【発明の詳細な説明】
細胞培養方法
本発明は細胞培養方法に関するものであり、特に実質的に均質な細胞集団（例
えばニューロン細胞）をインビトロで生産するための細胞培養方法に関するもの
である。また、本発明は、神経細胞（例えばヒト神経細胞）の中に選択可能なマ
ーカー（例えば、陽性および／または陰性の選択可能なマーカー）を導入した神
経細胞に関するものである。
中枢神経系は、現在集中的な研究の対象であるが、その細胞レベルでの膨大な
複雑さが、その機能の十分な理解を阻むように働いてきた。生体外で神経細胞の
特定の副集団を選択的に標識する方法が多数開発されてきたが（例えば免疫染色
、インシチュハイブリダイゼーション、組織化学等）、生体細胞のような副集団
を分離し、精製することには、非常な困難があった。
この問題を解決するために、種々の解決法が採用されてきた。例えば、微分遠
心分離のような技術を採用することによって、特定の神経細胞の表現型を強化し
ていた。他の方法は、蛍光性の細胞型特異的な基質を使用して細胞の副集団を標
識することに基づいているか、あるいは蛍光性のトレーサー染料を使用して、所
定の組のニューロンの特異的な終結領域中に注射することに基づいている（シェ
フナー等、１９８７年、「J．Neuroscience」７ :3088)。いずれの場合において
も、標識されていない細胞からの標識細胞の分離は、蛍光活性化細胞選別法（Ｆ
ＡＣＳ）による。
他の方法は、所定の細胞型に対して特異的な細胞外膜結合マーカーの同定に基
づいている（ウラカミ及びチウ、１９９０年、「J．Neuroscience」１０：６２
０）。ここで、この例における分離を実行するには、混合された細胞集団を接合
抗体層についてパンニング
し、細胞抗体複合体を生成させ、これから目的とする細胞を後で分離し、更なる
研究に供することができる。
他の既知の方法によれば、特定の細胞集団をもたらす先祖細胞を、発癌遺伝子
の形質導入によって、または自然細胞発芽後成長の継代培養によって不死化させ
る。
おそらく前駆体細胞の不死化技術という例外はあるが、これらの技術のほとん
どは、広範な応用を獲得してこなかった。これは部分的には中枢神経系中で表現
型に多大な不均質性があるために、採用するマーカーと分離技術とが、不所望の
細胞型との交差反応を避けるために極度に特異的でなければならないからである
。
第二に、均質性を得るために必要な精製の度合いは、しばしば２以上のオーダ
ーの大きさであり、このような強化はＦＡＣＳやパンニングには大きすぎ、その
結果は汚染の度合いとなる。
第三に、十分に豊富で、しかも十分に特異的な細胞外マーカーであって、良く
特徴付けられた神経細胞集団（例えば、ドーパミン作用性細胞やグルタミン酸作
用性細胞）に対しても共通な細胞外マーカーの入手可能性は限られている。
更に、これらの既知の強化技術のほとんどは、処理の間に神経細胞が破壊する
のを防止するために、比較的に未熟な神経細胞を必要とする。
最後に、適当な量の新鮮なヒトの脳組織を得ることが困難であるために、これ
らの考慮はヒト神経細胞に対しては更に一層制限的となる。
本発明は、予め選択された細胞副集団を、不均質集団からインビトロで選択的
に培養するための方法を提供し、（ａ）選択可能なマーカー（例えば陽性および
／または陰性の選択可能なマーカー）を不均質細胞集団中へと導入し、このマー
カーを前記の予め選択され
た副集団中の特異的な形質発現／活性に供する工程；および（ｂ）この予め選択
された副集団を、その中における前記選択可能なマーカーの特異的な形質発現／
活性に基づいて選択的に培養する工程を具えている。
予め選択された細胞の副集団は、特定の細胞型または細胞クラスの実質的に均
質な細胞集団であってよい。例えば、この予め選択された副集団は、特定のクラ
スの神経細胞であってよい。神経細胞の場合には、予め選択された集団は、伝達
物質の特性に基づいて選択することができ、例えばドーパミンまたはアセチルコ
リンを含有するニューロンを、本発明の方法に従って選択的に培養できる。
選択可能なマーカーは、不均質細胞集団を構成するすべての細胞の中へと導入
する必要はなく、ほとんどの目的に対して、細胞の相当部分が選択可能なマーカ
ーを受容していれば十分である。
しかし、好ましくは、選択可能なマーカーを、不均質の細胞集団の大部分（例
えば実質的にすべて）の中へと導入する。
ここで説明したように、本発明の方法は、特定のクラスの実質的に正常な神経
細胞の選択的な培養に特に応用できる。しかし、本発明の方法は、一般的な用途
のものであり、他の細胞副集団を選択的に培養するために使用できる。
哺乳類の神経細胞に不均質遺伝物質を形質導入できることは、本技術分野にお
いて知られている。真核生物および他の細胞を形質導入する多くの方法が存在し
ているが、神経細胞の特徴から、自然なトランスフェクション法が最も有用なよ
うになっている（ミラー、１９９２年「ネイチャー」３５７：４５５）。従って
、例えば、ウイルスにパッケージされた遺伝物質を用いた形質導入は、例えばリ
ン酸ウルシウム沈殿、エレクトロポレーション、顕微投影衝撃または顕微注射よ
りも一層有効であるだけでなく、実際のプロセスの間
の神経細胞の死亡率をどいっそう低くする。中枢神経系からの哺乳類神経細胞の
形質導入は、インビボ（カルバー等、１９９２年「サイエンス」２５６：１５５
０）およびインビトロ（ストリンガーおよびフォスター、１９９４年「Brain Re
s」79:267）の双方が記載されている。
生細胞中へと導入できる遺伝物質には、陽性および陰性の双方の選択可能なマ
ーカーを含ませることができる。陽性の選択可能なマーカーは、この選択可能な
表現型を形質発現しない細胞を殺しうる環境下で、形質導入された細胞の生存を
可能とするマーカーである。
陰性の選択可能なマーカーは、それを形質発現する細胞に対して、他の細胞に対
して比較的に無害な環境下で細胞が破壊されるように、感受性を付与する。
広範な選択可能なマーカーを入手できる。陽性の選択可能なマーカーとして広
く応用されている遺伝子には、細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ne
o:コルベール- ガラピン等(Colbere-Garapin et al)「J．Mol．Biol．」 1981
年150:1)、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hph;サンテール等( San
terre et al)1984年「Gene」30:147）およびキサンチングアニン ホスホリボシ
ル トランスフェラーゼ(gpt; マリガンおよびベルグ(Mulligan and Berg)1981
年 「Proc．Natl. Acad．Sci．USA」78:2072)がある。
また、陽性の選択可能なマーカーとして使用されるのは、単純ヘルペスウイル
ス１型チミジンキナーゼ（HSV-1 TK;ウイグラー等(Wigler et al)1977年、「Cel
l」11;223）、アデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ARPT:ウイグラー
等(Wigler et al)1979年、「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」76;1373)およびハイ
ポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT;ジョリー等(Jolly et
al)1983年「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」である。これらの後者
のマーカー類は、特定の変異型遺伝子型（即ち、選択が基づいている遺伝子産物
に欠損をもたらす遺伝子型）を有する細胞中で使用しなければならない。
好ましい陰性の選択可能なマーカーには、プログラムされた細胞死（アポトー
シス）に関与する産物を暗号化する遺伝子、例えばｐ５３用の遺伝子が含まれる
。こうした陰性の選択可能なマーカーは、問題の遺伝子の形質発現を引き起こす
ことによって（例えば、後述するように、テトラサイクリン応答性のプロモータ
ーを使用することによって）活性化することができる。アポトーシスに関与する
産物を暗号化する遺伝子を使用することによる利点は、遺伝子が一時的に形質発
現することで（多くの場合に３０分間またはそれ以下で）、細胞を死に至らしめ
るのに十分であり得ることであり、信頼できる極めて厳格な陰性の選択が可能と
なる。
また、前述した遺伝子の幾つかは、陽性と共に陰性の選択可能な表現型をもた
らす。これらには、HSV-1、APRT、HPRTおよびgpt遺伝子が挙げられる。これらの
遺伝子が暗号化する酵素は、特定のヌクレオシドまたはプリン相同体を細胞毒性
の中間体へと変換するのを触媒することができる。例えば、ヌクレオシド相同体
であるガンシクロヴィール (ganciclovir:GCV)は、HSV-1チミジンキナーゼに対
しては良好な基質であるが、咄乳類細胞中に見られる天然チミジンキナーゼに対
しては貧弱な基質でしかない。この結果、GCV は、このHSV-1 TK遺伝子[ セント
クレア等(St．C1air et al )1987、「Antimicrob．Agents Chemotherap．」31
:844］を形質発現する細胞に対して、有効な陰性の選択をするのに使用できる。
キサンチングアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼは、野性型細胞［
べスナール等(Besnard et al)1987 年「Mol．cell．Biol.」7:4139］中で形質発
現したときには、陽性の選択と陰性の選択との双方
に対して使用できる。シトシンデアミナーゼも、陰性の選択可能なマ-カーとし
て使用でき、無害の５−フルオロシトシンを細胞毒性の５−フルオロウラシルへ
と変換する（ポラークおよびショーラー、1976年、「Chemotherapy(Basel)」21:
113）。
選択可能なマ-カーは、原核および真核遺伝子処理の双方において、比較的に
稀な遺伝的変化を被った細胞を、混合された細胞集団から回収することを可能と
するために、通常は使用されている。例えば、これらマーカーを、目的とする産
物を暗号化する他の遺伝子と物理的に関連して使用することによって、この他の
遺伝子を接種した細胞を前記の選択可能なマーカーと共に選択できる。例えば、
遺伝子治療が行われた後に、患者の試料から摂取した遺伝的に修飾された細胞を
監視するために、前記ｎｅｏ遺伝子が使用されてきた。
また、遺伝子治療に際して、安全装置として陰性の選択可能なマーカーを使用
することが提案されてきた( ラプトン等、1991年「Mol．Ce1l Biol．」11:3374)
。多くの遺伝子治療には、患者からの染色体細胞を除去し、この中に治療遺伝子
（この形質発現によって生化学的な病変を修復する）を導入し、次いでこれらの
細胞を患者内へと再び導入することが含まれる。こうして再導入された遺伝子的
に修飾された細胞は、最終的には患者の健康に対して有害であることが明らかに
なるかもしれないので（例えば、これら細胞が免疫的に適合していないか、また
は悪性であることが明らかになったときには）、陰性の選択可能なマーカーを、
治療遺伝子と共に導入することによって、（必要であれば）引き続いて遺伝的に
修飾された細胞を選択的に除去することを可能とする。
陽性または陰性の選択可能なマーカーを保持する多数のベクターが生産されて
きており、本分野に習熟した者には容易に入手できる（総覧のためには、Miller
(1992 年） 「Nature」357 :455を参照）。
他のものは、標準的な遺伝子クローニング技術を使用して、容易に生産できる。
本発明の方法では、胎児の神経細胞の混合された集団中に複製を予め誘発させ
ることを含むことができ、このため表皮成長因子や繊維芽成長因子のような助剤
を培地へと使用し、または不死化作用を有する発癌遺伝子によって予めトランス
フェクションしてこうした複製を強化する。または、非膨張性の細胞培養物を使
用できる。
好ましくは、平板培養後の初期の段階で、双方共に形質発現因子に対して操作
可能なように結合されている陽性の選択可能なマーカーと陰性の選択可能なマー
カーとによって細胞を形質導入する。この形質発現因子は、所定の中枢神経系領
域、所定の中枢細胞型、または特定のニューロンの副集団に対して特異的であっ
てよい。培養物が必要な水準の膨張量に達した後に、細胞を少なくとも部分的に
分化させることができる。次いで、適切な薬剤を適用し、形質導入されていない
細胞と、活性の特異的な形質発現因子がない形質導入細胞とが除去されるように
し、一方、活性因子（下流の選択可能なマーカーの形質発現をもたらす）を有す
る形質導入細胞が耐性になる。
単なる例示として、本発明において使用するための形質発現因子を、（ｉ）ド
ーパミン作用性、セロトニン作用性、ＧＡＢＡ作用性、コリン作用性またはペプ
チド作用性ニューロンおよびその副集団；（ｉｉ）シュワン細胞、希突起膠細胞
、星状膠細胞、ミクログリアおよびその副集団、（ｉｉｉ）特定段階の胚形成、
および（ｉｖ）他の特定の非神経組織において、特異的に活性であるプロモータ
ーおよび／またはエンハンサーから選択できる。本発明で使用するのに特に好ま
しいものは、例えばフース等、１９９４年「ＰＮＡＳＵＳＡ」９１巻、９３０２
−９３０６頁に記載されているテトラサ
イクリン応答性プロモーターである。このプロモーターをテトラサイクリン応答
調節系中の因子として使用し、インビボで遺伝子形質発現の一時的および／また
は空間的な調節を実施する。
または、これらを、（ｉ）神経伝達物質特異性の受容体；（ｉｉ）イオンチャ
ンネル；（ｉｉｉ）イオンチャンネルのゲーティングに関与する受容体、（ｉｖ
）サイトカイン類、成長因子およびホルモン類、および（ｖ）パラクリン、オー
トクリンまたはエンドクリン状態で特異的に生産され、分泌されるあらゆる物質
のための遺伝子を転写させるプロモーターおよび／またはエンハンサーから選択
できる。例えば表１を参照。
本発明は、ヒトおよび他の哺乳類細胞（例えば神経細胞）を培養する方法、お
よび、これらの中に含有されている遺伝物質に基づいて細胞の副集団を選択する
ことによって、単細胞型の均質な培養物を生産する方法を提供するものである。
この培養物は、基礎的な電気生理学的、神経化学的、発生工学的な実験を含む
種々の用途に適用できる。更に、精製された神経細胞集団は、中枢神経系変性疾
患の症状を除去するための移植の実現性の評価のような、一層臨床的な適用研究
において有用でありえるし、種々の形態の治療、予防及び診断に用途がある。
こした疾患には、（ｉ）パーキンソン病またはパーキンソン症候群、予め選択
された細胞副集団は、黒質のドーパミン作用性ニューロンである；（ｉｉ）ハン
チントン病、予め選択された細胞副集団は、線状体の神経細胞である；（ｉｉｉ
）アルツハイマー病、予め選択された細胞副集団は、新皮質または旧皮質と関連
する、アセチルコリン、セロトニンおよび／またはノルアドレナリンニューロン
を含有するニューロンである；または、（ｉｖ）多発性硬化症、予め選択された
細胞副集団は、脳の希突起膠細胞である；が含まれる。
実施例１：ヒトドーパミン作用性ニュ−ロンの均質な培養物の調製
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）およびｎｅ
ｏ遺伝子を、ドーパミン含有ニューロン中でのみ活性であるプロモーター、例え
ばチロシンヒドロキシラーゼの形質発現を制御するプロモーター（例えばハリン
トン等、１９８７年「Nucl.Acids Res.」１５：２３６３に記載されているプロ
モーターを参照）へと操作可能なように連結する。次いで、この構成体をレトロ
ウイルスベクターの適切なクローニング部位へとクローニングし、両性のレトロ
ウイルスのパッケージング用の細胞系（例えば、Ψ−クリップ：総覧のためには
「分子ウイルス学、実際的なアプローチ：Molecular Virology Practical Appr
oach」(AJ Davison 及び RM Elliott編集)IRL出版を参照。）にトランスフェク
ションするのに使用する。
胎児（妊娠後約５−８週間）のヒト腹部中脳から組織を解剖し、分離された培
養物の中で成長させた。繊維芽成長因子（メイヤー等、1993年「Neuroscience」
56:389）、表皮成長因子（レイノルズ及びワイス、1992年、「Science」255:170
7）を適用することによって、または発癌遺伝子の形質導入（ストリンガー等、1
994年、「BrainRes．」79:267）によって、これらのドーパミン作用性前駆体細
胞の複製を誘発させる。平板培養の少し後に、これらの培養細胞を、レトロウイ
ルスにパッケージされた選択可能なマーカーを用いて形質導入し、この培養物を
膨張させた。十分な数の細胞を生産したあと、培養物を、ニューロンの分裂の停
止をもたらすような条件下でインキュベートする。次いで、培養物をジェネチシ
ンによって処理し、形質導入されていない細胞に加えてチロシンヒドロキシラー
ゼを形質発現していない形質導入細胞を除去し、形質導入された、チロシンヒド
ロキシラーゼを含有するニューロンを残す。実施例２：ヒト希突起膠細胞の均質な培養物の調製
単純へルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）およびｎｅ
ｏ遺伝子を、希突起膠細胞特異的な酵素であるガラクトセレブロシダーゼの形質
発現を制御する、希突起膠細胞中でのみ活性であるプロモーターへと操作可能な
ように連結する。この構成体を、実施例１のようにしてウイルス中にパッケージ
ングする。この代わりにアデノウイルスのようなウイルス類も使用できる。胎児
または成人の脳から得た組織を分離し、分離された培養物中で成長させる。必要
であれば、(例えば、HS2ts6マウス(ノーブル等、1991年、WO91/13150）からの細
胞を使用することによって）細胞の複製を誘発させ、平板培養の少し後に、例え
ば、ガラクトセレブロシダーゼプロモーターに連結されている陽性の選択可能な
マーカーを暗号化し、およびサイトメガロウイルスのような構成的に活性のプロ
モーターに連結されている陰性の選択可能なマーカーを暗号化する遺伝子を用い
て、細胞を形質導入する。細胞の選択物を、実施例１におけるようにして得、希
突起膠細胞の純粋な集団を得る。実施例３：カルシトニン遺伝子に関連するペプチドを形質発現する実質的に正常 なヒト後根神経節細胞の均質な培養物の調製
後根神経節（ＤＲＧ）からのニューロンを、インビボで、源物質として胎児の
、新生児の、または成人の組織のいずれかを使用して成長させることができる。
これらの混合細胞集団を、例えば、栄養上の支援をもたらすために、例えば予め
成長させたネオマイシン耐性の非ニューロン細胞（ブレンネマン等、1987年、「
J．Cell Biol.」104:1603）のバックグラウンド層上で成長させる。このＤＲＧ
細胞を、アデノウイルス技術を使用して、カルシトニン遺伝子関連ペ
プチド（ＣＧＲＰ）形質発現用のプロモーターに対して操作可能なように連結さ
れているｎｅｏ遺伝子を用いて、トランスフェクションする。プロモーターを活
性化させ、これによってｎｅｏの形質発現を誘発させるために数日間経過した後
に、ｎｅｏを活性的に形質発現していないＤＲＧ細胞は、ネオマイシンを適用す
ると破壊されるであろう。この結果、ヒトＤＲＧに由来する分化したＣＧＲＰ陽
性のニューロンの純粋な集団がもたらされ、インビトロで使用できる。実施例４：神経細胞の形質導入
胎児（妊娠後８週間）のヒト皮質、線状体、視床下部、中脳、縫線複合体、延
髄、脊髄前角から得た一次細胞を、ゼラチン／ポリ−Ｌ＋リジン被覆フラスコ上
へと別々に平板培養した。この培地は、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有
する(1:1)DMEM/Ham's F12、L-グルタミン(2mM)および基礎繊維芽成長因子を含有
する（５ｎｇ／ｍｌ）調整貯蔵溶液(ボッテンスタインおよびサトウ、「PNAS」7
6(1979 年)514-517頁; ロミジン等、「J．Neurophysiol.」40(1981 年)1132-115
0頁)の混合物であった。
いったん細胞が接合すると、ＳＶ４０Ｔプロモーターに連結されているジェネ
チシン（Ｇ４１８r）に対する耐性マーカーを包含する構成体（ｔｓＡ５８）を
含有するレトロウイルス粒子を、この培地に対して、０．８μｇ／ｍｌのポリブ
レンと共に添加した。１時間後、この培地を、新しい培地と交換した。５日後、
ジェネチシンを培地（０．４ｍｇ／ｍｌ）へと添加し、更に１０日間、レトロウ
イルスベクターを包含していない細胞を完全に除去した。
１５日から２０日後に、ＦＧＦを含有する培地中で複製することができ、ジェ
ネチシンに対しても耐性であった、前掲の領域のすべ
てから、ヒト神経前駆体細胞の凝集体を見いだすことができた。すべてが、ニュ
ーロンの表現型を示した（これらは、例えば、ニューロン特異的なエノラーゼ陽
性であった。）。
このように、中枢神経系の種々の領域から、レトロウイルスにパッケージング
された遺伝子構成体を使用して、ヒト神経細胞に安定して形質導入することが可
能である。第二に、この構成体には、ジェネチシン耐性のような選択マーカーを
含有させることができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Cell Culture The present invention relates to cell culture methods, relates a cell culture process for producing especially a substantially homogenous population of cells (e.g. neuronal cells) in vitro. The present invention also relates to a nerve cell in which a selectable marker (for example, a positive and / or negative selectable marker) is introduced into a nerve cell (for example, a human nerve cell). Although the central nervous system is currently the subject of intensive research, its enormous complexity at the cellular level has worked to prevent a thorough understanding of its function. A number of methods have been developed to selectively label specific subpopulations of neurons in vitro (eg, immunostaining, in situ hybridization, histochemistry, etc.), but to separate subpopulations such as living cells, Purification was very difficult. Various solutions have been adopted to solve this problem. For example, techniques such as differential centrifugation have been used to enhance the phenotype of certain neurons. Other methods are based on labeling a subpopulation of cells using a fluorescent cell type-specific substrate, or using a fluorescent tracer dye to specificize a given set of neurons. (J. Neuroscience, 7: 3088). In each case, the separation of labeled from unlabeled cells is by fluorescence activated cell sorting (FACS). Other methods are based on the identification of extracellular membrane-associated markers specific for a given cell type (Uracami and Chiu, 1990, "J. Neuroscience" 10: 620). Here, to perform the separation in this example, the mixed cell population is panned on the conjugated antibody layer to generate a cell-antibody complex, from which the cells of interest are later separated for further study. be able to. According to other known methods, progenitor cells that give rise to a particular cell population are immortalized by transduction of oncogenes or by subculture of natural cell post-emergent growth. With the possible exception of progenitor cell immortalization techniques, most of these techniques have not gained widespread application. This is due in part to the large heterogeneity of the phenotype in the central nervous system, and the markers and separation techniques employed are extremely specific to avoid cross-reactivity with unwanted cell types. It must be. Second, the degree of purification required to achieve homogeneity is often on the order of two or more, and such enhancements are too large for FACS or panning, resulting in a degree of contamination. Third, cells that are abundant and sufficiently specific extracellular markers that are common to well-characterized neuronal populations (eg, dopaminergic and glutamate-active cells) Availability of outside markers is limited. Furthermore, most of these known enhancement techniques require relatively immature nerve cells to prevent the destruction of the nerve cells during processing. Finally, these considerations are even more restrictive for human neurons because of the difficulty in obtaining adequate amounts of fresh human brain tissue. The present invention provides a method for selectively culturing a preselected cell subpopulation in vitro from a heterogeneous population, comprising: (a) selecting a selectable marker (eg, a positive and / or negative selectable marker); ) Into a heterogeneous cell population and subjecting the marker to specific phenotypic expression / activity in said preselected subpopulation; and (b) transforming said preselected subpopulation into Selectively culturing based on the specific expression / activity of said selectable marker in the culture. The pre-selected subpopulation of cells may be a substantially homogeneous cell population of a particular cell type or cell class. For example, the preselected subpopulation may be a particular class of neurons. In the case of neural cells, the preselected population can be selected based on transmitter properties, for example, neurons containing dopamine or acetylcholine can be selectively cultured according to the methods of the present invention. The selectable marker need not be introduced into every cell that makes up the heterogeneous cell population; for most purposes, it is sufficient if a substantial portion of the cells have received the selectable marker. is there. However, preferably, the selectable marker is introduced into a majority (eg, substantially all) of the heterogeneous cell population. As described herein, the method of the present invention is particularly applicable to the selective culture of a particular class of substantially normal neurons. However, the methods of the present invention are of general use and can be used to selectively culture other cell subpopulations. It is known in the art that heterologous genetic material can be transduced into mammalian nerve cells. Although many methods exist for transducing eukaryotes and other cells, the characteristics of neurons make natural transfection methods most useful (Miller, "Nature" 357, 1992). : 455). Thus, for example, transduction with genetic material packaged in a virus is not only more effective than, for example, ursium phosphate precipitation, electroporation, microprojection bombardment or microinjection, but also during the actual process. Even lower neuronal mortality. Transduction of mammalian neurons from the central nervous system has been described both in vivo (Culver et al., 1992 "Science" 256: 1550) and in vitro (Stringer and Foster, 1994 "Brain Res" 79: 267). Have been. Genetic material that can be introduced into living cells can include both positive and negative selectable markers. A positive selectable marker is a marker that allows the transduced cells to survive in an environment that can kill cells that do not express this selectable phenotype. A negative selectable marker confers susceptibility to cells that express it, such that cells are destroyed in an environment that is relatively harmless to other cells. A wide range of selectable markers are available. Genes widely used as positive selectable markers include bacterial neomycin phosphotransferase (neo: Colbere-Garapin et al, J. Mol. Biol. 1981, 150: 1), Hygromycin phosphotransferase (hph; Santerre et al. 1984 "Gene" 30: 147) and xanthine guanine phosphoribosyltransferase (gpt; Mulligan and Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 78: 2072). Also used as positive selectable markers are herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-1 TK; Wigler et al. (Wigler et al) 1977, Cell 11: 223), adenine phosphoribosyl Transferase (ARPT: Wigler et al. (Wigler et al.) 1979, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"76; 1373) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT; Jolly et al., 1983, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA. These latter markers must be used in cells with a particular mutant genotype (ie, a genotype that results in a deficiency in the gene product upon which selection is based). Preferred negative selectable markers include genes encoding products involved in programmed cell death (apoptosis), such as the gene for p53. A selectable marker can be activated by causing expression of the gene of interest (eg, by using a tetracycline responsive promoter, as described below). The advantage of using a gene that does is that transient expression of the gene (often 30 minutes or less) can be sufficient to cause cells to die, and is reliable. Extremely strict negative selection is possible, and some of the genes mentioned above lead to a positive and negative selectable phenotype, including the HSV-1, APRT, HPRT and gpt genes. Enzymes encoded by these genes can catalyze the conversion of certain nucleoside or purine homologs to cytotoxic intermediates. For example, the nucleoside homolog ganciclovir (ganciclovir: GCV) is a good substrate for HSV-1 thymidine kinase, but not for the natural thymidine kinase found in mammalian cells. As a result, GCV is a cell that expresses the HSV-1 TK gene [St. C1air et al. 1987, “Antimicrob. Agents Chemotherap.” 31: 844]. Can be used to make a valid negative selection. Xanthine guanine phosphoribosyltransferase, when expressed in wild-type cells [Besnard et al., 1987, “Mol. Cell. Biol.” 7: 4139], is responsible for both positive and negative selection. Can be used for. Cytosine deaminase can also be used as a negative selectable marker and converts harmless 5-fluorocytosine to cytotoxic 5-fluorouracil (Polarck and Scholler, 1976, Chemotherapy (Basel) 21: 113). ). Selectable markers are usually used to allow cells that have undergone relatively rare genetic changes in both prokaryotic and eukaryotic gene processing to be recovered from a mixed population of cells. in use. For example, by using these markers in physical association with other genes that encode the product of interest, cells inoculated with the other genes can be selected with the selectable markers described above. For example, the neo gene has been used to monitor genetically modified cells taken from patient samples after gene therapy has been performed. It has also been proposed to use a negative selectable marker as a safety device in gene therapy (Lapton et al., 1991 "Mol. CeIl Biol." 11: 3374). Many gene therapies involve removing the chromosomal cells from the patient, introducing a therapeutic gene into it, which repairs a biochemical lesion, and then reintroducing the cells back into the patient. For example. Genetically modified cells thus re-introduced may eventually prove to be detrimental to the patient's health (for example, if they are not immunocompatible). , Or when it turns out to be malignant), the selective removal of subsequent genetically modified cells (if necessary) by introducing a negative selectable marker with the therapeutic gene It is possible to do. Numerous vectors carrying either positive or negative selectable markers have been produced and are readily available to those skilled in the art (for a review, see Miller (1992) Nature 357: 455). Others can be readily produced using standard gene cloning techniques. The method of the present invention can include pre-inducing replication in a mixed population of fetal neurons, so that auxiliaries such as epidermal growth factor and fibroblast growth factor are used in the medium. Or pre-transfection with an oncogenic gene having an immortalizing action to enhance such replication. Alternatively, non-swellable cell cultures can be used. Preferably, the cells are transduced at an early stage after plating with a positive selectable marker and a negative selectable marker, both of which are operably linked to the trait-expressing factor. The trait expressor may be specific for a given central nervous system region, a given central cell type, or a particular neuronal subpopulation. After the culture has reached the required level of expansion, the cells can be at least partially differentiated. Appropriate agents are then applied to ensure that non-transduced cells and transduced cells lacking an activity-specific transducer are removed, while the activator (of a downstream selectable marker) is removed. The transduced cells (which result in expression) become resistant. Merely by way of example, trait-expressing factors for use in the present invention include (i) dopaminergic, serotonergic, GABA-, cholinergic or peptidergic neurons and subpopulations thereof; (ii) Schwann cells, From promoters and / or enhancers that are specifically active in oligodendrocytes, astrocytes, microglia and subpopulations thereof, (iii) certain stages of embryogenesis, and (iv) other specific non-neural tissues. You can choose. Particularly preferred for use in the present invention are the tetracycline-responsive promoters described, for example, in Hoos et al., 1994, PNASUSA, Vol. 91, pp. 9302-9306. This promoter is used as a factor in the tetracycline response regulatory system to perform transient and / or spatial regulation of gene expression in vivo. Alternatively, they may be selected from the group consisting of (i) neurotransmitter-specific receptors; (ii) ion channels; (iii) receptors involved in ion channel gating, (iv) cytokines, growth factors and hormones, and (V) can be selected from promoters and / or enhancers that specifically produce the paracrine, autocrine or endocrine state and transcribe the gene for any secreted substance. See, for example, Table 1. The present invention provides a method for culturing human and other mammalian cells (eg, neural cells), and the selection of a sub-population of cells based on the genetic material contained therein, thereby providing a homogenous, unicellular form. It provides a method for producing a culture. This culture can be used for a variety of applications, including basic electrophysiological, neurochemical, and developmental engineering experiments. In addition, the purified neural cell population may be useful in more clinical application studies, such as assessing the feasibility of transplantation to eliminate the symptoms of central nervous system degenerative disease, and various forms of treatment, There are uses for prevention and diagnosis. Such diseases include (i) Parkinson's disease or Parkinson's syndrome, where the preselected cell subpopulation is dopaminergic neurons in the substantia nigra; (ii) Huntington's disease, the preselected cell subpopulation is (Iii) Alzheimer's disease, the preselected cell subpopulation is neurons containing acetylcholine, serotonin and / or noradrenaline neurons associated with the neocortex or the old cortex; or iv) multiple sclerosis, a preselected cell subpopulation is the oligodendrocytes of the brain; Example 1 Preparation of Homogeneous Culture of Human Dopaminergic Neurons Herpes Simplex Virus (HSV) thymidine kinase gene (tk) and neo gene are expressed in promoters that are active only in dopamine-containing neurons, such as tyrosine hydroxy. It is operably linked to a promoter that controls the expression of the enzyme (see, for example, the promoter described in Harrington et al., 1987, Nucl. Acids Res., 15: 2363). This construct is then cloned into the appropriate cloning site of a retroviral vector and the cell line for amphoteric retrovirus packaging (eg, Ψ-clip: for a review "Molecular virology, practical Approach: Molecular Virology Practical Approach (edited by AJ Davison and RM Elliott, see IRL Publishing). Tissue was dissected from fetal (approximately 5-8 weeks after gestation) human abdominal midbrain and grown in isolated culture. Transduction of oncogenes or by applying fibroblast growth factor (Meyer et al., 1993 "Neuroscience" 56: 389), epidermal growth factor (Reynolds and Weiss, 1992, "Science" 255: 1707). Stringer et al., 1994, "BrainRes." 79: 267) induce the replication of these dopaminergic precursor cells. Shortly after plating, the cultured cells were transduced with a selectable marker packaged with the retrovirus and the culture expanded. After producing a sufficient number of cells, the culture is incubated under conditions that result in arrest of neuronal division. The culture is then treated with geneticin to remove transduced cells not expressing tyrosine hydroxylase in addition to non-transduced cells, leaving transduced, tyrosine hydroxylase-containing neurons. Example 2: Preparation of a homogenous culture of human oligodendrocytes The herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase gene (tk) and the neo gene were transduced by the oligodendrocyte-specific enzyme galactocerebrosidase. Operably linked to a promoter that regulates expression and is only active in oligodendrocytes. This construct is packaged in a virus as in Example 1. Alternatively, viruses such as adenovirus can be used. Tissue obtained from fetal or adult brain is isolated and grown in isolated culture. If necessary, induce cell replication (eg, by using cells from HS2ts6 mice (Noble et al., 1991, WO 91/13150)) and shortly after plating, for example, the galactocerebrosidase promoter. Transform cells with a gene that encodes a linked positive selectable marker and encodes a negative selectable marker linked to a constitutively active promoter, such as cytomegalovirus. Introduce. A selection of cells is obtained as in Example 1 to obtain a pure population of oligodendrocytes. Example 3 Preparation of a Homogeneous Culture of Substantially Normal Human Dorsal Root Ganglion Cells Expressing a Peptide Related to the Calcitonin Gene Neurons from the dorsal root ganglion (DRG) as a source material in vivo It can be grown using either fetal, neonatal, or adult tissue. These mixed cell populations can be used, for example, to provide nutritional support, for example, in the background of pre-grown neomycin-resistant non-neuronal cells (Brennemann et al., 1987, "J. Cell Biol." 104: 1603). Grow on layer. The DRG cells are transfected using adenovirus technology with the neo gene operably linked to a promoter for calcitonin gene-related peptide (CGRP) expression. After several days to activate the promoter and thereby induce neo expression, DRG cells that are not actively expressing neo will be destroyed upon application of neomycin. This results in a pure population of differentiated CGRP-positive neurons derived from human DRG, which can be used in vitro. Example 4 Transduction of Neurons Primary cells obtained from human cortex, striatum, hypothalamus, midbrain, raphe complex, medulla oblongata, spinal anterior horn of a fetus (8 weeks after gestation) were converted to gelatin / poly Plated separately on -L + lysine coated flasks. This medium was prepared with DMEM / Ham's F12 containing penicillin / streptomycin (1: 1), L-glutamine (2 mM) and basal fibroblast growth factor (5 ng / ml) in conditioned storage solutions (Bottenstein and Sato, "PNAS" 76 (1979) pp. 514-517; Lomidine et al., "J. Neurophysiol." 40 (1981) pp. 1132-1150). Once cells have mated, retroviral particles containing a construct (tsA58) containing a resistance marker for geneticin (G418 r ) linked to the SV40T promoter are treated with 0.8 μg / ml polybrene against this medium. Was added. One hour later, the medium was replaced with fresh medium. Five days later, Geneticin was added to the medium (0.4 mg / ml) and cells that did not contain the retroviral vector were completely removed for another 10 days. After 15 to 20 days, aggregates of human neural progenitor cells can be found in all of the above regions, which were able to replicate in media containing FGF and were also resistant to Geneticin. Was. All exhibited neuronal phenotypes (these were, for example, neuron-specific enolase positives). In this way, it is possible to stably transduce human neurons from various regions of the central nervous system using gene constructs packaged in retroviruses. Second, the construct can contain a selectable marker, such as geneticin resistance.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ
Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，
ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ
，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，
ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S
Z, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, B
Y, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES
, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG,
KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, M
D, MG, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT
, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ,
TM, TT, UA, UG, US, UZ, VN