JPH03505784A - クロマトグラフィカラム及びこれを用いた分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 漣ＭＵＬＹ生辺ｊ」ゴ歪 本発明は、分子の大きさ、電荷、疎水性及びバイオ親和性のような普通のクロマ トグラフィの性質に基づくクロマトグラフィ分離、そしてまたこのような分離に 有用なりロマトグラフィ分離に関する。

発明の背景及び概要 従来のクロマトグラフィは、ビーズの床（ｂｅｄ）を通るサンプルの通過を含む 。しかし、完全に充填した床を達成することは、不可能であった。充填した床の 不均一性は、ゾーンの広がりを生じ、それは妨げるファクターとなる。充填した 床の他の不利な点は、ビーズの調製に必要な、時間のかかるしかも高価な工程、 所望の大きさを選ぶためのビーズの篩分け、及びビーズによるカラムの充填であ る。

これらの不利益は、単量体から形成された連続したしかも凝集性のゲル・プラグ （Ｈｅｌ　ｐｌｕｇ）の形のクロマトグラフィ分離媒体の使用により避けられる ことが分かり、該単量体は、重合すると溶離液の通過を許すのに十分なチャンネ ル（ｃｈａｎｎｅｌｓ）を有し、しかも分子篩、イオン交換、疎水性相互作用、 アフィニティ、ボロネート及びダイ・リガンドのクロマトグラフィのような分離 技術にそれを有用にする性質を有する構造を形成する。このようなチャンネルは 、例えば単量体が水中の制限された溶解性を有するものを含むとき形成できる。

これらの単量体が十分な量又は割合で用いられるとき、得られた重合体は、それ らを溶液の外に沈殿させるのに十分な疎水性を有する。この沈殿の結果、重合体 鎖は、束（ｂｕｎｄｌｅｓ）で互いに付着しがちになり、前記の空所（ｖｏｉｄ ｓ）又はチャンネルは束の間に形成される。

この記述に合致する単量体の一つの例は、Ｎ、Ｎ’　　−メチレンビスアクリル アミドであり、本発明における好ましい重合体は、ポリ尿素類、特にポリアクリ ルアミド類である。

ゲル・プラグの均一性の高い構造は、溶離液を非常に狭いゾーンに分離し、プラ グは、単に単量体溶液を囲い（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）に満たすだけで、クロマト グラフィ分離が生ずべき毛管、カラム又は他の囲いで直接、容易にしかも再生可 能に調製される。

発明のその他の特長及び利点は、下記の記述から明らかになるだろう。

発明の詳細な説明及び好ましい態様 ここで記載される連続したしかもチャンネル浸透の構造は、その他の方法では透 明なポリアクリルアミド・ゲルを不透明（ｏｐａｌｅｓｃｅｎｔ）にし、即ちそ れをより水に溶は難くするのに十分な程度の橋かけ結合から生ずるものである。

この橋かけ結合の程度は又、水及びサンプル成分の分子の通過を行わせるのに十 分なほど大きい割れ目（ｃｒａｃｋｓ）又はチャンネルを重合体の組織に形成す るのに十分なように重合体の鎖を互いに密に引き寄せるものであろう。割れ目に 隣接する連続的構造は、多孔性でも又は非多孔性でもよい。

一般に、これらのチャンネルの形成は、少なくとも約０゜４５、好ましくは少な くとも約０．５５、そして最も好ましくは少なくとも約０．７０の橋かけ剤対線 状形成単量体のモル比を用いることにより達成されるだろう。

重合体を形成するのに用いられる単量体は、プラグが用いられようとするクロマ トグラフィのタイプに応じて選ばれよう。クロマトグラフィの任意の特別なタイ プに適切な単量体の分子構造及び単量体の官能基の選択は、当業者に容易に明ら かであろう。従って、人々は、例えば本発明内で分子篩クロマトグラフィ、イオ ン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロ マトグラフィ、ボロネートクロマトグラフィ及びグイ・リガンドクロマトグラフ ィに適したプラグをデザインできる。

好ましい線状形成単量体は、アクリルアミド類及びアクリル酸の他の誘導体であ る。アクリルアミドそれ自体は、特に好ましい線状形成単量体であり、それは、 単独で又は他の構造的に関連のあるもの例えばアクリル酸のメチルエステルとの 組み合わせで用いることができる。好ましい橋かけ剤は、前述の通り、Ｎ、Ｎ’ 　−メチレンビスアクリルアミドであり、そして線状形成単量体がアクリルアミ ドである系では、前記のモル比は、５０％又はそれ以上、５５％又はそれ以上、 そして６０％又はそれ以上のＣ値（橋かけ剤及び線状形成単量体の合計に対する 橋かけ剤の重量％）に相当する。

重合体がポリアクリルアミドである発明の好ましい態様では、アクリルアミド単 量体とともに用いられる当業者に周知の任意の広範囲の橋かけ剤が、用いられる 。このような剤の中に、ビスアクリルアミド類、ジアクリレート類並びに広範囲 の末端ジエン類が含まれる。特定の例は、ジヒドロキシエチレンビスアクリルア ミド、ジアリルタルタルジアミド、トリアリルシトリツクトリアミド、エチレン ジアクリレート、ビスアクリリルシスタミン及びＮ、Ｎ”　−メチレンビスアク リルアミドである。

プラグは、当業者に周知の従来の技術による重合により形成される。プラグは、 例えば、プラグが用いられようとするケーシング又はカラム管中で直接、単量体 及び橋かけ剤及び重合触媒及び他の従来の添加物の水溶液から形成できる。この ような場合、プラグをカラムの内壁に共有的に結合させることが有利であろう。

これは、従来の技術に従って、結合剤例えばバインド・シラン（Ｂｉｎｄ　５ｉ ｌａｎｅ）により達成できよう。重合体成分が溶液の約１重量％〜約２０重量％ を構成する水溶液が好ましい。この範囲内で、約２％〜約１０％の濃度がさらに 好ましく、そして約２．５％〜約５％の濃度が最も好ましい。

サンプルのその成分への分離は、従来の技術に従って同様に達成される。水又は 好ましくは約７．０〜約８．５のｐ　Ｈの緩衝溶液が、プラグを通るサンプルの ための担体として好適に働き、そして流れはポンプ処理又は重力流により達成で きる。次に、分離したサンプル成分の検出は、もし必要ならば染色法（ｓｔａｉ ｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ）を用いるカラムそれ自体で、又はカラムからの個々 の成分の溶離液としてのプラグの下流部分又はカラムの外側で、従来の手段によ り達成される。このタイプの分離媒体は、約１０００〜約１．Ｏｏ　ｏ、ｏ　ｏ 　ｏに及ぶ分子量を有するものの分離に特に有効である。

下記の実施例は、説明の目的のみに提供され、そして決して発明を制限したり又 は規定することを目的とするものではない。

実施例 ガラスウールのプラグを、ピペットの収縮した部分の頂部でパスツールピペット に置いた。ホースクランプを備えたある長さのプラスチック管をピペットの先端 に取り付けた。

０．０１Ｍ）リス−ＨＣｆ及び１０％（重量／容量）シュクロースを含むｐ　Ｈ ７，５の緩衝溶液を、ピペットに注いだ。

次に、ホースクランプを開いた。緩衝液のレベル（ｂｕｆｆｅｒｌｅｖｅｌ）が ガラスウールに達したとき、ホースクランプを閉じて緩衝液の流れを停止させた 。

次に、脱気した混合物をピペットに注ぎそして重合させた。上記混合物は、１　 ｒｔｔｌのアクリルアミド及びＮ、Ｎ”　−メチレンビスアクリルアミドの水溶 液（下記の濃度及び割合）、６μｌのベルオクソニ硫酸アンモニウムの１０％（ 重量／容量）溶液及び１μ２のテトラメチルエチレンジアミンよりなった。

一度溶液が重合すると、それは、ガラスウール上のピペットの幅に及ぶ水不溶性 の連続した構造を形成した。次に、下記の成分よりなるサンプルを、重合体構造 の頂部に適用した。

フ　　ィ　　コ　　エ　　リ　　ト　　リ　　ン　　−〜−分子量　２９０，０ ００フ　　ィ　　コ　　シ　　ア　　ニ　　ン　　−・　分子１　１　３　５， ０　０　０チ　　ト　　り　　ロ　　−　　ム　　−・−分子量　　　１３，０ ００ブロムフエノールブルー　　−−−分子ｔ　　　　ｉ、ｏｏ。

Ｏ，０１Ｍトリス−ＨＣｆよりなるｐ　Ｈ７，５の緩衝溶液をサンプルの上に重 ね、そしてサンプル及び緩衝溶液を重力流によりピペットを通して流れさせた。

種々のポリアクリルアミド組成及び緩衝溶液の流速を、下記の表に示したように 用いた。この表では、記号Ｔは、形成する溶液中で組み合わされたアクリルアミ ド及びＮ、Ｎ”−メチレンビスアクリルアミドの濃度（重量％）を示し、記号Ｃ は、アクリルアミド及びＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミドの組合せに対 するＮ、Ｎ”　−メチレンビスアクリルアミドの重量％で表された割合を示し、 最後の欄は、各Ｃ値に対する互いに相対的な値の流速を表す。Ｔ＝４、Ｃ＝６０ について与えられた流速は、全溶離に関し約４〜５時間に等しい。直接の比較は 、単一のＴ値により種々のＣ値の流速の中で行うことができる。

正の重力流が検出可能な例では、前記の４種の成分が増大する分子量の順序で別 々のバンドに分離でき、最大の分子量の成分（フイコエリトリン）は、カラムを 通る最大の移動度を示した。

前述は、主として説明の目的で提供されている。系の材料、方法及び他のパラメ ータの点の変更及び置換は、発明の趣旨及び範囲から外れることなく導入できる ことは、当業者により容易に明らかであろう。

国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．クロマトグラフィカラムの断面領域に及ぶ水不溶性プラグよりなる分離媒体 を含み、該プラグが、高分子溶離物（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｌｕｅ ｎｔｓ）を浸透しうるチャンネルを形成するのに、十分な程度の橋かけを有し且 つ十分に疎水性である橋かけした重合体よりなる、クロマトグラフィカラム。
2. ２．前記の橋かけした重合体が、線状形成単量体及び橋かけ剤の混合物から形成 され、線状形成単量体及び橋かけ剤の合計に対する橋かけ剤のモル比が、少なく とも約０．４５である請求項１記載のクロマトグラフィカラム。
3. ３．前記の橋かけした重合体が、アクリルアミドを含む線状形成単量体及びビス アクリルアミドである橋かけ剤の混合物から形成される請求項１記載のクロマト グラフィカラム。
4. ４．前記の橋かけした重合体が、アクリルアミドを含む線状形成単量体及びＮ， Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドである橋かけ剤の混合物から形成され、該Ｎ ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドが、該アクリルアミド及び該Ｎ，Ｎ′−メ チレンビスアクリルアミドの合計の少なくとも約５０重量％を構成する請求項１ 記載のクロマトグラフィカラム。
5. ５．液体サンプル中の高分子物の混合物を分子の大きさに基づいて成分に分離す る方法において、クロマトグラフィカラムの断面領域に及ぶ水不溶性プラグより なる分離媒体を含むクロマトグラフィカラムに該サンプルを通して、該成分を該 プラグ内で実質的に別々のバンドに分離させ、該プラグが、高分子溶離物を浸透 しうるチャンネルを形成するのに、十分な程度の橋かけを有し且つ十分に疎水性 である橋かけした重合体よりなる方法。
6. ６．前記の橘かけした重合体が、線状形成単量体及び橋かけ剤の混合物から形成 され、線状形成単量体及び橋かけ剤の合計に対する橋かけ剤のモル比が、少なく とも約０．４５であり、そして前記のプラグが、水により飽和されたとき、該プ ラグ及び該水を合わせた重量の約１％〜約２０％を構成する請求項５記載の方法 。
7. ７．前記の橋かけした重合体が、アクリルアミドを含む線状形成単量体及びＮ， Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドである橋かけ剤の混合物から形成される請求 項５記載の方法。
8. ８．前記のプラグが、約７．０〜約８．５のｐＨで緩衝溶液により飽和され、そ して該プラグが、該プラグ及び該水を合わせた重量の約２．５％〜約５％を構成 する請求項５記載の方法。
9. ９．前記のプラグを通るサンプルの前記の通過が、重力流により達成される請求 項５記載の方法。
10. １０．液体サンプル中の高分子物の混合物を分子の大きさに基づいて成分に分離 する方法において、アクリルアミド及びＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド の混合物から形成された橋かけされたポリアクリルアミドの水不溶性の流体浸透 性プラグから構成されたクロマトグラフィカラムに該サンプルを通し、該Ｎ，Ｎ ′−メチレンビスアクリルアミドが、該アクリルアミド及び該Ｎ，Ｎ′−メチレ ンビスアクリルアミドの合計の少なくとも約５５重量％を構成し、さらに該プラ グが、水により飽和されたとき、該プラグ及び該水を合わせた重量の約２．５％ 〜約５％を構成する方法。