JPH11509172A - 目的の機能ドメインを有するポリペプチドおよびそれの同定および利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 目的とする機能領域を有する新規のポリペプチドと、このポリペプチドをコードするDNA配列が記載されていろ。これらのポリペプチドを同定する方法として、配列非依存的な（すなわち発見したポリペプチドの一次配列には非依存的に）、認識単位に基づいた機能的スクリーニングの手段も開示されている。本方法および同定されたポリペプチドの様々な応用が記載され、薬剤の発見、修飾および精製のための検定キットへのこれらの利用も含まれている。

Description

【発明の詳細な説明】 目的の機能ドメインを有するポリペプチドおよびそれの同定および利用法 本出願は、1995年4月7日に出願された係属中の米国特許出願第08/417872（本 明細書中に全て参考文献として援用される）の一部継続出願である。1. 産業上の利用分野 本発明は、目的の機能ドメインを有するポリペプチドおよびその機能的同等物 に関する。これらのポリペプチドの同定法および、対標的薬剤投与法を一例とし て含むそれらの様々な利用法が記載される。2. 背景技術 混成ライブラリー（combinatorial）は、基礎化学研究および薬剤設計におけ る非常に興味深い新しい道具の代表である。合成化学または分子生物学によって 、多くのサブユニットの並び方を有する複雑なポリマーのライブラリーを生成す ることが可能である。このようなライブラリーには、多くの類似物が存在する。 即ち、プラスチック・ピン上（Geysen et al.,1987,J.Immunol.Meth.102:259-27 4）、ビーズ（Lam et al.,1991,Nature 354:82-84）上に、または可溶型で（Hou ghten et al.,1991,Nature 354:84-86）合成され得、またはウィルス粒子の表面 に発現され得る（Cwirla et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382； Kay et al.,1993,Gene 128:59-65；Scott and Smith,1990,Science 249:386-390 ）ランダムペプチド；核酸（Ellington and Szostak,1990,Nature 346:818-822 ；Gao et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11207-11211；Tuerk and Gold, 1990,Science 249:505-510）；および小有機分子（Gordon et al.,1994,J.Med.C hem.37:1385-1401）である。これらのライブラリーはタンパク質間相互作用のマ ッピングおよび薬剤の発見において非常に有用である。 ファージ・ディスプレイは、目的の標的分子に対する親和性を有する分子を多 数のペプチド、変異タンパク質、およびcDNAからスクリーニングするための強力 な方法となっている。10⁸から10⁹個の異なる組み換え体を生成することが可能で あり、これらの中から、抗原、抗体、細胞表面受容体、タンパク質シャペロン、 DNA、金属イオンその他に対する親和性を有する1つ以上のクローンが選択され得 る。ライブラリーのスクリーニングは、提示される因子がキャプシド融合タンパ ク質としてウィルス表面に発現されるため、多用途に用いられ得る。この方法の 最も重要な結果は、表現型（フェノタイプ）と遺伝型（ジェノタイプ）の間に物 理的な関連が存在するということである。さらに、1）ライブラリーから親和性 セレクションによって単離されたウィルス粒子は、単に細菌に感染させることに よって再生され得る、2）提示された結合ペプチドまたはタンパク質の一次構造 は、ウィルスゲノム中のクローニングされた断片をDNA配列決定することによっ て容易に推定され得る、といういくつかの他の利点が存在する。 混成ペプチドライブラリーはバクテリオファージによって発現される。複数の 不特定のコドンを有する一定の長さの合成オリゴヌクレオチドが、バクテリオフ ァージM13の遺伝子III、VI、またはVIII中にクローン化され得、それによって多 数のペプチド：キャプシド融合タンパク質として発現される。しばしばランダム ペプチドライブラリーと呼称されるこれらのライブラリーは、目的の標的分子に 対する結合に関してスクリーニングされ得る。通常、一週間以内に3から4回のス クリーニングが達成され得、1から数百の結合ファージの単離が成され得る。 次に個々のクローンの塩基配列決定によって、結合ペプチドの一次構造が推定 される。ペプチド配列の観察から、一般的なモチーフすなわちコンセンサス配列 が判明する場合がある。一般的に、このモチーフが可溶性ペプチドとして合成さ れた場合には、完全な結合活性を有する。ランダムペプチドライブラリーから、 抗体のFab部位（Cwirla et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382；S cott and Smith,1990,Science 249:386-390）、細胞表面受容体（Doorbar and W inter,1994,J.Mol.Biol.244:361-369；Goodson et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 91:7129-7133）、細胞質内受容体（Blond-Elguindi et al.,1993,Cell 75 :717-728）、細胞内タンパク質（Daniels and Lane,1994,J.Mol.Biol.243:639-6 52;Dedman et al.,1993,J.Biol.Chem.268:23025-23030；Sparks et al.,1994,J. Biol.Chem.269:23853-23856）、DNA（Krook et al.,1994,Biochem.Biophys.Res. Comm．204:849-854）、および多数の他の標的（Winteer,1994,Drug Dev.Res.33: 71-89）に結合する複数のペプチドが首尾良く産生されてきた。 多くの重要な細胞内反応は、タンパク質間の複雑な相互作用の形をとる細胞内 の信号伝達によって制御されている。信号伝達、すなわち細胞内の情報の流れの 研究は広く深く行われてきており、これらのタンパク質間相互作用がしばしば信 号伝達タンパク質中の独立機能ドメインによって媒介されることが明らかになっ てきた。最初に発見されたガン原遺伝子（プロトオンコジーン）の生産物であり 最初に発見されたチロシンキナーゼであるSrcは（Taylor and Shalloway,1993,C urrent Opinion in Genetics and Development 3:26-34）、独立機能ドメインを 含む典型的なタンパク質である。 Srcは60kDのタンパク質チロシンキナーゼであり、細胞膜上に存在する。Srcは 1970年代にRous腫瘍ウィルスのガン原因子として最初に発見され、1980年代に動 物細胞の信号伝達系の構成要素であると考えられた。しかし、Srcのウィルス型 および細胞型（すなわちv-Srcおよびc-Src）の同定以後、それらのガン化、正常 細胞の増殖、および発生における各々の役割は完全には解明されていない。 そのチロシンキナーゼ領域（Srcホモロジー1ドメインと呼ばれる場合がある） に加えて、Srcは多くのタンパク質において機能的および構造的相同物を有する ことが知られている2つの領域を含む。これらの領域はSrcホモロジー2（SH2）ド メインおよびSrcホモロジー3（SH3）ドメインと呼ばれている。SH2およびSH3ド メインは、これらを含むタンパク質によらない折り畳みをし、NおよびC末端が互 いに空間的に近い二次構造をとり、様々なタンパク質において様々な位置（N末 端からC末端の各所）に存在するという点において独立機能を有する（Cohen et al.,1995,Cell 80:237-248）。SH2ドメインは良く研究されており、リン酸化さ れたチロシン残基への結合に関わることが知られている（Pawson and Gish,1992 ,Cell 71:359-362）。 SrcのSrcホモロジー領域3（SH3）は、長さ60から70アミノ酸であり、多くの細 胞タンパク質中に存在するドメインである（Cohen et al.,1995,Cell 80:237-24 8；Pawson,1995,Nature 373:573-580）。c-SrcはSH3ドメイン中の変異によって 活性化され得る（すなわち形質転換能を有する）ため（Jackson et al.,1993,On co gene 8:1943-1956；Seidal-Dugan et al.,1992,Mol Cell Biol 12:1835-1845） 、Src中では、SH3ドメインは負の阻害性ドメインと考えられている。 Ab1のSH3ドメインの結合特異性を推定するために、David Baltimoreのグルー プはcDNAライブラリーを放射性標識したGST-Abl SH3融合タンパク質を用いてス クリーングし、2つの結合性cDNAクローンを同定した（Cicchetti et al.,1992,S cience 257:803-806）。これらのクローンの両者とも、後にSH3結合ドメインで あることが示されたプロリンに富む領域を有するタンパク質をコードしていた。 次に、他のグループが混成ペプチドライブラリーをスクリーニングし、Src SH 3ドメインに結合するペプチドを同定した（Yu et al.,1994,Cell 76:933-945；C headle et al.,1994,J.Biol.Chem.269:24034-24039）。SrcのSH3ドメインを用い て、Sparks et al.,1994,J.Biol.Chem．269:23853-23856は、ファージ提示ラン ダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、特異的に高親和性でSrc SH3ド メインに結合するコンセンサスペプチド配列を同定した。 これらの様々な研究から得られた結果は、Src SH3の最適なペプチド・リガン ドはRPLPPLP（SEQ ID NO:45）であるということである。最近、ペプチド-SH3ド メイン複合体の構造がNMRによって推定され、このペプチドはSH3ドメインに対し て2つの可能な方向で結合することが示された（Feng et al.,1994,Science 266: 1241-1247；Lim et al.,1994,Nature 372:375-379）。 SH3ドメインは細胞内の重要な信号伝達および構造因子の機能において重要な 役割を有することが発見されたため、SH3領域を含むタンパク質の同定法は非常 な興味の対象である。この点に関し、SH3を含む独立機能ドメインの配列の類似 性が低いため、このような方法が利用不可能であることに留意するのが重要であ る（例えば、既知の様々のSH3ドメイン間の最小一次配列相同性を図示した図6参 照）。 配列相同性検索は未だ認識されていない目的の機能ドメインを含む既知のタン パク質を同定し得るが、この方法が成功するためには、配列相同性は通常40％以 上でなくてはならない。機能ドメインは通常40％以下の相同性であるため、多く は配列相同性検索では認識されない。さらに、相同性検索では新規のタンパク質 は同定されず、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列がすでに定められ、データベー スに存在するタンパク質のみが同定される。 別の方法は、発現ライブラリー中から新規のタンパク質を検索するために、ヌ クレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション法を用いることである。機 能ドメインは配列相同性が低いため、この方法は機能ドメインを含む新規のタン パク質の同定には殆ど利用できない。 タンパク質間相互作用に関わる相手のタンパク質の単離法は、主にすでに発見 され解析されたタンパク質に対するリガンドを発見することに集中してきた。こ のような方法には、cDNA発現ライブラリー中から結合リガンドをスクリーニング するために、既知のタンパク質の代替物として働く抗イディオタイプ遺伝子型抗 体を利用することが含まれる（Jerne,1974,Ann.Immunol.(Inst.Pasteur)125c:37 3-389；Sudol,1994,Oncogene 9:2145-2152）。Skolnick et al.,1991,Cell 65:8 3-90は、PI3キナーゼの結合相手を単離した。cDNA発現ライブラリーを³²Ｐ標識 したチロシンによってカルボキシル末端をリン酸化された表皮成長因子受容体（ EGFR）を用いてスクリーニングした。 タンパク質間相互作用に関わる、操作上定義されるリガンドの単離、およびリ ガンドの結合に関与する機能ドメインを含む多数のタンパク質の同定の簡便な方 法は、極めて望ましい。 このような方法が利用され得るならば、目的のいかなる機能ドメインの機能型 を有するいかなるポリペプチドの単離にも有効であると考えられる。このような 総合的な方法は、目的の機能ドメインの各自の型を有する関連するタンパク質の 全体的なファミリーが同定され得るという点において、極めて有用であると考え られる。このような関連するタンパク質を知ることは、細胞増殖または死、悪性 腫瘍、および免疫応答を一例として含む様々な生理的過程に対する我々の理解に 大いに資すると考えられる。このような方法はまた、より副作用の少ない、さら により効果的な治療、診断、または予防薬の開発にも資すると考えられる。 本発明によって、まさにこのような方法が提供される。 SH3ドメインを含むタンパク質に関し、細胞増殖（Zhu et al.,1993,J.Biol.Ch em.268:1775-1779；Taylor and Shalloway,1994,Nature 368:867-871）、悪性腫 瘍（Wages et al.,1992,J.Virol．66:1866-1874；Bruton and Workman,1993,Can cer Chemother.Pharmacol．32:1-19）、細胞骨格および/または細胞膜へのタン パ ク質の細胞内局在（Weng et al.,1993,J.Biol.Chem．268:14956-14963；Bar-Sag i et al.,1993,Cell 74:83-91）、信号伝達（Duchesne et al.,1993,Science 25 9:525-528）、細胞形態（Wages et al.,1992,J.Virol．66:1866-1874；McGlade et al.,1993,EMBO J．12:3073-3081）、神経分化（Tanaka et al.,1993,Mol.Cel l.Biol．13:4409-4415）、T細胞の活性化（Reynolds et al.,1992,Oncogene 7:1 949-1955）、および細胞内オキシダーゼ活性（McAdara and Babior,1993,Blood 82:A28）に対する我々の理解に、本発明の方法は大いに資すると考えられる。 本明細書中上記の参考文献は、これらが本発明の先行技術であるという認識と して解釈されるべきものではない。3. 発明の概要 本発明は概して、リガンドに結合する多数の化合物のセットを最もよく同定す るための結合相互作用に関与する、単離され、操作上（operationally）定義さ れたリガンドの利用法に関する。一つの態様においては、単離されたリガンドは 、特異的なタンパク質間相互作用に関わるペプチドであり、リガンドに結合する 一連の新規の独立機能ドメインを含むタンパク質を同定するために用いられる。 この方法を用いて、低い類似性しか有さないが共通の機能を有する複数のタンパ ク質が発見され得る。 本発明は、目的の機能ドメインを有するポリペプチドまたはポリペプチドのフ ァミリーの同定法に関する。この方法の基本的な段階は、（a）目的の機能ドメ インを有する標的分子に対する選択的親和性を有する認識ユニットまたは一連の 認識ユニットを選択し、（b）認識ユニットを多数のポリペプチドど接触させ、 （c）認識ユニットに対して選択的な結合親和性を有するポリペプチド（目的の 機能ドメインまたはその機能上等価物を含む）を同定することからなる。 本発明のある態様においては、目的の機能ドメインを有するポリペプチドの網 羅的なスクリーニングには、SH3ドメインを含むタンパク質を同定するために、 一次スクリーニングで同定されたSH3ドメインに対するリガンドまたは認識ユニ ットが続けて発現ライブラリーのスクリーニングに用いられる反復過程が含まれ る。 特に、本発明の方法には、目的の機能ドメインを有する標的分子に対する選択 的親和性を有する認識ユニットの選択が含まれる。この認識ユニットを用いて（ 特に本発明による多価認識ユニットスクリーニングの条件下で）、認識ユニット に対して選択的結合親和性を有するいくつかのポリペプチドが同定され得るよう な方法で、様々な材料由来の複数のポリペプチドが試験され得るということがさ らに発見された。そのようにして同定されたポリペプチドは、目的の機能ドメイ ンを含むことが示された。すなわち、発見された機能ドメインは、目的の機能ド メインと同じ結合特異性を示すことが可能な活性型である。すなわち、本方法に よって同定されたポリペプチドは、これらの関連するポリペプチドに対して、当 初の標的分子の目的のドメインと同じ、同様の、または類似の（機能的には同等 の）選択親和性特性を示させ得る目的の機能ドメインの特性を有する。多数のタ ンパク質から結合性認識ユニットをスクリーニングすることによって、本発明の 方法は旧来のDNAに基づくスクリーニング法の限界を克服し、機能的に等価の機 能ドメインを有する極めて多岐のタンパク質配列の同定を可能にする。 本発明の特定の態様においては、cDNA発現ライブラリー中に存在するタンパク 質から多数のポリペプチドが得られる。目的の機能ドメインまたはその機能上の 等価物を含むポリペプチドの、様々なペプチドまたは認識ユニットに対する特異 性が次に検査され、特定のポリペプチド/認識ユニット相互作用の生理的な役割 をよりよく理解することが可能になり得る。実際、認識ユニット-ポリペプチド 対、または認識ユニットと各々が目的の機能ドメインの機能上の等価物（例えば 、同じ結合特異性を示す、すなわち同じ認識ユニットに結合し得る）を1コピー する関連するポリペプチドの「パネル」間の、相互作用に与える特定の薬剤候補 物質の観察された効果に基づいた薬剤の検索法を本発明は提供する。 本発明はまた、いくつかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。さ らに、本発明はまたいくつかのコーディング配列からなるDNA配列を含む核酸を 提供する。本発明の方法を用いて、SH3ドメインを含む18以上の異なったタンパ ク質が同定され、その半数以上は以前に記載されていない。 本発明は、発現ライブラリーまたは他のポリペプチド材料のスクリーニングに 用いられる認識ユニットの結合価（すなわち、単体であるか、2量体であるか、4 量体であるか等）が、認識ユニット-機能ドメイン相互作用に明らかに著しい効 果を及ぼすことを予期せず発見した。本発明者は、小さいペプチド、多価型の認 識ユニットの特異性は弱いが、特異性を喪失しないということを発見した。特に 、多価（4価と考えられる）ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼ複合体 に結合したビオチニル化ペプチドは、予期せぬ性質特異性を有する。このため、 ペプチドにとっての元来の標的機能ドメインに同一ではないが類似の機能ドメイ ンを含むポリペプチドのクラスを同定するためにライブラリーをスクリーニング するために、このようなペプチドが用いられることが可能になる。 本発明はまた、新規の薬剤となり得る候補（および先行化合物となり得るもの ）の同定およびその特性の決定の方法を提供する。例えば、目的の機能ドメイン を有するポリペプチドおよび認識ユニット（例えば結合ペプチド）が互いに選択 的親和性を示す場合、ポリペプチド-認識ユニット相互作用に影響を及ぼす薬剤 （例えば相互作用の作用薬または反作用薬（阻害剤）として）を同定しようと試 み得る。次にこの試験を用いて、一連の薬剤の候補の中から、最も望ましい特性 （例えば、ポリペプチドと結合する認識ユニットの相互作用を破壊する、または 競合するために最も効果的なもの）を有するものをスクリーニングし得る。 さらに、本発明はまた、機能ドメインを含むポリペプチドの認識ユニットへの 結合に影響し得る候補薬剤をスクリーニングするためのいくつかの試験キットお よびそれらの試験キットの利用法を提供する。本発明の特定の態様においては、 試験キットは、（a）目的の機能ドメインを含むポリペプチド、および（b）この ポリペプチドに選択的親和性を有する認識ユニットからなる。さらに別の試験キ ットは、各々が目的の機能ドメインを含む多数のポリペプチド、およびこれらの ポリペプチドの各々に対して選択的親和性を有する少なくとも一つの認識ユニッ トからなり得る。ここにおける目的の機能ドメインは、SH1、SH2、SH3、PH、PTB 、LTM、アルマジロ、ノッチ/アンキリンリピート、ジンクフィンガー、ロイシン ジッパー、およびヘリックス−ターン−ヘリックスから選択されたドメインであ る。 本発明の他の目的は、以下の詳細な記載をさらに考慮した場合通常の当業者に は明白である。4 ．図面の説明 図1は、目的の機能ドメインを有する標的分子に対して特異的親和性を示す認 識ユニットの同定法の概略の模式図である。この図では、標的分子はSH3ドメイ ンを有するポリペプチドであり、認識ユニットはファージ提示ライブラリーによ って発現されたSH3ドメインに対して特異的親和性を有するペプチドである。 図2は、SH3ドメインを含むことが知られている既知のポリペプチドの「パネル 」に対して、Src SH3ドメインに結合する特定の認識ユニット（この場合、2つの 7量体ペプチド）が示す選択性を示す。SH3を含まないタンパク質であるGSTは対 照である。RPLPPLPはSEQ ID NO:45であり、APPVPPRはSEQ ID NO:203である。 図3は、適当な認識ユニットを用いて多数のポリペプチドをスクリーニングす ることによって、目的の機能ドメインを有するポリペプチドを同定する方法の概 略の模式図である。図中では、cDNA発現ライブラリーから複数のポリペプチドが 得られ、認識ユニットはSH3ドメイン結合ペプチドである。 図4は、他のSH3ドメインを含むタンパク質を同定するためにどのようにしてSH 3ドメイン結合ペプチドが用いられ得るかを図示する。示したのは、目的の機能 ドメインを有する標的分子の一次スクリーニング、認識ユニットの選択、および 認識ユニットに対して選択的親和性を有し目的の機能ドメインまたはその等価物 を含むポリペプチドの同定の進行の模式図である。 図5は、ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼ（SA-AP）と結合した型 の、ビオチニル化したSH3結合ペプチド認識ユニットでプローブ探査した、λcDN Aライブラリーの一次（図5B）および三次（図5A）スクリーニングのフィルター を図示する。λEXlox中のマウスの16日胚cDNAライブラリーを、ビオチニル化pSr cCIIとSA-AP間で形成された多価複合体と共に保温した。ペプチド結合の部位は 、BCIP（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-リン酸-p-トルイジン塩）およびNBT （塩化ニトロブルー テトラゾリウム）とともに約5分間保温することによって検 出された。 図6は、様々な既知のSH3ドメイン間の最小一次配列相同性を示すSH3ドメイン の比較を示す。示したアミノ酸配列は、SEQ ID NO:68から111である。 図7Aは、円によって表される機能ドメインの集団の模式図である。「A」は一 つの円のみに特異的な認識ユニットである。一方Bは、3つのドメインを認識し、 B1およびB2は各々2つしか認識しない。図7Bは、新しい認識ユニットが最初の認 識ユニットに含まれないポリペプチドに基づいて選択される反復法を図示する。 これらの新しい認識ユニットは、他の関連するポリペプチド等の同定につながり 、さらに多岐に渡る関連する集団の構成分子の研究範囲を拡大させる。 図8は、いくつかのSH3認識ユニットの結合特異性を図示する。ビオチニル化さ れたクラスI（pSrcCI）またはクラスII（pSrcCII）Src SH3ドメイン認識ユニッ ト、Crk SH3認識ユニット（pCrk）、PLCγ SH3ドメイン認識ユニット（pPLC）、 およびAbl SH3ドメイン認識ユニット（pAbl）が、2組のミクロタイタープレート 上に固定した図に示すGST-SH3ドメイン融合タンパク質への結合に関して検査さ れた。認識ユニットは図の左側に示し、GST-SH3ドメイン融合タンパク質は下辺 に示す。認識ユニットはビオチニル化ペプチドとストレプトアビジン-セイヨウ ワサビパーオキシダーゼ（SA-HRP）との多価複合体として（複合体）、または単 価のビオチニル化ペプチド（非複合体）として、保温した後にSA-HRPとともに保 温した。平均の光学濃度を示す。 図9は、本発明を用いて単離されたSH3ドメインを含むタンパク質の模式図であ る。各配列のクローン名、遺伝子名、スクリーニングの種類、個々の元のクロー ン数を示す。図は大きさに合わせてあり、SH3ドメインは約60アミノ酸である。 略語AR、P、CR、E/P、およびSH2はアンキリンリピート、プロリンに富む配列、 コルタクチンリピート、グルタミン酸/プロリンに富む配列、およびSrcホモロジ ー2ドメインを各々表す。末端は、各cDNAの予想される翻訳開始部位を示す。マ ウス、ヒト1、およびヒト2ライブラリーはそれぞれ、マウス16日胚、ヒト骨髄、 ヒト前 立腺ガンcDNAライブラリーに対応する。pSrcIIおよびpCort認識ユニットについ ては6.1.章参照。 図10Aおよび10Bは、本発明を用いて単離されたタンパク質中のSH3ドメインの 配列の比較である。各クローンの名前と遺伝子名を示す。適切な場合、1つのポ リペプチドの複数のSH3ドメインをN末端からC末端に向かってA、B、C等と呼ぶ。 点は、類似の残基の並列が最大になるように導入されたギャップである。Srcお よびGrb2/Sem5のSH3ドメイン中の、リガンドとの結合に関与することが示された 保存された残基（Tomasetto et al.,1995,Genomics 28:367-376）に対応する位 置は、それぞれ太字および下線で示す。SH3P1から8およびSH3P10から13の一次構 造はマウスに対応し、SH3P15から18、クローン5、34、40、41、45、53、55、56 、および65はヒトに、SH3P9およびSH3P14はマウス（m）またはヒト（h）cDNAク ローンに対応する。配列の比較のため、マウスc-Src SH3ドメインの配列（Genba nk登録番号P41240）を示す。マウスのコルタクチン、SPY75/HS1、Crk、およびヒ トMLN50、Lyn、Fyn、およびSrcのGenbank登録番号はそれぞれ、U03184、D42120 、S72408、X82456、M16038、P06241、およびP41240である。示したアミノ酸配列 はSEQ ID NO:112から140である。 図11は、5.2.1章に記載する特異性連続体を示す。「SA-APペプチド複合体」は 、前述の章で記載するストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼとビオチニ ル化ペプチドの多価（恐らく4価）複合体を示す。 図12は、ペプチド認識ユニットが合成され、6.1および6.1.1章に記載する新規 SH3ドメインへの結合能を検査された実験の結果を示す。-は結合しないことを、 +は結合を、+の数は結合の強さを示す。詳細については6.2章参照。示したアミ ノ酸配列はSEQ ID NO:141から168である。 図13は、図12に示した実験のさらなるデータである。示したアミノ酸配列は、 SEQ ID NO:169から188である。 図14は、ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼと前もって結合させた 場合に、SH3ドメインに対するビオチニル化ペプチドの親和性に及ぼす効果を示 す。詳細は6.3.1章参照。 図15は、ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼと前もって結合させた 場合に、ナイロン膜上に固定したGST-SH3ドメイン融合タンパク質に対するビオ チニル化ペプチドの親和性に及ぼす効果を示す。詳細は6.3.2参照。 図16は、ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼと前もって結合させた 場合に、cDNAクローンによって発現されたSH3ドメインを含むタンパク質に対す るビオチニル化ペプチドの親和性に及ぼす効果を示す。詳細は6.3.3章参照。 図17は、網羅的に発現ライブラリーからSH3ドメインを含むタンパク質をスク リーニングするための戦略である。混成ペプチドライブラリーからGST融合タン パク質として細菌に発現させたSH3ドメインに対する結合分子をスクリーニング することによって、ペプチド認識ユニットが産生される。このペプチドは次に、 cDNA発現ライブラリー中の一連のSH3ドメインを含むタンパク質をスクリーニン グするために、多価ストレプトアビジン-ビオチニル化ペプチド複合体として用 いられる。一次発現ライブラリースクリーニングで同定されたSH3ドメインの認 識ユニットを同定するために、混成ライブラリーがもう一度用いられる。これら の認識ユニットは重複する一群のタンパク質を発現ライブラリーから同定する。 この過程を何回も繰り返すことによって、与えられたcDNAライブラリー中の全て のSH3ドメインを系統的にクローニングすることが可能である。 図18は、マウスp53bp2であるSH3P1のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:5）を示す 。 図19は、マウスp53bp2であるSH3P1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:6）を示す。 図20は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P2のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:7 ）を示す。 図21は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:8）を 示す。 図22は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P3のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:9 ）を示す。 図23は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P3のアミノ酸配列（SEQ ID NO:10） を示す。 図24は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P4のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1 1）示す。 図25は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P4のアミノ酸配列（SEQ ID NO:12） を示す。 図26は、マウスのコルタクチンであるSH3P5のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1 3）を示す。 図27は、マウスのコルタクチンであるSH3P5のアミノ酸配列（SEQ ID NO:14） を示す。 図28は、マウスのMLN50であるSH3P6のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:15）を示 す。 図29は、マウスのMLN50であるSH3P6のアミノ酸配列（SEQ ID NO:16）を示す。 図30は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P7のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1 7）を示す。 図31は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P7のアミノ酸配列（SEQ ID NO:18） を示す。 図32は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P8のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1 9）を示す。 図33は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P8のアミノ酸配列（SEQ ID NO:20） を示す。 図34は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P9のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:2 1）を示す。 図35は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P9のアミノ酸配列（SEQ ID NO:22） を示す。 図36は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P9のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:23 ）を示す。 図37は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P9のアミノ酸配列（SEQ ID NO:24）を 示す。 図38は、マウスのHS1であるSH3P10のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:25）を示 す。 図39は、マウスのHS1であるSH3P10のアミノ酸配列（SEQ ID NO:26）を示す。 図40は、マウスのCrkであるSH3P11のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:27）を示 す。 図41は、マウスのCrkであるSH3P11のアミノ酸配列（SEQ ID NO:28）を示す。 図42Aは、マウスの新規の遺伝子であるSH3P12の1から2600の位置のヌクレオチ ド配列（SEQ ID NO:29の一部）を示す。 図42Bは、マウスの新規の遺伝子であるSH3P12の2601から3335の位置のヌクレ オチド配列（SEQ ID NO:29の一部）を示す。 図43は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P12のアミノ酸配列（SEQ ID NO:30） を示す。 図44は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P13のヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 31）を示す。 図45は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P13のアミノ酸配列（SEQ ID NO:32） を示す。 図46Aは、マウスのH74であるSH3P14の1から2400の位置のヌクレオチド配列（S EQ ID NO:33の一部）を示す。 図46Bは、マウスのH74であるSH3P14の2351から4091の位置のヌクレオチド配列 （SEQ ID NO:33の一部）を示す。 図47は、マウスのH74であるSH3P14のアミノ酸配列（SEQ ID NO:34）を示す。 図48は、ヒトのH74であるSH3P14のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:35）を示す 。 図49は、ヒトのH74であるSH3P14のアミノ酸配列（SEQ ID NO:36）を示す。 図50は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P17のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:37 ）を示す。 図51は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P17のアミノ酸配列（SEQ ID NO:38）を 示す。 図52Aは、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P18のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:3 9）を示す。 図53は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P18のアミノ酸配列（SEQ ID NO:40）を 示す。 図54は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン55のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:189）を示す。 図55は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン55のアミノ酸配列（SEQ ID NO:19 0）を示す。 図56は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン56のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:191）を示す。 図57は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン56のアミノ酸配列（SEQ ID NO:19 2）を示す。 図58Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン65の1から1720の位置のヌクレオ チド配列（SEQ ID NO:193の一部）を示す。 図58Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン65の1721から2873の位置のヌク レ オチド配列（SEQ ID NO:193の一部）を示す。 図59は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン65のアミノ酸配列（SEQ ID NO:19 4）を示す。 図60は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン34のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:195）を示す。 図61Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン34のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:196の一部）を示す。 図61Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン34のアミノ酸配列の一部（SEQ I D N0:196の一部）を示す。 図62は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン41のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:197）を示す。 図63Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン41のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:198の一部）を示す。 図63Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン41のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:198の一部）を示す。 図64Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン53のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:199）を示す。 図65Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン53のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:200の一部）を示す。 図65Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン53のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:200の一部）を示す。 図66Aおよび66Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン5のヌクレオチド配列 （SEQ ID NO:220）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:221）を示す。5 ．発明の詳細な説明 上述したように、本発明は広く目的の機能ドメインを有するある種のポリペプ チドに関し、それらのポリペプチドの同定および利用法に関する。本発明はまた 、リガンドに結合する化合物の網羅的な一群を最も良く同定するための、結合相 互作用に関わる、単離され、操作上定義されたリガンドの利用法、および化合物 、標的分子、および一つの態様においては目的の機能ドメインを有するポリペプ チド、およびこれらの化合物の利用法に関する。以下の詳細な説明は、本発明を さらに明解にし、本発明の特定の態様を実施することに興味を持ち得る通常の当 業者をさらに助けるために提供される。 始めに、いくつかの定義を列記する。すなわち、「ポリペプチド」という用語 はペプチド（すなわちアミド）結合によって連結したアミノ酸残基からなる分子 を指し、タンパク質およびポリペプチドを含む。よって、本発明のポリペプチド は1つまたは複数の共有結合したアミノ酸鎖からなり得、さらにはジスルフィド 結合からなる分子間または分子内結合を含み得る。いくつかのポリペプチドもま た、多ユニットの巨大分子複合体を形成し得る。自然においては、ポリペプチド は高次構造上の傾向を有し、三次元構造をとることが期待され得る。高次構造上 の傾向と三次元構造の両者とも、通常はポリペプチドの一次（すなわちアミノ酸 ）配列および/またはジスルフィド結合または他の共有または非共有分子間また は分子内相互作用の存在（または不在）によって定められる。 本発明のポリペプチドは、いかなる大きさでもあり得る。予想されるように、 ポリペプチドは広範な分子量をとり得、あるものは150から200kDを超える。典型 的には、ポリペプチドは約5000から約100000ダルトンの範囲の分子量を有し得る 。さらに他のものは、例えば約10000から約75000ダルトン、または約20000から 約5 0000ダルトンの小さい範囲に存在し得る。 「機能ドメイン」という語は、目的の特定の機能を果たす能力を与えるポリペ プチドの領域を指す。この機能は、一例として機能ドメインの関与するタンパク 質間相互作用（例えば結合相互作用）、機能ドメインまたは機能ドメインが作用 する分子の構造変化または異なる化学的状態への変化、細胞間または細胞内信号 伝達、遺伝子またはタンパク質発現の制御、細胞増殖または死の制御、または免 疫応答の活性化または阻害を含み得る、可逆的または非可逆的な生物的、化学的 、または生理的影響を引き起こし得る。さらに、「目的の」機能ドメインは、与 えられた標的分子に存在する特定の機能ドメインによって定められる。特定の機 能ドメインを含む標的分子は、以降で述べる。 多くの機能ドメインは、あるポリペプチド（または標的分子）中に1つ以上存 在し、または異なるタンパク質のファミリー中に存在するという点で、独立機能 を有する。1つのポリペプチドまたは異なったポリペプチド中に1つ以上存在する 場合、一次配列および/または三次元構造において、独立機能ドメインは実質的 に同一の構造をとり得、または目的の機能ドメインの様々の型の間で、微少なま たは大きな変化または修飾を含み得る。 しかし重要な点は、これらの関連する機能ドメインが、標的分子中に存在する 目的の機能ドメインの機能性を保持していることである。実際、本発明の方法に よって同定され、定義され、調査され得るのは、目的の機能ドメインの2つまた はそれ以上の可能な型間の機能相関であることが協調される。好ましい態様にお いては、目的の機能は目的の分子（例えばペプチド）に結合する能力である。 本発明は、遺伝子発現ライブラリー（例えばcDNA、ゲノムライブラリー）中か ら新規の機能ドメインを含むタンパク質を系統的にスクリーニングするために、 機能ドメインを含む分子に結合する認識ユニットが用いられ得る、全般的な戦略 を提供する。特定の態様においては、認識ユニットは先ずランダムペプチドライ ブラリーから単離され、または既知のペプチドリガンドまたは認識ユニットであ り、または目的の結合特性を有するペプチド認識ユニットと相同性を有する配列 をデータベースから検索することによって同定された認識ユニットである。本発 明の方法を用いて、発現ライブラリーから特定の機能ドメインを有するタンパク 質を網羅的にスクリーニングすることが可能である。 先行技術においては、新規の遺伝子（およびそれらがコードするタンパク質産 物）は、多くはcDNAライブラリーから同定される。概して、オリゴヌクレオチド または抗体であるプローブを用いて、適当なcDNAライブラリーがスクリーニング される。いずれにおいても、ライブラリー中の非特異的な広範な遺伝子群の背景 値の中から同定されるべき遺伝子を選択するためには、その遺伝子に対してプロ ーブは充分に特異的でなければならない。先行技術による新規の遺伝子の同定に おいて、克服されなければならない最大の障害は、この特異的プローブの必要で ある。cDNAライブラリーから遺伝子を同定する別の方法は、ライブラリーから望 ましい遺伝子の断片を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の利用によ る。PCRには、望ましい遺伝子との配列の類似性を有するオリゴヌクレオチドが 利用できることが必要である。 先行技術において利用されるプローブが核酸である場合、cDNAクローンによっ てコードされ得るいかなるタンパク質産物の発現の必要もなく、cDNAライブラリ ーはスクリーニングされ得る。先行技術において利用されるプローブが抗体であ る場合、cDNAライブラリーを適切な発現ベクターに構築することが必要になる。 cDNAライブラリーから遺伝子を同定する技術の包括的な説明については、Sambro ok,Fritsch and Maniatis、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Col d Spring Harbor Laboratory Press,1989 第8章「Construction and Analysis o f cDNA Libraries」を参照。また、Sambrook,Fritsch and Maniatis、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1 989 第12章「Screening Expression Libraries with Antibodies and Oligonucl eotides」を参照。 cDNAライブラリーの代わりに、ゲノムライブラリーが用いられる。先行技術に おいてゲノムライブラリーが用いられる場合、プローブは事実上常に核酸プロー ブである。Sambrook,Fritsch and Maniatis、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 第9章「Cloniing of Eukaryotic Genomic DNA」を参照。 先行技術においては、ライブラリーのスクリーニングに用いられる核酸プロー ブは多くの場合、単離されることが望まれる遺伝子に相同だと考えられる既知の 遺伝子の配列に基づく。この方法の成功は、プローブと標的遺伝子の相同性が十 分に高いことに依存する。機能ドメインの配列は共通のドメインとして認識され 得るのに充分に類似しても、機能ドメインを含む遺伝子をcDNAまたはゲノムライ ブラリーからタンパク質中の既知の機能ドメインの配列に基づくプローブによっ てスクリーニングし得るほど類似性は高くないため、このようなプローブの価値 は低い。 ゲノムライブラリーから遺伝子を同定するためにPCRが用いられ得る。しかし 、cDNAライブラリーから遺伝子を同定するためにPCRを用いる場合と同じく、望 まれる遺伝子と相同な配列を有するオリゴヌクレオチドが利用できることが必要 である。 本発明によって提供されるスクリーニング法を用いて、配列の相同性からは容 易に同定されない、望まれる機能ドメインを有するタンパク質をコードするDNA が、認識ユニットに対する機能的結合特異性によって同定され得る。本発明のス クリーニング法によって結合条件が簡便になるため、多くの新規の、機能的に相 同な、機能ドメインを含むタンパク質が同定され得る。いかなる機械論的な説明 にも限定されるものではないが、この結合特異性の簡便性は、ライブラリーをス クリーニングするために使用される多価（好ましくは2価より大きく、さらに好 ましくは4価以上、最も好ましくはストレプトアビジン-ビオチニル化ペプチド認 識ユニット複合体）ペプチド認識ユニットの利用の結果であると考えられる。 本発明の特定の態様においては、望ましい機能ドメインを有するタンパク質の 網羅的なスクリーニングは、一次スクリーニングで同定されたSH3ドメインの認 識ユニットを、続く発現ライブラリースクリーニングでSH3ドメインを含むタン パク質を検出するために用いる反復過程を含む（図17参照）。この戦略は、各々 の連続する円によって、さらに拡がる円と考えられる「配列空間」を探査するこ とを可能にする。この反復戦略は、ただ1つの機能ドメインを含むタンパク質お よび認識ユニットしか存在しない場合からでも開始され得る。 この反復過程は、SH3ドメインを含むタンパク質に限定されない。他の機能ド メインのクラスの構成分子もまた、重複する、または少なくとも類似の認識ユニ ッ トの一群を有し、構造的に安定であり、しばしば広範なタンパク質に対して類似 の結合特性を付与する。これらの特性によって、本発明の方法がSH3ドメインを 含むタンパク質に適用されるのみならず、広範な機能ドメインを含むタンパク質 に適用され得ることが予想される。5.1. 機能ドメインを含む新規の遺伝子およびポリペプチドの発見 本発明は、予め定められた標的分子中に存在する目的の機能ドメインに相当す る、またはその等価物である、目的の機能ドメインを含む1つまたは複数のポリ ペプチド（特に標的分子を含む、ポリペプチドの「ファミリー」）の同定法を提 供する。 本発明は、事実上いかなる目的の機能ドメインをもコードする遺伝子（例えば cDNA）の迅速な同定の機構を提供する。cDNAライブラリーまたはほかのポリペプ チド材料から配列の類似性ではなく認識ユニット結合性をスクリーニングするこ とによって、本発明は従来のDNAに基づくスクリーニング法の限界を克服し、同 等の機能活性を有する高度に広範なタンパク質配列の同定を可能にする。特定の 独立機能ドメインを含む全ての種類のタンパク質を単離し得ることは、ゲノムの 分子生物的研究および薬剤発見プログラムに新しい標的を導入することの両者に おいて極めて重要であると考えられる。 同様に、本発明の方法によって、目的の機能ドメインを有する広範なポリペプ チドが同定され得るということが明らかである。その方法は、 （a）多価認識ユニット複合体を複数の（plurality of）ポリペプチドと接触 させ；そして （b）上記の認識ユニット複合体に対して選択的結合親和性を有するポリペプ チドを同定することを含む。 特定の態様においては、過程は （a）多価認識ユニット複合体（複合体中の認識ユニットの価数は少なくとも2 、または少なくとも4）を、認識ユニットに対して選択的親和性を有するポリペ プチドを同定することが望まれる複数のポリペプチドと接触させ；そして （b）認識ユニット複合体に対して選択的結合親和性を有するポリペプチドを 同 定し、好ましくは回収することを含む。 別の特定の態様においては、過程は目的の機能ドメインを含む少なくとも1つ のポリペプチドを同定する方法を含む。この方法は、 （a）1つまたはそれ以上の多価認識ユニット複合体と複数のポリペプチドを接 触させ；そして （b）少なくとも1つの上記の認識ユニット複合体に対して選択的結合親和性を 有する、少なくとも1つのポリペプチドを同定することを含む。 さらに別の特定の態様においては、過程は、 （a）（i）アビジンまたはストレプトアビジンおよび（ii）ビオチニル化認識 ユニットを含む多価認識ユニット複合体とcDNAライブラリー由来の複数のポリペ プチドとを接触させ（ここで認識ユニットは6から60アミノ酸残基のペプチドで ある）；そして （b）上記の認識ユニット複合体に対して選択的結合親和性を有するポリペプ チドを同定することを含む。 さらに別の特定の態様においては、過程は目的のSH3ドメインを有するポリペ プチドの同定法を含む。この方法は、 （a）（i）アビジンまたはストレプトアビジンおよび（ii）ビオチニル化認識 ユニットを含む多価認識ユニット複合体とcDNAライブラリー由来の複数のポリペ プチドとを接触させ（ここで認識ユニットは6から60アミノ酸残基のペプチドで あり、SH3ドメインに選択的に結合する）；そして （b）上記の認識ユニット複合体に対して選択的結合親和性を有するポリペプ チドを同定することを含む。 さらに別の特定の態様においては、過程は目的の機能ドメインまたはその機能 的等価物を有するポリペプチドの同定法を含む。この方法は、 （a）目的の機能ドメインに選択的に結合するペプチドを同定するためにラン ダムペプチドライブラリーをスクリーニングし；そして （b）上記のペプチドに選択的に結合するポリペプチドを同定するために、上 記のペプチドまたはその結合部位を用いてcDNAまたはライブラリーをスクリーニ ングすることを含む。 上記の方法の特定の態様においては、スクリーニングの段階（b）は、多抗原 ペプチド（MAP）の型での上記のペプチドの利用、または牛血清アルブミンまた はスカシガイヘモシアニンに架橋結合した上記のペプチドの利用によって行われ る。 別の特定の態様においては、過程は目的の機能ドメインまたはその機能的等価 物を有するポリペプチドの同定法を含む。この方法は、 （a）目的の機能ドメインに選択的に結合する複数のペプチドを同定するため にランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし； （b）上記のペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を決定し； （c）上記のペプチドの決定されたアミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列 を決定し；そして （d）上記のペプチドに選択的に結合するポリペプチドを同定するために、コ ンセンサス配列を含むペプチドでcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニン グすることを含む。 別の特定の態様においては、過程は目的の機能ドメインまたはその機能上の等 価物を有するポリペプチドの同定法を含む。この方法は、 （a）目的の機能ドメインに選択的に結合する最初のペプチドを同定するため にランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし； （b）上記の最初のペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を決定し； （c）上記の最初のペプチドのアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含むタン パク質を同定するために、複数の発現された自然のタンパク質のアミノ酸配列を 含むデータベースを検索し；そして （d）上記の最初のペプチドのアミノ酸配列に相同な、上記のタンパク質の配 列からなる2番目のペプチドを用いて、cDNAまたはゲノム発現ライブラリースク リーニングすることを含む。 上述の方法で同定されたポリペプチドは、目的の機能ドメインまたはその機能 上等価物（すなわち、同一の機能ドメインを有するか、または配列は異なるが同 一の認識ユニットに結合し得る機能ドメインを有する）を含むと考えられる。特 定の態様においては、同定されるポリペプチドは新規のポリペプチドである。好 ましい態様においては、多価認識ユニット複合体を形成するために用いられる認 識ユニットは、ランダムペプチドライブラリーから単離されまたは同定される。 特定の態様においては、本発明はSH3ドメインを含む新規のタンパク質をコー ドするアミノ酸配列およびDNA配列を提供する。SH3ドメインは、配列は異なるが 、SH3認識ユニットに対する結合特異性は保持する。また、SH3ドメインを含む新 規のタンパク質の断片および派生物、およびそれをコードするDNAが提供される 。また、保存的なアミノ酸置換によって新規のタンパク質とは配列が僅かに異な るタンパク質が提供されるということは、通常の当業者には明らかであると考え られる。また、通常の方法によって、新規のタンパク質が組み換え技術によって 発現され得るということも、通常の当業者には明らかであると考えられる。新規 のタンパク質はまた、様々な他のタンパク質（例えばグルタチオン-S-トランス フェラーゼ）との融合タンパク質として発現され得る。 本発明は、SH3ドメイン、SEQ ID NO:113から115、118から121、125から128、1 33から139、204から218、および219からなるグループから選択されたアミノ酸配 列を有する、上記のSH3ドメインを含む精製したポリペプチドを提供する。また 、ポリペプチドをコードする、精製されたDNAが提供される。 また、SH3ドメインを含む精製されたポリペプチドが提供される。上記のポリ ペプチドは、SEQ ID NO:8、10、12、18、20、22、24、30、32、38、40、190、19 2、194、196、198、200、および221からなるグループから選択されたアミノ酸配 列を有する。また、ポリペプチドをコードする、精製されたDNAが提供される。 また、SH3ドメインをコードする精製されたDNAが提供される。上記のDNAは、S EQ ID NO:7、9、11、17、19、21、23、29、31、37、39、189、191、193、195、1 97、199、および220からなるグループから選択された配列を有する。また、この 精製されたDNAを含む核酸ベクターが提供される。また、この核酸ベクターを含 む組み換え細胞が提供される。 また、SEQ ID NO:8、10、12、18、20、22、24、30、32、38、40、190、192、1 94、196、198、200、および221からなるグループから選択されたアミノ酸配列を 有するポリペプチドをコードする精製されたＤＮＡが提供される。また、当該精 製ＤＮＡを含む核酸ベクターが提供される。また、当該核酸ベクターを含む組み 換え細胞が提供される。 また、アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする精製されたDNAが提供さ れる。上記のDNAは、SEQ ID NO:113から115、118から121、125から128、133から 139、204から218、および219からなるグループから選択されたアミノ酸配列をコ ードする。また、この精製されたDNAを含む核酸ベクターが提供される。また、 この核酸ベクターを含む組み換え細胞が提供される。 また、SH3ドメインを含む精製された分子が提供される。上記のSH3ドメインは 、SEQ ID NO:8、10、12、18、20、22、24、30、32、38、40、190、192、194、19 6、198、200、および221からなるグループから選択されたアミノ酸配列を有する 。 また、（a）SEQ ID NO:8、10、12、18、20、22、24、30、32、38、40、190、1 92、194、196、198、200、および221のアミノ酸配列を有するポリペプチドのSH3 ドメインを含むアミノ酸配列と、（b）ペプチド結合によって（a）に結合した少 なくとも6または10、または20アミノ酸の異なったタンパク質由来のアミノ酸配 列からなる融合タンパク質が提供される。また、融合タンパク質をコードする精 製されたDNAが提供される。また、融合タンパク質をコードする精製されたDNAを 含む核酸ベクターが提供される。また、この核酸ベクターを含む組み換え細胞が 提供される。また、この融合タンパク質の生産法が提供される。この方法は、上 記の融合タンパク質発現されるように上記の融合タンパク質をコードする核酸ベ クターを含む組み換え細胞の培養、および発現された融合タンパク質の回収から なる。 本発明はまた、SEQ ID NO:7、9、11、17、19、21、23、29、31、37、39、189 、191、193、195、197、199、および220からなるグループから選択した配列を有 する核酸にハイブリダイズし得る精製された核酸を提供する。 本発明はまた、113から115、118から121、125から128、133から139、204から2 18、および219からなるグループから選択したアミノ酸配列を有するポリペプチ ドに対する抗体を提供する。 本発明はまた、SEQ ID NO:8、10、12、18、20、22、24、30、32、38、40、190 、192、194、196、198、200、および221からなるグループから選択されたアミノ 酸配列を有するポリペプチドに対する抗体を提供する。 本明細書中の実施例によって、混成ペプチドライブラリー由来のSH3ドメイン リ ガンドからなる認識ユニットが、SH3機能ドメインを含む新規のタンパク質の迅 速な発見のためのプローブとして本発明の方法に従って利用され得るということ が示される。探索の過程を開始するに当たって本発明の方法は、SH3ドメインの 自然の細胞内リガンドの特性に関するいかなる先行知識をも必要としない。ラン ダムペプチドライブラリーからペプチドを選択するためには、充分量の精製され たSH3ドメインを含むタンパク質（例えば1から5μg）が必要とされるだけである 。さらに、本発明の方法はcDNA発現ライブラリーから結合特性にのみ基づいて新 規のタンパク質を同定するため、標的SH3ドメインと発見された新規のタンパク 質間のある程度の機能の類似性が保存されていれば、これらの間の一次配列の同 一性が低くても、これに制限されることがない。また、本発明の方法は迅速であ り、廉価な試薬のみ必要であり、簡便でよく確立された実験技術を用いる。 これらの方法を用いて、その半数以上は以前に記載されていなかった異なるSH 3ドメインを含む18以上のタンパク質が同定された。これらの以前に知られてい ないタンパク質のいくつかは、アンフィフィシンおよびドレブリンのような既知 の遺伝子と明らかに関連し、その他は信号伝達および/または細胞骨格タンパク 質の新しいクラスを構成する。これらは、複数のSH3ドメインからなるアダプタ ー様タンパク質の新しいファミリーの2つの構成分子であるSH3P17およびSH3P18 ；3つのSH3ドメインを有する新規のタンパク質であり、細胞外ペプチドホルモン であるソルビンに類似の領域を有するSH3P12；SH3を含むタンパク質の3番目の新 しいファミリーの3つの構成分子であるSH3P4、SH3P8、およびSH3P13を含む。こ れらの新規のタンパク質は6.1および6.1.1章でより良く記載される。本発明の方 法によって同定された新規のタンパク質の割合が高いことは、多くのSH3ドメイ ンを含むタンパク質が本発明の方法の適用によって発見されるであろうというこ とを示唆する。 本明細書中に記載するタンパク質の様々な応用に当たっては、上述の新規のタ ンパク質はその全長が用いられる必要はないといことは、通常の当業者は認識す ると考えられる。多くの場合、新規のタンパク質の機能ドメイン（例えばSH3） を含む部分を用いることが充分であると考えられる。SH3ドメインを含むタンパ ク質の部分のこのような例は、図10Aおよび10Bに示す。従って、本発明はSH3ド メインを含む新規のタンパク質の派生物（例えば、断片および断片からなる分子 ）を提 供する（例えば図10Aおよび10Bに示す）。また、これらの断片または他の派生物 をコードする核酸が提供される。 別の態様においては、SH3ドメインを含む1つまたはそれ以上の新規のタンパク 質の同定法を本発明は含む。上記の方法は、 （a）SH3ドメインを用いてペプチドライブラリーをスクリーニングすることに よって、SH3ドメインに対し選択的親和性を有する認識ユニットを同定し； （b）上記の認識ユニットを生産し； （c）上記の認識ユニットをポリペプチド材料と接触させ；そして （d）上記の認識ユニットに対し選択的親和性を有する1つまたはそれ以上の（ SH3ドメインを含む）新規のポリペプチドを同定することを含む。 5.1.1.機能ドメイン 本発明の実施における目的の機能ドメインは、多くの型を取り得、様々な機能 を果たし得る。例えば、そのような機能ドメインは多くの細胞内、生物化学的、 または生理的過程（例えば細胞内信号伝達、転写制御、翻訳制御、細胞間接着、 移動または輸送、サイトカインの分泌および免疫応答の他の面、その他）に関わ り得る。本発明の特定の態様においては、目的の機能ドメインは、SH1、SH2、SH 3、PH、PTB、LIM、アルマジロ、およびNotch/アンキリンリピートとして知られ る領域（例えば、Pawson,1995,Nature 373:573-580；Cohen et al.,1995,Cell 8 0:237-248参照）を含み得る。また、機能ドメインはジンクフィンガー、ロイシ ンジッパー、およびヘリックス−ターン−ヘリックスまたはヘリックス−ループ −ヘリックスとして知られる領域中から選択され得る。いくつかの機能ドメイン は、DNA結合ドメインまたはアクチン結合ドメインのような結合ドメインであり 得る。さらに他の機能ドメインは、触媒活性部位として働き得る。 本発明の1つの態様においては、特定の目的の機能ドメインを含む適当な標的 分子が選択される。例えばSH3ドメインの場合、多くのタンパク質（または機能 ドメインを含む派生物またはその類似分子）が標的分子として選択され得る（一 例としてSrcファミリーのタンパク質、Fyn、Lck、Lyn、Src、またはYesを含む） 。さらに他のタンパク質もSH3ドメインを含み、用いられ得る（一例として、Abl 、Cr k、Nck（他のガン遺伝子）、Grb2、PLCγ、RasGAP（信号伝達に関わるタンパク 質）、ABP-1、ミオシン1、スペクトリン（細胞骨格に存在するタンパク質）、お よび好中球NADPHオキシダーゼ（酵素）を含む）。触媒部位の場合、酵素のよう ないかなる触媒活性タンパク質も用いられ得る。特にその触媒部位が知られてい るものが用いられ得る。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）タ ンパク質が用いられ得る。触媒活性を有する他の標的分子には、一例としてタン パク質セリン/スレオニンキナーゼ、タンパク質チロシンキナーゼ、セリンプロ テアーゼ、DNAまたはRNAポリメラーゼ、フォスフォリパーゼ、GTPアーゼ、ATPア ーゼ、PIキナーゼ、DNAメチラーゼ、代謝酵素、またはタンパク質グリコシラー ゼが含まれ得る。 5.1.2.認識ユニット 「認識ユニット」という語は、標的分子の機能ドメインに選択的親和性を有し 、好ましくは約20,000D以下の分子量を有するいかなる分子をも意味する。本発 明の特定の態様においては、認識ユニットは約100から約10,000Dの分子量を有す る。 従って、本発明の好ましい認識ユニットは約100から約5,000Dの分子量を有し 、好ましくは約100から約2,000D、最も好ましくは約500から約1,500Dのの分子量 を有する。以下でさらに記載する通り、本発明の認識ユニットは、ペプチド、炭 化水素、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、なんらかの合成小分子、または自 然の産物であり得る。認識ユニットがペプチドである場合、ペプチドは好ましく は約6から約60アミノ酸残基からなる。 認識ユニットがペプチドである場合、ペプチドは約140アミノ酸残基以下であ り得、好ましくはペプチドは約100アミノ酸残基以下であり、好ましくはペプチ ドは約70アミノ酸残基以下であり、好ましくはペプチドは20から50アミノ酸残基 以下であり、最も好ましくはペプチドは約6から約60アミノ酸残基からなる。 ペプチド認識ユニットは好ましくはアビジンまたはストレプトアビジン（アル カリホスフォターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼのような標識に結合 していてもよい）およびビオチニル化ペプチドを含む多価ペプチド複合体の型で ある。 本発明において、自然のRNAまたはDNA中に存在する核酸配列を含む遺伝子配列 （例えばcDNAライブラリー、ゲノムライブラリー）の多数の発現産物をスクリー ニングするために、認識ユニット（好ましくは多価ペプチド複合体の型で）が用 いられる。 認識ユニットの選択の段階は、通常の当該業者には既知の様々な方法（一例と して、cDNAまたはランダムペプチドライブラリーから目的の機能ドメインに結合 するペプチドをスクリーニングすることを含む）で達成され得る。例えば、Yu e t al.,1994,Cell 76:933-945；Sparks et al.,1994,J.Biol.Chem．269:23853-23 856参照。または、ペプチドまたは他の小分子または薬剤が特定の標的分子に結 合することが通常の当業者には知られ得、用いられ得る。認識ユニットは、先行 化合物（それ自身がペプチド、炭化水素、オリゴヌクレオチド、小薬剤分子、そ の他）から合成されることも可能である。また、利用できる認識ユニットは、目 的の機能ドメインに選択的に結合する能力を有する他の既知の認識ユニットと相 同性を有する分子の（好ましくはデータベースの）検索を行うことによって同定 され得る。 特定の態様においては、利用できる認識ユニットの選択の段階は、例えばラン ダムまたは混成ペプチドまたは非ペプチドライブラリーのような様々なライブラ リーによって効果を与えられ得る。これらのライブラリーから、目的の機能ドメ イン、例えばSH3ドメインに特異的に結合する分子がスクリーニングされ得る。 当該技術分野においては、例えば化学的に合成されたライブラリー、組み換え（ 例えばファージ提示ライブラリー）、および試験管内翻訳に基づくライブラリー のような、利用され得る多くのライブラリーが知られている。 化学的に合成されたライブラリーの例は、Fodor et al.,1991,Science 251:76 7-773；Houghten et al.,1991,Nature 354:84-86；Lam et al.,1991,Nature 354 :82-84；Medynski,1994,Bio/Technology 12:709-710；Gallop et al.,1994,J.Me dicinal Chemistry 37(9):1223-1251；Ohlmeyer et al.,1993,Proc.Natl.Acad.S ci.USA 90:10922-10926；Erb et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422-1 1426；Houghten et al.,1992,Biotechniques 13:412；Jayawickreme et al.,199 4,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1614-1618；Salmon et al.,1993,Proc.Natl.Acad .Sci.USA 90:11708-11712；PCT公開WO 93/20242；およびBrenner and Lerner,19 9 2,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5381-5383に記載されている。 ファージ提示ライブラリーの例は、Scott and Smith,1990,Science 249:386-3 90；Devlin et al.,1990,Science 249:404-406；Christian,R.B.,et al.,1992,J .Mol.Biol．227:711-718；Lenstra,1992,J.Immunol.Meth．152:149-157；Kay et al.,1993,Gene 128:59-65；1994年8月18日付けPCT公開WO 94/18318に記載され ている。 試験管内翻訳に基づくライブラリーには、一例として1991年4月18日付けPCT公 開WO 91/05058；Mattheakis et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022-902 6に記載されているものが含まれる。 非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば 、Bunin et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4708-4712参照）が応用され 利用され得る。ペプトイドライブラリー（Simon et al.,1992,Proc.Natl.Acad.S ci.USA 89:9367-9371）もまた用いられ得る。用いられ得るライブラリーの別の 例は、化学的に転換された混成ライブラリーを産生するためにペプチド中の機能 性アミドがパルメチル化されたもので、Ostresh et al.,1994,Proc.Natl.Acad.S ci.USA 91:11138-11142に記載されている。 本発明に有用な非ペプチドライブラリーの種類は豊富である。例えば、Ecker and Crook,1995,Bio/Technology 13:351-360は、様々なライブラリーの根幹を成 す化学分子属の例として、ベンゾジアザピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン 、ビフェニル、糖類似分子、β-メルカプトケトン、アリル酢酸、アシルピペリ ジン、ベンゾピラン、クバン、キサンチン、アミンイミド、およびオキサロゾン を挙げている。 非ペプチドライブラリーは大きく、修飾単体および多量体の2つの型に分類さ れ得る。修飾単量体ライブラリーは、様々の機能基を加えるための比較的単純な 足場構造を用いる。多くの場合、足場は既知の有用な薬理学的活性を有する分子 である。例えば、足場はベンゾジアザピン構造であり得る。 非ペプチド多量体ライブラリーは、単量体の並び方に依存する新しい形を形成 するように統合される、極めて多数の単量体を用いる。利用されてきた単量体ユ ニットには、カルバミン酸塩、ピロリノン、およびモルホリンがある。側鎖がα 炭素ではなくαアミノ基に結合した、ペプチドに類似の多量体であるペプトイド は、非ペプチド多量体ライブラリーの別の型の基幹を成す。最初の非ペプチド多 量体ライブラリーは、1つの型の単量体を用い、そのために繰り返し骨格を有し た。最近のライブラリーは、1つ以上の単量体を用い、さらなる可塑性が付与さ れた。 ライブラリーのスクリーニングは様々な既知の方法により行うことができる。 例えば下記のペプチドライブラリーのスクリーニングについての参考事項を参照 のこと：Parmley and Smith,1989,Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218;Scott and Sm ith,1990,Science 249:386-390;Fowlkes et al.,1992;BioTechniques 13:422-42 7;Oldenburg et al.,1992,Proc.Acad.Sci.USA 89:5393-5397;Yu et al.,1994,Ce ll 76:933-945;Staudt et al.,1988,Science 241:577-580;Bock et al.,1992,Na ture 355:564-566;Tuerk et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6988-6992;E llington et al.,1992,Nature 355:850-852; 米国特許第5,096,815,号、および 米国特許第5,223,409,号、および米国特許第5,198,346,号、これらはすべてLadn er et alの特許である;Rebar and Pado,1993，Science 263:671-673; およびPCT 公開第WO94/18318号。 ある特定の態様において、認識ユニットの同定のスクリーニングは、固相に固 定したSH3ドメインとライブラリーメンバーとを接触させ、SH3ドメインに結合す るライブラリーのメンバーを得ることによって行うことができる。この様な「パ ニング」技術と呼ばれるスクリーニング法の例は、Parmley and Smith,1988,Gen e 73 :305-318;Fowlkes et al.,1992,BioTechniques 13:422-427;PCT特許出願第 WO94/18318;およびこれらに引用された参考文献に記載されている。 また、別の態様において、酵母内に於て相互作用するタンパク質を選択する、 ２ハイブリッドシステム（Field and Song,1989,Nature340:245-246;Chien et a l.,1991,Proc．Natl.AcadSci.USA 88:9578-9582）をSH3ドメインと特異的に結合 する認識ユニットの同定に用いることができる。 認識ユニットがペプチドである場合、ランダムペプチドライブラリー、複合ペ プチドライブラリー、または偏向（biased）ペプチドライブラリー、を含むいか なるペプチドライブラリーからも簡便に選択できる。「偏向」という用語は、ラ イブラリーの作製方法に於て、１つまたはより多くの要因について制限を設け、 この場合のペプチドにおいて結果できる分子集団の多様性を抑えることを意味す る。 完全なランダムペプチドライブラリーは、ペプチドのある部位で、あるアミノ 酸を見いだす確率が２０のアミノ酸全てについて等しいようなペプチド集団を生 成する。ある偏向をライブラリーに導入することが可能であるが、しかし制限を 行うことにより、たとえばリジンが５アミノ酸ごとに現れることや、デカペプチ ドライブラリーの4,8,または9位のアミノ酸が、アルギニンのみになるように固 定されたりすることができる。明らかに、多くの型の偏向が考案できるが、本発 明はいかなる偏向にも限定したものではない。さらに、本発明では、ファージ提 示ペプチドライブラリーや、DNA挿入断片を持つλファージを有するDNA構築物を 利用したライブラリーといった特殊な型のペプチドライブラリーを考案する。 上述のように、認識ユニットがペプチドの場合、ペプチドはおよそ6からおよ そ60以下のアミノ酸残基、好ましくはおよそ6から25アミノ酸残基、さらにもっ とも好ましくはおよそ6から15アミノ酸残基を有することができる。また、別の 態様において、ペプチド認識ユニットは20-100アミノ酸、または20-50アミノ酸 の範囲を有する。例えば胆汁酸受容体の場合、認識ユニットはコール酸やコレス テロールといった、分子量約300から600程度の胆汁酸でもよい。機能ドメインが 転写調節に関わるなら、認識ユニットは対象となる遺伝子またはRNAポリメラー ゼに結合する転写因子の一部でもよい。認識ユニットは、あるいは、コルジセピ ンまたはそれらの３リン酸化物といったヌクレオシド類似体であってもよい。認 識ユニットはまた、アシル酸糖タンパク質受容体に対する選択性を有する糖タン パク質の炭水化物部位であってもよい。あるいは、セルロース結合ドメインやヘ パリナーゼ活性部位との選択親和性をしめす繰返しグルカンユニットであっても よい。 選択的認識ユニットは化学合成、または組換え発現により得ることができる。 多くの遺伝子配列のスクリーニングにおける使用に先立ち、精製することが好ま しい。 5.1.3ポリペプチドの源（source）のスクリーニング 認識ユニットを使用のために選択した後、認識ユニットを複数のポリペプチド 、好ましくはその機能ドメインを有するペプチドと接触させる。本発明の特定の 態 様で、複数のポリペプチドがポリペプチド発現ライブラリーより得られる。ポリ ペプチド発現ライブラリーはcDNA、断片化ゲノムDNAなどより得ることができる 。ある特定の態様において、スクリーニングされるライブラリーは、ある生物全 体の全ポリA+RNAの、あるいはある特定の細胞あるいは組織型、または発生段階 、病気の状態もしくは段階のcDNAライブラリーである。発現ライブラリーでは該 当技術分野において通常の知識を有するものに知られる組換えバクテリオファー ジ、λファージ、M13、組換えプラスミドおよびコスミドなどを含み、これらに 限らない多くの発現ベクターを利用する。 複数のポリペプチドあるいは当該ポリペプチドをコードするDNA配列は、原核 細胞または真核細胞、あるいは野性型、組換え体、または変異体、といったさま ざまな自然のまたは非自然の源より得られる。特に複数のポリペプチドは細菌や 酵母または真菌類といった微小生物、ウィルス、動物（哺乳類、無脊椎動物、爬 虫類、鳥類、および昆虫類を含む）または植物細胞に対し内在しうる。 さらに複数のポリペプチドは、ウィルス粒子の表面コート、特定の細胞溶解物 、組織抽出液といった、より特異的な元から得られる。またはそれらは細胞膜の 表面に発現されるようなポリペプチドに限定される。 さらに、多くのポリペプチドは生物的流動体、特に人から、血液、血漿、血清 、尿、糞、粘液、精液、膣液、羊水、または髄液などを含む（これらに限らない ）ものから得られる。細胞が前もって培地中に分泌または合成したポリペプチド 産物全てを含む複数のポリペプチドが、培養液または馴化培地からさえ得られる 。 認識ユニットと多くのポリペプチドの接触の行程は複数の方法で行うことがで きる。例えば、ある方法では、認識ユニットを固体支持体へ固定し、そして複数 のポリペプチドの溶液を固定した認識ユニットと接触させることによって行うこ とができる。そのような行程は固定した認識ユニットを構成している親和性マト リクスとして行う親和性クロマトグラフィーの行程に類似している。認識ユニッ トに対して選択的親和性があるポリペプチドは、親和性選択により精製すること が可能である。固相支持体の性質、認識ユニットの固相支持対への接触の行程、 溶解、および親和性単離の条件または選択行程は使用した認識ユニットの型に依 存するだろうが、主として該当技術分野において通常の知識を有するものに知ら れる従来の行程で行うことができる。さらに、ポリペプチドのスクリーニングに 用いた認識ユニット複合体中の認識ユニットの結合価は、スクリーニングの段階 の特異性に影響すると信じられる。そして結合価は望みの特異性を見越して、適 切に選択されることが可能である。（5.2および5.2.1章参照） あるいは、複数のポリペプチドを個別のポリペプチドを含む分離した画分に分 離することもできる。例えば、複数のポリペプチドをゲル電気泳動、カラムクロ マトグラフィー、などのポリペプチドの分離の分野において通常の知識を有する ものに知られる方法により分離できる。形質転換した宿主細胞により、その細胞 においてまたはその外膜の表面に個々のポリペプチドを合成することもできる。 所望により発現に必要である誘導体存在下において、認識ユニットと個々のクー ロン間の選択的親和性相互作用を調べるため、分離した個々は認識ユニットによ るプローブ探査が可能である。認識ユニットと個々のポリペプチドを含む各々の 画分との接触に先立ち、付加的簡便の為、ポリペプチドを所望により先に固相支 持体へ移すことが可能である。そのような固相支持体は簡単にニトロセルロース またはナイロン製のフィルター膜とすることが出来る。 この方法で、発現ライブラリーを形質転換した宿主細胞の集団から、認識ユニ ットに対する選択的親和性を持つポリペプチドをコードするDNA構築物を持つ陽 性のクローンを同定することが可能である。陽性のクローンに合成されるポリペ プチドは、目的の機能ドメインまたはその機能的等価物を含む。さらにその認識 ユニットに対する選択親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を従来のアミ ノ酸配列決定法により直接決定することが可能である。あるいは、ポリペプチド をコードしているDNA配列は、より簡便に標準的なDNA配列決定法により決定する ことが可能である。１次配列は対応するDNAの配列から予測することが可能であ る。 アミノ酸配列決定をポリペプチド自身から行うなら、マイクロ配列決定の技術 を使用することができる。配列決定技術は、マススペクトロスコピーの技術を含 んでもよい。 ある状況では、配列の決定や選択親和性相互作用の存在（すなわち、洗浄の行 程のあとに結合している認識ユニットの存在）の検出を試みる前に、全ての非結 合認識ユニットを認識ユニットと多くのポリペプチドの混合液から洗い落とすこ とが望ましいだろう。このような洗浄の行程は多くのポリペプチドが固相支持体 へ結合しているとき特に望まれるだろう。 予期できるように、選択親和性の度合は幅広くひろがっていることが観察され 、一般に約1nMから約1mMの領域になる。本発明の望ましい態様において、選択親 和性は約10nMから約100μMの桁に、より望ましくは約100nMから約10μM、さらに 最も好ましくは約100nMから約1μMの桁になるだろう。5.2. 認識ユニットの特異性 ある認識ユニットは対象となるドメインを持つ（または異なる型の対象となる ドメインまたは機能的に等価な対象となるドメインを持つ）ポリペプチドの「一 団」のいくつかの（例えば３または４またはそれ以上の）一員に対して属全体に わたる選択特異性を持ってもよく、あるいは同じ「一団」の中の１つまたは２つ または３つのポリペプチドのみに対して特異的選択性を持ってもよい。さらに、 各々ポリペプチドの「一団」に対してある選択性の幅を示す複数の認識ユニット は、目的の機能ドメインを含む他のポリペプチドの包括的なセットを同定するた めに使用されることが可能である。 従って、関連のあるポリペプチドのうち、各一員の対象となる機能ドメインは 模式的に円で表される。実施例の図7A参照。あるポリペプチドの円は他のポリペ プチドの円と重なってもよい。その様な重なりは各々のポリペプチドに対して少 なくてもまたは多くてもよい。ある認識ユニットＡは、ある他のどの円とも重な らないようなポリペプチドの円のある部分を認識、または相互作用してもよい。 その様な認識ユニットはそのポリペプチドに特異的である。一方、第２の認識ユ ニットBは２つまたはそれ以上のポリペプチドに重なる領域を認識してもよい。 それゆえ、この様な認識ユニットは認識ユニットAよりも特異性は低いだろう。 また、、認識または相互作用するポリペプチドの数に依存して、より属全体にわ たる特異性を有すると特徴づけられる。 各々異なる「一団」のポリペプチドを認識するような、あらゆる数のB型認識 ユニット(B1,B2,B3など)が存在しうることも、当業者によって明らかである。そ れゆえ、多認識ユニットの使用はより網羅的ポリペプチドの集団を提供するだろ う。 それらの集団の各々は始めの標的分子中に存在する対象となる機能ドメイン内の 多様性または発達を示す。また、あるポリペプチドの同定が別の認識ユニットの 選択につながるというように、本方法を繰返して適応することも可能であること も明らかである。実施例7B参照。一方、この新たなポリペプチドの認識ユニット の使用は、表現型的におよび／または遺伝型的に「関連」ポリペプチドの総数の 多様性を強める対象となる機能ドメインを含む他のポリペプチドの同定につなが る。 従って、与えられたポリペプチドに対しただ１つまたは２つの異なるポリペプ チドとの相互作用しか観察されねくてもよい。他の認識ユニット３つ、４つ、ま たはそれ以上の選択的相互作用を見出してもよい。ただ１つの相互作用しか観察 されない状況では、必ずではないが、選択的親和性相互作用は認識ユニットと最 初の標的分子の複製（またはとても構造的および「機能的」に最初の標的分子に 類似した分子）の間のものであろう。 5.2.1 認識ユニット複合体の提示の認識ユニット-機能ドメイン相互作用の特異 性に与える影響 当発明者は思いがけなく、発現ライブラリーまたは他のポリペプチドの源をス クリーニングするために用いた認識ユニットの結合価（すなわち、単量体、２量 体、３量体などのいずれか）は、どの遺伝子またはポリペプチドが発現ライブラ リーまたはポリペプチドの源から同定されるか、に大きな影響を持つことを見い だした。特に認識ユニット−機能ドメイン相互作用はスクリーニングの行程での 認識ユニットの結合価に影響されるようである。これにより、機能ドメインとど の認識ユニットがスクリーニングの段階で結合するかの選択性が特異性を表す。 上述のように、ある態様において認識ユニットは認識ユニットの源、例えばフ ァージ提示ライブラリーの、ある標的機能ドメインに結合する認識ユニットを得 るためのスクリーニングにより得ることができる。あるいは、既知の認識ユニッ トとの配列相同性のある認識ユニットを探すためのデータベース検索を行うこと も可能である。もちろん、もしある標的機能ドメインに対する認識ユニットがす でに知られているなら、ライブラリーまたは他の認識ユニットの元のスクリーニ ングを行う必要はなく、その認識ユニット合成することは可能である。得られた 認識ユニットは認識ユニットが結合するポリペプチドを同定するために、発現ラ イブラリーまたはその他のポリペプチド源のスクリーニングに使用できる。その 標的機能ドメインのみを同定する認識ユニットは、完全な特異性のある認識ユニ ットである。複数のポリペプチドの中から（たとえば10⁴,10⁶または10⁸以上の複 雑さ）の、標的機能ドメインを含まない１つまたは２つのほかのポリペプチドを 同定し、さらにその標的機能ドメインを含む分子を同定する認識ユニットは、た いへん高い特異性を有する。その標的機能ドメインを含まない複数の他のポリペ プチドを同定し、さらにその標的機能ドメインを同定する認識ユニットは非特異 的ユニットである。とても特異性の高い認識ユニットと非特異的認識ユニットの 間で、本発明者はその標的機能ドメインの他に、機能ドメインを有する少数の分 子を認識する認識ユニットが存在することを発見した。このような認識ユニット は一般的特異性を有すると言われる。 従って、ある認識ユニットが示す完全なおよび高い特異性から全般的そして非 特異的への、「特異性の連続体」がある。この特異性の連続性を記述した図11を 参照。本出願人は認識ユニットが示す特異性に影響する主な因子は発現ライブラ リーのスクリーニングで用いた複合体中の認識ユニットの結合価となるようであ ることを発見した。 通常、ライブラリーのスクリーニングにおいて高い特異性が望まれる。高い特 異性は例えば、一般にとても特異性の高い親和性精製したポリクローナル抗血清 がしめす。モノクローナル抗体もまた高い特異性を示す。他方、ライブラリーの スクリーニングにおいて、１価の結合価の小ペプチドは一般にとても弱い、非特 異的シグナルを与える。それゆえそれらは非特異的であると考えられる。 本発明者は小ペプチドの型の多結合価の型の認識ユニットは、抗体の抗特異性 と１結合価のペプチドの低い／非特異性の間の中程度の特異性を有することを発 見した。認識ユニットの最低２つの多結合価は、遺伝子ライブラリーのスクリー ニングに用いた認識ユニット複合体中で望まれ、最低４つの多結合価がさらに特 異性を緩めるが、喪失しないようにスクリーニングに行うには望まれる。特に、 ストレプトアビジンまたはアビジン（好ましく標識、例えばアルカリフォスファ ターゼまたはセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼまたは蛍光源、例えば緑色蛍光 タンパク質に結合している）を含む多合価（４結合価であると信じられる）の認 識ユニット複合体とビオチン化したペプチド認識ユニットは予期せぬ一般的な特 異性を有する。このことにより、ペプチドの標的機能ドメインと類似するが同一 でない機能ドメインに接触するポリペプチドのクラスを同定するためのライブラ リースクリーニングにおいてこのようなペプチドを用いることができる。これら のクラスのポリペプチドは機能ドメインのアミノ酸配列では低水準の相同性では あるが同定される。 別のある態様において、多結合価ペプチド認識ユニットは多抗原性ペプチド（ MAP）の型であってもよい。（Tam,1989,J.Imm.Meth.124:53-61;Tam,1988,Proc.N atl.Acad.Sci.USA 85;5409-5413）この型において、ペプチド認識ユニットは固 相ペプチド合成法を用いて、分岐リシルマトリックスで合成される。MAPの型の 認識ユニットは該当技術分野において既知の方法により調製してもよい（Tam,19 89,J.Imm.Meth.124:53-61;Tam,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85;5409-5413）。 または、たとえばMAPレジン（Applied Biosystems）上で段階固相法により、製 造業者により作られた方法を利用して調製してもよい。MAPペプチドは（認識ユ ニットペプチド）₂Lys₁，（認識ユニットペプチド）₄Lys₃，（認識ユニットペプ チド）₈Lys₆,またはより高基準の分岐を含むように合成してもよい。 高結合価ペプチド認識ユニット複合体は、ペプチドを担体タンパク質（たとえ ば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）またはある 酵素）に既知の架橋剤の使用によって架橋させることにより調製できる。そのよ うな架橋ペプチド認識ユニットは、例えば担体タンパク質に対する抗体や担体タ ンパク質の酵素活性の検出により、検出される。 さらに、本発明者はさまざまな型の認識ユニットおよびその複合体によりどの ような特異性が示されるか、すなわちこれらの認識ユニットおよびそれらの複合 体は特異性の連続体のどの位置にあるかを発見した。本発明者はライブラリーの スクリーニングにおいて使用した認識ユニットの形式の範囲を発見した。例えば 本発明者は、アルカリフォスファターゼとの２価の融合タンパク質の型のペプチ ドはとても特異的であることを決定した。M13バクテリオファージ由来で、ファ ージの表面に発現するpIIIタンパク質との融合タンパク質の型の同じペプチドは 幾 分低くなるがまだ高い特異性を有する。４価のストレプトアビジン−アルカリフ ォスファターゼとの複合体の型でビオチン化した同じペプチドは全般的な特異性 を有する。そのような全般的な特異性を有するペプチドの使用により発現ライブ ラリーまたは他のポリペプチドの元から、広い範囲の各タンパク質がある機能ド メインを含むようなタンパク質を同定することが可能となる。 それゆえ、本発明は多くのポリペプチドをスクリーニングし、機能ドメインを 有するポリペプチドの同定をするための認識ユニットとして使用できるペプチド になるように、ペプチドの特異性の調節法を提供する。ある特定の態様において 、認識ユニットと結合することの知られている標的機能ドメインが高特異性条件 下で配列が変化する機能ドメインを有するポリペプチドの同定のために特異性が 全般的であるものとする。ある特定の態様において、方法は発現ライブラリーの スクリーニングに於ける使用に先立って４価のビオチン化ペプチドおよびストレ プトアビジン-アルカリフォスファターゼ複合体を形成させることを含む。5.3. キット 本発明はまた、薬剤候補のスクリーニングにおいて有用な測定キットに関係す る。本発明の特定の態様において、測定キットは、１つまたはそれ以上の容器の 形態で(a)興味のある機能ドメインを含むポリペプチド；および(b)ポリペプチド に対する選択的な親和性を持つ認識ユニットを含むと考えられる。キットは所望 により、ポリペプチド認識ユニット相互作用の存在またはその欠損を決定するた めの検出手段を含む。 特定の態様において、機能ドメインまたは認識ユニットを含むポリペプチドは いずれも標識される。本発明において、さまざまな標識が使用可能であり、従来 の方法にしたがって、認識ユニットのビオチンへの結合が含まれるがこれに限ら ない。あるいは、標識は、蛍光、酵素、エピトープ、色素、または放射性ヌクレ オチドを含む。好適には、ビオチンはポリペプチドまたは認識ユニットのいずれ かに共有結合により結合する。ポリペプチドまたは好適には認識ユニットは、固 体支持体に固定する。標識を検出するために使用する検出方法は、標識の性質に 依存し、例えば、放射性ヌクレオチドを検出するためのフィルム；酵素の存在を 検出するための検出可能なシグナルを発する酵素基質；エピトープの存在を検出 するための抗体などのような、当該技術分野において既知の方法である。 本発明の測定キットのさらなる態様は、それぞれが興味のある機能ドメインを 含む複数のポリペプチドの使用を含む。測定キットはさらに、複数のポリペプチ ドのそれぞれに対する選択的親和性を持つ少なくとも１つの認識ユニットを含み 、およびポリペプチド認識ユニット相互作用の存在またはその欠損を決定するた めの検出手段を含む。 例えば、SH3ドメインが本発明の方法により同定される新規のSH3ドメインであ る、SH3ドメインを含む第一分子およびSH3ドメインに結合する第二分子を含む１ つまたはそれ以上の容器の形態でキットが提供される。 特定の態様において、本発明は１つまたはそれ以上の容器の形態で以下を含む 測定キットを提供する： (a)機能ドメインがSH1,SH2,SH3,PH,PTB,LTM,アルマジロ、ノッチ/アンキリン リピート、ズィンクフィンガー、ロイシンジッパー、およびヘリックスターンヘ リックスを含むグループから選択したドメインである、興味のある機能ドメイン を含む精製したポリペプチド；および (b)上述のポリペプチド内の上述の機能ドメインに対する選択的な結合親和性 を持つ精製した認識ユニット。 上述の測定キットにおいて、ポリペプチドは、配列番号8,10,12,18,20,22,24, 30,32,38,40,190,192,194,196,198,200,221,113-115,118-121,125-128,133-139, 204-218,および219を含むグループより選択したアミノ酸配列を含む。 上記の測定キットにおいて、ポリペプチドは、配列番号6,14,16,28,34,36,112 ,116,117,122-124,129-132,および140を含むグループより選択したアミノ酸配列 を含む。 上述の測定キットの他の態様において、認識ユニットはペプチドで良い。認識 ユニットは、例えば、酵素、エピトープ、色素、またはビオチンで標識できる。 他の特定の態様において、本発明は容器の形態で以下を含む測定キットを提供 する： (a)個々のポリペプチドが別々の容器に入れられ、興味のある機能ドメインがS H1,SH2,SH3,PH,PTB,LIM,アルマジロ、ノッチ/アンキリンリピート、ズィンクフ ィンガー、ロイシンジッパー、およびヘリックスターンヘリックスを含むグルー プから選択したドメインである、興味のある機能ドメインを含む個々のポリペプ チドである精製した複数のポリペプチド；および (b)上述の複数のポリペプチド内の上述の機能ドメインに対する選択的な結合 親和性を持つ少なくとも１つの認識ユニット。 本発明はまた、１つまたはそれ以上の容器の形態で以下を含む測定キットを提 供する： (a)個々のポリペプチドが別々の容器に入れられ、個々のポリペプチドがSH3ド メインを含む精製した複数のポリペプチド；および (b)上述の複数のポリペプチド内のSH3ドメインに対する選択的親和性を持つ少 なくとも１つのペプチド。 本発明はまた、個々のポリペプチドが別々の容器に入れられ、および個々のポ リペプチドは異なる配列の機能ドメインを持つが同じ結合特異性を示す興味のあ る機能ドメインを含む精製した複数のポリペプチドを含むキットを提供する。 上記に記載したキットにおいて、ポリペプチドは配列番号8,10,12,18,20,22,2 4,30,32,38,40,190,192,194,196,198,200,221を含むグループより選択したアミ ノ酸配列を含む。 上記に記載したキットにおいて、機能ドメインはSH3ドメインである。 キットの分子成分は好適には精製する。 本発明のキットは、新規の薬剤候補の同定および5.4節に記載したその特異性 を決定するための手段において使用する。5.4. 新規の薬剤候補の同定およびその特異性を決定するための方法 本発明はまた、新規の薬剤候補（およびその化合物）の同定およびその特異性 を決定するための方法を提供する。例えば、興味のある機能ドメインおよび結合 ペプチドのような認識ユニットを持つポリペプチドは互いに選択的親和性を示す ことがわかっているので、例えば相互作用の拮抗剤または阻害剤のようなポリペ プチド認識ユニット相互作用に影響を及ぼすような薬剤を同定することを試みる ことが可能である。この測定において、例えば相互作用をもっとも効率的に破壊 するまたは認識ユニットのポリペプチドへの結合をもっとも効率的に競合するよ うなもっとも望ましい特性を示す”薬剤”候補の集合をスクリーニングすること が可能である。 または、特定の認識ユニットが同一、同様または機能ドメインと機能的に同一 な異なるポリペプチドを持つ異なる選択を有用化できる。従って、可能性のパネ ルの中から、特定のポリペプチド認識ユニット相互作用に対するより選択的な活 性を示す薬剤候補を同定するためのスクリーニング法を作成できる。従って、例 えば、好ましくない二次的な効果を生み出す可能性のある特定の結合相互作用の 効果が存在するまたは存在しないことを同定するために薬剤候補をスクリーニン グできる。 実際に、本発明の興味深い応用を、以下に記載する。既知の抗ウイルス剤であ るFIAU（ハロゲン化したヌクレオシド類似体）は、B型肝炎の原因であるウイル スに対して特定の量にて効果的である。しかし、この化合物は、薬剤を投与した 患者の肝臓をだめにする二次的な毒性効果を引き起こす可能性がある。本発明に したがって、肝臓への毒性を緩和しながらウイルス複製に対する効果を維持する ような新しいFIAU由来の薬剤の作成を開発するために使用できる測定が提供され る。このような測定は、B型肝炎ウイルスまたはウイルスに感染した細胞に存在 するポリペプチドに対する選択的親和性を持つ認識ユニットとしてのFIAUを選択 することによって提供される。このポリペプチドまたは興味のある機能ドメイン を持つポリペプチドファミリーは、本発明の方法に従って、選択した認識ユニッ ト,FIAUをB型肝炎ウイルスゲノムおよび/または感染した細胞のcDNA発現ライブ ラリーを含む発現ライブラリーと接触させることにより得られる。 同様に、選択した認識ユニットは、ヒト肝臓抽出液または感染していない肝細 胞の試料より得られる複数のポリペプチドと接触させることができる。この方法 において、それぞれ選択した認識ユニットに対する選択的親和性を示すポリペプ チドの”パネル”が同定される。上述したように、このパネルは、ウイルスポリ ペプチド-FIAU相互作用に対する肝臓ポリペプチド-FIAU相互作用の選択的な阻害 という目でみて、薬剤(FIAU)ホモログ、類似体、または派生物の活性を決定する ために使用する。従って、肝臓ポリペプチドとの相互作用ができないまたは結合 親和性が非常に低い（および、従って、望ましくない分子相互作用が除去される ために肝臓における毒性が減少する）一方でウイルスポリペプチド（または感染 した細胞のポリペプチド）に対する選択的親和性を保持しているこれらの薬剤ホ モログ、類似体、または派生物を、同定し選択することが可能である。望む場合 には、このプロセスさらに反復することが可能である。 それゆえ、本発明は以下を含む薬剤候補をスクリーニングするための手法を提 供する：(a)ポリペプチドおよび認識ユニットが上述の薬剤候補が存在しないと きに互いに接触させた場合に相互作用可能であり、そして興味のある機能ドメイ ンがSH1,SH2,SH3,PH,PTB,LTM,アルマジロ、ノッチ/アンキリンリピート、ズィン クフィンガー、ロイシンジッパー、およびヘリックスターンヘリックスを含むグ ループから選択したドメインであるような条件下で、薬剤候補の存在下において 興味のある機能ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチドを、このポリペプ チドに対する選択的親和性を持つ少なくとも１つの認識ユニットと接触させ；そ して(b)ポリペプチドと認識ユニットとの相互作用に対するおける薬剤候補の存 在の効果を決定する。 ある態様において、ポリペプチドのうち少なくともいくつかは、配列上他と異 なる機能ドメインを持つが、他のポリペプチドの機能ドメインと同じ結合特異性 を示す、複数の異なる相互作用するポリペプチド認識ユニットの組み合わせに対 する薬剤候補の効果を決定する。 他の態様において、少なくとも１つのポリペプチドまたは認識ユニットの少な くとも１つは、それぞれ、保存された機能ドメインおよび保存された認識ユニッ トを含む。 他の態様において、薬剤候補は、阻害剤の存在下において認識ユニットに対す るポリペプチドの結合の低下を検出することによって同定されるポリペプチド認 識ユニット相互作用の阻害剤である。 他の態様において、上述のポリペプチドは以下の方法によって作成したSH3ド メインを含むポリペプチドである： (i)SH3ドメインに結合する１つまたはそれ以上のペプチドを得るためにSH3ド メ インによるペプチドライブラリーのスクリーニング； (ii)SH3ドメインを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを同定する目的で ポリペプチド源をスクリーニングするための段階(i)で入手したペプチドの１つ の使用； (iii)段階(ii)で同定したポリペプチドのアミノ酸配列の決定；および (iv)SH3ドメインを含む１つまたはそれ以上の新規のポリペプチドの作成。 他の態様において、上述のポリペプチドは以下の方法によって作成したSH3ド メインを含むポリペプチドである： (i)SH3ドメインに結合する複数のペプチドを得るためのSH3ドメインによるペ プチドライブラリーのスクリーニング； (ii)段階(i)で入手したペプチドの保存配列の決定； (iii)保存配列を含むポリペプチドの作成； (iv)SH3ドメインを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを同定する目的で ポリペプチド源をスクリーニングするための保存配列を含むペプチドの利用； (v)段階(iv)において同定したポリペプチドのアミノ酸配列の決定；および (vi)SH3ドメインを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドの作成。 好適な態様において、複数の異なる相互作用するポリペプチド認識ユニットの 組み合わせの薬剤候補の効果は、好適には少なくとも上述のポリペプチドのいく つか（例えば、少なくとも2,3,4,5,7,または10個）配列上は異なる機能ドメイン を持つが、同じ結合特異性、すなわち同一の認識ユニットに結合するということ で決定する。他の特定の態様において、上述のポリペプチドおよび/または認識 ユニットの少なくとも１つは、それぞれ保存された機能ドメインおよび認識ユニ ットを含む（従って、天然で発現されるタンパクとしては知られていない）。あ る態様において、ポリペプチドは本発明の方法によって同定された新規のポリペ プチドである。特定の態様において、ポリペプチド認識ユニット相互作用の阻害 剤は、このような阻害剤の存在下においてポリペプチドの認識ユニットへの結合 の減少を検出することによって同定される。 新規の薬剤を開発する際の共通の問題点は、望ましい特性を持たない多くの化 合物のバックグラウンドの中から望ましい特性を保持するたったひとつまたは少 数の化合物を同定することである。この問題は、植物、動物または微生物由来の 試験化合物および人工的な化合物の両方で生じる。典型的に、数百または数千の 化合物は、受容体または他のタンパク質のような関連物質に対する結合能、また は受容体およびリガンド間の結合を破壊する能力のようななんらかの酵素活性に 対する化合物の効果を調べるようなin vitro測定の利用によってランダムにスク リーニングされる。 この一次スクリーニングを通過した化合物は、候補化合物となる。それからこ れらの候補化合物は、一次in vitro試験において徴候のみられた候補化合物が確 定的かまたは間違いであるのかについて、動物およびヒトにおいて最終的にin v ivo試験を行うことを含む、次の試験にまわす。レーミングトン薬剤化学、1990, A.R.ゲナロー、編集.,第８章、60-62ページ,マック印刷、イーストン、ペンシル ベニア州；エクターおよびクローク、1995,Bio/Technology 13:351-360、参照。 新規化合物を上記に記載した一次スクリーニング段階であるin vitro測定にお いて試験する必要は、絶えず存在する。これらの化合物の薬剤活性が試験される 新規の測定法もまた、絶えず必要である。候補化合物が機能ドメインを含むポリ ペプチドおよび機能ドメインに結合する認識ユニット間の結合に影響するかどう かを決定するこのような新規の測定法を提供することが本発明の目的である。特 に、上述の測定法において使用する機能ドメインおよびそれに相当する認識ユニ ットを含むポリペプチド、特に新規のものを提供することが本発明の目的である 。これらのポリペプチドの使用は薬剤活性に有用な薬剤候補をスクリーニングす るのに（並びに、逆のまたは望ましくない薬剤活性を示す薬剤候補を同定するの に）使用するいくつかの測定法に有用である。本発明のある特定の態様において 、ポリペプチドはSH3ドメインを含む。 本発明のある態様において、このようなポリペプチドは次の工程を含む方法で 同定される：ポリペプチド源をスクリーニングするためにあらかじめ決定した機 能ドメインに結合できる認識ユニットを使用し、それから機能ドメインまたは類 似の機能ドメインを含む新規のポリペプチドを同定する。 上記に記載した方法の特定の態様において、新規のポリペプチドはSH3ドメイ ンを含み、以下の工程によって得られる： (i)SH3ドメインに結合する１つまたはそれ以上のペプチドを得るためにSH3ド メインによるペプチドライブラリーのスクリーニングを行い； (ii)段階(i)で入手したペプチドの１つを、SH３ドメインを含む１つまたはそ れ以上の新規のポリペプチドを同定するためにポリペプチド源をスクリーニング するために、好適には多重複合体の形で使用し； (iii)段階(ii)で同定したポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；そして (iv)SH3ドメインを含む１つまたはそれ以上の新規のポリペプチドを作製する 。 上述に記載した方法の他の態様において、SH3ドメインを含む新規のポリペプ チドは以下の方法によって作成する： (i)SH3ドメインに結合するペプチドを得るためにSH3ドメインによるペプチド ライブラリーのスクリーニングを行い； (ii)段階(i)で入手したペプチドの保存配列を決定し； (iii)保存配列を含むポリペプチドを作製し； (iv)保存配列を含むペプチドを利用して、SH3ドメインを含む１つまたはそれ 以上の新規のポリペプチドを同定するためにポリペプチド源をスクリーニングし ； (v)段階(iv)において同定した新規のポリペプチドのアミノ酸配列を決定し； そして (vi)SH3ドメインを含む１つまたはそれ以上の新規のポリペプチドを作成する 。 当業者は、本明細書中に記載した測定方法において、SH3ドメインを含む完全 な新規のポリペプチドを使用することは必ずしも必要ではないことを理解するで あろう。しばしば、SH3ドメインを含むポリペプチド部分で十分であり、例えば 、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)-SH3ドメイン融合タンパク質で十分で ある。一例としてSH3ドメインを含む新規のポリペプチド部分に関する図10Aおよ び10B参照。 本発明の典型的な測定法は、少なくとも以下の成分を含む：(1)機能ドメイン を含む分子（例えば、タンパク質またはポリペプチド）；(2)機能ドメインに選 択的に結合する認識ユニット；(3)機能ドメインを含むタンパク質および認識ユ ニット間の結合に影響を及ぼす能力があると考えられる候補化合物。測定成分は さらに、(4)機能ドメインを含むタンパク質および認識ユニット間の結合を認識 する手段を 含んでもよい。このような手段は、例えば、機能ドメインを含むタンパク質、認 識ユニット、または候補化合物に結合させた検出可能な標識である。 特定の態様において、機能ドメインを含むタンパク質は、本発明の方法によっ て発見された新規のタンパク質である。 他の特定の態様において、本発明は、以下の工程を含む、機能ドメインを含む 分子および機能ドメインに選択的に結合する認識ユニットの結合に影響を与える 化合物の同定方法を提供する： (a)候補化合物の存在下において、結合を誘導する条件下で機能ドメインを含 む分子および認識ユニットの接触を行い、および、この分子および認識ユニット の間の結合量を測定し； (b)段階(a)における結合量と、候補化合物の非存在下において上記分子および 認識ユニットの間に起こる既知ですでに決定されている結合量を比較し、ここで 、段階(a)における結合量と、候補化合物の非存在下において上記分子および認 識ユニットの間に起こる既知ですでに決定されている結合量との相違は、候補化 合物は機能ドメインを含む分子および認識ユニットの結合に影響を及ぼす化合物 であるということを意味する。特定の態様において、機能ドメインを含む分子は 本発明の方法によって発見された新規のタンパク質である。他の特定の態様にお いて、機能ドメインはSH3ドメインである。 ある態様において、測定法は、SH3ドメインを含むポリペプチドを、認識ユニ ットのSH3ドメインを含むタンパク質への結合が候補化合物によって破壊される または妨げられない限り起こるような条件下において、候補化合物の存在下また は非存在下において選択的にSH3ドメインと結合する認識ユニットと接触させる ことを含む。候補化合物の存在下における認識ユニットのSH3ドメインを含むタ ンパク質への結合量の検出および候補化合物の非存在下における認識ユニットの SH3ドメインを含むポリペプチドへの結合量の比較により、候補化合物が結合に 影響を及ぼし、SH3ドメインを含むタンパク質の活性を修飾するような有用な化 合物かどうかを決定することが可能である。候補化合物の効果は結合を増強させ るまたは減少させるのいずれかである。 本発明において、使用に適した測定法の１つは、SH3ドメインを含むタンパク 質 をマイクロタイタープレートの穴のような固体支持体に結合させることを含む。 穴の中の状態を適切にするための適切な緩衝液および他の基質を含む穴は、SH3 ドメインを含むポリペプチドの認識ユニットへの結合を可能にする。それから、 認識ユニットおよび候補化合物を穴に添加する。認識ユニットは、例えばビオチ ン化または放射性分子で標識するように、好適に標識する、または例えばアルカ リホスファターゼのような酵素に結合させる。適切な時間インキュベートした後 に、穴を洗浄して、結合しなかった認識ユニットおよび化合物を除去する。候補 化合物がSH3ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドの標識した認識ユニ ットへの結合を阻害しない場合、標識した認識ユニットは穴の中のSH3ドメイン を含むタンパク質またはポリペプチドと結合する。この結合を検出することがで きる。候補化合物がSH3ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドおよび標 識した認識ユニットの間の結合を阻害する場合、標識は穴の中に存在しないか、 またはSH3ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドおよび標識した認識ユ ニットを含むが候補化合物は添加しないコントロールの穴と比較した場合よりも 存在程度は低い。もちろん、候補化合物の存在により、SH3ドメインを含むタン パク質またはポリペプチドおよび標識した認識ユニットの間の結合が増加するこ ともありうる。または、認識ユニットを測定の間、固体基質に固定することも可 能である。SH3ドメイン以外の機能ドメインおよびそれに相当する認識ユニット もまた、使用可能である。 上記に記載した方法における特定の態様においては、SH3ドメインを含むタン パク質またはポリペプチドは、本発明の方法によって同定されたSH3ドメインを 含む新規のタンパク質またはポリペプチドである。 5.5.薬剤活性を持つポリペプチドを発見するための、機能ドメインを含むポリペ プチドの使用 本発明の方法を使用して、例えば、SH3ドメインのような機能ドメインを含む 多くのポリペプチドを同定および単離することが可能である。これらのポリペプ チドを使用して、薬剤候補化合物を順番に並べたものに対してポリペプチドに関 連するマトリックスを構築することが可能である。例えば、表１はこのようなマ ト リックスを示す。 表１では、表の一番上に示した文字で始まるカラムは、SH3ドメインを含む異 なるポリペプチドを表す（好適には本発明の方法で同定した新規のポリペプチド ）。表の左に沿ってならんだ数字は、SH3ドメインに対するさまざまな特異性を 持つ認識ユニットを表す。個々の薬剤候補化合物について、結合測定の結果をも とに表１のような表を作成する。特定の数字の列および文字のカラムの交差する ところに示したXは、結合に対して正であること、すなわち、特定のカラムのSH3 ドメインに対する特定の列の認識ユニットの結合に影響を与える薬剤候補化合物 を示す。 上記に示したようなデータは、薬剤候補化合物が望ましいまたは望ましくない 生理学的または薬学的活性を示すまたは示す危険性があるかどうかを決定するた めに使用される。例えば、表１において、薬剤化合物は認識ユニット２のポリペ プチドB,D,およびＨのSH3ドメインへの結合を阻害する；化合物は認識ユニット ５のポリペプチＦのSH3ドメインへの結合を阻害する；化合物は認識ユニット７ のポリペプチドＣおよびＨのSH3ドメインへの結合を阻害する；および化合物は 認識ユ ニット９のポリペプチドＡのSH3ドメインへの結合を阻害する。 ポリペプチドＨとの相互作用が望ましい生理学的または薬学的活性を導く場合 、この薬剤候補は好ましいとされる。しかし、ポリペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、お よびＦとの相互作用が副作用に対して評価される必要がある。 地図を作成し、薬剤効果を観察する場合、地図は望ましい薬学的効果を得るた めに特に必要な戦略的アセスメントを可能にする。例えば、化合物５および９が 薬学的活性に影響を及ぼさない一方で、化合物２および７がなんらかの薬学的活 性に影響を及ぼす場合、ポリペプチドＨがその薬学的活性に含まれると考えられ る。例えば、化合物５および９が肥満細胞の脱顆粒化を阻害できない一方で、化 合物２および７が阻害可能な場合、ポリペプチドＨが肥満細胞の脱顆粒化に含ま れると考えられる。 従って、本発明は、ポリペプチドが薬学的活性に関与しているかどうかを決定 するための測定における、本発明の機能ドメインを含むポリペプチドの使用方法 を提供する。特定の態様において、ポリペプチドはSH3ドメインを含む。 他の態様において、方法は以下の工程を含む： (a)結合を誘導させる条件下において、薬剤化合物を機能ドメインを含む分子 と接触させ、および生じた特異的結合を検出または測定し；そして (b)それぞれ異なる機能ドメインを含むが適切な条件下においてあらかじめ決 められた単一の認識ユニットに結合できる、異なる複数の分子について、段階(a )を繰り返すこと。 好適には、少なくとも１つの上述の分子は、本発明の方法により同定された新 規のポリペプチドである。特定の態様において、分子は、Src,Abl,コータクチン 、ホスフォリパーゼCγ,Nck,Crk,p53bp2,アンフィフィシン,Grb2,RasGap,または ホスファチジルイノシトール3'キナーゼのSH3ドメインを含む。 本発明はまた、以下の工程を含む、分子の潜在的な薬学的活性を決定する方法 も提供する： (a)結合を誘導させる条件下において、当該分子を機能ドメインを含む化合物 と接触させ； (b)生じた特異的結合を検出または測定し；そして (c)それぞれの化合物は異なる配列の機能ドメインを含むが同じ結合特異性を 示す、異なる複数の化合物を用いて、段階(a)および(b)を繰り返すこと。 特定の態様において、機能ドメインはSH3ドメインである。 他の態様において、化合物は、Src,Abl,コータクチン、ホスフォリバーゼCγ, Nck,Crk,p53bp2,アンフィフィシン,Grb2,RasGap,またはホスファチジルイノシト ール3'キナーゼのSH3ドメインを含む。 本発明はまた、以下の工程を含む、機能ドメインを含む分子と該機能ドメイン に選択的に結合する認識ユニットとの結合に対して影響を与える化合物を同定す る方法も提供する： (a)候補化合物の存在下において結合を誘導する条件下において、機能ドメイ ンを含む分子および認識ユニットを接触させ、そして当該分子および認識ユニッ トの間の結合量を測定し、但しここで機能ドメインはSH1,SH2,SH3,PH,PTB,LIM, アルマジロ、ノッチ/アンキリンリピート、ズィンクフィンガー、ロイシンジッ パー、およびヘリックスターンヘリックスを含むグループから選択したドメイン である； (b)段階(a)における結合量と、候補化合物の非存在下における分子および認識 ユニット間に起こる既知ですでに決定されている結合量とを比較し、ここで、段 階(a)における結合量と、候補化合物の非存在下における分子および認識ユニッ ト間に起こる既知ですでに決定されている結合量とに相違があるときは、候補化 合物が機能ドメインを含む分子の認識ユニットへの結合に影響を及ぼす化合物で あることを示すものとする。 特定の態様において、機能ドメインはSH3ドメインである。 5.6.２つ以上の認識ユニットの同時使用 認識ユニットによるポリペプチド源のスクリーニングを行う際に、同時に２つ 以上の認識ユニットを使用することが可能であることが見いだされた。特に、５ つ以上も異なる認識ユニットをポリペプチド源のスクリーニングを行う際に使用 することが可能であることが見いだされた。 特に、認識ユニットがビオチン化されたペプチドであり、ポリペプチド源がcD NA発現ライブラリーである場合は、cDNA発現ライブラリーのスクリーニングを含 む段階ばかりでなく、ビオチン化されたペプチドをストレプタビジンアルカリホ スファターゼにあらかじめ結合させる段階も、単一のビオチン化されたペプチド を認識ユニットとして使用する場合と本質的に同様の方法で行うことができる。 詳細は第6.1節参照。同時に２つ以上のビオチン化されたペプチドを使用する際 の重要な相違は、選択が行われるポリペプチドと接触する前またはその段階のと きにペプチドに結合することである。 ポリペプチドを発現させるために、バクテリオファージ発現ライブラリーを使 用する態様において、正のクローンについてプラークを単離するまで行う場合に 、一次スクリーニングにおいて認識ユニットとして使用される複数のペプチドの うちいずれにファージが実際に結合するかを決定するために、単離したプラーク 由来のバクテリオファージについて、ビオチン化した個々のペプチドに対して試 験することができる。5.7. 既知のアミノ酸配列由来の認識ユニットの使用 多くの場合、与えられた機能ドメインに対する認識ユニットを得るために、例 えばペプチドライブラリーのような基質集団をスクリーニングする必要はない。 例えば、ペプチド認識ユニットの場合には、既知のアミノ酸配列を調べることに よって認識ユニットを同定することが可能である場合もある。機能ドメインに対 する既知の結合配列に類似したこれらのアミノ酸配列を合成し、与えられた機能 ドメインを含む複数のポリペプチドを得るためにポリペプチド源をスクリーニン グすることが可能である。 一般的な特異性を持つ認識ユニットを調整するための方法を本発明が開示する 前は、この手法を実行することは無意味なことと思われてきた。予想されたこと は、上記に記載したすでに報告されたアミノ酸配列より選択した認識ユニットは 、機能ドメインを含むせいぜい一つのタンパク質を同定するだけに有用であるだ ろうということであった。5.8. 機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸の単離および発現 特定の見地において、本発明は、好適にはヒトポリペプチドである、機能ドメ インを含むポリプチドのアミノ酸配列、および抗原決定部位（すなわち、抗体に よって認識可能）を含むまたは上記のアミノ酸をコードする核酸配列のように機 能的に活性のあるその断片および誘導体を提供する。本明細書中において使用し た”機能的に活性”な物質は、その物質が、例えば、生体活性、免疫抗原性（抗 体が結合できる）のような１つまたはそれ以上の機能活性を示し、または認識ユ ニットに特異的に結合可能な機能ドメインを含むことをいう。特定の態様におい て、本発明は少なくとも４０アミノ酸または少なくとも７５アミノ酸を含む機能 ドメインを含むポリペプチド断片を提供する。上記をコードする核酸を提供する 。少なくとも１０または２０アミノ酸の機能断片もまた、提供する。 他の特定の態様において、本発明は好適にはヒトポリペプチドであり、少なく とも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、または少なくとも１５０ ヌクレオチドを含む、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列を 提供する。機能ドメインを含むポリペプチド断片をコードする核酸を、このよう な核酸に相補的でハイブリダイゼーションできる核酸も含めて提供する。ある態 様において、このような相補的な配列は、少なくとも２５ヌクレオチド、または 少なくとも１００ヌクレオチドの機能ドメインを含むポリペプチドをコードする cDNA配列に相補的である。好適な見地において、本発明は機能ドメインまたはそ の一部分を含むヒトポリペプチドを含むcDNA配列を使用する。 真核細胞は、機能ドメインを含むポリペプチドの分子クローニング用の核酸源 となりえる。DNAは、cDNAクローニング、またはゲノムDNAクローニング、または 望ましい細胞から精製したその断片により当該技術分野において既知の標準的な 方法（例えば、DNA”ライブラリー”）により入手できる。（例えば、ザムブル ックら、1989,分子クローニング、実験の手引、コールドスプリングハーバー研 究所、第二版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；グローバー、D.M ．（編集）、1985,DNAクローニング：実験のアプローチ、MRL印刷、オックスフ ォード、イギリス、第I,II巻、参照）。ゲノムDNA由来のクローンは、コード領 域に加えて、制御およびイントロンDNA領域を含む；cDNA由来のクローンは、エ キソン配列のみ含む。起源が何であれ、機能ドメインを含むポリペプチドをコー ドする遺伝子は、遺伝子が増えるのに適したベクター中に分子クローニングする 。 ゲノムDNA由来の遺伝子の分子クローニングにおいて、DNA断片を作成すると、 そのなかには望ましい遺伝子をコードするものもある。DNAは、さまざまな制限 酵素を使用して特定の部位で切断する。または、マンガン存在下においてDNAse を使用してDNAを断片化、またはDNAを例えば超音波処理のように物理的に切断す ることができる。それから、直線状のDNA断片を、アガロース、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーが含まれるがこれに限らない 標準的な技術によって大きさにしたがって分離することが可能である。 機能ドメインを含む特定のポリペプチドをコードする遺伝子が一度ひとつの種 より単離されたら、別の種の相当する遺伝子を単離することは容易である。望ま しい遺伝子を含む別の種由来の特定のDNA断片の同定は、いくつかの方法でなさ れる。例えば、ひとつの種の遺伝子部分または特定のRNA、または例えば機能ド メインのような断片をある量入手可能で、精製および標識可能な場合には、別の 種由来のDNA断片を標識したプローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによ ってスクリーニングすることができる（ベントン、W.およびデイビス、R.,1977, Science 196,180;グルンスタイン,M.およびホグネス,D.,1975,Proc.Natl.Acad.S ci.U.S.A．72,3961）。プローブに対してある程度ホモロジーのあるDNA断片がハ イブリダイゼーションする。好適な態様において、ひとつの種の既知の遺伝子配 列にハイブリダイゼーションするプライマーを用いたPCRは、異なる種における このような遺伝子ホモログを増幅するために使用可能である。それから、増幅さ れた断片を単離し、発現またはクローニングベクターに挿入できる。制限酵素で 消化することにより適切な断片を同定し、既知の制限地図が得られればこれにし たがって予想される断片の大きさを比較することが可能である。遺伝子の特性に 基づいてさらなる選択を行うことが可能である。または遺伝子の存在を発現産物 の物理的、化学的、または免疫学的特性に基づいて測定することにより検出でき る。例えば、同様または同一の電気泳動パターン、等電点電気泳動分析、タンパ ク分解地図、in vitro凝集活性（”接着性”）またはひとつの種由来の機能ドメ インを含む特定のポリペプチドとして知られる抗原特性のようなタンパク質を作 成する、適切なmRNAをハイブリッドにより選択するcDNAクローン、またはDNAク ローンを選択することが可能である、。特定のポリペプチドに対する抗体が入手 可能であれば、別 の種の相当するポリペプチドを、ELISA（酵素による免疫吸光測定）のような手 法によってポリペプチドを合成すると思われるクローンに対する標識した抗体の 結合によって同定できる。 機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子もまた、核酸のハイブリ ダイゼーションによりmRNA選択してin vitro転写を行うことによって同定するこ とが可能である。この手法において、断片はハイブリダイゼーションにより相補 的なmRNAを単離するために使用される。このようなDNA断片は、入手可能なひと つの種由来の機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の精製したDN Aを示す。単離したmRNAのin vitroにおける転写産物の免疫沈降解析または機能 測定（例えば、認識ユニットへの結合能）により、mRNA、すなわち、望ましい配 列を含む相補的なDNA断片が同定される。さらに、特定のmRNAは機能ドメインを 含むポリペプチドに対する特異的な固定した抗体に対する細胞から単離したポリ マーの吸光により選択できる。機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺 伝子の放射性標識したcDNAは、鋳型として選択したmRNA（吸着ポリマーより）を 使用して合成することが可能である。それから、放射性標識したmRNAまたはcDNA を、他のゲノムDNA断片の別の種の機能ドメインを含むポリペプチドをコードす る遺伝子を示すDNA断片を同定するためのプローブとして使用する。特定の態様 において、マウス遺伝子のヒトホモログを、上述の方法によって得た。さまざま な態様において、ヒトホモログは、緩い条件またはきつい条件下においてマウス ホモログにハイブリダイゼーションする。このような緩い条件を使用した手法の 例として、以下が挙げられるが、これに限ったことではない（シロおよびワイン バーグ、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6789-6792も参照）：DNAを含むフィ ルターを6時間40℃で、35%ホルムアミド、5XSSC,50mMTris-Hcl(pH7.5),5mM EDTA ,0.1%PVP,0.1%ファイコール,1% BSA,および500μg/ml変性させたサケ精子DNAを 含む溶液中で調整する。ハイブリダイゼーションは、同じ溶液を以下に変更して 行う：0.02%PVP,0.02%ファイコール,0.2% BSA,および100μg/ml変性させたサケ 精子DNA,10%(重量/容積)硫酸デキストラン、および5-20X10⁶cpm ³²Pで標識した プローブを使用する。フィルターはハイブリダイゼーション混合液中で18-20時 間40℃でインキュベートし、それから2XSSC,25mMTris-HCl(pH7.4),5mM EDTA,お よび0.1% SDSを含む溶 液中で1.5時間55℃で洗浄する。洗浄液を新しい液体と置換して、さらに1.5時間 60℃でインキュベートする。フィルターを乾燥させてオートラジオグラフィーに かける。必要であれば、フィルターを65-68℃で３度目の洗浄を行い、再びフィ ルムに感光させる。使用できる緩い条件の他の条件は、当該技術分野において既 知である（例えば、種間ハイブリダイゼーションを利用する）。 きつい条件を使用した手法の例として、以下が挙げられるが、これに限ったこ とではない：DNAを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを6XSSC,50mMT ris-HCl(pH7.5),1mM EDTA,0.02%PVP,0.02%ファイコール,0.02% BSA,および500μ g/ml変性させたサケ精子DNAを含む緩衝液中で65℃で8時間から一晩行う。フィル ターは、100μg/ml変性させたサケ精子DNAおよび5-20X10⁶cpm ³²Pで標識したプ ローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で65℃で48時間ハイブリダイ ゼーションする。フィルターの洗浄は2XSSC,0.01%PVP,0.01%ファイコール,およ び0.01% BSAを含む溶液中で1時間37℃で行う。それから0.1XSSCで45分50℃で洗 浄した後にオートラジオグラフィーにかける。使用できるきつい条件の他の条件 は、当該技術分野において既知である。 それから、同定し単離した機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝 子を、適切なクローニングベクターに挿入できる。当該技術分野において既知の 非常に多くのベクター宿主システムを使用できる。使用できるベクターには、プ ラスミドまたは修飾したウイルスが含まれるがこれらに限ったことではないが、 ベクター体系は使用する宿主細胞に適合しなければならない。このようなベクタ ーには、ラムダ派生体のようなバクテリオファージ、またはPBR322またはpUCプ ラスミド派生体のようなプラスミドが含まれるがこれらに限ったことではない。 クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的な末端を持つクローニングベ クターへDNA断片をライゲーションすることにより、行われる。しかし、DNAを断 片化するのに使用する相補的な制限部位がクローニングベクター中に存在しない 場合には、DNA分子の末端は酵素的に修飾する。または、望ましい部位をDNA末端 に核酸配列（リンカー）をライゲーションすることによって作成できる；これら のライゲーションしたリンカーは、制限酵素認識配列をコードする特定の化学的 に合成オリゴヌクレオチドを含む。別の方法において、切断したベクターおよび 遺 伝子を、ホモポリメリックテイリングによって修飾できる。組換え分子は、形質 転換、形質導入、感染、エレクトロポレーション、などにより宿主細胞に導入で き、遺伝子配列の多くのコピーが生じる。 別の方法において、望ましい遺伝子は”ショットガン”法で適切なベクターに 挿入した後に同定し単離できる。例えば、クローニングベクターに挿入する前に 、大きさによる画分化により望ましい遺伝子を濃縮することが可能である。 特定の態様において、単離した遺伝子、cDNA、または合成DNA配列を含む組換 えDNA分子で宿主細胞を形質転換すると、遺伝子が多コピー得られる。従って、 形質転換体を増殖させ、形質転換体より組換えDNA分子を単離し、および必要で あれば、単離した組換えDNAから挿入遺伝子を回収することによって大量に遺伝 子が得られる。 本発明の機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を、適切な発現ベ クター、すなわち、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に 必要な要素を含むベクター、に挿入することが可能である。必要な転写および翻 訳シグナルもまた、ポリペプチドをコードする本来の遺伝子および/またはそれ に続く領域によって供給される。さまざまな宿主ベクターシステムが、タンパク 質をコードする配列を発現するのに利用できる。これらには、ウイルスを感染さ せた哺乳動物細胞システム（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、な ど）；ウイルスを感染させた昆虫細胞システム（例えば、バキュロウイルス）； 酵母ベクターを含む酵母のような微生物、またはバクテリオファージ、DNA,プラ スミドDNA,またはコスミドDNAで形質転換したバクテリアが含まれるが、これに 限られたことではない。ベクターの発現要素はその強度および特異性に従ってさ まざまである。宿主ベクターシステムの利用にしたがって、適切な転写および翻 訳要素のうち１つを使用できる。 ベクターへのDNA断片の挿入について上記に記載した方法は、適切な転写/翻訳 制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクタ ーを構築するのに使用できる。これらの方法は、in vitro組換えDNAおよび合成 技術およびin vivoの組換え（遺伝的組換え）を含む。タンパク質またはペプチ ド断片をコードする核酸配列の発現は、タンパク質またはペプチドが組換えDNA 分子で 形質転換した宿主において発現されるように第二の核酸配列によって制御される 。例えば、タンパク質の発現は当該技術分野において既知のプロモーター/エン ハンサー要素によって制御される。遺伝子発現を制御するのに使用するプロモー ターには、SV40初期プロモーター領域（ベノイストおよびチャンボン、１９８１ 、な連れ290,304-310）、ラウス肉腫ウイルスの長い3'末端繰返しを含むプロモ ーター(山本、ら、1980,Cell 22,787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモー ター(ワグナーら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．78,1441-1445)、メタロチ オネイン遺伝子の制御配列(ブリンスターら、1982,Nature 296,39-42)；βラク タマーゼプロモーター（ビラ-カマロフ、ら、1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A． 75,3727-373）、またはtacプロモーター（デボアー、ら、1983,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A．80,21-25）のような原核生物発現ベクター；Scientific American 1 980,242,74-94の“組換えバクテリアの有用なタンパク質”、；ノパリン合成酵 素プロモーター域（ヘルラ-エストルラら、Nature 303,209-213）またはカリフ ラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（ガーダー、ら、1981,Nuc.Acids Res.9,2871）、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモ ーター（ヘルラ-エストルラら、Nature 310,115-120）を含む植物発現ベクター ；Gal4プロモーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ ホスフォグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモ ーターのような酵母または他の菌類由来のプロモーター要素、および組織特異性 を示し、トランスジェニック動物において有用化されている以下の動物の転写制 御領域：膵臓ブドウ球細胞において活性のあるエラスターゼI遺伝子制御領域（ スウィフトら、1984,Cell 38,639-646;オリンズら、1986,コールドスプリングハ ーバーSymp.Quant.Biol.50,399-409;マクドナルド、１９８７、Hepatology 7,42 5-515）；膵臓β細胞において活性のあるインシュリン遺伝子制御領域（ハナハ ン、1985,Nature 315,115-122）、リンパ細胞において活性のあるイムノグロブ リン遺伝子制御領域(グロッシェデルら、1984,Cell 38,647-658;アダムスら、19 85,Nature 318,533-538;アレクサンダーら、1987,Mol.Cell.Biol.7,1436-1444) 、睾丸、乳、リンパ球および肥満細胞において活性のあるマウス乳腺腫瘍ウイル ス制御領域（レーダーら、1986,Cell 45,485-495）、肝臓において活性のあるア ルブミン遺伝子制 御領域（ピンカートら、1987,Genes and Devel.1,268-276）、肝臓において活性 のあるαフェトタンパク質遺伝子制御領域(クルムラウフら、1985,Mol.Cell.Bio l.5,1639-1648;ハマーら、1987,Science 235,53-58)；肝臓において活性のある α１アンチトリプシン質遺伝子制御領域(ケルシーら、1987,Genes and Devel.1, 161-171)、ミエロイド細胞において活性のあるβグロビン遺伝子制御領域(モグ ラムら、1985,Nature 315,338-340；コリアスら、1986,Cell 46,89-94)；、脳の オリゴデンドロサイト細胞において活性のあるミエリンベイシックタンパク質遺 伝子制御領域(リードヘッドら、1987,Cell 48,703-712)、骨格筋細胞において活 性のあるミオシン軽鎖2遺伝子制御領域(サニ、1985,Nature 314,283-286),およ び視床下部において活性のあるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（マ ソンら、1986,Science 234,1372-1378）が含まれるがこれに限ったことではない 。 機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子のインサートを含む発現 ベクターは、３つの遺伝的な手法により同定することが可能である：(a)核酸ハ イブリダイゼーション、(b)”マーカー”遺伝子機能の存在または欠損、および( c)インサート配列の発現。第一の手法において、発現ベクターに挿入された外来 遺伝子の存在は、挿入遺伝子に相同的な配列を含むプローブを使用して核酸ハイ ブリダイゼーションにより検出可能である。 第二の手法において、組換えベクター/宿主システムは、外来遺伝子がベクタ ー中に挿入されることによって生じる”マーカー”遺伝子機能の存在または欠損 に基づいて同定および選択することが可能である（例えば、チミジンキナーゼ活 性、抗生物質に対する耐性、形質転換活性、バキュロウイルスにおける封入体形 成など）。例えば、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子がベク ターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、遺伝子を含む組換え体は、マー カー遺伝子機能の欠損により同定することが可能である。第三の手法において、 組換え発現ベクターは、組換え体によって発現される外来遺伝子産物の測定によ って同定することが可能である。このような測定は例えば、認識ユニットへの結 合能のようなin vitro測定システムにおいて遺伝子産物の物理的または機能的な 特性に基づく。 一度特定の組換えDNA分子が同定され単離されたら、当該技術分野にいて既知 の いくつかの方法を使用することにより増殖させることが可能である。一度適切な 宿主体系および増殖条件が確立されたら、組換え発現ベクターを増殖させて大量 に調整することが可能である。先に説明したように、使用できる発現ベクターは 、以下のベクターまたはその派生体を含むがこれに限ったことではない：ワクシ ニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロ ウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（ 例えば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドDNAベクター。 さらに、挿入した配列の発現を調節するか、または望みの特異的な方法で遺伝 子産物を修飾および加工する宿主細胞株を選ぶことができる。特定のプロモータ ーからの発現は、特定の誘導物質の存在下において上昇させることが可能であり ；このようにして、タンパク質の発現を調節することができる。さらには、異な る宿主細胞は、タンパク質の翻訳中および翻訳後の加工、および修飾（例えば、 グリコシル化、切断）のための特徴的および特異的な機構を有している。発現さ れる外来タンパク質の望みの修飾および加工を確実にするために、適当な細胞株 または宿主の系を選ぶことが可能である。例えば、バクテリアの系における発現 は、グリコシル化されない核（コア）タンパク質産物を生産するのに利用できる 。酵母における発現は、グリコシル化された産物を産生するであろう。哺乳動物 細胞における発現は、異種構造タンパク質の”天然の”グリコシル化を確実にす るのに利用できる。さらには、異なるベクター/宿主の発現系は、タンパク質分 解の切断等の加工反応に影響するであろう。 他の特定の態様においては、機能ドメイン、またはそれらの断片、類似物、ま たは誘導体は、融合、またはキメラのタンパク質産物（（異なるタンパク質の） 異種構造のタンパク質配列にペプチド結合を介して結合したポリペプチド、断片 、類似物、または誘導体を含む）として発現され得る。そのようなキメラ産物は 、望みのアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を、当該技術分野において知 られている方法により適当な読み枠にお互いを連結し、且つ、当該技術分野にお いて一般的に知られている方法によりキメラ産物を発現させることによって作製 可能である。その代わりとして、そのようなキメラ産物をタンパク質合成技術に よって、例えば、ペプチド合成機により作製することが可能である。 5.8.1 発現させた遺伝子産物の同定および精製 いったん機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を発現する 組換え体を同定すれば、その遺伝子産物が分析可能である。これは、遺伝子産物 の放射性標識に続いたゲル電気泳動による分析を含む、産物の物理的または機能 的特徴に基づいた分析により達成できる。いったん機能ドメインを含むポリペプ チドを同定すれば、それをクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグ ラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびサイズカラムクロマトグラフィー ）、遠心、溶解度の差を含む標準的な方法により、またはタンパク質の精製のた めの他の標準的な技法により、単離し、精製することができるだろう。機能的特 徴は、認識単位への結合を含むがそれには限定されない、適当な分析法を用いて 評価することができる。 5.9 機能ドメインを含むポリペプチドの誘導体および類似体 本発明はさらに、機能的に活性な、例えば、機能ドメインを含むポリペプチド の誘導体（断片を含むが、これに限定されない）および類似体を供給する。特定 の態様においては、誘導体または類似体は、機能的に活性、すなわち、全長の野 生型のポリペプチドに関連した一つまたはそれ以上の機能的活性、例えば認識単 位への結合、を示すことができる。一つの例として、そのような誘導体および類 似体は全長のポリペプチドの抗原性を有している。 特に、誘導体は機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を、 機能的に等価の分子を供給する置換、付加、または欠失により変換することによ って作製することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重により、本発明の実 行において、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子として、実質 的に同一のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を使用することが可能である 。これらには、配列内に機能的に等価のアミノ酸残基をコードする異なるコドン の置換により変換され、こうして表面化しない変化（サイレントチェンジ）を生 み出す、そのような遺伝子の全てまたは一部を含むヌクレオチド配列が含まれる が、 それらに限定されるものではない。同様に、発明の誘導体には、機能的に等価の アミノ酸残基を配列内で表面化しない変化を生じる残基に置換した改変配列を含 む機能ドメインを含む、ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を一次ア ミノ酸配列として含むものが含まれるが、これらに限定されるものではない。例 えば、配列内の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、機能的に等価で、表面化 しない変化を生じるものとして機能する同様の極性の別のアミノ酸により置換で きる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから 選択できる。例えば、非極性の（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、 イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、および メチオニンが含まれる。極性を有する中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、 システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に帯電 した（塩基性の）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含ま れる。負に帯電した（酸性の）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン 酸が含まれる。 機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の誘導体または類似体に は、それらの遺伝子またはその断片に実質的に相同性があり、それらのコードし ている核酸が遺伝子の核酸配列にハイブリダイズすることのできる、それらのポ リペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。 本発明の誘導体および類似体は、当該技術分野で知られているさまざまな方法 により生産することができる。それらを生産するに至る操作は遺伝子またはタン パク質の段階で生じ得る。例えば、クローン化した遺伝子配列は、当該技術分野 で知られている多数の手法のいずれかにより修飾することができる（Maniatis， T.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Har bor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York）。配列は、制限酵素により適 当な部位で切断し、その後、必要ならばさらに酵素による修飾を行い、単離し、 in vitroで連結することができる。望みのポリペプチドをコードする核酸をPCR により増幅する間に望みの配列の変化を導入するために、PCRプライマーを構築 することができる。誘導体または類似体をコードする遺伝子の生産において、修 飾された遺伝子が同一の翻訳の読み枠にあり、望みの活性がコードされている遺 伝子 領域において翻訳の終止コドンにより中断されていないことを確実にすることに 注意を払わなければならない。 さらに、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の配列は、翻訳 、開始、および/または終結の配列を創るため、および/または破壊するために、 またはさらにin vitroの修飾を容易にするためにコード領域内に変化を創るため 、および/または新たな制限酵素部位を創るため、または先に存在していた部位 を破壊するために、in vitroまたはin vivoで変異を入れることができる。in vi troの部位特異的変異導入（Hutchinson，C.ら、1978，J．Biol．Chem 253:655） 、TABリンカー（Pharmacia）の利用等を含むがこれに限定されない、当該技術分 野において知られている変異導入の技法は、いずれも利用可能である。 配列の操作はまた、タンパク質の段階においても行うことが可能である。例え ば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロック基 による誘導、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合 等による、翻訳中または翻訳後に特異に修飾されるタンパク質断片、または他の 誘導体、または類似体は、本発明の範囲に含まれる。臭化シアン、トリプシン、 キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH₄による特異的な化学的切断 ；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元； チュニカマイシン存在下における代 謝合成等を含むが、これらに限定されない、多数の科学的な修飾により、多数の 化学的修飾がいずれも実行可能である。 さらに、類似体および誘導体は化学的に合成することが可能である。例えば、 機能ドメインを含むポリペプチドの一部に相当するペプチドは、ペプチド合成機 を用いて合成することができる。さらには、もし望むならば、非古典的なアミノ 酸または化学的なアミノ酸類似体を配列中に基質として、または付加残基として 導入することが可能である。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸のD-異性 体、α-アミノイソブチル酸、4-アミノブチル酸、ヒドロキシプロリン、サルコ シン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェ ニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、β-メチルアミノ酸等の デザインされたアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、およびNα-メチルアミノ酸が含 まれるが、これらに限定されるものではない。 5.10 機能ドメインを含むポリペプチドに対する抗体 ある態様に従って、本発明はその結合ドメインを含み、機能ドメインを含むポ リペプチドに対して標的化された抗体、およびその断片を提供する。それに応じ て、機能ドメインを含むポリペプチド、特にその断片または類似体または誘導体 を、そのようなポリペプチド、断片または類似体または誘導体に対する抗体を作 製するための抗原として使用することができる。そのような抗体は、ポリクロー ナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab断片、またはFab発現ライブラリー 由来であり得る。特定の態様においては、機能ドメインを含むポリペプチドの機 能ドメインに特異的な抗体を調製することができる。 当該技術分野において知られているさまざまな方法を、ポリクローナル抗体の 生産に利用することが可能である。特定の態様においては、機能ドメイン、また はその部分配列を含むポリペプチドの抗原提示基に対するウサギの抗体を得るこ とができる。抗体の生産には、機能ドメインを含む天然のポリペプチド、または 合成したもの、またはその断片の注射により、ウサギ、マウス、ラット等を含む がこれらに限定されない、さまざまな宿主動物を免疫することができる。宿主の 種に依存して、免疫学的応答を増加させるために、フロイト（完全および不完全 なもの）、水酸化アルミニウム等の無機質ゲル、リゾレシチン等の界面活性剤、 プルロニック系のポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、 スカシガイヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanins)、ジニトロフェノール、 およびBCG（bacille Calmette-Guerin）およびcorynebacterium parvum等の有用 な可能性のあるヒトのアジュバントを含むが、これらに限定されない、さまざま なアジュバントを利用することができる。 モノクローナル抗体の調製には、培養液中の連続培養細胞株による抗体分子の 生産を提供するいずれの技法も利用可能である。例えば、KohlerおよびMilstein により開発されたハイブリドーマ法(1975，Nature 256，495-497)並びにトリオ ーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozborら、1983，Immunology Today 4， 72）、および、ヒトのモノクローナル抗体を生産するためのEBV-ハイブリドーマ 法（Coleら、1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss , Inc.，pp．77-96 中）。 分子の遺伝子型（結合ドメイン）を含む抗体断片は既知の手法により作製でき る。例えば、そのような断片には、抗体分子をペプシンで消化することにより生 じ得るF(ab)'₂断片；F(ab)'₂断片のジスルフィド結合を還元することにより生じ 得るFab'断片、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生 じ得るFab断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。抗体の生産に おいては、望みの抗体のスクリーニングは例えばELISA（酵素結合免疫吸着剤分 析(enzyme-linked immunosorbent assay)）のように、当該技術分野において知 られている手法により達成できる。 6. 実施例 6.1. cDNA 発現ライブラリーからの遺伝子の同定 ペプチド認識単位が、それらの標的となる機能ドメインと同一または類似であ るが、それらの標的となる機能ドメインを含むタンパク質以外のタンパク質に含 まれている機能ドメインを認識できるかどうかを決定するために、研究を開始し た。比較的小さなサイズの認識単位を用いるそのような”機能的な”スクリーニ ングは、これまでには知られておらず、機能ドメインを含んだタンパク質間の配 列の相同性の度合が低いために開発するのが困難であった。このように、例えば オリゴヌクレオチドプローブは、SH3ドメインの一次配列の相同性の度合の低さ に基づいた信頼度で設計することは不可能であった。 組み合わせの（conbinatorial）ペプチドライブラリー由来のSH3ドメイン結合 ペプチドを認識単位として用いることで、我々は一連のマウスおよびヒトのcDNA 発現ライブラリーを検索した。我々は、ライブラリーから単離した74クローンの うち69クローンが少なくとも一つのSH3ドメインをコードすることを見いだした 。これらのクローンは、18種類以上のSH3ドメインを含むタンパク質に相当し、 その中の10種類以上は過去に報告されていないものであった。 選択した最初の認識単位は、ファージ提示型ランダムペプチドライブラリー（ Sparksら、1994，J．Biol．Chem．269: 23853-23856）から単離したSrc SH3ド メイン結合ペプチド（pSrcCIIと呼ぶ）であった。pSrcCIIは（ビオチン-SGSGGIL APPVPPRNTR-NH₂）（配列番号1）であった。pSrcCIIは標準的なFMOC化学作用によ り合成し、HPLCにより精製し、且つ、その構造は質量分析およびアミノ酸分析に より確認した。多価複合体を形成させるために、50 pmolのビオチン化pSrcCIIペ プチドを、2 μgのストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（SA-AP）（ビ オチン：ビオチン結合部位が１：１の割合になるように）と共にインキュベート した。過剰なビオチン結合部位は500 pmolのビオチンを添加することによりブロ ックした。代わりとして、31.2 μlの1 mg/ml SA-APを、15 μlの0.1 mM ビオチ ン化ペプチドと共に4℃で30分間インキュベートすることも可能であったであろ う。続いて10 μlの0.1 mM ビオチンを加え、インキュベートした溶液をさらに1 5分間インキュベートした。 λEXloxマウスの16日胚のcDNA発現ライブラリーはNovagen（Madison，WI）よ り入手した。cDNAライブラリーを公表されている方法（YoungおよびDavis，1983 ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80: 1194-1198）に従ってスクリーニングした。 ライブラリーを以下のようにして初濃度30,000プラーク/100 mmペトリ皿でプレ ーティングした。分注したライブラリーを、SM（100 mM NaCl，8 mM MgSO₄，50 mM Tris HCl pH 7.5，0.01% ゼラチン）で1:1000に希釈した。希釈したファージ 3μlを、1.5 mlのそれぞれのSM、10 mM CaCl₂/MgCl₂、およびBL21(DE3)pLysE E ．coli細胞の終夜培養液に添加した。BL21の終夜培養液は、10 mM MgSO₄，0.2% マルトース，および25μg/ml クロラムフェニコールを加えた2×YT培地（1.6% トリプトン，1% 酵母エキス，および0.5% NaCl）で増殖させた。この混合液を、 37℃で20分間インキュベートし、その後300 μlを25 μg/ml クロラムフェニコ ールを含む3 mlの0.8% 2×YTトップアガロースで、14枚の2×YT寒天培地のそれ ぞれにプレーティングした。37℃で6時間置いてプラークを形成させ、その後、 イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を染み込ませたフィルター を接触させた。37℃でさらに8時間インキュベートした後、フィルターに印を付 け、プレートから剥がし、そしてリン酸緩衝塩水（PBS; 137 mM NaCl，2.7 mM K Cl，4.3 mM Na₂HPO₄，1.4 mM KH₂PO₄，0.1%），Triton X-100で3回洗浄した。フ ィルターはPBS，2% 仔牛血清アルブミン（ブロッキング溶液）中で1時間ブロッ キングし、続いて新 たなブロッキング溶液にストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（SA-AP） 結合ペプチドを加えたもので4℃で一終夜インキュベートした。1 mlのブロッキ ング溶液中でペプチドと会合しているSA-AP 約1μgをそれぞれのフィルターに用 いた。続いて、フィルターに対してPBS，0.1% Triton X-100で15分間の洗浄を４ 回行った。結合したSA-AP-ペプチド複合体は、44 mlの塩化ニトロブルーテトラ ゾリウム（NBT，70% ジメチルホルムアミド中75 mg/ml）、および33 mlの5-ブロ モ-4-クロロ-3-インドイルリン酸-p-トルイジン塩（BCIP ジメチルホルムアミド 中50 mg/ml）と共に10 mlのアルカリホスファターゼ緩衝液（0.1 M Tris-HCl，p H 9.4，0.1 M NaCl，50 mM MgCl₂）中でインキュベートすることにより検出した ；シグナルは強く、しばしば数分以内に明確になった。陽性のプラークはパスツ ールピペットで中心を吸い取り、クロロホルムを一滴垂らした1 mlのSMに入れた 。λファージ粒子は、殺菌剤として働くクロロホルムに対して構造的に耐性であ る。これらのプラーク中心部を次のプレーティングの前に少なくとも1時間溶液 に拡散させた。プラーク中心部由来のファージはそれぞれ100 μlのSM，10 mM C aCl₂/MgCl₂，およびBL21(DE3)pLySE細胞の終夜培養液でプレーティングした。フ ァージは、プラーク形成単位（pfu）/プレートの数がそれぞれのスクリーニング で力価がおおよそ10減少する（即ち、一次スクリーニングでは3×10⁴、二次スク リーニングでは3×10³等々）ような意図をもってプレーティングする。これは、 プラーク中心部を1:1000に希釈し、1-10 μl/プレートでプレーティングするこ とにより達成できる。独立のプラークを得るためには、通常４回のスクリーニン グが要求される。 プラスミドはBM25.8 E．coli細胞内でcreの媒介する切り出しによりλEXloxフ ァージから回収する。それぞれのクローンついて、100μlのSMおよび100μlのBM 25.8細胞の終夜培養液（10 mM MgSO₄，0.2% マルトース，34 μg/ml クロラム フェニコール，および50 μg/ml カナマイシンを加えた2×YT培地で培養したも の）を含む溶液に、1:100に希釈したファージを5 μl加える。37℃で30分経過後 、この溶液100 μlをLB ampアガロースプレートに拡げ、37℃で一終夜インキュ ベートした。それぞれのプレート由来の単一コロニーを3 mlの2×YT/ampに植菌 するのに用い、一終夜インキュベートした。プラスミドDNAはPromega Wizard Mi niprep DNA精製キット（Promega，Madison，WI）を用いて終夜培養液から精製し 、等量の フェノール/クロロホルムとそれに続いてクロロホルムのみにより抽出し、そし てエタノールで沈澱させた。このプラスミドDNAを化学反応性のDH5α細胞に形質 転換した。それぞれの形質転換から三つのコロニーを3 mlの培養液への植菌に用 いた；DNAは上述のようにして精製した。形質転換した細胞由来の個々に精製し たそれぞれのDNA試料の1/20を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、挿入DNAのサイズ およびDNAの質を決定するために、1% アガロースゲルによる電気泳動により検定 した。それぞれのクローンに対して一つのDNA調製物をジデオキシ法を用いての 手作業によるか、または蛍光ジデオキシヌクレオチド終結因子を用いた自動手法 によるかのいずれかで配列を決定した。どちらの場合にも都合良くEcoRI制限部 位の約40bp上流に位置するT7遺伝子10プライマーを用いた。 λEXloxの16日胚cDNA発現ライブラリーの一次スクリーニングにおいて、1×10⁶ プラークのうち約100が意味のあるpSrcCII結合活性を示した。図５は一次およ び三次スクリーニング由来の典型的なフィルターである。単離し配列を決定した 18の陽性のクローンの中で、全てがSH3ドメインをもつタンパク質をコードして いることが判明したが、いくつかのクローンは同族種であるか、または同一のmR NAに由来すると思われた。こうして、pSrcCIIのスクリーニングによって９種類 のSH3ドメイン含有タンパク質をコードするcDNAが同定された（図９を参照のこ と）。これらのタンパク質の配列をGenBank中の配列とBLASTコンピュータープロ グラムで比較した。これらのタンパク質のうちの３つは、GenBankに登録されて いるものと一致した。SH3P1は、p53bp2、すなわちp53結合タンパク質であるp53b p2、のマウスのホモログ（Iwabuchiら、1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91: 6098-6102）であると思われ； SH3P6はいくつかの乳癌において増幅している 遺伝子である、ヒトのMLN50（Tomasattoら、1995，Genomics 28: 367-376）に似 ており；そしてSH3P5は細胞骨格組織に関わっているタンパク質である、コータ クチン（WuおよびParsons，1993，J．Cell Biol．120: 1417-1426）である。６ つのクローンは、GenBankに登録されているものとは一致せず、これは本発明が 新規のSH3ドメイン含有タンパク質を同定するのに利用できることを示している 。これらの新規のタンパク質のうち、SH3P2は３つのアンキリン・リピートおよ びそのSH3ドメインに隣接する一つのプロリンに富んだ領域を含んでおり； SH3 P7およびSH3P9 は、それぞれドレブリン（Ishikawaら、1994，J．Biol．Chem．269: 29928-2993 3）およびアンフィフィジン（Davidら、1994，FEBS Lett．351: 73-79）の各タ ンパク質の領域に関連のある配列を含んでいる。最後に、新規のタンパク質であ るSH3P4およびSH3P8は、既知のタンパク質には似ていないが、お互いに高い関連 性がある（89%のアミノ酸の類似性）。 本発明は、その過程において、順に次のスクリーニングのための付加的な認識 単位を生じさせるために使われる機能ドメインを含むタンパク質を同定するため に認識単位を使用するような、反復した工程の一部として利用することが可能で ある。例えば、これらの新たにクローン化したSH3ドメインの結合特異性を決定 するために、それらをグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク 質として、細菌内で過剰発現させることができ、次にはそれは、次にはSH3ドメ インを含むより新しいタンパク質を得るためにcDNAライブラリーをスクリーニン グするのに利用できる認識単位を得るために、ランダムなペプチドライブラリー をスクリーニングするのに利用することができる。 上記のpSrcCIIスクリーニングにおいて単離されたSH3ドメインのうちの二つ（ p53bp2およびコータクチン）の認識単位の結合の優先性はすでに記載されている （Sparksら、1996．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93: 1540-1544）。これらのSH 3ドメインは、pSrcCII配列に関連があるが、しかし異なっている、認識単位モチ ーフを認識する。我々は、マウス胚cDNA発現ライブラリーをスクリーニングする ために、コータクチンのSH3認識単位のモチーフを含む合成ペプチド（pCort）を 使用した。pCortは（ビオチン-SGSGSRLTPQSKPPLPPKPSWVSR-NH₂）（配列番号２） である。pCortは上記のpSrcCIIのようにして調製し、SA-APと会合させた。pCort によるマウス胚ライブラリーのスクリーニングは上記のpSrcCIIの場合と同様に 行った。 シグナルの長さの異なる26のクローンを単離し、21のクローンがSH3ドメイン を含むタンパク質をコードしていることが判明した。pCortのスクリーニングに より、９種類のSH3含有タンパク質に相当する遺伝子が得られ（図９を参照のこ と）、そのうちの４つはGenBankに登録されているものと一致した。SH3P5および SH3P6は上述したコータクチンおよびMLN50であり； SH3P10は、IgEのシグナル 伝達系に関 与するタンパク質であるSPY75/HS1（Fukamachiら、1994，J．Immunol．152: 642 -652）と一致し； そしてSH3P11は、SH2ドメインおよびSH3ドメインを含むアダ プター分子であるCrk（Knudsenら、1994，J．Biol．Chem．269: 32781-32787） である。５つの新規の転写産物は上述したSH3P7、SH3P8、およびSH3P9； SH3P4 /SH3P8ファミリーの付加的なメンバーであるSH3P13； ３つのSH3ドメイン、お よびペプチドホルモンであるソルビン（Vagen-Descroiz M.ら、1991，Eur．J．B iochem．201: 53-50）と有意な配列の類似性を有する領域をもつタンパク質であ るSH3P12をコードしている。 興味深いことに、pCortスクリーニングの結果はごく部分的にpSrcCIIのスクリ ーニングの結果と重複しているに過ぎなかった： pCortにより単離された９つ のSH3含有タンパク質のうちの４つは、pSrcCIIでは同定されなかった。さらには 、pSrcCIIのスクリーニングにおいてもっとも高頻度（50%）に同定されたタンパ ク質であるSH3P9は、pCortプローブではより低い頻度（7%）で単離された。この ように、異なる認識単位は、異なる組のSH3ドメインを同定するのに利用可能で ある。 少なくとも一つのSH3ドメインを有するのに加えて、pSrcCIIおよびpCortのス クリーニングにおいて同定されたタンパク質の顕著な特徴は、タンパク質内のSH 3ドメインの位置である： 13のタンパク質のうち12がそれらのC末端の近くにSH 3ドメインをもっている。pSrcCIIはSrcのSH3ドメインに効率良く結合できる（図 8）が、Src（そのSH3ドメインはN末端付近に存在する）はpSrcCIIのスクリーニ ングでは同定されなかった。我々はこの偏りが、マウス胚cDNAライブラリーがオ リゴdTプライムのcDNAを用いて作製されているという事実の結果ではないかと考 えている。それとも、ライブラリーの調製に使用したmRNAが非常に少ないSrcの 一次転写物を含んでいたか、またはまったく含まなかったのかもしれない。 pSrcCIIペプチドの変形型（T12SRC.1）を、オリゴdTをプライマーにしたλgt2 2aのヒト前立腺癌細胞株のcDNAライブラリー、および、ランダムおよびオリゴdT プライマーをプライマーにしたλgt11のヒト骨髄のライブラリーをプローブ検索 するのに使用した。T12SRC.1は（ビオチン-GILAPPVPPRNTR-NH₂）（配列番号3） であった。T12SRC.1は最初のスクリーニングにおいてペプチドT12SRC.4と共に用 いた。T12SRC.4は（ビオチン-VLKRPLPIPPVTR-NH₂）（配列番号4）であった。λg t2 2aのヒト前立腺癌細胞株cDNAライブラリーは、標準的な方法、すなわちSuperscr ipt Lambda system for cDNA synthesis and cloning（Bethesda Research Labo ratories，Gaithersburg，MD）を用いて、LNCap前立腺癌細胞株より作製した。 λgt11のヒト骨髄cDNA発現ライブラリーはClonetch（Palo Alto，CA）より入手 した。ヒトのライブラリーをスクリーニングし、λgt11およびλgt22aファージ のcDNA挿入配列をcreの介在する切り出しによって回収するのではなく、PCRによ り増幅するという点を除いて、上記のようにして陽性のクローンを単離した。こ れらのライブラリーからスクリーニングした1.2×10⁷のλcDNAクローンのうち、 30のクローンが検出可能なpSrcCII結合活性を示した。陽性のクローンの解析に より、それらのそれぞれが少なくとも一つのSH3ドメインをコードしており、そ してそれらは合計6種類の転写産物から生じていることが明らかとなった（図9） 。これらのうち３つは、Ｃ末端以外にSH3ドメインを有しているタンパク質をコ ードしており、これは本発明が、活性ドメインをタンパク質内のその位置に関わ らず同定するのに利用できることを示している。同定した６つのタンパク質のう ち、３つのみがGenBankに登録されているものと一致した。SH3P15およびSH3P16 はそれぞれ、SrcのSH3ドメインの選択性（Rickles，1994，EMBO J．13: 5598-56 04）と類似したリガンドの選択性のあるSH3ドメインを有する二つのSrcファミリ ーのメンバーである、Fyn（Kawakamiら、1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85 : 3870-3874）およびLyn（Yamanashiら、1987，Mol．Cell．Biol．7: 237-243） であり； そしてSH3P14は未知の機能のタンパク質であるマウスのH74のヒトホ モログであると思われる。残りの３つのタンパク質はGenBankに登録されている ものとは一致せず、上述したSH3P9、およびそれぞれ少なくとも４つおよび３つ のSH3ドメインからなる二つの関連性のある（85%アミノ酸の類似性）アダプター 様タンパク質の断片である、SH3P17およびSH3P18のヒトホモログを含んでいる。 本研究において同定されたSH3ドメインの一次配列を調べた結果、いくつかの 興味深い特徴が明らかになった（図10を参照のこと）。SrcのSH3ドメインによる リガンドの結合に重要な位置（Fengら、1994，Science 266: 1241-1247; Lescur eら、1992，J．Mol．Biol．228: 387-94）およびGrb2/Sem5においてSH3の機能に 不可欠な位置が保存されている（Clarkら、1992，Nature 356: 340-344）。さら に、図 10で示されている配列表における二つのギャップは、以前に特性を記述されたSH 3ドメインの間で見られる長さの変化した領域に相当している。驚いたことに、 本研究において同定されたSH3ドメインは、それぞれ100%および83%が同一である SH3P9およびSH3p14のマウス型およびヒト型のものを除いて、それらが他の既知 のSH3ドメインに似ている程には、お互いには大して似ていない。この結果は、S H3ドメインが一次構造上大きく変化に富んでいて、それでも選択的にプロリンに 富んだペプチド認識単位に結合することを示している。 6.1.1. cDNA発現ライブラリーから単離した遺伝子のヌクレオチド配列および それに相当するアミノ酸配列。 pSrcCIIおよびpCortペプチドでのマウス16日胚cDNAライブラリーのスクリーニ ングにより同定されたマウスの遺伝子、SH3P1、SH3P2、SH3P3、SH3P4、SH3P5、S H3P6、SH3P7、SH3P8、SH3P9、SH3P10、SH3P11、SH3P12、SH3P13、およびSH3P14 がそれぞれ図18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40、42AおよびB、44、 および46AおよびBに示されている。マウスの遺伝子、SH3P1、SH3P2、SH3P3、SH3 P4、SH3P5、SH3P6、SH3P7、SH3P8、SH3P9、SH3P10、SH3P11、SH3P12、SH3P13、 およびSH3P14に対応するアミノ酸配列が、それぞれ図19、21、23、25、27、29、 31、33、35、39、41、43、45、および47に示されている。 T12SRC.1ペプチドでのヒト骨髄およびヒト前立腺癌cDNA発現ライブラリーのス クリーニングにより同定されたヒトの遺伝子、SH3P9、SH3P14、SH3P17、およびS H3P18が、それぞれ図36、48、50、および52に示されている。ヒトの遺伝子、SH3 P9、SH3P14、SH3P17、およびSH3P18に対応するアミノ酸配列が、それぞれ図37、 49、51および53に示されている。 二つの遺伝子、SH3P9およびSH3P14はマウスおよびヒトのライブラリーの両方 から単離された。 SH3P15およびSH3P16の配列は示されていない。SH3P15はLynであり、SH3P16はF ynである。 図54は、第6.1節に記載されている方法、およびT12SRC.4およびpCort（第6.1 節に記載されている）の混合物を認識単位として用いることにより、ヒトの骨髄 cD NAライブラリー（第6.1節に記載されている）より同定し単離した新規のヒトの 遺伝子であるクローン55のヌクレオチド配列を示す。 図55はクローン55のアミノ酸配列を示す。 図56は第6.1節に記載されている方法、およびT12SRC.4およびpCort（第6.1節 に記載されている）の混合物を認識単位として用いることにより、ヒトの骨髄cD NAライブラリー（第6.1節に記載されている）より同定し単離した新規のヒトの 遺伝子であるクローン56のヌクレオチド配列を示す。 図57はクローン56のアミノ酸配列を示す。 図58Aは、第6.1節に記載されている方法、および認識単位としてP53BP2.Conお よびNck1.Con3の混合物を用いて、ヒトの骨髄cDNAライブラリー（第6.1節に記載 されている）から同定し単離した新規のヒトの遺伝子、クローン65の位置1-1720 由来のヌクレオチド配列を示し、図58Bはその位置1720-2873のヌクレオチド配列 を示す。P53BP2.ConおよびNck1.Con3はそれぞれ、そのアミノ酸配列がビオチン- SFAAPARPPVPPRKSRPGG-NH₂（配列番号201）およびビオチン-SFSFPPLPPAPGG-NH₂（ 配列番号202）であるペプチドである。P53BP2.ConおよびNck1.Con3は、それぞれ p53bp2およびNckのSH3ドメインに結合する認識単位の保存された配列である。 図59はクローン65のアミノ酸配列を示す。 図60は、第6.1節に記載されている方法、および認識単位としてT12SRC.1およ びT12SRC.4（第6.1節に記載されている）の混合物を用いて、ヒトの前立腺癌cDN Aライブラリー（第6.1節に記載されている）から同定し単離した新規のヒトの遺 伝子クローン34のヌクレオチド配列を示す。 図61Aおよび61Bはクローン34のアミノ酸配列を示す。 図62は、第6.1節に記載されている方法、および認識単位としてPXXP.NCK.S1/4 およびPXXP.ABL.G1/2Mの混合物を用いて、ヒトの骨髄cDNAライブラリー（第6.1 節に記載されている）から同定し単離した新規のヒトの遺伝子、クローン41のヌ クレオチド配列を示す。PXXP.NCK.S1/4およびPXXP.ABL.G1/2Mは、そのアミノ酸 配列がそれぞれビオチン-SRSLSEVSPKPPIRSVSLSR-NH₂（配列番号222）、およびビ オチン-SRPPRWSPPPVPLPTSLDSR-NH₂（配列番号223）であるペプチドである。PXXP .NCK.S 1/4およびPXXP.ABL.G1/2Mは、それぞれNckおよびAblのSH3ドメインに結合する。 図63Aおよび63Bはクローン41のアミノ酸配列を示す。 図64は第6.1節に記載されている方法、および認識単位としてPXXP.NCK.S1/4お よびPXXP.ABL.G1/2Mの混合物を用いて、ヒトの前立腺癌cDNAライブラリー（第6. 1節に記載されている）から同定し単離した新規のヒトの遺伝子、クローン53の ヌクレオチド配列を示す。 図65Aおよび65Bはクローン53のアミノ酸配列を示す。 図66Aおよび66Bは、第6.1節に記載されている方法、および認識単位としてT12 SRC.1およびT12SRC.4（第6.1節に記載されている）の混合物を用いて、HELA細胞 cDNAライブラリー（第6.1節に記載されている）から同定し単離した新規のヒト の遺伝子、クローン5のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。 6.2. SH3ドメイン結合配列に類似するペプチドの認識単位としての利用 我々は、多数の公表されたアミノ酸配列を調べ、保存されたSH3ドメイン結合 配列に類似したアミノ酸のプロリンに富んだ並びを同定した。これらのプロリン に富んだ配列を含むペプチドを合成し、本発明の方法により、第6.1および6.1.1 節に記載された新規のSH3ドメインに特異的に結合する能力を調べた。精製したS H3ドメインを含むクローンを、適当な時間増殖させたY1090宿主細胞のローンの 上にスポットし、プラークを付けて持ち上げたフィルターを、第6.1節に記載さ れているようにストレプトアビジン-アルカリホスファターゼと結合させたビオ チン化ペプチドでスクリーニングした。 結果は図12および13に示されている。見て分かるように、多くの場合、合成し たペプチドは新規のSH3ドメインに結合することができた。これは、それらの合 成ペプチドが、ポリペプチドの源からそれらの新規のSH3ドメインを同定するの に利用できることを示している。 6.3. ペプチド認識単位の結合価は認識単位の特異性に影響する 6.3.1 ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼとペプチド認識単位の事 前の結合により標的に対する認識単位の親和性が上昇する SH3ドメインを検出するためのプローブとして利用することにおいての認識単 位の能力に対する、ペプチド認識単位の結合価の影響の予備的な試験として、Sr cまたはAblのいずれかのSH3ドメインに結合することが以前に示されているビオ チン化ペプチドを、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（SA-AP）と事 前に結合させるか、または結合させないかのいずれかで、それぞれのSH3ドメイ ンへのそれらの結合する能力を検定した。GST-SrcSH3およびGST-AblSH3融合タン パク質（Sparksら、1994，J．Biol．Chem．269: 23853-23856、に記載されてい るようにして作られる）を、10% SDS-PAGEにより分離し、Immobilon Dナイロン メンブレン（Millipore，New Bedford，MA）に移した。メンブレンをブロッキン グ溶液中で1時間25℃でインキュベートし、続いて、ビオチン化したSrc SH3ドメ イン結合ペプチドまたはビオチン化したAbl SH3ドメイン結合ペプチドと共に、 多価（SA-AP）または単価のいずれかの形式で4℃で一終夜インキュベートした。 フィルターをPBS/Tで３回洗浄し（それぞれ15分の洗浄）、発色のためにNBTおよ びBCIPと共にインキュベートした。検出の工程のさらなる詳細は第6.1節を参照 のこと。 結果が図14に示されている。パネルAにおいては、ビオチン化ペプチドをSA-AP と予め結合させ、続いて固定したSH3ドメインに結合させるようにした。事前の 結合は第6.1節に記載されているようにして行った。パネルBにおいては、ペプチ ドを最初に固定したSH3ドメインに結合させるようにし、次に結合したペプチド をSA-APを加えて検出した。どちらの場合においても、発色は第6.1節のようにし て行った。使用したペプチドの配列は： Src特異的ペプチドとしてビオチン-SG SGGILAPPVPPRNTR（配列番号1）、およびAbl特異的ペプチドとしてビオチン-SGSG SRPPRWSPPPVPLPTSLDSR（配列番号41）であった。図14に示されている結果は、SA -APと予め結合させておくことにより、検出されるシグナルの強度が劇的に増加 することを証明している。 6.3.2 ペプチド認識単位とストレプトアビジン-アルカリ・ホスファターゼの事 前 の結合により、様々なSH3ドメインの認識が可能になる それぞれのGST-SH3ドメイン融合蛋白質の一群のうちの２μｇをImmobilon D ナイロンメンブレン（Millipore，New Bedford，MA）にドット・ブロット（装置 ）を用いて転写した。ビオチン化したSrc、Abl、またはコータクチンのSH3ドメ イン結合ペプチドを予めSA-APに結合させておき、フィルターとともにインキュ ベートした；アルカリ・ホスファターゼによって引き起こされる発色反応をペプ チドの結合の検出に用いた。固定した一面の蛋白質もまたポリクローナルの抗GS T抗体（Pharmacia，Piscataway，NJ）と反応させた。Src,Abl,およびコータクチ ン結合ペプチドの配列はそれぞれ、ビオチン-SGSGVLKRPLPIPPVTR(配列番号42)、 ビオチン-SGSGSRPPRWSPPPVPLPTSLDSR(配列番号41)、およびビオチン-SGSGSRLGEF SKPPIPQKPTWMSR（配列番号43）であった。 図15に示された結果からわかるように、予めビオチンと結合させたペプチドは 、本来の標的であるSH3ドメインのみならず、類似したドメインも同様に認識し た。SrcペプチドはSrcのSH3ドメインと同様にYesおよびコータクチンのSH3ドメ インも認識した；AblペプチドはAblのSH3ドメインと同様にコータクチンのSH3ド メインも認識した；そしてコータクチンペプチドはコータクチンのSH3ドメイン を認識するのと同様に、Src、Yes、Abl、Crk、およびGrb2のC末端のSH3ドメイン を認識した。 以上の実験は、ナイロンメンブレン上に固定したSH3ドメインを用いて行った 。以下の事柄は、ストレプトアビジンと事前に結合させた場合もまた、ペプチド 認識単位がマイクロタイタープレートのウェル内に固定されているならば、様々 なSH3ドメインを認識できることを示している。 ５種類のペプチド認識単位（pAbl、pPLC、pCrk、pSrcCI、pSrcCII）の７種類 のSH3ドメイン（Src、Abl、PLCγ、Crk、コータクチン、Grb2N、Grb2C）への結 合能を、多価形式、または単価の形式のいずれかで、ELISAにおいて検定した。 これらのペプチドの配列は以下の通りであった：pAbl、SGSGSRPPRWSPPPVPLPTSLD SR(配列番号41)；pPLC、SGSGSMPPPVPPRPPGTLGG（配列番号66）；pCrk、SGSGNYVN ALPPGPPLPAKNGG（配列番号67）；pSrcCI、SGSGVLKRPLPIPPVTR(配列番号42)；pSr cCII、SGSGGILAPPVPPRNTR（配列番号１）。これらのペプチドは第6.1節において 示した ようにしてビオチン化した。 SH3ドメインは、Sparksら、J．Biol．Chem．269:23853-23856，1994、に記載 されたようにして、GST-SH3融合タンパク質として生産した。その純度および濃 度はそれぞれSDS-PAGEおよびBradfordタンパク質分析法により確認した。GST-SH 3融合蛋白質は以下のようにしてマイクロタイタープレートのウェルに固定した ；それぞれのGST-SH3融合蛋白質２μｇを、平底の酵素結合免疫吸着剤分析（enz yme linked immunoabsorbent assay）（ELISA）マイクロタイタープレート（Cos tar、Cambridge、MA）のウェル内で、100mMのNaHCO₃中で、25℃で１時間インキ ュベートした。一単位量のSuperBlockブロッキング緩衝液（Pierce Chemical Co .，Rockford，IL）をそれぞれのウェルに加え、さらに30分間インキュベートし た。プレートをPBS/0.1% Tween-20/0.1% 仔牛血清アルブミン（BSA）をで３回洗 浄した。固定された蛋白質は、ストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシ ダーゼ（SA-HRP; Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）を用い、多価形式また は単価形式でSH3ドメインに結合するペプチドを用いて検出した。ビオチン化ペ プチドおよびSA-HRPの複合体の形成のための、ペプチドおよびSA-HRPの濃度は、 第6.1節においてSA-APの複合体形成について記載したものと同様であるが、全て のインキュベーションおよび洗浄はPBS / 0.1% Tween-20 / 0.1% BSA中で行った 。プレートは発色反応前、およびSA-HRP（単価形式）の添加前に５回洗浄した。 100μlのセイヨウワサビ ペルオキシダーゼ基質[2',2'-アジノ-ビス 3-エチルベ ンズチアゾリン-6-スルホン酸（ABTS）、0.05% 過酸化水素、50mM クエン酸ナト リウム、pH 5.0]を添加して、結合したSA-HRPの量を評価した。5-30分間の反応 時間の後、マイクロタイタープレートのウェルの光学濃度（OD）を、405 nm の 波長に合わせたマイクロタイタープレートスキャナー（Molecular Devices，Sun nyvale，CA）を用いて測定した。結果は図８に示されている。図８より、４価の （複合体化した）ペプチドは、標的のSH3に対して、親和性の増加および特異性 の広域化の両方を示すことがわかるであろう。しかしながら、複合体化したペプ チドの結合は依然としてSH3ドメインに限られていた；複合体はGSTにも（図８） 、他の関連のないタンパク質にも（データは示していない）結合しない。したが って、事前にSA-APと複合体を形成させることにより、ペプチド認識単位の特異 性は減少するが、ペプチ ドが非特異的になることはない。むしろ、事前に複合体を形成させておくと、ペ プチドはそれらの標的ドメインに加えて様々なSH3ドメインを認識する。 6.3.3 ペプチド認識単位とストレプトアビジン-アルカリ・ホスファターゼとの 事前の結合により、発現された様々なcDNAクローンの認識が可能になる 様々なSH3ドメインを含む遺伝子群のラムダファージクローンを、マウス16日 胚cDNA発現ライブラリー（Novagen，Madison，WI）のスクリーニングから単離し た。これらのcDNAクローンの単離の記載については第6.1節を参照のこと。一晩 培養したBL21（DE3）pLysE E.coli 100μlの培養液を含む3mlの2xYT-0.8%寒天を 注いでおいた、2xYT-1.5%寒天ペトリ皿の上に、個々のラムダファージcDNA組替 え体に対応するファージ粒子をスポットした。37℃で６時間培養した後、cDNA部 分の発現をIPTGに浸したニトロセルロースフィルターで誘導した。一終夜インキ ュベートした後、発現されたタンパク質をフィルターに転写し、続いてフィルタ ーをSA-APに予め結合させたビオチン化したSH3ドメイン結合ペプチドか、または T7-タグ融合ペプチドを認識するモノクローナル抗体（αT7.10Mab; Novagen、Ma dison、WI）のいずれかとともにインキュベートした。この抗体は、全てのクロ ーンで発現している抗原提示基（全てのλEXlox組替え体に共通しているφ10リ ーダー配列の一部）を認識するために、陽性の対照として用いた。pSrcI、pSrcI I、コータクチン、およびCaM（カルモジュリン結合）ペプチドの配列は、それぞ れ、ビオチン-SGSGVLKRPLPIPPVTR(配列番号42)、ビオチン-SGSGGILAPPVPPRNTR（ 配列番号１）、ビオチン-SGSGSRLGEFSKPPIPQKPTWMSR（配列番号43）、およびビ オチン-STVPRWIEDSLRGGAARAQTRLASAK（配列番号44）であった。 結果は図16に示されている。図16より、SA-APと事前に複合体を形成させるこ とによりペプチド認識単位の特異性は低下するが、ペプチドは非特異的にはなら ない；どのペプチドも２つの負の対照配列であるα-アクチニンおよびカルモジ ュリン（CaM）とは優位な形式では反応しない。むしろ、事前に複合体を形成さ せた場合には、ペプチドはそれらの標的ドメインを含むクローンに加えて、SH3 ドメインを含む様々なcDNAクローンを認識する。 6.4 cDNA クローンがコードするタンパク質の特徴付け 6.4.1 cDNAクローンがコードするタンパク質の生産 全ての陽性cDNAクローン（認識単位当たりおよそ18-20の陽性クローン）から 精製したDNAを、化学的に受容性のBL21細胞（Hanahanら、1983，J．Mol．Biol． 166:557-580、その完全な開示は本明細書中で参考文献に引用されている）の形 質転換に用いた。 100μg/mlのアンピシリンを含む2xYT寒天培地上で37℃で一終夜培養して現れ るコロニーを4mlの2xYT/amp培養液に植菌した。37℃で７時間振とう培養した後 、各培養液に、最終濃度100μMになるようにIPTGを加えた。さらに２時間培養し た後、各培養液から1mlを回収し、遠心して細胞を沈澱させた。細胞の沈澱物は4 00μlの1xSDS/DTTローディング緩衝液に懸濁し、100℃で5分間煮沸した。その結 果生じた細胞溶解物を、8%アクリルアミドゲルのドデシル硫酸ナトリウム-アク リルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にかけた。ゲルをクマシーで染色するか、 またはImmobilon Dメンブレン（Millipore）に転写しブロットした（Towbinら、 1979，Proc．Natl．Acad．Sci．76:4350-4354）。 6.5. 第6.1、6.2、6.3.1、6.3.2、6.3.3、および6.4.1節において使用した材料 ブロッキング溶液 Hepes（pH 8） 20 mM MgCl₂ 5 mM KCl 1 mM ジチオスレイトール 5 mM 粉ミルク 5 % w/v 2xＹT培地（1L） バクトトリプトン 16 g 酵母エキス 10 g NaCl 5 g 2ｘＹT寒天プレート 2ｘＹＴ+15 g 寒天/L 2ｘＹＴトップアガロース（8 %） 2ｘＹＴ+8 g アガロース/L SDS/DTT ローディング緩衝液 （10 mLの5x 溶液） .5M Tris base 0.61 g 8.5% SDS 0.85 g 27.5 % ショ糖 2.75 g 100 mM DTT 0.154 g .03 % ブロモフェノールブルー 3.0 mg 終夜細胞培養液 単離した適当な細胞型のコロニーを培地に植菌し、37℃で一終夜振とう培養す る ＢＬ21（ＤＥ3）ｐＬｙｓＥ 2ｘＹＴ 培地 マルトース 0.2% MgSO₄ 10 mM クロラムフェニコール 25 μg/mL ＢＭ25．8 2ｘＹＴ培地 マルトース 0.2% 硫酸マグネシウム 10 mM クロラムフェニコール 34 μg/mL カナマイシン 50 μg/mL 6.6 その他の機能的ドメインおよび認識単位 SH3ドメインについて先に記載したものと同様のやり方で本方法に用いるため に、興味深い他の機能的ドメインに対して標的化した認識単位を選ぶこともでき る。例えば、GSTの機能ドメインを研究するための認識単位として、以下のGST結 合ペプチドが多数のポリペプチド：クラス１ CWSEWDGNEC（配列番号46）、CGQW ADDGYC（配列番号47）、CEOWDGYGAC（配列番号48）、CWPFWDGSTC（配列番号49） 、CMIWPDGEEC（配列番号50）、CESOWDGYDC（配列番号51）、CQQWKEDGWC（配列番 号52）、またはCLYOWDGYEC（配列番号53）；クラスＩＩ- CMGDNLGDDC（配列番号 54）、CMGDSLGOSC（配列番号55）、CMDDDLGKGC（配列番号56）、CMGENLGWSC（配 列番号57）、またはCLGESLGWMC（配列番号58）、をスクリーニングするために利 用できる。 さらに、SH2ドメインを含むポリペプチドを同定するために、本発明の方法に 従って、以下のSH2結合ペプチド：GDGYEEISP（配列番号59）（Srk ファミリーに 対して）、GDGYDEPSP（配列番号60）（Nckに対して）、GDGYDHPSP（配列番号61 ）（Crkに対して）、GDGYVIPSP（配列番号62）（PLCγNに対して）、GDGYQNYSP （配列番号63）（PLCγCに対して）、GDGYMAMSP（配列番号64）（p85PI3KN およ び p85PI3KCに対して）、またはGDGQNYSP（配列番号65）（Grb2に対して）、を 利用することができる。本明細書中にその完全な開示が引用されている、Yang、 Cell 72: 767-778、を参照のこと。 さらに、本明細書中で参考文献にその完全な開示が引用されている、Mayerら 、Cell 73:629-630、による記載のように、″PH″機能ドメインを有するポリペ プチド（Vav、Bcr、Msos、PLCδ、Atk、またはプレクストリンに類似している） を、PH結合ペプチドを用いて単離することもできる。 他の合成的な、半合成的なまたは天然由来の分子を含む、他の認識単位が容易 に予想され得る。 本発明は本明細書中に記載されている特異的な態様の範囲に限られるべきでは ない。実際、本明細書中に記載されているものに加えて、発明のさまざまな修飾 が、前述の記載および付随する図から、当業者に明らかになるだろう。そのよう な修飾は、添付した請求項の範囲の中に含まれるように意図されている。さまざ まな出版物が本明細書中に引用されており、その開示は参考文献によりそのまま の状態で援用されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年４月１１日 【補正内容】 『図5は、ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼ（SA-AP）と結合した型 の、ビオチニル化したSH3結合ペプチド認識ユニットでプローブ探査した、λcDN Aライブラリーの一次（図5B）および三次（図5A）スクリーニングのフィルター を図示する。λEXlox中のマウスの16日胚cDNAライブラリーを、ビオチニル化pSr cCIIとSA-AP間で形成された多価複合体と共に保温した。ペプチド結合の部位は 、BCIP（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-リン酸-p-トルイジン塩）およびNBT （塩化ニトロブルー テトラゾリウム）とともに約5分間保温することによって検 出された。 図6Aおよび6Bは各々、様々な既知のSH3ドメイン間の最小一次配列相同性を示 すSH3ドメインの比較を示す。示したアミノ酸配列は、SEQ ID NO:68から111であ る。 図7Aは、円によって表される機能ドメインの集団の模式図である。「A」は一 つの円のみに特異的な認識ユニットである。一方Bは、3つのドメインを認識し、 B1およびB2は各々2つしか認識しない。図7Bは、新しい認識ユニットが最初の認 識ユニットに含まれないポリペプチドに基づいて選択される反復法を図示する。 これらの新しい認識ユニットは、他の関連するポリペプチド等の同定につながり 、さらに多岐に渡る関連する集団の構成分子の研究範囲を拡大させる。 図8A-8Jは、いくつかのSH3認識ユニットの結合特異性を図示する。ビオチニル 化されたクラスI（pSrcCI）またはクラスII（pSrcCII）Src SH3ドメイン認識ユ ニット、Crk SH3認識ユニット（pCrk）、PLCγ SH3ドメイン認識ユニット（pPLC ）、およびAbl SH3ドメイン認識ユニット（pAbl）が、2組のミクロタイタープレ ート上に固定した図に示すGST-SH3ドメイン融合タンパク質への結合に関して検 査された。認識ユニットは図の左側に示し、GST-SH3ドメイン融合タンパク質は 下辺に示 す。認識ユニットはビオチニル化ペプチドとストレプトアビジン-セイヨウワサ ビパーオキシダーゼ（SA-HRP）との多価複合体として（複合体）、または単価の ビオチニル化ペプチド（非複合体）として、保温した後にSA-HRPとともに保温し た。平均の光学濃度を示す。 図9は、本発明を用いて単離されたSH3ドメインを含むタンパク質の模式図であ る。各配列のクローン名、遺伝子名、スクリーニングの種類、個々の元のクロー ン数を示す。図は大きさに合わせてあり、SH3ドメインは約60アミノ酸である。 略語AR、P、CR、E/P、およびSH2はアンキリンリピート、プロリンに富む配列、 コルタクチンリピート、グルタミン酸/プロリンに富む配列、およびSrcホモロジ ー2ドメインを各々表す。末端は、各cDNAの予想される翻訳開始部位を示す。マ ウス、ヒト1、およびヒト2ライブラリーはそれぞれ、マウス16日胚、ヒト骨髄、 ヒト前立腺ガンcDNAライブラリーに対応する。pSrcIIおよびpCort認識ユニット については6.1.章参照。 図10A、10Bおよび10Cは、本発明を用いて単離されたタンパク質中のSH3ドメイ ンの配列の比較である。各クローンの名前と遺伝子名を示す。適切な場合、1つ のポリペプチドの複数のSH3ドメインをN末端からC末端に向かってA、B、C等と呼 ぶ。点は、類似の残基の並列が最大になるように導入されたギャップである。Sr cおよびGrb2/Sem5のSH3ドメイン中の、リガンドとの結合に関与することが示さ れた保存された残基（Tomasetto et al.,1995,Genomics 28:367-376）に対応す る位置は、それぞれ太字および下線で示す。SH3P1から8およびSH3P10から13の一 次構造はマウスに対応し、SH3P15から18、クローン5、34、40、41、45、53、55 、56、および65はヒトに、SH3P9およびSH3P14はマウス（m）またはヒト（h）cDN Aクローンに対応する。配列の比較のため、マウスc-Src SH3ドメインの配列（Ge nbank登録番号P41240）を示す。マウスのコルタクチン、SPY75/HS1、Crk、およ びヒトMLN50、Lyn、Fyn、およびSrcのGenbank登録番号はそれぞれ、U03184、D42 120、S72408、X82456、M16038、P06241およびP41240である。図10Aおよび10Bに 各々示したアミノ酸配列はSEQ ID NO:112から140である。図10Cに示したアミノ 酸配列は、各々S EQ ID NO:204-219である。 図11は、5.2.1章に記載する特異性連続体を示す。「SA-APペプチド複合体」は 、前述の章で記載するストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼとビオチニ ル化ペプチドの多価（恐らく4価）複合体を示す。 図12Aおよび12Bは、ペプチド認識ユニットが合成され、6.1および6.1.1章に記 載する新規SH3ドメインへの結合能を検査された実験の結果を示す。-は結合しな いことを、+は結合を、+の数は結合の強さを示す。詳細については6.2章参照。 示したアミノ酸配列は、各々SEQ ID NO:141から168である。 図13は、図12に示した実験のさらなるデータである。示したアミノ酸配列は、 SEQ ID NO:169から188である。 図14は、ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼと前もって結合させた 場合に、SH3ドメインに対するビオチニル化ペプチドの親和性に及ぼす効果を示 す。詳細は6.3.1章参照。 図15は、ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼと前もって結合させた 場合に、ナイロン膜上に固定したGST-SH3ドメイン融合タンパク質に対するビオ チニル化ペプチドの親和性に及ぼす効果を示す。詳細は6.3.2参照。 図16は、ストレプトアビジン-アルカリホスフォターゼと前もって結合させた 場合に、cDNAクローンによって発現されたSH3ドメインを含むタンパク質に対す るビオチニル化ペプチドの親和性に及ぼす効果を示す。詳細は6.3.3章参照。 図17は、網羅的に発現ライブラリーからSH3ドメインを含むタンパク質をスク リーニングするための戦略である。混成ペプチドライブラリーからGST融合タン パク質として細菌に発現させたSH3ドメインに対する結合分子をスクリーニング するこ とによって、ペプチド認識ユニットが産生される。このペプチドは次に、cDNA発 現ライブラリー中の一連のSH3ドメインを含むタンパク質をスクリーニングする ために、多価ストレプトアビジン-ビオチニル化ペプチド複合体として用いられ る。一次発現ライブラリースクリーニングで同定されたSH3ドメインの認識ユニ ットを同定するために、混成ライブラリーがもう一度用いられる。これらの認識 ユニットは重複する一群のタンパク質を発現ライブラリーから同定する。この過 程を何回も繰り返すことによって、与えられたcDNAライブラリー中の全てのSH3 ドメインを系統的にクローニングすることが可能である。 図18は、マウスp53bp2であるSH3P1のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:5）を示す 。 図19は、マウスp53bp2であるSH3P1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:6）を示す。 図20は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P2のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:7 ）を示す。 図21は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:8）を 示す。 図22は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P3のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:9 ）を示す。 図23は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P3のアミノ酸配列（SEQ ID NO:10） を示す。 図24は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P4のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1 1）を示す。 図25は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P4のアミノ酸配列（SEQ ID NO:12） を 示す。 図26Aは、マウスのコルタクチンであるSH3P5のヌクレオチド配列の1-1640位（ SEQ ID NO:13の一部）を示す。 図26Bは、マウスのコルタクチンであるSH3P5のヌクレオチド配列の1641-1867 位（SEQ ID NO:13の一部）を示す。 図27は、マウスのコルタクチンであるSH3P5のアミノ酸配列（SEQ ID NO:14） を示す。 図28は、マウスのMLN50であるSH3P6のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:15）を示 す。 図29は、マウスのMLN50であるSH3P6のアミノ酸配列（SEQ ID NO:16）を示す。 図30は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P7のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1 7）を示す。 図31は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P7のアミノ酸配列（SEQ ID NO:18） を示す。 図32は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P8のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1 9）を示す。 図33は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P8のアミノ酸配列（SEQ ID NO:20） を示す。 図34は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P9のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:2 1）を示す。 図35は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P9のアミノ酸配列（SEQ ID NO:22） を示す。 図36は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P9のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:23 ）を示す。 図37は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P9のアミノ酸配列（SEQ ID NO:24）を 示す。 図38は、マウスのHS1であるSH3P10のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:25）を示 す。 図39は、マウスのHS1であるSH3P10のアミノ酸配列（SEQ ID NO:26）を示す。 図40は、マウスのCrkであるSH3P11のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:27）を示 す。 図41は、マウスのCrkであるSH3P11のアミノ酸配列（SEQ ID NO:28）を示す。 図42Aは、マウスの新規の遺伝子であるSH3P12の1から2200の位置のヌクレオチ ド配列（SEQ ID NO:29の一部）を示す。 図42Bは、マウスの新規の遺伝子であるSH3P12の2201から3345の位置のヌクレ オチド配列（SEQ ID NO:29の一部）を示す。 図43は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P12のアミノ酸配列（SEQ ID NO:30） を示す。 図44は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P13のヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 31）を示す。 図45は、マウスの新規の遺伝子であるSH3P13のアミノ酸配列（SEQ ID NO:32） を示す。 図46Aは、マウスのH74であるSH3P14の1から2200の位置のヌクレオチド配列（S EQ ID NO:33の一部）を示す。 図46Bは、マウスのH74であるSH3P14の2201から4091の位置のヌクレオチド配列 （SEQ ID NO:33の一部）を示す。 図47は、マウスのH74であるSH3P14のアミノ酸配列（SEQ ID NO:34）を示す。 図48は、ヒトのH74であるSH3P14のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:35）を示す 。 図49は、ヒトのH74であるSH3P14のアミノ酸配列（SEQ ID NO:36）を示す。 図50は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P17のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:37 ）を示す。 図51は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P17のアミノ酸配列（SEQ ID NO:38）を 示す。 図52は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P18のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:39 ）を示す。 図53は、ヒトの新規の遺伝子であるSH3P18のアミノ酸配列（SEQ ID NO:40）を 示す。 図54は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン55のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:189）を示す。 図55は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン55のアミノ酸配列（SEQ ID NO:19 0）を示す。 図56は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン56のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:191）を示す。 図57は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン56のアミノ酸配列（SEQ ID NO:19 2）を示す。 図58Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン65の1から1720の位置のヌクレオ チド配列（SEQ ID NO:193の一部）を示す。 図58Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン65の1721から2873の位置のヌク レオチド配列（SEQ ID NO:193の一部）を示す。 図59は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン65のアミノ酸配列（SEQ ID NO:19 4）を示す。 図60は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン34のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:195）を示す。 図61Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン34のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:196の一部）を示す。 図61Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン34のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:196の一部）を示す。 図62は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン41のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:197）を示す。 図63Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン41のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:198の一部）を示す。 図63Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン41のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:198の一部）を示す。 図64は、ヒトの新規の遺伝子であるクローン53のヌクレオチド配列（SEQ ID N O:199）を示す。 図65Aは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン53のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:200の一部）を示す。 図65Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン53のアミノ酸配列の一部（SEQ I D NO:200の一部）を示す。 図66Aおよび66Bは、ヒトの新規の遺伝子であるクローン5のヌクレオチド配列 （SEQ ID NO:220）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:22）を示す。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 スパークス，アンドリュー・ビー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27510，カーボロ，ブルー・リッジ・ロー ド 201 (72)発明者 ホフマン，ノア アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27410，グリーンスボロ，マンニング・ド ライブ 5001 (72)発明者 カイ，ブライアン・ケイ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，ワイステリア・ ウェイ 18 (72)発明者 フォルクス，ダナ・エム アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27516，チャペル・ヒル，ダマスカス・チ ャーチ・ドライブ 2013 (72)発明者 マコーネル，スティーブン・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92126, サン・ディエゴ，カミノ・ルイツ 10211, ナンバー 52

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 目的とする機能領域を含んだポリペプチドを同定する方法で、以下を含む もの： (a) 多価の認識単位複合体と複数のポリペプチドを接触させること；および (b) 上述の認識単位複合体に対する選択的な結合親和性を有するポリペプチド を同定すること。 ２． 請求項１の方法で、上述の複数のポリペプチドが、ポリペプチド発現ライ ブラリーからなるもの。 ３． 請求項１の方法で、上述の複数のポリペプチドが、ウイルスから取得され るもの。 ４． 請求項２の方法で、上述の発現ライブラリーがcDNA発現ライブラリーであ るもの。 ５． 請求項２の方法で、上述の発現ライブラリーがゲノムDNAライブラリーであ るもの。 ６． 請求項２の方法で、上述の発現ライブラリーが組換えバクテリオファージ ライブラリーであるもの。 ７． 請求項６の方法で、上述の組換えバクテリオファージライブラリーが組換 えM13ライブラリーであるもの。 ８． 請求項２の方法で、上述の発現ライブラリーが組換えプラスミドまたはコ スミドライブラリーであるもの。 ９． 請求項１の方法で、認識単位がペプチドであるもの。 10． 請求項１の方法で、上述の認識単位が約140アミノ酸残基未満を有するペプ チドであるもの。 11． 請求項１の方法で、上述の認識単位が約100アミノ酸残基未満を有するペプ チドであるもの。 12． 請求項１の方法で、上述の認識単位が約70アミノ酸残基未満を有するペプ チドであるもの。 13． 請求項１の方法で、上述の認識単位が約６から60アミノ酸残基を有するペ プ チドであるもの。 14． 請求項１の方法で、上述の認識単位が20から50アミノ酸残基を有するペプ チドであるもの。 15． 請求項１の方法で、複合体における認識単位の価数が少なくとも２価であ るもの。 16． 請求項９の方法で、複合体における認識単位の価数が少なくとも２価であ るもの。 17． 請求項１の方法で、複合体における認識単位の価数が少なくとも４価であ るもの。 18． 請求項９の方法で、複合体における認識単位の価数が少なくとも４価であ るもの。 19． 請求項17の方法で、認識単位複合体が、(a)アビジンまたはストレプタビジ ン、および(b)ビオチン化された認識単位を含むもの。 20． 請求項18の方法で、認識単位複合体が、(a)アビジンまたはストレプタビジ ン、および(b)ビオチン化された認識単位を含むもの。 21． 請求項２の方法で、上述の同定段階が陽性クローンの選別を含むもの。陽 性クローンは、上述の認識単位に対して選択的親和性を有し、目的の機能領域ま たはそれと機能的に同等な領域を含むようなポリペプチドをコードするDNA構築 を有する。 22． 請求項21の方法で、上述のDNA構造のコーディング配列の決定をさらに含む もの。 23． 請求項22の方法で、上述のコーディング配列からのアミノ酸配列の予測を さらに含むもの。 24． 請求項１の方法で、上述の接触段階として、上述の認識単位複合体を固相 支持体に固定すること、および上述の複数のポリペプチドを含む溶液を上述の固 定した認識単位複合体と接触させることを含むもの。 25． 請求項１の方法で、上述の接触段階として、上述の複数のポリペプチドを 分離すること、および上述の認識単位複合体を上述の分離したポリペプチドと接 触させることを含むもの。 26． 請求項１の方法で、上述の同定段階として、上述の複数のポリペプチドの 中から上述の認識単位に対して選択的親和性を有するようなものを選別すること 、および上述のポリペプチドのアミノ酸配列を決定することを含むもの。 27． 請求項１の方法で、上述の複数のポリペプチドが、固相支持体に固定され ているもの。 28． 請求項27の方法で、上述の接触段階として、上述の固相支持体と上述の認 識単位複合体を含んだ溶液とを接触させることを含むもの。 29． 請求項28の方法で、結合しなかった認識単位複合体を洗い落とすことをさ らに含むもの。 30． 請求項29の方法で、上述の固相支持体に結合している認識単位複合体の検 出をさらに含むもの。 31． 請求項１の方法で、上述の選択的な結合親和性が約１nMから１mMのオーダ ーにあるもの。 32． 請求項１の方法で、上述の選択的な結合親和性が約10nMからI00μMのオー ダーにあるもの。 33． 請求項１の方法で、上述の選択的な結合親和性が約100nMから10μMのオー ダーにあるもの。 34． 請求項１の方法で、上述の選択的な結合親和性が約100nMから１μMのオー ダーにあるもの。 35． 請求項９の方法で、上述のペプチドが、無作為のペプチドライブラリーか ら選別されるもの。 36． 目的とする機能領域を含んだポリペプチドを同定する方法で、以下を含む もの： (a) 多価の認識単位複合体で(i)アビジンまたはストレプタビジン、および(ii) ビオチン化された認識単位を含み、認識単位が６から60の範囲のアミノ酸残基を 有するペプチドであるようなものと、cDNA発現ライブラリー由来の複数のポリペ プチドを接触させること；および (b) 上述の認識単位複合体に対して、選択的な結合親和性を有するポリペプチ ドを同定すること。 37． 請求項４または36の方法で、cDNA発現ライブラリーがヒトcDNA発現ライブ ラリーあるもの。 38． 請求項36の方法で、すでにペプチドが同定されていて、その同定方法とし ては無作為のペプチドライブラリーをスクリーニングして、目的の機能領域また はそれと機能的に同等の領域と選択的な結合親和性を有するペプチドを同定する ことを含むもの。 39． 請求項36の方法で、目的とする機能領域が、SH1、SH2、SH3、PH、PTB、LIM 、アルマジロ、Notch/アンキリンリピート、ジンクフィンガー、ロイシンジッパ ー、ヘリックスターンヘリックスを含むグループから選別された領域であるもの 。 40． 請求項１の方法で、目的とする機能領域が、SH1、SH2、SH3、PH、PTB、LIM 、アルマジロ、Notch/アンキリンリピート、ジンクフィンガー、ロイシンジッパ ー、ヘリックスターンヘリックスを含むグループから選別された領域であるもの 。 41． 請求項１、37、38の方法で、目的とする機能領域が、SH3領域であるもの。 42． 目的とするSH3領域を含んだポリペプチドを同定する方法で、以下を含むも の： (a) 多価の認識単位複合体で(i)アビジンまたはストレプタビジン、および(ii) ビオチン化された認識単位を含み、認識単位が６から60の範囲のアミノ酸残基を 有するペプチドで選択的にSH3領域と結合するようなものと、cDNA発現ライブラ リー由来の複数のポリペプチドを接触させること；および (b) 上述の認識単位複合体に対して選択的な結合親和性を有するポリペプチド を同定すること。 43． 請求項１の方法で、目的とする機能領域が触媒部位を含むもの。 44． 請求項43の方法で、上述の触媒部位がグルタチオンS-トランスフェラーゼ に見い出される触媒部位に相当するもの。 45． 目的とする機能領域、またはそれと機能的に同等の領域を含んだポリペプ チドを同定する方法で、以下を含むもの： (a)無作為のペプチドライブラリーをスクリーニングして、目的の機能領域また はそれと機能的に同等の領域と選択的な結合親和性を有するペプチドを同定する こと；および (b)cDNAまたはゲノム発現ライブラリーを上述のペプチドまたはその結合部分で スクリーニングして、上述のペプチドに選択的に結合するポリペプチドを同定す ること。 46． 請求項45の方法で、スクリーニング段階(b)が、多価のペプチド複合体中の 上述のペプチドを用いて遂行されるもの。 47． 請求項46の方法で、スクリーニング段階(b)が、ストレプタビジンおよびビ オチン化されたペプチドを含んだ複合体中の上述のペプチドを用いて遂行される もの。 48． 請求項46の方法で、スクリーニング段階(b)が、多重抗原ペプチド(MAP)の 形をとった上述のペプチドを用いて遂行されるもの。 49． 請求項46の方法で、スクリーニング段階(b)が、上述のウシ血清アルブミン またはスカシガイ（keyhole limpet）ヘモシアニンと架橋されたペプチドを用い て遂行されるもの。 50． 目的とする機能領域、またはそれと機能的に同等の領域を含んだポリペプ チドを同定する方法で、以下を含むもの： (a)無作為のペプチドライブラリーをスクリーニングして、目的の機能領域に選 択的に結合する複数のペプチドを同定すること； (b)上述のペプチドの少なくとも一部のアミノ酸配列を決定すること； (c)上述のペプチドの決定したアミノ酸配列に基づいて、共通の配列を決定する こと；および (d)cDNAまたはゲノム発現ライブラリーを、共通の配列を含んだペプチドでスク リーニングし、上述のペプチドに選択的に結合するポリペプチドを同定すること 。 51． 請求項50の方法で、スクリーニング段階(d)が、多価のペプチド複合体中の 上述のペプチドを用いて遂行されるもの。 52． 目的とする機能領域、またはそれと機能的に同等の領域を含んだポリペプ チドを同定する方法で、以下を含むもの： (a)無作為のペプチドライブラリーをスクリーニングして、目的の機能領域に選 択的に結合する１個目のペプチドを同定すること； (b)上述の１個目のペプチドの少なくとも一部のアミノ酸配列を決定すること； (c)自然に存在して発現されている複数のタンパク質のアミノ酸配列を含んだデ ータベースを検索して、上述の１個目のペプチドのアミノ酸配列に相同性がある アミノ酸配列を含むタンパク質を同定すること；および (d)cDNAまたはゲノム発現ライブラリーを、上述の１個目のアミノ酸配列と相同 性のある上述のタンパク質の配列を含むような２個目のペプチドでスクリーニン グすること。 53． １個またはそれ以上の容器中に以下の成分を含んだ検定キット： (a)目的の機能領域を含むような精製したポリペプチドで、その機能領域が、SH1 、SH2、SH3、PH、PTB、LIM、アルマジロ、Notch/アンキリンリピート、ジンクフ ィンガー、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックスを含むグループから 選別された領域であるようなもの；および (b)精製された認識単位で、上述のポリペプチドの上述の機能領域に対し、選択 的な結合親和性を有するもの。 54． 請求項53の検定キットで、上述のポリペプチドが、配列番号：8，10，12， 18，20，22，24，30，32，38，40，190，192，194，196，198，200，および221 からなるグループから選別されるアミノ酸配列を含むもの。 55． 請求項53の検定キットで、上述のポリペプチドが、配列番号：113-115，11 8-121，125-128，133-139，204-218，および219からなるグループから選別され るアミノ酸配列を含むもの。 56． 請求項53の検定キットで、上述の認識単位がペプチドであるもの。 57． 請求項53の検定キットで、上述のポリペプチドまたは認識単位が標識され ているもの。 58． 請求項57の検定キットで、上述のポリペプチドまたは認識単位が酵素で標 識されているもの 59． 請求項57の検定キットで、上述のポリペプチドまたは認識単位がエピトー プで標識されているもの。 60． 請求項57の検定キットで、上述のポペプチドまたは認識単位が発色団で標 識されているもの。 61． 請求項57の検定キットで、上述のポリペプチドまたは認識単位がビオチン で 標識されているもの。 62． 請求項53の検定キットで、上述のポリペプチドまたは認識単位が固相支持 体上に固定されているもの。 63． 複数の容器に以下の成分が含まれている検定キット： (a)精製された複数のポリペプチドで、それぞれのポリペプチドが分離された容 器に納められ、それぞれのポリペプチドが目的とする機能領域を含み、目的とす る機能領域が、SH1、SH2、SH3、PH、PTB、LTM、アルマジロ、Notch/アンキリン リピート、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス を含むグループから選別された領域であるようなもの；および (b)少なくとも１個の認識単位で、上述の複数のポリペプチドのそれぞれの上述 の機能領域に対して、選択的な結合親和性を有するもの。 64． １個または２個以上の容器に、以下の成分を含んだ検定キット： (a)複数の精製されたポリペプチドで、それぞれのポリペプチドが分離された容 器に納められ、それぞれのポリペプチドがSH3領域を含んだもの；および (b)上述の複数のポリペプチドのそれぞれのSH3領域に対して、選択的な結合親和 性を有するような、少なくとも１個のペプチド。 65． 目的とする機能領域を含むような、精製された複数のポリペプチドを含む キットで、それぞれのポリペプチドが分離された容器に納められ、それぞれのポ リペプチドが異なる配列の機能領域を有するが、同じ結合特異性を示しうるもの 。 66． 請求項65の検定キットで、ポリペプチドが、配列番号：8，10，12，18，20 ，22，24，30，32，38，40，190，192，194，196，198，200，および221からな るグループから選別されるアミノ酸配列を含むもの。。 67． 請求項65のキットで、機能領域がSH3領域であるもの。 68． 請求項65の検定キットで、機能領域が上述のポリペプチドが、配列番号：8 ，10，12，18，20，22，24，30，32，38，40，190，192，194，196，198，200， および221からなるグループから選別されるアミノ酸配列を有するポリペプチド に由来するSH3領域であるもの。 69． 可能性のある薬剤候補をスクリーニングする方法で、以下を含むもの： (a)目的の機能領域を含む少なくとも１個のポリペプチドを、上述のポリペプチ ド の上述の機能領域に対して選択的な親和性を有するような少なくとも１個の認識 単位と、可能性のある適量の薬剤候補の存在下で接触させること。ここで上述の ポリペプチドと上述の認識単位は、上述の薬剤候補の非存在下でお互いに接触さ せたときに相互作用することが可能であり、目的とする機能領域は、SH1、SH2、 SH3、PH、PTB、LIM、アルマジロ、Notch/アンキリンリピート、ジンクフィンガ ー、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックスを含むグループから選別さ れた領域である；および (b)上述のポリペプチドと上述の認識単位との相互作用に対し、上述の適量の薬 剤候補の存在の効果があれば、それを決定すること。 70． 請求項69の方法で、多重の異なるポリペプチド認識単位の対について薬剤 候補の効果を決定するもの。ここで少なくともいくつかの上述のポリペプチドが 有する機能領域は、上述のポリペプチドの他のものの機能領域と、配列は異なる が同じ結合特異性を示しうる。 71． 請求項69の方法で、上述の少なくとも１個のポリペプチドまたは認識単位 の少なくとも一つが、それぞれ共通の機能領域および共通の認識単位を含んでい るもの。 72． 請求項69の方法で、ポリペプチドが請求項１の方法で同定されたポリペプ チドであるもの。 73． 請求項69の方法で、薬剤候補がポリペプチド認識単位の相互作用の阻害剤 であり、その存在下で認識単位に対するポリペプチドの結合の低下を検出するこ とで同定されるような阻害剤であるもの。 74． SH3領域を含む精製されたポリペプチドで、上述のSH3領域が、配列番号： １13-115，118-121，125-128，133-139，204-218，および219からなるグループ から選別されるアミノ酸配列を有するもの。 75． SH3領域を含む精製されたポリペプチドで、上述のポリペプチドが、配列番 号：8，10，12，18，20，22，24，30，32，38，40，190，192，194，196，198， 200，および221からなるグループから選別されるアミノ酸配列を有するもの。 76． SH3領域をコードする精製されたDNAで、上述のDNAが、配列番号：7，9，11 ，17，19，21，23，29，31，37，39，189，191，193，195，197，199，および22 0 からなるグループから選別される配列を有するもの。 77． 精製されたDNAで、配列番号：8，10，12，18，20，22，24，30，32，38，4 0，190，192，194，196，198，200，および221からなるグループから選別される アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするもの。 78． 精製されたDNAで、配列番号：113-115，118-121，125-128，133-139，204- 218，および219からなるグループから選別されるアミノ酸配列を含むポリペプチ ドをコードするもの。 79． ポリペプチドのSH3領域を含む精製した分子で、配列番号：8，10，12，18 ，20，22，24，30，32，38，40，190，192，194，196，198，200，および221か らなるグループから選別されるアミノ酸配列を有するもの。 80． 融合タンパク質で、(a)配列番号：8，10，12，18，20，22，24，30，32，3 8，40，190，192，194，196，198，200，または221のアミノ酸配列を有するポリ ペプチドのSH3領域を含むアミノ酸配列が、ペプチド結合を介して(b)異なるポリ ペプチド由来の少なくとも６アミノ酸のアミノ酸配列に連結されたものを含むも の。 81． 精製されたDNAで、請求項80の融合タンパク質をコードするもの。 82． 核酸ベクターで、請求項81のDNAを含むもの。 83． 核酸ベクターで、請求項76のDNAを含むもの。 84． 核酸ベクターで、請求項78のDNAを含むもの。 85． 組換え体細胞で、請求項82、83、または84の核酸ベクターを含むもの。 86． 精製された核酸で、配列番号：7，9，11，17，19，21，23，29，31，37，3 9，189，191，193，195，197，199，および220からなるグループから選別される 配列を有する核酸と、ハイブリッド形成可能なもの。 87． 請求項80の融合タンパク質を作製する方法で、上述の融合タンパク質をコ ードする核酸ベクターを含む組換え体細胞を培養し、上述の融合タンパク質が発 現されるようにして、発現された融合タンパク質を回収することを含むもの。 88． 請求項74のポリペプチドを作製する方法で、上述のポリペプチドをコード する核酸ベクターを含む組換え体細胞を培養し、上述のポリペプチドが発現され るようにして、発現されたポリペプチドを回収することを含むもの。 89． 請求項69の方法で、上述のポリペプチドが、以下を含む方法により作製さ れたSH3領域を含んだポリペプチドであるもの： (i)ペプチドライブラリーをSH3領域でスクリーニングして、SH3領域に結合する １個または２個以上のペプチドを取得すること； (ii)段階(i)で得られたペプチドの一つを用いて、ポリペプチドの供給源をスク リーニングし、SH3領域を含む１個または２個以上のポリペプチドを同定するこ と； (iii)段階(ii)で同定されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定すること；およ び (iv)SH3領域を含むような１個または２個以上の新規のポリペプチドを作製する こと。 90． 請求項69の方法で、上述のポリペプチドが、以下を含む方法により作製さ れたSH3領域を含んだポリペプチドであるもの： (i)ペプチドライブラリーをSH3領域でスクリーニングして、SH3領域に結合する 複数のペプチドを取得すること； (ii)段階(i)で取得されたペプチドの共通配列を決定すること； (iii)共通配列からなる一つのペプチドを作製すること； (iv)共通配列からなるペプチドを用いて、ポリペプチドの供給源をスクリーニン グし、SH3領域を含む１個または２個以上のポリペプチドを同定すること； (v)段階(iv)で同定されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定すること；および (vi)SH3領域を含むような１個または２個以上の新規のポリペプチドを作製する こと。 91． ある分子の潜在的な薬剤活性を決定する方法で、以下を含むもの： (a) 結合を促進するような条件下で、この分子を機能領域を含む化合物と接触 させること； (b) このとき生じる特異的な結合を検出または測定すること；および (c) 異なる配列であるが同じ結合活性を示しうるような機能領域を含む複数の 異なる化合物について、段階(a)および(b)を繰り返すこと。 92． 請求項91の方法で、機能領域がSH3領域であるもの。 93． 請求項92の方法で、化合物が Src、Ab1 コータクチン、ホスホリパーゼC γ、Nck、Crk、p53bp2、アンフィフィジン、Grb2、RasGap、またはホスファチジ ルイノシトール３’キナーゼのSH3領域を含むもの。 94． 機能領域に選択的に結合する認識単位に対して、機能領域を含む分子が結 合する際に影響を与える化合物を同定する方法で、以下を含むもの： (a)機能領域を含む分子と認識単位を、候補となる化合物の存在下で、結合を促 進する条件下で接触させること、およびこの分子と認識単位の結合量を測定する こと。ここで目的とする機能領域は、SH1、SH2、SH3、PH、PTB、LIM、アルマジ ロ、Notch/アンキリンリピート、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ヘリッ クスターンヘリックスを含むグループから選別された領域である； (b)段階(a)における結合量を、候補となる化合物の非存在下でこの分子と認識単 位との間で起こることがすでに知られている、または決定される結合量と比較す ること。ここで段階(a)と、候補となる化合物の非存在下でこの分子と認識単位 との間で起こることがすでに知られている、または決定される結合量との間の結 合量の違いは、候補となる化合物が、機能領域を含む分子と認識単位との結合に 影響を与える化合物であることを示す。 95． 請求項94の方法で、機能領域がSH3領域であるもの。 96． 請求項20の方法で、認識単位複合体が(a)アルカリホスファターゼに共役し たストレプタビジン；および(b)ビオチン化されたペプチドを含んだ複合体であ るもの。 97． 目的とする機能領域を含むポリペプチドを同定する方法で、以下を含むも の： (a)140アミノ酸またはそれ未満のアミノ酸を有するペプチドである認識単位を、 複数のポリペプチドと接触させること；および (b)上述の認識単位複合体に対して選択的な親和性を有するポリペプチドを同定 すること。 98． 配列番号：113-115，118-121，125-128，133-139，204-218，および219か らなるグループから選別されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体。 99． 配列番号：8，10，12，18，20，22，24，30，32，38，40，190，192，194 ，196，198，200，および221からなるグループから選別されるアミノ酸配列を含 むポリペプチドに対する抗体。 100． 請求項86の精製された核酸で、機能領域を含んだポリペプチドをコードす るヒトの核酸であるもの。 101． ヒトcDNAまたはゲノム配列を含む、１個目の核酸でコードされるような精 製されたタンパク質。この核酸は、配列番号：7，9，11，17，19，21，29，およ び31からなるグループから選別された配列を有する２個目の核酸とハイブリッド 形成できる。 102． 請求項53の検定キットで、上述のポリペプチドが配列番号6，14，16，26 ，28，34，36，112，116，117，122-124，129-132，および140からなるグループ から選別されたアミノ酸配列を含むもの。