JPH03204899A - ヒト肝再生因子、そのｄｎａ塩基配列、該配列を含むプラスミド及び形質転換体並びにリコンビナント肝再生因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトの肝再生因子（肝細胞増殖因子、ｈｅｐａ
ｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　；　ｈ−
ＨＧ　ｐ　）　、より詳しくはヒト血清に由来し、肝細
胞の増殖を可能とする新しい蛋白性物質、これをコード
する新規なりＮＡ塩基配列（遺伝子）、該遺伝子を含む
ｈ−ＨＧＦ発現用プラスミド、該プラスミドで形質転換
された形質転換体及び該形質転換体を培養して得られる
リコンビナントｈ−ＨＧＦ並びに之等の製造方法に関す
る。

従来技術とその課題 肝臓は、再生能力の旺盛な臓器であり、例えばラットの
肝臓はそのほぼ２／３を切除しても、残された組織が急
速に増殖を開始し、約２週間後には元の大きさに戻るこ
とが知られており、この事実を利用して、ヒトでも劇症
肝炎患者や肝癌患者等において肝組織の部分切除手術後
、残された正常肝組織からの増殖を待つ治療法が行なわ
れている。上記肝臓の増殖（肝再生）機序については、
従来より各種の研究が行なわれ、肝切除後のラットの血
液中に何らかの体液性の肝再生因子が出現することが示
唆され、該因子（ｒａｔ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏ
ｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：　ｒ−ＨＧＦ）　（７）部分精
製に成功した例も種々報告されている。また四塩化炭素
やチオアセトアミド等による肝障害ラット血清中にも上
記因子の存在することが報告されている。

ヒトにおいても上記ラットと同様の体液性肝再生因子の
存在は推定されているが、現在向、該因子の確認、証明
はなされるに至っていない。

本発明者らは、上記ヒトの肝再生因子につき鋭意研究を
重ねてきたが、その過程で劇症肝炎等の一定の肝疾患患
者の血清が、高い肝細胞増殖活性を有するという知見を
得、これを基礎として該活性物質（ｈ−ＨＧＦ）の単離
精製に成功した。

また引き続く研究の結果、上記ｈ−ＨＧＦの部分的アミ
ノ酸配列を解明し、これをコードするオリゴヌクレオチ
ドを合成し、該オリゴヌクレオチドをプローブとして、
新たにｈ−ＨＧＦｃＤＮＡの単離に成功し、ここにｈ−
ＨＧＦをコードするＤＮＡ塩基配列（遺伝子）を解明し
、該配列を含むｈ−ＨＧＦ発現プラスミド、該プラスミ
ドを保有する形質転換体及びその培養によるリコンビナ
ントｈ−ＨＧＦの製造という一連の研究開発に成功し、
ここに本発明を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、（１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
による）が９６０００〜８２０００の範囲にあり且つ主
に９２０００と８４０００とであり、（２）メルカプト
エタノール存在下での還元処理により下記サブユニット
αとサブユニットβ１又はβ２とに分離され、（３）ｐ
ｈ　ｅを基準（２２モル）とするアミノ酸組成が以下の
ものである Ａｓｐ　ｌ　Ｑ　６Ｔｈｒ　　４８Ｓｅｒ　　５１Ｇｌ
ｕ　　８７　　　Ｇｌｙ　　７６Ａｌａ　　３１Ｖａｌ
　　３３　　　Ｍｅｔ　　１７　　１１ｅ　　４ＱＬｅ
ｕ　　５Ｑ　　　Ｔｙｒ　　３（３Ｐｈｅ　　２２ＬＹ
Ｓ　　５８　　　Ｈ４Ｓ　　２７　　　Ａｒｇ　　５２
ことを特徴とする肝再生因子が提供される。

サブユニットα： （１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）は約６２
０００である、 （２）少なくとも次のアミノ酸配列を有する、（ｉ）Ｃ
ｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（ｉｉ）Ａｓｎ−Ｍｅ　
ｔ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−Ｌｅ　ｕ−Ｈｉ　ｓ−Ａｒｇ−
Ｈｉ　ｓ　−Ｉ　１　ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｌｙｓ（面Ａ　ｓｎ−
Ｔｙｒ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
ｒ−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｔｈ　ｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｌｙ
−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ（＄　Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇ　
１　ｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＴｈｒＴｈｒ−Ａｓｐ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉ　１ｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｎ（ｙ）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒ。

Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−ＴｈｒＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−
Ｃｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ （ｙ９　Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａ−Ｈｌｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｔｈｒ−ＧｌｙＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−
Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒ。

１１ｅ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃ：ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（
３）Ｐｈｅを基準（１８モル）として次のアミノ酸組成
を有する、 Ｃｏ＋ｃ　　３８．　５　　　Ａｓｐ　　８７．　５Ｔ
ｈｒ　　３７．　　ｌ　　　Ｓｅｒ　　３２．　７Ｇｌ
ｕ　　６０．　８　　　Ｇ’）’　　４３．　０Ａｌａ
　　１４．　９　　　Ｖａｌ　　１３．　３Ｍｅｔ　　
ＩＱ、　　４　　１１ｅ　　２２．４Ｌｅｕ　　２３．
　７　　　Ｔｙｒ　　２３．　５Ｐｈ”　　１８．ＯＬ
ｙｓ　　４１．４Ｈｉｓ　　２０．　８Ａｒｇ　　３６
．　８サブユニツトβ１　； （１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）は約３４
０００である、 （１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）は次の通
りである、 Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉ　ｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔ
ｙｒ−ＡｒｇＡｓｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｃｙｓ
−（３）Ｐｈｅを基準（４モル）として次のアミノ酸組
成を有する、 Ｃｍｃ　　１２．　２　　　Ａｓｐ　　２８．　７Ｔｈ
ｒ　　１２．　３　　　Ｓｅｒ　　１９．　４Ｇｌｕ　
　２８．　　Ｉ　　　Ｇ’Ｙ　　４１．　　ＩＡｌａ　
　１５．　３　　　Ｖａｌ　　２２．　　ＱＭｅｔ　　
　３．２　　　Ｈｅ　　１５．７Ｌｅｕ　　２６．　　
Ｉ　　　Ｔ）’ｒ　　１４．　６Ｐｈｅ　　　４．Ｑ　
　　Ｌｙｓ　　ＩＢ、５Ｈｉｓ　　　９．２Ａｒｇ　　
１９゜０サブユニツトβ２　： （１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）は約３２
０００である、 （１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）は次の通
りであり、β１のそれと一致する、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈ
ｒ−ＡｓｎＩ　ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ
−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｃｙｓ−（３）Ｐｈｅを基準
（４モル）として次のアミノ酸組成を有する、 Ｃｍｃ　　１５．　０　　　Ａｓｐ　　３２．　４Ｔｈ
ｒ　　１３．Ｑ　　　Ｓｅｒ　　２１．　０Ｇｌｕ　　
３１．　　ＯＧ’Ｙ、　　４４．　２Ａｌａ　　１５．
　７　　　Ｖａｌ　　２４．　１Ｍｅｔ　　　３．９　
　１１ｅ　　１７．８Ｌｅｕ　　２９．　５　　　Ｔｙ
ｒ　　１５．　７Ｐｈｅ　　　４．ＯＬｙｓ　　２１．
６Ｈｉｓ　　１０．　３　　　Ａｒｇ　　２１．　３上
記及び以下の本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩
基配列、核酸等等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ，Ｉ
ＵＢの規定もしくは当該分野における慣用される表示法
に従うものとする。

本発明の肝再生因子（以下これをｒｈ−ＨＧＦＪと略記
する）の上記特性及びその他の性状については、後記実
施例において詳述する。

本発明のｈ−ＨＧＦは急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、劇
症肝炎等の肝疾患の治療乃至は肝切除術後の治療薬とし
て、また上記各疾患の免疫学的診断を確立するための抗
原等として有用である。更に該ｈ−ＨＧＦの利用によれ
ば、ヒトを始めとして各種動物由来の肝細胞を、該ｈ−
ＨＧＦの存在下に生体外で極めて容易に増殖、維持する
ことができ、かくして増殖、維持される肝細胞は、例え
ば肝機能等の基礎的研究用、各種ホルモンもしくは薬剤
等の肝細胞に対する作用の研究用、肝疾患治療薬等のス
クリーニング試験用等に有用であり、更に発癌試験用及
び肝炎ウィルスの生体外培養における宿主細胞としても
有用である。本発明はかかる有用な生理活性物質を提供
するものである。

以下、本発明ｈ−ＨＧＦの製造方法につき詳述する。

本発明ｈ−ＨＧＦは、一定の肝疾患を有する患者の血清
、殊に劇症肝炎患者の血清より効率よく、しかも高収率
で単離することができる。ここで原料として用いられる
血清は、常法に従って得ることができる。

上記原料からの本発明ｈ−ＨＧＦの製造は、基本的には
この種の生体物質からの蛋白性物質の分離に汎用される
通常の方法と同様にして、目的とするｈ−ＨＧＦの物理
的、化学的性質を利用した各種処理操作に従い実施する
ことができる。該処理操作としては、例えば通常の蛋白
沈澱剤による処理、限外が過、分子ふるいクロマトグラ
フィー（ゲル濾過）、遠心分離、電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
、透析法、これらの組み合せ等が挙げられる。特に好ま
しい上記操作の一例としては、まず原料血清を陽イオン
交換クロマトグラフィーにかけて活性を有するピークを
集め、これを次いでＨＧＦと特異的に結合する例えばヘ
パリン等を用いたアフィニティークロマトグラフィーに
かけ、更に得られる活性ピークを逆相クロマトグラフィ
ーに付すことにより精製することができる。上記各処理
の操作、条件等は、通常のこの種の方法におけるそれら
と同様のものとすることができ、これにより本発明ｈ−
ＨＧＦが単離精製され、これは上記した特性にて特定さ
れる。

尚、本発明ｈ−ＨＧＦは、上記精製操作により精製単品
とした後、これを２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ
）やジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の存在下に還元処
理することによって、サブユニットαとサブユニットβ
１又はβ２とに分離させることができ、このことからα
鎖とβ鎖の２つのサブユニットから構成されていること
が確認される。

上記各サブユニットの単離のための還元処理は、２−Ｍ
ＥやＤＴＴを始めとする各種の薬剤を用いた通常の方法
に従い実施できる。より好ましくはｈ−ＨＧＦのジサル
ファイド結合数の約５０倍モル量程度のＤＴＴを用いて
、例えば塩酸グアニジン等の変性剤の溶液中で還元処理
し、次いで該変性剤に対してほぼ倍量のヨードアセトア
ミドを用いて遊離したスルフィド基をブロックした後、
種々のクロマトグラフィー操作、より好適には逆相クロ
マトグラフィー操作により、各サブユニットを分離収得
できる。

かくして得られる本発明ｈ−ＨＧＦ及びそのサブユニッ
トの各々の緒性質（分子量、アミノ酸配列、アミノ酸組
成等）は、後記実施例に詳述する方法に従い測定される
。

また、本発明ｈ−ＨＧＦの活性の測定は例えば次の方法
により行われる。即ち、肝より分離された肝細胞をプレ
ート上にまき、これを培養する。

肝としてはラット肝、ヒト肝等の種々の哺乳動物の肝を
使用することができるが、その入手容易性やＨＧＦの研
究がラットを出発点としていることを考慮すれば、ラッ
ト肝の使用が好ましい。上記肝からの肝細胞の分離は例
えば常法に従いコラ−ゲナーゼ等の適当な酵素を作用さ
せて行なう方法を例示できる。また、上記肝の初期培養
は約６〜２４時間程度を要して行なうのがよく、プレー
トでの細胞密度は約５×１０４／ｃｍ２程度とするのが
好ましい。上記培養のための培地としては、通常の細胞
培養用培地をいずれも使用でき、特にウィリアムスＥ培
地等を用いるのが好ましい。上記で初期培養されたプレ
ート中にサンプルを添加する。その添加量は５０μ！程
度とするのがよい。

サンプルを添加したプレートを更に上記と同様の条件で
６〜２４時間程度、好ましくは１２時間程度培養した後
、放射性元素等で標識した核酸塩基、例えば　　■で標
識したデオキシウリジンや　Ｈで標識したチミジン等を
添加して、之等の細胞核への取り込みの度合いを測定す
ることによって、サンプル添加後の肝細胞のＤＮＡ合成
の増加度を測定する。上記標識された核酸塩基の添加量
は、１μＣｉ程度であるのが好ましい。

また本発明によれば、次式（１）で表わされ、本発明ｈ
−ＨＧＦに関連する新規なりＮＡ塩基配列と共に、該式
（１）のＤＮＡ塩基配列を含む次式（２）で表わされ、
本発明ｈ−ＨＧＦをコードする新規なりＮＡ塩基配列（
以下単に「本発明遺伝子」という）、これを含む発現プ
ラスミド及び形質転換体並びに該形質転換体の培養にょ
るリコンビナントｈ−ＨＧＦが提供される。

式（１）： ％式％ ： ＧＴＴＣＡＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡ
ＡＧＡＣＴＴＡＣＡＴＣＧＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＴＧＧ
ＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＴＡＡＧＣＴＧＡＡＴＧ
ＡＧＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＡＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡ
ＴＧＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣ：ＴＧＧＴＧＣＴＡ
ＣＡＣＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧ
ＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＧＴＴＧＴＧ
ＡＡＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＴＡＧＴ
ＣＡＡＴＴＴＡＧＡＣＣＡＴＣＣＣＧＴＡＡＴＡＴＣＴ
ＴＧＴＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＧ
ＴＴＧＴＡＡＡＴＧＧＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＧＡＡＣ
ＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＴＴＡＧＴＴＴＧ
ＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＴＣＴＧＣＧ
ＧＡＧＧＡＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＴＴＧ
ＧＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣＧＡＣＡＧＴＧＴＴＴＣ
ＣＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＧ
ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴ
ＣＣＡＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣ
ＡＡＡＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＣ
ＴＧＧＴＡＴＡＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＡ
ＴＣＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＧ
ＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＡ
ＧＴＡＣＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＣＣＴＡＡＴＴＡＴＧＧ
ＡＴＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＧＴ
ＴＧＣＡＧＴＧＴＴＴＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡ
ＣＴＧＧＡＴＴＧＡＴＣＡＡＣＴＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴ
ＡＴＴＡＣＧＡＧＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＣＴＡＴＡＴＡ
ＡＴＧＧＧＡＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣ
ＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡ
ＴＧＡＧＴＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴ
ＧＡＡＡＡＧＡＴＴＧＧＴＣＡＧ 式（２）： ％式％ ＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣ
ＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＡＧＴＣ
ＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＡＡＡＧ
ＡＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＧＧ
ＡＴＴＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡ
ＧＣＡＡＣＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴ
ＧＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＡＴ
ＧＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴ
ＴＴＴＴＧＴＣＣＧＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡ
ＡＡＡＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡ
ＣＡＴＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴ
ＧＡＡＧＴＡＡＧＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＡ
ＣＣＡＡＴＡＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＴＴＡＡＡ
ＡＴＧＴＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＴＡＡＧＡＣ 上記式（１）で表わされるＤＮＡ塩基配列は、ｈ−ＨＧ
Ｆに関連するもの、即ち本発明ｈ−ＨＧＦのアミノ酸配
列の少なくとも一部をコードするものであり、また式（
２）で表わされるそれは本発明遺伝子である。之等はい
ずれもリコンビナントｈ−ＨＧＦの遺伝子工学手法によ
る製造を可能とする遺伝情報を包含し、この点より該リ
コンビナントｈ−ＨＧＦの製造に有利に利用できる。

特に本発明遺伝子は勿論のこと、上記式（１）のＤＮＡ
塩基配列には、ｈ−ＨＧＦの活性中心をコードする配列
が含まれており、これを利用した遺伝子工学的手法によ
れば、活性なりコンビナンドｈ−ＨＧＦが製造できる。

以下、本発明のＤＮＡ塩基配列（本発明遺伝子）の製造
につき詳述すれば、これはヒト胎盤細胞を起源として、
該細胞より分離されたｍＲＮＡから調製できる。

上記細胞からのｍＲＮＡの分離は、基本的には通常の抽
出操作に従い実施される。より詳しくは、上記細胞を、
まず例えばＣＥＭ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ
−１６０培地、イーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’
ｓ　ＭＥＭ）　、−フィッシャーの培地（Ｆｉｓｈｅｒ
’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）　、Ｆ　−１０培地、Ｆ−１２培
地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ−１０９培地、ＲＰＭＩ−
１６４０培地等又は必要に応じて牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ
）等の血清やアルブミン等の血清成分を添加した上記培
地で、約ｌＸ１０４〜ｌ×１０７個／　ｘｌｌの濃度範
囲で、通常の培養法例えば炭酸ガス培養法等に従い、約
３０〜４０℃程度、好ましくは約３７℃前後で１〜５日
間を要して培養する。次いで培養上清中に目的物質が生
産蓄積される時期に、上記培養細胞を適当な界面活性剤
、例えばＳＤＳ、ＮＰ−４０、トリトンＸ１００、デオ
キシコール酸等を用いて、或いはホモジナイザーを用い
る方法や凍結融解等の物理的方法によって、部分的又は
完全に破壊、可溶化後、染色体ＤＮＡを、ホ＋）　）　
（７ン（ＰＯＬＹＴＲＯＮ、　ＫｉｎｅｍａｔｉｃａＳ
ｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等のミキサーもしくは注射筒を
用いである程度せん断し、その後蛋白質と核酸分画とを
分別して全ＲＮＡの抽出を行なう。この抽出操作には、
グアニジニウム／セシウムクロライド法［Ｇｕａｎｉｄ
ｉｎｉｕｍ　／　Ｃｅｓｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｍ
ｅｔｈｏｄ。

Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｐ１９４−１
９６　（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、　１９８２３等が一般ニ用イラレる
。

また上記各方法ではＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防
ぐために、例えばＲＮａｓｅインヒビター、ヘパリン、
ジエチルピロカーボネート、バナジウム複合体等を添加
使用することもできる。

上記操作に従い得られるＲＮＡからのｍＲＮＡの分離、
精製は例えばオリゴｄＴ−セルロース［コラボレイティ
プ　リサーチ社（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅ
ａｒｃｈ　Ｉｎｃ、）　］　、］ポリＵ−セファローし
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社コ等を用いて吸
着カラム法又はバッチ法により実施できる。

また之等の抽出操作に代えて、市販のｍＲＮＡ。

即ちヒト胎盤ポリ（Ａ）”　ＲＮＡを用いることも可能
である。

目的のｈ−ＨＧＦに対するｍＲＮＡの精製濃縮及び同定
は、例えば得られたｍＲＮＡを蔗糖密度勾配遠心等によ
って分画し、その分画につき、蛋白質の翻訳系、例えば
アフリカッメガエルの卵母細胞への注入やウサギ網状赤
血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻
訳させ、その蛋白質のｈ−ＨＧＦ活性を調べることによ
り実施できる。かくして目的ｍ　ＲＮ　Ａの存在を確認
できる。更に目的ｍＲＮＡの確認は上記ｈ−ＨＧＦの活
性測定に代えて、ｈ−ＨＧＦに対する抗体を用いる免疫
法によっても行ない得る。

上記で得られる精製ｍＲＮＡは通常不安定であるため、
これを安定なｃＤＮＡに変換し、目的遺伝子の増幅を可
能とするために微生物由来のレプリコンに接続する。イ
ンビトロでの上記ｍ　ＲＮ　ＡのｃＤＮＡへの変換、即
ち本発明遺伝子の合成は、一般的な方法、例えばオカヤ
マーバーグ法〔Ｈ・Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｐ、Ｂｅ
ｒｇ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、３．　ｐ２８０　（１９
８３））やダブラ−ホフマン法（Ｖ、Ｇｕｂｌｅｒ　ａ
ｎｄ　Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｇｅｎｅ、　ｖｏｌ
。

２５・ｐ２６３−２６９　（１９８３）　３等に従い実
施できる。より詳しくはまずオリゴｄＴをプライマーと
しくこのプライマーはポリｄＴを付加したベクタープラ
イマーであってもよい）　、ｍＲＮＡを鋳型としてｄＮ
　Ｔ　Ｐ　（ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　　ｄｃＴＰ又は
ｄＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡか
らこれに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次のステ
ップは上記においてオリゴｄＴを用いたか、ベクタープ
ライマーを用いたかにより、それぞれ以下の如く異なる
。

前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカリ処理等によ
り分解して除去し、その後−本鎖ＤＮＡを鋳型として逆
転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼ■を用いて二本鎖ＤＮ
Ａを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの両端をエキ
ソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適当なリンカ
−ＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩基を複数付
加し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系プラスミド
ベクターやλｇｔ系ファージベクター等に組込む。

また後者の場合、鋳型としたｍ　ＲＮ　Ａを残存させた
まま上記と同様のアニーリング可能な組合せの塩基を複
数付加した開環状プラスミドと、リンカ−ＤＮＡ　（Ｌ
ばしば動物細胞で自立複製できる領域とｍＲＮＡの転写
プロモーター領域を含むＤＮＡ断片が用いられる）とを
アニーリングさせて閉環状とした後、ｄＮＴＰの存在下
でＲＮａｓｅ　ＨとＤＮＡポリメラーゼＩとを共存させ
てｍＲＮＡをＤＮＡ鎖に置換して完全なプラスミドＤＮ
Ａを作成できる。

上記のごとくして得られるＤＮＡは、これをベクターの
宿主、例えばエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）　　、バチルス　　ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、サツカロミセス
　セレビシ７工（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）等の適当な宿主内に導入して、これを
形質転換できる。このＤＮＡの宿主への導入及びこれに
よる形質転換方法としては、一般に用いられる方法、例
えば主として対数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣｌ２
処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にしてプラ
スミドを取り込ませる方法等を採用できる。

上記方法においては通常知られているように形質転換の
効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ２やＲｂＣＡ’を
更に共存させ得る。また宿主細胞をスフ二ロプラスト又
はプロトプラスト化してから形質転換させる方法も採用
できる。

上記により得られる形質転換株から、目的のｈ−ＨＧＦ
のｃＤＮＡを有する株を選出するには、例えば以下に示
す各種方法を採用できる。

（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリ
ーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる場合（該配列は複数個連続した特異的配列であれば
目的蛋白のどの領域のものでもよい）、該アミノ酸に対
応するオリゴヌクレオチドを合成しくこの場合コドン使
用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩基配列
の組合せの複数個のどちらでもよくまた後者の場合はイ
ノシンを含ませてその種類を減らすこ３２　　　　３５ ともできる）、これをプローブ（Ｐ又は　Ｓでラベルす
る）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロ
セルロースフィルタートハイブリダイゼーションし、得
られたポジティブ株を検索してこれを選出する。

（２）動物細胞でｈ−ＨＧＦを産生させてスクリニング
する方法 形質転換株を培養し遺伝子を増幅させ、その遺伝子を動
物細胞にトランスフェクトしくこの場合、自己複製可能
でｍＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミドもし
くは動物細胞染色体にインチグレートするようなプラス
ミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白質
を産生させてその培養上清もしくは細胞抽出物のｈ−Ｈ
ＧＦ活性を測定するか又はｈ−ＨＧＦに対する抗体を用
いてｈ−ＨＧＦを検出することにより元の形質転換株よ
り目的のｈ−ＨＧＦをコードするｃＤＮＡを有する株を
選出する。

（３）ｈ−ＨＧＦに対する抗体を用いて選出する方法 予めｃＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベク
ターに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、ｈ−
ＨＧＦに対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用い
て、ｈ−ＨＧＦ産生株を検出し、目的株を得る。

（４）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トラン
スレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃＤＮＡをニトロセルロースフ
ィルターにプロットし、ｈ−ＨＧＦ産生細胞からのｍＲ
ＮＡをハイブリダイゼーション後−１ｃＤＮＡに対応す
るｍ　ＲＮ　Ａを回収する。回収されたｍＲＮＡを蛋白
翻訳系、例えばアフリカッメガエルの卵母細胞への注入
や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞
系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のｈ−ＨＧＦ活性を
調べるか又はｈ−ＨＧＦに対する抗体を用いて検出して
、目的の株を得る。

得られた目的の形質転換株より本発明遺伝子を採取する
方法は一般的方法、例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに
相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮ
Ａ領域を切り出すことにより行ない得る。

かくして、前記式（１）のＤＮＡ塩基配列及び式（２）
の本発明遺伝子を収得できる。之等はそれぞれ次式（３
）に示す５８８個のアミノ酸配列のｈ−ＨＧＦ関連ポリ
ペプチド及び次式（４）に示す７２８個のアミノ酸配列
のｈ−ＨＧＦポリペプチドをコードしている。

式（３）： ％式％ Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−１
１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ
−Ｇｌｙ（ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔ
ｒｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ＡｓｐＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−
Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｎ
−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−
３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓ
ｎＴｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−
Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＳｅｒＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｌｓ−
Ａｒｇ−）（ｉｓ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＬｅｕＡｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ
−ＧｌｙＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇ
ｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｙ−３ｅｒ
（４）　： Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ａｌａ−
１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈ
ｒ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕｌ
ｌｅ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｙｓ（ｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃ
ｙｓＡｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ
−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈ
ｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ａｒｇ
−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−１１ｅ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−１１ｅ−５ｅｒ−ＡｒｇＣｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、−
Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈ
ｉｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌ
ａＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒ
ｐ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ
−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−５ｅ
ｔ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ
−Ｈｌｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａ
Ｉａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（ｌｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ・Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｙ
−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−
５ｅｒ−８ｅｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅ
ｒ−９ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒ。

Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ
−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｍ
ｅｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ
−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｈ
ｉｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｍｅ
ｔ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−
１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−
５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｈｌｓ−Ｇｌｕ−Ｈ
ｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−５
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ（Ｉｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−ＡｓｐＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ
−５ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−
Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈ
ｉｓ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ
−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ（ｌｅ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙ
ｓ−ＧｌｕＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＬｅｕＡｓｐ−Ｈｉ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒ
ｐ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ
−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−）（ｉｓ−１１ｅ−Ｃｙｓ
−ＧｌｙＧｌｙ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−ＡｓｐＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｌｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｍ
ｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−５ｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｇｌ
ｎ−３（ｉｓ−Ｈｌｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｕ
ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−９ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙ
ｓ−ＧｌｕＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｈ
ｌｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌｌｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＡｌａＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｈｌｓ−Ｌｙｓ−１１ｅ−１１
ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｎ−８ｅｒ本発明遺伝子（ＤＮＡ塩基配列）は、
上記式（３）及び式（４）に示された情報に基づき、例
えばホスファイト　トリエステル法（Ｎａｔｕｒｅ・３
１０、１０５．　（１９８４））等の常法に従い、核酸
の化学合成により製造することもでき、また各式に示さ
れるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするＤＮＡを
原料として、上記化学合成手段を含む通常の方法に従い
製造することもでき、特に後者の方法は簡便であり好適
である。

この後者の方法において、一部ＤＮＡの化学合成やＤＮ
Ａ鎖の切断、削除、付加乃至は結合を目的とする酵素処
理やＤＮＡの単離、精製乃至複製、選別等の各種操作乃
至手段は、いずれも常法に従うことができ、本発明遺伝
子以外の遺伝子もしくはＤＮＡ鎖について当該分野でよ
く知られている各種方法をいずれも採用することができ
る。例えば上記ＤＮＡの単離精製は、アガロースゲル電
気泳動法等に従うことができ、核酸配列のコドンの一部
の改変は、サイト−スペシフィック　ミュータジェネシ
ス（Ｓｉｔｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｔｓ　）［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、
　８１．５６６２−５６６６　（１９８４）　）等に従
うことができる。尚、上記において所望のアミノ酸に対
応する遺伝暗号の選択は、特に限定されるものではなく
、利用する宿主細胞のコドン使用頻度等を考慮して常法
に従い決定できる（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
、　９．４３−７４　（１９８１）　）。

また上記に従い得られるＤＮＡ配列の決定及び確認は、
例えばマキサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅ
ｒｔ）（７）化学修飾法［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、　
６５．４９９−５６０　（１９８０）］やＭ１３ファー
ジを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ、　Ｊ、　ａｎｄＶｉｅｉｒａ、　Ｊ、、　Ｇｅ
ｎｅ、　１９．２６９−２７６　（１９８２））等ニヨ
り行なうことができる。

かくして得られる本発明遺伝子の利用によれば、遺伝子
組換え技術により、リコンビナントｈ−ＨＧＦを容易に
且つ大量に製造、収得できる。

このリコンビナントｈ−ＨＧＦの製造方法は、上記本発
明遺伝子（ＤＮＡ）の利用を必須として、基本的には公
知の各種遺伝子組換え技術に従うことができ６　（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）等参照
〕。

より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる
ような組換えＤＮＡ　（発現プラスミド等）を作成し、
これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換株を
培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用いることができる。該真核生物の細胞には、を
推動物、酵母等の細胞が含まれ、を推動物細胞としては
、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｙ、　Ｇｌｕｚ
ｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ、　２３．１７５−１８２（１９８
１））やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ
葉酸レダクターゼ欠損株（Ｇ、　Ｕｒｌａｕｂａｎｄ　
Ｌ、　Ａ、　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　、互、　４２１６−４２２０　（１９８
０））等がよく用いられているが、之等に限定される訳
ではない。を推動物細胞の発現ベクターとしては、通常
発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター
ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写
終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要
により複製起点を保有していてもよい。該発現ベクター
の例としては、ＳＶ４０の初期プ０−Ｅ−−ターを保有
するり　Ｓ　ｙ　２ｄｈｆｒ　［Ｓ。

Ｓａｂｒａｍａｎｉ、　Ｒ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ
　Ｐ、　Ｂｅｒｇ、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１．８５４−８６４　（１
９８１））等を例示できるが之等に限定される訳ではな
い。

また真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、
中でもサツカロミセス属酵母を有利に利用できる。該酵
母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性
ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐ
ＡＭ８２［Ａ・Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８０．１−５　（１９８３）］等を好
ましく利用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられる。之等を宿主とする場合、本発明では、例え
ば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、
このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように、該
遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン・アン
ド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な
開始コドン（例えばＡＴＧ　）を付与した発現プラスミ
ドを利用するのが好ましい。上記宿主としての大腸菌と
しては、エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターと
しては、一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、之等
に限定されず公知の各種の菌株及びベクターをいずれも
利用することができる。プロモーターとしては、例えば
トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターｌｐｐプロモー
ター　１ａｃプ０（−一ター、ＰＬプロモーター等を使
用でき、いずれも本発明遺伝子を発現できる。

上記大腸菌等の原核生物を宿主とする一つの方法につき
詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロ
モーター及びＳＤ配列を有するベクターｐＴＭ１〔今本
文男２代謝、　Ｖｏｌ、２２．２８９（１９８５））を
使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ
部位に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリペプ
チドをコードする遺伝子を連結させればよい。尚、本発
明遺伝子の発現は上記の如き直接発現系に限らず、例え
ばβ−ガラクトンダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利用し
て融合蛋白質発現系とすることもできる。

上記融合蛋白発現系の例としては、シグナルペプチドの
利用により目的ポリペプチドを細胞質膜外に分泌発現さ
せる方法を例示できる。ここでシグナルペプチドとして
は、例えばＬｐｐ　、　ＯｍｐＡ。

ＯｍｐＦ、　ＰｈｏＥ等の外膜蛋白質や、ＰｈｏＡ　　
Ｂｌａ等のペリプラズム蛋白質等の公知の各種のものを
使用できる。

本発明遺伝子の利用によるリコンビナントｈ−ＨＧＦの
製造の他の例としては、宿主細胞としてＣＯ８細胞を用
いる方法を例示できる。この方法においては発現ベクタ
ーとしてＳＶ４０複製起点を保有しＣＯ８細胞において
自律増殖可能で、更に転写プロモーター、転写終結シグ
ナル及びＲＮＡスプライス部位等を備えたものを用い得
、例えばＤＮＡ取り込みによる形質転換可能な状態（コ
ンピテント）のＥ、　ｃｏｌｉに本発明遺伝子を取り込
ませることにより目的発現プラスミドを収得できる。

かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への導
入及びこれによる形質転換方法としては、一般に用いら
れる各種方法を採用でき、例えば目的遺伝子が挿入され
た発現プラスミドは、アルカリ溶菌法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　ｐ３６Ｂ（１９８２））
等により調製され、ＤＥＡＥ−デキストラン法やリン酸
カルシウム−ＤＮＡ共沈澱法等によりＣＯ８細胞に取込
ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を容易
に収得できる。

本発明遺伝子の利用によるリコンビナントｈ−ＨＧＦ製
造の他の方法としては、例えば宿主細胞としてチャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ
欠損細胞株を用いる方法を例示できる。

かくして得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養
でき、該培養により目的のりコンピナン）ｈ−ＨＧＦが
生産、蓄積される。該培養に用いられる培地としては、
採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜
選択できる。例えば宿主細胞として大腸菌等を利用した
形質転換体の培養には、ＬＢ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地、
Ｍ６３培地等を使用でき、２等培地には更に必要に応じ
て通常知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビ
タミン類、天然物抽出物、生理活性物質等を添加するこ
ともできる。また、ＣＯ８細胞等を宿主とする形質転換
体は、例えばＲＰＭ　Ｉ　−１６４０培地、ダルベツコ
の修正イーグル最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　
ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭＤＭＥＭ）
等の培地に、必要に応じて牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ）等の
血清成分を添加したもの等を使用して培養できる。上記
形質転換体の培養条件としては、宿主細胞の生育に適し
た条件を採用でき、大腸菌の場合は例えばｐＨ約５〜８
、好ましくは７又はその付近、温度的２０〜４３℃、好
ましくは３７℃又はその付近を採用できる。

上記により、形質転換体の細胞内乃至細胞外に目的とす
含むことを特徴とするヒトｈ−ＨＧＦが生産、蓄積乃至
分泌される。該リコンビナントｈ−ＨＧＦはその物理的
性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（「生化
学データーブックＩＩ　Ｊ　、１１７５−１２５９頁、
第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学
同人発行、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖｏｌ、２
５゜Ｎｏ、２５．８２７４−８２７７　（１９８６）　
；　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

巧ム３１３−３２１　（１９８７）等参照）により分離
、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常
の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心
分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子
篩クロマトグラフィー（ゲルが過）、吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アブイニテイ
クロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
Ｐ　Ｌ　Ｃ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法
、之等の組合せ等を例示できる。特に好ましい分離方法
においては、まず培養上清より予め目的とする物質を部
分精製する。この部分精製は例えば硫酸アンモニウム、
硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる
処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる
限外濾過処理により行なうことができる。之等各処理の
操作及び条件は、通常のこの種の方法のそれらと同様の
ものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、吸着クロマトグラフ
ィー、アブィニティクロマトグラフィーゲル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等
に付すことにより、又は之等各操作の組合せにより、目
的物質の活性が認められる両分を収得でき、かくして目
的物質を均質な物質として単離できる。上記により、容
易に高収率、高純度で所望のりコンビナンドｈ−ＨＧＦ
を工業的規模で製造できる。

かくして得られる本発明のりコンビナンドｈ−ＨＧＦは
、前述した本発明ｈ−ＨＧＦと同様の各種用途に有利に
利用できる。

実　　施　　例 以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述べるが、
本発明は之等に限定されるものではない。

実施例　１ （１）肝細胞増殖活性（ＨＧＦ活性）の測定セグ１７　
ン（Ｓｅｇｌｅｎ）　（７）方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１３．　ｐ２
９．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ
（１９７６）　）に従い、ウィスター系雄ラット（体重
１５０　ｇ）より、０．０５％コラ−ゲナーゼ（タイ１
１，９フフ社）を用いて肝実質細胞を単離した。この肝
実質細胞を直径２．　４ａｎのウェルを有するマルチウ
ェル　プラスチック　デイツシュ（Ｎｕｎｃ、社）に５
Ｘ１０４個／　１　ｘｉ　／　ｃｍ　２０：）濃度でま
き込み、３０％ＣＯ２＋７０％０２混合ガス気相下、３
７℃で単層培養した［Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、　ｅｔａｌ
、、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、、　１３５．３
６３−３７１　（１９８１）　）。

培養培地としては５％牛血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ、　Ｆｌｏｗ
　ＬａｂＮａｒｔｈ　Ｒｙｄｅ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ
）、２μＭインスリン、１μＭデキサメサゾン、１００
Ｕ／ｙ／ペニシリン及び１００μｇ　／　ｘｌｌストレ
プトマイシンを添加したウィリアムスＥ培地（フローラ
ボラトリーズ社、以下「基本培地」と略す）を使用した
。培養開始後、２４時間目にＦＢＳを含まない基本培地
に培地交換し、同時に適量（５０μｌ以下）の被検試料
を添加した。

ｈ−ＨＧＦ活性は、被検試料添加による被検細胞のＤＮ
Ａ合成の増加によって検討した。これは２５ 上記被検試料添加後、１２時間目に　　Ｉ−デオキシウ
リジン（アマジャム社製）１μＣｉ　／　５０μｌを加
え、更に２４時間培養を継続し、この継続培養後、被検
細胞をＰＢＳで２回、５％ＴＣＡ（和光紬薬工業社製）
で１回洗浄し、次いでＩＮＮ　ａ　ＯＨ１２Ａ７で可溶
化して、該細胞核中のＤＮＡ２５ に取り込まれた　　Ｉ−デオキシウリジン量を、ガンマ
カウンター（アロカ社製）を用いて測定することにより
実施した。

被検試料により肝実質細胞ＤＮＡに取り込まれ１２５　
　　− た　　■−アオキシウリジン量を、被検試料無添加群と
のカウントの差として求め、これをＤＮＡ合成活性（ｃ
ｐｍ　／ウェル）とし、被検試料のＨＧＦ活性の指標と
した。

（２）本発明ｈ−ＨＧＦの製造 ■　劇症肝炎患者の血漿交換療法に際して得られた患者
血漿を原料として用いた。

まず原料血漿１１を、５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，５）にて２倍に希釈し、Ｎ００４ガラスフイルター
を用いて濾過し、炉液を直接Ｓ−セファロースファース
トクロー（ファルマシア社製）カラムに添加した。同カ
ラム（４Ｘ２５ｃｍ）は、予め５０ｍＭ）リス塩酸含有
０．１５ＭＮａＣｌ、Ｑ、１％ＣＨＡＰＳ　（片山化学
工業（株）製）（ｐＨ８，５）（以下「Ａバッファー」
という）で平衡化しておき、サンプルを３１！／分の速
度で添加後、２ＭＮａＣＡ’を含む同溶液（以下「Ｂバ
ッファー」という）を用いたリニアグラジェント（Ａ、
Ｂそれぞれ４００ｙＡ’）により溶出させた。

上記で得られた活性画分（０，５〜０，６ＭＮａＣ／）
を蒸留水で３倍に希釈し、希塩酸でｐＨを７．８に調整
した後、Ａバッファーで平衡化したヘパリン−セファロ
ースカラム（ファルマシア社、０．８Ｎ７ｃｍ）にかけ
た。

サンプルを０．５ｘｌｌ１分の速度で添加後、Ｂバッフ
ァーを用いてリニアグラジェントにより溶出させた（Ａ
、Ｂ各バッファーそれぞれ５０ｚｌり。

上記で得られた活性画分（１〜１．２ＭＮａＣＡ’）を
、Ｃ４−逆相高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰ　Ｌ　
Ｃ）にて分画して、単品のｈ−ＨＧＦを得た。

即ち、０．１％ＴＦＡ＝水で平衡化したＣ４逆相カラム
（ハイボアーＲＰ３０４．２４０Ｘ４／６ＩｎＩｎ１バ
イオラッド社製）を用いたリニアグラジェント（平衡化
及び溶出液抜５０ｚｌ）により溶出させた。

かくして原料血漿より３０万倍以上に精製された純粋な
ｈ−ＨＧＦを得た。

■　ｈ−ＨＧＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の測定 レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）（７）方法［Ｎａｔｕｒｅ、
　２２７．６８０−６８５　（１９７０））に従い、３
％スタッキングゲル及び１０％分離ゲル（厚さ１．５ｍ
ｍ）を用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、銀染色した後
、同時に泳動させた分子量マーカーのバンドと比較して
ｈ−ＨＧＦの分子量を決定した。

その結果ｈ−ＨＧＦの分子量は、約８４０００Ｄである
ことが判明した。

■　ｈ−ＨＧＦのアミノ酸組成 上記■で精製されたｈ−ＨＧＦ溶液約２０μｇ相当量を
、硬質カラスサンプル管（日型理化硝子社製、６Ｘ４０
＋ｎｍ）にとり、加水分解用反応バイアル（ピアース社
製）に入れ、真空乾固後、６Ｎ−塩酸（含１％フェノー
ル）２００μｌを該反応バイアルに入れ、減圧密封し、
１３０℃で４時間加水分解反応を行なった。

反応終了後、サンプル管にＮａＳＴＭ溶液（ベックマン
社製）２００μｌを加え、アミノ酸分析用サンプル管に
移し、その５０μｌを６３００Ｅ型アミノ酸分析計（ベ
ックマン社製）に自動注入してアミノ酸分析を行なった
。

尚、検出法としては、ニンヒドリン法を用いた。

該方法ではトリプトファンは検出できない。

分離固定された各アミノ酸を３点の濃度の標準アミノ酸
（１ナノモル）にて作成した検量線により定量し、分子
量が８００００位になるように、フェニルアラニンを２
２個含むものとして、その組成比を算出した。

上記に従う本発明ｈ−ＨＧＦのアミノ酸組成比は下記第
１表の通りであった。

第　　　１　　　表 （３）ｈ−ＨＧＦサブユニットの製造 ■　サブユニットα、β１及びβ２の製造上記（２）の
■で精製したｈ−ＨＧＦの純品を、遠心型エバポレータ
ーで濃縮後、４Ｍ塩酸グアニジン含有０．５Ｍ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）３ｘｌｌに、１ナノモル／　ｚ
ｌの濃度となるように溶解し、６マイクロモルのジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）を添加して５０℃にて４時間還
元反応を施した。

１２マイクロモルのヨードアセトアミドを加え、室温で
１時間反応させた後、Ｃ４−逆相ＨＰＬＣ（機種、条件
等は前記（２）の■と同様とした）により分画して、サ
ブユニットα、β１及びβ２のそれぞれを得た。

■　サブユニットの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の決
定 上記■で得た各サブユニットの分子量を前記（１）の■
と同様の方法により５ＤＳ−ＰＡＧＥにて決定した。

その結果サブユニットαの分子量は、約６２０００であ
った。

サブユニットβ１の分子量は、約３４０００であった。

サブユニットβ２の分子量は、約３２０００であった。

■　サブユニットαの部分アミノ酸配列の決定前記（３
）の■により得られたサブユニットαの約６０μｇ相当
量に、リジルエンドペプチダーゼ（シグマ社製）の０．
２ミリモルを、３７℃で一晩作用させて、酵素処理断片
溶液を得た。

該酵素処理断片溶液を、Ｃ１８−逆相ＨＰＬＣにて分画
し、これを５つの画分に分け、再度これをＣ工８−逆相
ＨＰＬＣにかけた（クロマトの機種、条件は前記（２）
の■と同様とした）。

その結果、得られたフラグメントより次の配列が同定さ
れた。

（ｉ）Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（ｉｉ）Ａｓｎ
−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉ　ｓ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉ　ｓ−Ｉ　ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ（ｉｉｉ）Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
５ｅ　ｒ−Ｇ　１　ｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ｐＪ　Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇ
　１　ｕ−Ａ　ｓ　ｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−５ｅｒ
−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｙｒ−ＣｙｓＳｅｒ−Ｇｉｎ−１１ｅ−Ｐｒｏ
−Ａｓｎ（ｙ）　Ｇ　１ｙ−Ｐｈ　ｅ　−Ａ　５ｐ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ａｓ　ｎ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ
−Ｔｙｒ−ＣｙｓＡｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ ｉＤＬｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−
Ｈ４５−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉ　ｌ
ｅ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ上記上記
サブユニット槽成する部分アミノ酸配列（ｉ）〜（Ｖｌ
ｌ中には、下記アミノ酸配列（１）　　Ｃｙｓ−Ｇｌｎ
−Ａｒｇ−Ｔｒｐ　。

（２）　　Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
Ａｓｐ及び（３）　　Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ というクリングル構造（Ｋｒｉｎｇｌｅ　）　　（Ｍａ
ｇｎｕｓｓｏｎ。

Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ
　ａｎｄ　ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｇｕｌａｔ
ｉｏｎ、　　ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｄ、　　Ｗ、　　Ｒ
ｉｂｂｏｎｓ　ａｎｄ　Ｋ。

Ｂｒｅｗ、　ｐｐ２０３−２３８．　Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　ニ特徴的な配列が
含まれており、このことから、サブユニットα中には、
少なくとも３つのクリングル構造が含まれると推定され
る。

ＨＧＦのサブユニットβのＮ末端アミノ酸配列がＶａ　
１−ｖａ　ｌであることと、サブユニットαが上記クリ
ングル構造を有することは、プラスミノーゲン、ウロキ
ナーゼを始めとする因子と同様であり、このことから、
Ｐｒｏ）（ＧＦが一本鎖であり、プラスミノーゲンと同
様のプロセスにより活性化され得ることが推定される。

またＨＧＦ分子の進化、作用機序の解明においても之等
の因子の性格は参考となる。

■　サブユニットβ１及びβ２のＮ末のアミノ酸の同定 前記（３）の■により得られたサブユニットβ１の約５
００ピコモル相当量を用いて、気相プロテインシークエ
ンサ−（アプライドバイオシステムズ社製、４７０Ａ型
）にて、サブユニットβ１のＮ末端より２５個のアミノ
酸残基の配列を決定した。

各反応サイクルで得られるＰＴＨ−アミノ酸溶液を、真
空乾固後、３３％アセトニトリル水溶液に溶解させ、Ｐ
ＴＨ−アミノ酸分析用逆相高速液体クロマトグラフィー
（ベックマン社製）にて分離固定した。

上記により決定されたサブユニットβ１のＮ末アミノ酸
配列は次の通りであった。

Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉ　ｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｉ　１ｅ−Ｃ
ｙｓ−前記（３）の■により得られたサブユニットβ２
の約５００ピコモル相当量につき、同様にしてＮ末端よ
り２５個のアミノ酸残基の配列を決定した結果は次の通
りであり、これはサブユニットβ１と同一であることが
確認された。

Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉ　ｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｖａ　１−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−１１ｅ−Ｃ
ｙｓ−■　サブユニットのアミノ酸組成 上記で得られたサブユニットα、β１及びβ２のそれぞ
れ約２μｇ相当量を、硬質ガラスサンプル管（日型理化
硝子社製、６Ｘ４ｍｍ）にとり、加水分解用反応バイア
ル（ピアース社製）に入れ、真空乾固後、６Ｎ塩酸（含
１％フェノール）２００μノを該反応バイアルに入れ、
減圧密封し、１３０℃で４時間加水分解反応を行なった
。

反応終了後、サンプル管にＮａＳＴＭ溶液（ベックマン
社製）２００ａｌ！を加え、アミノ酸分析用サンプル管
に移し、その５０μｌを６３００Ｅ型アミノ酸分析計（
ベックマン社製）に自動注入してアミノ酸分析を行なっ
た。

上記方法に従い求められたサブユニットαのアミノ酸組
成は下記第２表の通りである。

第　　　２　　　表 同様にして求めたサブユニットβ１のアミノ酸組成を第
３表に、サブユニットβ２のアミノ酸組成を第４表にそ
れぞれ示す。

実施例　２ この例は前記式（１）のＤＮＡ塩基配列の製造を示す例
であり、以下の通り実施された。

（１）ｃＤＮＡライブラリーの調製 ヒト胎盤ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡ　（クローンチック社
製）の３μｇを用い、ランダムプライマーを鋳型として
ｃＤＮＡ合成システムプラス（アマジャム社製）により
ｃＤＮＡを合成した。

得られたｃＤＮＡ　（１μｇ）の末端にｃ　ＤＮＡクロ
ーニングシステム−λｇｔｌＯ（アマジャム社製）を用
いて、Ｅｃｏ　ＲＩリンカ−を連結し、連結物をランダ
ムファージλｇｔｌｏに導入してｃＤＮＡライブラリー
を得た。このｃＤＮＡの合成及びλｇｔｌＯへの導入は
、いずれもアマジャム社のマニュアルに従った。

（２）ｈ−ＨＧＦｃＤＮＡの単離 上記（１）で得たｃＤＮＡライブラリーの内の約１７０
万個のクローンにつき、ｈ−ＨＧＦｃＤＮＡのスクリー
ニングを、以下に示すプラークハイブリダイゼーション
法により実施した。プローブとしては、精製ｈ−ＨＧＦ
α鎖のアミノ酸配列解析より得られた次のペプチド（ペ
プチドＩ及び■）から、それらにそれぞれ相当するオリ
ゴヌクレオチドを合成して用いた。之等各オリゴヌクレ
オチドの合成は常法（例えば特開昭６３−１５２３９８
号公報参照）に従った。

〈ペプチド■〉 Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉｓ−１１ｅ−ＰｈｅＴｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
−Ａｓｐ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｌｙｓ〈ペプチド■〉 Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒ。

Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｎ−Ｉ　ｌｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−９ｅｒ−Ｇｌｎ（ｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ上
記各ペプチドより得られた各プローブ（プローブ５５０
〜５５５）のＤＮＡ配列は、それぞれ次の通りである′
。

ペプチドＩ→プローブ５５０（４４７−３２種）Ａｓｎ
−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅペプチド■→プローブ５５４
（６５７−２５６種）Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−
Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＡｌａＴＧＧ　　Ｇ
ＡＧ　　ＣＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＣ−３’ペプチドエ→
プローブ５５１（１７マーＨｉｓ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒ。

８種） ペプチドエ→プローブ５５２（１７７−８種）Ｈｉｓ−
１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒ。

ペプチドエ→プローブ５５３（１７７−８種）Ｈｉｓ−
Ｔｉｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒ。

Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒ。

ＧＴ Ａｓｎ−１１ｅ ＡＡＣＡＴ　　　−３’ ペプチド■→プローブ５５５（４５７−３２種）Ａｓｎ
−Ｉ　ｌｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ
−Ａｓｐ−ＭｅｔＣＣＣＡＡＣＴＧＴ　　ＧＡＣＡＴＧ
　　−３’１５ｃｍシャーレに調製したＬＢ寒天培地（
１％バクトドリプトン、０．５％バクトイ−スト・エキ
ストラクト、１％ＮａＣ１，１，５％バクトアガー、ｐ
Ｈ７，５）上に、大腸菌ＮＭ５１４株とプレート当り約
５００００個のプラークができるように希釈したファー
ジとを混ぜたトップアガロース（１％バクトドリプトン
、０．５％イースト・エキストラクト、０．５％ＮａＣ
ｊ？、０１２５％ＭｇＳＯ４，０，７％アガロース）を
重層した。

このプレートを３４枚用意し３７℃で７時間培養後、４
℃で１時間冷却した。このプレート表面にナイロンフィ
ルター（バイオダインＡメンプラン、Ｐａ１ｌ　Ｕｌｔ
ｒａｆｉｎｅ　Ｆｊｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｃｏｏｐｒａｔ
ｉｏｎ社製）を１分間のせてから、フィルターを変性液
［０，５Ｍ　　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　　ＮａＣ／］で５
分間、次に中和液［０，５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，０）
、１．５Ｍ　　ＮａＣ１＋０で５分間それぞれ処理し、
２ｘＳＳＣ［１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　　ＮａＣ１＋０
．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液］で洗浄して３０分
間風乾後、８０℃、真空下で１時間ベーキングを行なっ
た。尚、同様の操作を繰り返して同一プレートから２枚
のナイロンフィルターを得た。

このナイロンフィルターをプレハイブリダイゼーション
溶液［２×３３　Ｃ，１０）＜Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶
液（Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液＝０．０２％ポ
リビニルピロリドン十０．０２％牛血清アルブミン＋０
．０２％フィコール）、１００μｇ　／　ｚ／熱変性サ
す精子ＤＮＡ］中で５０℃で２時間処理した。

次にハイブリダイゼーション溶液［２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ。

Ｉ　Ｑ　）＜Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、プローブ］ニ
フィルターを移し６５℃、３０分間、更に徐々に６５℃
から４５℃に温度を下げてそのまま一晩処理してハイブ
リダイゼーションを行なった。プローブとしてはプロー
ブ５５０をγ−３２Ｐ−ＡＴＰで５′末端標識し、ニッ
クカラム（ファルマシア社製）で精製して３ｎｇ／１１
１の濃度でハイブリダイゼーション溶液に加えた。ハイ
ブリダイゼーション後、フィルターを２ＸＳＳＣ中、室
温で５分間、合計３回洗浄し、更に２ＸＳＳＣ中、５０
℃で２分間処理し、ＺＸＳＳＣ中でリンスして、３０分
間風乾後、増感スクリーンを用いて、Ｘ線フィルム（Ｘ
ＡＲ５、コダック社製）に、−７０℃で３日間オートラ
ジオグラフィーを行なった。

同一プレートから調製した２枚のナイロンフィルターの
同位置でプローブと強くハイブリダイズした２７個を選
び、元のプレートより２等プラークを含むアガロースを
かきとり、８Ｍ溶液［１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、０．０
１％ゲラチン、トリス塩酸（ｐＨ７，５）　、８ｍＭ　
　ＭｇＳＯ４コに懸濁させて、ファージ懸濁液とした。

このファージ懸濁液を希釈して、上記のプラークハイブ
リダイゼーションを繰り返し、最終的に単一ファージ懸
濁液を得た。

大腸菌ＮＭ５１４株とトップアガロースとを混ぜて重層
したＬＢ寒天培地に、上記の単一ファージ懸濁液を０．
５μｌずつ別々にスポットし、３７℃で１２時間培養し
た。このプレートを用いて上記のプラークハイブリダイ
ゼーションを行なった。プローブとしてはプローブ５５
１．５５２及び５５３の混合物、プローブ５５４及びプ
ローブ５５５を別々に用いた。混合プローブの場合はハ
イブリダイゼーションを６５℃から徐々に室温に温度を
下げて、室温で１時間以上行ない、２×ＳＳＣによる洗
浄は４０℃で行なった。

以上の結果、混合プローブ（５５１，５５２及び５５３
）、プローブ５５４及びプローブ５５５の全てとハイブ
リダイズするクローン２４個を得た。

（３）ｈ−ＨＧＦｃＤＮＡの塩基配列決定上記（２）で
得たｃＤＮＡのうち、最長のｃＤＮＡをもつ［λｈ−Ｈ
ＧＦ−４Ｊにつき、そのｃＤＮＡの塩基配列を以下の通
り決定した。

λｈ−ＨＧＦ−４　　ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ１で
切断後、約７８０　ｂｐ、約７４０ｂｌ］及び約３５０
ｂｌ’の各ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法で
分離シ、ソノケルカラＧＥＮＥｃＬＥＡＮ（Ｂ■ｏ１ｏ
１社製）で各断片を単離精製し、之等をそれぞれプラス
ミドｐＵｃ１１８　（宝酒造社製）の制限酵素Ｅｃｏ　
ＲＩ部位に挿入し、それぞれについて挿入方向が異なる
２種類の大腸菌ＪＭ１０９株トランストランスフォーマ
ント種）を得た。

之等を「Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　／　ｐｈ−ＨＧＦ
−４Ｊ、［Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　／　ｐｈ−ＨＧＦ−４ＬＲＪ、
「Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　／ｐｈ−１（ＧＦ−４Ｍ
Ｊ　、　　［Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　／　ｐｈ−Ｈ
ＧＦ−４ＭＲＪ、［Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　／　ｐ
ｈ−ＨＧＦ−４ＳＪ及び「Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　
／　ｐｈ−ＨＧＦ−４ＳＲＪとする。

之等のトランスフォーマントから、アルカリ溶菌法［Ｔ
、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ
　ａｎｄ　Ｊ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、　ｐ３６Ｂ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　１９Ｂ２）　ニヨ？）
プラスミドＤＮＡを調製し、キロシークエンスキットで
あルシークエナーゼ（５ｅｑｕｅｎａｓｅ　　　Ｕｎｉ
ｔｅｄＳｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社製）を
用イテ、キラトノマニュアルに準じてｃＤＮＡの塩基配
列を決定した。

その結果、λｈ−ＨＧＦ−４ｃＤＮＡは、前記式（３）
に示す５８８アミノ酸残基をコードする前記式（１）に
示すものであり、これによりコードされる推定アミノ酸
配列は、ｈ−ＨＧＦα鎖の部分アミノ酸配列と一致した
。またβ鎖のアミノ末端アミノ酸配列とも一致した。

実施例　３ この例は、本発明遺伝子及び遺伝子工学的手法によるリ
コンビナントｈ−ＨＧＦの製造の詳細を示す例であり、
以下の通り実施された。

（１）ｈ−ＨＧＦｃＤＮＡの単離 ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（クローンチック社製）
から、約１．３Ｘ１０６個のλファージについて、以下
に示すプラークハイブリダイゼーション法によりｃＤＮ
Ａの単離、スクリーニングを実施した。プローブとして
は前記λｈ−ＨＧＦ−４のｃＤＮＡ領域を制限酵素Ｅｃ
ｏ　ＲＩで切断して得られる３個のＤＮＡ断片の内、５
′側の７３６ｂｐ　（以下これを「５′　プローブ」と
よぶ）と、３′側の３５１ｂｐ（以下これを１３′プロ
ーブ」とよぶ）とを、ニックトランスレーション・キッ
ト（アマジャム社製）により、３２Ｐでラベルしたもの
を用いた。

実施例２と同様にして、ファージＤＮＡを固定したナイ
ロンフィルターをプレハイブリダイゼーション溶液［５
０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ　’　ｓ溶液
、５ｘＳＳＰＥ　（２０ｘＳＳＰＥ”３Ｍ　　ＮａＣＡ
’　十ｏ、２Ｍ−ＮａＨ２ＰＯ４十０．０２Ｍ　　ＥＤ
ＴＡ　（ｐＨ７，４））、０．１％ＳＤＳ及び１００μ
ｇ　／　ｘｌｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ１中で、４２℃で
４時間処理した。その後、ハイブリダイゼーション溶液
［５′プローブ及び３′プローブをそれぞれ１０６Ｃ１
）＋１１１　／ｉｌｌ含む上記プレハイブリダイゼーシ
ョン溶液コにフィルターを移し、４２℃で１６時間イン
キュベーションを行なった。ハイブリダイゼーション後
、フィルターを２ｘＳＳＣ−０，１％ＳＤＳ中で、室温
にて５分間、合計３回洗浄した後、更に０．１×５ＳＣ
−０，１％ＳＤＳ中で、６２℃で３０分間、合計２回洗
浄した。フィルターを風乾後、増感スクリーンを用いて
、Ｘ線フィルム（ＸＡＲ５、コダック社製）に、−７０
℃で一晩オートラジオグラフィーを行なった。

その結果、５′プローブと３′プローブとの両方にポジ
ティブ・シグナルを示す１０クローンを得た。之等につ
いて上記プラークハイブリダイゼーションを繰り返し、
それぞれを最終的に単一クローンとして単離した。

上記１０クローンの内、５′プローブとのみハイブリダ
イズし、１．６ｋｂのｃＤＮＡインサートを有するクロ
ーン（クローン８）及び５′プローブと３′プローブと
の両方共にハイブリダイズし、１．５ｋｂのｃＤＮＡイ
ンサートを有するクローン（クローン１２）を選び、之
等のそれぞれのｃＤＮＡ領域の塩基配列を決定した。

その結果を、制限酵素切断部位と共に第１図に示す。

尚、図中制限酵素の後の括弧内数値は５′末端から数え
た塩基の数であり、白抜き部分はｈ−ＨＧＦのコーディ
ング領域を示し、実線部分は非コーディング部分を示す
。

また第１図に示された全ＤＮＡ配列及びそのコーディン
グ領域の全アミノ酸配列（７２８アミノ酸残基からなる
）を第２図（第２−１図〜第２−３図）に示す。

上記図より、クローン８とクローン１２との両者に亘っ
て、ｈ−ＨＧＦの全コーディング領域が含まれることが
明らかである。

（２）　ｐｈＨＧＦの作製 この概略を第３図に示す。

上記（１）で得たクローン８のｃＤＮＡインサート由来
（７）　ｌ　４７ｂｐノＢａｍ　ＨＩ　−Ｅｃｏ　ＲＩ
　ＤＮＡ断片及び７２１　ｂｐノＥｃｏ　ＲＩ　−Ｓｃ
ａ　Ｉ［）　Ｎ　Ａ断片をそれぞれ単離し、之等をプラ
スミドｐＵｃ１１８のＢａｍ　ＨｌとＨｉｎｃ　ＨＩ間
に挿入して、ｐｈＨＧＦＢａｍ−５ｃａを得た。

次に、上記（１）で得たクローン８のｃ　ＤＮＡインサ
ート由来の７７１ｂｌ）のｐｓｔ　ｒ　−Ｅｃｏ　ＲＩ
ＤＮＡ断片と、同クローン１２のｃＤＮＡインサート由
来（ｙ）　５５５　ｂｐ（ｙ）Ｅｃｏ　ＲＩ−旧ｎｄ　
ＩＩＩ　ｌ）　ＮＡ断片とを単離し、之等をプラスミド
ｐＵｃ１１８（ｙ）ＰｓｔｌとＨｉｎｄ　ＩＩＩ間に挿
入して、ｐｈＨＧＦＰｓｔ−Ｈｉｎｄを得た。

更に、上記クローン１２由来の４２７ｂｌ）のＢｇｌＩ
Ｉ　−Ｅｃｏ　ＲＩ　ＤＮＡ断片と、同クローン１２由
来（７）　５１３　ｂｐ（ｙ）Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｄｒａ
　ＩＤＮ　Ａ断片トラ単離し、之等’ｆｔ”ｊラスミＦ
ｐＵＣ１１８（７）ＢａｍＨＩとＨｉｎｃ　ＨＩ間に挿
入して、ｐ　ｈ）（Ｇｐ　Ｂｇｌ−Ｄｒａを得た。

上記３種のプラスミドにつき、１）ｈＨＧＦＢａｍＳｃ
ａからは３３１　ｂｐ（ｙ）Ｂａｍ　ＨＩ−Ｎｃｏ　Ｉ
［）　Ｎ　Ａ断片を、ｐ　ｈＨＧｐ’　Ｐｓｔ−Ｈｉｎ
ｄからは８Ｑ　８ｂｐ（７）Ｎｃｏ　Ｉ−Ｘｈ。

Ｉ　ＤＮＡ断片を、またｐ　ｈＨＧ　Ｆ　Ｂｇｌ−Ｄｒ
ａからは６５８　ｂｐノＸｈｏ　ｌ−５ｐｈ　Ｉ　Ｄ　
Ｎ　Ａ断片ヲ、ツレツレ単離し、之等をプラスミドｐＵ
ｃ１１８のＢａｍ　ＨＩとＳｐｈ　Ｉ間に挿入して、目
的のｐｈＨＧＦを得た。

（３）ｐＲ８Ｖｓ−ｈＨＧＦ−ｄｈｆｒ１７）作製上記
（２）で得たプラスミドｐｈＨＧＦを制限酵素Ｂａｎ　
ＨＩ及びｓｐｈ　Ｉを用いて切断し、約２．３ｋｂのｈ
−ＨＧＦ　　ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によ
り単離した。

得られたＤＮＡ断片の両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて平滑化した後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを用
イテＳ８１■　リンカ−［ＧＧＴＣＧＡＣＣ，全酒造社
製コを連結し、次いで制限酵素Ｓａｌ■で切断すること
により、両末端にＳａｌ　Ｉ切断部位を有するｈ−ＨＧ
Ｆ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、プラスミドＩ）　ＲＳ　Ｖ　Ｓ　−ｄｈｆｒ　［
特開平２−２３９１号公報参照］を、Ｒ８Ｖ−ＬＴＲプ
ロモーターの下流に存在するＳａｌ　Ｉ部位で切断し、
得られた断片に、上記で得た両末端にＳａｌ　Ｉ切断部
位を有するｈ−ＨＧＦ　　ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結して、目的とするｈ−ＨＧＦ発現ベク
ターｐＲ８Ｖｓ−ｈＨＧＦ−ｄｈｆｒを構築した。

かくして得られたｈ−ＨＧＦ発現ベクターｐＲ８ＶＳ−
ｈＨＧＦ−ｄｈｆｒを保有する大腸菌ＨＢＩＯＩ株は、
「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｔ（ＢＩＯＩ　
／ｐＲ５ＶＳ−ｈＨＧＦ−ｄｈｆｒ　Ｊなる表示テ、工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されて
おり、その寄託番号は微工研菌寄第１１７３３号（ＦＥ
ＲＭＰ−１１７３３）　Ｊである。

（４）リコンビナントｈ−ＨＧＦを産生するＣＨＯ細胞
株の取得 ３Ｘ１０８細胞（ｙ）ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞株ＤＸＢ
１１　［Ｇ、　Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｌ、　Ａ、　Ｃ
ｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、
　７７、４２１６　（１９８０）コに、上記（３）で得
たｈ−ＨＧＦ発現ベクターｐ　ＲＳ　Ｖ　Ｓ　−ｈ　Ｈ
Ｇ　Ｆ　−ｄｈｆｒ（７）　２０　μｇを、エレクトロ
ポーレージａン法［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ｅｒＳＳＨ−１、島津製作所製コにより導入し、該導入
細胞を１０％透析血清（ギブコ社製）及び１×非必須ア
ミノ酸液（フロー社製）を含むＤＭＥＭ　（ギブコ社製
）からなる完全培地を用いて培養し、ｄｈｆｒ　　形質
転換細胞株をスクリーニングし、限界希釈法によりクロ
ーニングを行なってクローンを得た。

得られたクローンの内の２４株を２４ウエルプレートを
用いて４日間培養し、その培養上清中のｈ−ＨＧＦ量を
ｈ−ＨＧＦに対する抗体を利用したＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に
より測定した。

該ＥＬＩＳＡ法は次の通り実施された。

即ち、まずｈ−ＨＧＦモノクローナル抗体（Ｈ４−２）
（特開昭６４−２７４９１号参照）を、その濃度が１μ
ｇ　／　ｉｌｌとなるように、０．１ＭＮａＨＣＯｓで
調整し、これを１００μｌ／ウエルの割合でプレートに
コード口、これを−晩４°Ｃで放置した後、リン酸緩衝
化生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）緩衝液で洗浄し、プレート
をブロッキングするため１％ウシ胎児血清アルブミン（
ＢＳＡ）溶液２５０μＩＩ／ウエルを加え、−晩４℃で
放置した。

次に、１％ＢＳＡ及び０．４ＭＮａＣＡ’を含ｔ；　０
　、　　Ｉ　Ｍ　ＩＪ　ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）８０
ｔｔｌｌと、被検試料２０μｌを加え、２時間インキュ
ベートした後、０．０５％ツウィーン２Ｑ　（Ｔｗｅｅ
ｎ２０、シグマ社製）を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄し、
更に０．１％ＢＳＡを含む０．１ＭＩＪン酸緩衝波緩衝
液００倍に希釈したモノクローナル抗体（Ｈ４−２）を
１００μＩＩ／ウエルで加え、２時間インキュベートし
た後、０．０５％ツウィーンを含むＰＢＳで３回洗浄し
、１％ＢＳＡ及び０．１５Ｍ　　ＮａＣＡ’を含むＯ，
１Ｍリン酸緩衝液に３０００倍希釈した抗体（抗−ラッ
トＩｇＧ−ｐｏｘ、カッペル社製）を加えて、２時間イ
ンキュベートした。０．０５％ツウイーンを含むＰＢＳ
で３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ、和
光紬薬工業社製）２５■／１００ｚ／溶液を１００μ！
添加して発色させた。１０分後、２Ｎ硫酸１００μｌを
加えて反応を停止させ、ＯＤ　４９２の波長にて測定を
行なった。

予め同様の測定により作成した標準曲線より、ｈ−ＨＧ
Ｆの産生量をイムノリアクティブＨＧＦ（Ｉｍｍｕｎｏ
ｒｅａｃｔｉｖｅ　ＨＧＦ　　ｎｇ／ｌｌ）として求め
た。

上記ｈ−ＨＧＦ産生量測定結果より、所望のりコンビナ
ンドｈ−ＨＧＦ産生株ＣＨＯ−ｈＨＧＦ２−１株を選択
した。

該ＣＨＯ−ｈＨＧＦ２−１株の５Ｘ１０５／２５ｃｍ２
／　１０ｘｌｌとなる量を、２００ｎＭのメトトレキセ
ート（ＭＴＸ）を含む完全培地［非必須アミノ酸液（Ｘ
　１００非必須アミノ酸液、フロー社製）、１１■／　
ｉｌｌｌｌラジウムベート（フロー社製）、１０％牛脂
児血清（Ｆ　ＣＳ、ギブコ社製）及び２００ｎＭ　　Ｍ
ＴＸを含むＤＭＥＭ　（ギブコ社製）培地］中で、約３
週間培養し、得られたＭＴＸ耐性細胞を限界希釈法によ
りクローニングし、次にこれを２４ウエルプレートにて
４日間培養し、得られた各培養上清中のｈ−ＨＧＦ量を
、上記と同様にして測定した。

その結果を第５表に示す。

第 ５ 表 地に培地交換し、この培地でのＭＴＸ耐性株をスクリー
ニングした。

上記１μＭ　　ＭＴＸ耐性株をスクリーニング後、上記
と同様の条件下で該株の培養上清中のｈ−ＨＧＦ産生量
を測定した。

結果は下記第６表の通りである。

第　　　６　　　表 上記第５表に示されるｈ−ＨＧＦ高産生株ＣＨＯ−ｈＨ
ＧＦ２−１クローン０．２’−１６を、更に２００ｎＭ
　　ＭＴＸを含む完全培地で約２週開綿代培養した後、
１μＭ　　ＭＴＸを含む完全培上記第６表に示されるよ
うに、この方法によりｈ−ＨＧＦを２μｇ　／　ｘｉ以
上産生ずるクローン（ＣＨＯ−ｈＨＧＦ２−１クローン
１−６及び同クローン１−４４）が得られた。

（５）リコンビナントｈ−ＨＧＦの精製■　モノＳカラ
ムを用いた精製 上記（４）で得られた培養上清１０００ｚＡ’を、予め
０．１５Ｍ　　ＮａＣ１，１０ｍＭ　　Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（
ＨＥＰＥＳ）及び２　ｍ　Ｍ　Ｃａ　ＣＡ’　２を含む
５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）で平衡化し
たモノＳカラム（Ｍｏｎｏ　Ｓ　；ファルマシア社製）
にアプライし、同緩衝液で洗浄後、０．１から１．ＯＭ
　　ＮａＣ／の直線濃度勾配にて溶出させた（流速１１
／／分、２１１／チユーブ）。

その結果を第４図に示す。

図において縦軸は（１）が２８０１ｍにおける吸光度（
Ａ　２８０ｎｍ）を、（２）がＨＧＦ活性（ＤＮＡ合成
活性、ｃｐｍｘｌｏ’）を、（３）が免疫活性（イムノ
リアクティブＨＧＦ量、ｎｇ　７　ｘｌ！　）を、（４
）がＮａＣ１濃度（Ｍ）をそれぞれ示し、横軸はフラク
ションＮｏ、を示す。

該図より、リコンビナントｈ−ＨＧＦを含む培養上清の
モノＳカラム−ＦＰＬＣのＨＧＦ活性と免疫活性との溶
出位置は、共に０．８Ｍ付近であることが判る。

■　ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムを用いた
精製 上記■の溶出画分を、ＩＮ　　ＨＣＡ’にてｐＨ７，９
に調整し、蒸留水にて３倍希釈した。これを０．３Ｍ　
　ＮａＣ／を含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
９）で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ　
（ファルマシア社製、ベツドボリウム２，２ｚｌ）にア
プライし、同緩衝液にて洗浄後、０．３から２．０Ｍ　
　ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出させた（流速０．
５ｙｌｌ１分、１１１／チユーブ）。

上記溶出パターンを第５図に示す。

図において横軸はフラクションＮｏ、を、縦軸は２８０
１ｍにおける吸光度（Ａ２８０１ｍ、曲線（１））　、
ＨＧＦの免疫活性（曲線（２））、ＤＮＡ合成活性（Ｃ
ｐｍ　Ｘ　１０４　、曲線（３））及びＮａ　ＣＡ’濃
度（曲線（４））をそれぞれ示す。

該図より、本発明リコンビナントｈ−ＨＧＦは、ＮａＣ
／濃度約１．２Ｍ付近に溶出されることが判る。

（６）　リコンビナントｈ−ＨＧＦの同定■　５ＤＳ−
ＰＡＧＥによる分子量の測定上記（５）の■で精製され
たｈ−ＨＧＦを用いて、ラムリらの方法（Ｌａｅｍｍｅ
ｌｉ　ｅｔ、ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ。

２２７、６８０＝６８５　（１９７０））　ニ従ッテ、
５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。

その結果、本発明リコンビナントｈ−ＨＧＦの分子量は
、非還元条件下では約８４ｋｄであり、還元条件下では
約６２ｋｄの重鎮（サブユニットα）及び３２ｋｄと３
４ｋｄの２種の軽鎖（サブユニットβ１及びβ２）が検
出された。

■　アミノ酸組成 上記（５）の■で精製されたりコンビナンドｈ−ＨＧＦ
溶液約２０μｇ相当量を、硬質カラスサンプル管（日型
理化硝子社製、６Ｘ４０ｍｍ）にとり、加水分解用反応
バイアル（ピアース社製）に入れ、真空乾固後、６Ｎ−
塩酸（含１％フェノール）２００μｌを該反応バイアル
に入れ、減圧密封し、１３０℃で４時間加水分解反応を
行なった。

反応終了後、サンプル管にＮａＳＴＭ溶液（ベックマン
社製）２００μｌを加え、アミノ酸分析用サンプル管に
移し、その５０μｌを６３　’００　Ｅ型アミノ酸分析
計（ベックマン社製）に自動注入してアミノ酸分析を行
なった。

尚、検出法としては、ニンヒドリン法を用いた。

該方法ではトリプトファンは検出できない。

分離固定された各アミノ酸を３点の濃度の標準アミノ酸
（１ナノモル）にて作成した検量線により定量し、分子
量が８００００位になるように、フェニルアラニンを１
８個含むものとして、その組成比を算出した。

上記に従う本発明リコンビナントｈ−ＨＧＦのアミノ酸
組成比は下記第７表の通りであった。

尚、第７表には、実施例１で得た精製された天然型ｈ−
ＨＧＦの同結果を併記する。

第 表 ■　ＨＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性） 上記（５）の■で精製された本発明リコンビナントｈ−
ＨＧＦのＤＮＡ合成活性を、実施例１の（１）に記載の
方法に従い調べた。

結果を第６図に、線（１）として示す。

尚、第６図には、実施例１で得た精製された天然型ｈ−
ＨＧＦの同結果（線（２））を併記する。

図において横軸は供試試料の濃度（ｎｇ／ウェル／１１
）を、縦軸はＤＮＡ合成活性（ＣＩ）”　Ｘ　１０４　
）をそれぞれ示す。

該図より、本発明リコンビナントｈ−ＨＧＦは、本発明
の天然型ｈ−ＨＧＦとほぼ同等のＤＮＡ合成活性を示す
ことが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３で得たクローン８とクローン１２のｃ
ＤＮＡ領域と制限酵素地図とを概略図である。 第２図（第２−１図〜第２−３図）は本発明ｈ−ＨＧＦ
遺伝子の全ＤＮＡ塩基配列を示す図である。 第３図は実施例３に従いｐ　１ｎ　）（Ｇｐ　Ｂａｍ−
３ｃａと、ｐｈＨＧ　Ｆ　Ｐｓｔ−Ｈｉｎｄと、ｐｈ）
（Ｇ　Ｆ　Ｂｇｌ−Ｄｒａとから、ｐｈＨＧＦを作製す
る概略図である。 第４図は実施例３に従いリコンビナントｈ−ＨＧＦをモ
ノＳカラムを用いて精製した結果を示す溶出パターンで
ある。 第５図は実施例３に従いリコンビナントｈ−ＨＧＦをヘ
パリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムを用いて精製し
た結果を示す溶出パターンである。 第６図は実施例３に従い得られたりコンビナンドｈ−Ｈ
ＧＦのＤＮＡ合成活性を調べた図である。 （以　上） ←　− Ｉ−１Ｉ＋１ くｘ く− ＋　Ｑ く−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］（１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）が
   ９６０００〜８２０００の範囲にあり且つ 主に９２０００と８４０００とであり、 （２）メルカプトエタノール存在下での還元処理により
   下記サブユニットαとサブユニット β＿１又はβ＿２とに分離され、 （３）Ｐｈｅを基準（２２モル）とするアミノ酸組成が
   以下のものである Ａｓｐ１０６：Ｔｈｒ４８：Ｓｅｒ５１： Ｇｌｕ８７：Ｇｌｙ７６：Ａｌａ３１： Ｖａｌ３８：Ｍｅｔ１７：Ｉｌｅ４０： Ｌｅｕ５０：Ｔｙｒ３６：Ｐｈｅ２２： Ｌｙｓ５８：Ｈｉｓ２７：Ａｒｇ５２ ことを特徴とする肝再生因子。 サブユニットα： （１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）は約６２
   ０００である、 （２）少なくとも次のアミノ酸配列を有する、（ｉ）【
   遺伝子配列があります】 （ｉｉ）【遺伝子配列があります】 （ｉｉｉ）【遺伝子配列があります】 （ｉｖ）【遺伝子配列があります】 （ｖ）【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （ｖｉ）【遺伝子配列があります】 （３）Ｐｈｅを基準（１８モル）として次のアミノ酸組
   成を有する、 Ｃｍｃ３８．５：Ａｓｐ８７．５： Ｔｈｒ３７．１：Ｓｅｒ３２．７： Ｇｌｕ６０．８：Ｇｌｙ４３．０： Ａｌａ１４．９：Ｖａｌ１３．３： Ｍｅｔ１０．４：Ｉｌｅ２２．４： Ｌｅｕ２３．７：Ｔｙｒ２３．５： Ｐｈｅ１８．０：Ｌｙｓ４１．４： Ｈｉｓ２０．８：Ａｒｇ３６．８ サブユニットβ＿１： （１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）は約３４
   ０００である、 （２）Ｎ末端から２５個のアミノ酸配列は次の通りであ
   る、 【遺伝子配列があります】 （３）Ｐｈｅを基準（４モル）として次のアミノ酸組成
   を有する、 Ｃｍｃ１２．２：Ａｓｐ２８．７： Ｔｈｒ１２．３：Ｓｅｒ１９．４： Ｇｌｕ２８．１：Ｇｌｙ４１．１： Ａｌａ１５．３：Ｖａｌ２２．０： Ｍｅｔ３．２：Ｉｌｅ１５．７： Ｌｅｕ２６．１：Ｔｙｒ１４．６： Ｐｈｅ４．０：Ｌｙｓ１８．５： Ｈｉｓ９．２：Ａｒｇ１９．０ サブユニットβ＿２： （１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による）は約３２
   ０００である、 （２）Ｎ末端から２５個のアミノ酸配列は次の通りであ
   り、β＿１のそれと一致する、 【遺伝子配列があります】 （３）Ｐｈｅを基準（４モル）として次のアミノ酸組成
   を有する、 Ｃｍｃ１５．０：Ａｓｐ３２．４： Ｔｈｒ１３．０：Ｓｅｒ２１．０： ＧＩｕ３１．０：Ｇｌｙ４４．２： Ａｌａ１５．７：Ｖａｌ２４．１： Ｍｅｔ３．９：Ｉｌｅ１７．８： Ｌｅｕ２９．５：Ｔｙｒ１５．７： Ｐｈｅ４．０：Ｌｙｓ２１．６： Ｈｉｓ１０．３：Ａｒｇ２１．３ ［２］式 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 で表わされるヒト肝再生因子のＤＮＡ塩基配列。 ［３］式 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 で表わされるヒト肝再生因子のＤＮＡ塩基配列。 ［４］請求項［３］に記載のＤＮＡ塩基配列を含むこと
   を特徴とするヒト肝再生因子の発現用プラスミド。 ［５］請求項［４］に記載のプラスミドで形質転換され
   た形質転換体。 ［６］請求項［５］に記載の形質転換体を培養して、発
   現される肝再生因子を採取することを特徴とするリコン
   ビナント肝再生因子の製造方法。 ［７］式 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 で表わされるアミノ酸配列を有することを特徴とするリ
   コンビナント肝再生因子。