保
護である免疫応答を刺激する物質として定義される。免
疫は、外来生物の侵襲もしくは病原作用又は外来生物産
生物の毒性作用に対する非感受性として定義される。保
護免疫は、体液性又は細胞性免疫のいずれであってもよ
い。体液性免疫は、身体の血漿、リンパ液及び組織中に
存在しかつ細胞に付着しうる抗体によって媒介される特
異的免疫として定義される。細胞性免疫は、Ｔリンパ球
によって媒介される特異的免疫として定義される。抗原
は、特異的抗体と特異的に結合しうる物質を表わすため
に本明細書では用いられている。

完全（インタクト）Ｅ、テネラ挿出に対して作られたモ
ノクローナル抗体によって確認される可溶化Ｅ、テネラ
種挿出ンパク質は、感染性嚢胞体による侵襲から鶏を保
護しうろことが示された〔ジエンケル（Ｓｃｈｅｎｋｅ
ｌ）ら、欧州特許出願第１３５．７１２号明細書〕。同
様の結果は、同様の技術で作られたＥ、テネラ娘虫（ｍ
ｅｒｏｚｏｉ　ｔｅ）からも得られた（ジエンケルら、
欧州特許出願第１３５．０７３号明細書）。

免疫原ポリペプチドはＥ、テネラ挿出から単離された〔
マレ−（Ｍｕｒｒａｙ）及びガルスカ（Ｇａｌｕｓｋａ
）、米国特許第４，６３９．３７２号〕。しかしながら
、いずれの個別的ポリペプチドがＥ、テネラ侵襲から鶏
を保護しているのかについて、指摘はなかった。

組換えＤＮＡ技術によれば、免疫原アイメリアポリペプ
チドの確認及びワクチン開発に十分な攬のポリペプチド
の産生が可能であった。ニューマン（Ｎｅガｍａｎ）ら
は欧州特許出願第１６４．’１７６号において、それぞ
れ１７，０００及び８，０００ダルトンの２つのサブユ
ニットから構成されるＥ、テネラ由来の２５．０００ダ
ルトンポリペプチドの単離について記載している。２５
，０００ダルトンポリペプチドはゲノムＤＮＡクローン
を用いた組換えＤＮＡ技術によって産生され、Ｅ、テネ
ラによりもたらされるコクシジウム症から鶏を保護する
ことが示された。もう１つの免疫原Ｅ、テネラポリペプ
チドは、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）及びマクカ
ントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ）により特許協力条約
出願ＷＯ第８６１００５２８号で開示されている。この
ペプチドは配列決定されたが、２８０のアミノ酸から構
成されており、嚢胞体ゲノムＤＮＡクローン及び全嚢胞
体ｍＲＮＡから単離されるクローンの双方を用いた組換
えＤＮＡ技術によって産生され、コクシジウム症から鶏
を保護する。最近、クラーク（Ｃ１ａｒｋ）ら、モレキ
ュラー・アンド・バイオケミカル・パラサイトロジー、
第２２巻、第７９−８７頁、１９８７年では、発現ベク
ターλａｍｐ　３を用いた大腸菌中での［、テネラ由来
ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作成について開示した
。Ｅ、テネラ免疫原を発現するクローンが検出されたが
、但しいずれのペプチドも免疫原活性について試験され
なかった。アイメリア・テネラ挿出の表面積は、有効な
表面免疫原を特徴付けるために様々な技術によって標識
化された〔ライラシャ−、モレキュラー・アンド・バイ
オケミカル・パラサイトロジー、（Ｗｉｓｈｅｒ＋・Ｍ
ｏ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＰａｒａｓｉＬ、）第２１巻、
第７−１５頁、１９８６年）。抗Ｅ、テネラ抗体と反応
した主な表面ポリペプチドは、下記範囲内、即ち１１３
９６ｋＤ、７３−６７ｋＤ、５４−４２ｋＤ。

３７−３２ｋＤ及び１８−１４ｋＤであった。

発現ベクターは免疫原として有用な融合タンパク質を発
現させるために使用することができる。

ベクターは複製オリジン及び細菌に対する選択マーカー
を有する３、３５キロベースペアーベクターが特徴であ
る。プラスミドは発現される異種タンパク質をコード化
するＤＮＡセグメントを調製するために大腸菌プロモー
ターセグメント、Ｃｈ　ｅ　Ｙ融合タンパク質配列、及
びＣｈｅＹセグメントの３′末端に於ける特有の制限部
位を有する。

したがって、本発明の目的はコクシジウム症に対して鶏
を免疫するために用いることができるアイメリア・テネ
ラの新規タンパク質を提供することである。本発明の他
の目的は、胞子形成嚢胞体及び稚虫に特に係わる免疫原
タンパク質を提供することである。本発明のさらに他の
目的は、免疫原タンパク質の推定アミノ酸配列を提供す
ることである。本発明のさらに他の目的は、特異的タン
パク質免疫原についてコードする遺伝子を単離すること
及び適切な発現ベクター中に遺伝子を組込むことである
。本発明のさらに他の目的は、適切な宿主を各々の組換
えベクターで形質転換し、特定コクシジウム遺伝子の発
現を誘導し、かつ純粋な免疫原を単離することである。

本発明のさらに他の目的は、特異的コクシジウムタンパ
ク質発現用の新規発現ベクターを製造することである。

本発明のさらに他の目的は、免疫原タンパク質に対して
反応する単一特異性抗体を製造することである。

本発明は、アイメリア・テネラの胞子形成嚢胞体、捕虫
、契止、嫡出に係わるタンパク質の天然もしくは組換え
精製タンパク質免疫原及びいずれかの微異質（ｍｉｃｒ
ｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）　もしくはサブユニッ
ト免疫原を基礎にしたコクシジウム症ワクチンに関する
。本明細書で用いられている天然タンパク質とは、寄生
虫の適切なアイメリア遺伝子により産生される完全な鎖
長を有するタンパク質に関する。組換えとは、所望タン
パク質相遺伝子の単離及び所望タンパク質を過剰産生ず
る細菌を作り出すためのかかる精製遺伝子の使用に関す
る。

サブユニット免疫原は、天然免疫原部分よりも少ないア
ミノ酸を有するが但し免疫原の免疫原性部位を含んだ免
疫原タンパク質又はポリペプチド部分として定義される
。本明細書で用いられる微異質体とは、翻訳後構造的に
修正された単一遺伝子産物、即ちＤＮＡの単一遺伝子ユ
ニットから産生されるタンパク質に関する。しかしなが
ら、これらの構造修正によって、タンパク質免疫原活性
のいかなる有意的変化も生じない。修正は、寄生虫の体
内で又は単離及び精製過程中に生じる。生体内修正の結
果、格別限定されないが、Ｎ末端のアセチル化、タンパ
ク質分解、グリコジル化又はホスホリル化が生じる。タ
ンパク質分解としては、１以上の末端アミノ酸が連続的
、酵素的に開裂されて原遺転子産物よりも少ないアミノ
酸数の微異質体を生じる細胞外タンパク質分解がある。

タンパク質分解には、アミノ酸配列中の特定箇所でペプ
チドを開裂するエンドプロテアーゼの作用によって生じ
る細胞内タンパク質分解修正も含む。同様の修正は精製
過程中でも起こり、その結果微異質体を生じる。精製中
に起きる最も一般的な修正は、プロテアーゼ阻害剤の使
用によって通常最小限に保持されるタンパク質分解であ
る。

更に本発明は、個々のタンパク質に関する遺伝情報の単
離及び精製、並びに対応免疫原タンパク質の発現方法に
関する。本明細書で用いられるボＪペプチド又はタンパ
ク質は、アミド結合で互いに結合したアミノ酸の直鎖ポ
リマーに関する。鎖中のアミノ酸配列は、タンパク質又
はポリペプチドの生物学的機能に関して極めて重要であ
る。ポリペプチド及びタンパク質はζ本明細書において
互換的に用いられる。本明細書で用いられる免疫原とは
、動物体内に導入された場合に１．天然のままで機能的
である体液性及び／又は細胞性免疫応答、即ち特定感染
症から動物を保護しうる免疫を促進する分子又は大分子
に関する。本ケースにおいて、免疫原は体液性、細胞性
のいずれか又は双方の免疫応答を生じさせ、コクシジウ
ム症を起こすアイメリア種による感染から家禽を保護す
る。

アイメリア・テネラ嚢胞体は４〜１０日前、好ましくは
７日前に感染した鶏の盲腸内容物から単離され、一方、
Ｅ、アセルブリナ嚢胞体は５〜６日前に感染した鶏の糞
及び腸内容物から単離される。

盲腸内容物及び糞はそれぞれウェアリング・ブレンダー
（Ｗａｒｉｎｇ　Ｂｌｅｎｄｅｒ）内でそれぞれ蒸留水
中で物理的に粉砕され、タンパク質分解酵素、好ましく
はペプシンで分解される。破壊屑及びペプシンは蒸留水
中での遠心により除去される。部分的に純粋な嚢胞体分
画は約２．２Ｍスクロース中での浮遊化により集められ
〔ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、パラサイトロジー、
第５４巻、第８７−９３頁、１９６４年〕、更に約４℃
で約１０分間水中約５〜約６％、好ましくは５．２５％
の濃度の次亜塩素酸ナトリウム中におけるインキュベー
トによって処理される。次亜塩素酸ナトリウムは、精製
された無菌嚢胞体を得るために、約ｐＨ７，６の無菌リ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）での数回の洗浄により除去される
。嚢胞体は約２０°Ｃで約４８時間にわたり振盪水浴中
で胞子形成せしめられる〔エドガー　トランザクション
ズ・オブ・アメリカン・マ・イクロオーガニズム・ソサ
エテー、第６２巻、第２３７−２４２頁、１９５４年（
［！ｄｇａｒ、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓｏｆ　Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　５ｏｃｉｅ
ｔｙ、６２　：　２３７２４２　（１９５４）））。

胞子形成嚢胞体はＰＢＳに懸濁され、プランソニック（
１）ｒａｎｓｏｎｉｃ）細胞破壊器〔ブランソン（Ｂｒ
ａｎｓｏｎ）　）巾約０°Ｃで先細プローブにより破壊
される。超音波処理は過熱を防止するために約３０秒間
のショートバースト（ｓｈｏｒｔ　ｂｕｒｓｔ）で行わ
れ、９０％の破壊が約５〜約２０分間で生じる。界面活
性剤、好ましくは約０．１ｗ／ν％のツビッタージェン
ト３−１２　（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３　１２　）
　　（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　）が超
音波処理液に加えられ、混合物は約４°Ｃで約１８時間
撹拌される。

界面活性剤処理された胞子形成嚢胞体は約２７，０００
Ｘｇで約３０分間遠心分離され、上澄液が集められる。

種型は、パラトン、サイエンス、第１５０巻、第７６７
−７６９頁、１９６５年（１’ａｔｔｏｎ＋　５ｃｉｅ
ｎｃｅ１５０　ニア６アー７６９　（１９６５））の操
作に従い、ゆるめた乳棒装備のｍｌホモゲナイザー中約
４　’Ｃ約５０　Ｏｒｐｍで約５分間にわたり約ｐＨ７
，６のＰＢＳ中約５Ｘ１０’／ｄの精製胞子形成嚢胞体
懸濁物をすりつぶすことにより得られる。破壊された物
質は遠心分離により集められる。Ｅ、テネラペレットは
非破壊嚢胞体、スポロシスト（ｓｐｏｒｏｃｙｓ　ｔ）
及び嚢胞体外被からなり、ハンクス（Ｉｌ’ａｎｋｓ）
平衡塩溶液（ｐＨ７、４）のような緩衝液巾約０．２５
％（ｈ／ｖ）　）リプシン及び約４％（ガ／ν）タウロ
デオキシコール酸〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）含有騰貴
用溶液中に再懸濁される　Ｈ，アセルブリナペレントも
非破壊嚢胞体、スポロシスト及び嚢胞体外被からなり、
ハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７，４）のような緩衝液巾約
０．１２５％（ｗ／ｖ）　トリプシン（１：２５０）及
び約１．０％タウロデオキシコール酸含有脱騰貴溶液中
に再懸濁される。再懸濁されたペレットは約５％ＣＯ２
含有雰囲気中で約４１’Ｃでインキュベートされる。騰
貴化はε、アセルプリナの場合約０．５時間及びＥ、テ
ネラの場合約１時間続けられ、しかる後溶液が遠心分離
で除去される。

種型は、シュマソッら、ジャーナル・オブ・プロトズー
ロジー、第３１巻、第１８１−１８３頁、１９８４年（
Ｓｃｈｍａｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌｏｇｙ３１　：　１８１−１８３　
（１９８４）　）の方法に従いＤＢ−５２アニオン交換
カラムを用いて単離される。精製された種型は、少なく
とも３回の凍結及び解凍によって破壊されるが、破壊さ
れるまで約１ｍＭフヱニルメチルスルホニルフルオリド
含有ＰＢＳ中で超音波処理される。

胞子形成嚢胞体及び捕虫細胞の双方を含有していない調
製物は、ｐｏ約７．２の約５０　ｍＭ　ＮａｚｌｌＰＯ
４Ｎａｌｌ□ｐｏ、及び約０．１％ツビッタージエント
３−１２含有の分離用緩衝液中におけるゲル浸透クロマ
トグラフィー、好ましくはセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｓ−２００（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）　）により分離される。各調製物は８Ｘ４４ｃｍの
カラムに加えられ、分離用緩衝液で溶離される。溶出は
２３０ｎＩ１１の吸光度によってモニターされ、約１４
ｍ１ｌ／画分の両分が集められる。両分は直線勾配ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（５Ｏ５−ＰＡＧＥりによって分析され、両分
はこれらの特徴に従いプールされる。プールされた両分
は炭酸水素塩緩衝液に対して透析され、感染性Ｅ、テネ
ラ胞子形成嚢胞体の侵襲から鶏を保護しうるそれらの能
力について試験される。２０令ブロイラー鶏は、ＰＢＳ
中無胞子形成嚢胞体又は無挿出細胞免疫原タンパク質約
５μｇ〜約５０μｇのプール画分で筋肉内に免疫注射さ
れる。無細胞免疫原は、約０．１２ｄ／川量／鳥の総容
量中ミョウバン（最終濃度約０．４％）と沈降する。ミ
ョウバン−免疫原沈降複合体は、ウェアー、実験免疫学
ハンドブック、ブラックウェル・ナイエンティフインク
・パブリケーションズ、ロンドン、第Ａ３．１１頁、１
９７８年［Ｗｅｉｒ、１ｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＩＥｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋Ｂｌａ
ｃｋｗｅｌｌ　ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ、ｐｇ、Ａ３．１１　（１９
７Ｂ））の技術によって製造される。免疫処理は９日目
及び１６日目に繰返されたが、鳥は最終免疫後７日目の
２３日目に感染性Ｅ、テネラ胞子形成嚢嚢胞で侵懇され
る。各調製物からの単一画分が挿出侵聾から鶏を保護し
た。これらの両分は同様の溶出及び電気泳動特性を有し
ていたことから、ポリペプチドが類似であることを示唆
している。胞子形成嚢胞体から単離された最も活性な免
疫原画分はカラム画分８４−９４でみられ、画分Ｖと命
名されている。

抗血清は、アイメリア・テネラの胞子形成嚢胞体（画分
■）、挿出、超音波処理非胞子形成嚢胞体、第二世代製
出及びＥ、アセルプリナの超音波処理捕虫の免疫保護画
分に対して作られる。Ｅ、テネラ製出は、ジェームス（
Ｊａｍｅｓ）、パラサイトロジ、第８０巻、第３０１−
３１２頁、１９８０年のプロトコールに従い感染後約４
日間で４腸細胞から得られる。血液は免疫操作開始前に
抗体産生動物、好ましくはウサギから集められ、免疫前
血清が単離されて、コントロール目的用に貯蔵される。

ウサギは、上記のうち１つの免疫原タンパク質約２０〜
約８０μｇ／免疫で複数回の免疫注射をうける。初回の
免疫は、許容されるアジュバントと共に、通常等量の免
疫原及びアジュバントで行われる。許容されるアジュバ
ントとしては、フロイント完全液、フロイント不完全液
、ミョウバン沈降物、コリネバクテリウム・パルブム（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）及び
ｔ　ＲＮＡ含有油中水型エマルジョンがあるが、フロイ
ント完全アジュバントが初回免疫用として好ましい。フ
ロイント不完全アジュバントはすべての追加免疫用とし
て好ましい。初回免疫は、ウサギ背中の複数皮下部位に
おけるエマルジョン約１−の投与からなる。

等量の免疫原を用いる追加免疫は約１か月間隔で行われ
、十分量の抗体が個々のウサギ血清中に存在するまで続
けられる。血液は集められて、血清が当業界で公知の方
法により単離される。抗コクシジウム抗血清は、血清学
的分析、好ましくは非胞子形成嚢胞体、胞子形成嚢胞体
、挿出及び製出から得られる抗原を用いたウェスターン
プロット分析によって特徴付けられる。本明細書で用い
られる抗原は、抗体と結合しうるいずれかの物質として
定義される。上記のような免疫原は、特異的抗体を特徴
付けるために用いられる場合には抗原とみなされる。

上記のようなウェスターンプロット分析に用いられる約
５０μｇの寄生虫免疫原は、約ｐｌ＋６．８の約０．　
Ｉ　Ｍ　Ｆリス１１Ｃ！、約４％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）、約２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０
％（ｖ／ｖ）　２−メルカプトエタノール及び約０、　
ＯＯ２％（ｖ／ｖ）ブロモフェノールブルーからなる約
２倍濃縮サンプル緩衝液とほぼ等量で混合される。サン
プルは、レムリ、ネーチャー、第２２７巻、第６８０−
６８４頁、１９７０年（Ｌａｅｍｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０　６８４　（１９７０））
の方法により、約３分間煮沸され、ＳＤＳ含有ポリアク
リルアミドゲル（ＰＡＧＥ）の５〜２０％直線勾配上で
電気泳動に付される。ＳＯ５−ＰＡＧＩＥにより分離さ
れたタンパク質はトービンら、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、
第７６巻、第４３５０−４３５４頁、１９７９年ＣＴｏ
ｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏ
ｆＮａｔｉｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ　７６　：　　４３５０４３５４　
（１９７９）　）の方法により電気泳動的にニトロセル
ロースに移動し、ニトロセルロースは約ｐＨ７，４のリ
ン酸緩衝゛液中０．５％ゼラチンでブロックされる。ブ
ロックされたニトロセルロースは、約０．２５％ゼラチ
ン及び０．０５トリトンＸ−１００含有Ｔ　Ｅ　Ｎ　ｌ
ｆｉ衝液（約ｐＨ７，４の約５０ｍＭ１−リス！ＩＣ１
、約１５０ｍＭ　ＮａＣ１及び約５ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴ八）巾約１＝５〜１：４００で希釈さ
れた適切な抗血清約２０ｍ１中において室温で一夜イン
キュベー１・される。結合抗体は“２５１−タンパク質
Ａの添加によって検出される。

免疫を生じる上記コクシジウムポリペプチドのいずれも
が公知の分離又は精製法によって均質に精製されないこ
とから、個々のポリペプチドのアミノ酸組成を明らかに
することは不可能であった。

したがって、様々なアイメリア抗原に対する抗体が、組
換えＤＮＡ技術で得られる保護コクシジウム免疫原ポリ
ペプチドを免疫学的方法により確認するために用いられ
る。組換えＤＮＡ技術は、異なる細胞、通常異なる生物
由来の遺伝情□報ＤＮＡセグメントをそのＤＮＡが得ら
れる生物体外で端部間で結合させかつ原ＤＮＡがコード
するタンパク質について産生ずべき細胞中にこのハイブ
リッドＤＮＡを組込むための技術として、本明細書では
定義される。遺伝情報ＤＮＡ又はｍＲＮＡは胞子形成嚢
胞体又は挿出から単離され、適切なりロニングベクター
に組込まれ、適切な宿主細胞中に導入されて、宿主細胞
の産物は抗Ｅ、テネラ抗体と結合するポリペプチドの産
生に関してスクリーニングされる。免疫反応性ポリペプ
チドを発現することが確認された遺伝子は、適切な発現
ベクター中に組込まれ、適切な宿主細胞系中で発現せし
められる。

本明細書で用いられるクローニングベクターは、特定の
実験的外来ＤＮＡの組込みが可能であって、しかも安定
状態で存在しかつ実験的ＤＮＡで指示されたタンパク質
を発現しうる宿主細胞中に結合ＤＮＡが導入されるため
のＤＮＡ配列として定義される。ベクターＤＮＡと結合
した外来ＤＮＡは、組換え技術で得られる組換えＤＮＡ
分子を構成する。クローニングベクターとしては、プラ
スミド、バクテリオファージ、ウィルス及びコスミドが
ある。いずれのクローニングベクターも新規アイメリア
免疫原ＤＮＡ配列を複製するために使用可能であると解
されるが、ラムダｇｉｌｌが好ましい。

通常、クローニング、ＤＮＡプロセッシング及び初期発
現用の宿主細胞としては細菌がある。好ましいクローニ
ング用宿主は大腸菌である。発現ベクターは、適切な宿
主中における遺伝子複製コピーの転写及びそれらのｍ　
ＲＮ　Ａの翻訳のために必要なりＮＡ配列として本明細
書では定義される。

このようなベクターは、細菌、藍藻植物、酵母細胞、昆
虫細胞及び動物細胞のような様々な宿主中で原核細胞又
は真核細胞いずれかの遺伝子を発現させるために使用す
ることができる。免疫原は、いくつかのウィルス系中で
も発現しうる。特別にデザインされたベクターは、細菌
−酵母又は細菌動物細胞間におけるＤＮＡのシャトル化
Ｃｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）を可能にする。適切に構成され
た発現ベクターは、宿主細胞中での自律的複製用の複製
源、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コ
ピー数及び強いプロモーターを含んでいるべきである。

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合さ
せてＲＮＡ合成を開始させるためのＤＮＡ配列として定
義される。強ブロモークーとは、高頻度でｍＲＮＡが開
始せしめられるようなものをいう。発現ベクターとして
は、格別限定されないが、クローニングベクター、修正
クローニングベクター、特別デザインプラスミド又はウ
ィルスがある。

本発明の独特な免疫原タンパク質は、格別限定されない
が、アイメリアの規定遺伝子により特定化される完全タ
ンパク質、即ち天然タンパク質として又はそのいずれか
のフラグメントもしくはサブユニットとして、又は完全
タンパク質、そのフラグメントもしくはサブユニットの
ハイブリッドとして存在しうる。本明細書で用いられる
完全タンパク質とは、適切なアイメリア遺伝子から得ら
れる完全鎖長ポリペプチドに関する。完全タンパク質は
、適切なアイメリア種からの精製により、又は対応組換
え遺伝子産物の適切な発現ベクターにおける発現により
得られる。タンパク質フラグメント又はサブユニットと
は、完全タンパク質よりも少ないアミノ酸数であってか
つ抗コクシジウム免疫を導きうる能力を留めたいずれか
のタンパク質部分に関する。ハイブリッドタンパク質と
しては、格別限定されないが、発現ベクター内の複数遺
伝子の発現から得られるタンパク質又は融合タンパク質
がある。融合タンパク質は、発現ベクターによりコード
された限定数のアミノ酸が発現せしめられて、発現の結
果特異的免疫原ポリペプチドにそれらが結合しているよ
うなものとして定義される。複数遺伝子から得られるタ
ンパク質としては、免疫反応性を高める第二ポリペプチ
ド又はペプチドにペプチド結合で結合せしめられた特異
的免疫原ポリペプチドがある。高めるポリペプチド部分
は、コクシジウム免疫原に対する免疫応容性を増加させ
うる能力を有している。

適切なコクシジウムＤＮＡは、遺伝子由来タンパク質を
抗画分■及び抗挿出抗体と反応させるごとにより単離か
つ確認される。組換えコクシジウムポリペプチドは、ゲ
ノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのいずれかの天然遺伝子をクロ
ーニングすることにより得られる。ゲノムＤＮＡは、特
異的遺伝子を得る好ましい方法であるが、約０．５％Ｓ
ＤＳ及び約１５ｍＭ　ＥＤＴＡによる処理で約１．５Ｘ
ＩＯ’の寄生虫を破壊することによりスポロシスト又は
種型から抽出される。放出されたＤＮＡは、約５０°Ｃ
で約３時間約１００μｇ／ｍρのタンパク質分解酵素、
好ましくはプロテイナーゼにでの分解によって可？容化
される。ゲノムＤＮＡは、フェノールによる約２回の抽
出、フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコー
ル（約２５：２４：１）の混合物による約２回の抽出、
クロロホルム及びイソアミルアルコール（約２４　：　
１）による約２回の抽出、並びに酢酸ナトリウム／エタ
ノールによる約２回の連続的沈降によって精製される。

ＤＮＡは、約７０％エタノールで２回洗浄され、約５×
１０８寄生虫相当数／ｄのおよその濃度でトリスＩＣＩ
！、、約１０ｍＭ、ＩＥＤＴＡ、約１ｍＭ　（ＴＥ）中
に再懸濁される。いずれの関連ＲＮＡも、約３７゛Ｃで
約６０分間約５０　Ｂ　ｇ　／　ｍｌの濃度でＲＮアー
ゼ、好ましくは熱不活性化ＲＮアーゼＡでの分解により
選択的に除去される。ＲＮＮアーゼ及び他のいずれの残
留タンパク質も、約５０°Ｃで約３時間約０．５％ＳＤ
Ｓ／１５ｍＭ、ＥＤＴＡ中におけるプロテイナーゼＫに
よる二次分解によって除去される。次いで、ゲノムＤＮ
Ａは有機溶媒で抽出され、エタノールで沈降され、約７
０％エタノールで洗浄され、遠心分離により集められる
。ゲノムＤＮＡペレットは約２〜３ＸＩＯ’種虫相当数
／　ｍｌの濃度でＴＥに懸濁され、２６０ｎｍでの吸光
度により定量される。コクシジウムＤＮＡは、高分子Ｉ
ＤＮへの物理的〔オールド及びプライムロース、遺伝子
操作の原理、第２版、カリフォルニア大学出版、第２０
頁、１９８１年（Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ。

Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ、　２　ｎｄ　Ｅｄ、。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　
Ｐｒｅｓｓ＋　　ｐ、２０（１９８１））又は化学的〔
スミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）　　ら、サイエンス、
第２０２巻、第１２８４−１２８９頁、１９７８年〕い
ずれかの断片化によってクローニング用に製造される。

次いで、ゲノムＤＮＡは適切なりロニングベクター、即
ち下記ｃＤＮＡ用クローニングベクター中に組込まれる
。クローニングベクターは宿主細胞中に導入され、ヒユ
ーインら、“ＤＮＡクローニング：実務的アプローチ”
、第１ｓ、グローバー編集、ＩＲＬブレス、オックスフ
ォード、第４９−７８頁、１９８５年［Ｈｕｙｎｈｅｔ
　　ａｌ、、Ｉｎ　　ＤＮＡ　　ｃｌｏｎｉｎｇ：　　
Ａ　　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　ａｐｐｒｏａｃｈ”。

Ｖｏｌ、　Ｉ　、　Ｇｌｏｖｅｒ　Ｅｄ、、ＩＲＬ　Ｐ
ｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ＋　１）Ｉ）、　４９７８（１
９８５））の場合と同様の操作によってスクリーニング
される。陽性クローンは、所望の免疫原タンパク質の多
量産生用に工学処理された発現ベクターに移される。下
記発現ベクターは、免疫原タンパク質産生用に適した下
記宿主細胞中に導入されて形質転換させる。

コクシジウム免疫原ポリペプチド産生用の遺伝情報を得
るための最も好ましい方法は、特定タンパク質について
コードするｍＲＮＡの単離である。

全ＲＮＡは、約７時間胞子形成された嚢胞体及び種型か
らチャーブウィンら、バイオケミストリー第１８巻、第
５２９４−５２９９頁、１９７９年（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ
　ｅＬ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８　：
　５２９４５２９９　（１９７９））のグアニジニウム
チオシアネート法を用いて単離される。ポリアデニル化
ＲＮ　Ａ　４；ｔ、、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロ
マ１〜グラフイーにより選択される〔アビブ（＾νｉｖ
）及びレーダー（Ｌｅｄｅｒ）、プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ
（Ａｖｉｖ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９）、第６９巻、第１４
０８−１４１２頁、１９７２年〕。

約６〜約９μｇのポリアデニル化ＲＮＡを用いる場合、
−次及び二次ｃＤＮＡ鎖反応はガブラー及びホフマン、
ジーン、第２５巻、第２６３−２６９頁、１９８３年（
Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｉｌｏｆｆｍａｎ＋Ｇｅｎｅ　
２５：２６３−２６９　（１９８３））に記載された操
作に従い、ＡＭＶリバーストランスクリプターゼのよう
なリバーストランスクリプターゼ、ＲＮＮアーゼのよう
なＲＮアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ■のようなりＮＡ
ポリメラーゼを用いて行われる。ｃＤＮＡはＩＥｃｏｌ
？　！メチラーゼのようなメチラーゼでメチル化され、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼでプラン
ト末端化され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡリガ
ーゼによって１ＥｃｏＲＩデキサヌクレオチドリンカー
のようなホスホリル化オリゴヌクレオチドリンカーに結
合せしめられる。リンカ−結合ｃ　ＤＮＡはＥｃｏＲＩ
のような制限酵素で完全に切断され、切断されたリンカ
−は２Ｍ酢酸アンモニウムから無水エタノールによる繰
返し沈降によって除去される〔オカヤマ及びハーグ、モ
レキエラー・セル・バイオロジー第２巻、第１６１−１
７０頁、１９８２年（Ｏｋａｙａｍａａｎｄ　Ｂｅｒｇ
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２
　：　ｌ　６１１７０　（１９８２））。ｃＤＮＡはエ
ルチップｄ　（Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ）カラム〔シュライヒ
゛ヤー＆シェル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｅ
ｌｌ））で更に精製される。制限酵素又は制限エンドヌ
クレアーゼとは、二本鎖ＤＮＡ中の特定ヌクレオチド塩
基配列を認識しかつ認識配列中の特定位置において２本
の鎖を開裂する酵素である。約１００〜約５００ｎｇ、
好ましくは３００ｎｇの精製ｃＤＮＡは、約７．５μｇ
の市販ＥｃｏＲＩ切断アルカリホスファターゼ処理λｇ
ｔｌｌヘクターＤＮＡ中に結合せしめられ、製造者の指
示〔アマ−ジャム（Ａ＋＋＋ｅｒｓｈａｍ）　）に従い
市販パッケージ化抽出物により生体外でパッケージ化さ
れる。他の許容されるベクターも使用可能であるが、λ
ｇｔｚが好ましく、その理由はそれが大腸菌中でβ−ガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質としてアイメリア抗原の
発現を誘導しうるからである。パラゲージ化ファージの
一部は大腸菌宿主Ｙ　１０８８株に導入され、これらは
約６００　ＩＩ　ｇ　／ｍｌ　Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インＦ　ＩＪルーβＤ−ガラクトピ
ラノシド）及び約１６ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）含有ＬＢ軟質寒天約２
．５−を用いてルリアバータニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔ
ａｎｉ）　（ＬＢ）培地寒天プレート上におかれる。

約ｌＸｌ０？の独立組換えファージクローンからなるｃ
ＤＮＡライブラリーが得られる。非組換えバンクグラウ
ンドは、Ｘ　−ｇａ　ｌ　／　ＩＰＴＧプレー１・上で
の増殖性から決定した場合、約１３％であると評価され
る。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ヒユーイン
ら、“ＤＮＡクローニング：実務的アプローチ”、第１
巻、グローバー編集、ＩＲＬプレス、オソクスフォード
、第４９−７８頁、１９８５年の方法によって行われる
。非増殖ｃＤＮＡライブラリーからパッケージ化された
ファージは上記ヒユーイン記載の大腸菌Ｙ１０９０株中
に導入され、約０．５〜約１．０Ｘ１０５プラーク形成
単位（ｐｆｕ）／プレー１への適切な密度でプレート培
養される。

プレートは約４２℃で約３時間インキュベートされ、約
１０ｍＭ−ＩＰＴＧ中に予め浸積されたニトロセルロー
スフィルターで覆われ、約３７℃で一夜再インキュベー
１・される。フィルターは除去され、約０．０５％ツイ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０　（ＴＢＳＴ）含有トリス緩
衝液（ＴＢＳ）　　（約５０ｍＭ）リス１ｌｃｌ、約１
５０ｍＭ　ＮａＣｌ！　、ｐＨ約８．０）のような許容
される緩衝液中約２０％牛脂児血清でブロックされ、約
２０％牛脂児血清含有ＴＢＳＴ中約１：１００希釈され
た適切な抗体、通常ウサギ抗挿出抗体又はウサギ抗画分
Ｖ抗体と共に適切な時間にわたりインキュベートされる
。すべての抗血清はラムダｇｔｌｌ溶原ＢＮＮ９３の濃
溶難物で完全に事前吸着される。抗体結合部位は、フィ
ルターを１２５■−タンパク質Ａと接触させることによ
り検出される。陽性プラークは、各クローンが純粋プラ
ークであることが示されるまで、取出され、再プレート
培養されかつ再スクリーニングされる。ウサギ抗挿出抗
体による約ｌＸｌ０６独立組換え体の胞子形成嚢胞体ラ
イブラリーの初回スクリーニングでは、約５７の抗原発
現ファージが単離される。二次及び三次の再スクリーニ
ングでは、初回に確認されたクローンの２９％以上が陽
性のままであることを示す。

交差スクリーニングでは、前記のように誘導された組換
え融合タンパク質と共に大腸菌Ｙ　１０９０細胞の区画
上に各プラーク精製クローンのファージ溶離物約１μｌ
をスポットすることが必要である。

タンパク質はニトロセルロースに移動し、上記のように
免疫プロットされる。交差スクリーニング用抗血清とし
ては、ウサギ抗Ｅ、テネラ非胞子形成嚢胞体抗体、ウサ
ギ抗Ｅ、テネラ挿出抗体、ウサギ抗画分■及びウサギ抗
Ｅ、テネラ製出抗体がある。

すべての抗血清はλｇｔｌｌ溶原ＢＮ溶加３の濃溶難物
で完全に事前吸着される。

組換え体及び野生型λｇｔｌｌファージは、約１０の多
重度で大腸菌宿主Ｙ１０８９株中に溶加として導入され
る。溶原化クローンは、約５０μｇ／ｒｓｌアンピシリ
ン補充ルリアーバータニ（ＬＢ）培地約１０−巾約３２
℃で、６００ｎｍの光学密度が０．２５に達するまで増
殖せしめられる。ファージ複製は約２０分間にわたる約
４５℃への温度シフトによって誘導され、β−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質の合成が約１０ｍＭ　ＩＰ１’
Ｇの培地添加によって誘導される。細胞はインキュベー
トされ、遠心分離により集められ、ペレットがｐＨ約７
．５の約５０ｍＭｔ−リス１ｌＣｆ、約１５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１、約５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
含有ＮＥＴ緩衝液約２５０μ！中約２％ＳＯ３と共に再
懸濁される。細胞は煮沸により溶離され、細菌ＤＮＡが
遠心分離により除去される。上澄液は変性条件下で約５
％ＳＯ５−ＰＡＧＥ上において分析される。２つの同一
ゲルが用いられるが、１つは銀染料〔バイオランド（Ｂ
ｉｏｒａｄ）　）で染色され、他はトービンら、プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サ
イエンスＵＳＡ　、第７６巻、第４３５０４３５４頁、
１９７９年の方法によって免疫プロットされる。

組換え免疫原の各々に対する単一特異性抗体は、ホール
（ｆｌａｉｌ）ら、ネーチャー、第３１１巻、第３７９
−３８２頁、１９８４年の方法の修正法により多特異性
（ρｏｌｙｓｐｅｃｊｆｉｃ）抗血清からアフィニティ
ー精製されるか、前記のようなウサギを下記のような精
製組換えＥ、テネラタンパク質で免疫処理することによ
り得られるか、又はコーラ−（にｏｈｌｅｒ　）及びミ
ルスタイン（Ｍ目５ｔｅｉｎ）　、ネーチャー、第２５
６巻、第４９５−４９７頁、１９７５年の技術を用いて
モノクローナル抗体として得られる。本明細書で用いら
れる単一特異性抗体は、関連抗原との均質的結合特性が
ある単一抗体種又は多抗体種として定義される。本明細
書で用いられる均質的結合とは、特異的な天然又は組換
え［。

テネラ群免疫原と関連した特異的抗原又はエピトープと
結合しうる抗体種の能力に関する。ポリクローナル抗血
清から単一特異性抗体を得るホールの技術では、スクリ
ーニング用に必要とされる精製組換えクローンからのフ
ィルタープラークリフ）（ｌｉｆｔ）の製造を必要とす
る。約２Ｘ１０’のプラーク形成単位が、３７℃のイン
キュベート時間の最後で半融合溶菌状態に近づくように
プレート培ｌｌされる。ニトロセルロースはプレートか
ら取除かれ、ＴＢＳＴ中で約４時間約２０％生胎児血清
でブロックされ、約０．０２％ＮａＮ、含有ＴＢＳＴ中
約２０％牛脂児血清で約１：２００希釈された事前吸着
多特異性血清約２０−と共に一夜インキユベートされる
。フィルターは、少なくとも２０分間約５０　ｄＴＢｓ
Ｔで少なくとも５回並びに約０．１５ｍＭＮａＣｌ及び
約０．０５％ツイーン２０で１回洗浄される。抗体は、
ρ１１約２．８で約３０分間約０．２　Ｍグリシン−１
１０１、約０．１５Ｍ　ＮａＣ１及び約０．０５％ツイ
ーン２０のような許容される溶離剤で溶離される。ｐＨ
は約８．０に調節され、抗体は貯蔵される。

組換えＥ、テネラ群免疫原、抗原又はエピトープの各々
に対して反応性のモノクローナル抗体は、近交系マウス
、好ましくはＢａβｂ／ｃを適切な組換えタンパク質で
免疫処理することにより得られる。マウスは、等量の許
容しうるアジュバント中０、５　ｄにつき約１１００ｎ
〜約１０μｇ、好ましくは約ＩμｇのＭｉ換え免疫原で
腹腔内に免疫注射される。このような許容しうるアジュ
バントとじては、格別限定されないが、フロイント完全
液、フロイント不完全液、ミョウバン沈降物、コリネバ
クテリウム・パルブム及びｔ　ＲＮＡ含有油中水型エマ
ルジョンがある。マウスには、初回免疫後約１４．２１
及び６３日目にアジュバントなしで等量の組換え免疫原
の静注追加免疫が行われる。最終追加免疫後約３日目に
、個々のマウスは抗組換え免疫原抗体に関して血清学的
に試験される。抗体産生マウスから肺臓細胞が単離され
、当業界で公知の技術により５Ｐ−２１０等のようなマ
ウスミエローマ細胞と融合せしめられる（コーラ−及び
ミルスタイン、ネーチャー、第２５６巻、第４９５−４
９７頁、１９７５年参照）。ハイブリドーマ細胞はダル
ベツコ修正イーグル培地（ＤＭＢＭ）のような適切な細
胞培地中ヒボキサンチン、チミジン及びアミノプテリン
存在下での増殖により選択される。抗体産生ハイブリド
ーマは、好ましくはマクファーソン、軟寒天技術、組織
培養法及び応用、クルーズ及びパターソン編集、アカデ
ミツクプレス、第２７６頁、１９７３年（Ｍａｃｌ’ｈ
ｅｒｓｏｎ。

５ｏｆｔ　　Ａｇａｒ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｉｎ
　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｍｅｔｈｏｄ
ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｋｒｕｓｅ　ａ
ｎｄ　Ｐａｔｅｒｓｏｎ、　１ｉｄｓ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ｐ、　　２７６　（１
９７３）　）の軟寒天技術を用いてクローニングされる
。別々のコロニーが適切な培地中での培養用に培養プレ
ートの各ウェルに移される。抗体産生細胞は、適切なＥ
。

テネラ組換え免疫原でスクリーニングすることにより確
認される。免疫原陽性ハイブリドーマ細胞は、当業界で
公知の技術により維持される。特異的抗組換えＥ、テネ
ラモノクローナル抗体は、生体外でハイブリドーマを培
養するか又は当業界で公知の操作によりハイブリドーマ
注射後マウス体内で腹水を作り出すことにより得られる
。

寄生虫抗原は、前記ウェスターンプロット分析により分
析される。対象クローンは、発現ポリペプチドと上記抗
血清との反応性に応じて４つの抗原群に分けられる（第
１表参照）。同−群の異なるクローンは、下記のように
、抗体反応性、ＤＮＡ交差ハイブリッド形成及び制限エ
ンドヌクレアーゼ地図作成から判断した場合に、同一ポ
リペプチドの各部分を発現する。

第１表 Ａ　　　　　十　　　　　　　＋　　　　　　　　　　
　　＋Ｂ　　　　十　　　　　〜　　　　　　　　　＋
Ｃ＋　　　　　　　　　　−−ト １４　　　　　＋　　　　　　−＋　　　　　ｎ、ｄ。

Ｆ　　　　　＋　　　　　ｎ、ｄ、　　　　　　　ｎ、
ｄ、　　　　ｎ、ｄ。

＋ ＋ ｎ、ｄ。

Ｅ、　ｔ、はアイメリア・テネラを示し、一方Ｅ、ａ。

はアイメリア・アセルブリナを示す。（＋）は抗体が特
異的組換え誘導タンパク質と反応することを示し、一方
（−）はかかる応答性の欠如を示し、ｎ、ｄ、は実、施
せず（ｎｏｔ　ｄｏｎｅ）を意味する。

λｇｔｌｌクローンからのｃ　ＤＮＡインサート（ｉｎ
ｓｅｒｔ）の精製は、約ｐＨ７，５の約５０ｍＭＮａＣ
ｊ！／約１００ｍＭ１−リス１Ｉ（Ｊ、約ＳｍＭＭｇＣ
１ｇからなる反応緩衝液中約５倍過剰の酵素ｕｃｏＲ［
で組換えファージＤＮＡを完全に切断することにより行
われる。反応生成物は約１／１０量の３　Ｍ　（ｐＨ５
，６）貯蔵溶液の添加によって約０．３　Ｍ酢酸ナトリ
ウムに調製され、エタノールで沈降され、冷却され、遠
心分離によって集められる。ベレットをＴＥに懸濁後、
ＤＮＡは臭化エチジウム含有アガロース中で電気泳動に
付され、ファージアーム（ａｒｍ）からインサートを分
離させる。

インサートの分別化は、紫外線下での視覚化により確か
められる。インサートはＮＡ−４５（シュレーチャー＆
シュエル）膜上で電気泳動に付され、かかる後膜から溶
離される。不溶性粒子は遠心分離により除去され、可溶
性物質はフェノール、フェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール及びクロロホルム／イソアミルアルコ
ールで抽出される。ＤＮＡは酢酸ナトリウム／エタノー
ルで沈降され、エタノールで洗浄され、風乾される。

各ＤＮＡの一部が確認用分析アガロースゲル上で分析さ
れる。

保護コクシジウム免疫原についてコードする遺伝子の発
現は、様々なプロモータ、−発現系をもついくつかの異
なる宿主細胞中で行われる。宿主細胞としては、細菌、
酵母、昆虫及び哺乳動物細胞がある。抗原はい（つかの
ウィルス系でも発現可能である。遺伝子は多数の原核生
物細胞及び様々な真核生物細胞中で発現しうるが、最も
好ましい宿主細胞は大腸菌である。保護免疫原の発現用
に使用可能な発現ベクターとしては格別限定されずｐＢ
Ｒ３２２、ｐＰＬａ　２３１１ＸｐＫＣ３０、ｐｔａｃ
　１２、λｇａｌｌ、ｐＡＳ　ｌ　、　ｐＬｃ　２４、
ｐＳＢ　２２６　、ｐＲＩＴ　２Ｔ及びＳＶ４０がある
が、ｐＪＣ２６４と命名されたＣｈｅＹ　−ｐＵｃ山来
ベクターが好ましい。天然タンパク質もしくはそのフラ
グメント、組換えタンパク質もしくはそのフラグメント
又はアイメリアペプチド免疫原性を高めるかもしくは高
めない他のタンパク質と結合した融合タンパク質である
アイメリア・テネラ免疫原の使用が本発明に含まれるこ
とは望ましい、しかつその意図でもある。融合免疫原は
、免疫原発現タンパク質が発現プラスミドでコードされ
た付加ポリペプチド部分又は付加ＤＮＡ塩基配列の導入
によって遺伝子に加えられた付加ペプチド部分を含有す
るようにデザインされる。ｐ　Ｊ　Ｃ２６４プラスミド
は、様々なアイメリア・テネラペプチドに結合又は融合
した５つのリンカ−アミノ酸に機能可能に結合せしめら
れた大腸菌ＣｈｅＹタンパク質の８８アミノ酸部分の発
現を含むようにデザインされる。機能可能に結合せしめ
られたとは、所望のタンパク質が機能可能に結合した遺
伝子、セグメント又はリンカ−をもつ発現ベクターを含
んだ細胞によって産生されうるようなヌクレオチドセグ
メント、リンカ−又は遺伝子の適切な連続的配列を意味
する。Ｃｈ　ｅ　Ｙ遺伝子のヌクレオチド配列及びその
遺伝子から得られるアミノ酸配列は下記表で示されてい
る。

第２表 ＣｈｅＹタンパク質のアミノ酸及びヌクレオチド配列■ （資） 魚 本 ＣＧＴ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＧＧＣＧＣＧ　ＡＴＧＴＣＧ
　ＧＣＡ　ＴｒＧ　ＣＣＡ　Ｇ’ｌＴ；　ＴＴＡ　ＡＴ
Ｇ　ＧＴＧ　ＡＣｒ　ＧＣＡ＾ＲＧ　　ＡＬＡ　　ＡＳ
Ｐ　ＧＬＹ　　ＡＬＡ　　［ＳＵＲＡＬＡ　　ＬＥＤ　
　ＰＲＯＶＡＬ　　ＬＥＤ　　Ｍ［ｉ　　ＶＡＬ　　Ｔ
ＩＩＲＡＬＡＪンカーアミノ酸は、天然タンパク質を産
生ずる前記のＥ、テネラ遺伝子を融合タンパク質に結合
させるために用いられるアミノ酸として本明細書では定
義される。いずれのアミノ酸又はアミノ酸群もリンカ−
として使用可能であるが、しがしながらＣｂｅＹタンパ
ク質をＥ、テネラタンパク質に結合しうるタンパク質の
好ましいアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は以下のと
おりである： ５　’　　　ＧＣＣＣＡＡ　　ＧＡＡ　　ＴＴＣＧＧＮ
　　３　’＾ＬＡ　　ＧＬＮ　　ＧＬＵ　　ＰＩＩＥ　
　ＧＬＹ３′末端ＮはｃＤＮＡの第一ヌクレオチドを構
成し、得られるアミノ酸がいつもグリシンであればいず
れのヌクレオチドも表わす。

好ましいプラスミドｐＪＣ２６４はプラスミドｐＪｃ２
２０から得られるが、これは大腸菌走化性遺伝子Ｃｈｅ
Ｙ及びラット動脈性す１−リウム利尿ファクター（ＡＮ
Ｆ）の遺伝子の部分を含んだ構造体から得られる。Ｃｈ
ｅＹ　−ＡＮｒ’プラスミドは、マツムラら、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー第１６０巻、第３６−４１
頁、１９８４年（Ｍａｔｓｕｍｕｙａ　ｅｔ　ａｌ、＋
　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１６０：３６−４１　　（１９８４））に記載されたＣ
ｏｆ［１由来プラスミドｐ　ＬＣｌ−２８から作成され
る。ＣｈｅＢ遺伝子の３′部分並びにＣｈｅＹ及びＣｈ
ｅＺ遺伝子を含むＣｈｅオペロンフラグメントはＢａｌ
ｌ１ｌｌ■−旧ｎｄｌｌｌフラグメントとしてｐＬｃｌ
−２８プラスミドから取出され、Ｂａｎ＋ＨＩ−旧ｎｄ
ｌｕ切断ｐＵｃ１３プラスミド（ＰＬバイオケミカルズ
（ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））に組込まれてサ
ブクローニングされ、ｐＨｃ　１３−　ＣｈｅＹ　−Ｃ
ｈｅＺプラスミドを生じる。ｐＵｃ　１３−ＣｈｅＹ−
ＣｈｅＺで形質転換された大腸菌ＪＭ１０５クローンは
、ｐＵｃ１３ベクターの影響をうけるハＣプロモーター
を除き、ＣｂｅＹ及びＣｈｅＺポリペプチドを発現する
〔デービスら、分子生物学における基本的方法、エルス
ピア、ニューヨーク、ニューヨーク、第３０頁、１９８
６年（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　Ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ　Ｖｏｒｋ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ、ｐｇ、　３０（１９８６）　）　、　ｐＵｃ　１３
−ＣｈｅＹ−ＣｈｅＺプラスミドは、ＣｈｅＹコード領
域内部の唯一のＰｓｔｌ会１立（前記マツモトら参照）
及び挿入Ｃｈｅ　ＤＮＡの３′側のｐＵｃ１３ポリリン
カー内の唯一のＳｍａ　１部位で切断される。ｐＵｃ１
３ベクター、ＣｈｅＢ遺伝子の３′部分及びＣｈｅＹの
Ｎ末端１００残基についてコードするＤＮＡを含んだ、
得られる３ｋｂＰｓｔｌ−Ｓｍａ　Ｉフラグメントは、
Ｍｅｔ−（ラットＡＮＦ−２６）配列についてコードし
かつＡＮＦペプチドの末端コドンの３′側に非翻訳ＲＡ
Ｓ　１配列５０ｂｐを有するｐｓｃＮｌ−（ラットＡＮ
Ｆ−２６）の１６０　ｂｐＰｓｔｌ−旧ｎｄｌｌＩフラ
グメントと再結合される。この発現ベクターはＣｈｅＹ
　−ＡＮＦベクターと呼ばれる。

ｐｓｃＮｌ−（ラットＡＮＦ−２６）融合プラスミドは
、酵母、ＡＳ　１タンパク質５ＣＩＮのＮ末端１６５ア
ミノ酸を発現するｐＳＣＮ　１プラスミドから作成され
る〔テミール（Ｔｅｍｅ　ｌｅ）　　ら、ネーチャー、
第３１３巻、第Ｔｏｏ−７０３頁、１９８５年〕。

プラスミドｐｓｃＩＮはＡｃｃ　Ｉで完全に分解され、
末端は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ大フラグメント（フ
レノウポリメラーゼ）で補足される。合成Ａ　Ｎ　Ｆ遺
伝子はｐｓｃＩＮに結合されて、コンピテント（ｃｏｍ
ｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＪＭ１０５細胞を形質転換させる
ために用いられる＠　ＣｈｅＹフラグメントの前の［！
ｃｏＲＩ制限部位から最初のｌ１ｉｎｄｎｌ制限部位ま
でのＣｈｅＹ−へＮｌ？プラスミドのヌクレオチド配列
は、ヤニツシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ）　ら、ジーン、第３３巻、第１０３−１１９頁、１
９８５年でｐＵｃ１９に関して示されたものと同一であ
る。

ｐ　ＪＣ２６４発現プラスミドはλｇｔ　１１　Ｅｃｏ
Ｒ１部位として同一の読取り枠で唯一のＥｃｏＲ１部位
を有しており、λｇｉｌ１発現ライブラリーからのＣｃ
ｏＲＩフラグメントの容易なサブクローニング及び発現
を可能にしている。得られる融合タンパク質中における
ＣｈｅＹ遺伝子産物部分の取込みは、タンパク質の安定
化を促進しかつタンパク質の精製度を高める。β−ガラ
クトシダーゼのような他の融合キャリアと比較してサイ
ズの小さなＣｈｅＹタンパク質の場合には、所定質量の
融合タンパク質において対象タンパク質のモル収率をよ
り好ましいものにする。ＣｂｅＹ含有プラスミドｐ　Ｊ
Ｃ２６４は、アミノ末端の最初の９３アミノ酸が大腸菌
ＣｈｅＹタンパク質及びリンカ−に由来する融合タンパ
ク質を高レベルで発現する。上記のように、ｐＪＣ２６
４プラスミドは第７図で示されているようにＣｈｅＹ　
−ＡＮＩ’−プラスミドから得られる。ＣｈｅＹ　−Ａ
ＮＦは１１ｉｎｄｌｌで部分的に切断され、約０．７％
ジ−プラーク（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ　）アガロースゲル
中で電気泳動に付される。完全鎖長直鎖ＤＮＡは機械的
に摘出され、溶融によりゲルから除かれ、ＮＡＣＳカラ
ム（ＢＲＬ）で精製され、エタノール沈降により回収さ
れる。

ＤＮＡフラグメントはＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ
フラグメント〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　）で１ｌｉｎｄｌＩ
［末端を補足することによりプラント化され、フェノー
ル抽出され、エタノール沈降に供される。５′位にホス
ホリル化されたＢａｍ１ｌｌリンカ−は精製ＤＮＡに結
合され、大腸菌ＨＢＩＯＩは結合混合体で直接形質転換
される。アンピシリン耐性形質転換体コロニーはＢａｍ
ｆｌｌリンカ−用に制限地図化される。ｐＪＣ２２０と
命名されたコロニーはプロモーター隣接ｌ１ｉｎｄ１部
位にＢａｍ旧リクリンカ有している。プラスミドはその
場合にＣｈｅＹコード領域の３′末端に旧ｎｄｌｌ［部
位を有しており、したがって独特である。

プラスミドｐＪｃ２２０は旧ｎｄ［［で切断され、４塩
基突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）のうち２塩基はｄＡＴＰ
及びｄＧＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ
フラグメントで補足される。突出部のうち残り２塩基は
Ｓ１ヌクレアーゼで除去され、プラント末端を与える。

次いで、ＤＮＡはＥｃｏＲＩで切断され、ｄＡＴＰ及び
ｄＴＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラ
グメントで補足される。

プラスミドはＴ４ＤＮＡリガーゼによるプラント末端結
合で再環化されてｐＪＣ２６４を生じるが、これはＣｈ
ｅＹコード領域の３′末端側に唯一のＣｃｏＲ１部位を
有している。今度の１ＥｃｏＲ１部位はλｇｔｌｌのＥ
ｃｏＲ１部９位として同一の読取り枠内に存在するため
、λｇｔｌｌライブラリー中発現により確認される抗原
のＣｈｅＹ融合タンパク質として直接的サブクローニン
グ及び発現が可能になる。ｐ　Ｊ　Ｃ２６４制限地図は
第８図で示されている。

組換えλｇｔｌｌバクテリオファージのミニプレプ（ｍ
ｉｎｉｐｒｅｐ）が製造され、ファージＤＮＡが単離さ
れる。各抗原用の遺伝子インサートはＥｃｏＲ１消化で
除去され、アガロースゲル電気泳動によりファージアー
ムから分別化される。次いで遺伝子は、唯一のＥｃｏＲ
１部位で直鎖化されかつホスファターゼ処理されて自律
結合能を低下させたプラスミドｐＪＣ２６４中に挿入さ
れる。次いで、結合生成物は当業界で公知の標準的Ｃａ
ＣＩｔ、法を用いて細菌宿主大腸菌ＪＭ８３中に組込ま
れて形質感染され（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）、形質転換体
はアンピシリンプレート上で選択される。アンピシリン
耐性コロニーとは、Ｅ、テネラ免疫原に対して得られる
ポリクローナル抗血・清を用いて、インサートの存在に
ついて調べ、細菌プロモーターに関する外来ＤＮＡの向
きについて調べ、かつウェスターンプロット分析により
細菌融合タンパク質の発現について調べるために、分析
的スケールで増殖せしめら概る。

ＤＮＡインサートは上記で確認された様々な免疫原群の
代表的ファージクローンから単離され、かつＣｈｅＹベ
クターｐＪＣ２６４に関して前記されたｐＵｃ１８プラ
スミド−ベクターに組込まれてサブクローニングされる
。各群の構成物の制限エンドヌクレアーゼ地図が作成さ
れる。制限エンドヌクレアーゼとしては、格別限定され
ず、下記のものがある： ＾１ｕｌ　　　　　ｌｌ１ｎｄＩＩＩ　　　　５ａｌｌ
Ａｐａｌ　　　　１ｌｉｎｃｌｌ　　　　５ａｕ３ａ＾
ｖａｌ　　　　ｌ１ｉｎｆｌ　　　　　５ｓＬＩＡｖａ
ｌｌ　　　　ｌ１ｐａｌｌ　　　　　ＳｓｔｒｌＢａｍ
ｌｌｌ　　　　Ｋｐｎｌ　　　　　　ＴａｑｌＢｇｌｌ
　　　　Ｎｃｏｌ　　　　　　ＸｂａｌＣｌａｌ　　　
　Ｐｓｔ［Ｘｈｏｌ ｌｌａｅｌｌＩ　　　Ｐｖｕｌ　　　　　　ＸｈｏＩｒ
Ｈｈａｌ　　　　Ｐｖｕｌｌ 上記のすべてが市販されている。下記表は、群、各群に
属するクローンの名称及びクローンインサー・ト内で切
断不可能な制限エンドヌクレアーゼについて示している
。

第３表 指定されたクローンに存在しない 一部の制限エンドヌクレアーゼは、すべてのクローンで
はないが、群中の１以上のクローンを開裂することがで
きる。Ｂ群において、４つのクロ−ンのうち少なくとも
１つを開裂する他の制限エンドヌクレアーゼとしてはＡ
ｖａ　Ｉ　ＳＰ　ｓ　ｔ　ｌ　％　Ｓｓ　ｔ　ＩＩがあ
る。これらの部位は地図に示されなかった。

Ｈ群において、制限エンドヌクレアーゼ５ｓｔｌは３つ
のクローンすべてを開裂しないが、但しその部位は地図
にまだ示されていない。

上記情報は、ＬＢブイヨン中ミニ調製物としてｐＵｃ１
８組換えプラスミドを増殖させかつ下記アルカリ溶菌法
を用いてＤＮＡを単離することにより決定される。ＤＮ
Ａは約２０μｇ／ＩｄＤＮアーゼ−フリー牌臓ＲＮアー
ゼ含有約１０ｍＭトリス−ＨＣｆｆｌ（約ｐＨ８，０＞
　、約１　ｎ＋Ｍ　［ＤＴＡ（約ｐｕ８．０）を含有し
たＴＥ緩衝液のような分解用緩衝液中に再懸濁され、ポ
ルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ、渦巻式）ミキナーで簡単に
混合される。次いで、ＤＮＡサンプルはｃＤＮＡインサ
ートを開裂しうる能力をもつか否かを決定するために様
々な制限エンドヌクレアーゼ〔ベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）市販〕で分解される。地図
作成分析は、インサート／プラスミドの単一及び二重分
解をするために行われる。

ＤＮＡフラグメントは約１％アガロースゲル上で電気泳
動分離され、同一ゲルで同時に操作されたＤＮＡマーカ
ーと比較してサイズ分けされる。地図は、フラグメント
サイズデータ及び公知のベクター制限部位をインテリジ
ェネティクス制限地図作成プログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＭａｐ　Ｇ
ｅｎｅｒａｔｏｒ　ｐｒｏｇｒａｓ＋）　（ＭＡＰ＋イ
ンテリジエネティクス社（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、Ｉｎｃ、）　）に加えることによって各クローン
から作成される。ヌクレオチド配列に沿って導かれる酵
素切断部位の位置は約±ｌθ％のレベルで正確である。

Ａ群の制限地図は第１図に示されている。ＳＯ６遺伝子
は、下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的１８８６の
ヌクレオチド（ｎｔ）である：１１８（Ａｐａｌ）、２
８４　（ＰｓＬ　Ｉ）　、２９３　（ＰｖｕＩ［）　、
５９７　（Ｐｓｔ　Ｉ　）、１２８３（Ｐｓｔｌ）　、
１８２０　（ＩＩｉｎｃＩＩ）及び１８３７　（Ａｖａ
　ＩＩ　）。

ＳＰＩ遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する約１４
０４ｎｔである：　２１３　（Ｐｓｔ　Ｉ　）、８８９
　（Ｐｓｔ　Ｉ　）、１３８６　（旧ｎｃ１１）及び１
３９８（ＡｖａＩ［）　、　Ｓ　Ｏ６７遺伝子は下記塩
基位置に制限部位を有する鎖長８２２ｎ　ｔである：　
ｌ　０　Ｂ（Ｐｓｔｌ）及び８１６（旧１ｃ　ＩＩ　）
。

８群クローンの制限地図は第２図で示されている。ＳＯ
９遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的１０
７１ｎｔである：　２９７　（Ｐｕｖｌｌ）、３８１（
Ｂｇｌｌ）　、５７０　（ＡｐａＩ）　、７５０　ＣＢ
ｇｌ　Ｉ）、７８９　（Ｘｈｏ　［）及び９００（Ｐｖ
ｕＩ［）　、　Ｓ　０２４遺伝子は下記塩基位置に制限
部位を有する鎖長的１１０８ｎ　ｔである：２４３　（
ＰｖｕＩ）、２７Ｂ（［Ｉｇｌｌ）、４８２（ＡｐａＩ
）、６４６（Ｂｇｊ！　Ｉ）　、６９４　（Ａｐａ　［
）　、７１Ｂ　（Ｘｈｏ　Ｉ）、７４３　（ＡｖａＩＩ
）　、８４５　（ＰｖｕＩＩ）及び９Ｂ２　（Ａｐａ　
Ｉ　）。

ＳＯ７遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的
９８０　ｎｔである：　１１５　（Ｐｖｕ　ＩＩ　）、
１５０（Ｂｇ　１１　）、３６１（Ａｐａ　Ｉ）　、５
１Ｂ　（Ｂｇｔ！　Ｉ）　、５６１　（Ｘｈｏ　Ｉ　）
、５６４（Ａｖａｕ）　、７１７　（Ｐｖｕｕ）及び８
６１　（Ａｐａ　Ｉ　）。

Ｓｏｌ遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的
３３７ｎｔである：　７５（Ａｐａ　Ｉ　）、２３６（
Ｂｇ　Ｉ　Ｉ　）、２６１　（Ｘｈｏ　Ｉ　）及び２７
５　（Ａｖａｉｌ）。

０群クローンの制限地図は第３図で示されいる。

５Ｐ５４遺伝子は下記塩基位置に制限部位を存する鎖長
的６８７ｎ　ｔである：　１Ｂ？（Ａｖａ　Ｉ　）、２
７３（Ａｐａ　Ｉ　）、５５９　（Ｐｓｔ　Ｉ　）及び
６２７（ＩＩｉｎｄｌｌ［）　、　Ｓ　Ｐ　５９遺伝子
は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的１０１７ｎｔ
である：２２２Ｃ＾ｖａ　ＩＩ　）、２５０（Ａｖａ　
Ｉ　）、５００（Ａｖａ　ｌ　）、６０３　（Ａｐａ　
Ｉ）　、６８２　（Ａｐａ　Ｉ）　、８８９　（Ｐｓｔ
　Ｉ）及び９４７（Ｉｌｉｎｄｌｌｌ）。

８群クローンの制限地図は第４図で示されている。Ｓ０
３１１遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的
６８４ｎｔである：　　１５４　（ｌＩｉｎｃｌ［）、
２６２（Ｂｇｊ！　Ｉ）及び４００　（Ｐｖｕｌ［）　
。Ｓ　Ｏ２２７遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有す
る鎖長６３１ｎｔである：　　２５７　（ｌＩｉｎｃＩ
Ｉ　）　、３６９（Ｂｇｊ！　Ｉ）及び５３７（Ｐｖｕ
　ＩＩ　）。５Ｏ２３１遺伝子は下記塩基位置に制限部
位を有する鎖長６３２ｎｔである：　２５５　（Ｉｆ　
ｉｎｃ■）、３８２（１１ｇｆｆｉ　Ｉ）及び５１４（
Ｐｖｕ　ｕ　）。

Ｆ群りローンの制限地図は第５図で示されている。Ｓ０
２１６遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的
４８７ｎｔである： ４９（ｌｌｐａｌｌ）、９７（ｌｌｈａｌ）、１３２（
Ｋｐｎｌ）、１３９（Ｓａｕ３Ａ）。

１７６（八１ｕｌ）、２００（Ｓａｕ３Ａ）、２２Ｂ（
Ａｌｕｌ）、２３７（Ｈａｅｌｌｌ）。

２９６　（Ｔａｑｌ）　、　３３５　（Ｉｌｉｎｆ　Ｉ
）　、　３４１　（Ｔａｑｌ）　、　４０２　（ＩＩ　
ｉｎｄ　ＩＩＩ）　。

４０４　（Ａｌｕｌ）　、　４１５　（ＩＩｌ＋ａｌ）
　、　４３２　（Ｔａｑ　Ｉ）　、　４３５　（Ｘｈｏ
ｌ　Ｉ）　。

４３５　（Ｓａｕ３Ａ）　、　４５５　（ＩＩ　ｉ　ｎ
　ｆ　Ｉ）及び４７７（八１ｕＩ）。

最初の８つのｎｔ及び最後の８つのｎｔはリンカ−のｎ
ｔを表わし・Ｅ、テネラＦ群遺伝子の一部ではなし１゜
組換え免疫原コクシジウムタンパク質、組換え融合タン
パク質及び組換えＣｈｅＶ融合タンパク質、好ましくは
組換えＣｈｅＹ融合タ融合タンパ上質は、単一コロニー
から単離された選択組換え細菌の、アンピシリン含有２
ＸＹＴ培地中における一夜の培養によって行われる。−
夜経過培養物は約５００ｍ１の２ＸＹＴ＋アンピシリン
に接種するために用いられる。培養物は中間対数的増殖
相が得られるまで曝気下約３７°Ｃで増殖せしめられ、
その時点でＩＰＴＧが最終濃度約１００．ＩＪＭまで加
えられる。

細胞は更に約３〜４時間インキュへ−Ｉ・され、氷冷さ
れ、遠心分離により集められる。細胞は洗浄され、遠心
分離により集められ、ｐＨ約８．０の約３０ｍＭトリス
Ｈ（１、約５．０　ｍＭ　ＩＥ［ｌＴＡ及び約１ｍＭフ
ェニルメチルスルホニルフルオリドからなる緩衝液Ａ約
ＩＱｍｆ中に再）調温される。細胞）懸濁液は、ブラン
ソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）細胞破壊器モデル３５０を用い
て水浴中３分間のバーストで維持しながら超音波処理さ
れる。超音波処理液は、約４℃で約４５分間約２７．０
００ｘｇの遠心分離によって清澄化される。

これは最初の上澄液である。ペレソ）（ＰＩ＞は０、１
　ｗ／ｖ％トリトンＸ−１００含有緩衝液Ａ約１０ｍ１
中氷浴内で約３０分間洗浄され、再遠心分離される。上
澄液は集められ、第二の上澄とする。ペレノＩ−（Ｐ２
）は同じ緩衝液である緩衝液Ａで２回洗浄される。洗液
は捨てられる。次いで、洗浄されたベレットＰ２は約１
００ｍＭジチオスレイト−ル含有の約６Ｍグアニジン−
＋１（１！約１．ＯＭｌに再懸濁され、懸濁液は約５０
℃で（約２時間）インキュベートされる。）懸濁液は約
７Ｍ尿素で１０ｍ１に希釈され、約４°Ｃで約４５分間
約２７，０００ｘｇの遠心分ＡＩＤこより清澄化される
が、この上澄液が第三の上澄である。各種融合タンパク
質の溶解性の差異に基づき、一部は第一の上清中にみら
れ、−部は第二の上清中にみられ、一部は第三の上清中
にみられる。例えば、免疫原Ａ群Ｓ　Ｏ６−ＣｈｅＹか
らの代表的クローンタンパク質は、第一、第二及び第三
の上清中に存在した。Ｂ群（ＳＯ？）　、Ｃ群（ＳＰ５
４）　、Ｈ群（Ｓ０３１１）及びＦ群（Ｓ０２１６）の
クローンからの代表的タンパク質は、第三の上清中に存
在した。ＳＯ７−ＣｈｅＹ及び５Ｐ５４−　ＣｈｅＹ双
方の融合タンパク質は、ヒドロキシアパタイト上でのク
ロマトグラフィーにより遅れて溶出することはなかった
。　　ＳＯ３１１−ＣｈｅＹ融合タ融合タンパ上質ロキ
シアパタイトと結合し、１６０ｍＭリン酸緩衝液で溶出
させることができた。第三の上清液から（７）　Ｓ　Ｏ
６−ＣｈｅＹ融合タ融合タンパ上質サクリルＭ−Ｄ　Ｅ
　Ａ　Ｅクロマトグラフィーにより更に精製された。

代表的アイ・メリア免疫原クローンは、３つの標準的技
術のうち１以上で各々の特定遺伝子のヌクレオチド配列
を決定するためにアッセイされる。

一部の場合においては、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は
マキサム及びギルバー１−、メソッズ・イン・エンデイ
モロジー、第６５巻（第１部）、第４９７５５９頁、１
９８０年（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎ　ＩＥｎｚｙｍｏｌｏｇＬ　　６
５　　（Ｉａｒｔ　ｌ）：　４９７−５５９（１９８０
））の化学的分解方法を用いて決定される。更にルーチ
ンには、ヌクレオチド配列はハソトリ及びサカキ、アナ
ライティカル・バイオケミストリー、第１５２巻、第２
３２−２３８頁、■　９８６年　（ｌｌａｔｔｏｒｔ　
　ａｎｄ　　５ａｋａｋｉ、　　八ｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１５２　：　２３２−２
３８　（１９８６））で記載されているように変性プラ
スミド鋳型（アイメリアｃＤＮＡの類型化サブ配列を含
むプラスミドｐＵｃ１８）を用いたジデオキシ瑣末端化
技術によって決定される。最後に一部のヌクレオチド配
列は、ｃＤＮＡインサート又はその一部をバクテリオフ
ァージｍｐ１８に組込んでサブクローニングしかつメソ
シング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メソッズ・イン・エンデイ
モロジー、第１０１巻、第２（１７８真、１９８３年の
標準的ジデオキシ鎖末端化配列決定法を用いて分泌され
た一本鎖組換えファージ鋳型を配列決定することにより
決定される。ΔＭＶリバーストランスクリプターゼ及び
ＤＮＡポリメラ−ゼＩのフレノウフラグメントに加えて
、修正Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼが用いられた（テーパー
（Ｔａｔ＋ｏｒ）及びリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄ
ｓｏｎ）　、プロシーディング・オプ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８４巻、第４７
６７−４７７１頁、１９８７年参照〕。

アミノ酸配列は、下記情報を組合せることにより決定さ
れたヌクレオチド配列から導き出される。

ファージ発現ベクターλｇｔｌｌ中の各々のｃＤＮ＾は
、β−ガラクトシダーゼと共に融合タンパク質として発
現された場合に、ポリクローナル抗血清を用いて確認さ
れる。β−ガラクトシダーゼと免疫原間の融合結合は、
リンカ−領域内で、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ
末端を免疫原のＮ末端におけるＰｈｅ残基と結合させた
Ｇｆ３＋残基からなる。εｃｏＲＩ制限酵素は、５′側
から３′側に読んだ場合にＧｌｕコドンの第−及び第二
ヌクレオチド間を開裂する。ＥｃｏＲＩ開裂部位におけ
るこの結合（及び読取り枠、クローニング部位）は、サ
ブクローニングベクターｐＵｃ１８、ｍｐｌｔ？又はｐ
　ＪＣ２６４の有無に係わらず完全ｃＤＮＡを要する各
々の後のクローニング時に再生される。その結果、読取
り枠は明確に確認することができ、これら３つのベクタ
ー中におけるインサートの方向が決定されると直ちにヌ
クレオチド配列が翻訳される。プラスミドｐｔＪｃｌＢ
及びｐＪＣ２６４又はファージｍｐ１８のベクター中に
おけるｃ　ＤＮＡインサートの方向決定は、当業界で公
知の制限酵素地図作成によって行われる。非対称制限酵
素認識配列がｃＤＮＡインサート内で確認されると、イ
ンサート方向及び転写方向は認識配列がヌクレオチド配
列から同様に予測される場合において明確に決定される
。本明細書で示されたすべてのアミノ酸配列は、アミノ
末端からカルボキシル末端にかけて読取られる。

Ａ群りローンのヌクレオチド配列及び得られるＡ群免疫
原アミノ酸配列は、代表的クローン５Ｏ６７で例示され
る。このクローンは３０６クローンの中に完全に含まれ
る。このクローンにおける約８７０ヌクレオチドのうち
、５′末端から始まる最初の１６２ヌクレオチドが配列
決定された。

転写方向及びひいては正確な読取り枠は、Ｃｈ　ｅ’ｆ
３０６７ｋｌ換えプラスミドの制限酵素地図作成がら予
測される制限酵素認識配列のヌクレオチド配列中の位置
に基づき明確に導き出すことができる。

ヌクレオチド配列及び得られる５３アミノ酸配列は第６
表で示されている。更に２２１のヌクレオチド配列は、
第７表で示されているように、クローンの３′末端から
得られたが、但し読取り枠は導き出されなかった。

Ｂ群りローンヌクレオチド配列及び得られるＢ群免疫原
アミノ酸配列は、代表的クローンＳ０７で例示される。

このクローンにおける９５７ヌクレオチドのすべてが配
列決定された。読取り枠は、ｃＤＮＡ内で非対称的に存
在する制限酵素部位の位置をヌクレオチド配列分析から
予測されるそれら各々の認識配列の位置と対比させるこ
とによって明確に導き出すことができる。ヌクレオチド
配列及びアミノ酸配列は第８表で示されている。

Ｃ群りローンヌクレオチド配列及び得られるＣ群免疫原
アミノ酸配列は、代表的クローン５Ｐ５４で例示される
。このクローンは５Ｐ５９クローン内に完全に含まれる
。このクローン中における約７００ヌクレオチドのうち
、５′末端で始まる最初の１５７ヌクレオチドが配列決
定された。転写方向及びひいては適切な読取り枠は、ヌ
クレオチド配列中の制限酵素認識配列をＣｈｅＹ　二５
Ｐ５４組換えプラスミドの制限酵素地図作成がら予測さ
れるそれらの非対称位置と対比させることによって明確
に導き出すことができる。そのヌクレオチド配列及び得
られる５２アミノ酸配列は第９表で示されている。

Ｈ型クローンヌクレオチド配列及び得られたＨ型免疫原
アミノ酸配列は代表的なりローンＳＯ３１１によって例
示される。このクローンには約６５０ヌクレオチドのう
ち５′末端に最初の１８５ヌクレオチドが配列されてい
る。転写配向従って適当な読み取り枠はヌクレオチド配
列中の制限酵素認識配列を制限酵素のマツピングによっ
て予測される非対称位置に関係づけることにより明白に
推定することができる。ヌクレオチド配列及び得られた
６１アミノ酸配列は表１Ｏに示される。３′末端に最後
の２８３スクレオチドが配列されているが読取り枠は推
定されていない（表１１参照）。

上記ｃＤＮＡでコードされる一次翻訳産物の分子量は、
適切なｍＲＮＡ群の生体外翻訳によって決定される。非
胞子形成嚢胞体、胞子形成嚢胞体及び挿出から抽出され
るｍＲＮＡの生体外翻訳は、組込まれるインジケーター
アイソトープとしての１ｓＳ−メチオニン又は″Ｈ−ロ
イシンいずれかと共に、ウサギ無網状赤血球細胞翻訳系
を用いて行われた。特異的生体外翻訳産物は、実施例６
で記載のように単一特異性抗体を用いて免疫沈降せしめ
られた。生体外翻訳用のプロＩ・コールは、（製造者の
指示に従う）プロメガ・バイオチック（Ｐｒｏａ＋ｅｇ
ａ　［ｌ１ｏｔｅｃ　）の技術誌に記載されているとお
りであって、テーラ−ら、モレキュラー・バイオケミカ
ル・パラサイトロジー、第１Ｏ巻、第３０５−３１８頁
、１９８３年の場合と同様の免疫沈降法に関するもので
あった。クローン３０６及び５０６７で例示されるＡ群
抗原に対して特異的な抗体により免疫沈降せしめられた
生体外翻訳産物は、約２４キロドルトン（ｋＤ）の分子
量を有する。クローンＳＯ７で例示されるＢ群抗原に対
して特異的な抗体により免疫沈降せしめられた生体外翻
訳産物は約２８ｋＤの分子量を有するが、一方副次的な
（ｍｉｎｏｒ）免疫原は約１７０．２４．２２．１６及
び１２ｋＤの分子量を有する。他の副次的な特異的免疫
沈降性生体外翻訳産物は、３１−■−ロイシンが標識前
駆体アミノ酸として用いられた場合に検出可能である。

１７０及び２２ｋＤの副次的免疫原も３５３．メチオニ
ンで検出可能である。

主な２８ｋＤ免疫原は、３Ｈ−ロイシンが前駆体アミノ
酸として用いられた場合にのみ検出可能である。クロー
ン５Ｐ５４及び５Ｐ５９で例示される０群抗原に対して
特異的な抗体により免疫沈降せしめられた生体外翻訳産
物は調べられなかった。

クローンＳＯ３１１で例示されるＨ群抗原に対して特異
的な抗体により免疫沈降せしめられた生体外翻訳産物は
約２８ｋＤの分子量を有し、一方副次的免疫原は４８．
３８．３３．１６．１３．１２及び１０ｋＤの分子量を
有する。他の副次的な特異的免疫沈降性生体外翻訳産物
は、３５５−メチオニンが標識前駆体アミノ酸として用
いられた場合に検出可能である。主な２１１ｋＤ免疫原
は、３％３−メチオニン及び３Ｈ−ロイシンの双方が用
いられた場合に検出可能である。

［、テネラの胞子形成嚢胞体及び／又は挿出から抽出さ
れた特異的ｍＲＮＡは、マニアティスら、分子クローニ
ング、実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、
ニューヨーク、第２０２頁、１９８２年（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉ
ｎｇ＋＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ。

ｐｇ、２０２　（１９Ｂ２））の方法及びＳ＆Ｓ固体支
持相への核酸の移入及び固定（Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎ
ｄＩｍｓｏｂｉｌｉｚａｔｔｏｎ　　ｏｆ　　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　ｔｏ　　Ｓ＆Ｓ　　５ｏｌｉ
ｄｓｕｐｐｏｒｔｓ　）、シュレーチャー及びシュニル
社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　
Ｉｎｃ、）発行、第１６−１９頁、１９８７年に記載さ
れた方法に従い、ノザンプロット分析でサイズ分けされ
た。クローンＳ０６及びＳＯ６７で例示されるＡ免疫原
についてコードするｍＲＮＡは、鎖長２．１５±０．１
３キロ塩基（ｋＢ）である。クローンＳ０７で例示され
るＢ免疫原についてコードするｍＲＮＡは鎖長１．２３
±０．２２　ｋ　Ｂである。クローン５Ｐ５４及び５ｐ
５９で例示されるＣ免疫原についてコードするｍＲＮＡ
は鎖長１．１２±０．０８　ｋ　Ｂである。クローンＳ
Ｏ３１１で例示されるＨ免疫原についてコードするｍＲ
ＮＡは鎖長０．９Ｂ＋０．０７ｋＢである。

天然免疫原Ｂ及びＣは、ゲル濾過及び特異的抗ＣｈｅＹ
免疫原抗体による同定又は特異的抗ＣｈｅＹ免疫原抗体
を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーのいず
れかによってＥ、テネラから単離される。約ｌＸｌ０９
のアイメリア・テネラ胞子形成嚢胞体は、氷浴巾約２．
５分間バーストで約１０分間、緩衝液、好ましくは約０
．１　ｍＭ　ｒＭｓＦ含有リン酸緩衝液中で超音波処理
される。破壊された胞子形成嚢胞体は、４℃で３０分間
２７，０００ｘｇの遠心分離により集められる。ベレッ
トは約０．１　ｍＭ　ＰＭＳＰ含有ＰＢＳ約４０ｄで約
３回洗浄され、上記のように遠心分離で回収される。洗
浄されたベレットはｐＨ約８．６の約４００ｍｇジチオ
スレイトール含有約５ＭグアニジンＨＣＩ／約０．５　
Ｍ　ｌ−リス１１Ｃ１約６０−に再懸濁される。還元は
、中度の攪拌下２０℃で約３時間行われる。還元されか
つ可溶化された免疫原は、上澄液の遠心分離及び収集に
よって得られる。免疫原は好ましくは限外濾過により約
２０ｍ１に濃縮され、ヨード酢酸約４００■の添加によ
ってカルボキシメチル化される。ｐＨは３Ｍトリス塩基
の添加で゛約８．６に調節され、反応は暗所巾約２０℃
で約６０分間続けられる。グアニジンｌＩｌ！は約０．
０５　Ｍ　ＮＩｆ４１１Ｃ（ｈ　、約０．１　ｍＭ　Ｐ
ＭＳＦ及び約０．０２％アジ化ナトリウムに対する約４
８時間の透析によって除去される。すべての不溶性物質
は遠心分離によって除去される。上澄液は限外濾過によ
り濃縮され、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離さ
れる。サンプルは、約０．０５Ｍ、Ｎ１１４１１ＣＯ３
、約０．１％ツビッタージエント３−１２及び約０．０
２％アジ化ナトリウムで平衡化された約８７　Ｘ　２．
５ｃｍのセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−
２００のカラムに供される。約４．５　ｍの両分は約２
５ｄ／ｈｒの流速で集め匂れ、約２８０ｎｓｅでモニタ
ーされる。

Ｅ、テネラ免疫原の存在は、ウェスターンプロット法に
より、ウサギ抗挿出抗血清及び特異的Ｅ、テネラ組換え
融合免疫原に対して産生された抗体で調べられる。天然
免疫原は、コクシジウム感染から鶏を保護することがで
きる。

天然Ｅ、テネラ免疫原Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｈ及びＦは、特異的
融合免疫原に対して産生された抗体を用いた免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーにより胞子形成嚢胞体から
単離されかつ精製される。アフィニティーカラムは、前
免疫血清及び特異的融合免疫原血清を用いて調製される
。免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ）画分は、コーチャーら
、ジャーナル、オブ・イムノロ・メソ、第６６巻、第７
５−７９頁、１９８４年（Ｃｏｒｔｈｉｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、　６６　：　７５−７９　（１９８４））の
方法又はバーン（ｌｌｅａｒｎ）ら、ジャーナル、オブ
・バイオロジカル・ケミストリー、第２５４巻、第２５
７２２５７４真、１９７９年のカルボニルジイミダジド
法によって得られる。１ｇＧ約１５■は、シュナイダー
ト（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｔ）ら、ジャーナル、オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第１０７６
６−１０７６９頁、１９８２年の方法を用いてセファロ
−スタンバクｔＡ　（シグマ）０．５ｇに結合せしめら
れる。ｐＨ８，１の約０．５ＭＮａＣｊ！、約０．０２
％アジ化ナトリウム及び約０．１　ｎＭ　ＰＭＳＦ含有
約０．１　Ｍホウ酸緩衝液中上記のように製造されたＥ
、テネラ胞子形成嚢胞体の還元カルボキシメチル化抽出
物約５■は、同一緩衝液で平衡化された前溶出カラムに
供される。前溶出カラムはカラム緩衝液３−で洗浄され
、合わせたカラム溶出液及び洗浄は同一緩衝液で平衡化
された抗Ｅ、テネラ融合免疫原カラムに供される。カラ
ムはカラム緩衝法的ｌＯ−で洗浄され、天然免疫原は約
３Ｍチオシアネートナトリウムで溶離される。個々の天
然免疫原は、コクシジウム感染から鶏を保護することが
できる。

アイメリア免疫原の分子量及び等電点も調べられた。分
子量は、Ｅ、テネラの胞子形成嚢胞体及び／又は挿出か
ら得られたサンプルの分析ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）　
、　Ｌかる後ニトロセルロース移動及び前記ウェスター
ンプロット法によ、る免疫検出によって調べられた。適
切な分子量はコントロールも含まれている。等電点は、
オーファレル（０’Ｆａｒｒｅｌｌ）　、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５０巻、第
４００７−４０２１頁、１９７５年の操作に従い二次元
ゲルラン（ｒｕｎ）のウェスターンプロット法により調
べられた。両操作用の抗体は上記のように得られる。

免疫原Ａは、分子量２４キロドルトン（ｋＤ）の単一バ
ンドとして分離された。主なり免疫原はＳＯＳ　−ＰＡ
ＧＥ’上２７−２８ｋＤの拡散ダブレットとして特徴付
けられ、−万態次的免疫原は微弱バンドとして現われる
ことから、Ｅ、テネラ内で抗原決定基が一部重複してい
ることを示唆している。副次的バンドは、２２．１９．
１８．１４．１２．９及び６ｋＤの分子量を有している
。２７−２８ダブレツトは、ｐｌ＋５．１及び６ｋＤ間
の範囲内で等電点フォーカシング（ｆｏｃｕｓ　ｉｎｇ
）時多数のスポットを生じる。ウェスターンプロット法
で検出された他の微弱バンドのｐＨは測定されなかった
。免疫原Ｃも分子量２ｌ−２２ｋＤのダブレットとして
移動する。免疫原■］は、分子１２８及び１８ｋＤの２
つの異なる主タンパク質並びに分子量２７．２４．２３
．１７．１４．１２及び９ｋＤの７つの副次的タンパク
質として分離する。Ｆ群免疫原は約２６−２９ｋＤの分
子量を存する。免疫原Ａの等電点は３．６５で、ｐＨ６
，６５である。Ｃ及びＦの等電点は測定されなかった。

家禽には１．前記組換えアイメリア・テネラ免疫原の１
以上の免疫化用量が投与される。鶏への免疫原投与は軽
口でも非経口経路であってもよく、鶏胚は卵殻を介して
接種される。これらのいずれかの経路による免疫原の投
与は、免疫原単独としてでも又は生理学上許容される媒
体との溶液もしくは懸濁？（ｌとしてであってもよい。

このような生理学上許容される媒体としては、格別限定
されないが、生理塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
グルコース緩衝液等がある。非経口投与としては、特に
Ｅ、テネラ免疫原の筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内注
射又は放出がある。経口投与される免疫原は水性溶液又
は懸濁液の形である。懸濁液は、例えばゼラチン又はア
ルギネ−１・からなるゲル中に免疫原を含んでいる。経
口投与される免疫原は飼料中に含有されていてもよい。

胚含有卵は、１以上のアイメリア免疫原の免疫原性用量
の注射によって免疫処理される。筋肉内及び皮下予防接
７皿用免疫原は、許容しうるアジュバントと共に投与さ
れてもよい。許容しうるアジュバントとしては、格別限
定されず、フロイント完全液、フロイント不完全液、二
重エマルジョン、無水油、ミョウバン沈降物、コリネバ
クテリウム・パルブム及びｔＲＮＡ含有油中水型エマル
ジョンがある。好ましいアジュバントは、免疫原がアル
ヒドロゲル（Ａｌｂｙｄｒｏｇｅｌ”）のような水酸化
アルミニウムで沈降せしめられたミョウバン沈降物であ
る。組換えＥ、テネラ免疫原による鶏の免疫処理の結果
、コクシジウム症に対する免疫が生じる。保護免疫は、
約１．Ｏｎｇ〜約１００／Ｊｇ、好ましくは約１１００
ｎ〜約１０μｇの投与によって獲得される。

下記実施例は本発明を説明しているが、本発明はそれら
に限定されるものではない。

去■拠土 嚢胞体、胞子形成嚢胞体、補出及び製出並びに対応免疫
原及び抗原の調製 アイメリア・テネラ嚢胞体を７日前に感染した鶏の盲腸
コア（嚢胞体の合体物）から単離した。

アイメリア・アセルプリナ嚢胞体を５〜６日前に感染し
た鶏の糞及び腸内容物がら単離した。単離された盲腸コ
ア及び糞をウェアリング・ブレンダー内（Ｎ留水中）で
別々ニ破壊し、３９℃ｐｌ＋２．０で１時間ペプシン（
２■／　ｍｌ　）により分解した。

大量の破壊屑及びペプシンを蒸留水中で遠心分離（１０
００ｘｇ）　　後ペレット物質がら除去した。

部分的純粋嚢胞体画分を２．２Ｍスクロース中での浮遊
化によりペレットから単離しくジャクソン、パラサイト
ロジー、第５４巻、第８７−９３頁、１９６４年）、こ
の粗製物質を冷りロロツクス（５，２５％次亜塩素酸ナ
トリウム、４゛ｃ）中で１０分間インキュベートするこ
とにより更に処理した。次亜塩素酸ナトリウムをｐＨ７
，６の無菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中数回の洗浄で除去
し、精製された無菌嚢胞体を得た。嚢胞体を２０°Ｃで
４８時間振盪水浴中で胞子形成させた（エドガー　トラ
ンサクションズ・オブ・アメリカン・マイクロバイオロ
ジー・ソサエテー、第６２巻、第２３７２４２頁、１９
５４年）。胞子形成嚢胞体を４°ＣでＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐ
Ｈ７、６）中において貯蔵した。

十分に胞子形成した嚢胞体をプランソニック細胞破壊器
内の氷上で先細プローブにより超音波処理した。超音波
処理は、過熱を防止するために３０秒間オン／オフサイ
クルで行われた。この操作により、９０％破壊を１０〜
１５分間で行なった。

界面活性剤（ツビッタ−ジエンｌ−３−１２、カルビオ
ケム、０．１％−／ｖ）を加え、混合物を４°Ｃで１８
時間攪拌した。２７．０００　ｘｇで３０分間遠心分離
後、上澄をセファデックスＳ−２００（ファルマシア）
のゲル浸透クロマトグラフィーに供した。

セファデックスＳ−２００カラム（８Ｘ４４ｃｍ）を４
℃においてｐＨ７，２の５０　ｍＭ　Ｎａ２１１１’０
４−Ｎａ１１ｇＰＯ４及び０．１％ツビッタージエント
３−１２で平衡化させた。超音波処理物をカラムに施し
、同一緩衝液で溶離し、画分を集め（１４ｍｊり　、２
３０ｎｍの吸光度によりモニターした。両分をＳＤＳ　
−ＰＡＧＥ特性に従いプールした。プールされた両分を
４℃で１週間にわたり緩衝液を３回交換して１０ｍＭ炭
酸水素アンモニウム８リツトルに対して透析し、しかる
後凍結乾燥した。凍結乾燥画分をガラス蒸留水に溶解し
、生体内用保護活性について試験した。生体内活性は、
画分８４−９４間でルーチン的に見出された。保護アイ
メリア・テネラ画分をプールし、画分Ｖと命名した。一
部のバッチの場合には、Ｓ−２００クロマトグラフイー
をρ１１７．７の０．０５％ツビッタ−ジエンＩ・含有
５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中で行なった。これは溶
出特性又は生体内効力に関して効果を有していなかった
。

第二世代製出を、ジェームス、バラサイトロジ（Ｊａｍ
ｅｓ、　Ｐａｒａｓ４ｔｏｌ）、第８０巻、第３０１−
３１２頁、１９８０年のプロトコールに従い感染後４日
目に鶏腸細胞から得た。

抗体産生用の免疫原を下記のようにして得た。

精製された胞子形成嚢胞体の懸濁液−２ｍ（５ｘｌ　Ｑ
７／ｄＰＢＳ、ｐＨ７，６）をゆるめた乳棒装備組織ホ
モゲナイザー中４℃５００ｒｐｍで５分間粉砕しくパソ
トン、サイエンス、第１５０巻、第７６７−７６０頁、
１９６５年）−１嚢胞体破壊物から得られる上澄液を遠
心分離（６００ｘｇで１０分間）後除去した。非破壊嚢
胞体、スポロシスト及び嚢胞体外被からなるＥ、テネラ
ペレットをハンクス平衡塩溶’ｔ（ｌ、　（ｐ）ｌ　７
．４　＞中０．２５％（ｎ／ｖ）　）リプシン（１：２
５０）及び４．０％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコリン酸
（シグマ）含有騰貴用溶液に再懸濁し、５％Ｃ○２中４
１℃でインキュベートした（パソトンら、ジャーナル・
オブ・バラサイトロジー、第６５巻、第５２６−５３０
頁、１９７９年）。同様に非破壊嚢胞体、スポロシス１
−及び嚢胞体外被からなるＥ、アセルプリナベレットも
ハンクス平衡塩溶液（ρ１１７．４　）中０．１２５％
（鹸ν）トリプシン（１：２５０）及び１．０％タウロ
デオキシコリン酸含有脱騰貴溶液に再懸濁した。ベレッ
トを５％ＣＯ２含有雰囲気中４１　’Ｃでインキュベー
トした。膜量処理をＥ５アセルブリナの場合０．５時間
及びＥ、テネラの場合１時間続け、しかる後騰貴用溶液
を遠心分離により除去し、寄生虫物質をｐＨ８，０、イ
オン強度０．１４５の１％グルコース含有リン酸緩衝塩
／グルコース（ＰＢＳＧ）緩衝液で２回洗浄した（シュ
マソッら、ジャーナル・オブ・プロテアーゼ（Ｊ、Ｐｒ
ｏｔｏｚｏｏｌ）、第３１巻、第１８１１８３頁、１９
８４年）。寄生虫混合物をＰＩＩＳＧで平衡化されたＤ
Ｅ５２アニオン交換カラムに供したが、精製された捕虫
は放出分について遅滞することなく溶出した（シュマソ
ッら、上記）。

捕虫を（ドライアイスル室温で）３回凍結−解凍させ、
プロテアーゼ阻害剤としての１ｍＭフェニルメチルスル
ホニルフルオリド含有Ｐ１３Ｓ中破壊されるまで超音波
処理し、植土抗原を得た。タンパクｔＱＭ度をローリ−
ら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー
、第１９３巻、第２６５−２７５頁、１９５１年の方法
により測定し、抗原を液体窒素中で貯蔵した。

実施例２ 抗アイメリア・テネラの非胞子形成嚢胞体、胞子形成嚢
胞体、捕虫、製出、抗画分Ｖ及び抗アイメリア・アセル
ブリナ種　抗体の産生 ウサギ〔ニュージーランドホヮイｌ−（Ｎｅｗ　Ｚｅａ
ｌａｎｄＷｈ　ｉ　ｔｅ）、雌性〕を実施例１に記載さ
れた様々な免疫原のうち１つで複数回免疫処理した。各
免疫用量はタンパク質５０μｇを含有していた。初回免
疫は、フロイント完全アジュバントで行なった。

後の免疫はフロイント不完全アジュバントで行なった。

抗原アジュバント混合物は、ＰＢＳ中タンパク質５０μ
ｇ含有抗原０．５　ｍｌをアジュバント０．５　ｍｌで
乳化させることにより調製した。次いで、エマルジョン
ｌ　ｍｌをウサギ背中の剃毛面上の複数部位に皮下注射
した。二次追加免疫は、−次免疫後約１か月間隔で行な
った。動物を放血させ、免疫スケジュール開始後６週間
口から始めて約１か月間隔で免疫血清を調製した。免疫
活性及び特異性は、実施例１の特異的抽出抗原及びトー
ビンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７６巻、第４３５０
−４３５４頁、１９７９年の技術を用いてウェスターン
プロット分析により測定した。各抗体はその対応免疫原
、即ち抗原に対して特異的であった。

大施開↓ 画分Ｖ免疫原によるコクシジウム症に対しての２日令鶏
の免疫 ブロイラー鶏を実施例１に記載の画分Ｖ免疫原で免疫し
た。用量はローリ−ら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、第１９３８、第２６５−２７５頁
、１９５１年の方法で測定した場合のタンパク質含有量
に基づくものであるが、これをふ化後２．９及び１６日
目に筋注した。実験用及びコントロール用量を最終免疫
後１週間目に５Ｘ１０”Ｅ、テネラ嚢胞体の経口接種に
より侵襲させた。侵盤後６日目に鶏を殺し、盲腸内にお
ける障害の重篤度をジョンソン及びレイド、エクスペリ
メンタル・パラサイトロジー、第２８巻、第３０−３６
頁、１９７０年［Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ｄ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ
　２８　：　３０　３６（１９７０））の方法に従い測
定した。

下記結果が得られた。

画分Ｖ　　　　１０．０　　　　Ｂ　　　　　１．０画
分Ｖ　　　　１．０　　　　Ｂ　　　　　１．６画分Ｖ
　　　　Ｏ，１０８２，９ な　　し　　　　　　　　　　　　　　　８３．４これ
らの結果は、画分■免疫原が２日令鶏を免疫するために
使用しうろことを示している。筋肉的接種は、通常の毒
性怒染後免疫烏における重度障害発生の非存在から示さ
れるように、疾患に対して高レベルの保護を与える。

実施例４ アイメリア・テネラ　　カ）らのゲノムＤＮへの調製実
施例１の精製アイメリア・テネラ挿出を植土１．５Ｘ１
０’／ｄの濃度でＴＥ培地（ｐＨ７，５の１０ｍＭ１−
リスＩＩＣｌ　、　０．１　ｍＭ　［！ＤＴＡ　）に懸
濁した。次いで、植土の希懸濁液を５ＤＳ（２０％ＳＤ
Ｓ貯蔵液から）中０．５％及びＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０
の０．５Ｍ貯蔵液から）中１５ｍＭに調節し、原形質膜
及び核膜の双方を溶解させた。核溶解後のゲノムＤＮＡ
放出は、溶液粘度の明白な増加によって確認される。可
溶化を助けるために、溶液をプラットホーム（ｐｌａｔ
ｆｏｒｍ）上５０℃で３０〜６０分間穏やかに揺動し、
しかる後５０℃で３時間１００μｇ／−の濃度のブロテ
イナーゼにで分解させる。ゲノムＤＮＡを、フェノール
による２回の抽出、フェノール、クロ、ロホルム及びイ
ソアミルアルコール（２５：２４：１）の混合物による
２回の抽出、クロロホルム及びイソアミルアルコール（
２４：１）による２回の抽出、並びに実施例８で記載の
ような酢酸ナトリウム／エタノールによる２回の連続的
沈降によって精製した。核酸ペレットを７０％エタノー
ルで２回洗浄し、５Ｘ１０”挿出相当数／−のおよその
濃度でＴＥに懸濁させる。核酸のＲＮＡ成分を３７℃で
６０分間濃度５０μｇ／−の熱不活性化ＲＮアーゼＡに
よる分解によって選択的に除去する。ＲＮアーゼＡ及び
他の残留タンパク質を上記のように５０℃で３時間０．
５％ＳＤＳ及び１５ｍＭ　ＩＥＤＴＡ中でのプロテイナ
ーゼＫによる二次分解によって除去した。次いで、ゲノ
ムＤＮＡを有ｍ’ｔ８媒で連続的に抽出し、エタノール
で２回沈降させ、しかる後７０％エタノールで２回洗浄
した。ゲノムＤＮＡペレットを２〜３×１０９種虫相当
数／　ｍｌの濃度でＴＥに懸濁し、２６０ｎｎ＋の吸光
度から定量した。次いで、非分解ゲノムＤＮＡを分析用
ゲルで分別化し、（ｉ）分光測定濃度、（ｉｉ）残留Ｒ
ＮＡの非存在及び（ｉｉｉ　）その高分子量保全性（ｉ
ｎｔｅｇｒｉｔｙ）について確認した。

犬新ｌ津ｉ ｃ　ＤＮＡ発現ライブラリーの作成 ７時間胞子形成されたＥ、テネラ嚢胞体及び種虫を前記
のようにして得た〔シヱマッツら、上記；ワン（Ｗａｎ
ｇ）及びストテ４ｙシュ（Ｓｔｏｔｉｓｂ）、ジャーナ
ル・オブ・プロトズーロジー、第２２巻、第４３８−４
４８頁、１９７５年〕。全ＲＮＡを、チャーブウィンら
の方法（バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４−
５２９９頁、１９７９年）により、単離直後（即ち、捕
虫）又は液体窒素で凍結され一８０℃で貯蔵された細胞
ペレット（即ち、７時間胞子形成嚢胞体）から各段階で
単離した。細胞壁が存在するため、嚢胞体ナンプルを４
倍量の４Ｍグアニジウムチオシアネー１・溶液（細胞ペ
レット量と比較した溶液量）に再懸濁し、ブランワン（
Ｂｒａｎｓｏｎ）　超音波器〔ヒート・システム・ウル
トラソニクス（ｌｌｅａＬ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｕｌｔｒａ
ｓｏｎｉｃｓ））により２０Ｗ、５０％サイクルで全部
で３０分間超音波処理した。捕虫はグアニジウムチオシ
アネ−１・貯蔵溶液（４Ｍグアニジウムチオシアネー１
・、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、ｐ＋＋７．ｏ
の２５ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１　Ｍ　２−メ
ルカプトエタノール）の添加により溶解したことから、
超音波処理は不要であった。次いで、溶解した細胞をベ
ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）　　Ｊ　Ｓ　−１３０一
ター中１０℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、
粒状の細胞破壊屑を沈降させた。上澄を清潔なフラスコ
中にデカントし、Ｉ　Ｍ＃ＭＯ，０２５倍容量及び無水
エタノール０．７５倍容量と混合した。フラスコを十分
に振盪し、−２０℃で一夜放置して、核酸を沈降させた
。翌日、ＲＮＡをベックマンＪＳ−１３０−ター中１０
℃、８０００　ｒｐｍで１０分間の遠心分離により集め
た。管から放液させて、細胞ペレットを緩衝化された塩
酸グアニジン貯蔵溶液（７，５Ｍ塩酸グアニジン、ｐＨ
７，０の０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム及び５ｍＭジ
チオスレイトール）０．５倍容量に再懸濁した。塩酸グ
アニジン貯蔵溶液の容量は、先に使用されたグアニジニ
ウムチオシアネート溶液の容量と比較したものである。

１Ｍ酢酸０．０２５倍容量及び無水エタノール０．５倍
容量を加えることによって、ＲＮＡを沈降させた。溶液
を一２０℃に一夜保ち、ＲＮＡをもう一度遠心分離によ
って集めた。先の沈降で用いられた容量の半分の塩酸グ
アニジン貯蔵溶液を用いて、塩酸グアムシン沈降を繰返
した。再沈降ＲＮＡを９５％エタノールで洗浄し、乾燥
し、無菌水に再懸濁した。この物質を１０℃、１０．０
０Ｏｒｐｍ（ベックマンＪＳ−１３０−ター）で３０分
間遠心分離した。上澄液を除去し、ペレットを無菌水に
再懸濁した。遠心分離工程を繰返した。上澄液を合わせ
、ｐＨ５の２Ｍ酢酸カリウム０．１倍容量及び無水エタ
ノール２倍容量と混合し、−２０″Ｃで一夜放置して沈
降させた。ＤＮＡペレットをＩＱ、００Ｏｒｐｍ　　（
ベックマンＪＳ−１３０−ター）で３０分間の遠心分離
により集め、乾燥し、無菌水に再懸濁した。ＲＮＡの濃
度を分光測定により調べた。

ポリアデニル化ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースク
ロマトグラフィーにより選択した（アビプ及びレーダー
、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンスＵＳＡ。

第６９巻、第１４０８−１４１２頁、１９７２年）。

■−カラムを用意するために、オリゴ（ｄＴ）−セルロ
ース（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ＢＲＬ）
０．３ｇを溶離用緩衝液（１０ｍＭ）リス１ｉｃｋ　ｐ
Ｈ７，５）に再懸濁し、パスツールピペット中に注いだ
。使用前、カラムを結合用緩衝液（０，５Ｍ塩化リチウ
ム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、９１１７．５の
１０ｍＭトリス１Ｉｃｊ！及び１ｍＭエチレンジアミン
四酢酸）１０倍層容量で洗浄した。

無菌水に溶解されたＲＮＡ（０，５■）を６８℃で５分
間加熱し、氷で室温まで冷却した。等容量の２×結合用
緩衝液を加え、十分に混合し、サンプルをカラムに供し
た。カラムを結合用緩衝液５゜−で洗浄後、ポリ　（Ａ
＋）−ＲＮＡを溶離用緩衝液ＩＱｍｌで溶出させた。１
０のｌ　ｍ１画分を集め、各々のＲＮＡ？Ｍ度を波長２
６０ｎ＋ａで分光測定により調べた。最も高い吸光度の
両分をプールし、ｐＨ５，０の２Ｍ酢酸カリウム０．１
倍容量及び無水エタノール２倍容量を加えることにより
ＲＮＡを沈降させた。サンプルを一２０℃で一夜放置し
、ＲＮＡを上記のような遠心分離により集めた。沈降後
、サンプルを無菌水に再懸濁し、各々の濃度を分光測定
により再度調べた。

ポリ　（Ａ＋）−ＲＮＡ７．５μｇから開始するため、
第−及び第二鎖ｃＤＮＡ反応をガプラー（Ｇｕｂｌｅｒ
）及びホフマン（Ｉｌｏｆｆｍａｎ）　（ジーン、第２
５巻、第２６３−２６９頁、１９８３年）により記載さ
れているように行った。ｃＤＮＡの第−鎖の合成は、ｐ
ＨＢ、３の５０ｍＭ）リス１Ｉｃｊ！　、　　１０ｍＭ
　ＭｇＣＪ　、、１０ｍＭ口Ｔ↑、４ｍＭピロリン酸ナ
トリウム、１．２５ｍＭ　ｄＧＴＰ　、１．２５　ｓ＋
Ｍ　ｄＡＴＰ、　１．２５　ｍＭ　ＴＴＰ　、０．５ｍ
ＭｄＣＴＰ、　　Ｃｒｙ−”Ｐ　）　ｄＣＴＰ　１５μ
Ｃ１（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｊ２）、オリゴ（ｄＴ＋ｚ
−＋ｓ）　１００１’　ｇ／ｒＩｄｌ、　ＡＭＶリバー
ストランスクリプターゼ３０００単位／ｍ１〔ビアード
（Ｂｅａｒｄ）、ライフサイエンシス（１，１ｆｅＳｃ
ｉｅｎｃｅｓ）　、セントビーターズハーグ、フロリダ
州〕含有反応液４ＯＮｌ中４２℃で３０分間行なった。

生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、２ＭＮ１
１４−アセテートから無水エタノールで沈降させた（オ
カヤマ及びバーブ、モレキュラー・アンド・セル・バイ
オロジー、第２巻、第１６１−１７０真、１９８２年）
。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、無菌
水４０μｌに再懸濁した。

第二鎖合成の場合には、−本鎖ｃＤＮＡ５００ｎｇ（即
ち、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッド１μｇ）をｐ１１
７．５の２０ｍＭ）リス１Ｉｃｊ２．５ｆｆ１ＭＭｇＣ
１２，１０ｍＭ　（Ｎ１１４）　２ＳＯ４，１００ｍＭ
　ＫＣｊ！　、０．１５　ｍＭβ−ＮＡＤ。

ＢＳＡ　５０μｇ／ｗｉｔ、ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　
ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ各４０μＭ、大腸菌ＲＮアーゼＨ
（ファルマシアＰＬバイオケミカルズ社）８．５単位／
ｍ１及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（ファルマシア
Ｐ−Ｌパイオケミカルズ社）２３０単位／　ｍｌの１０
０μｌに再）懸濁した。インキュへ−１・を１２°Ｃで
６０分間及び２２℃で６０分間連続的に行った。ＩＥＤ
Ｔ＾を２０ｍＭまで加えて反応を停止させ、生成物をフ
ェノール／クロロホルムで２回抽出した。二本鎖ｃＤＮ
Ａを前記のように２ＭＮ１１４−アセテートから無水エ
タノール２倍容量で沈降させた。

次いで、ｃ　ＤＮＡ　（５００μｇ〜ｌ　Ｎ　ｇ）をｐ
Ｈ７，５の５０ｍＭトリスＩ＋（１，１ｍＭ　［１ＤＴ
Ａ　、　５　ｍＭ　ＤＴＴ及び１０．ＩＪＭＳ−アデノ
シルメチオニン含有１×ＥｃｏＲＩメチラーゼ緩衝液２
０μβ中でメチル化した。

反応をＵｃｏＲｒメチラーゼにューイングランド・パイ
オラブズ）２０Ｕの添加後２０℃で２０分間行った。反
応を終了させるために、酵素を７０℃で１５分間かけて
熱不活性化させた。サンプルを水冷し、ｃＤＮＡを下記
のようにしてプラント末端化させた。ＥｃｏＲＩメチル
化ｃＤＮＡ２１μｐ含有チューブに、０．ＩＭ　ＭｇＣ
１ｔ　２．５μｌ、０．２ｍＭｄ（八、Ｃ、Ｇ　、　Ｔ
）ＴＰ２．５μ！及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ
）５単位を加えた。反応を２０〜２２℃で１０分間行い
、最終濃度１５ｍＭまでのＥＤＴ＾添加により終了させ
た。反応生成物をフェノール／クロロホルムで２回抽出
し、上記のようにエタノールで沈降させた。

前記反応からのペレットをｐＨ７，６の７０ｍＭｌ−リ
スｌＩＣ１，１０ｎ＋Ｍ　ＨｇＣ１ｚ　、５　ｍＭ　Ｄ
ＴＴ及び１ｍＭＡＴＰ含有緩衝液中１００μｇ／ｍｌキ
ナーゼ処理［ＥｃｏＲＩデキサヌクレオチドリンカー（
ＢＲＬ）４．５μβに再懸濁した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
にューイングランド・バイオロジー、２００　Ｕｌｏ、
５μｌ）を加え、反応混合物を１２℃で一夜インキュへ
一トシた。次いで、リンカ−結合ｃ　ＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉ　（ＢＲＬ　）で完全に切断した。−夜インキュベー
ト液５．５　ｕ　１に、ＥｃｏＲＩ修正緩衝液（ｐ１１
７．５の５０ｍＭＩ・リスｌＩＣ１，、ｌ　ＯｍＭ　Ｍ
ｇＳＯ４，２００ｍＭＮａＣ１）５μ＆を加えた。混合
物を７０°Ｃで１０分間加熱し、リガーゼを不活性化さ
せた。反応混合物の容量をｐＨ７，５の１００ｍＭ　ト
リスＩＩＣ／２．５０＋ｎＭＮａＣｌ及び１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２で２倍（２０μｎ）に増加させ、ＥｃｏＲＩ制
限エンドヌクレアーゼ（１６単位／μｌ）２μｌを加え
た。切断を３７℃で１時間続け、しかる後酵素を６５℃
で２０分間熱不活性化させた。生成物を上記のようにし
て沈降させた。

反応混合物から切断されたリンカ−を除去するために、
ｃＤＮＡをエルチップ−ｄカラム（シュレーチャー及び
シュエル）で更に精製した。最後に、ｃ　ＤＮＡ　（３
００μｇ）を市販品の１Ｅｃｏｌｌｌ切断されたアルカ
リホスファターゼ処理λｇａｌｌベクターＤＮＡ　（プ
ロメガ・バイオチク（ＰｒｏｍｃｇａＢｉｏｔｅｃ）　
）　７．５μｇに結合させた。結合混合物中のベクタ一
対ドナーのモル比はｌ：１であり、ＤＮＡの最終濃度は
約２００μｇ／ｄであった。

結合反応をｐＨ７，５のＩＯＩＩＩＭトリスＩＩＣｌ、
　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　Ｚ中で行った。λベクターの付
着端をアニーリングするために、混合物を最初に４２°
Ｃで１５分間インキュベートした。次いで、それを１　
ｍＭ　Ａ’ｒＰ。

１０ｍＭ　ＤＴＴ及びＴ４ＤＮＡ　リガーゼにューイン
グランド・バイオラプス）　４０．０００単位／ｄで補
足した。

反応液を１４℃で一夜インキュベートシタ。

λベクターハイブリッドを製造者の指示（アマ−ジャム
）に従い市販のパッケージ化用抽出物で生体外において
パッケージ化した。パッケージ化ファージの少量を大腸
菌宿主Ｙ１０Ｂ８株（ヒユーインら、“ＤＮＡクローニ
ング：実務的アプローチ°′、第１巻、グローバー、Ｄ
編集、ＩＲＬプレス、オックスフォード、第４９−７８
頁、１９８５年）中に形質導入し、これらをＸ　−ｇａ
ｌ　６００μｇ／戚及び１６ｎ＋Ｍ　ＩＰＴＧ含有ＬＢ
［バクトドリプトン（Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ）　
ｌ　Ｏｇ　／　ｌ、バクトー酵母エキス５　ｇ／ｌ、　
Ｎａ（，１１０ｇ／ｌ、ｐＨ’７．５　）軟寒天２．５
　ｍｌを用いてＬＢプレート上で培養した。各々約Ｉ　
Ｘ　Ｉ　Ｏ’の独立組換えファージクローンからなる２
つのｃＤＮＡライブラリーを得た。Ｘｇａ　Ｉｌ／　Ｉ
ＰＴＧプレート増殖から測定した場合、非組換えパック
グラウンドは１３％であると評価された。

実施例６ λｇｔｌ　１　ｃｌ）ＮＡライブラリーのスクリーニン
グ実施例２の抗両分■抗体又は抗挿出抗体いずれかによ
る実施例５のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは
、前記ヒユーインらによる記載のとおりに実質上行われ
た。非増幅ｃＤＮＡライブラリーからのパッケージ化フ
ァージを大腸菌Ｙ　１０９０株中に形質導入し、０．５
〜１．０Ｘ１０Ｓプラ一ク形成単位（ｐｆｕ）／プレー
トの密度で１５０ｍｍプレート上において培養した。プ
レートを４２℃で３．５時間インキュベートし、１０ｍ
Ｍ　ＩＰＴＧ中で事前浸積された乾燥ニトロセルロース
フィルターで覆い、３７℃で一夜インキユベートした。

フィルターを取除き、０．０５％ツイーン２０　（Ｔ［
１ＳＴ）含有トリス緩衝液（Ｔ　Ｂ　Ｓ　；　ｐＨ８，
Ｏの５０１１ＩＭトリス１１ｃ１／　１５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃｊ！　）中の２０％牛脂児血清で１時間ブロックし、
しかる後相当時間にわたり適切な抗体と共にインキュベ
ートした。抗体結合部位を〔”２５Ｉ〕標識タンパク質
Ａで検出した。陽性プラークを取出し、再プレート培養
し、各クローンが純粋プラークであると判明するまで再
スクリーニングした。

交差スクリーニング実験のために、各プラーク精製クロ
ーンのファージ溶解物ｌμｌを大腸菌Ｙ１０９０細胞区
画上にスポットした。組換え融合タンパク質を誘導し、
ニトロセルロースに移し、下記のように免疫プロットし
た。様々な抗血清によるスクリーニング及び交差スクリ
ーニングでは、第１表における５群のクローンを示した
。免疫プロットに用いられたすべての抗血清をλｇｔｌ
ｌ溶原ＢＮ溶加３の濃溶屑物に完全に事前吸着させた。

事前吸着後、それらをＴＢＳＴ中１：１００希釈し、必
要時まで４℃で貯蔵した。

組換えファージの各々に対する単一特異性抗体を、ホー
ルらの方法（ネーチャー、第３１１巻、第３７９−３８
２頁、１９８４年）の修正法により及び実施例２記載の
ようにウサギを実施例１３記載の精製された組換えＥ、
テネラＣｈｅＹ融合タンパク質で免疫することにより、
実施例２の多特異性抗血清からアフィニティー精製した
。融合タンパク質としては、Ａ群のＳ　Ｏ６７−Ｃｈｅ
Ｙ　；　８群の５Ｏ７−ＣｈｅＹ；Ｃ群のＳ　Ｐ　５４
−ＣｈｅＹ　ｓ　Ｈ群の３０３１１　２９−ＣｈｅＹ；
及びＦ群の３０２１６−　ＣｈｅＹがあった。フィルタ
ープラークリフトをスクリーニングに用いられる精製組
換えクローンから作成した。約２ＸｌＯ’ｐｆｕを１５
０＋ｎｍプレート毎に培養して、３７゛Ｃインキユベ一
ト時間の最後に半融合溶解状態に近づけた。次いで、ニ
トロセルロースを取除き、４時間にわたりＴＢＳＴ中２
０中２０見生胎でブロックし、（０，０２％ＮａＮ。

含有ＴＢＳＴ中２０％牛脂児血清で１　：　２００希釈
された）事前吸着多情異性血清２０ｍ１と共に一夜イン
キユベートした。すべてのインキュベートを一定の撹拌
上室温で行った。次いで、フィルターを各々２０分間Ｔ
［１ＳＴ５０ｄで５回及び０．１５Ｍ　ＮａＣ１１０，
０５％ツイーン２０で１回洗浄した。抗体をｐｌ＋２．
８の０．２Ｍグリシン−肛！！、／　０．１５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１１０，０５％ツイーン２０　１０ｄで３０分間にわ
たり各々のフィルターから溶出させた。各溶出物のρＩ
＋をトリス塩基で８．０に戻し、組換え溶出抗体（ＲＥ
Ａ）を必要時まで一２０°Ｃで貯蔵した。

寄生虫抗原を、実施例１記戦のプロテアーゼ阻害剤とし
て１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）含有のＮＥＴ緩衝液（ｐＨ７，５の５０ｍＭトリス
１１Ｃ！、１５０ｍＭ　Ｎａ（／！、５ｍＭ　ＥＤＴＡ
　）中で非胞子形成嚢胞体、胞子形成嚢胞体及びＤＥ−
５２精製種虫を超音波処理することにより得た。

各サンプルのタンパク質濃度を上記ローリ−らの方法に
よって測定した。３Ｘ１０’非胞子形成／胞子形成嚢胞
体からの抗原収量は約５０μｇであって、一方同量の抗
原は約２Ｘ１０６種虫から得られた。サンプルを使用準
備ができるまで一２０°Ｃに保持した。寄生虫抗原のプ
ロン°トのために、各々の超音波処理サンプル５０μｇ
を等量の２×サンプル緩衝液（ｐＨ６，８の０．１２５
　Ｍ　トリスＩＩＣ！、４−／ｖ％ＳＯＳ、１０ｖ／ｖ
％２−メルカプトエタノール、２０％グリセロール及び
０．００２５％ブロモフェノールブルー）と混合し、３
分間煮沸し、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル又
は５〜２０％５ＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲル上の
いずれかで電気泳動に付した（レムリ、ネーチャ第２２
７巻、第６８０−６８４頁、１９７０年）。

一方、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１−１０フエナン
トロリン２■／　ｍｌ　、ベンズアミジン２■／　ｍｌ
　、　ＰＭＳＩン０．００２　ｍｇ／ｒｎｌ、シグマ大
豆トリプシン阻害剤０．０４８　＋ｎｇ／　ｍｌ、アプ
ロチニン０．０４８ｍｇ　／　ｍｌ、ロイペプチン０．
０２　ｍｇ／ｍ１）含有ＮＥＴ緩衝液中に濃度５　Ｘ　
ｌ　０７／ｍ１の嚢胞体及び濃度５　Ｘ　１０’　７ｍ
Ｍの捕虫を再懸濁させることにより抗原を得た。その時
、サンプルをブロモフェノールブルーのない等量の２×
サンプル緩衝液と混合し、サンプルを３分間煮沸し、完
全に破壊されるまで超音波処理し、再度３分間再煮沸し
た。ブロモフェノールブルーを０．００２５％まで加え
、サンプルを使用準備ができるまで一２０℃で貯蔵した
。免疫プロットのために、嚢胞体又は種型抗原をのせて
、上記のような電気泳動に付した。

ＳＯ５−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質を、トービン
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７６巻、第４３５０−４
３５４頁、１９７９年の技術により電気泳動的に二Ｉ・
ロセルロースに移動させた。

次いで、ニトロセルロースを４時間ＴＢＳＴ中２０％牛
脂児血清でブロックした。ブロック後、ニトロセルロー
スを０．０２％ＮａＮ＋含有ＴＢＳＴ中２０％牛脂児血
清で希釈された抗体２〇−中において室温で一夜インキ
ユベートした。多特異性抗血清はｌ：１００〜１：２０
０希釈し、単一特異性組換え溶出抗血清は１：１０希釈
した。特異的抗体との接触後、フィルターをＴＢＳＴ２
００−で３回各々５分間にわたり洗浄した。結合抗体を
最終濃度２×１０５カウント／ｍｉｎ／ｍｆｆ１までＴ
ＢＳＴ２０−で希釈された１２５Ｉ−タンパク質入によ
り検出した。放射線標識タンパク質Ａとのインキュベー
トを室温で１時間行い、しかる後フィルターをＴＢＳＴ
　２００ｄで３回５分間にわたり再度洗浄し、風乾し、
コダ・ンクＸ−オマ・ントＡ　Ｒ（Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ｏ
ｍａｔ　ＡＲ）フィルムに露出させた。

一方、ニトロセルロースを３回の２００　ｍｆｌ洗浄に
より１時間にわたりｐＨ７，４のリン酸緩衝液中０．５
％ゼラチンでブロックし、しかる後１時間にわたりｐＨ
７，４の５０ｍＭトリス１（Ｃ！、１５０　ｍＭ　Ｎａ
Ｃｊ！。

５ｍＭＥＤＴＡ含有ＴＥＮ緩衝液中０．２５％ゼラチン
で二次ブロックし、前記のように洗浄した。ブロック後
、ニトロセルロースを０．２５％ゼラチン及び０．０５
％トリトンＸ−１００含有Ｔ巳Ｎ緩衝液で１：１００〜
１：２００希釈された抗体２０ｍ！中室温で一夜インギ
ュベー１−　した。フィルターを０．２５％ゼラチン含
有ＴＥＮ２００ｄで各々５回２０分間にわたり洗浄した
。結合抗体を最終濃度２　Ｘ　１０　’　ｃｐｍ　７ｍ
Ｍまで０．２５％ゼラチン、０．０５％トリトン含有Ｔ
　Ｅ　Ｎ　２０　ｍｌで希釈された＋２５１タンパク質
Ａにより検出した。放射線標識タンバク質Ａとのインキ
ュベートを室温で１時間行い、しかる後フィルターを１
５分間にわたり０．２５％ゼラチン、０．０５％トリト
ン含有Ｔ　Ｅ　Ｎ　２００　ｍｌで２回及び１５分間に
わたりＴＥＮ２００−で４回洗浄した。洗浄後、フィル
ターを風乾し、コダソクＸ−オマットＡＲフィルムに露
出させた。

実施例６の組換え及び野生型λｇｔｌｌファージを多重
度１０で大腸菌宿主Ｙ１０８９株（ヒユーインら、前記
）中に溶加として導入した。溶加を単一コロニー単離用
としてアンピシリン１００μｇ／　ｍｌ含有ＬＢプレー
ト上に画線的に接種し、３０〜３２℃で一夜インキュベ
ー１〜した。いくつかのコロニーの増殖性を３２℃及び
４２℃で調べた。

４２°Ｃで増殖しなかった３２°Ｃプレート培養物から
１つのコロニーを選別し、−夜の培養をアンピシリン５
０■／ｌ含有ＬＢブイヨン中で行った。

次いで、溶層処理クローンを、０．３〜０．５の６００
ｎｍ吸光度に達するまで、３２℃でアンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌ含有ＬＢブイヨン５０−中一夜培養物から増殖
させた。ファージ切出し及び複製を２０分間にわたる４
５℃への温度シフＩ・によって誘導した。継続的ファー
ジ複製は、細胞溶解の徴候が見えるまで、３７℃で２〜
３時間培養物を増殖させ続けることにより保証される。

培養物が完全に溶解しない場合には、クロロボルム０．
１　ｄを各々に加え、培養物を３７℃で更に１０分間攪
拌した。これらの条件下、細胞の溶解は数分間後に生じ
る。この時点で、細胞破壊屑をベックマンＪＳ−１３０
−ター中７．　ＯＯＯｒｐｍで５分間の遠心分離により
ルーチン的に除去した。ファージ上澄液を最終濃度０．
ＯＩＭまでのＭｇ５Ｏ，添加後４℃で一夜貯蔵し、ファ
ージ頭部を溶解させた。

ファージ上澄液を室温に戻した後、１０■／−ＤＮアー
ゼＩ５０＃＃及び１０ｍｇ／ｍ１ＲＮアーゼＡ２５μｌ
を各サンプルに加えた。これらを３０℃で最低１時間イ
ンキュベートし、しかる７ｉＮａ（４１、４６ｇを加え
、各々に完全に溶解させた。上澄液を最低３０分間氷上
で更にインキュベートした。

次いで、残留細胞破壊屑をベックマンＪＳ−１３０−タ
ー中１０．０００ｒｐｎ＋で１０分間の遠心分離により
集めた。上澄を各サンプルから集め、各上澄液にカルボ
ワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）　ＰＥＧ　８０００　（
ポリエチレングリコール２０００、フィッシャーサイエ
ンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ　Ｃｏ、））３．５ｇを溶解させた。ＰＨ，Ｇ存在下
、ファージ頭部を４℃で一夜放置して沈降させた。翌日
、ファージ頭部を遠心分離により集めた。上澄液を４℃
に維持されたベックマンＪＳ−１３０−ター中１０、０
０　Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液を慎重に
排出し、廃棄した。ペレットを０．１　Ｍ　）リス−１
１ｃ１（ｐＨ７，９）　、０．３Ｍ　ＮａＣｌ及びＬｍ
ＭＥＤＴＡ　２５０μｌに再懸濁し、しかる後０．５　
Ｍ　ＥＤＴＡ１２．５μｌを加えて、サンプル中に残留
するすべての遊離Ｍｇ”をキレート化させた。ファージ
頭部を上記緩衝液中６７℃で１０分間インキュベートし
た。インキュベート後、１０％５Ｄ３５μｌを各サンプ
ルに加え、サンプルを渦巻型ミキサー中で混合した。加
熱して、ファージタンパク質を変性させた。ＳＤＳで変
性工程を終了させ、ファージ頭部からＤＮＡを放出させ
る。

次いで、ファージから放出されたＤＮＡをフェノールで
２回、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：ｌ
）で３回抽出し、１／１０容量の３ＭＮａ０＾ｃ　　（
ｐｉ！？。５）及び２倍容量の無水エタノールの添加に
より沈降させた。サンプルを一２０℃で一夜放置して沈
降させた。翌日、ＤＮＡを小型遠心機で２０分間の遠心
分離により集めた。沈降ＤＮＡを０．３ＭＫＯ＾ｃ３０
０＃ｊ！に再溶解し、無水エタノール２倍容量の添加に
より再沈降させた。

サンプルを一８０℃で１０分間インキュベートし、ＤＮ
Ａを上記のような遠心分離によって集めた。

ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、
１０ｍＭトリス−ＩＩ（ｌ（ｐＨ７，６）、１ｍＭＩミ
ＤＴＡ（ｐＨ８，０）含有ＴＥ緩衝液１００μｌに再懸
濁した。各サンプル中におけるＤ　Ｎ　Ａ　Ｃ度を波長
２６０ｎｍでの分光測定により調べた。

ｌｊＦ例」− λｇｔｔｔクローンからのｃＤＮＡインサートの精実施
例７のλｇｔｌ１組換えファージ１０〜２０μｇ（最終
ＤＮＡ濃度０．２μｇ／μｉ）を５０１ＮａＣＡ　／　
１００ｍＭ　トリスＩＩｃ　ｌ　（ｐＨ７，５）　１５
ｍＭ　ＭｇＣＥ　２からなる反応緩衝液中１！ｃｏＲ１
（８０Ｌ＋／μｌ；ヘーリンガー・マンハイム）で完全
に切断した。反応を５倍過剰量の酵素を用いて３７°Ｃ
で４時間行った。反応生成物を３　Ｍ　（ｐＨ５，６）
貯蔵溶液ｌ／１０容計の添加によって０．３Ｍ酢酸すト
リウムに調節し、エタノール２．５倍容量で沈降させ、
−７０’Ｃで２０分間冷却し、４°Ｃで１５分間１５，
０００　ｘＢの遠心分離により集めた。ペレットをＴ　
Ｅ　（ｐｉｔ　７．５の１０ｍＭ）リスＨＣｊ２１０．
１ｍＭ　ＩＥＤＴＡ　＞　　３０　μＩ！に懸濁し、臭
化エチジウム含有プレパレーテイブ１％アガロース平面
ゲル上においた。インサーＩ・を−夜の電気泳動（Ｌ　
５ｈｒ’／　６０’ｍＡ）によりファージアームから分
離した。

インサートの分別化を紫外線下での視覚化により確認し
た。アガロースゲルをｃ　ＤＮＡインサートの両端でス
ライスし、ＮＡ−４５膜片（シュレーチャー及びシュエ
ル）をゲル中に挿入して、ｃＤＮΔＤＮＡインサートン
ドインチ”　（ｓａｎｄｗｉｃｈｉｎｇ）した。次いで
、インサートをＮＡ−４５膜上で電気泳動に付した。終
了後、膜をゲルから取除き、小片に裁断し、５０ｍＭア
ルギニンＣｔｌ離塩基）、ＩＭＮａ（Ｊ！からなる溶液
２５０μｌと共にエソペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
）管に入れた。ＤＮＡを７０℃で３時間かけて膜から溶
出させ、水溶液を除去し、新鮮溶離液２５０μｌを用い
て溶出プロセスを繰返した。２つの溶離液（全量５００
Ｉｌ＃）を合わせ、４°Ｃに冷却した。不溶性粒子を４
°Ｃで１０分間にわたる１５．０００　ｘｇの遠心分離
により集めた。

次いで、可溶性物質をフェノールで２回、フェノール／
クロロポルム／イソアミルアルコール（２５：：２４：
１）で２回及びクロロホルム／イソアミルアルコール（
２４：１）で２回抽出した。ＤＮＡを（上記のように）
０．３Ｍ＠酸ナトリウム／Ｅｔ０１１で沈降させ、７０
％Ｅ　ｔｏｔｌで２回洗浄し、風乾し、Ｔ　Ｅ　２５μ
ｌに懸濁し、２６０ｎｍの吸光度から定量した。次いで
、ＤＮＡの一部を確認のために分析用アガロースゲル上
で分析した。

衷及拠ｙ λｇｔｌｌう・イブラリ−から単離されたｃＤＮＡクロ
ーンの地図作成 実施例８のＤＮＡインサートを、Ａ群（Ｓ０６’ＳＰ　
１　、ＳＯ６７）、Ｂ群（Ｓ０９、ＳＯ２４、ＳＯ７’
ＳＱＬ’）、Ｃ群（Ｓｌ）　５４　、ＳＰ　５９）、Ｈ
群（Ｓｏ　３１１、ＳＯ２２７、ＳＯ２３１）及びＦ群
（Ｓｏ　２１６）の代表的ファージクローンから単離し
た。ファージインサートをベセスダ・リサーチ・ラボ市
販のプラスミドヘクターｐＵ０１８中に組込んでサブク
ローニングした。インサー１〜の単離及びサブクローニ
ングの双方を実施例１２でＣｈｅｗヘクターｐＪＣ２６
４に関して記載したように行った。プラスミドをＬＢブ
イヨン培養物５ｒｎ１中ミニ調製物として増殖させ、実
施例１２記載のアルカリ溶菌法を用いてＤＮＡを各々か
ら単離した。１０ｍＭ）リス１１Ｃ！（ｐＨ８，０）、
１　ｍＭ　［１ＤＴＡ　　（ｐＨ８，０）の無ＤＮアー
ゼ膵臓ＲＮアーゼ（２０μｇ／ｍ１）含有ＴＥ！：ＨＪ
ｉ液５０μ！中筒単な渦巻式混合により再懸濁した。

次いで、ＤＮＡサンプルを、ｃＤＮＡインサートのカッ
ター（ｃｕｔｔｅｒ）又は非カッターであるか否かを調
べるために、様々な制限エンドヌクレアーゼ（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズを含む多くの業者から市販
されている）で切断した。制限酵素切断は、常に製造者
の指示に従い行われた。

通常５種のカッターを各クローンについて選択し、地図
作成分析を各組換えプラスミドの一重及び二重切断によ
り行った。生じるＤＮＡフラグメントを１％アガロース
ゲル上で電気末動分離し、同一ゲル上で同時に操作され
るＤＮＡマーカーとの比較によりサイズ分けした。地図
は、フラグメントサイズデータ及び公知のベクター制限
部位をインテリジェネティクス制限地図作成プログラム
（ＭＡＰインテリジェネティクス社）中に入れることに
より、各クローンについて作成した。各場合において、
すべてのデータと最も適合する地図は第１〜５図に示さ
れている。

ｐ面倒１０ ＣｂｅＹ−八Ｎｌ”プラスミドの作成 融合ポリペプチド５ＣＩＮ−（ラットＡＮＦ２６）用の
発現プラスミドをｐｓｃＮ１プラスミドから得た。ｐ　
ＳＣＮ　１プラスミドは酵母ＲＡＳ　１タンパク質５Ｃ
ＩＮのＮ末端１６５アミノ酸用の細菌発現プラスミドで
あって、テメルズら、ネーチャー、第３１３巻、第７０
０−７０３頁、１９８５年に記載されている。プラスミ
ドｐｓｃＩＮ　（１μｇ）をＡｃｃｌで完全に切断し、
末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ！大フラグメント（タ
レノウポリメラーゼ）で補足した。合成ＡＮＦ遺伝子を
Ｄｄｅｌ及び旧ｎｄｎによるｐＡＮＦ−１切断によって
切出した。タレノウポリメラーゼでＤｄｅｌ末端を補足
後、１’０４ｂｐフラグメントを単離した。次いで、Ａ
ＮＦ遺伝子フラグメントを上記のように処理されたｐｓ
ｃＩＮに結合させ、コンピテントＪＭ１０５細胞を形質
転換させるために用いた。

アンピシリン耐性コロニーを適切なオリゴヌクレオチド
でスクリーニングした。ハイプリント形成陽性コロニー
のＳＤＳ抽出物を１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル（ＳＤＳＰＡＧＥ）上で電気泳動に付
し、しかる後クマシーブルー染色又はタンパク質プロッ
ト分析のいずれかによって融合タンパク質の発現につい
て調べた。

ＡＮＦ遺伝子をｐｓｃＮ１プラスミドからｐｔ、ｃｉ２
８プラスミドに移した。プラスミドｐＬｃ１２８は完全
Ｃｈｅオペロンを含んだｃｏ＃ｌＥＩ山来プラスミドで
あって、マツムラら、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー、第１６０巻、第３６４１頁、１９８５年に記載さ
れている。ＣｈｅＢ遺伝子の３′部分、Ｃｂ　ｅ　Ｙ及
びＣＩＩＥＺ遺伝子含有Ｃｈｅオペロンフラグメントを
ｐＬｃｌ−２８からＢａｍｌｌ１１１ｉｎｄｌ１１フラ
グメントとして切出し、Ｂａｍ１ｌｌ　−１１ｔｎｄ　
Ｉ［Ｉ切断ｐＵｃ１３　（ＰＬハイオケミカルズ）中に
組込んでサブクローニングし、ｐ　ＵＣｌ３−　Ｃｈｅ
Ｙ　−ＣｈｅＺを得た。ｐ　ＵＣｌ３−　ＣｈｅＹ　−
ＣｈｅＺで形質転換された大腸菌ＪＭ１０５クローンは
、ｐＵｃ１３ベクターの影響をうけた。ｌａｃプロモー
ターによってＣｈ　ｅ　’／及びＣｈｅＺポリペプチド
を発現した。ＣｂｅＹ　−（ラットＡＮＦ−２６）融合
用に発現プラスミドを作成するため、ｐ　ｌＩＣｌ３−
　ＣｈｅＹ　−ＣｈｅＺをＣｈｅＹコード領域内部の唯
一のＰｓｔＴ部位及び挿入ＣｈｅＤＮＡの３′側のｐＵ
ｃ１３ポリリンカー中の唯一のＳｍａ　１部位において
切断した。ｐＵＣ１３ベクター及びＣｈｅＹのＮ末端１
００残基についてコードするＤＮＡを含んだ、得られる
３　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｔ　−Ｓｍａ　Ｉフラグメントをｐ
ｓｃＮｌ−（ラットＡＮＦ−２６）の１６０　ｂｐ　Ｐ
ｓｔ　Ｉ−ｔｌｉｎｄｎ［フラグメントと再結合させた
が、これはＭｅｔ　　（うｙ　）　Ａ　Ｎ　Ｆ　　２６
　）についてコードしておりかつＡＮＦペプチドの末端
コドンの３′側の非翻訳ＲＡＳ　１配列５ｏｂｐを含ん
でいる。第６図参照。大腸菌ＪＭ１０５を上記２つのフ
ラグメント含有結合混合体で形質転換させた。ＤＮＡを
アンピシリン耐性クローンから（ミニ調製物として）単
離した。所望のクローンはＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ切
断で１６０ｂｐ遺伝子フラグメントを放出するものとし
て確認された。これらのクローンは、抗　Ａ　Ｎ　Ｉ？
抗血清を用いた全細胞タンパク質のウェスターンプロッ
ト分析によりＡＮＦペプチドを発現することが示された
。

実施例１１ プラスミドｐＪＣ２６４の作成 実施例ＩＯからのＣｈｅＹ　−ＡＮＦプラスミドをプラ
スミドｐ　ＪＣ２２０に変換し、それを順々に修正して
独特なｐＪＣ２６４プラスミドを作成した。

ＣｈｅＹ−八ＮＦをｐＪｃ２２０に変換するため、Ｃｈ
ｅＹ　−ＡＮＩ’プラスミドＤＮＡ４０μｇを最終容量
２００μｐのｐＨ７，８の２５ｍＭ　トリスＩＩｃ　ｌ
　、　５０ｍＭ　ＮａＣ１２、１０ｍＭＭｇ（Ｊ！２．
１ｍＭジチオスレイトール及び１１００ｕ／　ｍｌ牛皿
清アルブミン中ｌ１ｉｎｄｌｌ　（インターナショナル
・バイオチクノロシーズ社）２０単位と共に３７”Ｃで
インキュベ−１−１，た。１５分間隔で、５０μ１部分
をｐＨ８，ｏの０．５　Ｍ　Ｎａ−ＩＥＤＴＡ　２　ｐ
　１含有管に移して、切断を停止させた。各サンプル１
５０ｎｇを８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭＥ
ＤＴ＾（ＴＢＩＥ）及び０．５．１７　ｇ　／ｍｌ臭化
エチジウム含有０．７％ｈ／ｖ）ジ−プラークアガロー
ス（１７ＭＣ）ゲルの各隣接列において電気泳動に付し
た。直鎖化されたプラスミドは、３６５ｎｍ光で目視し
た場合にＸｈｏ　Ｉ切断ＣｈｅＹ−八ＮＦと同時に移動
するバンドとして確認された。このハンドを１５．３０
．４５及び６０分間の切断に対応する各列からレーザー
刃でゲルより切出し、６５℃で溶融させ、３７℃の０、
２Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７、２の１０ｍＭ１・リス１Ｉｃ
ｆ、１ｍＭＩＥＤＴＡ　（緩衝液Ａ）１０倍容量で希釈
した。ＤＮＡを重力流（ｇｒａｖｉｔｙ　ｆｌｏｗ）に
よりＮＡＣＳプレバック（Ｐｒｅｐａｃ）カートリッジ
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）ＢＲＬに結合
させ、緩衝液ＡＩＯ艷で洗浄し、重力流により緩衝液Ｄ
　（２ＭＮａＣｌ　、　ｐＨ７，２の１０ｍＭ１−リス
ＩＩＣ１，、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ）０．５−で溶出させ
た。無水エタノールｌ−をカラム溶出液に加えた。サン
プルを混合し、ドライアイス上でｌＯ分間インキュベ−
１−Ｌ、４℃１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離した
。上澄液をデカントし、沈降物を７０％エタノール０．
５−で洗浄し、減圧乾燥した。Ｔ　Ｅ　（ｐＨ７、４の
１０ｍＭトリス−＋１ｃｌ。

１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中にベレットを溶解後、　ＤＮＡ含
有量を臭化エチジウムスポット試験、即ちアガロースプ
レート法により測定したくマニアナイスら、分子クロー
ニング：実験マニュアル、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−１９８２年、第４６８−４６９頁）
。

直鎖プラスミドＤＮＡの末端を、ｄＡＴＰ、、ｄＧＴＰ
。

ｄＣＴＰ及びＴＴＰ各２０μＭ、６０ｍＭ　Ｎａ（／！
、ｐＨ７，５の６ｍＭ）リスｌＩｃ１１６ｍＭ　ＭｇＣ
ｊ２ｚ　、１ｍＭジチオスレイトール並びにＤＮＡポリ
メラーゼ■大（フレノウ）フラグメント２２．５単位（
ベーリンガーマンハイム）含有反応混合物２５μλ中１
５°Ｃで２時間３０ｎｇをインキュベ−１・することに
よりプラント化させた。反応を終了させ、ＤＮＡをフェ
ノール／クロロホルム抽出（マニアナイスら、前記、第
４５８−４５９頁）及びエタノール沈降（マニアナイス
ら、前記、第４６１頁）により精製した。

Ｂａｍ１ｌ　ｌリンカ−（ｄ−ＧＧＧ＾’ｒｃｃｃ、ベ
ーリンガーマンハイム）１２．５μｇをｐＨ７，４の５
０ｍＭトリス１１Ｃ２，１０ｍＭ　Ｍｇｃｐ２．５ｍＭ
ジチオスレイ１−一ル、５００μＭ　ＡＴＰ及び４０μ
Ｃｉのγ−３２ｐ−八ＴＰ（アマ−ジャム、５０００　
Ｃｉ　／　ｍｍｏ　ｌ　、　１０　ｍｃｉ　／　ｍｌ）
含有反応混合物４０μｌ中３７°Ｃで３０分分子４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア）４０単位により
ホスホリル化した。反応を、７０°Ｃで５分間インキュ
ベートすることにより停止させ、リンカ−を使用時まで
一２０°Ｃで貯蔵した。

プラント末端化直鎖プラスミドＤＮＡを水６．６μｌに
溶解し、ホスホリル化ＢａｍＨｌリンカ−１２５ｎｇ、
　ｐｉｔ　７．５の６．６　ｍＭ　トリス−＋１Ｃｆｆ
ｉ、６．６ｍＭＭｇＣｊ！ｚ、１ｍＭ　ＡＴｒ’、　　
１０ｍＭジチオスレイトール及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ
にューイングランドバイオラブズ）０、　ＯＯ２５単位
含有最終容量１０μ２に調節した。

４°Ｃで１８時間インキュベート後、この混合物５μｌ
をコンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞（ＢＲＬ）ｌＯＯ
μ２に加えた。細胞の形質転換をＢＲＬ発案法に従い行
った。１１のアンピシリン耐性コロニーをランダムに選
択し、各々をアンピシリン１００μｇ／−含有ＬＢブイ
ヨン（ｂｒｏｔｈ）液体培地（マニアナイスら、前記）
５ｄに接種するために用いた。３７°Ｃで一夜増殖後、
プラスミドミニ調製物をアイシューホロビクツ及びパー
ク、ヌクレイツク・アシッズリサーチ、第９巻、第２９
８９−２９９８頁、１９８１年（Ｉｓｈ−１１ｏｒｏｗ
ｉｃｚ　ａｎｄＢｕｒｋｅ　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　９　：　２９８９　　２９
９Ｂ（１９８１））で記載されているように作成した。

制限酵素地図作成及びアガロースゲル分析により、ｐＪ
ｃ２２０と命名された１つのプラスミドはプロモーター
隣接１１ｉｎｄ１部位にＢａｍ１ｌ　ｌリンカ−を有し
ていることが判明した。このプラスミドは、ＣｈｅＹコ
ード領域の３′末端側にｌｌ１ｎｄｎ［部位（今度は唯
一）を保有していることも判明した。

ｐＪｃ２２０プラスミドを５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７
，４の１１０１１Ｉトリス−＋１ｃｆｆｉ、１０ＩＩｌ
）’Ｉ　ＭｇＳＯ４及びＩＩＩＭジチオスレイトール含
有溶液５０μ２中３７°Ｃで１時間にわたる旧ｎｄｌｌ
ｌ（ベーリンガーーマンハイム）５０単位でのｐＪｃ２
２０ＯＮＡ１０μｇの切断によってｐＪＣ２６４プラス
ミドに変換した。酢酸アンモニウムを最終濃度２．５Ｍ
まで加え、ＤＮＡをエタノール２倍容量での沈降により
回収した。次いで、ｌｌ１ｎｄｌＩ［切断ＤＮＡをｄＡ
ＴＰ及びｄ　Ｇ　Ｔ　Ｉ）各２０＃Ｍ、６０ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１，ｐＨ７、５の６１トリス−１１０２，６ｍＭＭｇ
（、ｅｚ並びに１ｍＭジチオスレイトール含有溶液２０
μ！中ＤＮＡポリメラ−ゼＩの大フラグメント（ベーリ
ンガーーマンハイム）５単位で部分的に補足し、室温で
３０分間９ンキユベートした。サンプルをフェノール／
クロロホルムで抽出し、マニアテイスら、分子クローニ
ング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバ−ラ
ボラトリ−１９８２年で記載のようにエタノール沈降に
よって回収した。

ＤＮＡを水に溶解し、最終容量２０μ！中０．３Ｍ　Ｎ
ａＣ１、ｐＨ４，６の３０ｍＭ酢酸ナトリウム及び４、
５　ｍＭ　ＺｎＣｌ□に調節した。Ｓ１ヌクレアーゼ（
ＢＲＬ）５単位を加え、混合物を３７℃で３０分間イン
キュベートした。切断をｐＨ８，０の０．５　ＭＥＤＴ
Ａ　１　＃　ｆｆｉ添加によって停止させ、ＤＮＡをフ
ェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈降させた
。Ｓ１ヌクレアーゼ処理ＤＮＡを、１００ｍＭＮａＣｌ
　、　ｐＨ７，４の５０Ｉｌ１Ｍトリスー１１Ｃ２及び
１０ｍＭＭｇＳＯ４含有緩衝液５０ｐｌ中３７°Ｃで３
０分間Ｅｃｏｌ目　に□ューイングランドバイオラブズ
）８０単位で切断した。ＤＮＡを上記のように酢酸アン
モニウム中でのエタノール沈降によって回収した。

ＥｃｏＲＩ末端を上記のように、但しｄＡＴＰ及びＴＴ
Ｐの存在下かつｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの非存在下でＤＮ
Ａポリメラーゼｌの大フラグメントにより補足した。Ｄ
ＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール
沈降により回収した。

このＤＮＡ１０．ＯｎｇをｐＨ７，５の６６ｍＭトリス
−１１ｃｌ、６．６ｎ＋Ｍ　ＭｇＣｊ！ｚ　、ｌ　０ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４　ＤＮ＾
リガーゼにューイングランドバイオラブズ）４００単位
含有溶液１ＯｔＩｌ中４°Ｃで２４時間かけて結合させ
た。結合混合体２μ２を用いて、業者の標準操作法に従
いコンピテント大腸菌ＪＭ１０９細胞〔ストラタジエン
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）　）　　ｌ　ＯＯｕ　ｌを形質
転換させた。アンピシリン耐性形質転換株は、メーワン
（Ｍａｓｏｎ）及びウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）
、“核酸ハイブリッド形成：実務的アプローチ゛°、Ｂ
１口、バーメス（Ｂ、Ｄ、Ｉｌａｍｅｓ）及びＳ、Ｊ、
ヒゲンズ（Ｓ、Ｊ、Ｉｌｉｇｇｅｎｓ）　ｋｍ集、ＩＲ
Ｌプレス（１９８５年）、第１１３−１３７頁の標準的
方法を用い、プローブとして５′−３２Ｐ−標識合成オ
リゴヌクレオチドｄ　（ＣＣＣＡＡＧ八ＡＴＴＣへＣＴ
ＧＧ　）を用いてコロニーハイブリッド形成によりスク
リーニングした。ｐＪＣ２６４と命名された１つのハイ
ブリッド形成コロニーは、制限地図作成によると、Ｃｈ
ｅＹ遺伝子の３′末端側に唯一のＥｃｏＲ［部位を再び
組入れていることが判明した。

ＣｈｅＹ−八ＮＦからのｐＪＣ２６４の作成法は第７図
で略図化して示されており、ｐＪＣ２６４の制限地図は
第８図で示されている。

実施例１２ ｃＤＮＡ挿人体のｐＪＣ２６４へのサブクローニング 実施例１１で得られたｐＪＣ２６４２０μｇを実施例８
で記載した反応条件を使用してＩ！ｃｏＲ１で直線状に
した。反応生成物を沈殿させ７０％ＥｔＯＩＩで２回洗
浄し、蒸留水４３　ｔｔ　ｌ及びｌ０ＸＣＩＰ緩衝液（
０，５Ｍ＋−リス−１１Ｃｆ　、　ｐＨ９，０１１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ　ｚ、１　ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ　％　１０ｍ
Ｍスペルミジン）５μ２に懸濁させた。ＥｃｏＲＩ末端
の５′−リン酸基を仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で除去し
た。酵素（１９Ｕ／μｌ）１μ２を加え反応を３７°Ｃ
で３０分間開始させた後２番目のｌμｌを同じ時間加え
た。蒸留水４２．５μ！、２０％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）２．５μ！、１０　ｘｓＴＩＦ、　（１０
０ｍＭ　トリス−１１Ｃｆｆｉ　、　ｐＨＢ、　０／　
ＬＭ　ＮａＣｆｆ１／　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）　ｌ　Ｏ
ＩＩ　ｌを加えることにより反応を停止させ、６８°Ｃ
で１５分間加熱した。次いで反応混合液をフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール（４８：４８：２
）で２回、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４
：ｌ）で２回抽出し、最後に室温で５分間１１００Ｏｘ
で遠心分離によりＴＥで平衡にしたセファデックスＧ−
２５（媒質）の１　ｃｃカラム床に通過させた（スピン
カラム）。次いで前述のように沈殿させ、７０％Ｅ　ｔ
ＯＨで２回洗浄し、ＴＥ５０μ２に懸濁させ吸光度２６
０ｎｍで定攪した。

ｐＪ０２６４を直線状にしホスファターゼ処理したＥｃ
ｏＲｌ約１１００ｎをさらに６６ｍＭ）リス＋１Ｃｆ　
、　ｐＨ７，６，５ｍＭ　Ｍｇｃｐ、　、５　ｍＭジチ
オスレイトール、１ｍＭ＾ＴＰからなる反応混合液２０
μｆ中で同モル量のゲル精製アイメリアテネラｃ　ＤＮ
Ａ挿人体と混合した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼにューイング
ランドバイオラブス２００〜４００Ｕ／μＰ）を添加す
ることにより反応を開始し、１４°Ｃで１２〜１６時間
続けた。

予め決められた容量（形質転換反応当り３ｄ）の２ＸＹ
Ｔ細胞培地（１１当りバタトトリプトン１６ｇ／酵母エ
キス１０　ｇ　／Ｎａ（、Ｉ！、５　ｇ　）を大腸菌Ｊ
Ｍ８３の単一コロニーと温室し、６００ｎｍに於ける光
学密度０．６に達するまで３７°Ｃで激しく撹拌しなが
ら増殖させた。細菌をｌｏｏｏｘｇの遠心分離に４°Ｃ
で５分間かけることにより集め、５ＱｍＭ滅菌ＣａＣＩ
！、、を含む原培養のＡ容量に緩かに？Ａ濁させた。懸
濁液を氷で２０分間維持し、細菌細胞を上述の通り遠心
分離により集めた。次いで沈降物を５０ｍＭ滅菌ＣａＣ
ｌ　２のｌ／１０容量に緩かに懸濁させた。次いで細菌
懸濁液を４°Ｃで１６〜２４時間維持した。

連結反応混合液２０ＩＩｌを滅菌ＴＥ８０μεを加えて
ｌＯＯμｌに希釈し、５μ！及び９５μｉアリコートを
ポリプロピレン滅菌管に分配した。

コンピテント細菌約２００μ！を連結反応物（並びに適
当な連結及び形質転換対照）を含む各々の管に加え４０
分間氷上に置いた。この後４２°Ｃで９０秒間温温置て
細菌を熱シヨツク処理した。次いでプラスミドを保護す
る細菌の選択及びプラスミド維持のために５０ｍｇ／ｆ
ｆｉの濃度でアンピシリンを含む２ＸＹＴ寒天平板に各
々の形質転換反応管を覆った。平板を逆にして３７°Ｃ
で一晩温室した。

プラスミドを収容する細菌クローンを薬剤選択の存在下
で平板の増殖能により同定した。２　ＸＹＴ／ＡＭＰ　
（即ちアンピシリンを５０＋＋＋ｇ／Ｑで含む２ＸＹＴ
培地）５ｄを接種するために単一コロニーを使用し、こ
れらの培養菌を３７°Ｃで一晩激しく振盪しながら増殖
させた。培養菌約１．５　ｍｌを工、ベンドルフ管に注
ぎエツベンドルフ遠心機で少な（とも１分間遠心分離し
て集め、培養菌の残りを４　”Ｃで貯蔵し、遺伝子保存
として使用した。細菌沈降物上の培地を吸引し沈降物を
５０ｍＭグルコース１０ｍＭ　ＥＤＴ＾、２５ＩｎＭト
リスー＋１Ｃｆｆｉ　（ｐＨ８，０）４　ｍｇ　ｍｌ−
’　ＩＪゾチームの新しく調製した冷却溶液１００μｌ
に旋回させて懸濁させた。この混合液を室温で５分間温
置した。次いで０．２　Ｎ　Ｎａ０１１及び１％ＳＤＳ
からなる新しく調製した冷却溶液２００μ２を各々の管
に加え、逆にして緩かに混合し、氷に５分間置いた。こ
の混合液に５Ｍ酢酸カリウム６ｄ、氷酢酸１．１５ｍＬ
蒸留水２．８５　ｔｒｄｌを含む新しく調製した冷却溶
液１５０μｌを加えた。内容物を渦巻き混合で緩かに混
合し、この混合液を氷で５分間貯蔵した。エツペンドル
フ遠心機で４゛Ｃで１０分間遠心分離することによって
細胞片を集め、上澄み液をフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回抽出し
た。プラスミドＤＮＡ及び細胞性ＲＮＡを室温の１００
％エタノール２容量を加えた最終の水相から沈殿させた
。沈降物を室温で５分間遠心分離して集め沈降物を７０
％エタノールで１回洗浄した後、簡単に乾燥した。次い
で核酸沈降物を１ｍ！１当りＤＮａｓｅ−遊離ＲＮａ５
ｅ　２０ｕ　ｇを含むＴＢ５０μ！に懸濁させ３７°Ｃ
で１５〜３０分間温置分子温室性ＲＮＡを量的除去した
。次いで１０μｌのアリコートを５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！
、１００ｍＭ）リス１１Ｃｆ（ρ１１７．５　）　、５
ｍＭ　ＭｇＣｌ！、ｚからなる緩衝液中３７　’Ｃ６０
分間ＥｃｏＲ］（約２０ユニツト）で完全に切断した。

制限酵素反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって
分画して適当な挿入体を含むプラスミドを同定した。次
いで予測したＥｃｏＲＩ挿入体を含む組換え体プラスミ
ドを第２制限酵素（通常ＰｓＬＩ）で切断して（ｉ）挿
入体の単一複写のみがプラスミド内に含まれることが実
証され（ｉｉ）細菌プロモーターに関して挿入体ＤＮＡ
の配向が記録された。これはＲＮａｓｅ−消化された細
菌核酸の残りの４０μ！から２番目のｌＯμ！アリコー
トを除去しｐｓｔＩ約２０ユニットを含む１００ｍＭ　
ＮａＣ１，１０ｍＭ）リス−１１Ｃｌ　（ｐｌ＋７．５
　）及び１０ｍＭ　ＭｇＣｌ！ｚからなる緩衝液中３７
°Ｃで６０分間切断した。制限酵素消化物をアガロース
ゲル電気泳動によって分解した。

実施例１３ ブイヨン５　ｍｌに細菌の単一コロニーを接種して選択
組換え体細菌の一夜培養を調製した。培地はアンピシリ
ン（５０、Ｉｆ　ｇ／ｄ）を含む２ＸＹＴ（Ｉｎ当りト
リプトン１６［：、酵母エキスＬｏｇ、ＮａＣ１１０ｇ
）であった。アンピシリンを含む２ＸＹＴ５００−を接
種するために一夜培養を使用した。培養を３７℃で通気
しながら中間対数増殖が（Ａ　５５０＝０．５　）に達
するまで増殖させ、この点でＩ　ＰＴＧを最終濃度１０
０μＭまで加えた。

培養を３７°で更に３〜４時間増殖させ氷で冷却し、４
℃で１５分間遠心分離した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し
た後細菌を遠心分離で集め、必要になるまで一７０’ｃ
で凍結貯蔵した。必要とした際細菌沈降物を解速し、３
０ｍＭトリス−１１ＣＪ　、ｐＨ８，０，５０ｍＭ　Ｂ
ＤＴＡ及び１ｍＭフェニルメチルスルボニルフルオリド
（緩衝液Ａ）ｌｏｍｆに懸濁させた。懸濁液を氷上でプ
ランリンセルディスラブターモデル３５０（デユーティ
サイクル３０．出力コントロール４）を使用して各回３
分間で２回超音波処理した。超音波処理物を２７０００
ｘｇで４５分間４℃で遠心分離して清澄化した。上澄み
液は第１上澄み液を構成した。不溶性物質の沈降物を０
、１％−／ｖトリトンＸ１００を含む緩衝液Ａｌ０−で
洗浄した。懸濁液を水浴中で３０分間攪拌した後２７．
０００ｘｇで４５分間４℃で遠心分離した。上澄み液は
第２上澄み液と呼ばれる。次いで沈降物（Ｐ２）を緩衝
液Ａで２回洗浄し洗液を捨てた。

沈降物（Ｐ２）を１００ｍＭジチオスレイトールを含む
６Ｍグアニジン−１１Ｃ１１，０ｍｌに懸濁させ懸濁液
を５０℃で２時間温置した。懸濁液を７Ｍ尿素でＬＯ’
ｍｌに希釈し、２７０００ｘｇで４５分間４°Ｃで遠心
分離して清澄化した。上澄み液は第３上澄み液を構成し
た。異種融合タンパク質は異なった溶解度特性を示し、
主に第１上澄み液に見い出され、そして第２上澄み液及
び第３上澄み液に（最も共通的に）見い出された。

５０６−ＣｈｅＹ抗原（＆Ｉｌ換え体Ａ抗原）は第１、
第２及び第３上澄み液で見い出された。生体内試験に対
する物質はイオン交換クロマＩ・グラフィによって第３
上澄液から調製された。０．０２５Ｍ１−リス−１１Ｃ
Ｉ　、ｐＨ８，５，８Ｍ尿素で平衡にしたトリスアクリ
ルＭ　−ＤＥＡＦ　（ＬＫＢ）カラム（５−）を調製し
た。第３上澄み液からタンパク質１２■を含む２−試料
を上記緩衝液１００−に対して透析した後カラムに適用
した。カラムをカラム緩衝液の１カラム容量で洗浄した
後、０．０５　Ｍ、　０．１　Ｍ、　０．１５Ｍ、０．
２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ又は０．４Ｍ
ＮａＣ１を含むカラム緩衝液で段階的に溶離した。各々
の溶離を２カラム容量で行なった。溶出液をウサギ抗フ
ラクション■を使用して５Ｏ３ＰＡＧＥ及びウェスター
ンブロッティングにより組換元体タンパク質の存在を試
験した。ｓ０６／ＣｈｅＹタンパク質が０．１５Ｍ及び
０．２０Ｍ　ＮａＣ１画分に溶離することを見い出した
。両分をプールし、５０ｍＭ　Ｎ１１４ＣＯｉに対して
透析し、凍結乾燥した。５００ｍ！培養からの蛋白質の
収量は約３　＋ｗである。

ＳＯ７−ＣｈｅＹ融合タンパク賞（組換え体Ｂ抗原）は
第３上澄み液に見い出された。更に水酸化リン灰石によ
るクロマトグラフィで精製した。水酸化リン灰石（床容
量６−、バイオラドラプス、ＩＩＰＴグレード）を７Ｍ
尿素で平衡にし、第３上澄み液をカラムに適用した。カ
ラムを７Ｍ尿素の１床容量で洗浄した後、流動液及び洗
液を合わせ、アミコン透過膜ＹＭＩＯで１０−に濃縮し
、５０ｍＭＮＨ４１１Ｃ（ｈに対して透析し、凍結乾燥
した（生成したいかなる沈降物も包含する）。５００　
ｍｌ培養からの収量は約３５ｍｇタンパク質であった。

またＳ　Ｐ　５４−ＣｈｅＹ融合タンパク質（Ｍｌ換え
体Ｃ抗原）は第３上澄み液に見い出された。インビボ試
験用には、更に精製する必要はなかった。

５００−培養からの第３上澄み液中のタンパク質の収量
は約１７０■であった。

ＳＯ３１ｌ−２９−ＣｈｅＹ融合タンパク質（組換え体
Ｈ抗原）もまた第３上澄み液中に見い出された。更に水
酸化リン灰石によるクロマトグラフィで精製された。カ
ラムを上述の通り調製し、第３上澄み液を適用した。カ
ラムを７Ｍ尿素の２床容量、次に１０ｍＭ、２０ｍＭ、
４０ｍＭ、８０ｍＭ、１６０ｍＭ又は３２０　ｎＭリン
酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ６，５を含む７Ｍ尿素の２床
容量で展開した。カラム溶出液をウサギ抗−フラクショ
ン■、ウサギ抗−スボロゾイト血清又は組換え体溶離抗
体を使用して５Ｏ３ＰＡＧＥ及びウェスターンプロッテ
ィングにより組換え体タンパク質の存在に対して試験し
た。５Ｏ３１１２９ＣｈｅＶタンパク質が４０１１ＩＭ
、８０ｍＭ及び１６０ｍＭ溶出液に見い出された。これ
らの溶出液を上述の通り正確にプールし、濃縮し、透析
し、凍結乾燥した。５００ｄ培養液からの収量は約５■
タンパク質であった。

またＳｏ　２１６−　ＣｈｅＹ融合タンパク質（ｍ換え
体Ｆ抗原）が第３上澄み液に見い出された。生体内試験
に対して精製は必要としなかった。５００　ｍｌ培養液
からの収量は約３０＋■タンパク質であった。

実施例９で得られた代表的なＥ、テネラ免疫原クローン
を３標準方法の１又は２を利用してヌクレオチド配列分
析にかけた。いくつかの配列分析はマクサム及びギルバ
ート　メソッズ　イン　エンザイモロジー、第６５巻（
１部）４９７〜５５９頁（１９８０年）の化学的減成（
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）方法を使用して決定される。

更に一般的にはハラトリ及びサカキ、へｎａｌｙ１．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、第１５２巻、２３２〜２３８頁（１９８
６年）に記載される変性プラスミド鋳型（Ｅ、テネラｃ
ＤＮＡの同類配列を含むプラスミドｐＵｃ１８）を使用
するジデオキシ鎖終結技術により決定される。ヌクレオ
チド配列決定の第３方法はメッシング　メソッズ　イン
　エンザイモロジー、第１０１巻、２０〜７８頁（１９
８３年）のジデオキシ鎖終結配列標準方法を使用するｃ
ＤＮＡ挿入体又はその一部をバクテリオファージｍｐ１
８にサブクローンし、分泌−重鎮組換え体ファージ鋳型
を配列することによって達成される。更にＡＭＶ逆転写
及びＤＮＡポリメラーゼ■、変性Ｔ７ＤＮＡポリメラー
ゼのフレノウフラグメントが使用される、タボ−及びリ
チャードワン、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、へｃａｄ、ｓｃｉ、
Ｕｓ＾第８４巻、４７６７〜４７７１頁（１９８７年）
参照。

アミノ酸配列は以下の情報を組合わせることにより決定
ヌクレオチド配列から推定された。ファージ発現ベクタ
ーλｇｔｌｌ中ｃＤＮＡ、実施例８参照の各々はβ−ガ
ラクトシダーゼで融合タンパク質として発現された場合
ポリクローナル抗血清、実施例２参照によって同定され
た。この融合タンパク質の共有付加の性質を次の表に示
す。

表５ ＣｃｏＲＩクローニング部位 ＩＥｃｏＲＥ ＥｃｏＲＩ開裂部位に於ける結合（及び読取り枠、クロ
ーニング部位）は、サブクローニングベクターｐ　ＵＣ
ｌ　８ｍｐ１　Ｂ又はｐＪＣ２６４に関係なく全ｃＤＮ
Ａを含んでいる次の各々のクローニングで再生される。

従って読取り枠は明白に同定されこれらの３種のベクタ
ー中の挿入体の配向が確立されればヌクレオチド配列が
翻訳される。プラスミド、ｐＵｃ１８及びｐＪＣ２６４
又はファージｍｐ１８ベクター中のｃＤＮＡ挿人体の配
向は制限酵素マツピングにより達成される、実施例９参
照。

非対照制限酵素認識配列がｃＤＮＡＤＮＡ白人体内され
れば挿入体配向及び転写配向は認識配列がヌクレオチド
配列によって同様に予測される場合明白に指定すること
ができる。

Ａ型クローンヌクレオチド配列及び得られりＡ型免疫原
アミノ酸配列は代表的なりローン３０６７で例示される
。このクローンはＳＯ６クローン内に完全に含まれる、
実施例９参照。このクローンには約８７０ヌクレオチド
のうち５′末端で開始する最初の１６２ヌクレオチドが
配列されている。

転写配向、従って正確な読取り枠はＣｈｅＹ−５ｏ　６
７組換え体プラスミドの制限酵素マツピングによって予
測される制限酵素認識配列のヌクレオチド配列中の位置
に基づいて明白に推定することができる。ヌクレオチド
配列及び得られた５３Ｎ−末端アミノ酸配列を以下の表
に示す。

Ａ型免疫原５Ｏ６７のＮ 表６ 末端ヌクレオチド及び推 アミノ酸配列 更に２２１ヌクレオチド配列はクローンの３′末端から
得られる、以下の表７参照が読取り枠は推定されていな
い。

ｋ工 Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　？Ｓｅｔ　Ｐ
ｈｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｓ
ｒＢ型クローンヌクレオチド配列及び得られたＢ型免疫
原アミノ酸配列は代表的なりローンＳ０７で例示される
。読取り枠はヌクレオチド配列分析により予測される通
りｃＤＮＡ内に非対称に位置する制限酵素部位の位置を
各々の認識配列の位置と関係付けることによって明白に
推定することができる。このクローンには９５７ヌクレ
オチド全てが配列されている。ヌクレオチド配列と塩基
７１３に於ける末端コドンまでのアミノ酸配列を以下の
表に示す。

Ａ幻 りカ フ５０　　　　　７ＧＯ７７０７１１０７９０八Ｇ（〕
へＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＧ
ＧＣＧＧＧＧＣＣ（：ＧＧＧ［ＩＣＤＩ；ＣＴＧＣＡＧ
ＣＡＡＣＡＧＤ　　　　　　８１（ｌ　　　　　　ｌａ
　　　　　　Ｂ３Ｏ１３４０８５０（：八１；（：八Ｇ
（ＥｎｎｎＣ［；ＧＣＴ八（ｆｆ；ＣＣＧＣＧＧＡＧＣ
ＡＣＴ（ＩＣＡＧＧＧＡＡσｒＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＣ
ＧＧｌＪ３０　　　　　８７０　　　　　　Ｂ２Ｏ１１
ＸＩ　　　　　　９［Ｘｌ　　　　　　９１０ＧＡＧＩ
ＮＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＣＡ
ＴＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣ八ＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴ
ＧＣＡＧＱ２０　　　　　９３０　　　　　９４０　　
　　　　τすＣＡＧＣ八ＧＣへＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ
ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ
Ｃ型クローンヌクレオチド配列及び得られたＣ型免疫原
アミノ酸配列は、代表的なりローン５Ｐ５４で例示され
る、実施例９参照。このクローンは５Ｐ５９クローン内
に完全に含まれる、実施例９参照。このクローンには約
７００ヌクレオチドのうち５′末端で開始する最初の１
５７ヌクレオチドが配列されている。転写配向従って適
当な読取り枠はヌクレオチド配列中の制限酵素認識配列
をＣｈｅＹ−ＳＰ　５４　！ＩＪＩ換えプラスミドの制
限酵素マツピングによって予測される非対称位置と関係
づけることによって明白に推定することができる。ヌク
レオチド配列及び得られた５２個のアミノ酸配列を以下
の表に示す。

Ｃ型免疫原５Ｐ５４のＮ 表９ 末端ヌクレオチド及び推定アミノ酸配列Ａ１１ＧｌｕＳ
ｅｒＡｌａＡｓＩＩＴｌ＋ｒＡｌａＧｌｕＩｌｅＡｒｇ
ＶａｌＰｒｏＶａｌＧｌｙＡｌａＴｈｒＶａｌＶａｌＶ
ａｔＨ型クローンヌクレオチド配列及び得られたＨ型免
疫原アミノ酸配列は代表的なりローンＳｏ　３１１によ
って例示される、実施例９参照。このクローンには約６
５０ヌクレオチドのうち５′末端で開始する最初の１８
５ヌクレオチドが配列されている。転写配向従って適当
な読み取り枠はヌクレオチド配列中の制限酵素認識配列
を制限酵素のマ。

ピングによって予測される非対称位置に関係づけること
により明白に推定することができる。ヌクレオチド配列
及び得られたアミノ酸配列は次の表に示される。

１／ａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｃｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ｌａｕ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓ
ｅｒ　Ａｌａ、＋０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５０炎」１ １１型免疫原ＳＯ３１１のＮ−末端ヌクレオチド及び推
定アミノ酸配列ＬｅｕＡｌａＴｈｒＧｌｙＬｅｕＬｅｕ
ＰｈｅＡｌａＡｓｎＳｅｒＬｅｕＬｅｕＡｒｇＩｌｉｓ
ＧｌｙＳｅｒＶａｌＡｒｇＶａｔ付加的な２８３ヌクレ
オチド配列は、下の表にみられるように、クローンの３
′端から得られたものであるが、読み取枠は破壊されて
いなかった。

結合ヌクレオチドはｌ−８位に含まれていた。

！８０ ＡＡＴ　Ｇ匡α＾ＧＣＴＣ Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ Ｆ型免疫原のＦ型クローンヌクレオチド配列は代表的な
りローンＳＯ２１６によって例示される、実施例９参照
。各末端に８個のリンカ−ヌクレオチドを含む約４８７
ヌクレオチドを配列している。

配列を以下の表に示す。

表１２ 免疫原Ａ、Ｂ、Ｃ及びＨに特異的なｍＲＮＡによって生
じた試験管内−次翻訳生産物の分子量を定量した。胞子
形成されないオオシスト、胞子形成オオシスト及びスポ
ロゾイトから抽出されたｍＲＮＡの試験管内翻訳はウサ
ギ網状赤血球細胞を含まない翻訳系を使用し、結合指示
同位元素として３５Ｓ−メチオニン或は３ｔｔ−ロイシ
ンを用いて行なった。特異的試験管内翻訳生産物は実施
例６で記載した通り調製した単一特異性抗体を使用して
免疫沈殿させた。試験管内翻訳に対するプロトコールは
プロメガバイオチック（製造者の指導による）の技術報
告に記載される通りであり免疫沈殿に対するプロ１−コ
ールはティラー等、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐａｒａｓｉ　ｔｏｌ、第１０巻、３
０５〜３１８頁（１９８３年）の通りである。単一特異
性抗体によって認識されたＡ型−次翻訳生産物は分子量
２４キロドルトン（ｋ　Ｄ）を有する。クローンＳＯ７
からの優位量のＢ型免疫原は分子量２８ｋＤを有し、一
方劣量の免疫原は分子量１７０．２４．２２．１６及び
１２ｋＤを有する。更に劣量の特異的に免疫沈殿可能な
試験管内翻訳生産物は、３Ｈ−ロイシンを標識前駆体ア
ミノ酸として使用した場合検出することができた。また
１７０ｋＤと２２ｋＤの劣量の免疫原も３ＳＳ−メチオ
ニンで検出することができた。優位量の２８ｋＤ免疫原
は、３Ｈ−ロイシンを前駆体アミノ酸として使用した場
合のみ検出することができた。Ｃ型免疫原に対する分子
量は測定されなかった。クローン５０３１１からの優位
量のＨ型免疫原は分子量２８ｋＤを有し、一方、雪量の
免疫原は分子量４８．３８．３３．１６．１３．１２．
１０ｋＤを有する。更に雪量の特異的に免疫沈殿可能な
試験管内翻訳生産物は３″メチオニンを標識前駆体アミ
ノ酸として使用した場合に検出することができた。優位
量の２８ｋＤ免疫原は３５メチオニン及び３Ｈ−ロイシ
ンの両方を使用した場合に検出することができた。

実施例５のＥ、テネラの非胞子形成及び胞子形成オオシ
スト及び／又はスポロゾイトから抽出された特異的ｍＲ
ＮＡはマニアチス等、モレキュラクローニング　ラボラ
トリ−マニュアル、コールドスプリングハーハーラボラ
トリー、コールＦスプリングハーバ−、ニューヨーク２
０２真（１９８２年）の方法によるノザンブロソト法（
Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）及びＳ
ｃｈ　１ｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌ１社１６〜１９
頁（１９８７年）によって発表されたトランスファアン
ドイムノビリゼーションオブヌクレイックアシッズトウ
Ｓ＆Ｓソリッドサポートに記載された方法によって分類
した。Ａ型クローン５０６７に相補的なｍＲＮＡは２．
１５±０．１３キロベース（ｋｂ）であり、Ｂ型りロー
ンＳＯ７には１．２３±０．２２ｋｂであり、Ｃ型クロ
ーン５Ｐ５４及び５Ｐ５９には１．１２±０．０８ｋｂ
であり、そしてＩ−１型クローンＳＯ３１１には０．９
８±０．０７ｋｂであった。

またＥ、テネラ免疫原の分子量及び等電点を測定した。

分子量はＥ、テネラの胞子形成オオシスト及び／又はス
ポロゾイトから調製した試料の分析用ドデシル硫酸すト
リウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）　した後実施例６で記載した通すニトロセルロ
ースに移しそし実施例６で記載した通りのウェスターン
ブロッティングによる免疫検出によって定量した。等電
点は上述した試料の２次元ゲルのウェスターンブロッテ
ィングにより測定した。次元ゲルはＯ’Ｆａｒｒｅ１１
．Ｊ、旧ｏ１゜Ｃｈｅｍ、第２５０巻、４００７〜４０
２１頁（１９７５年）の操作によって行なった。両方の
操作に対する抗体は実施例２及び６で述べた通り調製し
た。

結果を以下の表に示す。

表１３ Ａ　　　　　Ｓ０６，５０６７　　　　　　２４　　　
　　３．６５Ｃ５Ｐ５４，５Ｐ５９　　　２１−２２　
　　　　ｎ、ｄ。

Ｆ　　　　　　５０２１６　　　　　　２６−２９　　
　　　ｎ、ｄ。

優勢なり免疫原は、ＳＯ３−ＰＡＧＥ上に２７〜２８ｋ
Ｄの拡散二重線として特徴を表わし、劣勢な免疫原は［
、テネラ内の抗原決定基が分割していると思われる弱い
バンドとして現われる。２７〜２８の二重線はｐＨ５，
１〜６．３の範囲で等電集束により多重スポットを生じ
る。更にウェスターンブロッティングにより検出された
微弱バンドのｐｌは測定されなかった。

実施例１５ 組換え体由来［、テネラ免疫原によるＥ、テネラでの攻
撃に対する防御誘発 ブロイラー用ひな鶏にミョウバンに吸収させたリン酸塩
緩衝食塩水中実施例１３で得た特異的組換え体融合免疫
原１０μｇを含む試料、最終濃度０．４％を１羽当り１
投与量につき全量０．１２−で生後２．９．１６日目に
筋肉的経路により３回免疫した。免疫原−ミョウバン複
合体はウニイル、ハンドブソトオブイクスベリメンタル
イムノロジ、ブラックウェルサイエンティフィックパブ
リケーションズロンドンＡ３．１１頁（１９７８年）の
操作により調製した。実験用及び対照用の鶏を、最終免
疫の７日後の２３日目に、生後３０日に非免疫対照に少
な（とも２．５の平均病変スコアを生じるのに十分な量
を５〜３０Ｘ１０″の胞子形成オオシストの経口接種で
攻撃した。攻撃の７日後鶏を殺し、盲腸の病変の重篤度
をジョンソン及びレイド、Ｅｘｐ、Ｐａｒａｓｉｔｏ１
第２８巻、３０〜３６頁（１９７０年）の方法により決
定した。代表例の結果を表１７〜２１に示す。

表１４ Ａ型免疫原５Ｏ６７−ＣｈｅＹを用いたコクシジウム症
に５　　　　　　　２、１　Ｂ　　　　　　３．４１１
０　　　　　　　２、５７　　　　　　３．５７１５　
　　　　　　１．７８　　　　　３．４４糞土旦 Ｃ型免疫原５Ｐ５４−　ＣｈｅＹを用いたコクシジウム
症に１．７１ １．６８ １．９３ ３．３８ ３．００ ３．２２ 表１５ Ｂ型免疫原ＳＯ？−ＣｈｅＹを用いたコクシジウム症に
）［型免疫原５Ｏ３１１−Ｃｈｅｖを用いたコクシジウ
ム症１０　　　　　　１．４１　　　　　　３．００２
０　　　　　　　１、２　Ｂ　　　　　　　３．４３３
０　　　　　　　１．３４　　　　　３．３８２．０３ ２．００ ２．９７ ３．３２ 犬土工 Ｆ型免疫原５Ｏ２１６−ＣｈｅＹを用いたコクシジウム
症１０　　　　　　　　１．５０　　　　　　２．１６
１５　　　　　　　１．３０　　　　　　２．７２２０
　　　　　　　　１．２５　　　　　　２．８９これら
の結果は、組換え体Ｅ、テネラ免疫原Ａ、Ｂ、Ｃ１１１
及びＦが生後２日の鶏をコクシジウム症に対して免疫に
するために使用することができることを示す。３回の筋
肉内接種は標準的ビルレット感染後免疫部に重篤な病変
が現われないことによって示されるように疾病に対して
高レベルの防御を与える。

０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭ
ＳＦ）を含むリン酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）２〇
−中［、テネラのｌＸｌ０’胞子形成オオシストの懸濁
液をプランリン　ソニック　パワー社のソニフィア　セ
ル　デイスラブター３５０（デユーティサイクル３０％
、出力コントロール４）を使用する２、５分破裂で合計
１０分間水浴中で超音波処理した。超音波処理物を４°
Ｃで３０分間２７，０００ｘｇで遠心分離した。ベレッ
トを４０　ｄ　ＰＢＳ７０．１ｍＭ　ＰＭＳＦで３回洗
浄し、上述の通り遠心分離して回収した。洗浄したベレ
ットを６０ｄの５Ｍグアニジン−＋１Ｃｆｆｉ１０．５
　Ｍ　ｌ−リス−ＩＩＣｌ　、　ｐＨ８，６及びジチオ
スレイト−ル４００■に再懸濁させた。

２０″Ｃで３時間緩かに撹拌しながら還元を進行させて
おいた。不溶性破片を上述の通り遠心分離で除去した。

還元及び可溶化Ｂ抗原を含む上澄み液を限外濾過（ウル
トラフィルターＰＭ−１０、アミコン社）によって２０
１ｄに濃縮しヨード酢酸（４００■）を加えた。３Ｍ）
リス塩基を加えてｐｕｓ、ｓに再調節し、２０°Ｃで６
０分間暗所でカルボキシメチル化を進行させた。次いで
反応混合液を０．０５Ｍ　ＮｌＩ４１ＩＣＯｓ／　０．
１　ｍＭ　ＰＭＳＰ／　０．０２％アジ化すトリウムに
対して４８時間透析した。グアニジン−Ｉｌｌを除去し
ていくらかの不溶性物質が生成し、その後上述の通り遠
心分離により除去した。

次いで透明な上澄み液を上述の通り限外濾過により１２
ｄまで濃縮した。次いで濃縮物を０．０５　ＭＮｌｌ＜
１ｌｃＯｚ　、０．１％ツイノタージェント（Ｚｈｉ　
ｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１２　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
）　、０．０２％アジ化ナトリウムで平衡させたセファ
クリル　（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　　Ｓ−２００の定寸
のカラム（０７Ｘ　２．５ｃｍ）に適用した。流速２５
１１ｄｌ／時間で合計１２０　Ｘ　４．５　ｍ１画分を
集めた。流出液画分を２８０　ｎｍでモニターし、Ｂ免
疫原の溶離を始めにウサギ抗スポロゾイト抗血清次にＳ
　Ｏ７／ＣｈｅＹタンパク質に対するウサギ抗血清を使
用するウェスターンブロンティングによりモニターした
。Ｂ抗原を含む両分（４７〜５７）をプールし１０ａｌ
ｌに濃縮し再びカラムに適用した。

カラムを溶離し前述のようにモニターした。プールした
両分を約０．５　ｍｇタンパク質／　ｍｌを含む容量に
ａ縮した。全収量は５．８　ｍｇであった。

ＳＤＳゲル分析は３０ｋＤ±３ｋＤの単一の均質に純粋
なタンパク質であり、ウェスターンプロット分析により
ウサギ抗スポロゾイト抗血清及びウサギ抗−３Ｏ７−Ｃ
ｈｅＹの両方と反応性であった。

Ｅ、テ不うから精製したＢ抗原の本試料の免疫原性活性
を実施例１５に記載した通り測定した。生後２日のブロ
イラー用ひな鶏をミョウバンに吸収させた精製した天然
Ｂ免疫原１０μｇを含む試料（最終濃度０．４％）で２
．９及び１６日目に筋肉的経路により３回免疫した。免
疫原−ミョウバン複合体をウニイル、ハンドブック　オ
ブ　イクスペリメンタル　イムノロジー、ブラックウエ
ルサイエンティフインク　パブリケーション、ロンドン
、Ａ３−１１頁（１９７８年）の操作により調製した。

実験用及び対照用部を最終免疫の７日後の２３日目に、
５〜１５Ｘ１０’胞子形成オオシス１−の経口接種で攻
撃した。攻撃７日後、鶏を殺し、盲腸の病変の重篤塵を
ジョンソン及びレイド、ＩＥｘｐ、　Ｐａｒａｓｉ　ｔ
ｏ１第２８巻、３０〜３６頁（１９７０年）の方法に従
って決定した。結果は８羽群に対する平均盲腸病変スコ
アとして表わし、以下の表に示す。

表１９ 天然Ｂ型免疫原を用いた鶏のコクシジウム症に対５　　
　　　　　　１．３６　　　　　　　３．４１１０　　
　　　　　　１．６４　　　　　　３．５７１　５　　
　　　　　　１、５４　　　　　　　３．４　４Ｅ、テ
ネラ由来のＢ免疫原を精製する別の方法はＳ　Ｏ７−Ｃ
ｈｅＹタンパク質に対する抗体を使用するアフィニティ
ークロマトグラフィによる。この目的のために２本の親
和性カラムを調製し、１本はＳ　Ｏ７−ＣｈｅＹ抗原で
免疫する前に除去したウサギの血清（プレブリードカラ
ム）（ｐｒｅｂｌｅｅｄ　ｃ、ｏｌｕｍｎ）を使用し、
１本は実施例２で記載した免疫法を用いてＳ　Ｏ７−Ｃ
ｈｅＹ抗原で免疫にした同じウサギからの抗血清を使用
した。Ｓ　Ｏ７−ＣｈｅＹ免疫原を実施例１３で記載し
た通り調製した。免疫グロブリンＩｇＧ分画を（コーチ
イア−等、ジュー。イムツル、メト　（Ｃｏｒｔｈｉｅ
ｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔ、　）第
６６巻、７５〜７９頁（１９８４年）の方法を使用して
各血清４　ｍ（ｌから調製した。各カラムに対してＩｇ
Ｇ１５ｍｇをシュネイダート等、ジエー、パイオル、ケ
ム（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、ｃｈｅｍ、　）第２５７巻、１０７６６〜１０７６９
頁（１９８２年）の方法を使用してセファロ−スープロ
チインＡ（シグマ）０．５ｇに結合した。カップリング
効率は７５〜９５％であった。イムノアフィニティー精
製については、０．１　Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８，１
，０，５ＭＮａＣｊ２．０．０２％ＮａＮ　３．０．１
　ｍＭ　ＰＭＳＦにおいて上述した通り調製した（ゲル
濾過による精製は用いない）還元カルボキシメチル化抽
出法的５１１１ｇを同じ緩衝液で平衡させたプレブリー
ドカラムに適用した。カラムをカラム緩衝液３　ｍｌで
洗浄し次いで合わせたカラム流動液と洗液を同じ緩衝液
で平衡させた抗−３Ｏ７／ＣｈｅＹに適用した。カラム
をカラム緩衝液１０ｍ１で洗浄した後３ＭＮａ５ＣＮで
溶離した。溶出液を０．０５　Ｍ　Ｎ１１４１１ＣＯ＋
１に対して４８時間透析した後凍結した。合計約５０μ
ｇの蛋白質を最終溶出液中に回収した。

このＥ、テ不う由来ＩＪＩ和性精製Ｂ抗原の免疫原性活
性を実施例１５に記載した通り試験した。生後２　ＩＩ
のブト１イラーひな鶏にミョウバンに吸収させたイムノ
アフィニティー精製Ｂ型免疫原約０．３μｇを含む試料
（最終濃度０．４％）を２．９及び１６日目に筋肉内径
路により３回免疫した。免疫原−ミョウバン複合体をウ
ニイル　ハンドブック　オブ　イクスペリメンタル　イ
ムノロジー、ブラックウェル　サイエンティフィック　
バブリケーション（ｌ１ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ＩＥｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＢｌａｃ
ｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ　）　、ロンドンＡ３−１１頁（１９７８年）
の操作によって調製した。実験用及び対照用を最終免疫
の７目後の２３０１」に１（１３０Ｘ１０３胞子形成嚢
胞体の経口投与でチャレンジした。チャレンジ７０後、
鶏を殺し、盲腸の病変の重篤度をジョンソン及びレイド
（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ｄ）　、エクスボ、
バラシトール（ＩＥｘｐ、ｒ’ａｒａｓｉＬｏ１）、第
２８巻、３０〜３６真の方法により決定した。結果を８
羽群に対する平均盲腸病変スコアとして表わし、以下の
表に示ず。

表２０ 天然Ｂ型免疫原を用いた鶏のコクシジウム症に対１０　
　　　　　　　　１．４１　　　　　　３．００２０　
　　　　　　　　　＋、　４４　　　　　　３．４３３
０　　　　　　　　　１、５９　　　　　　３．３８種
々のＥ、テネラ免疫原についてのＤＮＡを含む発見へフ
タ−ｐＪＣ２６４の試料はアメリカンタイプカルチュア
コレクション（ＡＴＣＣ）　１２３０１パークラウンド
ライフロツクビル、マリ−ランド（Ｐａｒｋｌａｗｎ　
Ｄｒｉｖｅ、ｌ１ｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ
）　２０８５２アメリ力合衆国のブタペスト条約のもと
に宿主大腸菌がＪＭ８３又はＪＭ１０９として寄託され
ている。１９８７年１１月４日にクローンＳＯ７、ＳＯ
６，５Ｐ５４及びＳＯ３１１を含む発現ベクターの試料
を寄託し各々受託番号６７５７７．６７５５９．６７５
５６及び６７５５８が示された。１９８７年１２月１９
日にクローンＳＰ５９を含む発現ベクターの試料を寄託
し受託番号６７５９４が示された。

１９８８年１月８日にクローン５Ｏ２１６を含む発現ベ
クターの試料を寄託し受託番号６７６００が示された。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡ群り１］−ンの制限地図である。 第２図は８群クローンの制限地図である。 第３図は０群クローンの制限地図である。 第４図はｌ−（群クローンの制限地図である。 第５図はＦ群クローンの制限地図である。 第６図はｐＳＣＩＮプラスミドの図である。 第７図はＣｈｅＹ−ＡＮＦプラスミドからｐ　Ｊ　Ｃ２
６４プラスミドへの変換について図示している。 第８図はｐＪＣ２６４のプラスミドの制限地図である。 図面の浄８（内容に変更なし） （１）別紙の通り 明細書１通を提出致します （２）別紙の通り 正式図面 １通を提出致します −・Ｌ続ネ市正書 （方式） ％式％ ２、発明の名称 タンパク質免疫原及び融合タンパク質の発現のための新
規なベクター ３、補正をする者 ・１１件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｌａｃプロモーターＤＮＡ配列、及び迅速なサブク
   ローニングを許容し異種ＤＮＡの導入部位であるＥｃｏ
   Ｒ I 制限酵素部位で終結するＣｈｅＹ融合担体ＤＮＡ
   配列を包含している発現ベクター。 ２、構造が実質的に第８図に示される通りである請求項
   １記載の発現ベクター。 ３、ｌａｃプロモーターが大腸菌中で発現される請求項
   １記載の発現ベクター。 ４、ｐＪＣ２６４と称される請求項１記載の発現ベクタ
   ー。 ５、ａ、培地中で異種タンパク質のＤＮＡを有する発現
   ベクターｐＪＣ２６４で形質転 換される大腸菌を培養し、 ｂ、大腸菌を破壊し融合タンパク質を集め、ｃ、大腸菌
   タンパク質がないように融合タ ンパク質を精製する ことを特徴とする融合タンパク質の製造方法。