JPH11514218A

JPH11514218A - 診断および治療監視のための分子マーカーとしての活性化し得る代謝酵素の錯体結合された阻害剤

Info

Publication number: JPH11514218A
Application number: JP9511588A
Authority: JP
Inventors: ノヴァク、ゲーツ; ブーハ、エルケ; バルディンガー、フェレーナ
Original assignee: マックス−プランク−ゲゼルシャフトツールフェルデルングデアヴィッセンシャフテンエー．ファウ．，ベルリン
Priority date: 1995-09-13
Filing date: 1996-08-01
Publication date: 1999-12-07
Also published as: EP0864092B1; ES2165513T3; WO1997010509A1; ATE208504T1; US6051390A; DE19533817A1; CA2231354A1; DE59608163D1; DK0864092T3; EP0864092A1; DE19533817C2

Abstract

(57)【要約】本発明は、活性化し得る代謝酵素の診断のためにこの酵素の活性化を決定するための分子マーカーとしての、高分子量担体に結合された、該酵素の阻害剤の使用に関する。本発明は、特に、凝固診断および治療監視において凝固活性化を決定するための分子マーカーとしての、高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤の使用に関する。本発明は、好ましくは凝固診断および治療監視のための分子マーカーとしての、デキストラン−ヒルジンまたはＰＥＧに結合されたヒルジンの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】診断および治療監視のための分子マーカーとしての活性化し得る代謝酵素の錯体結合された阻害剤本発明は、活性化し得る或いは活性化された代謝酵素の診断または治療監視の目的でこの酵素の活性化を決定するための、分子マーカーとしての高分子量担体に結合された、該酵素の阻害剤の使用に関する。本発明は、特に高分子量担体に結合された、血液凝固カスケードの活性化生成物または活性化フィブリン溶解酵素の阻害剤の使用に特に関する。本発明は、好ましくは高分子量担体に結合され、凝固診断および治療監視において凝固活性化を決定するための分子マーカーとして用いられるトロンビン阻害剤の使用に関する。本発明は、特に、凝固活性化を決定するための分子マーカーとしての錯体結合されたヒルジン（ＣＢＨ）に関する。多くの代謝生理学的工程は、場合によっては分岐し、そして一連の活性化し得る酵素を介して反応開始剤もしくは連鎖反応を強める働きを持つカスケードメカニズムを介して制御されている。例えば、上記の如きメカニズムは、グリコーゲン代謝の制御、細胞外信号の伝達、および特に血液凝固において効果的である。分子レベルにおいて、カスケードメカニズムに含まれるファクターの断続するリン酸化反応はしばしばこの時点で認識される。このメカニズムによる反応開始剤の強化は、それら自身もしばしば酵素である複数の基質分子を改質させることができるメカニズムの複数の異なる段階に関わる酵素による。上記の如きメカニズムの活性化された酵素は、各患者の体内において進行する活性化反応を決定するための分子マーカーとして好適である。上記の如き過程において、永続的診断系統などに供給されるべき主要な各活性化酵素の特定の親和性の高い阻害剤が使用される。しかしながら、この分子マーカー原理と呼ばれるものは、これまでは不十分に展開されてきただけであった。血液凝固の脈管内活性反応を決定するために適する分子マーカーの探索は数年に亘って鋭意に検討された。この仕事の過程において、凝固活性化の一連の代謝生成物が分子マーカーとして浮上してきた。これら代謝生成物は、プロトロンビンＦ１＋２断片、血小板因子ＩＶ、そしてフィブリノペプチドＡおよびＢだけでなく、フィブリン溶解によって生成されるフィブリン分解による一部の分裂生成物（例えばｄ−二量体類）から成り、そしてＴＡＴ錯体として知られる、天然の抗トロンビンとセリンプロテアーゼトロンビンとの間に形成される錯体から同様に成る。これらの分子マーカーの有用性は大規模な臨床研究において分析されてきた。血栓症発生もしくはトロンボ−陥入疾病中に確実に増加もしくは持続する、この種の分子マーカーの血液水準を決定することは可能であることが一般に確認されている。しかしながら、これらのマーカーの効率には改善の余地がかなり存在する。静脈血栓症もしくは動脈血栓症閉塞疾病を患う臨床患者においては、凝固に対し最も敏感なマーカーの応答容量、つまりプロトロンビン断片Ｆ１＋２は２０％未満であった。さらに、トロンボ−陥入疾病もしくは血栓症発生の重度とこの場合および他の分子マーカーの血液水準の大きさとの間に相関関係は見出せなかった。この種の疾病を患っている患者の経験から、止血学(haemostaseology)においてマーカーの実際の血液水準を決定することによって凝固活性化の強度についての結論を導き出し得る分子測定の原理はこれまで存在しなかったことが導き出される。この原因は、体内に自然に発生する凝固酵素の代謝生成物としての分子マーカーが、除去メカニズムによる循環からある程度迅速に除去されることに起因する。これに関して、マーカーを、特に肝臓代謝の範囲において、関与する器官の機能に依存してある程度迅速に代謝させることを考慮しなければならない。本発明の基礎となる目的は、それ故、代謝活性化の初期段階を検知するための好感度のマーカーを同定することにある。特に、凝固活性化の初期段階を検知するための好感度のマーカーを同定することである。さらに、分子マーカーは脈管内活性化反応、特に血液凝固を決定するための広い診断範囲を有するべきである。これに関して、マーカーは、代謝過程或いは除去反応に独立にその器官内において作用すべきである。マーカーが血液循環中でのみ迅速に分散し、全く代謝をしないか或いはわずかに代謝をし、そしてゆっくりとだけ除去されることが保証されなければならない。本発明によれば、この目的は、活性化し得る代謝酵素の活性化すなわち活性を決定するための分子マーカーとしての、高分子量担体に結合された、該酵素の特定の阻害剤の使用によって達成される。驚くべきことに、高分子量担体に結合された活性化し得る代謝酵素の阻害剤、つまり代謝酵素の錯体結合された阻害剤は、血液循環中に排他的に及び迅速に分散し、その器官内ではゆっくりとだけ分解もしくは除去され、そして遊離で、結合していない阻害剤が有しているのと酵素に対するほぼ同じ親和性を有することが分かっている。この原理は、高い親和性と特定の阻害剤が有効なすべての活性化し得る主要な酵素に対して適用できる。その原理は、トロンビン、活性化ファクターＶＩＩもしくは活性化ファクターＸの如き凝固カスケードの活性化生成物に特に適しており、そして例えば組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）もしくはプラスミンの如き活性化フィブリン溶解酵素にも適している。高い親和性および特定の阻害剤によって阻害し得る代謝の他の主要な酵素の例には、アンギオテンシン変換酵素（血圧制御）もしくはエラスターゼ（ショック反応）を包含する。以下の説明は、本発明の好ましい実施態様、つまりトロンビン阻害剤の使用に関する。しかしながら、本実施例において説明される血液の治療監視のための分子マーカー原理は、活性し得る酵素および高分子量担体物質に結合された高い親和性を有する特定の阻害剤との如何なる組み合わせにも対応するように適用し得ることは理解されるべきである。驚くべきことに、高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤（錯体結合されたトロンビン阻害剤）は、血液循環中に排他的に及び迅速に分散し、その器官内でゆっくりとだけ分解もしくは除去され、そして遊離のトロンビン阻害剤が有するのとほぼ同じ親和性をトロンビンに対して常に有し、それによって治療目的に適していることが分かっている。非結合トロンビン阻害剤は、血液中だけでなく体全体に分散されるので、この種の治療に対してこれらの物質を使用することは不可能であり、消費された際には、血液中での検知可能な濃度減少を示さずに再度分散される。高い親和性の天然のトロンビン阻害剤例えばヒルジン、そしてトロンビンに対して高い親和性を有するすべての他の直接接合している合成トロンビン阻害剤は、トロンビン阻害剤として使用できる。その例には、ＰＥＧ結合された４−アミジノフェニルアラニン（ペプチドリサーチ８、Ｎｏ．２、７８−８５（１９９５））が包含される。天然または合成の物質は、高分子量担体として使用できる。その例には、ポリエチレングリコール、デキストラン、そして体内に自然に発生する血液蛋白質が包含される。その他の例には、アルブミン、γ-グロブリン、およびフェリチン、サクシニル化されたゼラチン、架橋ポリペプチド、そしてポリヒドロキシスターチが包含される。デキストラン結合（ＤＰ）されたヒルジンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合されたヒルジン、もしくは人体蛋白質と結合されているヒルジンと同様に、使用に適している。その分子の大きさのため、これらの蛋白質（アルブミン結合されたヒルジン或いは規定されたγ-グロブリンに結合されているヒルジン）は、非常にゆっくりとした生物学的除去過程を受けるだけである。この種の錯体に結合されたヒルジンは、血液中にほぼ排他的に分散され、そして細胞外の流体空間中への溢血を全く示さないという大きな利点がある。このマーカーは少量でも、血液中に分散された時に、迅速に且つ強固に結合する、脈管内的に活性化されたトロンビンもしくはプロトロンビン−トロンビン転換の活性化中間体のための、高活性阻害剤として機能し得る。活性化酵素の錯体結合されたトロンビン阻害剤との結合により、「遊離」の錯化ヒルジンの量は、活性トロンビンが循環内に発生する程度によって減じられる。ヒルジン、および高分子に結合されたヒルジンは、セリンプロテアーゼトロンビンに対して高い親和性を有する。トロンビン種だけに対するヒルジンの単一特異性は、このマーカーがその生物中のこのセリンプロテアーゼに対して活性となることだけを許容する。他の酵素との結合は不可能且つ未知である。凝固組織の主要な酵素、つまりセリンプロテアーゼトロンビンが、内因性もしくは外因性凝固の最終生成物として、永久的な凝固活性化によって生物の血液中に存在するようになる場合、血液中に存在するＣＢＨ分子マーカーによって直ちに結合され、そして失活させられる。錯体結合されたヒルジン、つまり遊離な阻害剤の量は、トロンビン−ヒルジン錯体が形成される程度によって血液中に減少する。「遊離の」分子マーカー、つまり錯体結合されたヒルジンは、急速に実行され得る、遊離なヒルジンを検知する好感度で独特な方法を用いて決定される。この検知方法を用いることによって、離散的な凝固活性化効果が検知され、そして監視を繰り返すことによって生物中で早い時点において定量化され得る。本発明による分子マーカーは、患者の体重に関して、０.００５〜０.５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０１〜０.０５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.０１〜０.０２ｍｇ／ｋｇの投与量で用いられる。それらは非経口的に、好ましくは静脈注射によって投与される。マーカーの吸収が対応する処方によって保証される経口投与も可能である。この目的のために、本発明による分子マーカーは、慣用のアジェバント物質および担体物質と共に、この投与方法に適切である処方において用いられる。このように、例えば、錯体結合されたヒルジン調合物は、冷凍乾燥調合（５ｍｌの水中に溶解されるもの；ＰＥＧ−ヒルジン、アルブミン−ヒルジン、γ−グロブリン−ヒルジン）で或いは即使用可能な注射溶液（例えば、５ｍｌ；ゼラチン−ヒルジン、ヒドロキシ−スターチ−ヒルジン）として調製可能であり、ここでヒルジンの含有量は１アンプル当たり約５ｍｇのヒルジンである。使用に必要な投与量は以下の式によって算出され、そして静脈注射用濃縮塊として投与される。本発明を、以下の実施例を参照しながら更に詳しく説明する。実施例：分子マーカーとしての錯体結合されたヒルジン危篤状態にある群の患者に、体重に対応する分の錯体結合されたヒルジンを静脈注射で投与した。短い分散時間（１０−１５分間）の後に、このＣＢＨは一定の血液水準に達した。ＣＢＨに対する除去半減期は、健康な試験志願者における対応するコントロール調査による比較分量として知られていた。少量のクエン酸全血（０.５ｍｌ）が、血栓症で危篤状態の患者から短い間隔で採取された。遊離の循環ＣＢＨが、ヒルジン用の特定の検知方法、つまりエカリン凝固時間（ＥＣＴ，ヨーロッパ特許第９３９０３２３２．２）を用いて決定された。エカリン凝固時間は活性を決定する方法であり、そして遊離セルジンの検知には非常に好感度であるが、ヒルジン−トロンビン錯体に対してはそれほど好感度ではない。ＣＢＨの血液水準の減少と血液循環のトロンビン遊離の強度との間には直接的な相関関係が存在した。時間に関する血流中のトロンビンの遊離の定量化は、“消滅速度”を数学的にモデル化することの可能性もしくは遊離ＣＢＨの血液水準のより顕者な減少によって得られた。この方法を用いることによって、従来診断上では達成できなかった凝固活性化の初期段階を検知することも可能である。更なる試験においては、これらの分子トロンビン“プローブ”の効率が、動物を用いた実験に適用されるモデル化研究において検査された。ここで用いられた実験動物はラット（ＨＡＮ−ＷＩＳｔ、ジェナ大学の中央実験動物ユニット[Central Experimental Animal Unit of the University of Jena] ）およびウサギ（チンチラ雑種、サボ、バッドキスレッグ[Chinchilla bastards ，Savo，Bad Kislegg]）であった。ＳＰＦの家畜基準に準拠している上記二種類の動物のそれぞれの雄と雌が用いられた。ラットをエチルウレタン（皮下注射で１.５ｇ／ｋｇを投与）を用いて麻酔にかけ、ウサギをペントバルビタール（静脈注射で２５ｍｇ／ｋｇを投与）を用いて麻酔にかけた。二つの異なる検知方法が、血液中のヒルジンを決定するために用いられた。エスカリン凝固時間に加えて、色素基体法も用いられた。この方法において、色素基体（クロモジムティーエム、ペンタファームベイスル[Chromozym TM，Pentapharm Basle]）およびエスカリン（２５Ｅｕ／ｍｌ）もしくはトロンビン（１.５ＮＩＨＵ／ｍｌ）が血漿（１／１０に希釈）、そして二分後に分光計によって消失が測定された（ＮＩＨＵ：トロンビン凝固作用の国際基準；ＮＩＨ＝（国立健康機関[ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ]）。錯体結合されたヒルジンが、二つの異なるヒルジン調合物で用いられた。 1．デキストラン−ヒルジン（デキストラン１５０ｋＤａ）が、ウォルズマンら（Ｗａｌｓｍａｎｎｅｔａｌ）による方法によってヒルジンに結合された。比活性は９７１ＡＴＵ／ｍｇであった（ＡＴＵ＝抗トロンビンユニット＝直接トロンビン抑制剤用の国際基準）。 2．ＰＥＧに結合されたヒルジン。クノールによって提供された市販の調合物を用いた（ＰＥＧ−ヒルジン／１４４もしくはＰＥＧ／１５３）。１．ラットのＰＥＧヒルジンの血漿水準におけるトロンビンの効果実験構成：麻酔をかけたラットにＰＥＧ−ヒルジンを１４０ＡＴＵ／ｋｇ体重の投与量で、濃縮塊として静脈注射によって投与した（ＡＴＵ＝抗トロンビンユニット）。１０分後、ラットにトロンビンを注入し、そして対象動物に同量の生理食塩水を注入した。頸静脈に常設されているカテーテルを介して６０分ごとにラットからクエン酸血０.５ｍｌを採取し、それによって分子マーカーの血液水準を監視した。トロンビンを３５、７０、１４０、２５０および５００ＮＩＨＵ／ｋｇｘｈｏｕｒ^-1の濃度で３６０分間に亘りラットに注入した。結果を図１に示す。短い初期の分散期間の後に、比較的一定の血液水準を有するＰＥＧ−ヒルジンが血漿中で検知されたことが分かる。おおよその半減期は約１２から１４時間であった。３５ＮＩＨＵ／ｋｇｘｈｏｕｒ^-1のトロンビン注入において、ＰＥＧ−ヒルジンの血液水準の時間依存性は、ほとんど対象グループ（生理食塩水を注入された動物）のそれと同じであった。７０ＮＩＨＵ／ｋｇｘｈｏｕｒ^-1 のトロンビンでは、ＰＥＧ−ヒルジンの血液水準の有意に加速された減少は１２０分を過ぎた後でも検知された。トロンビンの投与量がもっと大きい場合、遊離ＰＥＧ−ヒルジンは血液循環からかなり急速に消滅した。２５０もしくは５００ＮＩＨＵのトロンビンでは、ＰＥＧ−ヒルジンは１２０分を過ぎた後でも血漿中に検知することはできなかった。２．ラットのＰＥＧ−ヒルジン水準におけるトロンビンの反復的な適用の効果これらの試験において使用されたＰＥＧ−ヒルジン（ＰＥＧ１５３）は、その分散性と血液水準の時間依存性は上記に説明される試験例の時間依存性とほぼ同じであることを示した。各々の患者に１００ＮＩＨ−Ｕ／ｋｇのトロンビンを１５分間注入した場合、１２０分後、１８０分後、および２４０分後にＰＥＧ− ヒルジン水準のわずかな影響が検知された。一方、２５０ＮＩＨ−Ｕ／ｋｇのトロンビンを適用した場合、ＰＥＧ−ヒルジン血液水準のより顕著な減少が３時間後に発生した。トロンビンの投与量を５００ＮＩＨ−Ｕ／ｋｇまで増加すると、この減少の割合がさらに大きくなった。３．ウサギのデキストラン−ヒルジンの血漿水準におけるトロンボキナーゼの効果ウサギを５０００ＡＴＵ／ｋｇのデキストラン−ヒルジンで前処理した。そのデキストラン−ヒルジン血液水準を監視することにより、ウサギの一定のヒルジン血液水準が２４時間後に始めて検知されたことがわかった。精製されたトロンボキナーゼ溶液（１ｍｌ／ｋｇ／ｈｏｕｒ）を６時間に亘って注入すると、デキストラン−ヒルジン血液水準においてより顕著な減少が検知された。これらの調査のために、５つの独立した試験結果を統合した。これらの調査から、内皮細胞の表面構造と、肝臓のＲＥＳと、および血液の小体性構成成分とデキストランとの相互作用により、デキストラン−ヒルジンはウサギの場合非常に長い分散相（２４時間）を有することが分かった。この種の動物に対しては、デキストラン−ヒルジンはマーカーの調査のためには限られた適性しか示さなかった。これらの調査から、デキストラン−ヒルジンがウサギの有機体のより深いところの小室にまで分散されているかどうかは同定できなかった。対照的に、ＰＥＧに結合されたヒルジン（ＰＥＧ１４４と１５３）は、ここに紹介されたラットに対して行われた試験の対応する分子マーカーモデル化に対して適切であることが証明された。比較的一定の分散平衡がラットにおける循環において１０分経過した後でさえ得られ、そして少量のトロンビンの連続注入によって、もしくはトロンビンの不連続な適用によって脈管内凝固活性化のモデル化が続きそしてＰＥＧ−ヒルジン血液水準の対応する変動によって測定される得る。動物実験に基づくこれらのモデル化調査から、錯体結合されたヒルジンが分子マーカーとして脈管内凝固活性化に適切であることが導き出される。ここに紹介された分子マーカーの利点とは、この種の高分子量ヒルジン鎖体が有機体の如何なる除去機能にも付されないということである。上記の高分子量ヒルジン鎖体は、凝固活性化の最終活性化生成物として循環中に永久に発生し得る、活性トロンビンの結合のために常に存在する。確定的な凝固活性は、遊離マーカーの水準を検知する好感度方法によって定量化され得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年５月２７日【補正内容】 (1)．明細書の補正明細書原文第１頁〜第５頁（翻訳文第１頁〜第５頁第１２行に相当）を以下の通り補正。明細書診断および治療監視のための分子マーカーとしての活性化し得る代謝酵素の錯体結合された阻害剤本発明は、診断のためにこの酵素の活性化を決定するための調合物を製造するための分子マーカーとして、血液凝固カスケードの活性化生成物のまたは活性化フィブリン溶解酵素の、高分子量担体に結合された、阻害剤の使用に関する。本発明は、好ましくは高分子量担体に結合され、凝固診断および治療監視において凝固活性化を決定するための分子マーカーとして用いられるトロンビン阻害剤の使用に関する。本発明は、特に、凝固活性化を決定するための分子マーカーとしての錯体結合されたヒルジン（ＣＢＨ）に関する。多くの代謝生理学的工程は、場合によっては分岐し、そして一連の活性化し得る酵素を介して反応開始剤もしくは連鎖反応を強める働きを持つカスケードメカニズムを介して制御されている。例えば、上記の如きメカニズムは、グリコーゲン代謝の制御、細胞外信号の伝達、および特に血液凝固において効果的である。分子レベルにおいて、カスケードメカニズムに含まれるファクターの断続するリン酸化反応はしばしばこの時点で認識される。このメカニズムによる反応開始剤の強化は、それら自身もしばしば酵素である複数の基質分子を改質させることができるメカニズムの複数の異なる段階に関わる酵素による。上記の如きメカニズムの活性化された酵素は、各患者の体内において進行する活性化反応を決定するための分子マーカーとして好適である。上記の如き過程において、永続的診断系統などに供給されるべき主要な各活性化酵素の特定の親和性の高い阻害剤が使用される。しかしながら、この分子マーカー原理と呼ばれるものは、これまでは不十分に展開されてきただけであった。血液凝固の脈管内活性反応を決定するために適する分子マーカーの探索は数年に亘って鋭意に検討された。この仕事の過程において、凝固活性化の一連の代謝生成物が分子マーカーとして浮上してきた。これら代謝生成物は、プロトロンビンＦ１＋２断片、血小板因子ＩＶ、そしてフィブリノペプチドＡおよびＢだけでなく、フィブリン溶解によって生成されるフィブリン分解による一部の分裂生成物（例えばｄ−二量体類）から成り、そしてＴＡＴ錯体として知られる、天然の抗トロンビンとセリンプロテアーゼトロンビンとの間に形成される錯体から同様に成る。これらの分子マーカーの有用性は大規模な臨床研究において分析されてきた。血栓症発生もしくはトロンボ−陥入疾病中に確実に増加もしくは持続する、この種の分子マーカーの血液水準を決定することは可能であることが一般に確認されている。しかしながら、これらのマーカーの効率には改善の余地がかなり存在する。静脈血栓症もしくは動脈血栓症閉塞疾病を患う臨床患者においては、凝固に対し最も敏感なマーカーの応答容量、つまりプロトロンビン断片Ｆ１＋２は２０％未満であった。さらに、トロンボ−陥入疾病もしくは血栓症発生の重度とこの場合および他の分子マーカーの血液水準の大きさとの間に相関関係は見出せなかった。この種の疾病を患っている患者の経験から、止血学(haemostaseology)マーカーの実際の血液水準を決定することによって凝固活性化の強度についての結論を導き出し得る分子測定の原理はこれまで存在しなかったことが導き出される。この原因は、体内に自然に発生する凝固酵素の代謝生成物としての分子マーカーが、除去メカニズムによる循環からある程度迅速に除去されることに起因する。これに関して、マーカーを、特に肝臓代謝の範囲において、関与する器官の機能に依存してある程度迅速に代謝させることを考慮しなければならない。特開昭６３−２０９５８７号には、デキストランとカップリングされている（トリプシンとキモトリプシンに対して効果的な）酵素阻害剤の生成、および酵素活性化の分析用の生体内診断剤としてのその阻害剤の使用が開示されている。本発明の基礎となる目的は、それ故、代謝活性化の初期段階を検知するための好感度のマーカーを同定することにある。さらに、分子マーカーは血液凝固の際の脈管内活性反応を決定するための広い診断範囲を有するべきである。これに関して、マーカーは、代謝過程或いは除去反応に独立にその器官内で作用すべきである。マーカーが血液循環中でのみ迅速に分散し、全く代謝をしないか或いはわずかに代謝をし、そしてゆっくりとだけ除去されることが保証されなければならない。本発明によれば、この目的は、酵素の診断のために、この酵素の活性化を決定するための調合物を製造するための分子マーカーとして、血液凝固カスケードの活性化生成物のまたは活性化フィブリン溶解酵素の、高分子量担体に結合された、阻害剤の使用によって達成される。驚くべきことに、高分子量担体に結合された阻害剤、例えば血液凝固カスケードの活性化生成物のまたは活性化フィブリン溶解酵素の錯体結合された阻害剤のような、活性化し得る代謝酵素の阻害剤は、血液循環中に排他的に及び迅速に分散し、その器官内ではゆっくりとだけ分解もしくは除去され、そして遊離で、結合していない阻害剤が有しているのと酵素に対するほぼ同じ親和性を有することも分かっている。この原理は、高い親和性と特定の阻害剤が有効なすべての活性化し得る主要な酵素に対して適用できる。その原理は、トロンビン、活性化ファクターＶＩＩもしくは活性化ファクターＸの如き凝固カスケードの活性化生成物に特に適しており、そして例えば組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）もしくはプラスミンの如き活性化フィブリン溶解酵素にも適している。以下の説明は、本発明の好ましい実施態様、つまりトロンビン阻害剤の使用に関する。しかしながら、本実施例において説明される血液の治療監視のための分子マーカー原理は、活性し得る酵素および高分子量担体物質に結合された請求項１による高い親和性を有する特定の阻害剤との如何なる組み合わせにも対応するように適用し得ることは理解されるべきである。驚くべきことに、高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤（錯体結合されたトロンビン阻害剤）は、血液循環中に排他的に及び迅速に分散し、その器官内でゆっくりとだけ分解もしくは除去され、そして遊離のトロンビン阻害剤が有するのとほぼ同じ親和性をトロンビンに対して常に有し、それによって治療目的に適していることが分かっている。非結合トロンビン阻害剤は、血液中だけでなく体全体に分散されるので、この種の治療に対してこれらの物質を使用することは不可能であり、消費された際には、血液中での検知可能な濃度減少を示さずに再度分散される。高い親和性の天然のトロンビン阻害剤例えばヒルジン、そしてトロンビンに対して高い親和性を有するすべての他の直接接合している合成トロンビン阻害剤は、トロンビン阻害剤として使用できる。その例には、ＰＥＧ結合された４−アミジノフェニルアラニン（ペプチドリサーチ８、Ｎｏ．２、７８−８５（１９９５））が包含される。天然または合成の物質は、高分子量担体として使用できる。その例には、ポリエチレングリコール、デキストラン、そして体内に自然に発生する血液蛋白質が包含される。その他の例には、アルブミン、γ-グロブリン、およびフェリチン、サクシニル化されたゼラチン、架橋ポリペプチド、そしてポリヒドロキシスターチが包含される。デキストラン結合（ＤＰ）されたヒルジンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合されたヒルジン、もしくは人体蛋白質と結合されているヒルジンと同様に、使用に適している。その分子の大きさのため、それらの蛋白質（アルブミン結合されたヒルジン或いは規定されたγ-グロブリンに結合されているヒルジン）は、非常にゆっくりとした生物学的除去過程を受けるだけである。この種の錯体結合されたヒルジンは、血液中にほぼ排他的に分散され、そして細胞外の流体空間中への溢血を全く示さないという大きな利点がある。このマーカーは少量でも、血液中に分散された時に、迅速に且つ強固に結合する、脈管内的に活性化されたトロンビンもしくはプロトロンビン−トロンビン転換の活性化中間体のための高活性阻害剤として機能し得る。活性化酵素の錯体結合されたトロンビン阻害剤との結合により、「遊離」の錯化ヒルジンの量は、活性トロンビンが循環内に発生する程度によって減じられる。ヒルジン、および高分子に結合されたヒルジンは、セリンプロテアーゼトロンビンに対して高い親和性を有する。トロンビン種だけに対するヒルジンの単一特異性は、このマーカーにその生物中のこのセリンプロテアーゼに対して活性化となることだけを許容する。他の酵素との結合は不可能且つ未知である。 (2)．請求の範囲の補正請求の範囲全文を以下の通り補正。請求の範囲１．酵素の診断のために、この酵素の活性化を決定するための調合物を製造するための分子マーカーとして、血液凝固カスケードの活性化生成物のまたは活性化フィブリン溶解酵素の、高分子量担体に結合された、阻害剤の使用。２．高分子量担体がデキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または体内に自然に生じる蛋白質であることを特徴とする、請求項１による使用。３．高分子量担体に結合された阻害剤がトロンビン阻害剤でありそして凝固診断および治療監視において凝固活性化を決定するための調合物を製造するための分子マーカーとして用いられることを特徴とする、請求項１または２による使用。４．トロンビン阻害剤がヒルジンであることを特徴とする、請求項３による使用。５．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤がデキストラン−ヒルジンまたはＰＥＧに結合されたヒルジンであることを特徴とする、請求項３による使用。６．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤が０.００５〜０.５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０１〜０.０５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.０１〜０.０２ｍｇ／ｋｇの投与量で用いられることを特徴とする、請求項３〜５のいずれかによる使用。７．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤が非経口的に投与されることを特徴とする、請求項３〜６のいずれかによる使用。８．高分子量担体に結合された阻害剤がプラスミン阻害剤または組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害剤でありそしてフィブリン溶解の活性化を決定するため調合物を製造するための分子マーカーとして用いられることを特徴とする、請求項１による使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者バルディンガー、フェレーナドイツ国デー−63546 ハンメルスバッハ、ヒルツバッハー・ヘーフェ 14

Claims

【特許請求の範囲】１．活性化し得る代謝酵素の診断のためにこの酵素の活性化を決定するための分子マーカーとしての、高分子量担体に結合された、該酵素の阻害剤の使用。２．高分子量担体に結合された阻害剤が血液凝固カスケードの活性化生成物または活性化フィブリン溶解酵素の阻害剤であることを特徴とする、請求項１による使用。３．高分子量担体がデキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または体内に自然に生じる蛋白質であることを特徴とする、請求項１または２のいずれかによる使用。４．高分子量担体に結合された阻害剤がトロンビン阻害剤でありそして凝固診断および治療監視において凝固活性化を決定するための分子マーカーとして用いられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかによる使用。５．トロンビン阻害剤がヒルジンであることを特徴とする、請求項４による使用。６．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤がデキストラン−ヒルジンまたはＰＥＧに結合されたヒルジンであることを特徴とする、請求項４による使用。７．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤が０.００５〜０.５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０１〜０.０５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.０１〜０.０２ｍｇ／ｋｇの投与量で用いられることを特徴とする、請求項４〜６のいずれかによる使用。８．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤が非経口的に投与されることを特徴とする、請求項４〜７のいずれかによる使用。９．高分子量担体に結合された阻害剤がプラスミン阻害剤または組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害剤でありそしてフィブリン溶解の活性化を決定するための分子マーカーとして使用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかによる使用。１０．活性化し得る代謝酵素の診断のために、この酵素の活性化を決定するための調合物を製造するための分子マーカーとして、高分子量担体に結合された、該酵素の阻害剤の使用。１１．高分子量担体に結合された阻害剤が血液凝固カスケードの活性化生成物または活性化フィブリン溶解酵素の阻害剤であることを特徴とする、請求項１０による使用。１２．高分子量担体がデキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または体内に自然に生じる蛋白質であることを特徴とする、請求項１０または１１のいずれかによる使用。１３．高分子量担体に結合された阻害剤がトロンビン阻害剤でありそして凝固診断および治療監視において凝固活性化を決定するための調合物を製造するための分子マーカーとして用いられることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかによる使用。１４．トロンビン阻害剤がヒルジンであることを特徴とする、請求項１３による使用。１５．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤がデキストラン−ヒルジンまたはＰＥＧに結合されたヒルジンであることを特徴とする、請求項１３による使用。１６．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤が０.００５〜０.５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０１〜０.０５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.０１〜０.０２ｍｇ／ｋｇの投与量で用いられることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかによる使用。１７．高分子量担体に結合されたトロンビン阻害剤が非経口的に投与されることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれかによる使用。１８．高分子量担体に結合された阻害剤がプラスミン阻害剤または組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害剤でありそしてフィブリン溶解の活性化を決定するため調合物を製造するための分子マーカーとして用いられることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかによる使用。