JPH11503170A - 半透性容器内に収容すベき生きた組織または細胞を前処理する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、半透性容器内に収容すべき生存可能な組織または細胞を前処理する方法であって：（ａ）ゲルを形成できる物質を含有し、前記生存可能な組織または細胞に対して生理学に適合するする溶液中に、生存可能な組織または細胞を懸濁させることと；（ｂ）得られた懸濁液を、前記物質がゲルを形成する条件下で処理することにより、半透性容器内に収容すべき生存可能な組織または細胞前処理することとを具備した方法を提供する。本発明はまた、生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する方法であって：上記方法に従って生存可能な組織または細胞を前処理する方法を提供する。本発明はまた、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を患者に移植する方法、並びにドナー由来の生存可能な組織または細胞を、該生存可能な組織または細胞を患者の免疫系による破壊から保護するように患者に移植する方法であって、夫々の方法は、前処理された生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容することを具備した方法を提供する。また、前処理された生存可能な組織または細胞、および半透性容器内に収容された前処理された生存可能な組織または細胞（マイクロカプセル内に収容された前処理された生存可能な組織または細胞を含む）が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 半透性容器内に収容すべき生きた組織または細胞を前処理する方法 ここに開示する発明は、保健福祉省のＮＩＨ補助金第 R01KD39008 号による政 府の援助を受けてなされたものである。従って、アメリカ合衆国政府は本発明に おいて一定の権利を有する。 この出願を通して、括弧内に種々の参照文献が引用される。これら参照文献の 開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に記載するために、その出典を明 示することによりその開示の全体を本明細書の一部とする。 〔発明の背景〕 膵島の移植は、インスリン依存性糖尿病対象の有望な治療法である。不幸にも 、ヒト膵島の入手可能性および産出量は極めて制限されており、免疫能が抑制さ れた糖尿病対象におけるヒト膵島の同種移植は長い間成功していない（１）。多 数の糖尿病患者の治療には、殆どが、動物から採取された異種ドナーの膵島が必 要とされるであろう。 現在では、豚、牛、イヌおよびウサギのドナーからの膵島の単離を可能にする 技術を利用することが可能である。臨床的な膵島の異種移植に対する主な障害は 、種間での膵島移植片の破壊を防止する有効な免疫抑制レジメが欠如しているこ とである（１，１３−１６，６０）。多孔性の機械的バリアーを用いずに、膵島 の異種移植を永続的に生存させることは未だ成功していない。 免疫学的手法を用いて、非近縁種の膵島異種移植片を永続的に生存させること には成功していないので、数人の研究者達によって、宿主の免疫細胞に対する機 械的防御障壁としての多孔性膜および包みの有用性が研究されてきた。膜を介在 させれば成功するという根拠は、細胞によって仲介される細胞毒性には、細胞と 細胞との接触が必要であるということにある。一般的に、膜の素材に対する炎症 反応の結果、膵島の短期異種移植の機能は喪失すると言われてきた（７，２９， ７５，８１）。 きわめて様々な血管内膜装置および血管外膜装置が試されてきたが、出血、凝 固および生体不適合性などの臨床的な問題が起こり得るため、それらを糖尿病患 者に使用することはできない（７，９，１７−１９，２９，６１，８１）。膵島 を免疫的に隔離する最も有望な方法は、ポリアミノ酸−アルギン酸マイクロカプ セルである。アルギン酸の小球（300-800μｍ）に移植する膵島を取り込ませ、 多孔性の膜を形成するポリアミノ酸によって被覆する。ストレプトゾトシンによ って糖尿病を誘発したラットの腹腔内に、ラット、イヌ、ブタおよびヒトの膵島 を同種移植または異種移植すると、血中グルコースは即座に正常となり、これは 100日間も維持された（２−４，６，１０，１１，２１−２４，２６−２９，３ １，３２，３４，３５，３７，３８）。予備的データでは、ミクロ封入したイヌ 膵島の同種移植（８３）、およびブタからサルへの異種移植（８９）によって高 血糖が改善することが示唆されている。少なくとも一人のヒトの患者において、 封入された膵島の同種移植により、外部から与えるインシュリンの必要量が減っ たという記録もある（７４）。 封入した膵島の移植を受けた齧歯類受容個体において、絶食時の低血糖（非症 候性）および異常なグルコース負荷曲線が見出されている（２，３，２５）。ま た、インシュリンを外部から与える療法に比べて、封入した膵島を移植する方が 代謝調節において優れていることが、多数の研究発表により裏付けられている。 さらに、他の多くの生物的人工膵臓デザインおよび膵臓組織全体の移植に比べて 、ミクロ封入された膵島移植片の方が、死亡率が非常に低い。マイクロカプセル デザイン（多数の小球体）は、多孔性膜装置にとっては最適な設計である。何故 なら、この技術は質量に対する表面積比を最大にし、大量移植に伴う抵抗力およ び拡散による時間的遅延を最小限にするからである（７，７５）。糖尿病治療に おいて、膵島のミクロ封入化の欠点の一つは、マイクロカプセルが幾分壊れやす く、かつヒトに100万個の膵島を移植する場合には約200ccというかなりの容量を 占めると推測されるので、腹腔が唯一の移植場所であること、また、拒絶または 破壊が起こった場合に腹腔内を自由に浮遊して腹腔表面に付着するので、マイク ロカプセルを全て回収することが難しいことである。それでもなお、ポリアミノ 酸−アルギン酸マイクロカプセルは、膵島の異種移植において有用な手段であり 得る。 いくつかの研究室が、従来のアルギン酸−ポリアミノ酸技術以外の試薬を用い て構築するマイクロカプセルに関するデータを公表してきた。これらの中には、 ポリステレン硫酸を使用した又は使用しないアガロース、ヒドロキシエチルメタ クリル酸−メチルメタクリル酸（HEMA-MMA）およびバリウム−アルギン酸などに よる封入化または膵島の「被覆化」が含まれる（３０，３２，３３，７８−８０ ）。生体への不適合および膵島移植片の生存が十分でないことが認められている 。 我々の標準ミクロ封入法は、以前リーチら（Reach et al.）（２０，２１）が 公表した方法を基にしたものである。我々の標準ミクロ封入化法を完全に記述し 、数回にわたって公表してきた（２，１０，２３，４５，５５）。 以下に概要を示す。生理的食塩水中のアルギン酸ナトリウム 1.85-2.0％に、 単離した膵島を懸濁し、22ゲージの空気噴出針から押し出して、アルギン酸中に 膵島を含む小滴を作成する。約 2cm の高さから、生理的食塩水中の 1.1％塩化 カルシウムを入れたビーカーに、膵島を含んだアルギン酸の小滴を注ぎ込む。負 に帯電したアルギン酸の小滴はカルシウムを結合し、アルギン酸カルシウムのゲ ルを形成する。適切な条件下では可溶化され得るという点で、アルギン酸カルシ ウムのゲルは一時的なものである。ゲル化した小滴から上清を除去し、続いて塩 化カルシウム中で10分間インキュベートする。 その後、さらに希釈した塩化カルシウム溶液で順次洗浄し、最後に生理的食塩 水で洗浄した後、0.5 mg/mlのポリ-L-リシンを添加し、６分間インキュベートし て、ポリ-L-リシンでカルシウムイオンを置換し、負に帯電したアルギン酸に結 合させて、ポリ電解質膜を作成する。初期の研究では、分子量57,000のポリ-L- リシンを用いた。近年の研究では、より分子量の小さいポリ-L-リシン（分子量1 8,000-25,000）を用いている。ポリ-L-リシンのインキュベーションに続いて、 マイクロカプセルを0.1％CHES 中で洗浄し、最後に0.185％-0.2％のアルギン酸 ナトリウム溶液を添加して、アルギン酸ナトリウムで外側を薄く被覆する。最後 に、生じたカプセルを55mMのクエン酸ナトリウム中でインキュベートして、ポリ -L-リシンと反応しなかった全てのアルギン酸カルシウムを溶解させる。この方 法により、「一重壁」カプセルと名付けたカプセルが製造される。 この技術を用いて、ストレプトゾトシンで糖尿病を誘発されたマウス(C57BLK およびB10)に対して、免疫抑制を施さずに、封入したLewisラット膵島を移植す ると100日以上生存することが報告されている（２，３，３８），（表１参照） 。残念ながら、糖尿病を自然発症するNODマウスに、同様に封入したラット膵島 を移植すると（「一重壁」マイクロカプセル技術を用いた）、拒絶されたマイク ロカプセルの周囲で細胞反応が顕著になり、6-21日で不成功に終わった。拒絶さ れた移植片の生検では、カプセルの破損もみられた。 カプセル壁の強度を増すために、「二重壁」技術と名付けられた技術が考案さ れ、詳細に公表されている（８４，４５，５５）。基本的には、「一重壁」法を 終えた後（ただしクエン酸ナトリウムインキュベーションに先立って）、さらに ポリ-L-リシンを添加して２度目のインキュベーションを約６分間行い、つぎに0 .1％CHESで洗浄し、つづいて希釈した0.185％-0.2％のアルギン酸ナトリウム中 でさらに再インキュベートし、最後にクエン酸ナトリウムでインキュベートする 。「二重壁」ミクロ封入された膵島の異種移植片は、NODマウス中で有意に長く 生存（p<0.01）（表１参照）し、「二重壁」カプセルの方が高い性能を有してい る（５５）。 封入された膵島の同系移植についての長期的な研究はなく、それ故、耐久性の 限界、およびミクロ封入された機能的膵島移植片の生存状況についてはほとんど 知られていない。封入された膵島移植片の機能を分析している実験は、ほとんど 全て、受容個体としてマウスまたはラットのいずれかを用いたものであり、移植 の機能を２００日以上にわたってモニターしている研究は皆無に等しい（２，３ ，６，３４，３６）。封入されていない移植片に比べて、ミクロ封入された膵島 の同種移植片および異種移植片の生存率は劇的に増大するので、封入された膵島 移植片の長期的な生存能力の限界は注目されなかった。１年も経たずに機能を喪 失するような移植技術は臨床的に受け入れられないと考えられるので、このこと はマイクロカプセル法の臨床適用に大いに関連する問題である。 齧歯類に対する、ミクロ封入した膵島の同種移植および異種移植についての報 告をいくつか注意深く読めば、移植片が氷続的に生存することは希であることが 分かるであろう。事実、成功した受容個体でさえも、生検採取された移植片中に 、 カプセルの摩耗が見出されている。機能している移植の生検を行ったときでさえ 、殆どの場合、カプセルの破損、および破損したカプセルに対する繊維反応が集 中的に起こっていた。マイクロカプセル技術をヒトに適用するのであれば、カプ セルの摩耗は、解決すべき重要な問題であるというのが、一般的に一致した見解 である。マイクロカプセル中のラット膵島同種移植片は、８週間以上何ら変化が なく、機能を保持し、反応も起こらないというホーチャー（Horcher）による最 近の報告は、封入された膵島に対する同種反応性および異種反応性をなくすこと ができれば、カプセルの摩耗は最小限になるということを示唆している。 マイクロカプセル化した膵島移植に関する別の問題点は、多孔性のマイクロカ プセルバリアーがあるにもかかわらず、誘発された糖尿病の場合とは異なり、自 然発症する糖尿病（BBラットおよびNODマウス）では、封入された膵島の同種移 植片および異種移植片が破壊されるということである（２，３，１０−１２，２ ２，２４，３１，３７，３８，４３，４４，５５）。ストレプトゾトシンにより 糖尿病を誘発されたレシピエント個体に比べて、NODマウスおよびBBラットの方 が封入された膵島をより早く破壊するので、封入化された膵島移植片をインシュ リン依存性の糖尿病患者に用いるのには障害があると考えられる。いくつかの研 究グループは、NODマウスおよびBBラットによる、封入した移植片の破壊には抗 膵島自己免疫が関与すると推測している。これらのモデルにおける膵島移植片破 壊の作用機序は、我々の研究室における重点的研究テーマであった。マイクロカ プセルは、宿主の免疫細胞との細胞−細胞間接触を妨げることによって、宿主に よる破壊から供与された膵島を幾分保護することが示された（７）。封入されて いない異種膵島移植片の破壊に、Ｔリンパ球が関与していることには十分な文献 的裏付けがある（８，１３，３９−４２，６２）。同種移植反応には、CD4+とCD 8+の二つのＴ細胞が関与しているのに対して、異種移植反応では主としてCD4+T 細胞が関与している（２，５６−６０，６２，６５）。マウスでは、宿主の抗原 提示細胞による提示を受けたとき、CD4+ヘルパーT 細胞は、同種抗原の場合のよ うに直接的に認識するのではなく、むしろ名目的抗原として異種抗原を認識して いることが示されてきた（１５，４３，５５）。また、異種移植片の破壊には、 さらに補体とサイトカインが必須であることも文献に記載されている （７，１４−１６，３９）。従来のデザインによるポリ-L-リシン・アルギン酸 マイクロカプセルは、膵島と宿主の抗体との接触を妨げるという報告もある。 自然発症性の糖尿病マウス（NODマウス）は封入された膵島を激しく破壊する のに対して、（ストレプトゾトシンにより）糖尿病を誘発されたマウスが封入さ れた膵島を破壊しない理由は未だ明らかではない。NODマウスは、他の系統のマ ウスに比べて、外来抗原に対してより攻撃的な反応を示す証拠がある（６６）。 マイクロカプセルに入れたドナー膵島でさえ破壊されるのは、NODマウスが宿主 の膵島を自己免疫によって繰り返し破壊するためかもしれないことを、幾つかの 研究かのグループは示唆している。膵島β細胞に対して特異的な細胞毒性をもつ Ｔ細胞および膵島β細胞特異的抗体がNODマウスから同定され、特性が明らかに され、クローニングされた（４９−５４，６４）。NODの糖尿病は抗原によって 引き起こされると広く推定されているが、関与しているペプチドは全く示されて いない（６７）。NODにおいて、膵島抗原に対する免疫寛容の低下と、重要な膵 島抗原であるグルタミン酸デカルボキシラーゼに対するT_Hl免疫応答の出現との 間に相関があることが、近年の研究により明らかにされてきた（７２，８５）。 移植および他の免疫反応と同様に、ヘルパーＴ細胞はCD8+細胞を活性化するよう に作用し、細胞障害性の攻撃によりβ細胞を直接損傷すると推測されている。し かし、最近の研究によれば、初めはCD4+細胞が関与するが、NODsによるβ細胞の 破壊は、主として浸潤性マクロファージ（有名なβ細胞毒であるサイトカインや 酸素フリーラジカルを放出する）が関係する非特異的な炎症反応による間接的な ものである、という推測もなされている。 コルトン（Colton）（7,75）は、免疫的に隔離された膵島が拒絶される道筋の 中で可能性のあるものについての作業仮説をまとめたが、これは膜から何らかの ドナータンパク抗原、細胞表面抗原、または細胞質抗原が放出あるいは分泌され 、これらを宿主の抗原提示細胞が認識、加工して、宿主Ｔ細胞に提示することに より、マクロファージおよび細胞障害性Ｔ細胞が活性化されるというものである 。さらに、活性化されたＢ細胞が特異的抗体を放出し、補体サイトカインがマイ クロカプセル周囲の近傍に集まる。 近年、デヴォスら（deVos et al.）（77）は、ドナー膵島の不完全な封入およ び ／またはポリ-L-リシン・アルギン酸膜からのドナー膵島の突出によってカプセ ルの破損が引き起こされ、損傷したあるいは不完全なカプセルに対して免疫応答 が集中するかもしれないと報告している。放出または分泌された抗原が、完全な ままの多孔性膜を通過するというコルトンのモデルでは説明されていないので、 この考え方はきわめて興味深いものである。我々は、齧デヴォスによって報告さ れた結果ときわめて類似した結果を得ており、このことはポリ-L-リシン・アル ギン酸マイクロカプセルのデザインにおいて改良しなければならない、重要な問 題であると信ずる。 ここで記載されているように、我々はマイクロカプセルの壁の中にドナー膵島 がトラップされることが、ミクロ封入に伴う上述の問題の一因となっていること を見出してきた。このようなトラップにより、欠陥のあるマイクロカプセルに対 する宿主細胞の応答が引き起こされ、マイクロカプセルの壊れやすさが増大し、 マイクロカプセルの耐久性は減少して、生存する移植片が限られてしまう。特定 の理論に束縛されることは望まないが、アルギン酸球体の中で膵島が中心から離 れて位置するのは、ミクロ封入化の過程における剪断力、遠心力、および／また は減速力のためであろうと推定される。 〔発明の概要〕 本発明は、半透性容器内に収容すべき生存可能な組織または細胞を前処理する 方法であって：（ａ）ゲルを形成できる物質を含有し、前記生存可能な組織また は細胞に対して生理学に適合する溶液中に、生存可能な組織または細胞を懸濁さ せることと；（ｂ）得られた懸濁液を、前記物質がゲルを形成する条件下で処理 することにより、半透性容器内に収容すべき生存可能な組織または細胞を前処理 することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する方法であ って：（ａ）上記方法に従って生存可能な組織または細胞を前処理して、前処理 された生存可能な組織または細胞を得ることと；（ｂ）この前処理された生存可 能な組織または細胞の回りに半透性容器を形成することにより、該生存可能な組 織または細胞を半透性容器内に収容することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を患者に移植する方法 であって、（ａ）ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、上記の方法に従っ て半透性容器内に収容することと；（ｂ）こうして得た収容された細胞生存可能 な組織または細胞を患者に移植することにより、ドナー由来の生存可能な組織ま たは細胞を患者に移植することとを具備した方法を提供する。 本発明は更に、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、該生存可能な組織 または細胞を患者の免疫系による破壊から保護するように患者に移植する方法で あって：（ａ）生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する上記方法に 従って、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、免疫因子を透過させない半 透性容器内に収容することと；（ｂ）こうして得た収容された組織または細胞を 患者の中に移植することにより、前記ドナー由来の生存可能な組織または細胞を 患者に移植することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、糖尿病に罹っている患者を治療する方法であって、ドナー由来 の生存可能な組織または細胞を患者の免疫系による破壊から保護するように患者 に移植する上記方法に従って、或る量の生存可能な膵島を患者に移植することを 具備し、この移植される生存可能な膵島の量は、糖尿病を治療するために有効な 量である方法を提供する。 本発明はまた、生存可能な組織または細胞を前処理する上記方法に従って前処 理された、生存可能な組織または細胞を提供する。 本発明は更に、生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する上記方法 に従って、半透性容器内に収容された生存可能な組織または細胞を提供する。 最後に、本発明は、上記方法に従って半透性容器内に収容された生存可能な組 織または細胞であって、前記半透性容器がマイクロカプセルである生存可能な組 織または細胞を提供する。 〔図面の簡単な説明〕 図 １： 本発明の新規な前処理法と比較した、マイクロカプセル化の「一重 壁」法および「二重壁」法を示す説明図。 図 ２： マイクロカプセル壁の中に埋め込まれた膵島を示す、前処理されな い「二重壁」法の位相差顕微鏡写真。 図 ３： 前処理されない「二重壁」マイクロカプセル壁の中に埋め込まれた 膵島を示す共焦点顕微鏡写真。 図 ４： 図３と同じ；カプセル壁が焦点位置にあるときに、膵島がカプセル 壁の中に埋設されて存在すること（中央画像）を示す連続的深度の共焦点画像。 図 ５： 膜中に埋め込まれていないマイクロカプセル内の膵島；新規な前処 理法；共焦点顕微鏡写真。 図 ６： 図５と同じ；中央の画像に注目のこと。ここでは、膜が焦点位置に あるときに膵島はマイクロカプセル内にあり、膜中に埋設されていない。 図７Ａおよび７Ｂ： 図７Ａ：「二重壁」アルギン酸マイクロカプセル中に埋 め込まれた膵島；位相コントラスト。 図７Ｂ：レシピエントの糖尿病ＮＯＤマ ウスによって拒絶された壁内の膵島。 図 ８： ９５日のＮＯＤにおける機能しているラット膵島の生検；「前処理 （ＰＴ）」プラス「二重壁」、0.2％アルギン酸。膵島はカプセル壁から離れて いることに注意されたい。 図９Ａおよび９Ｂ： 「一重壁」マイクロカプセル（図９Ａ）および「二重壁 ｘ」マイクロカプセル（図９Ｂ）の模式図。夫々の図において、アルギン酸塩層 は陰影を付して示し、またポリ−Ｌ−リジン層はハッチングを付して示してある 。 図１０： 培養における、封入されたヒト副甲状腺細胞。Ｈ組織学およびＥ組 織学。 〔発明の詳細な説明〕 本発明は、半透性容器内に収容すべきコア材料を前処理する方法であって:（ ａ）前記コア材料を、「前処理物質」、即ちゲルを形成できる物質を含有する溶 液中に懸濁させることと；（ｂ）得られた懸濁液を前記物質がゲルを形成する条 件下で処理することにより、半透性容器内に収容すべきコア材料を前処理するこ ととを具備した方法を提供する。 ここで使用する「コア材料」の用語は、後で器官の中に移植するために半透性 容器内に収容することを意図した何れかの材料を指す。コア材料には、酵素また は免疫タンパクのような巨大分子、生存可能な組織；および生存可能な細胞が含 まれるが、これらに限定されるものではない。特に、本発明は生存可能な組織お よび細胞に対して適用可能である。従って、一態様において、本発明は半透性容 器内に収容すべき生存可能な組織または細胞を前処理する方法であって：（ａ） ゲルを形成できる物質を含有し、前記生存可能な組織または細胞に対して生理学 に適合する溶液中に、生存可能な組織または細胞を懸濁させることと；（ｂ）得 られた懸濁液を、前記物質がゲルを形成する条件下で処理することにより、半透 性容器内に収容すべき生存可能な組織または細胞前処理することとを具備した方 法を提供する。 ここで使用する「半透性容器」の用語は、コア材料を収容でき、該半透性容器 内に収容されたコア材料と外部環境との間の少なくとも何等かの接触を防止する 何れかの手段を指す。コア材料が生存可能な組織または細胞を含むときは、当該 半透性容器は、生存可能な組織または細胞の逸脱を禁止し、生存可能な組織また は細胞によって分泌された特定の物質のみを透過させるように形成し得る。当該 半透性容器は、外部環境から特定の物質のみを選択的に導入するように形成して もよい。コア材料を収容するためのこのような半透性容器は、当該技術において 周知である。本発明が目的とする半透性容器は、血管内装置または血管外装置の 何れであってもよい。更に、本発明の目的にとって、半透性容器は如何なる形状 であってもよく、これには平面形、中空繊維のような管形、またはマイクロカプ セルのような球形が含まれるが、これらに限定されるものではない。 ここで用いる「生理学的に適合する」溶液の語は、生存可能な組織または細胞 が生存できる全ての溶液であり、このような溶液は当業者に周知である。 本発明の半透性容器は、半透性容器を形成するための当該技術で公知の如何な る方法によって形成されてもよい。半透性容器がマイクロカプセルであるときは 、該カプセルは、一般に、前処理されたコア材料を、「封入」材料（即ち、ゲル を形成できる材料）を含有する溶液中に懸濁させることと；得られた懸濁液を、 コア材料を封入するのに十分な大きさの液滴にすることと；得られた液滴を、封 入材料がゲルを形成する条件下で処理して、一時的な形状保持カプセルを形成す ることと；得られた一時的な形状保持カプセルの回りに永久的な半透膜を形成す ることによって形成される。 上記方法における前処理物質は、封入物質と同じであっても異なっていてもよ い。ゲルを形成することができ、従って本発明における前処理物質または封入材 料として有用な物質および材料は当該技術において周知であり、ｐＨ変化のよう な条件の変化または多価イオンへの露出に際してゲル化する天然または合成の多 糖ガムが含まれるが、これに限定されるものではない。本発明に有用なガムは、 ポリマー成分と反応し、該ポリマーを架橋して永久的な半透膜を形成する基を含 んでいてもよい。前処理物質として使用されるガムが封入材料に用いられるガム と同じ場合には、かかるガムはポリマー成分と反応する基を含んでいるのが望ま しい。ゲルを形成できる多糖類ガムの例には、アルギン酸ナトリウムのようなア ルギン酸アルカリ金属塩；グアーガム；カラジーナン；ペクチン；トラガカンス ガム；キサンタンガム；および上記何れかのガムの酸性画分が含まれるが、これ らに限定されるものではない。ポリマー成分と反応して該成分を架橋し、永久的 な半透膜を形成する基の例には酸基が含まれるが、これに限定されるものではな い。従って、本発明の上記方法の一つの態様において、特に前処理材料として用 いられるガムが封入材料として用いられるガムと同じであるときは、ゲルを形成 できる物質は、酸基、例えばアルギン酸アルカリ金属塩を含むガムである。 前処理物質がアルギン酸アルカリ金属塩であるときは、一つの態様において、 懸濁液を処理する前の懸濁液中における該アルギン酸アルカリ金属塩の最終濃度 は、約０％〜約１％である。他の実施例において、懸濁液を処理する前の懸濁液 中におけるアルギン酸アルカリ金属塩の最終濃度は、約０％〜約0.5％である。 更に別の熊様において、懸濁液を処理する前の懸濁液中におけるアルギン酸アル カリ金属塩の最終濃度は、0.2％である。 本発明の方法において、前処理物質がゲルを形成するのを可能にする条件は当 該技術において周知であり、コア材料を前処理するのに用いられる特定の物質に 依存する。一般に、このような物質はｐＨが変化し、または多価イオンと反応す るとゲル化する。例えば、前処理物質がアルギン酸ナトリウムのようなアルギン 酸アルカリ金属塩であるとき、該物質をゲル化させる条件には、該物質を多価陽 イオン（カルシウム陽イオンが含まれるが、これには限定されない）の溶液に曝 すことが含まれる。バリウムまたはマグネシウムのような他の多価陽イオンを用 いてもよいが、殆どの生存可能な組織または細胞に対して生理学的に適合する点 ではカルシウムが好ましい。従って、本発明のコア材料を前処理する方法の一つ の態様（ここでは、コア材料がアルギン酸アルカリ金属塩を含有する溶液中に懸 濁される）において、ステップ（ｂ）における懸濁液の処理には、該懸濁液を、 多価陽イオンを含有する溶液と接触させることが含まれる。一つの態様において 、当該処理が多価陽イオンを含有する溶液に懸濁液を接触させることを具備する とき、該多価陽イオンはカルシウム陽イオンである。 本発明の方法に従って生存可能な組織または細胞を前処理することによって、 半透性容器内に生存可能な組織または細胞を収容するための幾つかの障害が克服 される。個々の生存可能な細胞を含む、本発明の方法に従って前処理された生存 可能な組織または細胞は、容器形成プロセスの際に生じる遠心力、剪断力、減速 力または静電力により生じ得る半透性容器壁中での停泊が防止される。従って、 本発明の方法は、予め収容できない単一の生存可能な細胞を半透性容器内に収容 することを可能にする。一般に、コア材料を器官に移植する前に、かかる材料を 半透性容器内に収容することが有利である。何故なら、容器は比較的容易に器官 の組織および／または循環から分離されるので、その中に収容された材料は、容 器に収容されていない材料よりも容易に器官から回収されるからである。 異種材料が移植される場合、または器官において何らかの免疫反応を誘起する 材料が移植される場合において、移植の前に該材料を半透性容器内に収容するこ との他の利点は、当該容器によって、宿主の免疫細胞および宿主の抗体が当該材 料に接触してこれを破壊するのを防止することである。また、本発明の方法は、 生存可能な組織または細胞が、該細胞を収容すべき半透性容器の壁の中に停泊す るのを防止することにより、移植された半透性容器の構造的強度を増大させ、結 果的にその寿命を長くする。最後に、組織または細胞が容器壁の中に停泊しなけ れば、それらは当該容器の外部環境と接触しない。従って、本発明の方法は、そ れが移植される患者に対して免疫原性を有する生存可能な組織または細胞を収容 した半透性容器の生体適合性を増大させる。 本発明はまた、生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する方法であ って：（ａ）上記方法に従って生存可能な組織または細胞を前処理して、前処理 された生存可能な組織または細胞を得ることと；（ｂ）この前処理された生存可 能な組織または細胞の回りに半透性容器を形成することにより、該生存可能な組 織または細胞を半透性容器内に収容することとを具備した方法を提供する。一つ の態様において、当該コア材料は生存可能な組織または細胞を含んでいる。 コア材料を収容する本発明の方法において、該コア材料は、如何なるタイプの 半透性容器内に収容してもよい。上記のように、このような半透性容器は当該技 術において周知であり、中空繊維、プラスチック膜およびマイクロカプセルが含 まれるが、これらに限定されるものではない。上記方法の一実施例において、半 透性容器はマイクロカプセルである。 半透性容器がマイクロカプセルであるとき、それは、一般には上記のようにし て形成される。即ち、前処理されたコア材料を、封入材料を含有する溶液（コア 材料が生存可能な組織または細胞を含有するときは、該生存可能な組織または細 胞と生理学的に適合するする溶液）中に懸濁させ；得られた懸濁液を、該コア材 料を封入するのに十分な大きさの液滴に形成し；得られた液滴を、上記封入材料 をゲル化させる条件下で処理して、一時的に形状を保持するカプセルを形成し； 得られた一時的に形状を保持するカプセルの周りに、永久的な半透膜を形成する 。 マイクロカプセルの形成において、上記コア材料を封入剤の中に懸濁させた後 に、該懸濁液を液滴にするために十分な手段を用いてもよい。例えば、この懸濁 液を、該懸濁液に液滴の形状を取らせる空気ジェット針のような手段を通して押 し出してもよい。懸濁液を液滴の形状にするのに十分な手段の他の例は当業者に 周知であり、該懸濁液を噴霧装置によって分散させること、または該懸濁液を通 して空気を吹き込むことが含まれるが、これらに限定されるものではない。 上記方法において、液滴が形成された後、外液滴は封入剤をゲル化させる条件 下で処理される。このような条件は、上記で述べたように当該技術において周知 である。該封入剤がアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸アルカリ金属塩で ある一つの実施例において、液滴は、例えば多価陽イオンを含有する溶液中を落 下させまたは通過させることにより、かかる溶液と接触させられる。一実施例に おいて、液滴が多価陽イオンを含有する溶液に接触するとき、多価陽イオンはカ ルシウム陽イオンである。封入剤がケルを形成する条件下で液滴を処理すること により、該液滴は一時的に形状を保持するカプセルを形成する。これらの一時的 に形状を保持するカプセルは、該材料にゲルを形成させる条件を反転させること によって再液化される。 本発明におけるマイクロカプセルの形成では、液滴が一時的な形状を保持する カプセルを形成した後に、その周囲に永久的な半透膜が形成される。一般的に、 この永久的な半透膜は、該一時的に形状を保持するカプセルを、その封入材料の 官能基と反応してこれを架橋し、膜を形成するようなポリマー成分を含んだ物質 と接触させることにより形成される。一つの態様において、該材料が酸基を含む とき、該永久的な半透膜の形成には、この一時的に形状を保持するカプセルを、 該酸基と反応するアミンまたはイミン基のようなポリマー性成分を含む物質と接 触させることが含まれる。一つの態様において、一時的に形状を保持するカプセ ルが酸基と反応ずる成分を含む物質と接触されるとき、該物質はポリアミノ酸、 例えばポリ−Ｌ−リジンである。 上記で述べたマイクロカプセルの形成は当業者に周知であり、更に、1993年７ 月13日にウエーバー等に対して発行された米国特許第5,227,298号に開示されて おり、その内容は、ここでの引用により本明細書の一部とされる。 本発明の半透性容器の透過性は、当業者に公知の手段によって変更してもよい 。透過性は、当業者に公知の因子に基づいて選択すればよい。このような因子に は、収容すべきコア材料の大きさと；コア材料が生存可能な組織または細胞を含 むならば、生存可能な組織または細胞生存するために必要とされ、従って半透性 容器を通過することが要求される何れかの物質の大きさと；収容された生存可能 な組織または細胞によって分泌され、半透性容器を通過することを意図した何れ かの生物学的活性物質の大きさと；コア材料の免疫原性が含まれるが、これらに 限定されるものではない。例えば、略68,000の分子量を有するアルブミンが、或 る細胞を生存させるために必要とされるであろう。従って、このような細胞を収 容した半透性容器は、少なくとも略68,000の分子量を有する物質に対して透過性 でなければならない。もう一つの例として、生存可能な組織または細胞によって 分泌された生物学的活性物質は、典型的には約5000〜約6000の分子量を有する。 従って、もしこのような生物学的活性物質が当該容器を透過することが望ましい のであれば、このような生物学的活性物質を分泌する組織または細胞を収容する 半透性容器は、少なくとも約5000〜約6000の分子量を有する物質に対して透過性 でなければならない。ここで用いる「生物学的活性物質」とは、器官内で効果を 奏する何れかの物質、例えばインスリンである。更なる例として、もしコア材料 がそれを移植すべき患者において免疫反応を誘起し易いのであれば、当該半透性 容器を免疫因子に対して不透過性とするのが望ましい。ここで用いるとき、免疫 因子とは、免疫原を有する物質を破壊するために、該免疫原に応答して動物が産 生する何れかの細胞または物質である。免疫因子の例には、Ｔリンパ球のような 免疫細胞；免疫グロブリン；および補体タンパクが含まれるが、これらに限定さ れるものではない。最も小さい公知の免疫因子であるＩｇＧの大きさは、分子量 で略160,000である。従って、分子量が略160,000の物質に対して不透過生の半透 性容器は、免疫因子に対して十分に不透過生であろう。「免疫原」の用語は、患 者の中で免疫反応を誘起する全ての物質、例えば抗原または抗原上の特定のエピ トープを意味する。 生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する本発明の方法の一態様に おいて、該生存可能な組織または細胞は哺乳類のものである。 当該方法の他の態様において、前記生存可能な組織または細胞は、生物学的活 性物質を分泌することが知られている生存可能な組織または細胞を含んでいる。 生物学的活性物質は当業者に公知であり、ホルモン；神経伝達物質；および成長 刺激因子、血液凝集因子および免疫刺激因子のような生物学的機能に必要とされ る因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。生存可能な組織または 細胞は、本来的に、即ちその天然の状態出生物学的活性物質を分泌するものであ ってもよく、或いは、生物学的活性物質を分泌するように遺伝子加工されたもの でもよい。生物学的活性物質は、その作用部位がその分泌位置に対して比較的近 接している物質であってもよく、或いは、体液生物質、即ち、その作用部位が分 泌される位置から比較的離間している物質（該物質は生物の循環系を介して前記 作用部位に到達する）であってもよい。 前記生存可能な組織または細胞が生物学的活性物質を分泌するとき、一つの実 施例では、それらは内分泌系の組織または細胞である。内分泌系の組織および細 胞は当業者に公知であり、膵島、肝細胞、副甲状腺細胞または脳下垂体細胞であ る。 生存可能な組織または細胞が生物学的活性物質を分泌する他の実施例において 、前記生存可能な組織または細胞は神経外胚葉細胞である。神経外胚葉細胞の例 には副腎細胞およびリンパ球が含まれるが、これらに限定されるものではない。 本発明はまた、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を患者に移植する方法 であって、（ａ）ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、上記の方法に従っ て半透性容器内に収容することと；（ｂ）こうして得た収容された細胞生存可能 な組織または細胞を患者に移植することにより、ドナー由来の生存可能な組織ま たは細胞を患者に移植することとを具備した方法を提供する。 本発明の方法では、収容された生存可能な組織または細胞をステップ（ｂ）で 移植するために如何なる移植方法を用いてもよく、このような方法は当業者に周 知である。この収容された生存可能な組織または細胞を移植する方法の例には、 当該収容された生存可能な組織または細胞を患者に注入すること、または収容さ れた生存可能な組織または細胞を外科的に患者に移植することが含まれるが、こ れらに限定されるものではない。生存可能な組織または細胞が注入によって患者 の中に導入されるとき、該注入は皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射または静脈 内注射であり得る。 収容された生存可能な組織または細胞は、患者の如何なる部位に移植されても よい。収容された生存可能な組織または細胞が移植され得る部位は、当業者に公 知の因子に基づいて決定すればよい。このような因子には、患者に移植される半 透性容器の量および患者に移植される半透性容器の脆弱性、並びに、収容された 生存可能な組織または細胞が患者に影響を与えることを意図した生物学的活性物 質を分泌するときは、その生存可能な組織または細胞によって分泌される物質が 体液性物質であるかどうか、或いは当該物質がその目的とする影響を誘起するた めに患者の特定の部位に対して比較的近接していなければならないものであるか どうかが含まれるが、これらに限定されるものではない。比較的大量の半透性容 器が患者に移植される場合、かかる量は患者の腹膜に効果的に移植され得る。さ もなくば、内圧が移植された半透性容器を損傷するのには不十分であるような、 患者の如何なる部位を選択してもよい。例えば、移植部位は、患者がヒトであれ ば、大腿または腋窩のような脂肪組織の存在する部位であればよい。 ドナー由来の生存可能な組織または細胞を患者に移植する上記方法の一態様に おいて、この生存可能な組織または細胞は、患者に影響を与えることを意図した 生物学的活性物質を分泌することが知られている生存可能な組織または細胞を含 んでいる。生物学的活性物質を分泌することが知られている生存可能な組織また は細胞は、上記のように当該技術において公知である。生存可能な組織または細 胞が生物学的活性物質を分泌することが知られている上記方法の一つの態様にお いて、この生存可能な組織または細胞は内分泌系の組織または細胞である。内分 泌系の組織および細胞は、上記で述べたように当業者に公知である。生存可能な 組織または細胞が生物学的活性物質を分泌することが知られている上記方法の他 の態様において、この生存可能な組織または細胞は、神経外胚葉の組織または細 胞である。神経外胚葉の組織および細胞は、上記で述べたように当業者に公知で ある。 生存可能な組織または細胞は、種々の疾患に罹患した患者に対して、かかる患 者を治療するために、本発明の方法に従って移植され得る。例えば、肝細胞を血 友病患者に移植して、血液凝集因子を放出させてもよい。本発明に従って膵島を 糖尿病患者に移植し、血糖グルコースレベルを調節してもよい。成長ホルモンの ような特定のタンパクを発現するように加工された遺伝子をトランスフェクトし た細胞を、本発明に従って当該タンパクの欠乏した患者に移植してもよい。顆粒 球マクロファージ刺激因子を分泌することが予め決定されたクローン化細胞を、 本発明に従い、化学療法で治療されている患者に移植して、該薬物に伴う副作用 を増大することなく、より多くの化学療法薬剤を患者に投与することを可能にし てもよい。 本発明は更に、腫瘍に冒された患者を治療するために有用である。例えば、腫 瘍の増殖を阻害するために、ガンマ−インターフェロンの分泌のために予め選択 された細胞を、体腫瘍に冒された患者に移植してもよい。また、腫瘍に冒された 患者から該腫瘍細胞を取り出し、サイトカインのような増殖因子を発現する遺伝 子をトランスフェクトし、続いて本発明の方法に従って患者に逆移植して、患者 の中で腫瘍細胞に対する免疫応答を誘起させてもよい。 一定のホルモン欠乏を患っている患者を、本方法に従って治療してもよい。例 えば、コルチゾン欠乏の患者に副腎組織はたは細胞を移植してもよい。同様に、 副甲状腺の組織または細胞を、甲状腺欠乏患者に移植してもよい。黄体形成ホル モンまたは卵胞刺激ホルモンのようなホルモンを分泌する脳下垂体の組織または 細胞を、患者の不妊症を治療するために、または閉経に伴う副作用を低減するた めに、本方法に従って患者に移植してもよい。 更に、神経伝達物質を分泌する脳の組織または細胞は、本発明の方法に従って 移植すれば、精神分裂病のような一定の疾患を治療するために有用であり得る。 他の例として、疼痛を患っている患者の痛みを除去するために、エンドルフィン を分泌する組織または細胞を移植してもよい。 本発明の方法における患者は、如何なる患者であってもよい。一つの態様にお いて、該患者は哺乳動物である。更なる態様において、該患者はヒトである。 本発明は更に、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、該生存可能な組織 または細胞を患者の免疫系による破壊から保護するように、患者に移植する方法 であって：（ａ）生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する本発明の 方法に従って、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、免疫因子を透過させ ない半透性容器内に収容することと；（ｂ）こうして得た収容された組織または 細胞を患者の中に移植することにより、前記ドナー由来の生存可能な組織または 細胞を患者に移植することとを具備した方法を提供する。 ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、該生存可能な組織または細胞を患 者の免疫系による破壊から保護するように患者に移植する本発明の方法の一つの 態様において、該患者は哺乳動物、例えばヒトである。生存可能な組織または細 胞が患者の免疫系による破壊から保護される本発明の方法において、前記ドナー および患者は異なった種であってもよい。或いは、前記ドナーおよび患者は同一 種または類似種であってもよい。本発明の一態様において、前記ドナーおよび患 者は両者共に哺乳類である。ドナーおよび患者が両者共に哺乳類である一態様に おいて、患者はヒトである。 ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、該生存可能な組織または細胞を患 者の免疫系による破壊から保護するように患者に移植する本方法においては、如 何なる生存可能な組織または細胞をドナーから患者に移植してもよい。一つの態 様において、生存可能な組織または細胞は膵島を含んでいる。 従って、本発明はまた、糖尿病に罹っている患者を治療する方法であって、ド ナー由来の生存可能な組織または細胞を患者の免疫系による破壊から保護するよ うに患者に移植する上記方法に従って、或る量の生存可能な膵島を患者に移植す ることを具備し、この移植される生存可能な膵島の量は、糖尿病を治療するため に有効な量である方法を提供する。 本発明の方法において、糖尿病を治療するのに有効な生存可能な膵島の量は、 当業者に公知の因子に基づいて決定される。このような因子には、治療される患 者の大きさおよび移植される各膵島により産生されるインスリンの量が含まれる が、これらに限定されるものではない。 本発明はまた、生存可能な組織または細胞を前処理する本発明の方法に従って 前処理された、生存可能な組織または細胞を提供する。本発明は更に、生存可能 な組織または細胞を半透性容器内に収容する本発明の方法に従って、半透性容器 内に収容された生存可能な組織または細胞（マイクロカプセル内に収容された生 存可能な組織または細胞を含む）を提供する。 本発明は、以下の「実験の詳細」の章を参照することによって、より良く理解 されるであろう。しかし、当業者は、そこで述べられる特定の方法および結果は 、後述の請求の範囲において更に完全に記述される本発明を例示しているに過ぎ ず、本発明を限定するものでないことを容易に理解するであろう。 〔実験の詳細〕 我々は、主題発明の方法に従って前処理された膵島を含む一重壁および二重壁 のマイクロカプセルをマウスに移植し、そのマウス中での生存率を、前処理無し でマイクロカプセル化した膵島と比較した。膵島は、ラット、ウサギ、ウシ、イ ヌ、およびヒト等のドナー種から入手した。 膵島前処理 膵島は、ハンクの平衡塩溶液で洗浄され静置された。過剰のハンク溶液を除去 して、膵島のペレットを約２ｃｃのハンク溶液中に残存させた。その後、13.5ml の塩化ナトリウム中の２％アルギン酸ナトリウム溶液1.5mlを添加し、アルギン 酸塩の最終濃度を0.2％にした。膵島をこの溶液中で１０分間攪拌した。その後 、膵島を2000RPMで３分間遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を生理食塩水中 で３回洗浄して、通常生理食塩水0.2cc中に再懸濁した。1.1％の塩化カルシウム １５ｍｌを該再懸濁液中に添加し、該膵島を再び１０分間インキュベートした。 その後、膵島を通常生理食塩水で二回洗浄した。その結果、各膵島の周りに付着 した幾分かのアルギン酸塩、つまり架橋結合したアルギン酸塩の薄層によって、 膵島の表面は毛羽だった外観を呈した。その後、これらの前処理された膵島は、 「一重壁」又は「二重壁」のいずれかのマイクロカプセルへと加工された。 マイクロカプセル化 我々のマイクロカプセル化方法は、リーチ（Reach et al.）らの先般公表され た方法から適用された（２０，２１）。我々の方法を完全に記載したものは、数 回出版されている（２，１０，２３，４５，５５）。 簡略に言うと、単離された膵島を、生理食塩中1.85％-2.0％のアルギン酸ナト リウム中に懸濁し、２２ケージのエアージェット針を通しての押出によって、ア ルギン酸塩中に膵島を含む液滴を製造した。膵島を含むアルギン酸塩の液滴は、 生理食塩水中1.1％塩化カルシウムを含むビーカー中に注入された。 マイナスに帯電したアルギン酸塩の液滴は、カルシウムと結合してアルギン酸 カルシウムゲルを形成した。ゲル化した液滴は瓶に移され、続いてカルシウム中 で１０分間インキュベートされた。 その後、より希薄な塩化カルシウム溶液で連続的に洗浄した後、生理食塩水中 で最終洗浄し、その後0.5mg/mlのポリＬリジンを添加し、続いて６分間インキュ ベーションを行なって、プラスに帯電したポリＬリジンでカルシウムイオンを置 換させ且つマイナスに帯電したアルギン酸塩と結合させて、ポリ電解質膜を生成 させた。我々は、18-25,000の分子量のポリＬリジンを使用した。ポリＬリジン のインキュベーションに続き、マイクロカプセルを0.1％のＣＨＥＳで洗浄し、 最終濃度0.185％-0.2％のアルギン酸ナトリウム溶液を添加して、アルギン酸ナ トリウムの薄い外側皮膜を形成した。最終的に、カプセルを５５mMのクエン酸ナ トリウム中でインキュベートし、ポリＬリジンとは反応しなかったアルギン酸カ ルシウムを全て溶解した。 二重壁マイクロカプセルを形成するために、上記方法によって一重壁を完成さ せた後、クエン酸ナトリウムインキュベーションを行う前に、更にポリＬリジン を添加して第二のインキュベーションを６分間行い、続いて0.1％ＣＨＥＳ中で 洗浄し、希釈率0.185％-0.2％のアルギン酸ナトリウム中でもう一回再インキュ ベーションを行ない、次に最終のクエン酸ナトリウム・インキュベーションを行 った。数個の二重壁マイクロカプセルについては、単離された膵島は、最初に生 理食塩水中に1.85％のアルギン酸ナトリウムではなく、2.0％のアルギン酸ナト リウムを含む溶液中に懸濁された（図１、９Ａおよび９Ｂ参照）。 結 果 結果を表１および表２に示した。 考 察 一重および二重壁マイクロカプセルは共に、月齢６ヶ月を上回る前糖尿病ＮＯ Ｄマウス中で生体適合性を示した。破壊されたマイクロカプセルの周りには、時 折炎症反応があったが、無傷のマイクロカプセルの周りには何の反応もなかった 。７５％の空の一重壁マイクロカプセルが、６ヶ月後（平均２つの別々の実験を 行い、各実験に５ＮＯＤｓを使用）に回収された。二重壁マイクロカプセルにつ いては、６ヶ月後に７８％および８１％（平均２つの別々の実験を行い、各実験 に５ＮＯＤｓを使用）が回収された。一重壁マイクロカプセルは直径約700-800 ミクロンであり、回収された際には、外形が幾分不規則であった。一方、二重壁 マイクロカプセルは、直径約500ミクロンと小さく、見た目が厚く、膜は無傷で あった（参照番号５５参照）。更に、二重壁技法でカプセル化されてＮＯＤマウ ス内に移植されたラットの膵島は、一重壁技法でカプセル化された同じ膵島より も、かなり長い期間作用した（19.1±2.8日対12.6±1.2日）（表１）。この二重 壁技法は、既に特許されている（合衆国特許第5,227,298号）。不幸にも偶々拒 絶が起こったときは、一重壁マイクロカプセルで言及したと同様のＮＯＤマウス のポスト細胞反応が、拒絶された二重壁マイクロカプセルの周りに見られた。 一重壁でカプセル化された膵島に対比して、二重壁でカプセル化された膵島を 与えたＮＯＤｓにおける膵島の異種移植生存の改善は、穏やかではあったが統計 学的には有為であった。一重壁および二重壁のマイクロカプセルは共に、一方向 の混合されたリンパ球反応性を劇的に減少させた（23）。しかしながら、ＩｇＧ は、一重壁中にも二重壁マイクロカプセル中にも侵入したのに対して、ＩｇＭは 排除された（１０，１２，４５）。 本発見は全く予想外のことであった。というのは、グーセン（Goosen），キン グ（King），ヘール（Halle）らおよびダルクイ（Darguy）による研究は全て、 分子量17-25ＫのポリＬリジンで（我々が行ったように）作成された従来のマイ クロカプセルによって、IgGが排除されることを示唆していたからである（２０ ，２４，７１，７６）。 文献によると、ポリＬリジン（浸透性＜ＩｇＧ）（150.000分子量）は最適で あったので、他の必須試薬であるアルギン酸塩の濃度を再評価することを我々は 選択した。我々は、アルギン酸塩の濃度を1.85％から２％へと増加させ、効果を テストした。そして、この単純な技術的変更によって、ＩｇＧを排除するポリＬ リジンアルギン酸マイクロカプセルが産生され、カプセル化されたラットの膵島 の生存が19.1±2.8％日から86±23.5日まで伸びた事が分かった（表１）。 二重壁２％技法による移植が偶々失敗した時にはカプセルの破壊が見られ、そ れと共に、破壊されたカプセルに対して反応が見られ、無傷のカプセルに対して は何の反応も見られなかった。更に、一重壁および二重壁技法の両方でカプセル 化した膵島を組識学的および位相差顕微鏡的に評価すると、30-50％のカプセル が、マイクロカプセル壁に埋め込まれた少なくとも一つの膵島を持っており、そ の部位で壁が幾分変形を起こしていることが解明された。 このように、我々は、ポリＬリジンアルギン酸塩のマイクロカプセルの壁の中 に膵島および単一の肝細胞が同様に取り込まれるのを発見したデボス（deVos） （７７）の発見、チャンら（Chang et al.,）（２７，６９，７０）による先の 研究報告を立証した。別の研究者が何人か、実験室での膵島のカプセル化の例を 公表しているが、マイクロカプセル壁内に捕捉された膵島に言及したものはない のは興味深い（６，２１，２４）。チャンは、最初に調製した細胞を含む小さな アルギン酸カルシウムのビーズを、はるかに大きなマイクロカプセル内に捕捉し 、これによってより大きな第二のマイクロカプセル内に細胞が取り込まれるのを 防ぐ技法の特許化と公表を続けて行なった（図１参照）。 我々は、この技法を膵島のカプセル化に応用することを試み、これらの「マク ロカプセル」が壊れやすく、測定すると約1,500-2,000ミクロンの非常に大きな 物であることを発見した。チャンの技法で作成された大きなマイクロカプセル中 に入れたラットの膵島を、Ｂ１０又はＮＯＤマウスのどちらかに移植した予備研 究は失敗し、組織学的評価によって、カプセルはインビボ（in vivo）で、２− ３日内で崩壊していたことが分かった。そこで、我々はチャンの方法を捨て、マ イクロカプセルの壁内に細胞が取り込まれるのを防止できるかも知れない別の方 策を探求した。 我々は、二重壁技法による我々の発見を再解釈し、ポリＬリジン・アルギネー トの特別な層が、一重壁の膜内に最初に取り込まれた膵島に更に覆いを掛けるこ とになって、一重壁のマイクロカプセルにある程度の厚さおよび耐性を与えるの ではないかと仮定した。この解釈は、二重壁および一重壁のマイクロカプセル両 者が偶発的に縮小することとも符合した。というのは、両カプセルは高パーセン テージ（我々の経験では、30-50％）で、カプセルの壁の構造に同じような特有 の欠陥をもっていたからである。 デボスら（７７）は、カプセルの壁から突出しているか又はカプセルの壁内に 取り込まれている膵島の数は、カプセルのサイズが800ミクロンの時に最小であ り、それより大きいか又は小さい直径のカプセルでは、より多くの数の膵島が突 出しているのが観察されたと示唆していた。また、彼らによって、突出が、高濃 度のグロン酸配合アルギン酸塩（３％,Manugel,Kelco International）により少 なくなることが観察された。 最初は彼らの報告に気づかず、我々は別の方向を選択した。カプセル化プロセ スを開始する前に、希釈アルギン酸塩中で膵島を予備インキュベーションすると 、カプセルの壁に膵島が取り込まれるのが防止されるのではないかと思い、ここ に記載した本発明の予備処理方法を発見した。 本発明の予備処理方法を使用し、共焦点顕微鏡および位相差顕微鏡によって、 ５％未満のカプセルのみが、カプセルの壁に埋め込まれた膵島を含んでいたこと に注目した（図５、図６および図８）。今日まで、前処理技法によってラットの 膵島のＮＯＤ移植の生存に増加が見られたけれども、移植の機能的生存には幾分 変動があった（表１、表２）（図８参照）。 我々は、別の膵島のドナー源、ウサギによってこの技法を評価し、二つの興味 ある結果を見出した。まず、二重壁の２％アルギン酸塩技法によりＮＯＤ中にあ るラビットの膵島が保護される効果は、ＮＯＤ中のラットの膵島が保護される効 果よりもはるかに低い（ウサギ対ＮＯＤでは18.2±1.9日、これに対してラット 対ＮＯＤでは86±23.5日）（表１）。一方、ウサギの膵島を予備処理して二重壁 ２％カプセル化を行うと、予備処理なしの二重壁2.0％技法と比べて、ウサギ膵 島のＮＯＤへの移植生存が、統計学的有為性をもって延長される結果となった（ 30.75±5.6対18.2±1.9日）（表１）。 膵島の異種移植の報告書類では、多くの場合、同じ齧歯類のドナー・レシピエ ントの組み合せ、通常、ラット対マウスが研究されていた。NOSマウス中に、よ り大きな動物の膵島を異種移植する比較研究は有益であり、もしかすると、より 臨床学的に意義あるものではないかと仮定した。我々は、ＮＯＳにおけるヒト、 イヌ、ブタ、ウシ、ラット、およびマウスの膵島の機能を比較することを選択し た。ヒトおよびイヌの膵島は、リコルデイ(Ricordi)、リロ(Rilo)、ラヨッテ(Ra jotte)博士によって（夜間空輸によって）提供された。ブタの膵島は、リコルデ イの方法によって単離された(８６，１０)。牛新生児の膵島は、ジアナレリ(Gia nnarelli)（８７）の方法によって単離された（平均25,000島／膵臓；Ｎ＝３） （ＮＯＤ中インビボ（in vivo）でグルコースに反応性である）。ウサギの膵島 は、ボス（Vos）（88）の技法と同様な方法で、3,246±1571膵島／膵臓、の収量 で単離された（平均±Ｓ．Ｄ．）（Ｎ＝２０）。 ＮＯＤ中におけるカプセル化された膵島の生存には、明らかな階層分け：ラッ ト−ＮＯＤ＝86±23日，バルブマウス（Balb/C）-NOD=51±35日、ウサギ−ＮＯ Ｄ＝18.2±7日、ウシ−ＮＯＤ＝21日（Ｎ＝１）、イヌ−ＮＯＤ＝14±4日、ブタ −ＮＯＤ＝6および9日（Ｎ＝２）、ヒト＝6日（Ｎ＝１）（表２参照）があるこ とが分かった。異種移植拒絶時に、マイクロカプセルを生検すると、強力なＮＯ Ｄカプセル周辺細胞反応があることが分かった。これらの結果によって、種々の ドナー特異的抗原が分泌されているかも知れないこと、および／または抗原呈示 および／またはエフェクター反応の機構の違いが関与することが示唆される。前 糖尿病ＮＯＤドナー由来で、糖尿病ＮＯＤレシピエントに同系移植されたカプセ ル化膵島は、48±7日（表２）で拒絶された。生検では、カプセル周辺細胞反応 は最小で、無傷のカプセル内における非生存膵島の存在が解明された。遊離腹膜 細胞の数の増加があったが、これはまだ特徴づけがなされていない。このように 、同系移植の拒絶は、このモデルにおいては異種間および異型移植の拒絶とは異 なる。 マイクロカプセルから分泌されたドナー関連抗原を確認するアプローチの一つ は、膵島以外の細胞をカプセル化し、（ＮＯＤに対して）移植することである。 このような組織源としては副甲状腺があげられる。我々は、ヒト副甲状腺細胞が 培養基中にそのカプセル化を促進する「オーガノイド」を形成する事を見つけた （図１０参照）。 このデータによって、上記で説明し且つ請求の範囲に記載したようにドナー膵 島を前処理することよって、マイクロカプセル内に膵島を封入する標準方法が改 善されることがわかる。該データによって、ＮＯＤ中におけるカプセル化された 膵島の不一致（無関連）異種移植と一致異種移植の生存には対比すると差がある こともわかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/39 ＡＤＰ Ａ６１Ｋ 35/39 ＡＤＰ 35/407 35/407 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 11/04 11/04 5/00 Ｅ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．半透性容器内に収容すべき生存可能な組織または細胞を前処理する方法で あって： （ａ）ゲルを形成できる物質を含有し、前記生存可能な組織または細胞に 対して生理学に適合する溶液中に、生存可能な組織または細胞を懸濁させること と； （ｂ）得られた懸濁液を、前記物質がゲルを形成する条件下で処理するこ とにより、半透性容器内に収容すべき生存可能な組織または細胞前処理すること とを具備した方法を提供する。 ２．請求項１に記載の方法であって、前記ゲルを形成できる物質が酸基を有す るガムである方法。 ３．請求項２に記載の方法であって、前記ゲルを形成できる物質がアルギン酸 アルカリ金属塩である方法。 ４．請求項３に記載の方法であって、前記懸濁液を処理する前の懸濁液中にお ける前記アルギン酸アルカリ金属塩の最終濃度が０％〜約２％である方法。 ５．請求項４に記載の方法であって、前記懸濁液を処理する前の懸濁液中にお ける前記アルギン酸アルカリ金属塩の最終濃度が約０％〜約１％である方法。 ６．請求項５に記載の方法であって、前記懸濁液を処理する前の懸濁液中にお ける前記アルギン酸アルカリ金属塩の最終濃度が約０％〜約0.5％である方法。 ７．請求項５に記載の方法であって、前記懸濁液を処理する前の懸濁液中にお ける前記アルギン酸アルカリ金属塩の最終濃度が約0.2％である方法。 ８．請求項２に記載の方法であって、ステップ（ｂ）における懸濁液の処理に は、該懸濁液を、多価陽イオンを含有する溶液と接触させることが含まれる方法 。 ９．請求項８に記載の方法であって、前記多価陽イオンがカルシウム陽イオン である方法。 １０．生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する方法であって： （ａ）請求項１に記載の方法に従って生存可能な組織または細胞を前処理 して、前処理された生存可能な組織または細胞を得ることと； （ｂ）この前処理された生存可能な組織または細胞の回りに半透性容器を 形成することにより、該生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容するこ と とを具備した方法。 １１．請求項１０に記載の方法であって、前記半透性容器は免疫因子に対して 不透過性である方法。 １２．請求項１１に記載の方法であって、前記半透性容器は中空繊維、プラス チック膜およびマイクロカプセルである方法。 １３．請求項１２に記載の方法であって、前記半透性容器はマイクロカプセル である方法。 １４．請求項１３に記載の方法であって：半透性容器の形成は、 （ａ）前処理された生存可能な組織または細胞を、ゲルを形成できる材料 を含有し且つ生存可能な組織または細胞と生理学的に適合する溶液中に懸濁させ ることと； （ｂ）得られた懸濁液を、該組織または細胞を封入するのに十分な大きさ の液滴に形成することと； （ｃ）得られた液滴を、上記材料をゲル化させる条件下で処理して、一時 的に形状を保持するカプセルを形成することと； （ｄ）得られた一時的に形状を保持するカプセルの周りに、永久的な半透 膜を形成すること とを具備する方法。 １５．請求項１４に記載の方法であって、前記材料が酸基を有するガムである 方法。 １６．請求項１５に記載の方法であって、前記物質はアルギン酸アルカリ金属 塩である方法。 １７．請求項１５に記載の方法であって、前記液滴の処理には、前記液滴を多 価陽イオンを含む溶液と接触させることが含まれる方法。 １８．請求項１７に記載の方法であって、前記液滴の処理には、前記液滴をカ ルシウム陽イオンを含む溶液と接触させることが含まれる方法。 １９．請求項１５に記載の方法であって、前記永久的な半透膜の形成には、前 記一時的に形状を保持するカプセルを、前記酸基と反応する物質を含むポリマー に接触させることが含まれる方法。 ２０．請求項１９に記載の方法であって、前記ポリマーがポリアミノ酸である 方法。 ２１．請求項１４に記載の方法であって、前記得られたマイクロカプセヤルを 更に処理することにより、該マイクロカプセルの周りに永久的な第二の半透膜が 形成される方法。 ２２．請求項１０に記載の方法であって、前記生存可能な組織または細胞が哺 乳類のものである方法。 ２３．請求項１０に記載の方法であって、前記生存可能な組織または細胞が、 生物学的活性物質を分泌することが知られている生存可能な組織または細胞を含 む方法。 ２４．請求項２３に記載の方法であって、生物学的活性物質を分泌することが 知られている前記生存可能な組織または細胞が、内分泌系の組織または細胞であ る方法。 ２５．請求項２４に記載の方法であって、前記内分泌細胞が膵島細胞、肝細胞 、副甲状腺細胞または脳下垂体細胞である方法。 ２６．請求項２３に記載の方法であって、前記生存可能な組織または細胞が、 神経外外胚葉の組織または細胞である方法。 ２７．請求項２７に記載の方法であって、前記神経外胚葉細胞が副腎細胞また はリンパ球である方法。 ２８．ドナー由来の生存可能な組織または細胞を患者に移植する方法であって ： （ａ）ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、請求項１０に記載の方 法に従って半透性容器内に収容することと； （ｂ）こうして得た収容された細胞生存可能な組織または細胞を患者に移 植することにより、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を患者に移植するこ と とを具備した方法。 ２９．請求項２８に記載の方法であって、前記生存可能な組織または細胞が、 生物学的活性物質を分泌することが知られている生存可能な組織または細胞を含 んでいる方法。 ３０．請求項２９に記載の方法であって、生物学的活性物質を分泌することが 知られている前記生存可能な組織または細胞が、内分泌細胞である方法。 ３１．請求項３０に記載の方法であって、前記内分泌細胞が膵島細胞、肝細胞 、副甲状腺細胞または脳下垂体細胞である方法。 ３２．請求項２９に記載の方法であって、生物学的活性物質を分泌することが 知られている前記生存可能な組織または細胞が、神経外胚葉細胞である方法。 ３３．請求項３２に記載の方法であって、前記神経外胚葉細胞が副腎細胞また はリンパ球である方法。 ３４．請求項２８に記載の方法であって、前記患者はヒトである方法。 ３５．ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、該生存可能な組織または細 胞を患者の免疫系による破壊から保護するように患者に移植する方法であって： （ａ）生存可能な組織または細胞を半透性容器内に収容する請求項１１に 記載の方法に従って、ドナー由来の生存可能な組織または細胞を、免疫因子を透 過させない半透性容器内に収容することと； （ｂ）こうして得た収容された組織または細胞を患者の中に移植すること により、前記ドナー由来の生存可能な組織または細胞を患者に移植すること とを具備した方法を提供する。 ３６．請求項３５に記載の方法であって、前記患者がヒトである方法。 ３７．請求項３６に記載の方法であって、前記ドナーが哺乳動物である方法。 ３８．請求項３５に記載の方法であって、前記ドナーおよび前記患者が異なっ た種である方法。 ３９．請求項３８に記載の方法であって、前記ドナーおよび患者の両者が哺乳 動物である方法。 ４０．請求項３５に記載の方法であって、前記生存可能な組織または細胞が膵 島を含んでいる方法。 ４１．糖尿病に罹っている患者を治療する方法であって、請求項４０に記載の 方法に従って、ドナー由来の或る量の生存可能な膵島を患者に移植することを具 備し、この移植される生存可能な膵島の量は、糖尿病を治療するために有効な量 である方法。 ４２．請求項１に記載の方法に従って前処理された、生存可能な組織または細 胞。 ４３．請求項１０に記載の方法に従って半透性容器内に収容された、生存可能 な組織または細胞。 ４４．請求項１３に記載の方法に従ってマイクロカプセル内に収容された、生 存可能な組織または細胞。