JPH114682A

JPH114682A - 有核細胞保存方法、有核細胞保存用組成物及び有核細胞分離方法

Info

Publication number: JPH114682A
Application number: JP9172766A
Authority: JP
Inventors: Masaya Sumida; 政哉澄田; Shuji Terajima; 修司寺嶋
Original assignee: Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1997-06-16
Filing date: 1997-06-16
Publication date: 1999-01-12

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】安価で且つ簡便・短時間操作の、有核細胞を
含有する液体から有核細胞のみを分離して凍結保存する
方法、更に詳しくは、使用が決まってから、凍結解凍後
に細胞分離回収操作を行う方法の提供。【解決手段】有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は
実質的に捕捉しない手段に有核細胞含有液を導入して有
核細胞は捕捉させ、核を持たない細胞は流出させた後、
少なくとも凍害保護剤を含む液体を該手段に導入し、該
手段を凍結保存することを特徴とする有核細胞保存方
法。有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕
捉しない手段に有核細胞含有液を導入して有核細胞は捕
捉させ、核を持たない細胞は流出させた後、少なくとも
凍害保護剤を含む液体を該手段に導入し、捕捉された有
核細胞及び少なくとも凍害保護剤を含む液体を含む該手
段を凍結保存した後、該手段を解凍し、有核細胞回収液
を該手段に導入して有核細胞を回収することを特徴とす
る有核細胞分離方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば造血幹細胞
及び／又は造血前駆細胞（以下、「造血幹細胞」と略
す）やリンパ球などの有核細胞を含有する液体中の有核
細胞を凍結保存する方法、有核細胞保存用組成物及び有
核細胞分離方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臍帯血幹細胞は、ドナー侵襲皆無の造血
幹細胞移植ソースとして注目を集めており、欧米諸国を
中心にさかんに臨床応用が試みられている。臍帯血幹細
胞は、他の造血幹細胞移植、即ち、骨髄移植あるいは末
梢血幹細胞移植のようにドナーから採取されてすぐ患者
に移植されることはまれであるので、採取時から使用時
まで保存しておくことが必要である（特に非血縁者間移
植の場合）。特公平８−６９公報には臍帯血を凍結保存
後、解凍して移植に用いることが開示されている。とこ
ろで、臍帯血は凍結保存に際し、解凍後の破壊赤血球に
よる副作用防止及び凍結保存時の体積を小さくする目的
で、単核球に分離（赤血球を除去）すべきとされており
現在はほとんどが分離保存となっている（南江堂、「末
梢血幹細胞移植」１７３ページ）。事実、特公平８−６
９公報でもフィコールハイパキュー（比重液による遠心
分離）で分離すること（以下「フィコール法」と略す）
及びそのプロトコールの詳細が開示されている。更に、
その後の凍害保護剤を添加して凍結保存する方法の詳細
も開示されている。しかしながら、フィコール法は非常
に煩雑で長時間を要する操作であるという問題があり、
その上更に細胞濃度調整、凍害保護剤添加が加わるの
で、総作業時間は非常に長時間となる。又、必要な資材
も、フィコール法に用いる遠沈管、フィコール液、凍結
保存バッグ等が必要となりコスト高である。特開平８−
５２２０６公報には採取した臍帯血から造血幹細胞を分
離出来る臍帯血採取装置が開示されており、同公報７ペ
ージには臍帯血採取容器に凍害保護剤を添加しておくこ
とが好ましいことが開示されている。同公報によると膜
型血漿分離器で造血幹細胞は血漿成分に、非造血幹細胞
（赤血球）は血球成分に分離されるとしているが、造血
幹細胞と赤血球は大きさがほぼ同じであることから、本
分離法で期待する結果を得るためには非常な困難を伴う
と考えられる。一方、同公報には別の分離法として密度
勾配分離（即ち、フィコール法）装置を接続して分離す
る方法も開示されている。本法は先述したように、従来
使用されている方法であるので、造血幹細胞の分離は可
能であるが、同公報図３からもわかるように非常に大掛
かりな装置となる。又、自動化された装置とは言え、フ
ィコール法であるので、操作時間は長い。更に、必要な
資材も、フィコール法に用いるバッグ、フィコール液、
凍結保存バッグ等が必要となりコスト高である。ＷＯ９
６／１７５１４公報にはヒドロキシエチルスターチを用
いて赤血球を沈降分離し、有核細胞濃厚液を得るための
バッグシステム、方法が開示されている。本法はシステ
ム化されているものの、遠心分離が２回必要であるた
め、やはり長時間作業となり、又本法も必要な資材は細
胞分離用バッグ、凍結保存バッグ等が必要となりコスト
高である。更に、以上あげた方法はいずれも凍結保存の
前に細胞分離回収操作が行われているが、臍帯血の場
合、凍結保存する細胞が全て移植されるわけではなく、
移植を希望する患者のＨＬＡに適合（完全適合だけでな
く部分的適合も含む）した場合のみ解凍、移植されるの
であり、多くの細胞は凍結保存されたままである。即
ち、全ての細胞が移植されるのではないにもかかわら
ず、細胞分離回収操作を行うことは、きわめて非合理的
であり、本来なら不要である時間、資材が浪費されるこ
とになる。特公平８−２４５８３公報には繊維状物質が
容器に充填されてなるフィルターに有核細胞を吸着させ
た後、フィルターごと凍結し、室温で解凍することを含
むＤＮＡの抽出方法が開示されている。しかしながら、
同技術は各種遺伝子診断に用いるために、ＤＮＡを含む
有核細胞を分離採取するもので、採取後の有核細胞を溶
解させてＤＮＡを抽出するため、回収後の細胞は機能を
維持している必要がなく（ＤＮＡさえ保持していればよ
い）、凍害保護剤は使用していない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
で且つ簡便・短時間操作の細胞凍結保存方法を提供する
ことにある。更に詳しくは、使用が決まってから、即ち
凍結解凍後に細胞分離回収操作を行うので、凍結保存前
の細胞処理操作にかかる時間の短縮、使用資材を削減出
来る方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる従来
技術の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、細胞をフ
ィルターに捕捉させたまま、機能を維持した凍結保存が
可能であるという驚くべき事実を見出し、これにより凍
結保存前の細胞分離回収操作を一切省略することを可能
とし、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は
有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉し
ない手段に有核細胞含有液を導入して有核細胞は捕捉さ
せ、核を持たない細胞は流出させた後、少なくとも凍害
保護剤を含む液体を該手段に導入し、該手段を凍結保存
することを特徴とする有核細胞保存方法である。又、本
発明は有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に
捕捉しない手段と、該手段に捕捉された有核細胞と、少
なくとも凍害保護剤を含む液体からなることを特徴とす
る有核細胞保存用組成物である。更に、本発明は有核細
胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない手
段に有核細胞含有液を導入して有核細胞は捕捉させ、核
を持たない細胞は流出させた後、少なくとも凍害保護剤
を含む液体を該手段に導入し、捕捉された有核細胞及び
少なくとも凍害保護剤を含む液体を含む該手段を凍結保
存した後、該手段を解凍し、有核細胞回収液を該手段に
導入して有核細胞を回収することを特徴とする有核細胞
分離方法である。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。本
発明で言う有核細胞とは例えば、白血球のように核を持
つ細胞のことであり、リンパ球、顆粒球、単球、造血幹
細胞などがあげられる。本発明で言う核を持たない細胞
とは赤血球、血小板などがあげられる。又、本発明で言
う有核細胞含有液とは前記有核細胞を含有する液体のこ
とであり、例えば末梢血、リンパ液、骨髄液、臍帯血、
あるいはこれらに何らかの処理を施した液体等があげら
れる。本発明における有核細胞は捕捉し、核を持たない
細胞は実質的に捕捉しない手段とは、例えば有核細胞は
捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない材料を
充填した容器があげられる。有核細胞は捕捉し、核を持
たない細胞は実質的に捕捉しない材料とは通常の有核細
胞捕捉材であればいかなる材料も使用出来るが、成型
性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを
例示すると、ポリエチレン、ポリプリロピレン、ポリス
チレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリ
カーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の
合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロー
ス、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、
ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア
等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の
金属があげられる。更に、これらの材料は凍結解凍に耐
えられるものでなければならないので、所望の凍結温度
に応じて適宜材料を選択する。例えば、ポリエチレン、
ポリプロピレン等のポリオレフィン類はマイナス１９６
℃の凍結でも使用可能である。又、これらの捕捉材はこ
のままでも用いることが出来るが、血小板通過性を高め
る、あるいは細胞の選択的捕捉を行う等の必要に応じ、
表面改質を施したものでも良い。例えば、血小板通過性
を高めるにはＷＯ８７／０５８１２公報で提案されてい
る非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基を有するポリ
マーのコートによる方法等があげられ、細胞の選択的捕
捉を行う場合、アミノ酸、ペプチド、糖類、糖タンパク
（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）といった
特定の細胞に親和性のあるリガンドを、例えば特開平２
−２６１８３３公報で提案されているハロアセトアミド
法により固定する方法等があげられる。また、捕捉材の
形状としては粒状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状
多孔質体、平板等があげられるが、体積あたりの表面積
が大きいという点で粒状、繊維塊、織布、不織布、スポ
ンジ状多孔質体が好ましい。

【０００６】有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実
質的に捕捉しない材料を充填する容器は、成型性、滅菌
性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示する
と、ポリエチレン、ポリプリロピレン、ポリスチレン、
アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネ
ート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル
等の合成高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、ア
ルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、
アルミニウム等の金属があげられる。更にこれらの材料
は凍結解凍に耐えられるものでなければならないので、
所望の凍結温度に応じて適宜材料を選択する。たとえ
ば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン
類はマイナス１９６℃の凍結でも使用可能である。

【０００７】本発明で言う凍害保護剤とは、有核細胞の
凍結保存に用いられるものであればいかなるものも使用
可能であるが、凍害保護作用が高く、細胞毒性が低いと
いう点で好ましいものを例示すると、ジメチルスルホキ
シド、グリセリン、サッカロース、トレハロース等の低
分子有機化合物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン
グリコール、アルブミン、デンプン、ヒドロキシエチル
化デンプン、デキストランなどの高分子化合物があげら
れるがこれらに限定されるものではない。ところで、こ
れらはそれぞれ単独よりも組み合わせて使用すると、よ
り好ましい場合がある。例えば、造血幹細胞の場合、ジ
メチルスルホキシド＋ヒドロキシエチル化デンプン＋ア
ルブミンの混合系は、ジメチルスルホキシド単独系より
も優れており、また、ジメチルスルホキシド＋ヒドロキ
シエチル化デンプン＋デキストランの組み合わせも好ま
しい。本発明で言う有核細胞保存用組成物とは、前述
の、有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕
捉しない手段と、該手段に捕捉された有核細胞と、少な
くとも前述の凍害保護剤を含む液体からなる組成物であ
る。

【０００８】本発明で言う有核細胞は捕捉し、核を持た
ない細胞は実質的に捕捉しない手段に通液する方法とし
ては、前記手段にチューブを介して有核細胞含有液を入
れたバッグあるいはボトルを接続して落差、ローラーポ
ンプ、バッグを押しつぶし液流を惹起させる、などによ
り導入するか、有核細胞含有液を入れたシリンジを接続
し、手押しまたはシリンジポンプなどで送液して導入す
れば良い。有核細胞を該手段に導入すると、有核細胞は
該手段内に捕捉され、核を持たない細胞は該手段から流
出するが、若干容器内にも残存する場合があるので、残
存した核を持たない細胞を洗浄除去する目的で前記手段
に洗浄液を導入して洗浄することが好ましい。洗浄液と
しては生理的溶液であればいかなるものも使用可能であ
るが、いくつか例示すると、生理食塩水、ダルベッコリ
ン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）やハンクス液（ＨＢＳＳ）な
どの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培地があげられ
る。これらの生理的溶液に、細胞保護、栄養補給等の目
的で必要に応じデキストラン、ヒドロキシエチル化デン
プン、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロ
ース、トレハロース等を添加してもよい。洗浄液の送液
方向は有核細胞含有液を導入した方向と同一方向が好ま
しい。逆方向ではこの洗浄操作により、有核細胞が漏出
してしまう恐れがある。

【０００９】本発明で言う少なくとも凍害保護剤を含む
液体を、有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的
に捕捉しない手段に導入する導入方法としては、前記手
段にチューブを介して凍害保護剤を含む液体を入れたバ
ッグあるいはボトルを接続して落差、ローラーポンプ、
バッグを押しつぶし液流を惹起させる、などにより導入
するか、凍害保護剤を含む液体を入れたシリンジを接続
し、手押し又はシリンジポンプなどで送液して導入すれ
ばよい。ここで、凍害保護剤としてジメチルスルホキシ
ドを用いる場合は、冷却したジメチルスルホキシドを用
い、且つ前記手段自体も氷浴等により冷却しながら加え
ることが好ましい。これは、有核細胞が室温でジメチル
スルホキシドに長時間接触していると細胞機能へのダメ
ージがあることが知られているためである。

【００１０】本発明で言う凍結保存方法としては、一般
的な有核細胞の凍結保存方法、即ち、プログラムフリー
ザーで−１〜−３℃／分で徐冷してから液体窒素中で保
存する方法、発泡スチロール容器に被凍結保存物を入れ
て、直接−８０℃の冷凍庫中に静置する（発泡スチロー
ルにより徐冷が達成される）、など公知の方法を採用す
ればよい。また、同様に、解凍方法としては、一般に細
胞内に形成された氷晶による細胞の物理的損傷を防ぐた
めに急速解凍が好ましいとされており、３７〜４０℃の
水浴中での解凍が広く行われているので、これを採用す
ればよい。本発明で言う解凍後に容器に導入して、有核
細胞を回収する回収液とは、生理的溶液であればいかな
るものも使用可能であるが、いくつか例示すると、生理
食塩水、Ｄ−ＰＢＳやＨＢＳＳなどの緩衝液、ＲＰＭＩ
１６４０などの培地があげられる。これらの生理的溶液
に、粘度向上（回収率向上に有効な場合がある）、細胞
保護、栄養補給等の目的で必要に応じデキストラン、ヒ
ドロキシエチル化デンプン、アルブミン、グロブリン、
ゼラチン、グルコース、サッカロース、トレハロース等
を添加してもよい。

【００１１】本発明で言う有核細胞を回収する方法とし
ては、前述の有核細胞を回収する回収液を前記手段に導
入することで行うが、その導入方法としては該手段にチ
ューブを介して回収液を入れたバッグあるいはボトルを
接続して落差、ローラーポンプ、バッグ押しつぶしなど
で送液するか、回収液を入れたシリンジを接続し、手押
し又はシリンジポンプなどで送液すればよい。この際、
回収液の送液方向としては、凍結前に有核細胞含有液を
導入した方向と同一方向、その逆方向の２通りがある
が、一般に細胞回収率は後者の方が高いので好ましい。
回収液の流速は早い方が回収率が高くなるので好まし
い。また、凍害保護剤を含む液体を洗浄除去したい場合
には、回収液を導入する前に前記手段に洗浄液を導入
し、凍害保護剤を含む液体を洗浄除去する。洗浄液とし
ては生理的溶液であればいかなるものも使用可能である
が、いくつか例示すると、生理食塩水、Ｄ−ＰＢＳやＨ
ＢＳＳなどの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培地があ
げられる。これらの生理的溶液に、細胞保護、栄養補給
等の目的で必要に応じデキストラン、ヒドロキシエチル
デンプン、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グルコ
ース、サッカロース、トレハロース等を添加してもよ
い。洗浄液の送液方向は凍結前に有核細胞含有液を導入
した方向と同一方向が好ましい。逆方向ではこの洗浄操
作により、即ち回収操作前に細胞が漏出してしまい、結
果として回収率が低下するおそれがある。

【００１２】

【実施例】以下に実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。

【実施例１】細胞保存容器作製容器外寸（縦×横×厚み）４１×４１×１８ｍｍで液体
流出口と液体流入口を対角線上にもつポリカーボネート
製容器の入口側に平均繊維径１２μｍのポリエステル不
織布１２枚を、出口側に平均繊維径２．３μｍのポリエ
ステル不織布２５枚を充填した。なお、充填密度は０．
２ｇ／ｃｍ³、有効濾過面積１２．２５ｃｍ²、有効濾過
長１２．４ｍｍであった。凍害保護剤の調製市販の凍害保護剤“ＣＰ−１”（極東製薬工業社製、ヒ
ドロキシエチルデンプン１２ｇとジメチルスルホキシド
１０ｍｌを含む全量６８ｍｌの生理食塩水溶液）に同社
の使用説明書にしたがって市販の２５％ヒト血清アルブ
ミン３２ｍｌを添加し、全量１００ｍｌとした。これに
より本凍害保護剤の組成は以下のとおりになった。１２
％ヒドロキシエチルデンプン、１０％ジメチルスルホキ
シド、８％ヒト血清アルブミン。なお、本凍害保護剤は
使用時まで冷蔵庫にて冷蔵保存した。細胞保存操作図３に模式図で示した回路を組み立て、細胞保存操作を
行った。ヒト新鮮臍帯血（抗凝固剤ＣＰＤ）５０ｍｌを
入れた血液バッグ５を途中に生理食塩水バッグ６とで
調製した凍害保護剤バッグへの分岐１１及びローラーク
ランプ８とドリップチャンバー７を有するチューブで、
で作製した細胞保存容器９の入口側に接続した。細胞
保存容器９の出口側にはドレーン用血液バッグ１０を接
続した。新鮮臍帯血５０ｍｌを約６０ｃｍの落差で通液
し、細胞保存容器９から流出する赤血球含有液をドレー
ンバッグ１０に回収した。その後、細胞保存容器９内に
残存する赤血球、血小板を洗い流す目的で生理食塩水３
０ｍｌを通液した。その後、細胞保存容器９を氷浴で冷
却しながら、で調製した凍害保護剤５０ｍｌを点滴速
度（約５ｍｌ／分）で通液した。ローラークランプを閉
じてから、容器９の入口、出口に接続されているチュー
ブをヒートシール後切断した。凍結保存はＣＰ−１の使
用説明書にしたがい、−８０℃のディープフリーザーで
行った（プログラムフリージングせず）。本細胞保存操
作（ディープフリーザーに投入まで）に要した時間は２
５分であった。このまま、ディープフリーザー中に１ケ
月間保存した。有核細胞が細胞保存容器内に捕捉されて
いる状態及び有核細胞が捕捉されている細胞保存容器内
に凍害保護剤が導入された状態についてそれぞれ図１、
図２に模式的に示した。１は細胞保存容器、２は不織布
繊維、３は繊維に捕捉された有核細胞、４は凍害保護剤
を示す。細胞解凍操作ＣＰ−１の使用説明書にしたがい、３７℃の恒温水槽で
急速解凍した。所要時間は約５分であった。細胞回収操作細胞保存容器内の凍害保護剤を洗い流す目的で、細胞保
存容器の入口側に生理食塩水を入れた３０ｍｌシリンジ
を接続し、ゆっくり押し出した。入口側のシリンジをは
ずした後、細胞保存容器を反転させ、出口側に生理食塩
水３０ｍｌを入れたシリンジを接続し、細胞保存容器の
入口の下にコニカルチューブを置き、シリンジを強く押
し、細胞保存容器の中の細胞をコニカルチューブに回収
した。分析有核細胞数、有核細胞亜分画、赤血球数、血小板数は自
動血球計算機にて測定、バイアビリティはトリパンブル
ー排除法にて測定、有核細胞中のＣＤ３４陽性率はＦＩ
ＴＣ標識ＣＤ３４抗体を用い、ＳＳＣ−ＦＩＴＣに展開
するフローサイトメトリー法（宮崎、他：日常診療と血
液、５巻２号、２１〜２３ページ、１９９５年）を用い
て測定した。なお、回収率、除去率の算出方法は以下の
とおりである。回収率（％）＝１００×（凍結解凍後の回収細胞数／原
料血液中の細胞数）除去率（％）＝１００−１００×（凍結解凍後の回収細
胞数／原料血液中の細胞数）結果結果のまとめを表１に示す。単核球、ＣＤ３４陽性細胞
が高率に回収でき、赤血球、血小板が高率に除去されて
いる。また、バイアビリティも高値を維持している。

【００１３】

【発明の効果】以上示したように本発明による有核細胞
保存方法は簡便な操作かつ短時間で、必要細胞と不要細
胞の混合物から必要細胞のみが分離されて凍結保存、そ
して使用が決まってから、即ち凍結解凍後に細胞分離回
収操作を行うので、凍結保存前の細胞処理操作にかかる
時間の短縮、使用資材の削減に極めて有効である。本発
明により、得られた細胞は赤血球が高率に除去されてい
るため、破壊赤血球の輪注による副作用が防止できる。
更に、回収率も高く、バイアビリティも高値を維持して
いるので、臨床上もきわめて有用である。本操作は極め
て短時間の簡便な操作であるので、造血幹細胞移植分野
や養子免疫療法分野の細胞処理工程における省力化に貢
献するところ極めて大である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で有核細胞が容器内に捕捉されている状
態の模式図（凍害保護剤導入前）である。

【図２】本発明で有核細胞が捕捉されている容器内に凍
害保護剤が導入された状態の模式図である。

【図３】本発明の有核細胞保存操作に使用した回路シス
テムの１例を示す模式図である。

【符号の説明】１細胞保存容器２不織布繊維３繊維に捕捉された有核細胞４凍害保護剤５臍帯血バッグ６生理食塩水バッグ７ドリップチャンバー８ローラークランプ９細胞保存容器１０ドレーンバッグ１１凍害保護剤バッグへの分岐

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｚ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は
実質的に捕捉しない手段に有核細胞含有液を導入して有
核細胞は捕捉させ、核を持たない細胞は流出させた後、
少なくとも凍害保護剤を含む液体を該手段に導入し、該
手段を凍結保存することを特徴とする有核細胞保存方
法。
【請求項２】有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は
実質的に捕捉しない手段と、該手段に捕捉された有核細
胞と、少なくとも凍害保護剤を含む液体からなることを
特徴とする有核細胞保存用組成物。
【請求項３】有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は
実質的に捕捉しない手段に有核細胞含有液を導入して有
核細胞は捕捉させ、核を持たない細胞は流出させた後、
少なくとも凍害保護剤を含む液体を該手段に導入し、捕
捉された有核細胞及び少なくとも凍害保護剤を含む液体
を含む該手段を凍結保存した後、該手段を解凍し、有核
細胞回収液を該手段に導入して有核細胞を回収すること
を特徴とする有核細胞分離方法。