JPH11507927A

JPH11507927A - 造血細胞増殖因子拮抗剤及びその利用

Info

Publication number: JPH11507927A
Application number: JP9503469A
Authority: JP
Inventors: バデス，マシュー，アレクサンダー; ロペス，エンジェル，フランシスコ; シャノン，マリー，フランセス; チェア，キー−チー; セン，キャロル，ルース; バスチラス，スタン; ロビンス，アラン
Original assignee: ブレサジェンリミティド; メドベットサイエンスプロプライアタリーリミティド
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1999-07-13
Also published as: EP0871470A1; EP0871470A4; NZ310366A; CA2225517A1; US6322791B1; WO1997000695A1; NZ337791A; AUPN378095A0

Abstract

(57)【要約】本発明は対応の造血細胞増殖因子に対する拮抗剤として有用な造血細胞増殖因子の変異組換形態、並びに天然分子により惹起される異常作用を緩和並びに腫瘍、癌及び炎症を処置するうえでのその利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】造血細胞増殖因子拮抗剤及びその利用本発明は一般に対応の天然造血細胞増殖因子に対する拮抗剤として有用な造血細胞増殖因子の変異組換形態、並びに天然分子により惹起される異常作用の緩和及び腫瘍、癌及び炎症の処置におけるその利用に関する。本明細書において言及するヌクレオチド及びアミノ酸配列についての配列識別番号(SEQ ID NO)は詳細な説明の後に記述してある。本明細書を通じて、何らかのことわりのない限り、「含んで成る」なる用語は記載の要素又は一群の要素を含むが、任意のその他の要素を除外しないものと理解されるであろう。組換DNA工学の急速に進歩する精巧さは産業界における研究及び開発を大幅に促進する。特に医療及び提携健康分野はこの発展し続けている技術から恩恵を受けている。著しく関心のもたれている分野は増殖因子及びサイトカインの分野である。顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)は造血細胞増殖因子(HGF) のファミリーの一の構成員であり、そして一連の重要な活性、例えばアポプトシスとしても知られるプログラミングされた細胞死を抑制することにより正常な白血病性及び造血性細胞の生存の支持を示す。GM−CSFは、インターロイキン（IL ）３及び５にとってのレセプターと共有となっているGM−CSF特異的α鎖及びβ ｃ鎖より成るヘテロダイマーレセプターに結合する。両鎖はGM−CSF媒介シグナル生成のために必要とされる。本明細書に引用することで組入れる1994年７月28日出願の国際特許出願 PCT／ AU94／00432 号には一連のHGF拮抗剤が記載されている。このような拮抗剤の所定の形態又はタイプは、HGFレセプターを発現する細胞においてアポプトシスを誘導することが驚くべきことに発見された。HGF拮抗剤のかかる特性はとりわけ様々な腫瘍及び癌、そして特に骨髄性白血病の処置に対する新規のアプローチを供する。従って、本発明の一の観点は、HGF−特異的α−鎖及びβｃ鎖を含んで成るHGF ヘテロダイマーレセプターを担持する細胞においてアポプトシスを誘導するための方法を考慮し、この方法は前記細胞を有効な量のHGFと、アポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成り、ここで前記HGF はHGFの第一α−ヘリックス内のアミノ酸配列を含んで成り、ここで酸性特性を有する前記HGFの第一α−ヘリックス内の１又は複数個の露出アミノ酸は塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基で置換されているものである。 HGFは好ましくはGM−CSF，IL−２，IL−３，IL−４，IL−５，IL−６，IL−７，IL−９，IL−10，IL−11，IL−13，IL−14，IL−15及びこのファミリーの未だ発見されていないその他のもの、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−CSF)、エリトロポイエチン(EPO)及びトロンボポイエチン(TPO)である。最も好ましくは、HGFはG M−CSFである。本発明のこの観点に従うと、HGF−特異的α−鎖及びβｃ鎖を含んで成るHGFヘテロダイマーレセプターを担持する細胞におけるアポプトシスを誘導するための方法を提供し、この方法は前記細胞を有効な量のHGFと、アポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成り、ここで前記HGFはH GFの第一α−ヘリックス内のアミノ酸配列を含んで成り、ここで酸性特性を有する前記HGFの第一α−ヘリックス内の１又は複数個の露出アミノ酸は塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基で置換されているものである。 HGF拮抗剤は好ましくは組換又は合成形態で製造され、そして前記第一α−ヘリックス内でのアミノ酸置換を除き、HGFのアミノ酸配列は天然分子と同じであってよく、又は天然配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／もしくは付加を担持していてよい。一の特定の態様において、当該HGF拮抗剤は：（ｉ）非グリコシル化形態にある；（ii）後翻訳修飾を欠く；（iii）原核微生物において産生される；及び／又は（iv）化学合成により産生される；ものである。この拮抗剤はHGFの誘導体であるか、又はHGFレセプターのα−鎖に選択的に結合する任意のその他の分子、例えば、限定することなく、抗体、又はその他の小型もしくは大型分子であってアポプトシスをもたらすものであってよい。本発明をこれよりGM−CSF拮抗剤、そして特にヒトGM−CSF拮抗剤又はヒトにおいて機能できる哺乳類GM−CSF拮抗剤と言及する。ただしこの言及は本発明が、HGFレセプターのHGF−特異的α−鎖との相互作用により細胞アポプトシスを誘導できる任意のHGF拮抗剤に及ぶことの理解をもってする。本発明は当該β鎖と相互作用するHGF拮抗剤にも及ぶ。本発明を任意の一つの理論又は作用態様に限定するつもりはないが、GM−CSF 拮抗剤はレセプターα−鎖と選択的に相互作用することにより野生型GM−CSFの作用をブロックするか、又は定性的もしくは定量的なβ−鎖の異常刺激をもたらす態様でレセプターのα−及びβ−鎖に相互作用することによりアポプトシスを誘導するものと考えられる。定性的な差にはシグナル生成分子の回復を含む（例えばキナーゼのタイプ、又は状態）。定量的な差にはシグナル生成時間の程度が含まれる。本発明は特にヒトGM−CSFのアミノ酸21(Glu)のArgもしくはLys又は任意のその他の塩基性もしくは非酸性アミノ酸残基による置換を担持するGM−CSF拮抗剤の利用に向けられている。かかる突然変異はここでは「E21R」及び「E21K」とそれぞれ表示し、これは置換に関与するアミノ酸の一文字表示と置換の位置に基づく。E21Rを発現するベクターの構築を実施例に記載する。E21Rは封入体の中で、12 個のアミノ酸のリーダー配列、即ち、MFATSSSTGNDGの先行するGM−CSF(E21R)として発現される融合タンパク質である。本発明に従うと、GM−CSF拮抗剤E21RがGM−CSFレセプターのGM−CSF−特異的 α−鎖に結合すること及びかかる結合がGMS−CSFレセプターを発現する正常及び悪性骨髄細胞のアポプトシスを直接誘導することが発見された。アポプトシスはＧ−CSF及び幹細胞因子(SCF)の如き生存因子の存在下でさえも起こるが、レセプター鎖βｃとIL−３との結合により阻止される。従って、特に好適な態様において、本発明は骨髄細胞のアポプトシスを誘導するための方法を考慮し、この方法は前記細胞をGM−CSFアミノ酸配列の21位において置換された塩基性アミノ酸残基を有するアポプトシスに有効な量のGM−CSF と、プログラミングされた細胞死が開始されるのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成る。この方法は癌、例えば骨髄性白血病、並びに炎症、例えばリウマチ様関節炎及びアレルギー性症状、例えばぜん息の処置に特に関係する。好適なGM−CSF拮抗剤はGM−CSFの21位においてアミノ酸Arg又はLysを含んで成る。最も好適な拮抗剤はGM−CSFの21位においてArgを含んで成り、そしてここではE21Rを呼ぶ。従って、本発明の更なる観点はGM−CSFに対するレセプターを担持する細胞においてアポプトシスを誘導する方法を考慮し、この方法は前記細胞をGM−CSFレセプターのα−鎖に結合できる分子又はα−鎖及びβ−鎖の双方に結合できる分子と、プログラミングされた細胞死が開始されるのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成る。好ましくは、この分子は塩基性アミノ酸により置換されたアミノ残基21を有するGM−CSFの誘導体である。好ましくは、塩基性アミノ酸残基はArg又はLysである。最も好ましくは、塩基性アミノ酸残基はArgである。好ましくは、この分子は：（ｉ）非グリコシル化形態にある；（ii）後翻訳修飾を欠く；（iii）原核微生物において産生される；及び／又は（iv）化学合成により産生される；ものである。本発明の別の観点はヒト対象者における骨髄白血病を処置するための方法を考慮し、この方法は前記ヒト対象者に有効量のHGF拮抗剤を投与することを含んで成り、この投与は前記骨髄白血病細胞のアポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で行い、前記HGF拮抗剤はHGFの第一α−ヘリックス内のアミノ酸配列を含んで成り、ここで酸性特性を有する前記第一α−ヘリックス内の１又は複数個の露出アミノ酸は塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基により置換されているものである。好ましくは、このHGFレセプターはGM−CSFレセプターである。好ましくは、このHGF拮抗剤はGM−CSF拮抗剤である。好ましくは、このGM−CSF拮抗剤は、GM−CSFアミノ酸配列の21位にArg又はLys を含んで成る。好ましくは、GMS−CSF拮抗剤はE12Rである。アポプトシスの誘導は幹細胞移植及び遺伝子導入目的のための非前駆先祖細胞 (uncommitted progenitors)の富化においても有用である。本発明のこの観点に従うと、骨髄からの非前駆先祖細胞の富化のための方法を提供し、この方法は骨髄由来の細胞集団をHGFレセプターのα鎖を刺激することのできる有効量の分子と、前記レセプターのβｃ鎖の付随刺激をすることなく、前記α−鎖を担持する細胞のアポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成る。好ましくは、この分子は第一α−ヘリックス内のアミノ酸配列を有するHGFの誘導体であり、それにおいては酸性又は酸性様特性を有する前記第一α−ヘリックス内の１又は複数個のアミノ酸が塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基で置換されている。好ましくは、この分子はGM−CSF，IL−２，IL−３，IL−４，IL−５，IL−６，IL−７，IL−９，IL−10，IL−11，IL−13，IL−14，IL−15及びこのファミリーの未だ発見されていないその他のもの、Ｇ−CSF，EPO、又はTPOの誘導体である。好ましくは、この分子は21位においてGluの代わりにArg又はLysを有するGM−C SFである。最も好ましくは、この分子はE21Rである。好ましくは、アポプトシスは前駆先祖細胞（committed progenitors）(CD34⁺ CD38⁺，CD34⁺ CD33⁺)であり、CD34⁺ CD38^-細胞に認められる。本発明は更にリーダー配列MFATSSSTGNDGをコードするヌクレオチド配列を含んで成る構築体を含む、E21Rを発現するのに有用な遺伝子構築体を考慮する。本発明は更に上記遺伝子構築体の発現の後に、リーダー配列を有する又は有さないE21Rを精製するための方法も考慮する。本発明の更なる観点は上記遺伝子構築体を担持する真核又は原核生物を考慮する。本発明を以下の非限定的な図面及び実施例を参照しながら更に説明する。図面において：図１はプラスミドpBRE132の模式図である。このDNAカセットは固有のEcoRＶクローン部位を有し、そしてMFATSSSTGNDリーダー配列をコードする。図２はプラスミドpBRE133の模式図である。SmaＩ／HindIII GM−E21R PCR DN AをpBRE132のEcoRＶ／HindIIIの中にクローニングした。pBRE133はE21R MFATSSS TGNDG−GM−CSF(E21R)タンパク質をコードする。図３はE21R及び１nMの¹²⁵Ｉ−GM−CSFの、GMRα（GM−CSFレセプターのGM−CS F−特異的α−鎖）でトランスフェクションされたCHO細胞に対する結合の競合を示すグラフ図である。図４はTF１増幅アッセイにおけるE21RによるGM−CSFの拮抗性を示すグラフ図である。図５は好中球スーパーオキサイドアッセイにおけるE21RによるGM−CSFの中和を示すグラフ図である。図６はAML細胞のGM−CSF刺激式増幅をE21Rが阻害することを示すグラフ図である。図７はCML細胞のGM−CSF刺激式増幅をE21Rが阻害することを示すグラフ図である。図８はJCML細胞のコロニー増殖をE21Rが阻害することを示すグラフ図である。図９は骨髄細胞においてE21RがDNAの断片化を引き起こすことを示す写真図である。図10は時間及び用量依存式にGMRα⁺骨髄白血病細胞のアポプトシスをE21Rが誘導することを示すグラフ図である。図11はCD34⁺／GMRα⁺造血先祖細胞のアポプトシスをE21Rが誘導することを示すグラフ図である。図12はE21R誘導化アポプトシスが転写、タンパク質合成及びキナーゼ活性を必要とすることを示すグラフ図である。（Ａ）E21R（１μｇ／ml）の非存在下（白抜き記号）でのゲニスタイン(genistein)及びスタウロスポリンの力価。（Ｂ）E 21R（１μｇ／ml）の非存在下（白抜き記号）及び存在下（べた塗り記号）でのアクチノマイシンＤ及びシクロヘキシミドの力価。アポプトシスは48hr目において測定した。データーは一のAML症例の三重測定サンプルの平均及びSEMであり、そして４種のその他の症例の代表としている。図13は両レセプター鎖の膜近位ドメインがアポプトシスの誘導のために必要だが、いづれかの鎖の一層遠位な部分の欠失がE21R媒介アポプトシスに影響しないことを示す。実施例１組えE21Rタンパク質の発現のためのpBRE132及びpBRE133の構築pBRE132発現プラスミドの構築合成DNAカセットを、２本のオリゴヌクレオチドTATGTTCGCTACTTCAAGCTCTACGGG GAACGATATCGCTGCAGCCA（SEQ ID NO：１）及びAGCTTGGCTGCAGCGATATCGTTCCCCGTAG AGCTTGAAGTAGCGAACA（SEQ ID NO：２）を65℃で５min 200mMのNaCl中でアニーリングすることにより構築した。合成DNAカセットをNdeＩ／HindIIIで切断し、そしてpEC611発現ベクター(A．Brumby，1987「A vector for high expression o f native proteins」Honours Thesis，University of Adelaide)の中にクローニングし、pBRE132（図１）を作った。 pBRE133(E21R発現ベクター)の構築 GM−CSF(E21R)合成cDNAを固有SmaＩ及びHindIII部位を有するPCRプライマーを利用して増幅させた。PCR生成物をSmaＩ／HindIIIで切断し、そしてpBRE132のEc oRＶ／HindIII部位の中にクローニングしてpBRE133（図２）を作った。エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）MM294／pACYClacにおけるpBRE133の発現発現分析はエッシェリヒア・コリMM294／pACYClac内でpBRE133が、精製タンパク質の顕微鏡観察、標準SDS−PAGE及び質量スペクトル分析による判定に従い、組換E21Rタンパク質より成る封入体（Ｂ）を発現することを実証した。実施例２顆粒球マクロファージコロニー刺激因子拮抗剤E21Rの製造１．発酵Ａ．接種１．pBRE322を担持するエッシェリヒア・コリMM294／pACYClacを−80℃のグリセロールストックからアンピシリン（100μｇ／ml）及びカナマイシン（30μｇ／m l）を含む最少培地プレートの上に線引きし、そして37℃で一夜増殖させた。２．多重コロニーを、インデューサーを含む20mlの振盪フラスコ培養物の顕微鏡観察により、又はインデューサーを伴ってもしくは伴わないで（この場合、IPTG を伴って）アガープレート上のコロニーサイズにより、GM−CSF(E21R)について評価した。３．アガープレート由来の選定単一コロニーをアンピシリン（100μｇ／ml）＋カナマイシン（30μｇ／ml）を含む20mlの最少培地に移した。この培養物を37℃で一夜撹拌しがら増殖させた。４．10Ｌの量の窒素濃厚最少培地「Ｃ２」を22Ｌの発酵槽の中で滅菌し、そして一夜培養物で非常に低密度で接種を施した。増殖は37℃で行い、そして7.0のpH を12.5ＭのNH₄OHの添加により保った。５．撹拌を手動式にコントロールし、そして通気は酸素飽和レベルが10％のpO₂ を超えるように維持されるように自動式にコントロールした。16〜18時間目でのグルコースの枯渇の後、細胞質量に追加の塩を含む濃厚グルコース溶液を供給した。栄養供給率はpH又は酸素飽和レベルにより決定した。Ｂ．誘導１．Ａ₆₀₀＝50〜60の光学密度において、E21R拮抗剤の組換発現を、この場合はI PTGの添加により、誘導した。その培養物にアミノ酸を誘導時（Ｔ＝０）及びＴ＝２時間目において添加した。誘導は37℃で４時間、pH 7.0で続けた。サンプルをＴ＝０，１，２，３及び４時間目に取り出し、そしてIBの存在について顕微鏡により検査し、そのサイズはディスク遠心により決定した。２．培養物を４℃で一夜保存した。２．GM−CSF(E21R)封入体の一次単離１．ホモジナイゼーション−工程１培養物をGaulin 30CDホモジナイザーに13500psiで５回通し、その際ホモジネート品は通過させたら冷却した。ホモジネート品を等容量のRO H₂Oで希釈した。 IBサイズはディスク遠心により再決定した。２．遠心分離−工程１ホモジネート品をWestfalia SB−７分離器の中で9210rpmの定常スピードにおいて、IBサイズにより決定した流速で遠心分離した。この第一工程から回収された濃縮物を≦2.5％ｖ／ｖに希釈した。３．ホモジナイゼーション−工程２ IB懸濁物をGaulin 30CDホモジナイザーに1 3500psiで１回通した。 IBサイズをディスク遠心により再び決定した。４．遠心分離−工程２ホモジネート品をWestfalia SA−１分離器において9700の定常スピードで、IB サイズにより決定した流速で遠心分離した。実施例３ GM−CSF拮抗剤（E21R）の精製封入体（IB）溶液をまず等容量の温和な緩衝化変性剤、例えば２ＭのGuHClで洗う。この溶液を４℃で静かに30分撹拌する。洗浄したIBは低速遠心により回収できうる。洗浄IBを次いで少容量の水（例えばMilliQ）に再懸濁し、直ちに溶解及びリフォルディングさせる。 IB GM−CSF拮抗剤（E21R）の溶解、リフォルディング及び酸化は洗浄IBを未緩衝尿素溶液の中でアルカリ性pHにおいて溶解することにより開始する。IBの完全な溶解を確保するためには、尿素の濃度を2.5Ｍ〜４Ｍに、そしてpHは11〜12にすべきである。タンパク質の濃度は0.5〜5mg／mlであってよい。この３つのパラメーターはIB調製品の純度に依存して変えてよい。この撹拌溶液を水酸化ナトリウム溶液（例えば２ＭのNaOH）でアルカリ性pHに、リフォルディング及び酸化が平衡に達するのが認められうるまで、維持する。GM−CSFにとっての適正な折りたたみに対するリフォルディングの程度はクロマトグラフィー手段、例えば逆相 HPLC（RP−HPLC）又はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により、GM−CSFの既知の折りたたまれた標準品のそれとクロマトグラフィープロフィールを比較することでモニターできうる。リフォルディングが平衡に達したら、溶液のpH を適当なバッファーの濃厚溶液（例えば0.5Ｍの硼酸ナトリウムpH 9.1）で弱アルカリpH（例えばpH 9.1）に下げる。適正にリフォルディングしたGM−CSF拮抗剤（E21R）は次いで不適正にリフォルディングし、且つ凝集した形態から、クロマトグラフィー、例えばアニオン交換クロマトグラフィー(IEC)又はRP−HPLCを利用して精製できうる。例えば、上記由来のリフォルディング溶液をアニオン交換カラム（例えばQ-Sepharose Fast flow〔Pharmacia〕）に装填する。装填の終了後、そのカラムを２カラム容量の低塩バッファーで洗う。GM−CSF拮抗剤（E21R）の適正にフォルディングした形態は塩化ナトリウムの勾配（例えば、10カラム容量で0〜500mMのNaCl）によりカラムから溶出する。カラム溶出液は、SEC(例えばSuperose 12〔Pharmacia〕)又はRP−HPLC(例えばBrownleeブチル−シリカカラム(100mm×2.1mm(内径))のいづれかにより、バッファーＡとしての0.1％ｖ／ｖのTFA水溶液及びバッファーＢとしての0.1％のTFAアセトニトリル溶液を利用することで、GM−CSF拮抗剤（E21R ）の純度について分析できうる。精製GM−CSF拮抗剤（E21R）は製剤化及び凍結乾燥のための調製に適当なバッファー（例えば５mMのNa₂HPO₄、pH 7.6）へと脱塩（例えばSephadex G−25）できうる。脱塩タンパク質は9.09の₂₈₀Ａ^%を利用して光度計での280nmでのその吸収により定量できる。定量後、１重量部のグリシン及び５重量部のマンニトールを脱塩タンパク質溶液に添加する。この溶液を固体が全て溶解するまで静かに撹拌する。必要なら、pHを１ＭのNaOH又は25％ｗ／ｖのオルトリン酸でpH 7.6に調整する。次いでこの溶液を濾液(0.2μｍ)により除菌し、滅菌ガラス製品に小分けし、そして凍結乾燥する。実施例４ E21Rは拮抗特性を示す精製E21Rは野生型GM−CSFと同程度にGM−CSFレセプターα−鎖に結合した（図３）。更に、E21RはTF−１細胞増殖（図４）又は好中球Ｏ₂放出（図５）を直接は刺激しないが、その代わりに双方の機能アッセイ（図４及び５）においてGM− CSFの刺激作用を抑制した。急性骨髄白血病(AML)を有する患者由来の細胞を利用して、本発明者はE21Rが用量依存式にGM−CSFによるAML細胞増殖の刺激を中和することを見い出した（図６）。これは、E21RがIL−３−媒介増殖を中和しない点でGM−CSFに特異的であった（図６）。E21Rは慢性骨髄白血病(CML)を有する患者由来の細胞に対してGM−CSFの増殖作用を完全に中和した（図７）。実施例５ E21Rは幼若慢性骨髄白血病（JCML）細胞によるコロニー形成を阻害する JCMLは稀な病気であり、これは一般に２才未満の子供において診断される。この病状のために有効な治療はなく、そして診断後２〜３年でまちがいなく致命的となる。JCML患者由来の細胞は、これらの細胞にフィードバックするGM−CSFの自己分泌産生におそらくは基づき、培養物において自発的に増殖する。 E21RはJCMLの増殖を用量依存式に阻害することが見い出せた（図８）。これは自己分泌GM−CSFをブロックすること、アポプトシスの誘導（下記参照）、又は別のメカニズムに基づき得る。実施例６ α−鎖に対するE21R結合がGM−CSF刺激細胞機能を中和するため、本発明者はE 21Rが細胞生存を妨害しうるものと理論づけた。急性(AML)又は慢性(CML)骨髄性白血病を有する患者由来のGM−CSFレセプター発現性の悪性細胞のライフスパンを研究した。これらの細胞をE21Rとインキュベーションすると、染色体DNAは低分子量フラグメントに分解し、それはアポプトシスの際だった特徴である（図９）。 E21Rは骨髄性白血病細胞由来のDNAを分解する。DNA分解はGM−CSFのみ又は培地のみの双方とインキュベーションした細胞において存在しなかった。このデーターは一のAML症例に由来し、そして20のその他の症例の代表である。CD34／GMR α，CD34／CD38／GMRα及びCD34／CD33／GMRαを発現する正常骨髄（BM）細胞も E21Rによりアポプトシスとなった。CD34⁺／CD38⁺／GMRα^-集団においては、DNA 分解はなかった。このデーターは一のBM症例に由来し、そして二つのその他の症例の代表である。キロベース（kb）で表示する既知の分子量のマーカーを示す。診断においてAML(全てのFABサブタイプ)を有する患者由来の末梢血液細胞をFico ll分離した。Ｔリンパ球はマウス抗−ヒトCD３モノクローナル抗体とのインキュベーション、それに次ぐ磁性ビーズにカップリングしたウサギ抗−マウス抗体(M iltenyi Biotech，Gladbach，Germany)とのインキュベーションにより除去した。AML集団は＞99％の幼若細胞より成る。骨髄先祖細胞は健康ドナーから集め、そしてCD34⁺サブセットをフローサイトメトリー(FACStar^PLUS，Becton Dickinso n，NJ)によりソーティングした。GMRαを発現する細胞を抗−GMRαモノクローナル抗体及び磁性ビーズ手順を利用して単離した。細胞を10％ｖ／ｖの胎児牛血清 (FCS)、抗生物質、炭酸水素ナトリウム及びＬ−グルタミンの入ったRPMI1640培地の中で48ｈ 37℃でインキュベーションした。Ｅ．コリ誘導E21R（１μｇ／ml ）又はGM−CSF(0.3ng／ml、Genetics Institute，Cambridge，MA)のいづれかを培養物に添加した。骨髄細胞を培養するのに用いた培地はＧ−CSFを含んだ（10n g／ml、Amgen，Thousand Oaks，CA）。ゲル電気泳動の後にD NAを抽出し、そしてアガロース分析した。細胞とGM−CSFのみ又は培地のみとの48ｈに至るインキュベーションはDNAの分解を引き起こさなかった。一のAML症例に由来するプロピジウムヨージドによるD NA染色はE21R（１μｇ／ml）との48ｈインキュベーションがほとんど全ての細胞のアポプトシスを引き起こすことを示した(図10(ａ))。Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２領域は様々な細胞同期段階における細胞であり、一方半二倍体（subdiploid）Ap ピークはアポプトシス細胞を示す。アポプトシス細胞の数を定量するため、プロピジウムヨージドのDNA結合を測定した。まずAML細胞の約75％がE21Rの存在下で 48ｈ目にてアポプトシスとなった。アポプトシス細胞のこの比率はGM−CSFのレセプターを発現する細胞の数とよく相関した。E21R（１μｇ／ml）は21／21のAM L症例においてアポプトシスを誘導し（図10ｂ）、そして14／14のCML症例においてアポプトシスを誘導した。 E21Rのアポプトシス効果が培養条件において存在するGM−CSFの中和に二次的なものであるか、又はE21Rに対する直接的な効果であるかを調べるため、いくつかのコントロール実験を行った。第一に、正常骨髄造血細胞はGM−CSFのmRNAを発現しないことがわかっているが、一部のAML細胞はGM−CSFを産生できる。しかしながら、GM−CSFは21のAML症例のうちの８のみの上清液において検出された。その他の13症例はその上清液において検出可能なGM−CSFを示さず、そしてRNase 保護アッセイはGM−CSFについてのmRNAの欠如を示した。第二に、培養培地の中に生物学的に活性なGM−CSFは存在しなかった。無血清培地中のアポプトシス細胞の莫大な数は図10ｂに示すものと似た結果を生み出し、そして中和性抗GM−CS Fモノクローナル抗体4D4はAML細胞のアポプトシスを誘導しなかった（図10ｅ）。最後に、任意のGM−CSFが、ex vivoでin vitro培養物に移されたときにAMLの細胞に結合するかどうかを調べるため、本発明者は酸溶出の前後で¹²⁵Ｉ−ラベル化GM−CSFの細胞表層関連結合を測定した。特異的なGM −CSF結合において差は認められず、細胞がレセプター結合GM−CSFをキャリーオーバーしてないことが示唆された。E21RはGMRαを欠く骨髄細胞のアポプトシスは誘導せず、E21Rが毒性でないことが示唆された。 E21Rの力価検定は完全アポプトシス効果が１μｇ／mlで達成されることを示した（ｄ）。100ng／mlのGM−CSF濃度はE21R（１μｇ／ml）媒介アポプトシスを効果的に阻害した（ｄ）。値は一のAML症例由来の３重測定の平均±SEMである。 IL−３（10ng／ml、Genetics Institute）ではなく、Ｇ−CSF(10ng／ml)を組合せると、E21Rはほぼ全ての細胞のアポプトシスを誘導した（ｅ）。末梢血液を急性化状態の未処置のCML患者（全てフィラデルフィア染色体陽性）から集め、そして上記のAML細胞と同じように処理した。アポプトシスは、0.1％ｖ／ｖのTr iton X−100及びプロピジウムヨージド（50mg／ml）を含むバッファー中での一夜の細胞の三重培養物のインキュベーションの後にDNAに結合するプロピジウムヨージドの量の低下として、フローサイトメトリーにより決定した。実施例７正常造血細胞と類似して、骨髄白血病細胞はCD34表層マーカーを発現する高度に増殖性の先祖細胞の小プールに由来する。E21Rの効果がGMRα発現に関連する一般的な現象か、悪性細胞に限定されるものであるかを調べるため、正常CD34⁺ 先祖細胞の生存に対するE21Rの効果を研究した。骨髄細胞をフローサイトメトリーにより全CD34⁺，CD34⁺ CD38⁺（前駆体）、及びCD34⁺ CD33⁺（骨髄前駆）先祖細胞に分け、そしてアポプトシス画分をE21R処理後に決定した。 DNA断片化はCD34⁺／GMRα⁺，CD34⁺ CD38⁺／GMRα⁺及びCD34⁺ CD33⁺／GMRα⁺サブセットにおいてあったが、非前駆CD34⁺ CD38^-細胞にはなかった（図９）。後者はGMRαを欠く。プロピジウムヨージドのDNA結合の分析はE21RがCD34⁺ CD38⁺／G MRα⁺（図11ａ，ｃ）、CD34⁺／GMRα⁺、及びCD34⁺ CD33⁺／GMRα⁺集団（図11ｃ）において細胞のアポプトシスを引き起こし、GM−CSFα鎖を欠く細胞では引き起こさないことを示した。Ｇ−CSFを有する培地中でE21RはCD34⁺ CD38⁺／GMRα⁺前駆先祖細胞のアポプトシスは誘導したが（ａ）、CD34⁺ CD38^-／GMRα^-細胞は誘導しなかった（ｂ）。Ｇ−CSFと、GM−CSF又は幹細胞因子(SCF)のいづれかと組合せると、E21Rは48時間後に全てのCD34⁺／GMRα⁺サブセットのアポプトシスを引き起したが、IL−３の添加はアポプトシスを阻止した（ａ，ｃ）。非前駆CD34⁺ CD38^-／GMRα^-細胞はE21R処理の影響を受けなかった（ｂ，ｃ）。値は３症例由来の平均±SEMである。CD34⁺／GMRα⁺前駆先祖細胞によるコロニー形成の研究は、Ｇ−CSF、又はＧ −CSFとGM−CSF、又はＧ−CSFとSCFのいづれかと組合せたE21Rが事実上コロニー増殖を消失させ、一方E21RとＧ−CSF及びIL−３、又はE21RとＧ−CSF，SCF及びI L−３は前駆細胞のコロニー増殖を阻害しないことが示された（ｄ）。非前駆CD3 4⁺ CD38^-／GMRα^-サブセットのコロニー増殖はE21Rにより影響されなかった（ｄ）。データーは（ａ）においては３症例に由来し、値は平均±SEMである。骨髄細胞を集め、そして上記の通りにして処理した。アポプトシスは上記の通りにプロピジウムヨージドのDNA結合能の低下として測定した。造血性CD34⁺先祖細胞のメチルセルロースアッセイにおいてコロニー（＞40細胞）を調製し、そして14日後に評価した。三重測定培養物に我々はE21R（１μｇ／ml）、Ｇ−CSF（1 0ng／ml）、 GM−CSF(10ng／ml)及びSCF(10ng／ml、Amgen)の様々な組合せを添加した。抗−GMRαモノクローナル抗体によるGMRα陽性細胞の精製により、事実上100 ％の細胞がE21Rによりアポプトシスとなった（図10ａ）。その結果は、E21Rを１ μｇ／mlの用量、即ち、高GMRα占拠率を確保する濃度で供与したとき、21／21 のAML症例（図10ｂ）及び14／14のCML症例（図10ｃ）で観察された。この濃度は力価検定実験に基づき、１μｇ／mlのE21Rが最大のアポプトシスを供した（図10 ｄ）。この効果はGMRαに対するE21R結果に依存し、なぜなら１μｇ／mlのE21R に対するGM−CSFの力価検定は100ng／mlのGM−CSF濃度がE21Rのアポプトシス効果を完全に消失させることを示したからである（図10ｄ）。実施例８実施例７における発見を試験するため、そのレセプターがGM−CSFレセプターとは異なるホモダイマーであるＧ−CSF又はそのレセプターがヘテロダイマーであってそれにおけるβｃがGM−CSFレセプターと共有しているものであるIL−３のいづれかと組合せたE21Rの効果を調べた：これらのサイトカインにとっての機能的なレセプターを発現する白血病細胞を使用した。白血病細胞はそれらをE21R 及びＧ−CSFとインキュベーションしたときにアポプトシスとなったが、E21R及びIL−３とではならず（図10ｅ）、βｃ鎖の関与が生存に必須であることが示唆される。6／21のAML及び３／14のCMLの症例しかIL−３レセプターを発現しないため、本実施例はE21Rが大半の白血病の処置において有利でありうることを示す。 E21Rのアポプトシス効果が培養条件において存在するGM−CSFの中和力に二次的なものである可能性を排除するため、いくつかのコントロールを実施した。第一に、一部のAML及びCML細胞はGM−CS Fを産生できることが知られている。高感度増殖アッセイ（10pg／mlの下検出限界）の利用により、生物学的に活性なGM−CSFはCD34⁺ CD38^-／GMRα^-細胞にはない（図11ｂ，ｃ）。E21Rによるアポプトシスは２種類のその他の生存因子Ｇ−CS F及び幹細胞因子（SCF）が存在している場合も認められた（図11ａ，ｃ）。しかしながら、IL−３を培地に加えると、GMRαを発現する造血先祖細胞はアポプトシスから救済された（図11ａ，ｃ）。実施例９ E21Rはアポプトシスを直接誘導するため、本発明者はこの活性過程の可能性のあるシグナル生成要件を調べた。用量応答実験は特異的なチロシンキナーゼインヒビターゲニスタインがE21R誘導式アポプトシスに影響を及ぼさないことを示した（図12ａ）。別のコントロール実験において、ゲニスタイン(0.1〜10μｇ／ml )はAML細胞におけるチロシンリン酸のGM−CSF（0.3〜１ng／ml）媒介式刺激をブロッキングした。タンパク質キナーゼＣインヒビタースタウロスポリンは10μｇ／mlの用量で付与したときにE21R−誘導化アポプトシスを強力に阻害し（図12ａ）、セリン／スレオニンキナーゼがE21Rのアポプトシスメカニズムの中心でありうることを示唆する。更に、本発明者はシクロヘキシミドによるアクチノマイシンＤによる転写又はタンパク質合成の阻害がAML細胞のE21R−誘導式アポプトシスを用量依存式に大いに低めることを見い出した（図12ｂ）。実施例10 先祖細胞の増殖に対するE21Rの影響をコロニーアッセイで更に調べた。GM−CS F及びSCFを伴う又は伴わないE21RとＧ−CSFとの様々な組合せはコロニー増殖を事実上消失させ、一方IL−３の添加はE21Rによるコロニー増殖の阻害を解消し（図11ｄ）、前駆先祖細胞のE21R誘導アポプトシスと一致した（図11ｃと11ｄ）。 CD34⁺ CD38 ^- 細胞は非前駆多能先祖細胞であることに注目すべきことが重要である。CD34⁺ C D38⁺細胞ではなく、前駆先祖細胞（CD34⁺ CD38⁺，CD34⁺ CD33⁺）のE21R誘導式アポプトシスは幹細胞移植及び遺伝導入目的のための非前駆先祖細胞の富化にとって有用であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月２１日【補正内容】明細書 HGF拮抗剤は好ましくは組換又は合成形態で製造され、そして前記第一α−ヘリックス内でのアミノ酸置換を除き、HGFのアミノ酸配列は天然分子と同じであってよく、又は天然配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／もしくは付加を担持していてよい。一の特定の態様において、当該HGF拮抗剤は：（ｉ）非グリコシル化形態にある；（ii）後翻訳修飾を欠く；（iii）原核微生物において産生される；及び／又は（iv）化学合成により産生される；ものである。この拮抗剤はHGFの誘導体であるか、又はHGFレセプターのα−鎖に選択的に結合する任意のその他の分子、例えば、限定することなく、抗体、又はその他の小型もしくは大型分子であってアポプトシスをもたらすものであってよい。本発明をこれよりGM−CSF拮抗剤、そして特にヒトGM−CSF拮抗剤又はヒトにおいて機能できる哺乳類GM−CSF拮抗剤と言及する。ただしこの言及は本発明が、HGFレセプターのHGF−特異的α−鎖との相互作用により細胞アポプトシスを誘導できる任意のHGF拮抗剤に及ぶことの理解をもってする。本発明は当該β鎖と相互作用するHGF拮抗剤にも及ぶ。本発明を任意の一つの理論又は作用態様に限定するつもりはないが、GM−CSF 拮抗剤はレセプターα−鎖と選択的に相互作用することにより野生型GM−CSFの作用をブロックするか、又は定性的もしくは定量的なβ−鎖の異常刺激をもたらす態様でレセプターのα−及びβ−鎖に相互作用することによりアポプトシスを誘導するものと考えられる。野生型GM−CSFに対する定性的な差にはシグナル生成分子の回復を含む（例えばキナーゼのタイプ、又は状態）。定量的な差にはシグナル生成時間の程度が含まれる。好ましくは、GMS−CSF拮抗剤はE12Rである。アポプトシスの誘導は幹細胞移植及び遺伝子導入目的のための非前駆先祖細胞 (uncommitted progenitors)の富化においても有用である。本発明のこの観点に従うと、骨髄からの非前駆先祖細胞の富化のための方法を提供し、この方法は骨髄由来の細胞集団をHGFレセプターのα鎖を刺激することのできる又は前記レセプターのβ鎖を異常に刺激できる有効量の分子と、前記レセプターのβｃ鎖の付随刺激をすることなく、前記α−鎖を担持する細胞のアポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成る。好ましくは、この分子は第一α−ヘリックス内のアミノ酸配列を有するHGFの誘導体であり、それにおいては酸性又は酸性様特性を有する前記第一α−ヘリックス内の１又は複数個のアミノ酸が塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基で置換されている。好ましくは、この分子はGM−CSF，IL−２，IL−３，IL−４，IL−５，IL−６，IL−７，IL−９，IL−10，IL−11，IL−13，IL−14，IL−15及びこのファミリーの未だ発見されていないその他のもの、Ｇ−CSF，EPO、又はTPOの誘導体である。好ましくは、この分子は21位においてGluの代わりにArg又はLysを有するGM−C SFである。最も好ましくは、この分子はE21Rである。好ましくは、アポプトシスは前駆先祖細胞（committed progenitors）(CD34⁺ CD38⁺，CD34⁺ CD33⁺)であり、CD34⁺ CD38^-細胞に認められる。本発明は更にリーダー配列MFATSSSTGNDGをコードするヌクレオチド配列を含んで成る構築体を含む、E21Rを発現するのに有用な遺伝子構築体を考慮する。本発明は更に上記遺伝子構築体の発現の後に、リーダー配列を有する又は有さないE21Rを精製するための方法も考慮する。本発明の更なる観点は上記遺伝子構築体を担持する真核又は原核生物を考慮する。本発明を以下の非限定的な図面及び実施例を参照しながら更に説明する。図面において：図１はプラスミドpBRE132の模式図である。このDNAカセットは固有のEcoRＶクローン部位を有し、そしてMFATSSSTGNDリーダー配列をコードする。図２はプラスミドpBRE133の模式図である。SmaＩ／HindIII GM−E21R PCR DN AをpBRE132のEcoRＶ／HindIIIの中にクローニングした。pBRE133はE21R MFATSSS TGNDG−GM−CSF(ここでは「E21R」と表示)タンパク質をコードする。図３はE21R及び１nMの¹²⁵Ｉ−GM−CSFの、GMRα（GM−CSFレセプターのGM−CS F−特異的α−鎖）でトランスフェクションされたCHO細胞に対する結合の競合を示すグラフ図である。図４はヒト赤白血病細胞系、TF１増幅アッセイにおけるE21RによるGM−CSFの拮抗性を示すグラフ図である。図５は好中球スーパーオキサイドアッセイにおけるE21RによるGM−CSFの中和を示すグラフ図である。図６はAML細胞のGM−CSF刺激式増幅をE21Rが阻害することを示すグラフ図である。図７はCML細胞のGM−CSF刺激式増幅をE21Rが阻害することを示すグラフ図である。図８はJCML細胞のコロニー増殖をE21Rが阻害することを示すグラフ図である。図９は骨髄細胞においてE21RがDNAの断片化を引き起こすことを示す写真図である。図10は時間及び用量依存式にGMRaα⁺骨髄白血病細胞のアポプトシスをE21Rが誘導することを示すグラフ図である。図11はCD34⁺／GMRα⁺造血先祖細胞のアポプトシスをE21Rが誘導することを示すグラフ図である。図12はE21R誘導化アポプトシスが転写、タンパク質合成及びキナーゼ活性を必要とすることを示すグラフ図である。（ａ）E21R（１μｇ／ml）の非存在下（白抜き記号）及び存在下（べた塗り記号）でのゲニスタイン(genistein)及びスタウロスポリンの力価。（ｂ）E21R（１μｇ／ml）の非存在下（白抜き記号）及び存在下（べた塗り記号）でのアクチノマイシンＤ及びシクロヘキシミドの力価。アポプトシスは48hr目において測定した。データーは一のAML症例の三重測定サンプルの平均及びSEMであり、そして４種のその他の症例の代表としている。図13は両レセプター鎖の膜近位ドメインがアポプトシスの誘導のために必要だが、いづれかの鎖の一層遠位な部分の欠失がE21R媒介アポプトシスに影響しないことを示す。実施例１組換E21Rタンパク質の発現のためのpBRE132及びpBRE133の構築pBRE132発現プラスミドの構築合成DNAカセットを、２本のオリゴヌクレオチドTATGTTCGCTACTTCAAGCTCTACGGG GAACGATATCGCTGCAGCCA（SEQ ID NO：１）及びAGCTTGGCTGCAGCGATATCGTTCCCCGTAG AGCTTGAAGTAGCGAACA（SEQ ID NO：２）を65℃で５min 200mMのNaCl中でアニーリングすることにより構築した。合成DNAカセットをNdeＩ／HindIIIで切断し、そしてpEC611発現ベクター(A．Brumby，1987「A vector for high expression o f native proteins」Honours Thesis，University of Adelaide)の中にクローニングし、pBRE132（図１）を作った。 pBRE133(E21R発現ベクター)の構築 GM−CSF(E21R)cDNAを固有SmaＩ及びHindIII部位を有するPCRプライマーを利用して増幅させた。PCR生成物をSmaＩ／HindIIIで切断し、そしてpBRE132のEcoRＶ／HindIII部位の中にクローニングしてpBRE133（図２）を作った。エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)MM294／pACYClacにおけるpBRE133の発現発現分析はエッシェリヒア・コリMM294／pACYClac内でpBRE133が、精製タンパク質の顕微鏡観察、標準SDS−PAGE及び質量スペクトル分析による判定に従い、組換E21Rタンパク質より成る封入体（Ｂ）を発現することを実証した。実施例２顆粒球マクロファージコロニー刺激因子拮抗剤E21Rの製造１．発酵Ａ．接種１．pBRE322を担持するエッシェリヒア・コリMM294／pACYClacを−80℃のグリセロールストックからアンピシリン（100μｇ／ml）及びカナマイシン（30μｇ／m l）を含む最少培地プレートの上に線引きし、そして37℃で一夜増殖させた。２．多重コロニーを、インデューサーを含む20mlの振盪フラスコ培養物の顕微鏡観察により、又はインデューサーを伴ってもしくは伴わないで（この場合、IPTG を伴って）アガープレート上のコロニーサイズにより、GM−CSF(E21R)について評価した。３．アガープレート由来の選定単一コロニーをアンピシリン（100μｇ／ml）＋カナマイシン（30μｇ／ml）を含む20mlの窒素濃厚最少培地に移した。この培養物を37℃で一夜撹拌しがら増殖させた。４．10Ｌの量のＣ２を22Ｌの発酵槽の中で滅菌し、そして一夜培養物で非常に低密度で接種を施した。増殖は37℃で行い、そして7.0のpHを12.5ＭのNH₄OHの添加により保った。５．撹拌を手動式にコントロールし、そして通気は酸素飽和レベルが10％のpO₂ を超えるように維持されるように自動式にコントロールした。16〜18時間目でのグルコースの枯渇の後、細胞質量に追加の塩を含む濃厚グルコース溶液を供給した。栄養供給率はpH又は酸素飽和レベルにより決定した。Ｂ．誘導１．Ａ₆₀₀＝50〜60の光学密度において、E21R拮抗剤の組換発現を、この場合はI PTGの添加により、誘導した。その培養物にアミノ酸を誘導時（Ｔ＝０）及びＴ＝２時間目において添加した。誘導は37℃で４時間、pH 7.0で続けた。サンプルをＴ＝０，１，２，３及び４時間目に取り出し、そしてIBの存在について顕微鏡により検査し、そのサイズはディスク遠心により決定した。実施例３ GM−CSF拮抗剤（E21R）の精製封入体（IB）溶液をまず等容量の温和な緩衝化変性剤、例えば２Ｍのグアニジン塩酸塩(GuHCl)で洗う。この溶液を４℃で静かに30分撹拌する。洗浄したIBは低速遠心により回収できうる。洗浄IBを次いで少容量の水（例えばMilliQ）に再懸濁し、直ちに溶解及びリフォルディングさせる。 IB GM−CSF拮抗剤（E21R）の溶解、リフォルディング及び酸化は洗浄IBを未緩衝尿素溶液の中でアルカリ性pHにおいて溶解することにより開始する。IBの完全な溶解を確保するためには、尿素の濃度を2.5Ｍ〜４Ｍに、そしてpHは11〜12にすべきである。タンパク質の濃度は0.5〜５mg／mlであってよい。この３つのパラメーターはIB調製品の純度に依存して変えてよい。この撹拌溶液を水酸化ナトリウム溶液（例えば２ＭのNaOH）でアルカリ性pHに、リフォルディング及び酸化が平衡に達するのが認められうるまで、維持する。GM−CSFにとっての適正な折りたたみに対するリフォルディングの程度はクロマトグラフィー手段、例えば逆相HPLC（RP−HPLC）又はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により、GM−CSFの既知の折りたたまれた標準品のそれとクロマトグラフィープロフィールを比較することでモニターできうる。リフォルディングが平衡に達したら、溶液のpHを適当なバッファーの濃厚溶液（例えば0.5Ｍの硼酸ナトリウムpH 9.1）で弱アルカリpH（例えばpH 9.1）に下げる。適正にリフォルディングしたGM−CSF拮抗剤（E21R）は次いで不適正にリフォルディングし、且つ凝集した形態から、クロマトグラフィー、例えばアニオン交換クロマトグラフィー(IEC)又はRP−HPLCを利用して精製できうる。例えば、上記由来のリフォルディング溶液をアニオン交換カラム（例えばQ-Sepharose Fast flow〔Phar macia〕）に装填する。装填の終了後、そのカラムを２カラム容量の低塩バッファーで洗う。GM−CSF拮抗剤（E21R）の適正にフォルディングした形態は塩化ナトリウムの勾配（例えば、10カラム容量で０〜500mMのNaCl）によりカラムから溶出する。カラム溶出液は、SEC(例えばSuperose 12〔Pharmacia〕)又はRP−HPL C(例えばBrownleeブチル−シリカカラム(100mm×2.1mm(内径))のいづれかにより、バッファーＡとしての0.1％ｖ／ｖのTFA水溶液及びバッファーＢとしての0.1 ％のTFAアセトニトリル溶液を利用することで、GM−CSF拮抗剤（E21R）の純度について分析できうる。精製GM−CSF拮抗剤（E21R）は製剤化及び凍結乾燥のための調製に適当なバッファー（例えば５mMのNa₂HPO₄、pH 7.6）へと脱塩（例えばSephadex G−25）できうる。脱塩タンパク質は9.09の₂₈₀Ａ^%を利用して光度計での280nmでのその吸収により定量できる。定量後、１重量部のグリシン及び５重量部のマンニトールを脱塩タンパク質溶液に添加する。この溶液を固体が全て溶解するまで静かに撹拌する。必要なら、pHを１ＭのNaOH又は25％ｗ／ｖのオルトリン酸でpH 7.6に調整する。次いでこの溶液を濾液（0.2μｍ）により除菌し、滅菌ガラス製品に小分けし、そして凍結乾燥する。実施例４ E21Rは拮抗特性を示す精製E21Rは野生型GM−CSFと同等にGM−CSFレセプターα−鎖に結合した（図３）。更に、E21RはTF−１細胞増殖（図４）又は好中球Ｏ₂放出（図５）を直接は刺激しないが、その代わりに双方の機能アッセイ（図４及び５）においてGM−CS Fの刺激作用を抑制した。急性骨髄白血病(AML)を有する患者由来の細胞を利用して、本発明者はE21Rが用量依存式にGM−CSFによるAML細胞増殖の刺激を中和することを見い出した（図６）。これは、E21RがIL−３−媒介増殖を中和しない点でGM−CSFに特異的であった（図６）。E21Rは慢性骨髄白血病( CML)を有する患者由来の細胞に対してGM−CSFの増殖作用を完全に中和した（図７）。 E21Rは骨髄性白血病細胞由来のDNAを分解する。DNA分解はGM−CSFのみ又は培地のみの双方とインキュベーションした細胞において存在しなかった。このデーターは一のAML症例に由来し、そして20のその他の症例の代表である。CD34／GMR α，CD34／CD38／GMRα及びCD34／CD33／GMRαを発現する正常骨髄（BM）細胞も E21Rによりアポプトシスとなった。CD34⁺／CD38^-／GMRα^-集団においては、DNA 分解はなかった。このデーターは一のBM症例に由来し、そして二つのその他の症例の代表である。キロベース（kb）で表示する既知の分子量のマーカーを示す。診断においてAML(全てのFABサブタイプ)を有する患者由来の末梢血液細胞をFico ll分離した。Ｔリンパ球はマウス抗−ヒトCD３モノクローナル抗体とのインキュベーション、それに次ぐ磁性ビーズにカップリングしたウサギ抗−マウス抗体(M iltenyi Biotech，Gladbach，Germany)とのインキュベーションにより除去した。AML集団は＞99％の幼若細胞より成る。骨髄先祖細胞は健康ドナーから集め、そしてCD34⁺サブセットをフローサイトメトリー(FACStar^PLUS，Becton Dickinso n，NJ)によりソーティングした。GMRαを発現する細胞を抗−GMRαモノクローナル抗体及び磁性ビーズ手順を利用して単離した。細胞を10％ｖ／ｖの胎児牛血清 (FCS)、抗生物質、炭酸水素ナトリウム及びＬ−グルタミンの入ったRPMI1640培地の中で48ｈ 37℃でインキュベーションした。Ｅ．コリ誘導E21R（１μｇ／ml ）又はGM−CSF(0.3ng／ml、Genetics Institute，Cambridge，MA)のいづれかを培養物に添加した。骨髄細胞を培養するのに用いた培地はＧ−CSFを含んだ（10n g／ml、Amgen，Thousand Oaks，CA）。ゲル電気泳動の後にDNAを抽出し、そしてアガロース分析した。細胞とGM−CSFのみ又は培地のみとの48ｈに至るインキュベーションはDNAの分解を引き起こさなかった。一のAML症例に由来するプロピジウムヨージドによるDNA染色はE21R（１μｇ／ml）との48ｈインキュベーションがほとんど全ての細胞のアポプトシスを引き起こすことを示した(図10( ａ))。Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２領域は様々な細胞同期段階における細胞であり、一方半二倍体（subdiploid）Apピークはアポプトシス細胞を示す。アポプトシス細胞の数を定量するため、プロピジウムヨージドのDNA結合を測定した。まずAML 細胞の約75％がE21Rの存在下で48ｈ目にてアポプトシスとなった。アポプトシス細胞のこの比率はGM−CSFのレセプターを発現する細胞の数とよく相関した。E21 R（１μｇ／ml）は21／21のAML症例においてアポプトシスを誘導し（図10ｂ）、そして14／14のCML症例においてアポプトシスを誘導した。 E21Rのアポプトシス効果が培養条件において存在するGM−CSFの中和に二次的なものであるか、又はE21Rに対する直接的な効果であるかを調べるため、いくつかのコントロール実験を行った。第一に、正常骨髄造血細胞はGM−CSFのmRNAを発現しないことがわかっているが、一部のAML細胞はGM−CSFを産生できる。しかしながら、GM−CSFは21のAML症例のうちの８のみの上清液において検出された。その他の13症例はその上清液において検出可能なGM−CSFを示さず、そしてRNase 保護アッセイはGM−CSFについてのmRNAの欠如を示した。第二に、培養培地の中に生物学的に活性なGM−CSFは存在しなかった。無血清培地中のアポプトシス細胞の莫大な数は図10ｂに示すものと似た結果を生み出し、そして中和性抗GM−CS Fモノクローナル抗体4D4はAML細胞のアポプトシスを誘導しなかった（図10ｅ）。最後に、任意のGM−CSFが、ex vivoでin vitro培養物に移されたときにAMLの細胞に結合するかどうかを調べるため、本発明者は酸溶出の前後で¹²⁵Ｉ−ラベル化GM−CSFの細胞表層関連結合を測定した。特異的なGM−CSF結合において差は認められず、細胞がレセプター結合GM−CSFをキャリーオーバーしてないことが示唆された。E 21RはGMRαを欠く骨髄細胞のアポプトシスは誘導せず、E21Rが毒性でないことが示唆された。 E21Rの力価検定は完全アポプトシス効果が１μｇ／mlで達成されることを示した(図(ｄ))。100ng／mlのGM−CSF濃度はE21R（１μｇ／ml）媒介アポプトシスを効果的に阻害した(図(ｄ))。値は一のAML症例由来の３重測定の平均±SEMである。 IL−３（10ng／ml、Genetics Institute）ではなく、Ｇ−CSF(10ng／ml)を組合せると、E21Rはほぼ全ての細胞のアポプトシスを誘導した(図(ｅ))。末梢血液を急性化状態の未処置のCML患者（全てフィラデルフィア染色体陽性）から集め、そして上記のAML細胞と同じように処理した。アポプトシスは、0.1％ｖ／ｖの Triton X−100及びプロピジウムヨージド（50mg／ml）を含むバッファー中での一夜の細胞の三重培養物のインキュベーションの後にDNAに結合するプロピジウムヨージドの量の低下として、フローサイトメトリーにより決定した。実施例７正常造血細胞と類似して、骨髄白血病細胞はCD34表層マーカーを発現する高度に増殖性の先祖細胞の小プールに由来する。E21Rの効果がGMRα発現に関連する一般的な現象か、悪性細胞に限定されるものであるかを調べるため、正常CD34⁺ 先祖細胞の生存に対するE21Rの効果を研究した。骨髄細胞をフローサイトメトリーにより全CD34⁺，CD34⁺ CD38⁺（前駆体）、及びCD34⁺ CD33⁺（骨髄前駆）先祖細胞に分け、そしてアポプトシス画分をE21R処理後に決定した。DNA断片化はCD3 4⁺／GMRα⁺，CD34⁺ CD38⁺／GMRα⁺及びCD34⁺ CD33⁺／GMRα⁺サブセットにおいてあったが、非前駆CD34⁺ CD38^-細胞にはなかった（図９）。後者はGMRαを欠く。プロピジウムヨージドのDNA結合の分析はE21RがCD34⁺ CD38⁺／GMRα⁺（図11ａ，ｃ）、CD34⁺ ／GMRα⁺、及びCD34⁺ CD33⁺／GMRα⁺集団（図11ｃ）において細胞のアポプトシスを引き起こし、GM−CSFα鎖を欠く細胞では引き起こさないことを示した。Ｇ−CSFを有する培地中でE21RはCD34⁺ CD38⁺／GMRα⁺前駆先祖細胞のアポプトシスは誘導したが(図11(ａ))、CD34⁺ CD38^-／GMRα^-細胞は誘導しなかった(図11 (ｂ))。Ｇ−CSFと、GM−CSF又は幹細胞因子(SCF)のいづれかと組合せると、E21R は48時間後に全てのCD34⁺／GMRα⁺サブセットのアポプトシスを引き起したが、I L−３の添加はアポプトシスを阻止した(図11(ａ，ｃ))。非前駆CD34⁺ CD38^-／GM Rα^-細胞はE21R処理の影響を受けなかった(図11(ｂ，ｃ))。値は３症例由来の平均±SEMである。CD34⁺／GMRα⁺前駆先祖細胞によるコロニー形成の研究は、Ｇ− CSF、又はＧ−CSFとGM−CSF、又はＧ−CSFとSCFのいづれかと組合せたE21Rが事実上コロニー増殖を消失させ、一方E21RとＧ−CSF及びIL−３、又はE21RとＧ−C SF，SCF及びIL−３は前駆細胞のコロニー増殖を阻害しないことが示された(図11 (ｄ))。非前駆CD34⁺ CD38^-／GMRα^-サブセットのコロニー増殖はE21Rにより影響されなかった(図11(ｄ))。データーは(図11(ａ))においては３症例に由来し、値は平均±SEMである。骨髄細胞を集め、そして上記の通りにして処理した。アポプトシスは上記の通りにプロピジウムヨージドのDNA結合能の低下として測定した。造血性CD34⁺先祖細胞のメチルセルロースアッセイにおいてコロニー（＞40細胞）を調製し、そして14日後に評価した。三重測定培養物に本発明者はE21R（１μｇ／ml）、Ｇ−CS F(10ng／ml)、GM−CSF(10ng／ml)及びSCF(10ng／ml、Amgen)の様々な組合せを添加した。抗−GMRαモノクローナル抗体によるGMRα陽性細胞の精製により、事実上100 ％の細胞がE21Rによりアポプトシスとなった（図10ａ）。その結果は、E21Rを１ μｇ／mlの用量、即ち、高GMRα占拠率を確保する濃度で供与したとき、21／21 のAML症例（図10ｂ）及び14／14のCML症例（図10ｃ）で観察された。この濃度は力価検定実験に基づき、１μｇ／mlのE21Rが最大のアポプトシスを供した（図10 ｄ）。この効果はGMRαに対するE21R結果に依存し、なぜなら１μｇ／mlのE21R に対するGM−CSFの力価検定は100ng／mlのGM−CSF濃度がE21Rのアポプトシス効果を完全に消失させることを示したからである（図10ｄ）。実施例10 先祖細胞の増殖に対するE21Rの影響をコロニーアッセイで更に調べた。GM−CS F及びSCFを伴う又は伴わないE21RとＧ−CSFとの様々な組合せはコロニー増殖を事実上消失させ、一方IL−３の添加はE21Rによるコロニー増殖の阻害を解消し（図11ｄ）、前駆先祖細胞のE21R誘導アポプトシスと一致した（図11ｃと11ｄ）。 CD34⁺ CD38^-細胞は非前駆多能先祖細胞であることに注目すべきことが重要である。CD34⁺ CD38⁺細胞ではなく、前駆先祖細胞（CD34⁺ CD38⁺，CD34⁺ CD33⁺）のE 21R誘導式アポプトシスは幹細胞移植及び遺伝導入目的のための非前駆先祖細胞の富化にとって有用であろう。図13は双方のレセプター鎖の膜近位ドメインがアポプトシスの誘導のために重要であることを示す。請求の範囲 18．前記HGFがGM−CSFである、請求項17記載の方法。 19．前記HGFの拮抗剤が前記HGFに由来し、前記拮抗剤が前記HGFレセプターの α−鎖に結合することができる、請求項14記載の方法。 20．前記拮抗剤がGM−CSFの誘導体である、請求項19記載の方法。 21．前記GM−CSFの誘導体が、そのアミノ酸位置21位の酸性アミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基により置換されているものである、請求項20記載の方法。 22．前記酸性アミノ酸残基がGlu又はAspであり、前記塩基性アミノ酸残基がLy s又はArgであり、そして前記非酸性アミノ酸残基がGluもしくはAsn又はその誘導体である、請求項21記載の方法。 23．前記HGF拮抗剤がE21R又はE21Kである、請求項22記載の方法。 24．前記HGF拮抗剤がE21Rである、請求項23記載の方法。 25．前記アポプトシスを誘導する細胞が正常及び悪性骨髄細胞である、請求項 14記載の方法。 26．前記骨髄細胞が骨髄性白血病細胞である、請求項25記載の方法。 27．骨髄細胞由来の非前駆先祖細胞を富化するための方法であって、骨髄由来の細胞集団をHGFレセプターのα−鎖に結合できる有効量の分子と、前記α−鎖を担持する細胞のアポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成る、前記方法。 37．前記リーダー配列がアミノ酸配列MFATSSSTGNDGである、請求項36記載の方法。【図１】【図２】【図３】【図４】【図５】【図７】【図１０】【図１２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロペス，エンジェル，フランシスコオーストラリア国，サウスオーストラリア 5006，ノースアデレイド，スタンリーストリート 142 (72)発明者シャノン，マリー，フランセスオーストラリア国，サウスオーストラリア 5152，クラファーズ，ザクレセント８ (72)発明者チェア，キー−チーオーストラリア国，サウスオーストラリア 5159，アバーフォイルパーク，マスグレイブアベニュ 10 (72)発明者セン，キャロル，ルースオーストラリア国，サウスオーストラリア 5139，フォレストレンジ，ステンチフォードロード (72)発明者バスチラス，スタンオーストラリア国，サウスオーストラリア 5000，アデレイド，ボニソンクロース 21 (72)発明者ロビンス，アランオーストラリア国，サウスオーストラリア 5110，ワーテルローコーナー，バーカーロードロット８

Claims

【特許請求の範囲】１．HGF−特異的α−鎖及びβｃ鎖を含んで成る造血細胞増殖因子(HGF)ヘテロダイマーレセプターを担持する細胞においてアポプトシスを誘導するための方法であって、前記細胞を有効な量のHGF拮抗剤と、アポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成り、ここで前記HGF拮抗剤は第一α−ヘリックス内のアミノ酸配列を含んで成り、それにおいて酸性特性を有する前記HGFの第一α−ヘリックス内の１又は複数個の露出アミノ酸が塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基により置換されているものである、前記方法。２．前記HGFがインターロイキン（IL）である、請求項１記載の方法。３．前記HGFがIL−２，IL−３，IL−５，IL−６，IL−７，IL−９，IL−10，I L−11，IL−13，IL−14及びIL−15より選ばれる、請求項２記載の方法。４．前記HGFが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−CSF)、エリトロポイエチン(EPO)又はトロンボポイエチン(T PO)である、請求項１記載の方法。５．前記HGFがGM−CSFである、請求項４記載の方法。６．前記HGFの拮抗剤が前記HGFに由来し、前記拮抗剤が前記HGFレセプターの α−鎖に結合することができる、請求項１記載の方法。７．前記拮抗剤がGM−CSFの誘導体である、請求項６記載の方法。８．前記GM−CSFの誘導体が、そのアミノ酸位置21位の酸性アミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基により置換されているものである、請求項７記載の方法。９．前記酸性アミノ酸残基がGlu又はAspであり、前記塩基性アミノ酸残基がLy s又はArgであり、そして前記非酸性アミノ酸残基がGluもしくはAsn又はその誘導体である、請求項８記載の方法。 10．前記HGF拮抗剤がE21R又はE21Kである、請求項９記載の方法。 11．前記HGF拮抗剤がE21Rである、請求項10記載の方法。 12．前記アポプトシスを誘導する細胞が正常及び悪性骨髄細胞である、請求項１記載の方法。 13．前記骨髄細胞が骨髄性白血病細胞である、請求項12記載の方法。 14．ヒト対象者の骨髄性白血病を処置するための方法であって、前記ヒト対象者に有効な量のHGF拮抗剤を投与することを含んで成り、ここでこの投与は前記骨髄性白血病の細胞のアポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で接触させるものとし、ここで前記HGF拮抗剤は第一α−ヘリックス内のアミノ酸配列を含んで成り、それにおいて酸性特性を有する前記HGFの第一α−ヘリックス内の１又は複数個の露出アミノ酸が塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基により置換されているものである、前記方法。 15．前記HGFがインターロイキン（IL）である、請求項14記載の方法。 16．前記HGFがIL−２，IL−３，IL−５，IL−６，IL−７，IL−９，IL−10，I L−11，IL−13，IL−14及びIL−15より選ばれる、請求項15記載の方法。 17．前記HGFが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−CSF)、エリトロポイエチン(EPO)又はトロンボポイエチン(T PO)である、請求項14記載の方法。 18．前記HGFがGM−CSFである、請求項17記載の方法。 19．前記HGFの拮抗剤が前記HGFに由来し、前記拮抗剤が前記HGFレセプターの α−鎖に結合することができる、請求項14記載の方法。 20．前記拮抗剤がGM−CSFの誘導体である、請求項20記載の方法。 21．前記GM−CSFの誘導体が、そのアミノ酸位置21位の酸性アミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基により置換されているものである、請求項20記載の方法。 22．前記酸性アミノ酸残基がGlu又はAspであり、前記塩基性アミノ酸残基がLy s又はArgであり、そして前記非酸性アミノ酸残基がGluもしくはAsn又はその誘導体である、請求項21記載の方法。 23．前記HGF拮抗剤がE21R又はE21Kである、請求項22記載の方法。 24．前記HGF拮抗剤がE21Rである、請求項23記載の方法。 25．前記アポプトシスを誘導する細胞が正常及び悪性骨髄細胞である、請求項 14記載の方法。 26．前記骨髄細胞が骨髄性白血病細胞である、請求項25記載の方法。 27．骨髄細胞由来の非前駆先祖細胞を富化するための方法であって、骨髄由来の細胞集団をHGFレセプターのα−鎖に結合できる有効量の分子と、前記α−鎖を担持する細胞のアポプトシスを誘導するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含んで成る、前記方法。 28．前記分子がHGFの第一α−ヘリックス内のアミノ酸配列を有するHGFの誘導体であり、それにおいて酸性又は酸性様特性を有するHGFの第一α−ヘリックス内の１又は複数個の露出アミノ酸が塩基性アミノ酸残基又は非酸性アミノ酸残基により置換されているものである、請求項27記載の方法。 29．前記分子がGM−CSFの誘導体、インターロイキンＧ−CSF，EPO又はTPOである、請求項28記載の方法。 30．前記分子がGM−CSFである、請求項29記載の方法。 31．前記分子がE21R又はE21Kである、請求項30記載の方法。 32．前記分子がE21Rである、請求項30記載の方法。 33．組換分子を製造するための方法であって、前記組換分子を産生するためのヌクレオチド配列を発現できる遺伝子構築体を細胞の中に導入し、この細胞を前記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件に委ね、発現された組換分子を封入体の形態で回収し、そして前記封入体を前記組換分子をほどくのに十分に高いpH の条件下でカオトロピック剤の中で溶解し、このほどけた組換分子を希釈し、そしてそれをリフォルディング条件に委ね、次いでこのリフォルディングした組換分子を精製することを含んで成る方法。 34．前記カオトロピック剤が尿素である、請求項33記載の方法。 35．前記組換分子がGM−CSF又はその突然変異体である、請求項34記載の方法。 36．前記ヌクレオチド配列が前記組換分子に融合したリーダー配列を更にコードしている、請求項33記載の方法。 37．前記リーダー配列がアミノ酸配列MFATSSSTGNDである、請求項36記載の方法。