JPH11178577A - ノルコクラウリン６−ｏ−メチルトランスフェラーゼおよび該酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 コクラウリンまたはレティキュリン由来の植
物二次代謝産物の効率的な生産を可能にする。 【解決手段】 配列番号１に記載のアミノ酸配列または
該アミノ酸配列においてノルコクラウリン6-O-メチルト
ランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチド、前
記ポリペプチドをコードするDNA、配列番号２に記載の
ヌクレオチド配列を含むDNA；配列番号２に記載のヌク
レオチド配列を含むDNAとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし、かつノルコクラウリン6-O-メチルト
ランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドをコ
ードするDNA、前記のDNAを含むベクターで形質転換され
た微生物を用いて、ノルコクラウリン6-O-メチルトラン
スフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造す
る方法、前記のベクターで形質転換された植物の培養細
胞及び／又は組織を用いて植物二次代謝産物を製造する
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コクラウリンの生
合成酵素であるノルコクラウリン6-O-メチルトランスフ
ェラーゼ（以下「6-OMT 」と略記する）、該酵素をコー
ドするDNAおよび該DNAで形質転換された微生物および植
物、ならびに該植物またはその培養細胞および／または
組織を用いて、コクラウリン、レティキュリンおよび／
またはこれらの化合物から生合成される各種アルカロイ
ドを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ベルベリンは、イソキノリンアルカロイ
ドに分類される植物二次代謝産物の一種で、キンポウゲ
科のセリバオウレン（Coptis japonica Makino var. Di
ssecta(Yatabe) Nakai)やアキカラマツ（Thalictrum mi
nus var. hypolencum）、ミカン科のキハダ（Phelloden
dron amurense Rupr) 、メギ科のセイヨウメギ（Berber
is wilsoniae）などによって産生され、局方医薬品とし
て使用されている。現在のところ、ベルベリンは前記植
物種を始めとするベルベリン含有植物天然品からの抽出
によって製造されており、また当該植物の培養細胞を用
いた工業的な製造法が研究されている [K. Matsubara e
t al., J. Chem. Tech. Biotechnol. 46, 61-69 (198
9)] 。

【０００３】ベルベリンは、その生合成経路が酵素レベ
ルで解明された最初のアルカロイドであり、チロシン２
分子を前駆体として(S)-ノルコクラウリンを経由して13
段階の酵素反応により生合成される（図１）。図１に示
されるように、チロシンを前駆体として13段階の酵素反
応によりベルベリンが生合成される。これら各段階の反
応を触媒する酵素はそれぞれ同定されており、その酵素
化学的性質について精力的に研究が進められている [H.
M. Schumacher et al., Plant Med. 48, 212-220 (198
3); M. Ruffer et al., Plant Med. 49, 131-137 (198
3); F. Sato etal., Phytochemistry 32, 659-664 (199
3); N. Okada et al, Phytochemistry 27, 979-982 (19
93)]。

【０００４】ベルベリン生合成の最初のメチル化反応を
触媒する6-OMTは、S-アデノシル-L-メチオニン（以下
「SAM」と略記する）をメチル基供与体としてノルコク
ラウリンの6-位の水酸基をメチル化し、コクラウリンを
生成する酵素である。本酵素の酵素学的諸性質も既に調
べられており [F. Sato et al., Eur. J. Biochem. 22
5, 125-131 (1994)]、類似反応を触媒する既報の酵素、
(S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチル
トランスフェラーゼ（以下「4'-OMT」と略記する） [T.
Frenzel and M. H. Zenk, Phytochemistry 29, 3505-3
511 (1990)]や(S)-スコーレリン9-O-メチルトランスフ
ェラーゼ（以下「SMT」と略記する） [F. Sato et al.,
Phytochemistry 32, 659-664 (1993)]とその性質を比
較しても、基質特異性に関して大きな差が認められ（図
２）、極めてユニークな性質を持つことが明らかにされ
ている。しかし、6-OMTのアミノ酸配列ならびにそのア
ミノ酸配列をコードするDNAに関しては、それを解明し
ようとする研究はこれまでのところ全くなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、6-OMT をコ
ードするDNAを微生物または植物細胞にセンスまたはア
ンチセンスの形で組み込むことにより、 工業用酵素として利用できる6-OMTを効率よく生産す
る 宿主細胞の代謝を改変して特定の化合物を効率よく生
産する 宿主細胞の代謝を改変して特定の化合物群の生成比を
改変することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、オウレンの培養細胞から単離した6-OMTの内部
アミノ酸配列結果を基にDNAプローブを作成し、このプ
ローブを用いてオウレン培養細胞由来のcDNAライブラリ
ーから目的DNAを単離することに成功した。次にこのDNA
をベクターに組み込んだ後大腸菌に導入し、当該DNAに
由来する蛋白質を大量に発現させた。この蛋白質の酵素
学的性質を調べたところ、オウレン培養細胞から単離し
た6-OMTと同一の反応、すなわちノルコクラウリンから
のコクラウリンの生成が認められ、当該DNAが6-OMTをコ
ードする遺伝子であることを確認した。

【０００７】すなわち、本発明は、配列番号１に記載の
アミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは
２以上のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミ
ノ酸配列を含み、かつノルコクラウリン6-O-メチルトラ
ンスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを提供
する。このポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ
酸配列を含むノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェ
ラーゼであってもよい。また、本発明は、前記のポリペ
プチドをコードするDNAを提供する。このDNAは、配列番
号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するとよい。また、本発明は、配列番号２に記載のヌク
レオチド配列を含むDNA、ならびに配列番号２に記載の
ヌクレオチド配列を含むDNAとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつノルコクラウリン6-O-メチ
ルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチド
をコードするDNAを提供する。さらに、本発明は、前記
のDNAを含むベクターを提供する。このベクターは、微
生物および／または植物の細胞内で、ノルコクラウリン
6-O-メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリ
ペプチドを発現させることができるものであるとよい。
さらにまた、本発明は、前記のベクターで形質転換され
た微生物、および該形質転換微生物を用いて、ノルコク
ラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有
するポリペプチドを製造する方法を提供する。また、本
発明は、前記のベクターで形質転換された植物細胞、植
物組織または植物、ならびに該形質転換植物、または該
植物の培養細胞および／または組織を用いて、植物二次
代謝産物を製造する方法を提供する。この植物二次代謝
産物は、コクラウリンまたはレティキュリンから生合成
されるアルカロイドであってもよい。このアルカロイド
はベルベリン型アルカロイド、モルフィン型アルカロイ
ドまたはパパベリン型アルカロイドであるとよい。ま
た、形質転換植物はオウレン属植物またはケシ属植物で
あるとよい。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明者
らは、ベルベリン高生産性のセリバオウレン培養細胞か
ら、6-OMTの酵素活性（ノルラウダノソリンとS-アデノ
シルメチオニンからの6-O-メチルラウダノソリンの生
成）を指標に6-OMTを単離精製し、このポリペプチドの
内部アミノ酸の配列をもとにDNAプローブ作成した。次
いで、同じくセリバオウレン培養細胞からcDNAライブラ
リーを調製し、当該プローブで陽性となるプラークか
ら、6-OMTをコードするDNA全長を含むファージを取得し
た。ファージDNAから単離した目的DNAを大腸菌にサブク
ローニングした後発現させたところ、得られたポリペプ
チドが前記の6-OMTの酵素活性を示したことから、当該
ポリペプチドおよび当該DNAが、それぞれ目的とする6-O
MTおよび6-OMTをコードするDNAであることを確認した。

【０００９】本発明者らは、ベルベリン型アルカロイド
産生植物の一つである、オウレンの培養細胞から6-OMT
ならびにその遺伝子を単離したが、SAMをメチル基供与
体としてノルコクラウリンをコクラウリンに変換する反
応を有する植物であれば、本発明の6-OMTと実質的に同
一の酵素およびDNAが含まれていると推測され、本明細
書に記載の方法を用いればそれら植物からでも、本発明
の6-OMTと実質的に同一の酵素およびDNAを単離すること
ができる。SAMをメチル基供与体としてノルコクラウリ
ンをコクラウリンに変換する反応を有する植物として
は、セリバオウレンなどのキンポウゲ科Coptis属植物、
アキカラマツなどのキンポウゲ科Thalictrum属植物、キ
ハダなどのミカン科Phellodendron 属植物、セイヨウメ
ギなどのメギ科Berberis属植物、ケシなどのケシ科Papa
ver属植物などを例示することができる。

【００１０】本発明においてオウレンの培養細胞から単
離された6-OMTは、配列番号１に示したアミノ酸配列を
有しているが、本発明にかかる6-OMTは、それ自身が実
質的にオウレン細胞由来の6-OMTと同等の機能を有する
限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もし
くは２以上のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されて
いてもよい。なお、タンパク質の酵素機能などの生理活
性がその構成アミノ酸の１もしくは２以上のアミノ酸の
付加、欠失もしくは置換によっても変わらないことがあ
り得ることはよく知られており、また意図的にそのよう
なアミノ酸の変化を誘起する方法も報告されている[Nuc
leic Acids Res., 10, 6487-6500 (1982)]。

【００１１】また、塩基配列に関しても、実質的にオウ
レン細胞由来の6-OMTと同等の機能を有する酵素タンパ
ク質をコードする限り、配列番号２に記載の塩基配列に
おいて１もしくは２以上の塩基が付加、欠失もしくは置
換されていてもよい。この種の実質的にオウレン細胞由
来の6-OMTと同等の機能を有する酵素タンパク質をコー
ドするDNAとしては、配列番号２に記載ヌクレオチド配
列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、6-OMTの酵素活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNAを挙げることができる。ここで、ハイブリダ
イズの方法としては、従来から知られているDenhart's
溶液を用いる方法[J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Ma
niatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd
ed. ColdSpring Harbor Laboratory]を例示することが
できる。具体的には、６×SSC、５×Denhardt's、0.1%
SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、20mM NaH₂PO₄(PH
7.5)溶液中で42℃で２時間以上プレハイブリダイゼーシ
ョンをおこなったのち、³²PラベルしたDNAプローブ液を
加え、更に一晩インキュベートし、その後、室温で６×
SSC溶液、次いで50℃で６×SSC、0.1% SDS溶液で洗浄
後、オートラジオグラフィーする、という条件を例示す
ることができる。

【００１２】本発明で使用できるベクターとしては、従
来から微生物および／または植物細胞の形質転換に使用
されているベクターを例示することができ、前記の各条
件を満たす6-OMTをコードするDNAの他に、従来から知ら
れている当該DNAを発現させるための恒常発現型または
発現制御型のプロモーター、形質転換体の選抜を容易に
する薬剤耐性遺伝子、アグロバクテリウムのバイナリー
ベクター系を使用するための複製開始点などを包括する
ことができる。

【００１３】基本的なベクターとしては、大腸菌などの
微生物への導入にはpBluescript IISK-ベクターやpETベ
クターなどを例示でき、植物細胞への導入にはアグロバ
クテリウムによる導入に適したものとしてpBI101やpBI1
21などを例示することができる。エレクトロポーレーシ
ョン法を用いて植物細胞への導入を図る場合には、ベク
ターに特に制限はない。また、薬剤耐性遺伝子DNAとし
てはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝
子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを例示でき、プロ
モーターとしてはカリフラワーモザイクウイルス由来の
35Sプロモーター（恒常発現型）や熱ショック誘導タン
パク質のプロモーター（発現制御型）を例示することが
できる。複製開始点としては、TiまたはRiプラスミド由
来の複製開始点などを例示することができる。

【００１４】本発明の6-OMTをコードするDNAを微生物に
導入して、6-OMT蛋白質を大量に発現させることができ
る。6-OMTをコードするDNAを導入する微生物としては、
大腸菌などの細菌およびバキュウロウイルスなどのウイ
ルスを例示することができる。最も一般的な宿主である
大腸菌への外来DNAの導入方法としては、塩化カルシウ
ム法などで調製したコンピテントセルに、熱ショック法
やエレクトロポーレーション法などを用いて、当該外来
DNAを組み込んだプラスミドを取り込ませる方法があげ
られる。また、対象が大腸菌以外の宿主であっても、上
記と原理的に同様のDNA導入方法を使用することができ
る。

【００１５】このようにして形質転換された微生物は、
従来知られている方法によって増殖させることが可能で
あり、得られた菌体などから目的とする6-OMTのポリペ
プチドを抽出、分離することができる。また、培養中の
当該形質転換微生物に、特定の基質を添加し、O-メチル
化反応を行わせ、培養物から酵素反応生成物を回収する
ことも可能である。

【００１６】また、宿主細胞の代謝を改変して特定化合
物の生産性向上や特定の化合物群の生成比の改変を図る
ことを目的に、本発明の6-OMTをコードするDNAをセンス
またはアンチセンスの形で植物に組み込むことができ
る。6-OMTをコードするDNAを組み込む植物としては、SA
Mをメチル基供与体としてノルコクラウリンをコクラウ
リンに変換する反応を有する植物であればすべて使用で
きるが、中でもセリバオウレンなどのキンポウゲ科Copt
is属植物、アキカラマツなどのキンポウゲ科Thalictrum
属植物、キハダなどのミカン科Phellodendron 属植物、
セイヨウメギなどのメギ科Berberis属植物、ケシなどの
ケシ科Papaver属植物などを例示することができる。

【００１７】当該DNAを植物細胞に導入する方法として
は、前記の構成要素からなるベクターに当該DNAを組み
込み、アグロバクテリウム法やエレクトロポーレーショ
ン法など従来から知られている方法があげられる。アグ
ロバクテリウム法では、形質転換しようとする植物か
ら、減菌した葉などの切片を作成し、これにバイナリー
形式で当該DNAを導入したアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスを感
染させる、植物細胞に当該DNAを組み込ませることがで
きる。この後、植物切片に付着したアグロバクテリウム
を洗浄および殺菌し、当該DNAとともにベクターに組み
込んでおいた薬剤耐性マーカーに対応した抗生物質を含
む培地で、前記植物切片を培養し、形質転換が起こった
細胞から、選択的に腫瘍組織、根、シュートなどの形質
転換組織の増殖を図ることができる。

【００１８】また、エレクトロポーレーション法では、
形質転換しようとする植物から、減菌した葉、茎、根や
胚、または培養細胞を調製し、これらに当該DNAを組み
込んだベクターを塗布した金粒子など適当な微粒子をパ
ーティクルガンなどを用いて打ち込み、細胞に取り込ま
せることができる。この後、前記アグロバクテリウム法
の場合と同様に、ベクターに組み込んでおいた薬剤耐性
マーカーに対応した抗生物質を含む培地で、前記植物切
片を培養し、形質転換が起こった細胞から、選択的に形
質転換組織または細胞の増殖を図ることができる。

【００１９】このようにして得られた形質転換植物組織
からは、これまでに知られている植物組織培養法によっ
て、植物個体を再生することができるので、圃場などで
栽培することができる。また形質転換植物細胞は、通常
の植物培養細胞と同様、液体培地などで増殖させること
ができるので、タンクなどで大量培養することができ
る。得られた形質転換植物体または細胞は、通常の植物
体または細胞と同様に、有機溶媒などによる有効成分の
抽出に供することができる。

【００２０】さらに、本発明の6-OMTは、図２に示した
ようにノルコクラウリンの他にもノルラウダノソリンや
6-O-メチルラウダノソリンといった構造類似化合物をも
メチル化することができるので、前記の植物種以外であ
ってもこれらノルコクラウリンの構造類似化合物を含む
植物であれば、本発明の方法を適用することができる。
なお、酵素学的な検討の結果、本発明にかかる6-OMTは
以下の基本的性質を有することが明らかになっている。

【００２１】 ─────────────────────────────────── 分子量：40,000（SDS/PAGE） 等電点：4.7（Mono-P） 至適pH：9.0 K_m値： 3.95 mM（S-アデノシル-L-メチオニン） 2.23 mM（(R,S)-ノルラウダノソリン） K_i値： 2.1 mM（S-アデノシル-L-メチオニン） 0.18 mM（(R,S)-ノルラウダノソリン） （K_i値はともにS-アデノシル-L-ホモシステインに対して） 阻害剤：Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺ 反応機構：Bi-bi Ping-Pong反応 ───────────────────────────────────

【００２２】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 ［実施例１］6-OMT精製画分の調製 まず、セリバオウレンからベルベリン高産生培養細胞を
以下のようにして誘導した。

【００２３】セリバオウレンの葉および葉柄を、70%エ
タノールおよびアンチホルミン溶液で殺菌した後、切片
を作成し、10^-5Mαナフタレン酢酸および10^-8M6-ベンジ
ルアデニンを含むリンスマイヤー・スクーグの寒天培地
に床置し、25℃、暗所で培養した。培養開始後３週間目
頃から、当該切片の切り口に生じた黄色カルスを採取し
て、前記と同様の寒天培地に移植しさらに増殖を図っ
た。こうして得られたカルスを前記と同様の組成の液体
培地に懸濁し、前記と同じく25℃、暗所で、旋回型のロ
ータリーシェーカーを用いて100rpmで振盪培養し、２〜
３週間毎に移植を繰り返した。

【００２４】得られた液体培養細胞は、直径が数十μm
〜数mmの細胞塊からなるので、これら細胞塊を単位とし
て、ベルベリン高生産株の選抜を実施した。すなわち、
細胞塊の一部を前記の寒天培地上に均一に広げて培養
し、各細胞塊からコロニーを増殖させた。得られたコロ
ニーを同じ寒天培地に個別に増殖させ、その一方で液体
クロマトグラフィーを用いてベルベリンの含有量を測定
し、含有量の高いものを高生産細胞として選抜し、この
系統をあらたな親株として液体培養、次いで前記操作に
よる選抜を繰り返し、高生産株を得た。

【００２５】このベルベリン高産生培養細胞を10μMの
α- ナフタレン酢酸と0.01μMの6-ベンジルアデニンを
含むリンスマイヤー・スクーグの液体培地で3週間ごと
に継代培養し、佐藤らの方法 [Eur. J. Biochem. 225,
125-131 (1994)]にしたがって、6-OMTの単離精製を実施
した。簡単に説明すると、オウレン培養細胞を氷冷下で
摩砕し、10mMジチオスレイトール、１mM EDTA および10
%グリセロールを含む0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液(pH
8.0)に懸濁して、酵素を抽出した。懸濁物をチーズク
ロスで濾過し、濾液を5000×gで30分間遠心分離した。
得られた上清は、20-75%飽和の硫安沈殿、透析による脱
塩、SP-toyopearl 650C カラムによるアルカロイドの除
去、酵素活性を指標としたQ-Sepharose FF カラムクロ
マトグラフィー(Pharmacia社) 、次いでBio-Gel HTP(Bi
oRad社) カラムクロマトグラフィーによる分離、限外濾
過による濃縮、Mono-P カラムによるクロマトフォーカ
シング、逆相クロマトグラフィーを経て精製・単離し
た。なお、以上の操作はすべて０〜５℃で実施した。

【００２６】図３に酵素精製過程での純度向上の様子を
SDS-PAGEの結果で示した。こうして得られた6-OMTの精
製酵素標品は、図３のSDS-PAGEの結果にも示されるとお
り、40 kDaと41 kDaの２本のペプチドを含んでいた。両
ペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列解析を試みたが、
ブロックされていたため優位な情報を得ることができな
かった。そこで、両ペプチドの内部アミノ酸配列の解析
を目的に、以下の条件の下、Mono-P後の精製酵素液をサ
ンプルとして逆相クロマトグラフィーにより両ペプチド
をそれぞれ精製した。

【００２７】 ─────────────────────────────── HPLC ：LKB2150（LKB社） カラム ：YMC-Pack ODS-AP303（250x4.6 mm、YMC社） 検出 ：UV 210 nm 流速 ：0.8 ml/min 移動相 ：A: 0.1% TFA in H₂O, B: 70% AcCN, 0.1% TFA A/B 32/68 → 29/71 ───────────────────────────────

【００２８】分取した各フラクションは、図４に示した
とおりSDS/PAGEで確認した。その結果、40 kDaならびに
41 kDaのペプチドは、ともにさらに２本のピークに分離
した。それぞれのピークのペプチドの分子量をSDS-PAGE
で再確認した結果、40Aおよび40Bで示したピークのペプ
チド分子量はいずれも40 kDaであり、41Aおよび41Bで示
したペプチド分子量はいずれも41 kDaであることがわか
った。40 kDaペプチドをAchromobacter Protease I処理
したときのペプチドマップと得られた内部アミノ酸配列
を図５に示す。図５の１のピークのアミノ酸配列は解析
できなかったが、２と３のピークのアミノ酸配列は40A
と40Bで一致していることがわかった。

【００２９】［実施例２］6-OMT精製画分の40 kDaペプチドと41 kDaペプチドのペ
プチドマッピングおよび内部アミノ酸配列の解析 前記の逆相クロマトグラフィーで分取したペプチド溶液
をSpeed Vacにより固化した後、100 μl の10% SDS溶液
を加え、超音波処理を行いペプチドを溶解させた。SDS
濃度が0.1%以下になるように希釈した後、centricon 30
（Amicon社）により約50μlにまで濃縮した。その内の5
μl をSDS-PAGEによるペプチドの回収の確認に用い
た。残りの液のpHが中性付近であることを確認し、プロ
テアーゼ溶液（Residue-specific Protease Kit、Takar
a社）100 μl を添加し、37℃で16時間反応させた。80%
の蟻酸5 μlを加え反応を停止し、15,000 rpmで5分間遠
心分離し、上澄を逆相クロマトグラフィーにより分離し
た。41Aならびに41Bの２本のペプチドについては、それ
ぞれ約30μgのサンプルをリジン残基を特異的に認識切
断するAchromobacter Protease Iにより加水分解した。
また40 kDaペプチドはグルタミン酸残基を特異的に認識
切断するStaphylococcus aureus V8 Protease、アルギ
ニンまたはリジン残基を特異的に認識切断するTrypsin
を用いてそれぞれにつき約50μgのペプチドを加水分解
した。逆相クロマトグラフィーの溶出条件は6-OMT精製
画分の２本のペプチドの精製に準じ、直線濃度勾配（A/
B 80/20→ 20/80）で溶出した。分離が不十分な断片に
ついては、再度逆相クロマトグラフィーにより先の条件
より緩やかな直線濃度勾配（A/B 85/15 → 50/50）で分
離した。ここで得られたペプチド溶液をSpeed Vacによ
り約100 μl に濃縮し、気相式プロテインシークエンサ
ー（Model 477A、Applied Biosystems社）によりアミノ
酸配列を解析した。

【００３０】40Aと40B、ならびに41Aと41Bは、それぞれ
逆相クロマトグラフィーのプロファイルが酷似してお
り、対応するペプチド断片のアミノ酸配列が一致したこ
とから、40Aと40B、ならびに41Aと41Bはそれぞれ同一の
ペプチドであって、逆相クロマトグラフィー中にたまた
ま分離したものであることがわかった（図６、図７）。
このようにして得られたペプチド断片の中から、最終的
に41 kDaペプチドについては約100アミノ酸の配列を、4
0 kDaペプチドについては、約80アミノ酸の配列を解析
した。

【００３１】［実施例３］6-OMTのcDNAクローニングのためのオリゴヌクレオチド 以降の操作は、特に表記しない限りSambrookの方法 [J.
Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory
Manual 2nd ed., ed. Cold Spring Harbar laboratory]
に従った。内部アミノ酸配列の解析結果は、6-OMTおよ
び4'-OMT精製画分に含まれる２本のペプチドをスクリー
ニングするためのオリゴヌクレオチドプローブ作成に十
分なものであったので、前記オウレン培養細胞から作製
したcDNAライブラリーを用いて、40 kDaならびに41 kDa
ペプチドのcDNAのスクリーニングを実施した。このcDNA
ライブラリーは、ZAP-cDNA（登録商標）Synthesis Kit
（Stratagene社）を用いて作製されており、cDNAはUni-
ZAP XR vectorに導入されている。また、Uni-ZAP XR ve
ctorはpBluescript II SK-の全塩基配列を含み、その前
後に複製開始点および終了のシグナルが組み込まれてい
る。さらに、複製されたDNAを環状化してpackagingする
ためのシグナルも存在するため、大腸菌にUni-ZAP XR v
ectorとf1 phageとを同時に感染させることにより、フ
ァージベクターからプラスミドベクターにサブクローニ
ングできるようになっている。アミノ酸配列の解析結果
をもとに、アミノ酸配列をコードする可能な配列すべて
を含むようにオリゴヌクレオチドプローブを設計し、40
kDaペプチド、41 kDaペプチド両ペプチドそれぞれにつ
き２種類のプローブをDNA合成機（Model 381A、Applied
Biosystems社）により合成した（図８）。

【００３２】［実施例４］オリゴヌクレオチドプローブの5'末端標識 以下に示す反応液を作製し、37℃で１時間インキュベー
トし、ペーパークロマトグラフィー（濾紙：DE81 (What
mann社)、展開液：2.3%蟻酸アンモニウム）により³²Pの
取り込み率が50%以上であることを確認した後、ハイブ
リダイゼーションに用いた。

【００３３】 ──────────────────────────────── 合成オリゴヌクレオチド（10 pmol/(l） 1 μl 10x キナーゼバッファー^* 1 μl [γ-³²P] ATP水溶液 5 μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ（10単位/μl、NEB 社） 1 μl * 700 mM Tris/HCl (pH 7.6)、10 mM MgCl₂、5 mM DTT ────────────────────────────────

【００３４】［実施例５］6-OMTのスクリーニング 前記のオウレン培養細胞のcDNAライブラリー（ライブラ
リーサイズ：30万）を一度アンプリファイしたものを用
いて一次スクリーニングを行った。プローブには40 kDa
ペプチドプローブ１、41 kDaペプチドプローブ１を三次
スクリーニングまで用いた。NZYMトップアガロースの表
面にニトロセルロースフィルターを乗せ青インクを先に
つけたニードルでフィルター上の非対称の位置3ヶ所を
打ち抜き、変性液（0.5 N NaOH、1.5 M NaCl）で浸した
濾紙上にDNAを転写させた面が上になるように乗せ5分間
放置した。次に中和液（1.5 M NaCl、0.5 M Tris/HCl
(pH 8.0)）で浸した濾紙上に移した後、80℃のオーブン
中で２時間ベーキングしDNAをフィルター上に固定し
た。このフィルターをハイブリバッグに入れ、プレハイ
ブリ溶液（6xSSC、5xDenhardts、0.1% SDS、100 μg/ml
変性サケ精子DNA、20 mM NaH₂PO₄(pH 7.5)）を加え、
できるだけ気泡を除き密封した。42℃で２時間以上イン
キュベートした後、プローブ溶液を加えさらに一夜イン
キュベートし、ハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション終了後、フィルターは、まず室温で
6xSSC溶液で２回、次に50℃で6xSSC-0.1% SDS溶液で２
回洗浄した。ペーパータオルでフィルターの余分な水分
を除き、オートラジオグラフィーにより一夜感光させ
た。フィルターは１枚のプレートにつき２枚ずつ用意
し、シグナルの位置が２枚のフィルターで一致したもの
を陽性シグナルとした。シグナルの出た位置のトップア
ガロースを先端を切り落としたブルーチップで打ち抜
き、1.5 mlチューブに採取した。このチューブに100 μ
l SM溶液、1 μl クロロホルムを加えてボルテックス
し、ファージ液を得た。このファージ液の100倍希釈液1
0μlを200μl の大腸菌液（XLI-Blue OD₅₅₀=2）に加
え、37℃で20分間インキュベートし、50℃に保温した5
mM NZYMトップアガロースに添加し、NZYMプレート上に
注ぎ広げた。このプレートを37℃で一夜培養し、プラー
クの形成を確認した。以下、上記の一次スクリーニング
と同様に三次スクリーニングまで行い、陽性クローンを
単離した。40 kDaペプチドは、一次スクリーニングで約
70個の陽性シグナルを得たが、そのうち26個について、
二次スクリーニングを行い、三次スクリーニングの結
果、最終的に18個の陽性クローンを得た。一方、41 kDa
ペプチドでは、一次スクリーニングで18個の陽性シグナ
ル得、三次スクリーニングまで行った結果、9個の陽性
クローンを単離した。

【００３５】［実施例６］プラスミドベクターへのサブクローニング（in vivo ex
ision） 実施例５で単離したクローンをファージベクターからプ
ラスミドベクターにサブクローニングするため、以下の
とおりin vivo exisionを行った。三次スクリーニング
で得られたプラークを打ち抜いた寒天に500 μl SM溶
液、20μlクロロホルムを加えてボルテックスし、その
内の200 μl を大腸菌液（XLI-Blue OD₅₅₀=2）200 μl
に加え、さらに1 μl R408 helper phage を加えて37℃
で20分間インキュベートした。次にチューブ内容物を3
mlの2xYT培地に添加し、37℃で2.5時間振盪培養した。
得られた培養物は、70℃で20分間インキュベートした
後、この内の50μlを大腸菌液（XLI-Blue OD₅₅₀=2）200
μl に加え、その内の100 μlをプレーティングした。
37℃で一昼夜インキュベートし、Uni-ZAP XR vectorか
らpBluescript II SK-vectorにサブクローニングされた
プラスミドを持つコロニーを得た。なお、インサートcD
NAはpBluescript II SK-vectorの制限酵素Eco RI、Xho
I サイトに挿入されている。

【００３６】［実施例７］サザンハイブリダイゼーション in vivo exisionによって得られたクローンが目的のも
のであるかを確認するため、プラスミドDNAを精製し、
制限酵素によりインサートを切り出し、以下のとおりオ
リゴヌクレオチドプローブを用いたサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。in vivo exisionによって得られ
た大腸菌コロニーを爪楊枝でつつきLB（+ampicilin 50
μg/ml）培地に入れ一昼夜振盪培養した後、得られた大
腸菌からプラスミドDNAを精製し、次いで制限酵素Eco R
I 、Xho I で処理してインサートを切り出し、0.8%アガ
ロース電気泳動を行った。エチジウムブロマイドで染色
されたDNAをポラロイドカメラで撮影後、ゲルを変性液
（0.5 M NaOH、1.5 M NaCl）に20分間浸し、中和液（0.
5 M Tris/HCl (pH 7.0)、1.5 M NaCl、1 mM EDTA）に移
し30分間軽く振盪した。ゲルをブロッティング台に乗
せ、ゲル中のDNAをナイロンメンブレンに一夜キャピラ
リートランスファーした。ナイロンメンブレンを変性液
（0.5 M NaOH、1.5 M NaCl）に１分間、次いで中和液
（0.5 M Tris/HCl(pH 7.0)、1.5 M NaCl、1 mM EDTA）
に１分間、最後に2xSSCに10分間それぞれ浸した。得ら
れたナイロンメンブレンは、オーブンで80℃で２時間ベ
ーキングしてDNAを固定した後、40 kDaペプチド、41 kD
aペプチドともにプローブ１およびプローブ２それぞれ
に対してサザンハイブリダイゼーションを行った。その
結果、40 kDaペプチド、41 kDaペプチドともにスクリー
ニングで単離されたすべてのクローンに対して２種のプ
ローブがハイブリダイズすることが確認された。したが
って、得られたクローンはそれぞれ40 kDaペプチドある
いは41 kDaペプチドをコードすると推定された。

【００３７】［実施例８］6-OMT精製画分に含まれる40 kDaペプチドおよび41 kDa
ペプチドの大腸菌での発現 40 kDaペプチド、41 kDaペプチドのいずれが6-OMTであ
るのかを調べるため、両ペプチドを大腸菌で発現させ、
それら産物の反応性を調べた。 (1) 培養条件および発現ベクターの検討 a. pBluescript II SK-vectorを用いた40 kDaペプチ
ド、41 kDaペプチドの大腸菌での発現 両ペプチドのcDNAは、pBluescript II SK-ベクターに導
入されておりインサートcDNAがインフレームで導入され
た場合、IPTG（イソプロピル-β-D(-)-チオガラクトピ
ラノシド）誘導下でβ−ガラクトシダーゼの融合タンパ
ク質として発現させることができる。スクリーニングで
得られたクローンの中で40 kDaペプチドは3クローンが
インフレームで導入されていた。一方、41 kDaペプチド
は最初のメチオニンのすぐ上流にストップコドンが存在
しているためスクリーニングで得られたクローンには目
的タンパク質を発現しているものはなかった。しかし、
塩基配列の解析に用いたデリーションクローンの中に最
初のメチオニンを含んでインフレームで導入されている
クローンがあり、そのクローンを以降の操作に用いた
（図９）。以下に上記操作を詳述する。

【００３８】各クローンは5 ml LB（+ アンピシリン(50
μg/ml)）培地に入れ37℃で一昼夜振盪培養し、100 ml
LB（+ アンピシリン(50 μg/ml)）培地に植菌後、OD
₆₀₀=0.4 - 0.8となるように37℃で振盪培養し、IPTGを1
mMになるように添加した。さらに、37℃で4時間、
18℃で10時間、10℃で48時間振盪培養した後、4 ℃、
3000 rpmで15分間遠心した。以降の操作はすべて4 ℃で
行った。沈殿に5 mlの抽出バッファー（100 mM Tris/HC
l (pH 7.5)、10 mM アスコルビン酸ナトリウム、20 mM
β−メルカプトエタノール）を加え懸濁し、3000 rpmで
15分間遠心した。沈殿に1 ml抽出バッファーを加え再懸
濁後、超音波処理により菌を破砕し、15,000 rpmで15分
間遠心し上清をタンパク質粗抽出液として得た。この液
を用いて、以下の条件の下、酵素反応を行った。活性の
有無の判定には、基質としてラウダノソリン、ノルラウ
ダノソリンおよび6-O-メチルノルラウダノソリンを用い
た。

【００３９】 ───────────────────────────── 酵素反応条件 基質 2.5 mM SAM(S-アデノシル-L-メチオニン) 1 mM アスコルビン酸ナトリウム 25 mM Ches/NaOH (pH 9.0) 300 mM 酵素液 20μl 計 50μl HPLC分析条件 カラム：Nova-Pack C18 3.9×150 mm（Waters社） 検出 ：UV 280 nm 流速 ：1.0 ml/min 移動相：10%アセトニトリル+1%酢酸 ─────────────────────────────

【００４０】41 kDaペプチドは培養条件が10℃で48時
間の場合のみラウダノソリン、6-O-メチルラウダノソリ
ンに対して活性が認められたが、ノルラウダノソリンに
対しては活性が認められなかったことから、本ペプチド
は6-OMTではなく4'-OMTであることが示唆された。ま
た、40 kDaペプチドはどの培養条件でも活性が認められ
なかったので、pETシステム（Novagen社）での発現を試
みた。b. pETシステムでの40 kDaペプチド、41 kDaペプ
チドの大腸菌での発現pETシステムにおいては、目的遺
伝子は当該プラスミド上の強力なT7ファージプロモータ
ー下流に挿入され、宿主大腸菌により供給されるT7 RNA
ポリメラーゼにより転写される。このT7 RNAポリメラー
ゼ遺伝子は、宿主大腸菌染色体に組み込まれており、la
c UV5 プロモーター下流にあるため、IPTG添加による誘
導で発現をコントロールできる。以下に当該システムを
用いた40 kDaペプチドおよび41kDaペプチドの発現を調
べるための操作を詳述する。

【００４１】pETベクターにサブクローニングするため
に新たに制限酵素部位を導入した変異プライマーを合成
した（図10）。40 kDaペプチドおよび41 kDaペプチド、
pBluescript II SK-それぞれにつき、２種類合成した。
最初は変異プライマー40-1、41-1を用いてTransformer
^TMSite Directed Mutagenesis Kit （Clonteck社）によ
るin vivoの突然変異誘発を試みたが、選択プライマーS
K-1の合成不良が原因と思われる不調のため、プライマ
ー40-2、41-2ならびにM13ユニバーサルプライマーを用
いてPCRを行い、増幅されたDNA断片をpET21dベクターの
Bam HI、Xho Iサイトに導入し、T7 gene 10との融合タ
ンパク質として発現させた（図11）。図10では、40 kDa
ペプチドを例として挙げたが、41 kDaペプチドも同様に
行った。この系において両ペプチドはT7 gene 10の融合
タンパク質として発現できる。図10において、ベクター
由来の配列は下線で示した。なお、PCR条件は以下のと
おりである。

【００４２】 ─────────────────────────────────── PCR条件 変異プライマー40-2または41-2 100 pmoles M13ユニバーサルプライマー 100 pmoles 鋳型DNA 0.5μg Taq DNA ポリメラーゼ（Pharmacia社） 2.5 units 10 xバッファー 10μl ４種の dNTPsの混合物 各々2.5 mM 計 100 μl 90℃ 1分→45℃ 2分→72℃ 3分を１サイクルとし、30サイクル行った。 ───────────────────────────────────

【００４３】増幅されたDNA断片およびpET21dベクター
を制限酵素Bam HI およびXho I で処理した後、ライゲ
ーションを行い、大腸菌BL21細胞にエレクトロポーレー
ション法により形質転換を行った。得られたコロニーを
無作為に選んでプラスミドDNAを精製し、制限酵素Bam H
I およびXho I で処理した。アガロース電気泳動で導入
の成功したクローンを選び、前記の条件（10℃で48時
間）で培養し、酵素活性の有無を調べた。その結果、41
kDaペプチドは活性を示さず、発現していないと思われ
た。一方、40 kDaペプチドは僅かながらもラウダノソリ
ンおよびノルラウダノソリンに対して活性を有してお
り、6-OMTであることが示された。

【００４４】(2) 6-OMT精製画分の40 kDaペプチドおよ
び41 kDaペプチドの大腸菌での発現 培養条件ならびに発現ベクターの前記検討の結果から、
培養条件はOD₆₀₀=0.4- 0.8となるように37℃で振盪培養
し、IPTGを1 mMになるように添加し、さらに10℃で48時
間振盪培養する条件を選んだ。また、発現ベクターは、
40 kDaペプチドはpETベクターに導入したもの（pE4
0）、41 kDaペプチドはpBluescript II SK-ベクターに
導入したもの（pBS41）を用いた。pE40のコントロール
としてインサートを含まないpET21dベクターを形質転換
したもの、またpBS41のコントロールとしてインサート
を含まないpBluescript II SK-ベクターを形質転換した
ものを用いた。

【００４５】40 kDaペプチドはノルコクラウリンからオ
ウレン培養細胞の精製6-OMT（positive control）と同
一の保持時間を示す生成物、すなわちコクラウリンを生
成することから6-OMTであることが明らかとなった。ま
た、41 kDaペプチドは3-ヒドロキシ-N-メチルコクラウ
リンからオウレン培養細胞の6-OMT（positive contro
l）と同一の保持時間を示す生成物、すなわちレティキ
ュリンを生成することから、4'-OMTであることが明らか
となった（図12）。

【００４６】［実施例９］塩基配列の決定 スクリーニングで単離したクローンでインサートが最長
のものについて、以下の操作により全塩基配列の決定を
行った。 (1) プラスミドDNAの大量調製 大腸菌コロニーを爪楊枝でつつき、100 ml LB（+ アン
ピシリン (50 μg/ml)）培地に入れ、一昼夜振盪培養し
た。3000 rpmで15分間室温で遠心し、沈殿に4ml TEG（T
ris/HCl (pH 8.0)、10 mM EDTA、50 mM glucose）を加
え懸濁し、1 mMリゾチーム（25 mg/ml）溶液を加え5分
間放置した。10 mM NaOH-SDS（0.2 N NaOH 10% SDS）
溶液を加え5分間氷冷後、5 M酢酸カリウムを7.5 ml加
え、さらに10分間氷冷した。3000 rpmで15分間室温で遠
心し、上清に13.5 mlイソアミルアルコールを加え、室
温で15分間放置した。3000 rpmで15分間室温で遠心し、
沈殿を4.7 ml TE（含RNase A (50 μg/ml) ）に溶解
し、37℃で10分間インキュベートした。CsCl 5 gを加え
溶解後、エチジウムブロマイド（10 mg/ml）0.3 mlを添
加した。100,000 rpmで5時間室温で遠心（TL 100 (Beck
man社)、ローター：TLA 100-3）した後、紫外線を照射
し、赤い蛍光バンドの位置を回収した。回収サンプルに
500 μl のイソアミルアルコールを加えて、エチジウム
ブロマイドの抽出操作を4回繰り返した後、下層の液を
採取しこれに20μl 3 M酢酸ナトリウム（pH 5.2）、500
μl エタノールを加え4 ℃で一夜放置した。これを15,
000 rpmで15分間遠心して上清を除き、沈殿に70%エタノ
ールを加えボルテックス後再度15,000rpmで5分間遠心し
た。沈殿をSpeed Vacで乾燥し、これを100 μl TEに溶
解させてプラスミドDNA溶液を得た。

【００４７】(2) デリーションクローンの作成 先に述べたようにcDNAはpBluescript II SK-ベクターの
Eco RI、Xho I サイトにクローニングされている。した
がって、M13ユニバーサルプライマー側からのデリーシ
ョンを行うにあたっては制限酵素Apa I 、Xho I で処理
し、M13リバースプライマー側からのデリーションを行
うにあたっては制限酵素Sac I 、Eco RIで処理した。以
下にその操作を詳述する。

【００４８】10μgのプラスミドDNAを制限酵素（Apa I
、Xho I あるいはSac I 、Eco RI）で処理した後、フ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理
し、次いでエタノール沈殿後乾燥させた沈殿を20μl 1x
Exo III バッファー（66 mM Tris/HCl (pH 8.0)、6 mM
MgCl₂）に溶解し、30℃で5分間インキュベートした後、
エキソヌクレアーゼIII 1 μl （180 units）を加え、3
0秒ごとに2.5 μl ずつサンプリングし、0 ℃で保温さ
れた7.5 μl S1反応混合物に加え、計25サンプルを得
た。室温で30分間インキュベート後、1 μl S1停止混合
物（0.3 M Tris base50 mM EDTA (pH 8.0)）を加え、70
℃で10分間インキュベートし反応を停止した。氷冷後1
μl を電気泳動に用いデリーションが適当であることを
確認し、1 μl のクレノウ混合物（33 mM MgCl₂、3.3 m
M Tris/HCl (pH 7.6)、E. coli のクレノウフラグメン
ト、DNA ポリメラーゼ I 0.1 units）を加え、37℃で5
分間インキュベートした。各塩基につき0.5 mMのdNTP混
合物を1 μl 加え、室温で15分間インキュベートした
後、40μl リガーゼ混合物（10xligation buffer (0.5
MTris/HCl (pH 7.6)、0.1 M MgCl₂、0.1 M DTT) 4μl、
5 mM rATP 4 μl 、30% (w/w) ポリエチレングリコール
10 μl、T4 DNAリガーゼ 0.2 Weiss units）を加え、
さらに２時間インキュベートし、ライゲーションを行っ
た。これを熱ショック法で大腸菌に導入し、培養してコ
ロニーを得た。コロニーを無作為に選び爪楊枝でつつ
き、LB（+ アンピシリン (50μg/ml)）培地に入れ一夜
振盪培養した後、プラスミドDNAを精製し、インサート
の長さをアガロース電気泳動により調べた。デリーショ
ンが約200 bpごとになるようにクローンを選抜し塩基配
列の解析を行った。

【００４９】(3) 塩基配列の決定 塩基配列の決定には２種類のシステムを利用した。一つ
は蛍光標識プライマーを用いてT7 DNAポリメラーゼによ
る反応を行い、Sanger法で塩基配列を決定する方法であ
り、具体的にはAuto Read Sequencing Kit（Pharmacia
社）を用いて２本鎖DNAのシークエンス反応を行い、配
列解析にはAutomated Laser FluorescentA.L.F DNA Seq
uencer（Pharmacia社）を用いた。また、プライマーに
はM13 ユニバーサルプライマーおよびM13リバースプラ
イマーを用いた。もう一つは3'末端蛍光ラベル・シーク
エンス法を用いたDye Deoxy^TMCycle Sequencing Kit 40
115 （Applied Biosystems社）による方法で、具体的に
は２本鎖DNAについてサーマル・サイクラーによりシー
クエンス反応を行い、CTAB沈殿法により反応終了液を精
製し、ABI 373A DNA Sequencer（Applied Biosystems
社）で解析を行った。

【００５０】6-OMT（40 kDaペプチド）の全塩基配列は
図13に示すとおりである。図13において、網かけの部分
は推定のSAM認識部位を示す。ペプチドマッピングで解
析された配列は下線で示した。また、オリゴヌクレオチ
ドプローブ作製に用いた配列は二重線で示した。6-OMT
をコードしているcDNAは1267 bpであり、347アミノ酸を
コードする一つのORFを有し、その推定分子量は38,655
であった。当該cDNA配列の中には、SAM認識部位と推
定、報告されている配列が保存されていた。推定の分子
量がSDS-PAGEの結果から推定される値よりも小さいが、
翻訳開始シグナルの存在が示唆されていること、ならび
にSDS-PAGEの結果とのずれが誤差範囲と考えられること
などから、当該クローンは全長を含んでいると判断し
た。

【００５１】(4) ベルベリン生合成の3つの水酸基メチ
ル化酵素の一次構造の比較 InteliGenetics社のDNA解析用ソフトウェアGene Works
を用いて、ベルベリン生合成の3つの水酸基メチル化酵
素のアミノ酸配列を比較した。ホモロジープロットにお
いては、比較する各アミノ酸残基の前後各6残基の範囲
で、67%以上が同一であった場合に黒点が描画されるよ
うに設定した。本発明の6-OMTと、同じく本発明の解析
から得られた4'-OMTならびにSMT [N. Takeshita, H. Fu
jiwara, H. Mimura, J. H. Fitchen, Y. Yamada, Fisat
o Molecular cloning and characterization of S-aden
osyl-L-methionine: scouler: ne-plant Cell physiol.
36: 29(95)]三者間のアミノ酸レベルでの相同性は、そ
れぞれ全長で22%、SAM認識部位が存在するC末端側では3
4%、N末端側では13%であった（図14）。また、6-OMTと
4'-OMTのアミノ酸レベルでの相同性は、それぞれ全長で
51%、C末端側で58%、N末端側で47%であった（図15）。
さらに、SMTと6-OMTのアミノ酸レベルでの相同性は、そ
れぞれ全長で30%、C末端側では43%、N末端側では21%で
あった（図16）。なお、SMTと4'-OMTのアミノ酸レベル
での相同性は、それぞれ全長で30%、C末端側では42%、N
末端側では21%であった（図17）。

【００５２】(5) 6-OMTおよび4'-OMTと他の水酸基メチ
ル化酵素との推定SAM認識部位のアミノ酸配列の比較 6-OMTおよび4'-OMTと他の水酸基メチル化酵素との推定S
AM認識部位のアミノ酸配列を比較したところ、6-OMTお
よび4'-OMTのいずれにおいても配列がよく保存されてい
ることがわかった（図18）。図18において、側鎖の性質
の似たアミノ酸を大文字で表記した。

【００５３】(6) 水酸基メチル化酵素の系統樹 前記のGene Worksを用いてUPGMAにより6-OMTおよび4'-O
MTと他の水酸基メチル化酵素の全長アミノ酸配列から系
統樹を作成した。微生物由来や動物由来の水酸基メチル
化酵素に比べ、植物二次代謝関連の当該酵素が互いに進
化的に近い関係にあることが示唆された（図19）。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、医薬品原料などとして
有用な、コクラウリンまたはレティキュリン由来の植物
二次代謝産物を、コクラウリンの生合成酵素である6-OM
Tまたは当該酵素をコードするDNAで形質転換された微生
物、植物または当該植物の培養細胞および／または組織
を用いて効率よく生産することができる。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：347 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 起源 生物名：セリバオウレン 株名： 配列：156-1 Met Glu Val Lys Lys Asp Asn Leu Ser Ser Gln Ala Lys Leu Trp Asn 5 10 15 Phe Ile Tyr Gly Phe Ala Glu Ser Leu Val Leu Lys Cys Ala Val Gln 20 25 30 Leu Asp Leu Ala Asn Ile Ile His Asn Ser Gly Thr Ser Met Thr Leu 35 40 45 Ser Glu Leu Ser Ser Arg Leu Pro Ser Gln Pro Val Asn Glu Asp Ala 50 55 60 Leu Tyr Arg Val Met Arg Tyr Leu Val His Met Lys Leu Phe Thr Lys 65 70 75 80 Ala Ser Ile Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Gly Leu Ala Pro Pro Ala Lys 85 90 95 Tyr Leu Val Lys Gly Trp Asp Lys Cys Met Val Gly Ser Ile Leu Ala 100 105 110 Ile Thr Asp Lys Asp Phe Met Ala Pro Trp His Tyr Leu Lys Asp Gly 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ser Gly Thr Ala Phe Glu Lys Ala Leu Gly Thr Asn 130 135 140 Ile Trp Gly Tyr Met Ala Glu His Pro Glu Lys Asn Gln Leu Phe Asn 145 150 155 160 Glu Ala Met Ala Asn Asp Ser Arg Leu Ile Met Ser Ala Leu Val Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asn Ile Phe Asn Gly Ile Thr Thr Leu Val Asp Val Gly 180 185 190 Gly Gly Thr Gly Thr Ala Val Arg Asn Ile Ala Asn Ala Phe Pro His 195 200 205 Ile Lys Cys Thr Val Tyr Asp Leu Pro His Val Ile Ala Asp Ser Pro 210 215 220 Gly Tyr Ser Glu Val His Cys Val Ala Gly Asp Met Phe Lys Phe Ile 225 230 235 240 Pro Lys Ala Asp Ala Ile Met Met Lys Cys Ile Leu His Asp Trp Asp 245 250 255 Asp Lys Glu Cys Ile Glu Ile Leu Lys Arg Cys Lys Glu Ala Val Pro 260 265 270 Val Lys Gly Gly Lys Val Ile Ile Val Asp Ile Val Leu Asn Val Gln 275 280 285 Ser Glu His Pro Tyr Thr Lys Met Arg Leu Thr Leu Asp Leu Asp Met 290 295 300 Met Leu Asn Thr Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Glu Glu Trp Lys Lys 305 310 315 320 Leu Ile His Asp Ala Gly Tyr Lys Gly His Lys Ile Thr Gln Ile Thr 325 330 335 Ala Val Gln Ser Val Ile Glu Ala Tyr Pro Tyr 340 345

【００５６】配列番号：2 配列の長さ：1041 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：セリバオウレン 株名： 配列：156-1 ATGGAAGTGA AGAAGGACAA TCTCTCATCT CAAGCTAAAC TGTGGAACTT CATTTATGGT 60 TTTGCTGAAT CACTAGTCCT CAAATGTGCA GTGCAACTTG ATCTAGCCAA CATAATTCAC 120 AACAGTGGCA CGTCCATGAC TCTTTCCGAG TTATCTTCGC GTCTTCCAAG TCAACCTGTC 180 AATGAAGACG CCTTGTATCG AGTCATGCGT TACTTGGTTC ACATGAAGCT ATTCACAAAA 240 GCATCAATAG ATGGAGAACT AAGATATGGA CTTGCACCAC CAGCTAAGTA TCTTGTTAAA 300 GGTTGGGATA AATGTATGGT TGGCTCAATT TTAGCAATCA CTGATAAAGA TTTCATGGCA 360 CCATGGCATT ACCTTAAGGA TGGATTATCA GGCGAAAGTG GTACAGCGTT TGAGAAGGCC 420 TTGGGGACGA ATATATGGGG GTACATGGCA GAGCACCCTG AGAAAAACCA GCTATTTAAT 480 GAAGCAATGG CTAATGATTC AAGGCTTATT ATGTCTGCAT TGGTGAAAGA ATGTGGAAAT 540 ATTTTTAATG GTATAACTAC ACTTGTGGAT GTTGGTGGTG GTACTGGAAC TGCTGTGAGG 600 AATATTGCCA ATGCATTTCC ACATATAAAG TGTACTGTTT ATGATCTTCC TCATGTCATT 660 GCTGATTCTC CTGGGTACTC CGAAGTTCAT TGCGTGGCAG GTGATATGTT CAAGTTCATA 720 CCAAAGGCTG ATGCTATCAT GATGAAGTGC ATCCTTCACG ACTGGGATGA CAAAGAATGC 780 ATTGAAATTC TAAAGCGATG CAAGGAGGCA GTACCAGTCA AAGGCGGGAA AGTGATTATA 840 GTCGACATTG TCTTAAATGT GCAATCAGAA CATCCTTATA CCAAGATGAG ACTGACTTTG 900 GATTTGGACA TGATGCTCAA CACTGGAGGA AAAGAGAGGA CTGAAGAGGA ATGGAAGAAG 960 CTCATCCATG ATGCAGGGTA CAAAGGGCAT AAGATAACAC AAATTACTGC TGTACAATCT 1020 GTGATTGAGG CTTATCCATA T 1041

【図面の簡単な説明】

【図１】ベルベリン生合成経路を示す。 １：L-チロシンデカルボキシラーゼ、２：フェノラー
ゼ、３：L-チロシントランスアミナーゼ、４：p-ヒドロ
キシフェニルピルベートデカルボキシラーゼ、５：(S)-
ノルコクラウリンシンターゼ、６：ノルコクラウリン-6
-O-メチルトトランスフェラーゼ(6-OMT) 、７：コクラ
ウリンN-メチルトランスフェラーゼ(NMT) 、８：フェノ
ラーゼ、９：(S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン
4'-O-メチルトランスフェラーゼ(4'-OMT)、１０：ベル
ベリン架橋酵素(BBE) 、１１：(S)-スコウレリン9-O-メ
チルトランスフェラーゼ(SMT) 、１２：メチレンジオキ
シ環形成酵素、１３：テトラヒドロベルベリンオキシダ
ーゼ(THBO)

【図２】ベルベリン生合成の6-OMT/4'-OMT/SMTの基質特
異性を示す。

【図３】SDS-PAGEによる6-OMT精製の確認を示す電気泳
動の写真である。

【図４】逆相クロマトグラフィーによる6-OMT の精製を
示す。

【図５】40 kDaペプチドをAchromobacter プロテアーゼ
I処理したときのペプチドマップと得られた内部アミノ
酸配列を示す。

【図６】41 kDaペプチドをAchromobacter プロテアーゼ
I処理したときのペプチドマップと得られた内部アミノ
酸配列を示す。

【図７】40 kDaペプチドをトリプシン/Staphylococcuss
aureus V8 プロテアーゼ処理したときのペプチドマッ
プと得られた内部アミノ酸配列を示す。

【図８】オリゴヌクレオチドミックスプライマーの塩基
配列とそのもととなったアミノ酸配列を示す。

【図９】41 kDaペプチド発現ベクターpBS41 のベクター
とインサートの繋ぎ目部の塩基配列とそれを翻訳して得
られたアミノ酸配列を示す。

【図１０】突然変異誘発のための変異プライマーの塩基
配列を示す。

【図１１】pET ベクターへのサブクローニングの手順を
示す。

【図１２】40 kDaペプチドと41 kDaペプチドの大腸菌で
の発現を示す。

【図１３】単離された6-OMT(40 kDaペプチド) のcDNAの
塩基配列とそれを翻訳して得られたアミノ酸配列を示
す。

【図１４】ベルベリン生合成の３つの水酸基メチル化酵
素(6-OMT、4'-OMTおよびSMT)のアミノ酸配列の比較を示
す。

【図１５】6-OMTと4'-OMTのアミノ酸配列の比較を示
す。

【図１６】6-OMTとSMTのアミノ酸配列の比較を示す。

【図１７】4'-OMTとSMTのアミノ酸配列の比較を示す。

【図１８】6-OMT並びに4'-OMTと他の水酸基メチル化酵
素の推定のSAM認識部位のアミノ酸配列の比較を示す。

【図１９】メチル化酵素の系統樹を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 17/18 Ａ６１Ｋ 35/78 Ｆ // Ａ６１Ｋ 35/78 Ｃ Ｋ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列または
   該アミノ酸配列において１もしくは２以上のアミノ酸が
   付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、か
   つノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼの酵
   素活性を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 ポリペプチドが、配列番号１に記載のア
   ミノ酸配列を含むノルコクラウリン6-O-メチルトランス
   フェラーゼである請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   るDNA。
4. 【請求項４】 配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む
   ポリペプチドをコードする請求項３記載のDNA。
5. 【請求項５】 配列番号２に記載のヌクレオチド配列を
   含むDNA。
6. 【請求項６】 配列番号２に記載のヌクレオチド配列を
   含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、かつノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラー
   ゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
7. 【請求項７】 請求項３〜６のいずれか一項に記載のDN
   Aを含むベクター。
8. 【請求項８】 微生物および／または植物の細胞内で、
   ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼの酵素
   活性を有するポリペプチドを発現させることができる請
   求項７記載のベクター。
9. 【請求項９】 請求項７または８に記載のベクターで形
   質転換された微生物。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の形質転換微生物を用い
    て、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼの
    酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法。
11. 【請求項１１】 請求項７または８に記載のベクターで
    形質転換された植物細胞、植物組織または植物。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の形質転換植物、また
    は該植物の培養細胞および／または組織を用いて、植物
    二次代謝産物を製造する方法。
13. 【請求項１３】 植物二次代謝産物がコクラウリンまた
    はレティキュリンから生合成されるアルカロイドである
    請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 アルカロイドがベルベリン型アルカロ
    イド、モルフィン型アルカロイドまたはパパベリン型ア
    ルカロイドである請求項１２記載の方法。
15. 【請求項１５】 形質転換植物がオウレン属植物である
    請求項12記載の方法。
16. 【請求項１６】 形質転換植物がケシ属植物である請求
    項12記載の方法。