JPH11506009A

JPH11506009A - 骨形成剤を同定する方法及び構成

Info

Publication number: JPH11506009A
Application number: JP8536715A
Authority: JP
Inventors: イー．ハリス、ステファン; アール．マンディー、グレゴリー; ゴーシューチャウダリー、ナンディーニ; キュー．フェン、ジアン
Original assignee: オステオスクリーンインク．
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 1999-06-02
Also published as: EP0832297A4; WO1996038590A1; DE69626015D1; EP0832297A1; CA2221621A1; EP0832297B1; US6083690A; ATE231921T1; AU6377996A

Abstract

(57)【要約】骨形成剤を同定する方法及び構成が開示され、そこでは骨形成タンパク質のプロモーターがレポーター遺伝子のアッセイ産物の産生を制御するアッセイシステムに用いられている。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称骨形成剤を同定する方法及び構成技術分野本発明は、骨の形成を制御する薬剤を同定するアッセイ技術に関する。発明の背景骨破壊及び骨形成に影響する因子に関して入手可能な情報は多数あるが、新骨形成を刺激する成長因子についての情報はかなり限られている。発明者等はそのような活性の素材(source)を探索し、骨細胞それ自身が、骨細胞を刺激する能力がある因子の貯蔵場所(storehouse)であることを見出した。故に、屠殺場から得たウシ組織の抽出物は、骨の構造の整合性を維持するための構造タンパク質のみならず、骨細胞の増殖を刺激することができる生物活性の骨成長因子も含んでいる。後者の因子の中には、腫瘍成長因子β、ヘパリン結合成長因子（酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子）、インシュリン様成長因子（インシュリン様成長因子Ｉ及びインシュリン様成長因子II）及び最近詳述されている骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）と呼ばれるタンパク質のファミリーがある。これらの全ての成長因子は、骨細胞と同様に他のタイプの細胞に効果を有する。ＢＭＰｓは拡大された腫瘍成長因子βファミリーにおける新しい因子である。それらは、最初、鉱質除去された骨の抽出物の中から同定された(Ｕrist 1965, Ｗozney et al.,1988)。ＢＭＰ-2及びＢＭＰー4組換え体は、ラットの皮下に局所的に注入されたとき、新骨形成を誘導する(Ｗozney 1992,Ｗozney ＆Ｒosen 19 93)。これらの因子は、正常骨芽細胞によって、それらの分化により発現され、インビボでの骨形成同様、インビトロで骨芽細胞分化及び骨節形成を刺激した( Ｈarris et al.,1994)。この後者の特質は、骨損失の結果生じる病気における治療剤として可能な有用性を示唆する。骨形成に関与している細胞は骨芽細胞である。前駆細胞から成熟骨形成細胞への骨芽細胞の分化のとき、それらは、大量のタイプ-Iコラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン及びアルカリフォスファターゼを含む骨基質の構造タンパク質を発現及び分泌させる（Ｓ tein et al,1990,Ｈarris et al,1994）。それらは、骨基質に貯蔵される大量の成長調節ペプチドも同様に合成し、おそらく正常な骨形成に関与する。これらの骨形成調節ペプチドはＢＭＰｓも含む（Ｈarris et al,1994）。ラット胎児の頭頂骨骨芽細胞の初代培養の研究において、鉱質除去された骨節の形成よりも先にＢＭＰｓ1,2,3,4及び6が培養細胞で発現する(Ｈarris et al,1994)。ＢＭＰｓの発現は、アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン及びオステオホンチンの発現と同時に起きる。ＢＭＰｓはインビトロ及びインビボにおける骨形成を刺激する強力な効果があるが、骨の治療を向上させる治療剤としての使用に対しては不利である。骨形成タンパク質のレセプターが多くの組織で同定され、ＢＭＰｓそれ自身、明確な時期及び分布様式で、非常に多くの種類の組織において発現している。このことは、それらが骨以外にも多くの組織において影響し、全身的に投与されるときに、治療剤として有益性が制限されることが示唆される。更に、それらはペプチドなので、注射によって投与されなければならない。これらの不利は治療剤としてのＢＭＰｓの開発にとって厳しい制限である。局所的に骨においてＢＭＰｓの産生を刺激する可能性のある薬剤を同定する方法を提供することによって、公知の骨形成剤に存する固有の制限を克服することが本発明の目的である。従来の技術ＢＭＰ−5遺伝子の5'-フランキング領域小断片の配列データが公表されている（Ｃhen et al,1993;Ｋurihara et al,1993）が、プロモーターは以前は機能的に同定又は単離されてはいなかった。発明の開示骨の成長を刺激する化合物を同定及び評価する細胞を基にしたアッセイ技術は提供されており、それは当該アッセイ産物の発現を許容する条件下でアッセイ産物をコードするレポーター遺伝子に有効に連結した、少なくとも１つの骨形成タンパク質のプロモーター領域をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞系を培養すること、培養細胞系を骨形成活性を有する可能性がある少なくとも１つの化合物と接触させること、及び、レポーター遺伝子の発現を制御しそれによってアッセイ産物の産生を増加させるその能力により骨形成剤を同定することを含むものである。本アッセイ技術は、特異的に骨細胞を刺激し骨形成タンパク質ファミリーの中の骨成長因子を産生する骨形成剤を同定する。これら骨形成剤は、ＢＭＰファミリー及び例えば骨細胞によって通常産生される他の骨成長因子関連遺伝子のプロモーターの活性を増加させる能力を示す。本発明に従って、少なくとも１つの骨形成タンパク質のプロモーター領域をコードするＤＮＡ配列と、アッセイ産物をコードするレポーター遺伝子に有効に連結されたプロモーター配列を含む発現ベクターを含む骨形成剤を同定するシステムと、骨形成化合物への接触に応答して産生されるアッセイ産物を検出する手段もまた提供される。図面の簡単な説明図１Ａは、マウスグノムのＢＭＰ-4の制限酵素マップ及び２つの転写産物を模式的に図示している。マウスＢＭＰ−４遺伝子の転写産物ユニットは〜７ｋｂで、２つのコードエキソン（黒四角）及び３つの非コードエキソン、標識されたエキソン１Ａ、１Ｂ及び２を含む。この１９ｋｂクローンは〜６ｋｂの5'フランキング領域と〜７ｋｂ3'フランキング領域を持っている。この図はおよそ2.4kbの5 'フランキング領域と、3'フランキング小領域を示す。下のパネルは２つのオールタネーティブなＢＭＰ-4の転写産物を示す。どちらも、同じエキソン２，３と異なるエキソン１を持つ。転写産物Ａはエキソン１Ａを持ち、転写産物Ｂは、ＦＲＣ細胞におけるＲＴ-ＰＣＲ及びプライマー伸長によって推定されるエキソン１Ｂを有する。図１Ｂは、マウスゲノムのＢＭＰ−４（配列ＩＤＮＯ.1）の選択された一部分のＤＮＡ配列及び同定されたコードしているエキソン（配列ＩＤＮＯ.2）の予想されるアミノ酸配列を図示している。右にある数字は核酸配列の位置を示し、太字の数字はコード領域のアミノ酸配列の配置を指し示す。コード配列のほとんどはエキソン４の中にある。転写産物ユニットの末端は1.8kb転写産物に基づいて推測された。エキソン１Ａにあるプライマー１は、ＲＴ-ＰＣＲ解析においてエキソン３にあるプライマー３と用いられた。エキソン１Ｂにあるプライマー２は、ＲＴ-ＰＣＲ解析においてプライマー３と用いられた。プライマーＢ１及びプライマーＢ２はプライマー伸長反応において用いられた。図１Ｃは、ＢＭＰ−４のエキソン１Ａの5'フランキング領域及びマウスＢＭＰ −４の１Ａプロモーター（配列ＩＤＮＯ.3）にある潜在的レスポンスエレメントを描画している。マウスのＢＭＰー4遺伝子の2688bpの配列が示されている。ヌクレオチドは、１Ａプロモーターの主要な転写開始点に対応する左部を+1と番号付けされた。ＤＲー1Ａの近位及びＤＲ-1Ａの遠位ヌクレオチドのレスポンスエレメントが指し示されている。四角で囲った他の潜在的レスポンスエレメントは、 p53,ＲＢ(網膜芽細胞腫),ＳＰー1,ＡＰ-1及びＡＰー2である。ＤＮＡ配列+114から +96の上の線によって指し示されているプライマーＡは、エキソン１Ａ含有転写産物のプライマー伸長解析に用いられた。図２はプライマー伸長アッセイの結果を示す。ＦＲＣ細胞から調製した総ＲＮＡ(左枠)及びマウスの胎児9.5日目（右枠）がプライマーＡ又はプライマー２の相補鎖と一緒に用いられた。レーンＡに示された２つの主要な伸長断片、68及び 115bpがプライマーＡから得られた。２つの１Ｂプライマー、プライマーＢ１及びプライマーＢ２もまた、ＦＲＣもマウス胎児総ＲＮＡも鋳型として陰性の結果が得られた。転写産物Ｂはこのアッセイでは検出されなかった。ＲＴ-ＰＣＲにより、転写産物Ｂは検出及び定量することができた。図３Ａは、ＢＭＰ-4遺伝子の1Ａ-3及び1Ｂ-3 ＲＴ-ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の写真描写である。ＲＴ-ＰＣＲは、ＦＲＣ細胞のポリＡ+ ｍＲＮＡを鋳型として用いて２対のプライマーで行った。その産物は、ＤＮＡ核酸配列決定によって証明された。図３Ｂは、ＦＲＣ細胞での１Ａ及び１ＢエキソンでのスプライシングされたＲＴ-ＰＣＲ産物の概略図である。ＲＴ-ＰＣＲは、ＦＲＣ細胞のポリＡ+ ｍＲＮＡを鋳型として用いて２対のプライマーで行った。図は、プライマーがＢＭＰ-4ゲノムＤＮＡのどこに位置するか示す。エキソン１Ａ、エキソン２及びエキソン３の5'領域を含むＲＴ-ＰＣＲ産物がプライマー１及びプライマー３より産生された。プライマー２及びプライマー３は、エキソン1Ｂ-2-3パターンで２つのＲＴ-ＰＣＲ産物がを産生した。エキソン１Ｂは、大きさ的に異種であることが示された。骨細胞では、１Ａプロモーターが優勢に用いられている。図４Ａは、ＦＲＣ細胞における、ＢＭＰ-4 1Ａ 5'-フランキング領域-ＣＡＴプラスミド及びプロモーター活性を提供する。2.6kbのＥcoＲ1とＸbaとの断片、 1.3kbのＰstの断片、０．５ｋｂのＳphＩとＰstとの断片及び0.25kbのＰＣＲ断片をpＢＬＣＡＴに挿入した。黒四角は、非コードエキソン１Ａを示す。ＣＡＴボックスはＣＡＴレポーター遺伝子を表す。値は、pＣＡＴ-2.6セットが100％発現したＣＡＴ活性の百分率を表す。その値は、４つの独立したアッセイの平均を表す。図４Ｂは、図４Ａで確認されるＢＭＰ-4 1Ａ 5'-フランキング領域-ＣＡＴプラスミドをトランスフェクトされたＦＲＣ細胞を用いてのＣＡＴアッセイのオートラジオグラムを提供する。図５はマウスＢＭＰ-2遺伝子-2736から+139までの5'フランキング領域の核酸配列(配列ＩＤＮＯ.4)を描画している。図６Ａは、８％変性尿素ポリアクリルアミドゲルから分離したＢＭＰ2遺伝子の転写開始位置の決定のためのプライマー伸長アッセイの産物のオートラジオグラムを図示し、図中レーン１は、ラット胎児頭頂骨骨芽細胞の総ＲＮＡで、レーン２は、10μｇの酵母tＲＮＡでの対照のレーンである。全てのＲＮＡサンプルは、図６に示すように、マウスＢＭＰ2遺伝子のエキソン１から³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドでプライムされた。レーンＭは、³²Ｐ標識ＭspＩ消化λファージＤＮＡで、623bpから15bpまで掛かっている(spanning)ＤＮＡ断片を含んでいる(サイズマーカー)。図６Ｂは、プライマー伸長アッセイの概略図を提供する。用いられたプライマーは、18merの合成オリゴヌクレオチド、5'-ＣＣＣＧＧＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧ-3'(配列ＩＤＮＯ.5)である。図７は、選択されたＢＭＰ-2プロモーター-ルシフェラーゼレポーターの構築物の図を提供する。ＢＭＰ-2の5'-フランキング配列は斜線部四角（□）及びルシフェラーゼcＤＮＡは塗四角（■）で図示した。+114塩基は全ての構築物におけるＢＭＰ-2の3'末端を意味する。図８は、ラット胎児の頭頂骨骨芽細胞(Ａ)、ＨeＬa細胞(Ｂ)及びＲＯＳ17/2.8 骨芽細胞にトランスフェクトされたＢＭＰ-2遺伝子-ルシフェラーゼ構築物（図７参照）のルシフェラーゼ酵素活性を示す。ルシフェラーゼ活性は、細胞溶解液中のβガラクトシダーゼ活性により正規化された。図９Ａ-Ｆは、マウスＢＭＰ-2プロモーター及び遺伝子（配列ＩＤＮＯ.6）を示す。図10Ａ-Ｄは、マウスＢＭＰ-4プロモーター及び遺伝子（配列ＩＤＮＯ.7）を示す。図11は、ＢＭＰ-25'フランキング領域の配列を示す。好ましい形態についての詳細な説明骨の成長を刺激する化合物を同定及び評価する細胞系を基にしたアッセイ技術が提供され、これは当該アッセイ産物の発現を許容する条件下でアッセイ産物をコードするレポーター遺伝子に有効に連結した、少なくとも１つの骨形成タンパク質のプロモーター領域をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞系を培養すること、培養細胞系と骨形成活性を有する可能性がある少なくとも１つの化合物とを接触させること、及び、レポーター遺伝子の発現を制御しそれによってアッセイ産物の産生をその増加させる能力により骨形成剤を同定することを含むものである。本発明は、骨細胞を刺激して骨形成タンパク質(ＢＭＰ)ファミリーの中の骨成長因子を産生する化学物質、薬剤、因子、又は他の物質（以下、「骨形成剤」と称する。）を特異的に同定するので、他の骨活性化合物を同定する他の技術から特徴的に区別される。ＢＭＰファミリーの一員、並びに骨細胞及び軟骨細胞、腫瘍細胞及び前立腺細胞を含む他の細胞によって通常産生される他の骨成長因子の遺伝子のプロモーターの活性を増加させる能力によって、これら骨形成薬剤は同定される。患者がそのような化学物質で処置されたとき、適切なＢＭＰは、骨細胞によって産生され、その後骨で局所的に利用され、骨増殖又は骨治療を増強する。本アッセイ技術によって同定される当該化合物は、骨粗鬆症、分節性骨欠損、骨折修復、人工骨固定化又は骨減少に関する様々な病気の治療のために利用される。骨又は軟骨における骨形成タンパク質の発現を抑制する化合物もまた、骨芽細胞の腫瘍転移や他の原因による骨硬化症のような病気でおきる過度な骨形成の状態の治療において有用である。そのような化合物は、本発明に従って同定されることができる。少なくとも１つの骨形成タンパク質をコードするプロモーター領域の単離されたＤＮＡ配列、アッセイタンパク質をコードしているレポーター遺伝子に有効に連結した当該プロモーターを含む発現ベクターを含む骨形成剤を同定するシステム、及び骨形成化合物への接触に応答して産生されるアッセイ産物を検出する手段もまた本発明に従って提供される。ＢＭＰ-4及びＢＭＰ-2に対する遺伝子のプロモーターは、例えばホタルルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子に連結させることができる複合体プロモーターである。これらハイブリッド遺伝子（例えば、骨細胞ＢＭＰ-4プロモーター又は骨細胞ＢＭＰ-2プロモーター並びにホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)cＤＮＡ、又は例えばβ-ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレセンタンパク質、ヒト成長因子、アルカリフォスファターゼ、βグルクロニダーゼ及びその類似物のような他のレポーター遺伝子のcＤＮＡ）は、骨細胞にトランスフェクトされると、ＢＭＰ-4又はＢＭＰ-2プロモーターを活性化する骨形成剤は、その剤と一緒に培養した細胞からの細胞溶解液中のインビトロでのルシフェラーゼ活性を高める能力によって、同定することができる。ＢＭＰ-4遺伝子の5'-フランキング領域小断片の配列データは既に公開されている(Ｃhen et al,1993;Ｋurihara et al,1993)が、プロモーターはまだ同定、単離されておらず、転写を制御する方法は示されていない。本発明は、ＢＭＰ遺伝子のプロモーターを単離し、培養骨細胞の中でこれらプロモーターを利用し、骨で局所的にＢＭＰ-2又はＢＭＰ-4の産生を特異的に増加させる薬剤を同定することができる。ＢＭＰsは、骨細胞によって産生されることが知られているので、骨で特異的にそれら産生物を増強する方法は全身性の毒性を回避する。この恩恵は、ここで提供されるＢＭＰに対する独特の組織特異的プロモーターを利用することよって、更に骨細胞においてその活性を増強する薬剤を同定するためのこれら遺伝子プロモーターを用いることによって得られる。ここに提供される開示情報を利用することによって、他のプロモーターが、例えばＢＭＰ-3,ＢＭＰ-5,ＢＭＰ-6及びＢＭＰ-7のような更なる骨形成タンパク質から得られることができ、ここでに特に記載されるプロモーターと同程度の恩恵を与える。更に、本発明は骨芽細胞における更なる成長因子からのプロモーターの使用を意図させる。線維芽細胞成長因子(例えばＦＧＦ-1,ＦＧＦ-2及びＦＧＦ-7)、腫瘍成長因子β-1，β-2,及びβ-3、インシュリン様成長因子-1、インシュリン様成長因子-2、血小板由来成長因子と同様に更なる骨形成タンパク質が含まれる。そのようなプロモーターは、本発明において容易に用いられ、同等の恩恵を与えるはずである。本発明において用いることができる細胞は、胎児ラットの頭頂骨骨芽細胞の初代培養、商業的に利用されている株化骨細胞系(ＭＣ3Ｔ3-Ｅ1細胞、ＭＧ-63細胞、Ｕ2ＯＳ細胞、ＵＭＲ106細胞、ＲＯＳ17/2.8細胞、ＳaＯS2細胞及びアメリカンタイプカルチャーコレクション(ＡＴＣＣ)からのカタログにおいて提供されるそのような細胞)、及びトランスジェニックマウスから株化された骨細胞系を、存在するベクター及びシステムのための宿主として供することができる他の細胞系も同様に含む。更に、多くの腫瘍細胞系は、ヒトガン細胞系ＨeＬaと同様に、前立腺ガン細胞系ＰＣ3、ＬＮＣＡＰ及びＤＵＩ145を含むＢＭＰsを同様に発現する。故に、多くの細胞系の幾つかは、本発明において利用され、適当な細胞系の選択が特定の実施形態のための選択に重要である。下記の実施例は、本発明のより好ましい実例及び実施形態を説明するが、その範囲を制限するように解釈されるものではない。実験以下の実験の説明において、下記の略語が適用される； eq(等価);Ｍ(モーラー);μＭ(マイクロモーラー);Ｎ(正常);mol(モル);mmol(ミリモル);μmol(マイクロモル);nmol（ナノモル）;kg(キログラム);gm(グラム);m g(ミリグラム);μg(マイクログラム);ng(ナノグラム);Ｌ(リットル);ml(ミリリットル);μl(マイクロリッター);vol(容量);及び℃(摂氏度)。実施例１：マウスＢＭＰ-4遺伝子プロモーターの説明及び特徴（ａ）ライブラリースクリーニング、マウスＢＭＰ-4遺伝子プロモーターのクローン化及び配列決定Ｄr．Ｂ.Ｌ.ＮＨogan(Ｖenderbilt Ｕniversity school of Ｍedicine，Ｎashv ille，ＴＮ)によって提供されたマウスケノムのラムダfix ＩＩ脾臓ライブラリー(Ｓtratagene,Ｌa Ｊolla,ＣＡ)をマウス胎児ＢＭＰ-4cＤＮＡでスクリーニングした。プローブは、Ｂoehringer-Ｍannheim社(Ｉndianapolis,ＩＮ)のランダムプライマー標識キットを用いて、[α-³²Ｐ]dＣＴＰで標識した。フィルターに残ったプラークを一昼夜、6×ＳＳＣ,5×Ｄenhardt's，0.5％ＳＤＳを含有した2 00μg/mlの超音波処理サケ精子ＤＮＡ，10μg/ml polyＡ及び10μg/ml t-ＲＮＡで68℃下ハイブリダイズさせた。そのフィルターを55℃で20分間、2×ＳＳＣ,0. 1％ＳＤＳ緩衝液で２回、0.5×ＳＳＣ,0.1％ＳＤＳ緩衝液で１回洗浄した。単離したファージＤＮＡクローンを標準法(Ｓambrook et al．1989)に従って解析した。陽性クローンからの断片をpＢluescriptベクター(Ｓtratagene,Ｌa Ｊolla,ＣＡ)にサブクローン化して、シーケンスジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーションシーケンシングキット(Ｕ.Ｓ.Ｂiochemical社.，cleveland，ＯＨ)を用いて両方向から配列決定した。マウス胎児ＢＭＰ-4cＤＮＡのプローブ(Ｂ．Ｈogan，Ｖanderbilt Ｕniversit y，Ｎashville，ＴＮ)のコード領域全長を用いて、マウス脾臓の129のゲノムライブラリーの2×10⁶プラークから３つのクローンを単離した。図１に示すように、１つの19kbクローンは、５つのエキソンと〜6kbの5'-フランキング領域と〜7k bの3'-フランキング領域を含んでいた。マウスＢＭＰ-4遺伝子の7kbの転写ユニットと5'-フランキング領域を配列決定した（図１０）。マウスＢＭＰ-4の選択部分の核酸配列とコード領域のエキソン(408残基；配列ＩＤＮＯ.2)の推定されるアミノ酸配列を図１Ｂに示す。下記のＲＴ-ＰＣＲ実験に用いられたプライマーは、この図の中に示されている。図１は、2372bpの5'フランキング領域、及びエキソン１Ａの上流のＤＮＡ応答エレメントを示す。プライマー伸長に用いたプライマーもまた、図１Ｂ及び１Ｃに示される。（ｂ）マウスＢＭＰ-4遺伝子の転写開始部位のプライマー伸長マッピング転写開始部位は、エキソン１Ａの中のヌクレオチド+114から+96の相補鎖に対応する合成オリゴヌクレオチドプライマーＡ5'-ＣＧＧＡＴＧＣＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡ-3'(配列ＩＤＮＯ.8)、及びエキソン１Ｂの中のヌクレオチド+30から+13の相補鎖に対応する合成オリゴヌクレオチドプライマーＢ１ 5'-ＣＴＡＣＡＡＡＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧ-3'(配列ＩＤＮＯ.9)を用いてプライマー伸長反応によってマッピングされた。胎児ラット頭頂骨(ＦＲＣ)細胞及び9.5日齢マウス胎児(Ｂ．Ｈorgan，Ｖanderbilt大学からの提供)からの総ＲＮＡを両プライマーと一緒に用いた。プライマー伸長アッセイはＰromega(Ｍadison,ＷＩ)からのプライマー伸長キットを用いて行われた。しかしながら、アニーリング反応は60℃湯浴中１時間行った。産物を8％変性尿素ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフを撮った。エキソンＢ１の核酸配列+69から+52の相補鎖に対応する、もう１つのプライマーＢ２ 5'-ＣＣＣＧＧＣＡＣＧＡＡＡＧＧＡＧＡＣ-3'(配列ＩＤＮＯ.10)もまた、ＦＲＣ及びマウス胎児ＲＮＡsでプライマー伸長反応に用いた。１.ＢＭＰ-4遺伝子のオールタネートなエキソン１配列の使用の証明幾つかのＢＭＰ-4c ＤＮＡを前立腺ガン細胞及び初代ＦＲＣ細胞から配列決定された。４つの独立したＦＲＣ細胞ＢＭＰ-4cＤＮＡは、すべてエキソン１Ａを含んでいた。しかしながら、ヒト前立腺腫瘍細胞株(ＰＣ-3)cＤＮＡは、エキソン２(Ｃhen et al，1993)がスプライスされた明らかに独特なエキソン１Ｂ配列を含んでいた。エキソン１Ｂに対する２本鎖オリゴヌクレオチドプローブをヒトＰＣ-3エキソン１Ｂ配列に基づいて合成した。このエキソン１ＢプローブはマウスゲノムＢＭＰ-4クローンにおけるエキソン１Ｂ領域を同定するために用いた。エキソン１Ｂ候補はエキソン１Ａの3'末端から1696bp下流である。２.プライマー伸長反応プライマー伸長反応を行い、マウスＢＭＰ-4遺伝子転写開始点をマッピングした。プライマーＡ、エキソン１Ａからのオリゴヌクレオチド及びエキソン１Ｂからの２つのオリゴヌクレオチドを用いた。総ＲＮＡは、マウス胎児及びＦＲＣ両方からのものを用いた。図２に示すように、プライマーからの主要な伸長断片がマウス胎児及びＦＲＣ両方の総ＲＮＡにおいて得られ、それは115bpの位置に移動していた。115bpの伸長した5'末端は、１Ａ含有転写産物の主要な転写開始点を示した。このプライマーＢ１の5'非コードエキソンの大きさは306bpである。プライマーＢ１(エキソン１Ｂ)の相補鎖からの主要な伸長断片は、マウス胎児及びＦＲＣ両方の総ＲＮＡsを用いては検出されなかった。エキソン１Ｂからのもう一つのプライマーもまた陰性の結果であり、9.5日齢マウス胎児及びＦＲＣ細胞において、エキソン１Ｂ-含有の転写産物は検出されないことが示唆され、これらの細胞ではエキソン１Ｂ含有転写産物がエキソン１Ａ含有の転写産物よりも、量的に十分でないことが示唆される。全てのプライマー伸長が、高い条件(hig h stringency)でのプライマーのアニーリング後行われた。１Ｂプライマーとの低い条件でのアニーリングは、ＢＭＰ-4ｍＲＮＡに対応しない伸長産物が産生した。（Ｃ）エキソン１Ａ及び１Ｂ転写産物のためのＢＭＰ-4遺伝子5'フランキング領域４つのＦＲＣＭＰ-4 cＤＮＡが配列決定され、エキソン２をスプライスしたエキソン１Ａ配列を含んでいることが分かった。ヒトＵ2ＯＳＢＭＰ-4cＤＮＡ配列もまた、エキソン１Ａ(Ｗozney et al,1988)を含んでいる。これは、エキソン１ＡのＢＭＰ-4遺伝子配列上流が骨細胞において主に用いられることを示唆する。ＢＭＰ-4 １Ｂプロモーターが、ＦＲＣ細胞においてすべて用いられていることを調べるために、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインして、スプライスされた1Ｂ-2-3エキソン産物及び1Ａ-2-3 エキソン(対照)産物が、ＦＲＣpoly(Ａ⁺)-ＲＮＡを用いた更に感度がよいＲＴ- ＰＣＲ技術によって得られるかどうか確かめた。3'プライマーは、エキソン３にあり（図１Ｂ-プライマー3）、5'プライマーは、エキソン１Ａ（プライマー1）かエキソン１Ｂ（プライマー2）にある。ＲＴ-ＰＣＲ産物をクローン化及び配列決定した。得られた産物の写真及び図は、図３Ａ及びＢに図示されている。1Ａ-2-3及び1Ｂ-2-3の両方の産物が得られた。その結果は、ＦＲＣ骨芽細胞は転写産物を１Ａエキソン又は１Ｂエキソンで産生し、両方では産生しないことが示唆される。これは、１Ａと１Ｂのエキソンの間のイントロン領域がある条件下での制御応答エレメントを含んでいることを示唆する。ＦＲＣ骨芽細胞から得られた1Ｂ-2-3ＲＴ-ＰＣＲ産物には、２つの産物が、エキソン１Ｂのための異なった3'スプライス部位を用いて得られた。そのゲノムＤＮＡとの比較により、その２つのエキソン１Ｂsの両方3'末端は、1Ａ-1 Ｂ-2-3ＲＴ-ＰＣＲ産物から得られたオールタネーティブなスプライシングパターンからなる適切な5'スプライスの共通配列を持っている。最も重要なことに、ＢＭＰ-4遺伝子の1Ａ-1Ｂ-2-3 ＲＴ-ＰＣＲスプライシング産物は得られなかった。故に、１Ｂは、オールタネーティブにスプライスされた5'-非コードエキソンでないことは明らかである。定量的なＲＴ-ＰＣＲにより、１Ａ転写産物は、初代骨細胞において、更に10から15×の量であることが示された。ＲＴ-ＰＣＲを実施する技術を述べる。総容量20μｌ中、Ｓuperscript^TM逆転写酵素(Ｇibco ＢＲＬ)を用いて、18merのdＴプライマーで１μｇＦＲＣ細胞pol y(Ａ⁺)-ＲＮＡから、１本鎖cＤＮＡを合成した。そのcＤＮＡを２セットの合成ＤＮＡでのＰＣＲの鋳型として用いた。図１Ｂに示すように、エキソン１Ａの3' 領域の相当するプライマー1(5'-ＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧ-3')(配列ＩＤＮＯ.11)とエキソン３の5'領域の相当するプライマー3(5'-ＣＣＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡＴＣＡ-3')(配列ＩＤＮＯ.12)とが用いられ、エキソン1Ａ-2- 3のスプライスされたＰＣＲ産物を産生した。エキソン１Ｂの3'領域の相当するプライマー2(5'-ＣＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣ-3')(配列ＩＤＮＯ.13) とプライマー３とが用いられ、エキソン1Ｂ-2-3のスプライスされたＰＣＲ産物を産生した。ＧeneＡmpＰＣＲキットを、製品手順(Ｐerkin-Ｅlmer/Ｃetus,Ｎor walk,ＣＴ)に従い使用した。各サイクルは、変性ステップ(94℃１分間)、アニーリングステップ（59℃ ２分間）及び伸長ステップ (72℃ １分間)からなる。ＰＣＲ産物を大きさの判定のために、アガロースゲル電気泳動にて解析した。その産物をＴＡクローニングキット(ＩnＶitrogen，Ｓa n Ｄiego，ＣＡ)を用いてpＣＲ IIベクターにサブクローン化した。挿入物をＵ. Ｓ.Ｂiochemical(Ｃleveland,ＯＨ)製のシーケンシングキットで両方向から配列決定した。骨細胞が分化中のＦＲＣ細胞において検出された1.8kb ＢＭＰ-4転写産物が純粋な１Ａエキソンプローブ及び2-4エキソンプローブにハイブリダイズすることをノーザン解析は示している。2-4のシグナルに対する１Ａの割合はＢＭＰ-4の変化レベルを通して一定である。１Ｂエキソンプローブを用いてのＢＭＰ-4エキソン2-41.8kbシグナルに対するハイブリダイゼーションは検出されなかった。これはまた、１Ｂ転写産物は更に感度が良いＰＣＲ法では検出することができるが、転写産物を含む１Ａは骨細胞において優性であることを示している。定量的ＰＣＲを行うことによって、１Ａ転写産物がＦＲＣ細胞において、１Ｂよりも10-1 5×更に多いことが示された。（ｄ）ＢＭＰ-4プロモーター１Ａプラスミド構築及びトランスフェクション、及び骨芽細胞におけるプロモーター活性の検出３つのＢＭＰ-4 １Ａプロモーター／プラスミドを、マウスＢＭＰ-4遺伝子の5'フランキング領域から断片を切り取り、pＢＬ3ＣＡＴ発現ベクター(Ｌuckow and Ｓchutz，1987)にクローニングすることによって構築した。pＣＡＴ-2.6プラスミドは、ＢＭＰ-4遺伝子の2.6kb のＥcoＲＩ及びＸbaＩフラグメントを有したpＢＬＣＡＴ3ベクターである。pＣＡＴ-1.3プラスミドが、同様に1.3kbＰst断片(-1144/+212)から産生された。pＣＡＴ-0.5プラスミドは、0.5kb ＳphＩ及びＰstの断片(-260/+212)から作られた。pＣＡＴ-1.3及びpＣＡＴ-0.5プラスミドは、212bpのエキソン１Ａ非コード領域を有する。追加のプロモーター／プラスミドは、ヌクレオチド-25と+212の間の240bpに相当するＰＣＲ増殖産物から構築し、pＣＡＴ-0.24とした。増殖した断片を、最初ＴＡクローニングキットを用いてpＣＲIIベクターに挿入し、次にその断片をＨindIIIとＸhoＩで切り離し、pＢＬ3ＣＡＴに再結合した。ＣＡＴベクターに関して、全ての挿入物の正規オリエンテーションはＤＮＡ配列決定により確認された。一過性のトランスフェクション研究のために用いられる細胞は、Ｂellows等(1 986)とＨarris等(1994)に記載されているように、19日齢胎児ラット頭頂骨からトリプシンとコラーゲンでの連続消化によって単離された。要約すれば、頭頂骨の骨を外科的に取り出し、10％(Ｖ/Ｖ )のウシ胎児血清(ＦＣＳ)及び抗生物質含有の最小基本培地で洗浄することによって綺麗にした。骨は、ハサミで刻み、5mlの滅菌されたバクテリアのコラゲナーゼ(0.1％)とトリプシン(0.05％)を含んだ35mm組織培養皿に移植した。次に、これを37℃で20分間培養した。この時遊離した細胞を収集し、素早く等量のＦＣＳを混合してトリプシンを不活性化した。この方法を６回繰り返し、20分毎に細胞を遊離させた。３番目、４番目、５番目及び６番目の消化物(骨芽細胞が豊富) から遊離された細胞を混ぜ合わせ、その細胞を400×ｇで５分間遠心分離して収集した。その細胞を10％ＦＣＳ及び抗生物質含有のαＭＥＭの中に置き、コンフルエンスになるまで成長させた(2-3日)。この段階で、細胞をディッシュ当たり5 ×10⁵細胞の細胞密度になるように60mm組織培養ディッシュに移した。これらの初代骨芽細胞が、持続培養で骨様構造に自己形成できる(Ｂellows et al,1986; Ｈarris et al,1994)。ＨeＬa,ＲＯＳ17/2.8,及びＣＶ-1細胞は、ＡＴＣＣから販売されている。単離したＦＲＣ細胞は、骨芽細胞の表現型に富んでおり、一過性トランスフェクションアッセイのための受容細胞として用いられた。ＢＭＰ-4mＲＮＡは、持続培養中一過性の様式でこれらの細胞内で調節される(Ｈarris et al，1994b)。エレクトロポレーションの技術をＤＮＡトランスフェクションのために用いた( Ｐotter，1988；van den Ｈoff et al，1992)。エレクトロポレーションの後、細胞を等分し、直径100mm培養皿に置き、48時間10％ウシ胎児血清含有修飾イーグル最小基本培地(ＭＥＭ,ＧＩＢＣＯ,Ｇrand Ｉsland,ＮＹ)培養した。その抽出液は、Ｇormaによって開示された方法に従ってＣＡＴ活性のためにアッセイされ、そしてＣＡＴ活性は、Ｒouet等の方法に従ったβ-ガラクトシダーゼアッセイによって正規化された。様々なＢＭＰ-4-ＣＡＴレポーター遺伝子プラスミド構築物でのトランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、ＣＡＴ活性を測定した。図４Ａ及び４Ｂに示すように、pＣＡＴ-0.24プラスミド（-25/+212)はわずかな活性しかない。このプラスミドは、-25から+212の5'非コード領域エキソン１Ａを含み、親のpＢＬ3ＣＡＴプラスミドより３倍低かった。pＣＡＴ-0.5(-260/+212)、pＣＡＴ-1.3 (-1144/+212)、及びpＣＡＴ-2.6(-2372/+258)は、ＦＲＣ細胞にトランスフェクトされたとき、著しく増加したＣＡＴ活性を示した。これらのデータを図４に示す。pＣＡＴ-0.5(-260/+212)では、pＣＡＴ-0.24(-25/+212) に比較して、ＣＡＴ活性で１０倍増加した。pＣＡＴ-1.3(-1144/+212)は更に６倍の増加を示し、pＣＡＴ-2.6(-2372/+258)はpＣＡＴ-1.3よりも更に２倍の変化を示した。こうして、ＦＲＣ細胞におけるpＣＡＴ-0.24とpＣＡＴ-2.6の間でのＣＡＴ活性の正味の増加はおおよそ100倍である。実施例２．：マウスＢＭＰ-2遺伝子プロモーターの詳述及び特徴（ａ）マウスＢＭＰ-2ゲノムＤＮＡのクローン化マウスＢＭＰ-2遺伝子のゲノムのクローンを、初代骨芽細胞におけるＢＭＰ-2 遺伝子の転写制御測定のために単離した。5×10⁶プラークを、マウスゲノムライブラリーＢ6/ＣＢＡ(Ｓtratagene,Ｓan Ｄiego，ＣＡから販売されている。)から、プローブとしてＢＭＰ-2cＤＡＮを用いてスクリーニングした。ＢＭＰ-2 c ＤＮＡクローンを、ＰＣ3前立腺ガン細胞(Ｈarris et al，1994)のcＤＮＡライブラリーから単離した。ヒトＢＭＰ-2プローブは、コード領域のほとんどを含む 1.1kbのＳmaＩ断片のである。ＢＭＰ-2ゲノム遺伝子クローンを、デオキシアデノシン5'[α[³⁵Ｓ]チオ]トリフォスフェート及びシーケネースを用いてジデオキシチェーンターミネーション法(Ｓanger et al,1977)で配列決定した。すべての断片は、少なくとも２度配列決定し、重複部は適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて確定した。プライマーは、Ａpplied Ｂiosystems社のモデル392ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した。３つのＢＭＰ-2遺伝子のうちの１つであるおよそ16kbは、完全に配列決定した(図９)。この配列の解析により、マウスＢＭＰ-2遺伝子は１つの非コード領域及び２つのコード領域のエキソン(Ｆeng et al,199４)を含むことが示された。5'フランキング配列の解析は、ＢＭＰ-2遺伝子が典型的なＴＡＴＡ又はＣＡＡＴボックスを含まないことを示した。しかしながら、多くの推定されるレスポンスエレメント及び転写因子認識配列は、エキソン１の上流で確認された。5' -フランキング領域は、幾つかのＳＰ-1、ＡＰ-1、Ｐ53、Ｅ-ＢＯＸ、ホメオボックス及びＡＰ-2候補のＤＮＡ結合因子などＧＣに富んでいる。（ｂ）ＢＭＰ-2遺伝子の転写開始点の解析ＢＭＰ-2遺伝子の転写開始点を、プライマー伸長法によって同定した。プライマー伸長は(Ｈall et al.，1993)に従って行った。用いたプライマーは、³²Ｐ- 標識の18merオリゴヌクレオチド5'-ＣＣＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧ-3'(配列ＩＤＮＯ.5)である。初代胎児ラット頭頂骨骨芽細胞から得られた総ＲＮＡをプライマー伸長反応に用いた。その結果を図６に示す。主要な伸長産物は68bpであり、それが主要な転写開始点(+1、図５)と推測された。これらの結果は、Ｒna seプロテクションアッセイによって確認された。（Ｃ）ルシフェラーゼ(ＬＵＣ)レポーター遺伝子構築物を用いたＢＭＰ-2プロモーター及びエンハンサー活性の同定ＢＭＰ-2-ＬＵＣ構築物(図７)を、ＢＭＰ-2の5'フランキング領域から転写開始点にかけての様々な5'境界を含むように設計した。各構築物は、エキソン１における+114での3'の境界を含む。これらの構築物は、独立して、ラット胎児頭頂骨骨芽細胞の初代培養細胞、ＲＯＳ17/2.8骨芽細胞、ＨeＬa細胞及びＣＶ-1細胞にカルシウムリン酸沈降法によってトランスフェクトし、構築物の各々に対するプロモーター活性を、トランスフェクションの24時間後に各々の細胞溶解液に対するルシフェラーゼ酵素活性を測定することによりアッセイした。ＬＵＣ(ルシフェラーゼ酵素アッセイ)技術は下記(f)に述べる。プラスミドcＳＶ β Ｇalを各々のプラスミド構築物に共トランスフェクトし、それぞれのサンプルにおけるトランスフェクションの効率を正規化した。実験は、独立した胎児ラット頭頂骨細胞で少なくとも５回繰り返され、それぞれの細胞は３回アッセイした。代表的な実験からの平均値を図８に示す。（ｄ）ＢＭＰ-2遺伝子プロモータの機能的研究のための初代胎児ラット頭頂骨骨芽細胞の単離一過性のトランスフェクション研究のために用いる細胞を、Ｂellow等'(1986) 及びＨarris等(1994)に従って、トリプシンとコラーゲンでの連続的な消化によって、19日齢胎児ラット頭頂骨から単離した。要約すれば、頭頂骨の骨を外科的に取り出し、10％(Ｖ/Ｖ)のウシ胎児血清(ＦＣＳ)及び抗生物質含有の最小基本培地で洗浄することによって綺麗にした。骨は、ハサミで刻み、5mlの滅菌されたバクテリアのコラゲナーゼ(0.1％)とトリプシン(0.05％)を含んだ35mm組織培養皿に移植した。そうして、これを 37℃で20分間培養した。この時遊離した細胞を収集し、素早く等量のＦＣＳを混合してトリプシンを不活性化した。この方法を６回繰り返し、２０分毎に細胞を遊離させた。３番目、４番目、５番目及び６番目の消化物(骨芽細胞が豊富)から遊離された細胞を混ぜ合わせ、その細胞を400×ｇで５分間遠心分離して収集した。その細胞を10％ＦＣＳ及び抗生物質含有のαＭＥＭの中に置き、コンフルエンスになるまで成長させた(2-3日)。この段階で、細胞をディッシュ当たり5×10⁵ 細胞の細胞密度になるように60mm組織培養ディッシュに移した。これらの初代骨芽細胞が、持続培養で骨様構造に自己形成できる(Ｂellows et al,1986;Ｈarr is et al,1994)。ＨeＬa，ＲＯＳ17/2.8,及びＣＶ-1細胞はＡＴＣＣから販売されている。（ｅ）一過性のトランスフェクションアッセイ一過性のトランスフェクションアッセイのために、初代骨芽細胞を上記に述べた細胞密度でトランスフェクション前18-24時間静置した。トランスフェクションは、変形カルシウムリン酸沈降法（Ｇraham ＆ van der Ｅb 1973;Ｆrost ＆Ｗillians 1978）を用いて行った。細胞は、４時間37℃下、0.15ＭＣaＣl₂及びＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水(21mＭＨepes，13.5mＭＮaＣl，5mＭＫＣl，0.7m ＭＮa₂ＨＰＯ4，5.5ｍＭデキストロース，pＨ 7.05-7.1)中に10μｇのレポータープラスミド構築物と１μｇのｐＳＶ β Ｇal(トランスフェクション効率の正規化のため)を含む500μlのプラスミドＤＮＡのカルシウムリン酸沈降物存在下で培養した。沈降物存在下細胞を４時間培養後、細胞をインシュリン、トランスフェリン及びセレン(ＩＴＳ)含有の更なる新鮮なα ＭＥＭを添加後、２分間α ＭＥＭ中の15％グリセロールにて処理した。細胞はトランスフェクション２４時間後回収した。（ｆ）ルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼアッセイ細胞溶解液を調製して、ルシフェラーゼ酵素アッセイを、Ｐroｍega社(Ｍadis on，ＷＩ)のアッセイプロトコル及びアッセイキットを用いて行った。通常、20 μlの細胞溶解液と100μlのルシフェラーゼアッセイ試薬(270μＭ補酵素Ａ、470 μＭルシフェリン及び530μＭＡＴＰ)を混合し、ルシフェラーゼ活性を10秒間ＴＵＲＮＥＲＴＤ-20eルミノメーターで測定した。値は、各々の実験サンプルで得られた、βガラクトシダーゼ酵素活性によって正規化した。 βガラクトシダーゼ酵素活性は、Ｒouet等(1992)に従って96穴マイクロプレートを用いて細胞溶解液を測定した。10-20μｌ細胞溶解液を、88mＭリン酸緩衝液 pＨ7.3、11mＭＫＣl、1mＭＭgＣl2、55mＭ βメルカプトエタノール、4.4mＭクロロフェノールレッドβ-Ｄ-ガラクトピラノシド(Ｂoehringer-Ｍannheim社，Ｉ ndianapolos，ＩＮ)含有の90-80μｌのβガラクトシダーゼ反応液に添加した。反応混合液を、トランスフェクション効率依存して、37℃下30-60分インキュベートし、サンプルをエライザプレートリーダーで600nmを読みとった。（ｇ）プラスミド構築ルシフェラーゼ基本プラスミド(pＧＬbasic)を、全ての構築物のために用いるベクターとした(Ｐromega社，Ｍadison，ＷＩから購入)。ＢＭＰ-25'フランキング領域からのＤＮＡ断片の異なった長さを、このプラスミドのホタルルシフェラーゼcＤＮＡの上流にあるマルチクローニングサイトにクローン化した。ＢＭＰ- 2 ＤＮＡ断片を、利用可能な制限酵素サイト(構築物-196/+114；-876/+114,-199 5/+114,-2483/+114及び-2736/+114)又は、特異的オリゴヌクレオチドプライマー (構築物-23/+114,-123/+114)を用いたポリメレース連鎖反応によって単離した。ＢＭＰ-2遺伝子の最小のプロモーター活性が、転写開始点(-23/+114)の23bp上流を含む最も小さい構築物で同定された。転写開始点(-23/+114)を含まない構築物においては、ルシフェラーゼ活性が無いことが分かった。-196bpまでに5'配列の長くしたものを含む他の２つの構築物は、胎児ラット頭頂骨骨芽細胞及びＨe Ｌa細胞でのプロモーター活性において、再現的に減少を示した（図８）。-876/ +114構築物は、ＨeＬa細胞において、５倍の活性を示した。-1995/+114,-2483/+ 114及び-2736/+114構築物は、ＨeＬa細胞における-876/+114構築物に比較して、低いプロモーター活性を示した（図６）。初代胎児ラット頭頂骨骨芽細胞において、2.6kb構築物(-2483/+114)は、-1995 /+114構築物よりも2-3倍高いルシフェラーゼ活性を示した（図８）。これらの結果は、１又は２以上のポジティブなレスポンス領域が、-196と-1995の間に存在し、-1995と2483の間のＤＮＡ配列は、BMP-2の転写を制御することができるポジティブな制御エレメントを有していることを実証している。最も大きい2.9kb構築物(-2937/+114)は、これら初代胎児ラット頭頂骨骨芽細胞において、-2483/+114構築物と比較して、20-5 0％の低いプロモーター活性を繰り返し示した（図８）。ＲＯＳ17/2.8骨肉腫細胞において、ＢＭＰ-2プロモーター活性は、初代胎児ラット頭頂骨骨芽細胞やＨeＬa細胞よりも、一貫して高かった。ディリーション構築物の全ては、ＲＯＳ 17/2.8細胞において同じプロモーター活性を示した。ＲＯＳ 17/2.8細胞における形質転換状態は、ＢＭＰ-2遺伝子の著しい発現に原因があるのかもしれない。ＲＯＳ 17/2.8細胞は、はっきりと異なる骨肉腫を表現し、それらは、ＢＭＰ-2 mＲＮＡを高い水準産生する。それらは、腫瘍における骨様物質を付着したヌードマウスにおいて腫瘍を形成する（Ｍajeska等，1978; Ｍajeska等,1980）。（ｈ）ＢＭＰ-2プロモーターの特異性ＢＭＰ-2 mＲＮＡを発現しない細胞種におけるＢＭＰ-2プロモーターの活性を解析するために、ＢＭＰ-2プロモーター構築物をＣＶ-1細胞（サル腎臓細胞）にトランスフェクトした。ＢＭＰ-2プロモーター活性は、全ての構築物において、かなり低いことが分かった。このことは、ＢＭＰ-2プロモーターのこの領域が、内在的ＢＭＰ-2m ＲＮＡを発現する初代胎児ラット頭頂骨骨芽細胞、ＨeＬa細胞及びＲＯＳ 17/2.8のような細胞(Ａnderson及びＣoulter 1968)でのみ機能することを示唆する。ＣＶ-1細胞は、ＢＭＰ-2 mＲＮＡを発現しない。ＢＭＰ-2プロモーターは、前立腺細胞及び軟骨細胞のようなＢＭＰ-2を発現する他の細胞種において活性があるらしいが、転写の制御はこれらの細胞では異なっている。実施例３：骨形成剤を同定するレポーター遺伝子を持ったＢＭＰプロモーター含有プラスミド構築物の使用レポーター遺伝子を持ったＢＭＰプロモーター含有のプラスミド構築物を、骨芽細胞にトランスフェクトした。使用した細胞は、初代胎児ラット頭頂骨骨芽細胞、提供された又は商業的に取得した細胞株（ＭＣ3Ｔ#-Ｅ12細胞、ＳaＯＳ2細胞、及びＡＴＣＣのカタログにより提供されるそれ様の細胞）及びトランスジェニックマウスから確立された骨と軟骨細胞株である。その骨細胞を一過性又は安定にプラスミド構築物でトランスフェクトし、48時間試験するために化学物質、剤又は因子に接触させ、そしてルシフェラーゼ又はＣＡＴ活性をその細胞溶解液で測定する。成長因子の発現制御は、10%のウシ胎児血清、1%のペニシリン／ストレプトマイシン及び1%グルタミンを含有したαＭＥＭ培地での骨細胞培養することにより評価した。細胞は、細胞密度5×10³細胞／100μl／wellでマイクロタイタープレートに入れた。細胞は接着させ、37℃５％ＣＯ₂下24時間培養し、培地を取り除き、4%ウシ胎児血清含有の50μlα ＭＥＭと入れ替えた。ＢＳＡ溶液の中に試験する化合物又は因子を含む50μlの分量をそれぞれのウェルの中に添加した。最終容量は100μlであり、最終血清濃度は2%ウシ胎児血清である。チャイニーズハムスター卵巣細胞に発現させた組換えラットＢＭＰ-2をポジティブな対照例として用いた。処置した細胞を37℃５％ＣＯ₂下48時間培養した。培地を取り除き、細胞を３回リン酸緩衝液(ＰＢＳ)ですすいだ。余分なＰＢＳをウェルから除き、100μlの細胞溶解剤(Ｐromega #Ｅ153Ａ)を各々のウェルに添加した。10分後、10μlの細胞溶解液を、100μlの基質（Ｐromega #Ｅ152Ａ）入りのルシフェラーゼアッセイ溶液が入っている96穴白色のルミノメータ用プレート(Ｄynatech Ｌabs #0710 0)に添加した。ルシフェラーゼ活性は、Ｄynatech ＭＬ2250自動96穴ルミノメーターを用いて測定した。データは、ウェル当たりルシフェラーゼ活性のピコグラム又はμgタンパク質当たりルシフェラーゼ活性のピコグラムで出力した。実施例４ＢＭＰプロモーターをトランスフェクトされた骨細胞が、骨形成剤をスクリーニングするために利用されることの実証本発明が、潜在的骨形成剤の評価において有効であることを実証するために、商業的に取得した化学物質ライブラリーからの化合物のランダムアレイ（集合体）をスクリーニングした。ＢＭＰ-2の転写を増強することが知られているポジティブコントロールと比較して、おおよそスクリーニングされた化合物の１００に１つが、本アッセイシステムにおいてポジティブな応答が出された。ランダムライブラリーから同定された化合物は、詳細に容量依存曲線に従い、それらがＢＭＰメッセンジャーＲＮＡ発現を増強させ、例えばオステオカルシン、オステオポンチン及びアルカリフォスフェートを含む構造性タンパク質のような、インビトロで他の生物的効果を増強させ、及び頭頂骨げっし類動物の骨芽細胞の延長させた初代培養における骨結節形成を増強させることを実証した。このようにして同定された化合物は、マウスにおけるインビボでの骨形成を刺激する能力を試験することができる。これを実証するために、その化合物を正常マウスの頭蓋冠上の皮下組織に局所的に注射し、骨の変化を組織学的に追跡した。本発明により同定されたある化合物は、このインビボでのアッセイシステムにおいて新骨の形成を刺激することが分かった。化合物の効果は、4-6週齢で体重1 3-26gのＩＣＲスイスマウスで試験された。20mg/kgの化合物又は溶媒のみ(100μ lの5%ＤＭＳＯ及びリン酸緩衝液0.9%生理食塩水)を、１日に３回、７日間注射した。注射は、５匹のマウスの頭頂骨右側に重なる皮下組織になされた。マウスは、14日後、即ち化合物の最後の注射７日後に、エーテル吸入により殺された。10%のリン酸緩衝液ホルマリン中で固定した後、頭頂骨を試験した。後頭骨を素早く切除により後部に除き、平行にラムダ状縫合し、前頭骨を切除によりメス刃を用いて冠状縫合の前方に除いた。骨を、前頭面にそって２等分して、 3-4mmの骨片を、14% ＥＤＴＡ中脱灰し、特級アルコールで脱水し、パラフィンで固定した。４つの３μmの厚さの乱丁手順の薄片が、各試料から切り取られ、ヘマトキシリン・エオシンを用いて染色された。後部頭頂骨片からの２つの代表的な薄片を用いた。離散化タブレット及び骨測定イメージ解析システム(Ｏsteometrics社、Ａtlanta,ＧＡ）を用いて、各骨の外側縁における矢状縫合と筋進入部との間の骨の標準長における注射及び非注射の頭頂骨の側を組織学的測定を行った。測定は、1) 総骨領域(例えば、骨膜表面の内側と外側の間の骨及び髄質)、2) 外頭頂表面に形成される新網状骨の領域、3) 外頭頂表面に面して占める骨芽細胞の範囲、4) 外側の骨膜の領域、及び 5) 頭頂表面の長さから成る。これらの測定から、新骨と骨膜の厚さの平均及び外頭頂表面の骨芽細胞によって占められる表面の百分率が定量された。上記開示情報及び実施例を参考にすることによって、本発明が提供する骨の成長を刺激する化合物を同定及び評価する新規細胞ベースのアッセイが分かる。骨形成タンパク質遺伝子のプロモーター領域、及び発現ベクターにレポーター遺伝子を有効に連結させたプロモーターを用いての骨形成剤同定のシステムもまた、本発明に従って提供される。本発明は、骨形成タンパク質ファミリーにおける骨成長因子を産生する骨細胞を刺激する骨形成剤を特異的に同定する手段を提供する。これら骨形成剤は、ＢＭＰファミリー及び骨細胞によって正常に産生される他の骨成長因子の一員の遺伝子プロモーターの活性を増強させるのに有効である。実施例５：ＢＭＰ-2 5'フランキング領域の再配列決定実施例２に記載のＢＭＰ-2 5'フランキング領域は、再配列決定された。マウスＢＭＰ-2遺伝子の5'フランキング領域の核酸配列を図１１に提供する。図１１における配列情報は、図５及び９にある配列決定のエラーを修正する。図１１の核酸配列は、図５で提供する塩基-2736から+119と図９で提供する塩基１から+28 55に置き換える。図５に示す非核酸配列情報は、その様な塩基が存在する図１１に相当する塩基に適用できる。それぞれの個々の刊行物又は特許出願が参考により取り込まれように特に個々に指示されかのように、この明細書中に引用されるすべての刊行物及び特許出願は、ここに参考により組み込まれる。先の発明は、明瞭さ及び理解の目的のための図及び実施例により詳細に記述されているが、ある変換や修飾が添付の請求項の精神及び範囲から逸脱しない上でなされることは、本発明の教授の権利における技術の中における通常の技術であることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ゴーシューチャウダリー、ナンディーニアメリカ合衆国、78249 テキサス、サンアントニオ、アスペンパーク 7615 (72)発明者フェン、ジアンキュー. アメリカ合衆国、78240 テキサス、サンアントニオ、ロストブラッフ 10615

Claims

【特許請求の範囲】１．アッセイ産物をコードするレポーター遺伝子に有効に連結した、骨形成タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターを含む発現ベクターを含む、変換された組換え宿主細胞を含むことを特徴とする骨形成剤を同定するシステム。２．当該骨形成タンパク質がＢＭＰ-2及びＢＭＰ-4タンパク質から成る群から選択される請求項１に記載のシステム。３．当該レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレセンタンパク質、ヒト成長ホルモン、アルカリフォスファターゼ及びβ−グルクロニダーゼからなる群から選択されるアッセイ産物をコードする遺伝子を含む請求項１又は２に記載のシステム。４．当該レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ産物をコードする遺伝子を含む請求項３に記載のシステム。５．当該レポーター遺伝子からの当該アッセイ産物の発現を許容する条件下、請求項１−４の何れかに記載の細胞を培養し；当該細胞を骨形成活性を有する可能性のある少なくとも１つの候補化合物と接触させ；当該候補化合物の存在下に産生されるアッセイ産物の量を測定し、及び当該量と当該候補化合物の非存在下に産生されるアッセイ産物の量とを比較し；及び存在するときの当該アッセイ産物の量を増加させる候補化合物を骨形成化合物として同定する；以上のステップを含むことを特徴とする骨形成化合物を同定する方法。６．ＢＭＰ-2及びＢＭＰ-4タンパク質からなる群から選択される骨形成タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域をコードする核酸配列を含むことを特徴とする単離された核酸分子。７．図１Ｃ（配列ＩＤＮＯ:3）に図示されたＢＭＰ-4遺伝子の-2372 から+316部位、生物的に活性なプロモーターをコードするその部位、図１１に図示されたＢＭＰ-2配列、及び生物的に活性なプロモーターをコードするその部位からなる群から選択される核酸配列に対応する請求項６に記載の核酸分子。８．請求項６又は７に記載の核酸配列を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。９．当該核酸配列がアッセイ産物をコードするレポーター遺伝子に有効に連結する請求項８に記載の組換え発現ベクター。１０．当該レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレセンタンパク質、ヒト成長ホルモン、アルカリフォスファターゼ、及びβ-グルクロニダーゼからなる群から選択されるアッセイ産物をコードする遺伝子を含む請求項９に記載の組換え発現ベクター。