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JPH11515013A - Pseudomonas exotoxin as an immunogenic carrier for synthetic combination vaccines - Google Patents

Pseudomonas exotoxin as an immunogenic carrier for synthetic combination vaccines

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Publication number
JPH11515013A
JPH11515013A JP9516753A JP51675397A JPH11515013A JP H11515013 A JPH11515013 A JP H11515013A JP 9516753 A JP9516753 A JP 9516753A JP 51675397 A JP51675397 A JP 51675397A JP H11515013 A JPH11515013 A JP H11515013A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gnrh
peptide
immunogenic carrier
pseudomonas exotoxin
protein
Prior art date
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Pending
Application number
JP9516753A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ヒツケイ，ジエラード・ジエイ
モーン，ケネス・エル
Original Assignee
メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9602878.2A external-priority patent/GB9602878D0/en
Application filed by メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド filed Critical メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド
Publication of JPH11515013A publication Critical patent/JPH11515013A/en
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Abstract

(57)【要約】 シュードモナスエクソトキシン及びその変異体は、ＧｎＲＨの強力な免疫原性担体タンパク質である。シュードモナスエクソトキシンに結合したＧｎＲＨを含むワクチンは、動物中で高力価の抗ＧｎＲＨ抗体を誘発させ得、従って、妊性の制御、望ましくない生殖ホルモン誘発挙動の低減及び性ステロイド応答性腫瘍の治療に有用である。   (57) [Summary] Pseudomonas exotoxin and its variants are potent immunogenic carrier proteins of GnRH. Vaccines containing GnRH conjugated to Pseudomonas exotoxin can elicit high titers of anti-GnRH antibodies in animals, thus controlling fertility, reducing unwanted reproductive hormone-induced behavior and treating sex steroid responsive tumors Useful for

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 合成複合ワクチンの免疫原性担体としてのシュードモナスエクソトキシン発明の背景 本発明は、動物においてゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）に対する抗 体を誘発させる方法に関し、該方法は、動物に、ＧｎＲＨ及びシュードモナスエ クソトキシン又はその変異体を含む免疫原性担体系を投与することを含む。本発 明の方法は、有効且つ好ましい動物の断種（不妊）法である。該方法は、ステロ イドホルモン刺激性腫瘍の発生の抑制にも用い得る。 動物の断種という問題には多大な関心が寄せられている。これは、獣医学及び 動物畜産学関係者、特に、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタなどのような 家畜の断種問題に係わる人々の間で特に関心が高い。断種（不妊）は、雄の攻撃 性や雌の発情期挙動のような望ましくない性腺ステロイドホルモン誘発挙動の抑 制に用いて、飼料効率や、ブタ 及びウシのような食用動物のカーカス品質を改良したり、雄ブタカーカスの雄性 痕跡（boar taint）を排除したりすることができる。 過去数年の間に種々の断種法が開発された。例えば、雄ウシの場合、性的又は 攻撃的挙動問題を排除するために最も広く用いられている方法は去勢手術による 断種である。これは、種々の方法で行われ、例えば、ちゅう径輪中で精巣を保持 する精索を破壊するか、又は陰嚢の首部の周りに巻いたゴムバンドを用いて陰の う及び精巣を分離する。しかし、これらの「機械的」去勢法は、いろいろな点で 望ましくないことが証明された。例えば、該方法は、（１）外傷性であり、（２ ）感覚脱失の危険があり、（３）感染症を引き起こす恐れがあり、且つ（４）熟 練者を必要とする。さらに、そのような機械的去勢法はいずれも、精巣を完全に 機能不全にしてしまい、必然的に、精巣により産生され、成長及びタンパク質の 蓄積に対する刺激物質として作用する全てのステロイドの同化作用を完全に除去 してしまうことを意味する。 これらの欠陥を考慮して、化学的断種剤の使用といった種々の代替断種法が開 発された。化学的断種の１つの方法 は、性腺表面上のＧｎＲＨレセプターに結合する分子に結合した細胞毒性物質の 使用を含む。ＧｎＲＨ−細胞毒複合体が細胞内に取り込まれると、細胞毒性物質 が放出され、該物質が標的細胞を死滅させる。 ＧｎＲＨ−細胞毒法は、ＷＯ９０／０９７９９号に開示されており、該特許は 、２−イミノチオラン、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル ジチオ）プロピオネート）、ビス−ジアザベンジジン及びグルタルアルデヒドな どの任意の結合基を介して種々の毒素に結合したＧｎＲＨ類似体を含む特定の断 種剤を教示している。ＷＯ９３／１５７５１号はさらに、ＧｎＲＨ又はその類似 体と細胞毒とのキメラ分子を開示している。この開示によるキメラは、ＧｎＲＨ ペプチドがシュードモナスエクソトキシン分子に直接結合している分子である。 ペプチドの各毒素分子結合部位には単一のＧｎＲＨペプチドしか結合していない 。そのようなキメラ分子を投与すると、下垂体中のＧｎＲＨレセプター保有細胞 が破壊されると同時に性ホルモンの分泌が低下する。この方法の効力は、レセプ ターのエンドサイトーシス速度及び性腺刺激物質の細胞内プロセシング速度によ って決定される。この方法の最終結果は、 化学的断種及びステロイド刺激性腫瘍の増殖低下である。 ＵＫ出願第２，２８２，８１２号は、ＧｎＲＨをＭＡＰ（多重抗原ペプチド） 又はリシン樹状構造（lysinetree）と称される多重リシン単位を含む環状骨格に 結合し、該骨格をシュードモナスエクソトキシンのような細胞毒に結合する方法 を教示している。多重リシン骨格を用いることにより、１つの細胞毒結合部位が １つ以上のＧｎＲＨに結合し得る。しかし、ＭＡＰ法は必ずしも有利ではない。 というのは、ＭＡＰ複合体は、通常、疎水性溶媒にも親水性溶媒にも難溶性であ るために、配合がより困難になるからである。 このように、シュードモナスエクソトキシンに結合したＧｎＲＨが既に報告さ れてはいるが、これらの複合体は、ＧｎＲＨレセプターを発現する細胞のシトソ ール中に該毒素を輸送するのに用いられた。ＧｎＲＨ−シュードモナスエクソト キシンをワクチンとして用いて抗ＧｎＲＨ抗体を誘発させることは考えられては いなかった。 別の動物断種法は、ＧｎＲＨワクチン、即ち免疫断種法の使用を含む。典型的 には、ＧｎＲＨの免疫原性を高めるために、免疫原性が極めて弱いＧｎＲＨ分子 をタンパク質 のような免疫原性高分子と結合させる。あるいは、該目的のために、ＧｎＲＨと 免疫原性ペプチドとを含む融合タンパク質を構築してもよい。免疫複合体又は融 合タンパク質の投与を受けた動物は、抗ＧｎＲＨ抗体を産生し、該抗体がＧｎＲ Ｈの作用をダウンレギュレイトし、それによって、性ホルモンが急激に減少し、 アンドロゲン依存性器官が萎縮する。ワクチンとして用いるのに適した多くのＧ ｎＲＨ免疫複合体又は融合タンパク質が記載されている。 現在オーストラリアでは、Ａｒｔｈｕｒ Ｗｅｂｓｔｅｒ ＆ Ｃｏ Ｐｔｙ Ｌｔｄにより、商品名Ｖａｘｓｔｒ （例えば、Ｒ．Ｍ．Ｈｏｓｋｉｎｓｏｎら，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌ ．，１９９０，４：１６６参照）。オボアルブミンに結合したＧｎＲＨからな ると記載されているこのワクチンは免疫原性が極めて弱い。該ワクチンは、ＤＥ ＡＥデキストラン中に配合され、重度の注射部位反応を生起する。 ＵＳ４，９７５，４２０号は、アミノ酸１、６又は１０がシステインで置換さ れ、担体タンパク質に結合したＧｎＲＨ類似体を含む免疫断種剤を開示している 。 ＷＯ８８／０５３０８号は、天然ＧｎＲＨのペンタペプチド、ヘキサペプチド 又はペプタペプチドと、該ペプチドに結合した免疫原性タンパク質とを含む免疫 去勢組成物を開示している。 ＷＯ９３／０８２９０号は、ＧｎＲＨとロイコトキシンポリペプチドとを含む 融合タンパク質を記載している。ロイコトキシンは、抗原の免疫原性を高める担 体タンパク質として作用する。 ＥＰ５７８，２９３号は、大腸菌のＰ−フィムブリエ軸糸の一部とＧｎＲＨと を含む融合タンパク質を記載している。この担体系は、ＧｎＲＨに対して極めて 高い免疫応答を誘発し得、ワクチンに用いると、完全／不完全フロイントアジュ バント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）のような攻撃的なアジュバントを用いる必要が回避さ れると言う。 ＷＯ９２／１９７４６号は、ＧｎＲＨ、少なくとも１種のＴ細胞エピトープ及 び精製部位を含む組換えポリペプチドを教示している。 ＷＯ９０／０２１８７号は、Ｂ型肝炎表面抗原及びＧｎＲＨを含む融合タンパ ク質を開示している。該構築物は、アジュバントや多重注射の使用を不要とする 程十分な免疫 原性を有していると述べれられている。 ＵＳ５，３２４，５１２号は、Ｎ末端グルタミンを介して担体タンパク質に結 合したＧｎＲＨを教示している。該複合体は、抗妊性ワクチンとしても、前立腺 ガンの治療にも有用であるとクレームされている。 ＷＯ９４／２５０６０号は、ＧｎＲＨ及びＴ細胞エピトープと、任意成分であ る侵入ドメインとを含む免疫原性ペプチドを開示している。該ペプチドは、避妊 用ワクチンとしても、アンドロゲン依存性ガンの治療用にも有用である。 ＵＫ２，２２８，２６２号は、［Ｄ−Ｌｙｓ6］ＧｎＲＨ〔即ち、天然ＧｎＲ Ｈのアミノ酸６（グリシン）がＤ−Ｌｙｓで置換されているもの〕がＤ−Ｌｙｓ のε−アミノ基を介して担体タンパク質に結合している複合体を開示している。 該複合体は受胎力の抑制又は前立腺ガンの治療に用い得る。 上記ワクチンは一般に、抗体応答を得るために大量のワクチン並びに強力なア ジュバントを必要とする。最も一般的に用いられているアジュバントは、完全又 は不完全フロイントアジュバンド（ＣＦＡ又はＩＦＡ）であり、該アジュバント は、注射部位に様々なレベルの慢性炎症性反応 を引き起こし、従って一般にワクチン調節の権威者には許容され得ないものであ る。記載されているこれらのワクチンは、適切なレベルの抗ＧｎＲＨ抗体を誘発 させ得ず、所与のグループの全ての動物に１００％の効力を提供し得ない。 先に述べたように、シュードモナスエクソトキシンをＧｎＲＨと結合し、得ら れた構築物を性腺刺激物質の破壊に用いた。該構築物のＧｎＲＨは、毒素をＧｎ ＲＨレセプター保有細胞中に運ぶ働きをし、細胞内に入ると毒素は放出され、そ の細胞毒性作用を発揮して細胞を死滅させる。レセプター結合リガンドを用いて シュードモナス毒素を標的細胞中に運ぶ方法は、ＧｎＲＨ以外の多くのリガンド と共に多くの文献に記載されている。 Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４：４５３８−４５４２（１９ ８７）は、ＰＥ−４０、ＰＥエクソトキシンＡのトランケイト変異体及び形質転 換成長因子αから形成され、組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で産生させたハイブ リッド融合タンパク質を教示しており、該タンパク質は、上皮成長因子レセプタ ーを有するヒト腫瘍細胞に結合して、該細胞を死滅させる。 Ｅｄｗａｒｄｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２８６０−２８６７（ １９８９）は、膀胱の腫瘍細胞の治療に効力を有することが知見されている修飾 ＴＧＦ−α−ＰＥ−４０ハイブリッド分子の製造法を記載している。 Ｈｅｉｍｂｒｏｏｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ ７ ：４６９７−４７０１（１９９０）は、ヒト腫瘍細胞異種移植片を含むマウス の生存率を有意に延長させる修飾ＴＧＦ−α−ＰＥ−４０のＩｎ ｖｉｖｏ効力 を記載している。 米国特許第４，５４５，９８５号は、シュードモナスエクソトキシンＡを抗体 又は上皮成長因子に化学結合させ得ることを教示している。この特許はさらに、 これらの複合体を用いてヒト腫瘍細胞を死滅させ得ることも教示しているが、こ れらの化学結合毒素は、望ましくない非特異的活性レベルを有することが証明さ れた。 Ｂａｉｌｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３２６−１３２９ページ １ １月（１９８８）は、ＰＥ−４０とインターロイキン２から形成され、組換えＤ ＮＡ法を用いて細菌中で産生させたハイブリッド融合タンパク質を教示しており 、該タンパク質は、インターロイキン２レセプタ ーを有するヒト細胞系に結合し、該細胞を死滅させる。 ハプテンの免疫原性を高めるためのシュードモナスエクソトキシンの使用がＷ Ｏ９２／１２１７３号に記載されており、該特許は、シュードモナスエクソトキ シン及びヒトＰ−糖タンパク質特異領域の融合タンパク質を教示している。これ らの融合タンパク質は、Ｐ−糖タンパク質に対する抗体の産生に用いられる。Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ夾膜多糖及びシュードモナスエクソ トキシンＡ由来の組換えタンパク質からなる複合ワクチンがＡ．Ｆａｔｔｏｍら ，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，６１（３）１０２３−１０３２に記載され ている。 ヨーロッパ特許出願第０２６１６７１号は、全シュードモナスエクソトキシン Ａタンパク質（分子量６６，０００）の細胞結合機能は欠くが、該タンパク質の 転座機能及びＡＤＰリボシル化機能は保持する該タンパク質の一部を産生させ得 ることを教示している。全シュードモナスエクソトキシンＡタンパク質のうちそ の転座機能及びＡＤＰリボシル化機能を保持する部分はＰＥ−４０（分子量４０ ，０００）と称されている。ＰＥ−４０は、Ｇｒａｙら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８ １ ：２６４５−２６４９ １９８４に定 義されているように、全シュードモナスエクソトキシンＡタンパク質のアミノ酸 残基２５３−６１３からなる。該特許出願はさらに、ＰＥ−４０を形質転換成長 因子αと結合して、組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で産生させるハイブリッド融 合タンパク質を形成し得ることを教示している。発明の要旨 本発明は、ＧｎＲＨの免疫原性担体タンパク質としてのシュードモナスエクソ トキシン（ＰＥ）の使用に関する。ＧｎＲＨ−ＰＥ免疫原性担体系は、化学的手 段により生成されるＧｎＲＨ−ＰＥ複合体でも、組換えＤＮＡ法を用いて産生さ せるＧｎＲＨ−ＰＥキメラハイブリッドタンパク質であってもよい。ＧｎＲＨ− ＰＥ免疫原性担体系は、ほ乳類又は鳥類において、生殖、生殖ホルモン誘導挙動 の低減若しくは排除が望ましい症状、生理学又は解剖学、あるいは性ステロイド 応答性腫瘍の治療に用い得る。発明の詳細な説明 本発明は、１つの態様において、動物中で、合成複合ワクチンにより、抗体、 特に抗ＧｎＲＨ抗体を誘発させる方法を提供する。該方法は、好ましくは、前記 動物に、シュードモナスエクソトキシン又はその変異体に結合したＧｎ ＲＨを含む免疫原性担体系を抗ＧｎＲＨ抗体の誘発に有効な量投与することを含 む。より特定的に言えば、本発明は動物を断種する方法を提供し、該方法は、前 記動物に、シュードモナスエクソトキシン又はその変異体に結合したＧｎＲＨを 含む免疫原性担体系を断種の実施に有効な量投与することを含む。 シュードモナスエクソトキシンに結合したＧｎＲＨを含む免疫原性担体系は、 化学的手段により前記ＧｎＲＨをリンカーを介してシュードモナスエクソトキシ ンに結合したＧｎＲＨ−シュードモナスエクソトキシン複合体でも、ＧｎＲＨ− シュードモナスエクソトキシンハイブリッドタンパク質であってもよい。 以下の略号を用いる： ＣＺＥ キャピラリーゾーン電気泳動 ＤＣＣ ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＤＴＴ ジチオトレイトール ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩 ＥＭＯＣ ９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＰＳＥＣ 高性能サイズ排除クロマトグラフィー ＭＰＳ ３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシン イミドエステル ＰＥ シュードモナスエクソトキシン ＰｙＢＯＰ ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシ−トリス（ピロ リジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気 泳動 ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 本明細書及び請求の範囲に用いられている用語「ＧｎＲＨ」は、本発明に従っ て宿主に投与すると抗ＧｎＲＨ抗体を誘発させ得る天然ＧｎＲＨ及びその類似体 又は誘導体を包含するものとする。該用語が特定のＧｎＲＨ分子を指す場合には そのアミノ酸配列を明記する。 黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）とも称される天然のＧｎＲＨは、 アミノ酸配列［配列番号１］： （ここで、ｐＧｌｕはピログルタメートである） を有するデカペプチドである。天然ＧｎＲＨの多くの類似 体又は誘導体が記載されており、該類似体又は誘導体は、天然ＧｎＲＨの付加、 欠失、置換又は他の修飾により得ることができる。本発明に用いるのに適当であ り得るＧｎＲＨ類似体又は誘導体の非限定的な例としては、以下の文献に記載の もの： 英国特許第２，２２８，２６２号（例えば、［Ｄ−Ｌｙｓ6］ＧｎＲＨ ）；米国特許第４，９７５，４２０号（例えば、［Ｄ−Ｃｙｓ6］ＧｎＲＨ）； 米国特許第４，６０８，２５１号（例えば、Ｎ末端修飾ノナペプチド又はデカペ プチド）；ヨーロッパ特許出願第４６４，１２４号（例えば、２つのタンデム型 ＧｎＲＨ）；ヨーロッパ特許出願第２９３，５３０号（例えば、Ｃ末端延長型Ｇ ｎＲＨ）；ＰＣＴ出願第８８／０５３０８号（例えば、ＧｎＲＨのトランケイト 型フラグメント）；及び米国特許第５，３２４，５１２号（天然ＧｎＲＨのｐＧ ｌｕをＧｌｎで置換したもの）が挙げられる。 化学結合ＧｎＲＨ−ＰＥ複合体に用いるためには、天然ＧｎＲＨは、ＧｎＲＨ をシュードモナスエクソトキシンに結合させ得る介在官能基となるアミノ酸を含 めるように修飾するのが好ましい。そのようなアミノ酸は、Ｎ末端又はＣ末端に 位置していてもよいし、天然ＧｎＲＨのアミノ酸 ６（Ｇｌｙ）を置換してもよい。該ＧｎＲＨが遊離アミノ又はスルフヒドリル基 を含んでいればなお好ましい。遊離アミノ基は、例えば、Ｎ末端ｐＧｌｕをＧｌ ｎで置換するか、又は天然ＧｎＲＨのＧｌｙ6をＬｙｓで置換することにより得 ることができる。遊離スルフヒドリル基は、１つのアミノ酸、例えば、１、６又 は１０位のアミノ酸をシステインで置換して得ることもできるし、あるいは、遊 離アミノ基をホモシステインチオラクトン又はメルカプトプロパン酸を用いてチ オール化して遊離スルフヒドリル基を得ることもできる。 化学結合複合体の好ましい実施態様において、ＧｎＲＨは、配列［配列番号２ ］： 〔ここで、Ｂは、式ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｃｏ−Ｑのチオール含有リンカーであり ； ｐは０又は１であり； ｎは１〜１０であり； ＱはｐＧｌｕ又はＧｌｎであり； Ｗは、グリシン、アラニン、システイン、ホモシステイ ン、オルニチン及びリシンから選択されるＤ−又はＬ−アミノ酸であり； ＴはＬｅｕ又はＮｌｅであり； Ｕは、Ｐｒｏ又は４−ヒドロキシ−Ｐｒｏであり； Ｖは、Ｇｌｙ−ＮＨ2、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2、ＮＨ−Ｅｔ、ＮＨ−Ｐｒ又はＡｒ ｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2であり； 但し、Ｑ又はＷの少なくとも一方は遊離アミノ又はスルフヒドリル基を有する 〕 によって表し得る。 より好ましいＧｎＲＨは、式［配列番号３］： （式中、Ｑ及びＷは上記定義の通りである） を有するものである。 ハイブリッドタンパク質の場合、ＧｎＲＨは、組換えＤＮＡ法を用いて製造し 得る天然ＧｎＲＨ又はその類似体若しくは誘導体、例えば、２つのタンデム型天 然ＧｎＲＨ分子、又は単一の天然アミノ酸を含むＧｎＲＨ類似体であるのが好ま しい。 シュードモナスエクソトキシンは、３つの主要ドメイン と１つの副次ドメインに配置された６１３個のアミノ酸からなるタンパク質（分 子量６６，０００）である。好ましいシュードモナスエクソトキシンは、毒性が 低減されたその変異体、例えば、結合活性又はＡＤＰリボシル化活性が、結合又 はリボシル化ドメインのアミノ酸の欠失若しくは部分欠失、挿入又は置換により 減弱又は不活化されているか、あるいはＰＥホロ毒素が、例えば光不活化により 不活化されているシュードモナスエクソトキシンセグメントである。免疫原性担 体タンパク質としてのＰＥの効力はＰＥの毒素活性に依存し、従って、ＰＥ−Ｇ ｎＲＨ複合体又はハイブリッドタンパク質は、例えば、光不活化により不活化し 得るが、依然としてその免疫原性を保持している。毒素活性が低下したシュード モナスエクソトキシンの１つの例は、結合領域のほぼ全てを含むアミノ酸１−２ ５２が欠失しているが、細胞の転座領域及び毒素領域を含むアミノ酸２５３−６ １３は保持している。このシュードモナスエクソトキシンフラグメントは、ＰＥ −４０として同定された〔Ｈｗａｎｇら，前掲；Ｋｏｎｄｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ，２６３，９４７０−９４７５ページ（１９８８）；Ｃｈａｕｄｈａ ｒｙら，ＰＮＡＳ−ＵＳＡ，８７ ３０８ −３１２ページ（１９９０）；及びＰａｓｔａｎらの米国特許第４８９２８２７ 号参照〕。 シュードモナスエクソトキシンフラグメントＰＥ−４０からさらにアミノ酸３ ６５−３８０を除去してさらなる修飾を行い、ＰＥ−３８を得た。ＰＥ−４０及 びＰＥ−３８はリシン含有オリゴペプチドフラグメントをそのＮ末端に付加する ことによりさらに修飾し得る。９個のアミノ酸からなるペプチドＡＮＬＡＥＥＡ ＦＫ（「Ｌｙｓ」ペプチド）をＰＥ−４０とＰＥ−３８のＮ末端に付加して、そ れぞれＬｙｓＰＥ−４０及びＬｙｓＰＥ−３８として同定されたシュードモナス エクソトキシンを生産する。１０個のアミノ酸からなるペプチドＬＱＧＴＫＬＭ ＡＥＥ（「ＮＬｙｓ」ペプチド）を付加して、それぞれＮＬｙｓＰＥ−４０及び ＮＬｙｓＰＥ−３８として同定されたシュードモナスエクソトキシンを生産する 。 ＰＥ−３８の５９０位及び６０６位のリシンをグルタミンで置換し、６１３位 のリシンをアルギニンで置換して、ＰＥ−３８ＱＱＲとして同定されたシュード モナスエクソトキシンを生産する。Ｌｙｓ ＰＥ−３８ＱＱＲ及びＮＬｙｓ Ｐ Ｅ−３８ＱＱＲは、そのＮ末端に、それぞれ「Ｌ ｙｓ」ペプチド及び「ＮＬｙｓ」ペプチドを有する。 種々のシュードモナスエクソトキシンフラグメントがバイオテクノロジー及び 組換えＤＮＡ技術を用いて製造され、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ及びＰａｓｔａｎ，Ｂｉ ｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ． ，１９９４，５（１）：４０−４６及び該文献中に 引用されている参考文献に記載されている。 ＮＬｙｓ ＰＥ−３８ＱＱＲのアミノ酸配列は以下の［配列番号４］で示され る。下線を付した４つのアミノ酸はＰＥ−３８のＮ末端アミノ酸を表す。 他の適当なシュードモナスエクソトキシンとしては、光不活化ホロ毒素や、ジ スルフィド結合が還元された（Ｌｙｓ ＰＥ−３８、ＮＬｙｓ ＰＥ−３８、Ｐ Ｅ−３８ＱＱＲ、Ｌｙｓ ＰＥ−３８ＱＱＲ及びＮＬｙｓ ＰＥ−３８ＱＱＲを 含む）ＰＥ−３８が含まれる。 本発明においてより好ましい免疫原性担体タンパク質はＮＬｙｓ ＰＥ−３８ ＱＱＲである。 シュードモナスエクソトキシン及びＧｎＲＨを含む免疫原性担体系は、ＧｎＲ ＨをＰＥ担体タンパク質と化学結合させるか、又は組換えＤＮＡ技術を用いてＧ ｎＲＨ−ＰＥハイブリッドタンパク質を産生させることにより製造し得る。両方 法を以下に説明する。 ペプチドと高分子とを結合させる方法は当該分野で周知であり、本発明のＧｎ ＲＨ−ＰＥ複合体の製造にも適用し得る。一般に、ペプチドとＰＥは、ＳＰＤＰ （Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、グル タルアルデヒド、イミノチオラン、Ｎ−アセチル−ホモシステインチオラクトン 、ブロモアルカン酸無水物、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシン イミドエステル、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミドエステルなどのような架橋試薬を介して結合する。反応相手上 に求核基及び求電子基を与えるどの方法もペプチド結合には十分である。結合反 応の求電子基の相手となる本発明の好ましい架橋剤は、マレイミドイルアルカン 酸の活性エステル及びブロモアルカン酸無水物である。結合反応の求核試薬とな る好ましい架橋相手は、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン及びイミノチ オラクトンである。 ＧｎＲＨをリンカー基を介してＰＥに直接結合した免疫原性担体系の他に、本 発明はさらに、先ず、ＧｎＲＨ成分をオリゴペプチド骨格に結合させ、ＧｎＲＨ −骨格アセンブリーをＰＥに結合させた系を包含する。該骨格は１つ以上のＧｎ ＲＨ結合部位を含むように設計し得るので、ＰＥ上の各結合部位は１つ以上のＧ ｎＲＨを保有し得る。上記の架橋試薬はＧｎＲＨと該骨格との結合及び該骨格と ＰＥとの結合にも適用可能である。どちらのタイプの結合においても、即ち、骨 格を含む場合も含まない場合も、結合しなかったハプテンは全て結合反応後に除 去する必要がある。 従って、上記のリンカーの定義の範囲内での用語「ＧｎＲＨ−シュードモナス 複合体」は、骨格を含むか含まない かに拘わらず全てのＧｎＲＨ−ＰＥ複合体を包含する。 ＧｎＲＨ−骨格ＰＥ複合体は、式： （式中、Ａは独立に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、β−Ａｌａ及びＡｌａから選択 されるアミノ酸であり、但し、少なくとも１つのＡはＳｅｒ又はＴｈｒであり； Ｌ1は、任意に内部マーカーに結合したリンカーであり； Ｌ2は独立にリンカーであり； ＸはＧｎＲＨであり； Ｙ1及びＹ2は独立に、Ｌｙｓ又はＯｒｎであり； ｍは０〜３であり； ｎは１〜１０であり； ｐは０〜１であり； ｑは１又は２であり； ｒは１〜１０である） によって表し得る。 用語「骨格」は、以下に示されている一般式： （式中、変動成分は上記定義の通りである） によって表し得る。 骨格は、配列中に合計２７個までのアミノ酸を有し、そのうち少なくとも２個 は独立にオルニチン又はリシンである線状オリゴペプチドである。他のアミノ酸 は、非Ｌｙｓ非Ｏｒｎアミノ酸のうち少なくとも１個が親水性アミノ酸である小 型アミノ酸から選択される。適当な小型アミノ酸の例としては、アラニン、β− アラニン、グリシン、セリン及びトレオニンがあり、さらにセリン及びトレオニ ンは親水性である。親水性アミノ酸はセリン又はトレオニンが好ましく、最大５ 個の親水性アミノ酸残基を骨格中に取り込み得る。骨格オリゴペプチドが５〜１ ０個のアミノ酸を有し、そのうち１個又は２個がＳｅｒ又はＴｈｒであればなお 好ましい。リシン／オルニチン残基が少なくとも１個のアミノ酸を介して互いか ら分離され、リシン残基とオルニチン残基の間のスペーサーが約３〜８個のアミ ノ酸であるのが好ましい。 骨格の例としては、Ｌｙｓ−Ａn−Ｌｙｓ（ここで、ｎは、４〜７、より好ま しくは５又は６であり、Ａのうち１つはＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ａの残りは、 Ｇｌｙ、Ａｌａ及びβ−Ａｌａから選択される）がある。骨格のより特定的な例 には、［配列番号５］Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙ ｓ及び［配列番号６］Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−β−Ａｌａ− Ｇｌｙ−Ｌｙｓが含まれる。 用語「内部マーカー」とは、複合体の特性決定及びＧｎＲＨと担体タンパク質 の比率の計算を容易にするために組み込まれた非天然アミノ酸を意味する。該マ ーカーの例とには、β−Ａｌａ及びノルロイシンがある。 ＧｎＲＨとシュードモナスエクソトキシンとの化学結合用の「リンカー」は、 アミノ基及びスルフヒドリル基に対して反応性の基を有する任意のヘテロ二価架 橋剤から誘導され得る。例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル ３−（２− ピリジルジチオ）プロピオネート）、グルタルアルデヒド、イミノチオラン、ブ ロモアルカン酸無水物、マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−スクシンイミドエステル 、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステルなどを用い得る。好ましいリンカーは、式（ここで、末端Ｎ及びＳは結 合しているペプチド由来である）： （式中、Ｒは、Ｃ1−Ｃ5アルキレン、フェニル又はＣ5−Ｃ6シクロアルキレンで あり；ｓは１又は２である） を有する。 化学結合免疫原性担体系、即ち、リンカーを介してＰＥと結合したＧｎＲＨ、 及びＰＥに結合したＧｎＲＨ−骨格を構築する２つの方法を以下の図式に示す。 図式１ に対応する、結合、スクシンイミジルメチル又はチオメチルであり、ｒは１〜１ ０である。 第１のステップは、ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨと、ヘテロ二価リンカー、例えば、 マレイミドプロパノイルＮ−ヒドロ キシスクシンイミド（ＭＰＳ）、ブロモ酢酸無水物又はＳＰＤＰとの反応である 。ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨは、公知ペプチド合成法、好ましくは固相ペプチド合成 法を用いて製造する。「ＮεＨ2」はリシンのε−アミノ基である。 該反応は、極性溶媒中、（ａ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥ Ａ）のような非求核性有機塩基又は（ｂ）炭酸ナトリウム若しくは炭酸カリウム のような無機弱塩基から選択される塩基を用いて行う。極性溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジ メチルホルムアミド、水、アセトニトリル又はその混合物であってよい。Ｎ，Ｎ −ジメチルホルムアミドが好ましい。該反応は、０〜２５℃、好ましくは室温で 行い、一般に１０〜９０分間で完結する。該反応の後処理は、先ず、存在する塩 基をトリフルオロ酢酸のような酸で中和して混合物のｐＨを約２〜４にすること である。次いで、当業者に公知の方法を用いて生成物を単離する。 リンカー−ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ２と、１個以上の遊離スルフヒドリル官能基 を有するシュードモナスエクソトキシンとの結合は、窒素下に８〜１０のｐＨで 過剰なリンカー−ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨを用いて行う。シュードモナスエクソト キシン上のチオール置換基の各当量に対して通常 ２〜２０当量のＧｎＲＨ試薬を用いる。該反応は一般に極めて迅速であり、たっ た１〜５分で完了するが、その後、最大２時間まで熟成させても有害ではないこ とが知見された。当業者には公知の方法を用いてＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ複合体を 単離する。不要生成物の除去には反応混合物の透析が便利な方法であることが知 見された。一般に複合生成物は注射により投与されるので、得られた透析溶液を 滅菌濾過し、そのまま経皮投与用に用い得る。 図式２ (式中、変動成分は上記定義の通りである)。 図式２において、保護された内部マーカーであるβ−アラニンを有する骨格を ブロモ酢酸無水物と反応させて該骨格のＹ1及びＹ2残基の末端アミノ基（Ｎε） をブロモアセチル化する。該反応は、窒素下に、塩化メチレン、ジメチルホルム アミド又はその組み合わせのような不活性有機溶媒中、典型的には周囲温度で行 う。ブロモアセチル化骨格を、遊離スルフヒドリル基を有するＧｎＲＨ、例えば 、［ＤＣｙｓ6］ＧｎＲＨ又はＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−［Ｇｌｎ1］ＧｎＲＨと反応 させて、骨格支持ＧｎＲＨを得る。該反応は、水性アセトニトリル中室温で行い 、反応混合物のｐＨを、好ましくは約８、一般的には７．５〜８．５に維持する 。Ｆｍｏｃ保護基を例えばピペリジンを用いて除去し、脱保護ペプチドを、ジイ ソプロピルエチルアミンのような塩基の存在下に、ジメチルホルムアミドのよう な不活性有機溶媒中室温で、ＭＰＳのようなマレイミジルアルカン酸活性化エス テルと反応させて、マレイミド化骨格支持ＧｎＲＨを得る。 図式３ 図式３において、遊離チオールを有するシュードモナスエクソトキシン担体タ ンパク質を図式１に示されている骨格支持ＧｎＲＨ生成物と反応させて所望の複 合体を得る。遊離チオールは、遊離システインと結合させてもよいし、例えば、 ジチオトレイトールを用いて担体タンパク質中でジスルフィド結合を還元して生 成させてもよいし、又は、担体タンパク質をＮ−アルカノイルホモシステインチ オラクトンのようなチオール化剤と反応させて担体タンパク質中に導入してもよ い。担体タンパク質上には１個以上の遊離チオールが存在し得、従って、１個以 上の骨格支持Ｇｎ ＲＨを担体タンパク質上に添加し得る。 上記図式における反応順序は本発明を例示するに過ぎず、該順序は、本発明の 範囲内の他の変異形を得るべく、過度の実験を行うことなく当業者が適合又は改 変し得るものと理解されたい。 本発明の免疫原性担体系は、ＧｎＲＨとシュードモナスエクソトキシンＡとの ハイブリッドタンパク質であってもよい。そのようなハイブリッドタンパク質は 、構成タンパク質又はペプチドの近接配列を含む。該ハイブリッドタンパク質は 組換えＤＮＡ配列を発現させて製造するのが好ましい。 本発明の実施に用いられるＤＮＡは天然のものでも合成されたものでもよい。 本発明の実施態様をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメント は、以下の一般法に従って作製し得る： （ａ）所望のＤＮＡ配列を、該配列がクローン化されているプラスミドから切り 出し（又は、該配列を化学合成してもよい）； （ｂ）次いで、標的ＤＮＡ配列である第２のＤＮＡ配列を特定の位置で切断し； （ｃ）次いで、所望のＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列中の切断部と整列させ、２つ の配列を標準連結手順により結合する。得られた組換え遺伝子を発現ベクター中 の適当なプロモーターの下流で連結する。 本発明に用いられているようなＤＮＡの切断及び連結手順は一般に当業者には 周知のものであり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている 。 本発明に用いられるプロモーターは、遺伝子発現に用いられる宿主中での発現 に適当なものである限りどのプロモーターを用いてもよい。該プロモーターは対 応遺伝子から酵素的に作製することもできるし、化学合成することもできる。 全ての制限酵素の使用条件は、緩衝液及び温度に関する指示を含めて製造業者 の使用条件に従う。該酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅ ｔｈｅｓｄａＲｅｓｅｒａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ及びＰｒｏｍｅｇａから 入手し得る。 ベクターと挿入体ＤＮＡの連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い、６６ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＥ、１ｍＭのＡＴＰ（ｐ Ｈ７．５）中、１５℃で２４時間まで実施する。一般に、１〜２００ｎｇのベク ターと３〜５倍過剰の挿入体ＤＮＡが好ましい。 有組換えプラスミドを含む大腸菌の選択には、該細菌を適切な抗生物質含有Ｌ Ｂ寒天プレート上で画線培養するか、又は、培養フラスコ中、必要な場合には選 択用に適当な抗生物質を含有するＬＢ液（トリプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）中で培養することを含む。選 択用にどの抗生物質を選ぶかは、所与のプラスミド又はベクター上に存在する耐 性マーカーによって決定する。ベクターはアンピシリンにより選択するのが好ま しい。 大腸菌の培養には、２５０−３００ｒｐｍの振とう培養器を用い、エーレンマ イヤーフラスコ中で適切な選択用抗生物質を補ったＬＢ中で大腸菌を３７℃で増 殖させることを含む。他の温度（２５〜３５℃）を用いてもよい。タンパク質を 産生させるために細胞を増殖させる場合、該細胞 は、最終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いＡ５６０＝１で誘導する。あるいは、 誘発には、ｌｏｇ相増殖において他の細胞密度を選択してもよい。 収穫には、遠心による大腸菌細胞の回収ステップが含まれる。タンパク質を産 生させる場合、細胞は誘導後３時間してから収穫するが、他の収穫時間を選択し てもよい。 本発明において、ベクターは、宿主としての原核又は真核生物細胞中で複製さ れ得る限り、プラスミドのような任意のベクターを用いてよい。 最も好ましい宿主細胞は大腸菌ＨＢ１０１である。しかし、他の多くの大腸菌 株も適当である。日常的なクローニングには、大腸菌株ＤＨ５ａ（ＢＲＬ）を用 い得る。 本発明において、ハイブリッドタンパク質は、周知の分離及び精製法を適当に 組み合わせて分離、精製し得る。これらの方法には、溶解度の違いを利用する方 法（例えば、塩沈降法及び溶媒沈降法）、主として分子量の違いを利用する方法 （例えば、透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳 動）、電荷の違いを利用する方法（例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィ ー）、特異的親和性を利用する方法（例えば、アフィニティーク ロマトグラフィー）、疎水性の違いを利用する方法（例えば、逆相高性能液体ク ロマトグラフィー）、等電点の違いを利用する方法（例えば、等電点電気泳動） 、並びに変性、還元、再生及び酸化を用いる方法が含まれる。 本発明の免疫原性担体系は、家畜用と同様ヒト用薬剤にも効力を有する。これ は、ヒトにおいて去勢及び避妊薬を用いるにはいくつかの重要な生物学的理由が 存在するという事実による。例えば、乳ガンと前立腺ガンとは、２つの例しかな いが、そのようなホルモン操作に応答する性ステロイド依存性腫瘍である。ヒト 薬剤における別の適用領域は子宮内膜症の治療である。女性の腹膜と骨盤に痛み を伴う子宮内膜組織の増殖を引き起こすこの症状も、性ステロイド合成の阻害に 応答する。当業者には、本明細書に開示されている化合物を用いて性ステロイド の分泌を部分的に低減させ、それによって特定の疾患状態における特定のホルモ ン関連作用を低減又は排除し得ることも理解されよう。 本発明の免疫原性担体系は、生殖及び／若しくは生殖ホルモン誘導挙動の低減 若しくは排除が望ましい症状、生理学若しくは解剖学に対する家畜用薬剤又は動 物畜産学にも用い得る。動物の断種は主として生殖腺除去手術により実 施されている。手術は必然的に動物に対してある程度の疼痛、外傷及びストレス を与え、感染及び死をもたらす可能性もある。食用動物では、望ましくない挙動 又は肉特性を制御する手段として去勢が用いられているが、去勢により実質的な 生産高の損失が生ずる。ブタの場合、去勢しない雄は去勢雄よりはるかに高い飼 料効率（約１８％）を有している。しかし、去勢しない雄の脂肪中にはアンドロ ステノンが堆積し、それによって肉に望ましくない臭いと臭気を与える。 従って、本発明の別の態様は動物の断種法を提供し、該方法は、該動物に、シ ュードモナスエクソトキシン又はその変異体に結合したＧｎＲＨを含む免疫原性 担体系を断種に有効な量投与することを含む。本発明の免疫原性担体系を用いる 予防接種により去勢手術の必要がなくなる。従って、去勢手術に関連する疼痛、 ストレス、外傷、感染症、死、生産高の損失や動物の健康問題が排除される。予 防接種の望ましい結果には、遷移的断種、望ましくない生腺ステロイドホルモン 誘導挙動（例えば、雄の攻撃性及び雌の発情期挙動）の抑制、飼料効率や食用動 物（例えば、ブタ及びウシ）のカーカス品質の向上、並びに雄ブタカーカス における去勢しない雄ブタの雄性痕跡を排除する方法が含まれる。 これらの化合物の使用に係わる投薬量／時間の調整は、治療すべき動物の種、 特定のＧｎＲＨ及び／又は使用する担体、アジュバント、動物の年令や、所望の 予防接種結果のような種々の要素に応じて大きく異なり得る。一般に、免疫原性 担体系は、１回投薬量当たり１〜１，０００μｇの複合体の割合で皮下又は筋肉 内注射により哺乳動物に投与する。本発明の免疫原性担体系の単位投薬量は、断 種に要する全量であってもよいし、１〜６週間間隔で多重投薬量を投与する断種 計画を用いてもよい。さらに、断種剤として本発明の化合物を青春期前後に用い て断種を遅らせることもできる。この方法は、手術によらない断種の実施時期を 自由に変更し得ることに関連する利点が、飼料効率、肉の生産高及び／又は品質 に有利に貢献し得る動物畜産分野において特に有用である。 ブタの場合、該免疫原性担体系を用いて去勢しない雄ブタ様成長効率及びカー カス品質を最大限にしながら、去勢しない雄ブタの肉の不快な臭気や味を排除す ることができる。これは、成育期間中の種々の時期に１回又は２回の筋 肉内又は皮下注射により達成し得る。便利且つ効果的な計画の一例は、飼育／仕 上げ施設内に収容している時期（９〜１６週齢）における初期の予防接種と、成 育期（１８〜２２週齢）における追加免疫とからなる。いずれの予防接種も、投 薬量は、約１〜約１，０００μｇ、好ましくは約１０〜約１００μｇの免疫原性 担体系を用いる。単一投薬計画の場合、免疫原性担体系の量は一般に、２回以上 の投薬計画に用いられる量より高いレベルである。 飼育場（feedlot）のウシは、ブタに用いたものと類似の方法で治療し得、飼 育場への参入時と、所望の効果（即ち、雌ウシでは避妊、雄ウシでは最大の成長 ）により決定される別の時期に予防接種を行う。雌ウシは、避妊のために雌雄混 合飼育場に入れる前に予防接種を完了させておく必要があるが、性別に分けた飼 育場に入れる場合には、発情期挙動を防止するために飼育場への参入時と参入し てから４〜１２週後に予防接種する。雄ウシは、飼料効率を最大にするために出 来るだけ遅く且つ攻撃性の防止や肉のマーブル化を得るのに十分間に合うような 早い時期に予防接種を行う必要がある。 イヌやネコのような愛玩動物の場合、ＧｎＲＨワクチン は、標準予防接種を行う時期に皮下又は筋肉内注射により投与し得る（６〜２１ 週齢では６ヶ月に１回、その後毎年１回の追加免疫）。 イヌ、ネコ及びウマのような成動物の去勢には、２投薬量を２〜８週間隔で投 与し、次いで、毎年、去勢に十分な量の追加免疫を行う必要がある。実際の投薬 量及び配合は、用いられる特定の免疫原性担体系に応じて異なり得る。しかし、 ミョウバン上に配合され、１〜３ｍｌの容量で投与される本発明の免疫原性担体 系１〜２，０００μｇ、好ましくは約５００μｇは、上記のように投与すると十 分有効であり得る。 ヒトの場合、本発明の免疫原性担体系を用いて性ステロイド応答性腫瘍を治療 し得る。ワクチン１投薬量当たり１〜１，０００μｇの免疫原性担体系を２用量 ２〜８週間隔で投与し、腫瘍が無くなるかホルモン療法に対する応答が認められ なくなるまで６〜１２ヶ月毎に追加免疫し得る。 本発明の免疫原性担体系は、注射部位に病変を作ったり肉用動物のカーカス品 質を低下させたりする完全フロイントアジュバントのような強烈なアジュバント を用いることなく上記用途に用いることができる。適当なアジュバント は、当業者により、許容し得ない有害反応を起こすことなく免疫原に対する哺乳 動物の免疫応答を促進する物質であると認められた物質であり、そのようなアジ ュバントには、Ａｌ（ＯＨ）3、ＡｌＰＯ4、Ａｌ2（ＳＯ4）3のようなアルミニ ウム化合物、スクアラン又はスクアレンのような適切な溶媒中の不完全フロイン トアジュバント（ＩＦＡ）、 アセテート可溶化物質、サポニン、ムラミルジペプチドのような油中水滴型エマ ルションが含まれる。 好ましい実施態様において、本発明の免疫担体系は、代謝性油、ポリオキシプ ロピレン（ＰＯＰ）−ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ブロックポリマーのような 非イオン界面活性剤、乳化剤、及び、場合によって、式１ ｛式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ1-8アルキル、ベンジル、フェニル又 はＣＯＲ4〔ここで、Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、ベンジル若 しくは フェニル（該フェニル部分は、ヒドロキシ、１〜４個の炭素原子を有するカルボ キシ、ハロ、Ｃ1-4アルコキシ、Ｃ1-4アルキル及びＣ2-4アルケニルから選択さ れる最大３個の置換を有し得る）、ＳＯ3Ｍ又はＰＯ3Ｍ（ここで、Ｍは、Ｈ又は ナトリウム若しくはカリウムである）である〕であり； Ｒ2はＨ又はＯＲ1であり； Ｒ3はＯＲ1であるか、あるいはＲ3とＲ4が一緒になってオキソを形成し； Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は独立にＨ又はメチルであり； 但し、Ｒ3とＲ4が一緒になってオキソを形成するとき、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ2 はそれぞれＨであり；Ｒ2がＨのとき、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ水素で あり、Ｒ3はＯＲ1である｝ の免疫応答エンハンサーを含む水中油滴型エマルションとして投与される。 ワクチン組成物において、代謝性油は、６〜３０個の炭素原子を有する油であ ってよく、該油の例としては、アルカン、アルケン、アルキンや、それらの対応 酸及びアルコール、そのエーテル及びエステル、並びにその混合物が含 まれる。該油は、アジュバントが投与される患者の体内で代謝され得且つ生体に 対して無毒性の任意の植物油、魚油、動物油又は合成油であってよい。植物油の 例には、落花生油、大豆油、椰子油、オリーブ油、サフラワー油、綿実油、ヒマ ワリ油、ゴマ油及びコーン油が含まれる。動物油は生理的温度では通常固体であ るが、脂肪酸は、動物の脂肪から、遊離脂肪酸を提供する、部分又は完全トリグ リセリドけん化により得ることができる。殆どの魚は容易に回収し得る代謝性油 を含んでいる。例えば、タラ肝油及びサメ肝油が魚油の例である。げい鑞のよう なクジラ油も許容し得る。多くの分枝鎖油は、Ｃ5イソプレン単位として生化学 的に合成され、一般に、テルペノイドと称されている。サメ肝油は、スクアレン として知られている分枝鎖不飽和テルペノイドを含んでいる。スクアレンの飽和 類似体であるスクアランは、本発明の特に好ましい油である。本発明のアジュバ ント組成物及びワクチン中の油成分は通常、１〜１０％、好ましくは２．５〜５ ％の量で存在する。 用語「ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックポリマー」とは、 プロピレンオキシド次いでエチレンオキシドを、低分子量の反応性化合物、通常 プロピレン グリコールに逐次付加して形成されたポリマーを指す。これらのブロックポリマ ーは、Ｌｕｎｓｔｅｄに対して発行された米国特許第２，６７４，６１９号に記 載の方法に従って製造し得、ＢＡＳＦ−Ｗｙａｎｄｏｔｔｅから商標 ロックポリマーの特性は、ＰＯＰ核の分子量と製品中のＰＯＥの割合によって決 定される。ＰＯＰ部分はブロックポリマーに疎水性を付与し、ＰＯＥ部分は親水 性を付与する。 とそれに続く２又は３個のアラビア数字で示される。文字の接頭辞（Ｌ、Ｐ又は Ｆ）は、各ポリマーの物理的形態（液体、ペースト又は薄片化性固体）を指す。 最初の１つ又は２つのアラビア数字は、ＰＯＰベースの平均分子量をコードし、 最後のアラビア数字はＰＯＥの量を示す。例え ０のポリオキシプロピレンベースと、該分子の末端に存在する１０％ポリオキシ エチレンを有する液体である。好ましいブロックポリマーは、約１５〜４０℃の 温度範囲にわたり液体であるものである。さらに、上記温度範囲内では液体であ る、液体とペースト、液体とペーストと薄片化性 固体又は液体と薄片化性固体混合物といった高分子混合物も本発明において有効 であり得る。 好ましいブロックポリマーは、約２，２５０〜４，３００の分子量範囲のＰＯ Ｐベースと、約１〜３０％の量のＰＯＥを有するものである。より好ましいブロ ックコポリマーは、ＰＯＰが３，２５０〜４，０００の範囲の分子量を有し、Ｐ ＯＥ成分が１０〜２０％を構成するものである。 及びＬ１２２は該定義の範囲内に含まれる。最も好ましいのは、分子量４，００ ０のＰＯＰと１０％の量のＰＯＥを有するか、又は分子量３，２５０のＰＯＰと １０％の量のＰＯＥを有するブロックポリマー、例えば、それぞれ、Ｐ である。該ブロックポリマーは、好ましくは０．００１〜１０％、最も好ましく は０．００１〜５％の量で用いる。 用語「乳化剤」とは、エマルションを安定化し得る無毒性の界面活性剤を指す 。医薬品化学では一般に相当数の乳化剤や懸濁化剤が用いられている。それらに は、ガム類、植物性タンパク質、アルギネート、セルロース誘導体、リン脂質（ 天然又は合成）などのような天然物質が包含され る。ポリマー骨格上に親水性置換基を有する特定のポリマー、例えば、ポビドン 、ポリビニルアルコール及びグリコールエーテルベース化合物は乳化活性を有し ている。長鎖脂肪酸由来の化合物は、本発明に使用し得る第３の実質的乳化及び 懸濁化剤群である。無毒性である限り上記乳化剤のいずれを用いてもよいが、グ リコールエーテルベースの乳化剤が好ましい。好ましい乳化剤は非イオン界面活 性剤である。該界面活性剤には、ポリエチレングリコール（特に、ＰＥＧ ２０ ０、３００、４００、６００及び９０ ｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．から入手可能）、ポリオキシエチレン、 ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレ ン脂肪エーテル、蜜蜂ろう誘導体含有ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン ラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エス テル若しくは他のポリオキシエチレン酸アルコール又は１２〜２１個の炭素原子 を有する長鎖脂肪酸のエーテル誘導体が含まれる。好ましい乳化剤は、（ポリソ ルベート ８０又はポリオキシエチレン ２０ソルビタンモノオレエートとしても知られている）Ｔ れば上記乳化剤のいずれもが適当であるものと理解されたい。通常、乳化剤は、 約０．０５〜約０．５％、好ましくは約０．２〜１％の量で用いられる。 本発明のアジュバント組成物の水性部分は、緩衝された等浸透圧の食塩水であ る。組成物と標準生理液とのイオン濃度の違いによる投与後の膨張又は組成物の 急速吸収を阻止するために、張度が標準生理液と実質的に同じになるようにこれ らの溶液を調製するのが好ましい。ｐＨを標準生理条件に適合し得るように維持 するために食塩水を緩衝するのも好ましい。また、特定の場合、糖ペプチドのよ うな特定の組成物成分の安定性を確保するためにｐＨを特定のレベルに維持する 必要があり得る。本発明にはいずれの生理的に許容し得る緩衝液を用いてもよい が、リン酸塩緩衝液を用いるのが最も便利であることが知見された。リン酸塩緩 衝液の代りに、酢酸塩、トリス、重炭酸塩、炭酸塩などのような他の任意の許容 し得る緩衝液を用いてもよい。リン酸塩緩衝塩水か、又はリン酸塩と酢酸塩の混 合物で緩衝した食塩水を用いるのが好ましい。 式１の免疫応答エンハンサーは、当業界では周知の化合物（例えば、デヒドロ エピアンドロステロン）でもよいし、Ｒ．Ｍ．Ｌｏｒｉａの米国特許第５，２７ ７，９０７号又はＮｅｕｒｏｃｒｉｎｅ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＷＯ９５／ １０５２７号の開示に従って製造してもよい。本発明のワクチン組成物の好まし い実施態様においては、免疫強化量の免疫応答エンハンサーが含まれる。より好 ましくは、免疫応答エンハンサーは、式ａ（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7 はそれぞれＨであり、Ｒ3とＲ4は一緒になってオキソ基を形成する）の化合物で あり、該化合物はデヒドロエピアンドロステロン又はＤＨＥＡである。 本発明のワクチン組成物において、免疫原性担体系は、任意のＧｎＲＨ−ＰＥ 複合体又はＧｎＲＨ−ＰＥハイブリッドであってよい。本発明の免疫原性担体系 は、ＧｎＲＨとシュードモナスエクソトキシンＡとのハイブリッドタンパク質で あってもよい。そのようなハイブリッドタンパク質は構成タンパク質／ペプチド の近接配列を含んでいる。該ハイブリッドタンパク質は組換えＤＮＡ配列を発現 させて製造するのが好ましい。 本発明の実施に用いられるＤＮＡは天然のものでも合成 したものであってもよい。本発明の実施態様をコードするヌクレオチド配列を含 む組換えＤＮＡセグメントは、以下の一般法に従って作製し得る： （ａ）所望のＤＮＡ配列を、該配列がクローン化されているプラスミドから切り 出し（又は、該配列は化学合成してもよい）； （ｂ）次いで、標的ＤＮＡ配列である第２のＤＮＡ配列を特定の位置で切断し； （ｃ）次いで、所望のＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列中の切断部と整列させ、２つ の配列を標準連結手順により結合する。得られた組換え遺伝子を発現ベクター中 の適当なプロモーターの下流で連結する。 本発明に用いられているＤＮＡの切断及び連結手順は一般に当業者には周知の ものであり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。 本発明に用いられるプロモーターは、遺伝子発現に用いられる宿主中での発現 に適している限りどのプロモーター を用いてもよい。該プロモーターは対応遺伝子から酵素作用的に作製することも できるし、化学合成することもできる。 全ての制限酵素の使用条件は、緩衝液及び温度に関する指示を含めて製造業者 の使用条件に従う。該酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅ ｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅｒａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ及びＰｒｏｍｅｇａから入手し得る。 ベタターと挿入体ＤＮＡの連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い、６６ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＥ、１ｍＭのＡＴＰ（ｐ Ｈ７．５）中１５℃で２４時間まで実施する。一般に、１〜２００ｎｇのベクタ ーと３〜５倍過剰の挿入体ＤＮＡが好ましい。 組換えプラスミドを含む大腸菌の選択には、該細菌を、適切な抗生物質含有Ｌ Ｂ寒天プレート上で画線培養するか、又は、培養フラスコ中、必要な場合には選 択用に適当な抗生物質を含有するＬＢ液（トリプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）中で培養することを含む。選 択用にどの抗生物質を選ぶか は、所与のプラスミド又はベクター上に存在する耐性マーカーによって決定する 。ベクターはアンピシリンにより選択するのが好ましい。 大腸菌の培養には、２５０−３００ｒｐｍの振とう培養器を用い、エーレンマ イヤーフラスコ中の適切な選択用抗生物質を補ったＬＢ中３７℃で大腸菌を増殖 させることを含む。他の温度（２５〜３５℃）を用いてもよい。タンパク質産生 のために細胞を増殖させる場合、該細胞は、最終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを用 いてＡ５６０＝１で誘導する。あるいは、誘発には、ｌｏｇ相増殖において他の 細胞密度を選択してもよい。 収穫には遠心による大腸菌細胞の回収ステップが含まれる。タンパク質を産生 させる場合、細胞は誘導後３時間してから収穫するが、他の収穫時間を選択して もよい。 本発明において、ベクターは、宿主としての原核又は真核生物細胞中で複製さ れ得る限り、プラスミドのような任意のベクターを用いてよい。 最も好ましい宿主細胞は大腸菌ＨＢ１０１である。しかし、他の多くの大腸菌 株も適当である。日常的なクローニングには大腸菌株ＤＨ５ａ（ＢＲＬ）を用い 得る。 本発明において、ハイブリッドタンパク質は、周知の分離及び精製法を適当に 組み合わせて分離、精製し得る。これらの方法には、溶解度の違いを利用する方 法（例えば、塩沈降法及び溶媒沈降法）、主として分子量の違いを利用する方法 （例えば、透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳 動）、電荷の違いを利用する方法（例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィ ー）、特異的親和性を利用する方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィ ー）、疎水性の違いを利用する方法（例えば、逆相高性能液体クロマトグラフィ ー）、等電点の違いを利用する方法（例えば、等電点電気泳動）、並びに変性、 還元、再生及び酸化を利用する方法が含まれる。 本発明のワクチン組成物の好ましい実施態様において、水中油滴型エマルショ ンは、スクアラン、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１を含む。 該ワクチンが免疫応答エンハンサーとしてＤＨＥＡを含むのがより好ましい。シ ュードモナスエクソトキシンがＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲであればなお好ましい 。 該水中油滴型エマルションアジュバント組成物は、均一エマルションを形成す るミキサーを用いて乳化して製造す る。典型的には、該アジュバント組成物は、ＧｎＲＨ複合体に添加する前に超微 粒子流動化（microfluidize）する。該エマルションを超微粒子流動化装置を通 して約２〜２０回循環させる。次いで、ＧｎＲＨ複合体をアジュバント組成物と 混合するが、該混合物を超微粒子流動化装置を通して再度循環させてもよい。免 疫応答エンハンサー、例えば、ＤＨＥＡをワクチン組成物中に組み込む場合、該 エンハンサーは、微粒子流動化する前にアジュバント組成物に加えてもよいし、 ＧｎＲＨ複合体をアジュバント組成物と混合した後で加えてもよい。後者の場合 には、全混合物を再度超微粒子流動化し、一般に２〜２０回超微粒子流動化装置 を通して循環させる必要がある。該エマルション中の油性粒子は約０．０３〜０ ．５μｍの粒径を有するのが好ましく、該粒径が０．０５〜０．２μｍであれば より好ましい。ＧｎＲＨの調製 製剤１．ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ：［配列番号７］ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓ ｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ2： 該ペプチドは、ＡＢＩ モデル４３１Ａシンセサイザー及び単一のカップリン グ（ＤＣＣ／ＨＯＢＴ）を用い、固 相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）に従ってＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．２５ ｍｍｏｌ，Ａｍｉｎｏ Ｔｅｃｈ）上で合成した。試薬Ｒ（１ｍｌ／１００ｍｇ 樹脂、ＴＦＡ／チオアニソール／エタンジチオール／アニソール，９０：５： ３：２）を用い、樹脂からペプチドを切り離した。ジエチルエーテルを用い、濃 縮切断混合物からペプチドを沈降させ、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒ ｅｐＰ Ｂ，０−２０分；次いで２０−３５％ Ｂ，２０−４０分；λ＝２３０ｎｍ）に かけて精製した。 ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ：ＦＡＢ−ＭＳ（陽イオン，ＮＢＡマトリックス）計算値 ：Ｍ＋１＝１２５４．４４；実測値：Ｍ＋１＝１２５４．４。 製剤２：［ＤＣｙｓ6］ＧｎＲＨ：［配列番号８］ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ− Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＣｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ2 Ｒｉｎｋアミド樹脂（５２１ｍｇ）を逐次Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、 Ｄ−Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、ピログルタミン酸と結合した。 Ａｒｇ及びＧ ｌｙ残基を二重カップリングし、他の残基は単一カップリングした。樹脂をメタ ノールで３回洗浄し、窒素下に乾燥した（１．０６９ｇの樹脂＝０．５３９ｇの 増量）。 ペプチドを３時間切断し、樹脂を濾去、ペプチドを真空乾燥した。残留物をジ エチルエーテルですり砕き、沈降したペプチドを吸引濾過して回収し、凍結乾燥 した（４３１．７ｍｇ）。 ペプチドの一部（１９５．５ｍｇ）を０．１％ＴＦＡ、１０％アセトニトリル （３ｍｌ）に溶解し、濾過、ＲＰＨＰＬＣ（２つのタンデム型２５×１０ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ18カラムを用いる３０分間の１５−４５％アセトニト リル）にかけて精製した。ペプチドの第２の部分を反復精製した（１９０．５ｍ ｇ）。ピーク画分を回収し、合わせて凍結乾燥し、アリコートをＦＡＢ−ＭＳ及 びアミノ酸分析にかけて分析した。予測質量（１２２９）及びアミノ酸組成を確 認した。 製剤３．３−（メルカプトプロパノイル）−［Ｇｌｎ1］ＧｎＲＨ：［配列番号 ９］ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＨＮ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌ ｙ−Ｌ ｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ2 未添加Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，０ ．２５ｍｍｏｌ）を用い、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｆｍｏｃ 化学）でＧｌｎ1残基までのペプチドを調製した。最初のＧｌｙ残基を樹脂上に 二重カップリングした。Ａｒｇを除く他の全てのアミノ酸は単一カップリングし た。Ａｒｇ8の場合には、標準二重カップリングプロトコルを用いた。ペプチド からＮ末端のＦｍｏｃ基を除去し、樹脂を乾燥（Ｎ2）した。樹脂を、フリット 化底部を有する手動ペプチド合成容器（攪拌にはＮ2を使用）に移した。樹脂を ＤＭＦ（５ｍｌ）に懸濁し、ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ活性化（１ｍｍｏｌのＰｙＢ ＯＰ、０．１ｍｍｏｌのＨＯＢｔ）を用い３−メルカプトプロピオン酸（１ｍｍ ｏｌ）をアミノ末端に手動カップリングし、樹脂のカイザーテストにより反応が 完結したことが示されるまで（１６〜４８時間）Ｎ2下に攪拌した。２０ｍｌの 脱気「試薬Ｒ」（９０：５：３：２のＴＦＡ／チオアニソール／エタンジチオー ル／アニソール）を用い室温で３時間樹脂からペプチドを切り離した。混合物を 濾過し、濾液を真空濃縮した。残留物をエーテルですり砕き、 沈降物を回収、乾燥した（２７２．１ｍｇ）。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｄｅｌｔａ Ｐ ａｋ Ｃ18，ＲＣＭ２−５０×１０，４５ｍｌ／分，１６→２４％ ＣＨ3ＣＮ ，３０分）にかけてペプチドを精製した。所望生成物を含む画分を合わせ、一晩 凍結乾燥し、白色粉末としペプチドを得た（９８ｍｇ，３１％）。Ｅｌｅｃｔｒ ｏｓｐｒａｙ ＭＳにより、予測分子量（Ｍ＋Ｈ＝１２８８）が示された。 製剤４．［（３−メルカプトプロパノイル）−Ｇｌｎ1，ｄＡｌａ6］−ＧｎＲＨ ：［配列番号１０］ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ −Ｔｙｒ−ＤＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ2 未添加Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ，０． ２５ｍｍｏｌ）を用い、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｆｍｏｃ化 学）上でＧｌｎ1残基までのペプチドを調製した。最初のＧｌｙ残基を樹脂上に 二重カップリングした。Ａｒｇを除く他の全てのアミノ酸は単一カップリングし た。Ａｒｇ8の場合には、標準二重カップリングプロトコルを用いた。ペプチド からＮ末端のＦｍｏｃ基を除去し（ＡＢＩ上でのレギュラーピ ペリジンサイクル）、樹脂を乾燥（Ｎ2）した。樹脂を、フリット化底部を有す る手動ペプチド合成容器（攪拌にはＮ2を使用）に移した。樹脂をＤＭＦ（５ｍ ｌ）に懸濁し、ＰｙＢＯＰ／ＨｏＢｔ活性化（１ｍｍｏｌのＰｙＢＯＰ、０．１ ｍｍｏｌのＨＯＢｔ）を用い３−メルカプトプロピオン酸（１ｍｍｏｌ）をアミ ノ末端に手動カップリングし、樹脂のカイザーテストにより反応が完結したこと が示されるまで（１６〜４８時間）Ｎ2下に攪拌した。２０ｍｌの脱気「試薬Ｒ 」（９０：５：３：２のＴＦＡ／チオアニソール／エタンジチオール／アニソー ル）を用い室温で３時間樹脂からペプチドを切り離した。混合物を濾過し、濾液 を真空濃縮した。残留物をエーテルですり砕き、沈降物を回収、乾燥した（２３ ２．０ｍｇ）。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ18，ＲＣＭ２−５０× １０，４５ｍｌ／分，１５→３０％ ＣＨ3ＣＮ，３０分）にかけてペプチドを 精製した。所望生成物を含む画分を合わせ、一晩凍結乾燥して、白色粉末として ペプチドを得た（１１２ｍｇ，３５％）。Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ＭＳによ り、予測分子量（Ｍ＋Ｈ＝１３０３）が示された。 製剤５．ＤＬｙｓ6−ＤＡｌａ10−ＧｎＲＨ：［配列番号１１］ｐＧｌｕ−Ｈｉ ｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＤＡｌａ− ＮＨ2： ＡＢＩ モデル４３１Ａペプチドシンセサイザー及び単一のカップリング（Ｄ ＣＣ／ＨＯＢＴ）を用い、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（０．２５ｍｍ ｏｌ，Ａｍｉｎｏ Ｔｅｃｈ）上でペプチドを合成した。「試薬Ｒ」（２．０ｍ ｌ／１００ｍｇ樹脂，９０：５：３：２のＴＦＡ／チオアニソール／エタンジチ オール／アニソール）を用い樹脂からペプチドを切り離した（室温、３時間）。 ジエチルエーテルを用い濃縮切断混合物からペプチドを沈降させ、分取逆相ＨＰ ＬＣにかけて精製した。ＦＡＢ−ＭＳによる６−Ｄ−Ｌｙｓ−１０−Ｄ−Ａｌａ −ＧｎＲＨの特性決定（陽イオン，ＮＢＡマトリックス）計算値：（ｍ＋１）＝ １２６８．５；実測値：（ｍ＋１）＝１２６７．５。 製剤６．ＤＬｙｓ6−Ｐｒｏ9−ＮＨＥｔ−ＧｎＲＨ：［配列番号１２］ｐＧｌｕ −Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ Ｅｔ： ＡＢＩ モデル４３１Ａシンセサイザー及び単一カップ リング（ＤＣＣ／ＨＯＢＴ）を用い固相ペプチド合成法（Ｂｏｃ化学）に従って Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂上でペプチドを合成した。無水エチルアミンを用い、 樹脂からペプチドを切り離した（２４〜７２時間、室温）。粗保護ペプチドをジ エチルエーテルで沈降させ、吸引濾過して回収し、一晩（Ｐ2Ｏ5で）乾燥した。 アニソール（０．２〜２ｍｌ）及び亜リン酸ジメチル（０．１〜１ｍｌ）の存在 下に無水ＨＦで処理（０℃、０．５〜２時間、５〜３０ｍｌ）して、乾燥ペプチ ドから保護基を除去した。過剰なＨＦを真空除去し、残留物をジエチルエーテル ですり砕いた。分取逆相ＨＰＬＣにかけてペプチドを精製した。ＦＡＢ−ＭＳ（ 陽イオン、ＮＢＡマトリックス）による特性決定：実測値：（ｍ＋１）＝１２２ ３．９。 製剤７．ＤＯｒｎ6−ＧｎＲＨ：［配列番号１３］ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ− Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＯｒｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ2： ＡＢＩ モデル４３１Ａシンセサイザー及び単一のカップリング（ＤＣＣ／Ｈ ＯＢＴ）を用い固相ペプチド合成法（Ｆｍｏｃ化学）に従ってＲｉｎｋ Ａｍｉ ｄｅ ＭＢＨ Ａ樹脂（０．２５ｍｍｏｌ，Ａｍｉｎｏ Ｔｅｃｈ）上でペプチドを合成した。 試薬Ｒ（２．０ｍｌ／１００ｍｇ樹脂、ＴＦＡ／チオアニソール／エタンジチオ ール／アニソール、９０：５：３：２）を用い、樹脂からペプチドを切り離した （３時間、室温）。ジエチルエーテルを用い濃縮切断混合物からペプチドを沈降 させ、分取逆相ＨＰＬＣにかけて精製した。ＦＡＢ−ＭＳ（陽イオン、ＮＢＡマ トリックス）による６−Ｄ−Ｏｒｎ−ＧｎＲＨの特性決定：計算値：（ｍ＋１） ＝１２３９．４；実測値：（ｍ＋１）＝１２３９．５。 製剤８．３−インドリルプロピオニル−６−ＤＬｙｓ−ＧｎＲＨ：３−インドリ ルプロピオニル−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −ＮＨ2 ＡＢＩ モデル４３１Ａシンセサイザー及び単一のカップリング（ＤＣＣ／Ｈ ＯＢＴ）を用い固相ペプチド合成法（Ｆｍｏｃ化学）に従ってＲｉｎｋ Ａｍｉ ｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（０．２５ｍｍｏｌ，Ａｍｉｎｏ Ｔｅｃｈ）上でペプチド を合成した。試薬Ｒ（２．０ｍｌ／１００ｍｇ樹脂、ＴＦＡ／チオアニソール／ エタンジチオール／アニソ ール、９０：５：３：２）を用い、樹脂からペプチドを切断した（３時間、室温 ）。ジエチルエーテルを用い濃縮切断混合物からペプチドを沈降させ、分取逆相 ＨＰＬＣにかけて精製した。ＦＡＢ−ＭＳ（陽イオン、ＮＢＡマトリックス）に よる３−インドリルプロピオニル−６−Ｄ−Ｌｙｓ−ＧｎＲＨの特性決定：計算 値：（ｍ＋１）＝９９０．２；実測値：（ｍ＋１）＝９９０．７。 製剤９．３−インドリルプロピオニル−６−ＤＬｙｓ−９−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ− ＧｎＲＨ：３−インドリルプロピオニル−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＬｙｓ−Ｌｅｕ− Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ ＡＢＩ モデル４３１Ａシンセサイザー及び単一のカップリング（ＤＣＣ／Ｈ ＯＢＴ）を用い固相ペプチド合成法（Ｂｏｃ化学）に従ってＭｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄ樹脂上でペプチドを合成する。３−インドリルプロピオニル部分はＮ−ホルミ ル−３−インドールプロピオン酸として組み込む。無水エチルアミンを用いて樹 脂からペプチドを切り離す（２〜７２時間、室温）。粗保護ペプチドをジエチル エーテルで沈降させ、吸引濾過して回収し、一晩乾燥する（Ｐ2 Ｏ5）。アニソール（０．２〜２ｍｌ）及び亜リン酸ジメチル（０．１〜１ｍｌ ）の存在下に無水ＨＦで処理（０℃、０．５〜２時間、５〜３０ｍｌ）して乾燥 ペプチドから保護基を除去する。過剰なＨＦを真空除去し、残留物をジエチルエ ーテルですり砕く。分取逆相ＨＰＬＣにかけてペプチドを精製し、ＦＡＢ−ＭＳ により特性決定する。シュードモナスエクソトキシンの調製 製剤１０．ＮＬｙｓ ＰＥ４８ＱＱＲ プラスミドＰＪＨ４〔Ｊ．Ｈｗａｎｇ，“Ｃｅｌｌ”（１９８７，４８；１２ ９−１３６）参照〕はＰＥ1-613のコード配列を含んでいる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ，Ｆｒｉｔｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ Ｐｒｅｓｓ）により編纂されたＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２ 版（１９８９）の１５．５１〜１５．７３に記載されているオリゴヌクレオチド 突然変異誘発法が、ＰＥ分子に欠失／突然変異を形成する便利な方法として用い られてきた。ＰＪＨ４でＮｄｅＩ／ＨｉｎｄIIIを二重消化して構築物を線状化 し、ＰＥコード配列のＡＴＧ出発コドンを含む１２ｂｐのセグメントをクリッピ ングする。２つの相補的オリゴヌクレオチドを合成 し、アニーリングして、ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄIIIスプライス部位に連結する。該 オリゴマーは以下のヌクレオチド配列を有する：１−５′ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＧＣ ＣＧＡ ＡＧＡ ３′及びII−５ ′ＡＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＣＡＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡ ３′。改変されたＰＥ挿入体はＮ末端で構築されたＭＬＱＧＴＫＬ ＭＡＥＥ配列を有する。このプラスミドをＰＪＨ４２と称する。 該プラスミドＰＪＨ４２をＡｖａＩで部分的に切断する。直鎖状ＤＮＡを単離 し、ＨｉｎｄIIIで完全に消化し、得られた５．１ｋｂのフラグメントを単離す る。Ｓ１ヌクレアーゼ処理して、平滑末端を連結し、該プラスミドを再環化し、 ＰＪＨ４３と称する。これにより、アミノ酸４−２５２が欠失したＰＥを得る。 プラスミドＰＪＨ４３の５５３ｂｐのＳａｌＩ／ＢａｍＨ１フラグメントをＭ １３ｍｐ１９にクローン化する。構造５′ＧＧＣ ＧＴＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＧＣ ＣＧＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＧＧＣ ＣＴＣ ＧＴＣ ＧＴＴ ＧＣ ３′を有する長さ５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを合成し 、一本鎖Ｍ１３ベクターとアニーリングして、ＰＥ挿入体のア ミノ酸３６５−３８０の欠失を生成する突然変異誘発を容易にし（ループアウト し）、以下の配列を得る： ５０５ｂｐのＳａｌＩ／ＢａｍＨ１フラグメントをＭ１３の複製型変異体ＤＮ Ａから切り出し、プラスミドＰＪＨ４３の３．７ｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨ１フ ラグメントと連結する。この新たなプラスミドをＰＪＨ４４を称する。 ＰＪＨ４４から４６０個のヌクレオチドからなるＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１フラ グメントを切り出し、Ｍ１３ｍｐ１９にクローン化する。このフラグメントは、 コード配列のカルボキシ末端に変異した３つのリシンのヌクレオチド配列を含ん でいる。リシン５９０及び６０６はグルタミンに変異し、リシン６１３はアルギ ニンに変異している。次いで、以下のオリゴマーを用いて各リシンで連続的にオ リゴ誘発突然変異を実施する： Ｍ１３の複製型変異体ＤＮＡからＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１フラグメントを切り 出し、プラスミドＰＪＨ４４の３．４ｋｂのＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１フラグメン トと連結する。次いで、線状化プラスミドを再環化し、これをＰＪＨ４５と称し 、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅｒａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し 得る市販の大腸菌株、ＨＢ１０１からＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲと同定された修 飾ＰＥを発現させるのに用いる。ＮＬｙｓ ＰＥ４８ＱＱＲは、公開されたＷＯ ９３／１５７５１号（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）に記載されているＬ ｙｓ ＰＥ３８Ｍとしても知られている。 製剤１０．還元ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲ １２．８ｍｇの毒素を含む毒素ＮＬｙｓＰＥ３８ＱＱＲ溶液１０ｍｌに１７５ ｍｇのｐＨ８緩衝塩を添加してｐＨを８に調整した。ＥＤＴＡ二ナトリウム塩二 水和物（３７２．２４ｍｇ）及びジチオトレイトール（１５４．２５ｍｇ）を加 え、混合物を無水窒素下に室温で一晩振とうして、毒素中のシステイン２６５、 ２８７のジスルフィド結合の還元を完結させた。溶液を透析バッグに移し、緩衝 液：（窒素を分散させた）０．１Ｍ リン酸塩に対して室温で約８時間透析した 。次いで、還元毒素溶液を窒素分散下に０．０１Ｍ リン酸塩緩衝液に対して室 温で一晩透析した。透析が完結した後、透析バッグの反応内容物を滅菌プラスチ ック遠心チューブに移し、該内容物をチオール含量についてサンプリングし、精 製した還元毒素ジチオールを後続反応用に保存した。 製剤１１．光不活化ＰＥホロ毒素 シュードモナスエクソトキシンＡ（１０ｍｇ，０．１５２ｍｍｏｌ）（Ｓｉｇ ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を１０ｍｌの水に溶解し、該溶液に、８−ア ジドアデノシン（４３ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。これは完全には溶解 しなかった。少量の沈降物を遠心し、上清をＰｙｒｅｘ光反応器に装入、氷水で 冷却し、４５０ＷのＨａｎｏｖｉａランプで８分間照射した。得られた溶液を４ ＬのＰＢＳに対して１７．５時間透析し、次いで、ＴＳＫ２０００ ＨＰＳＥＣ にかけて分析したところ、低分子物質（即ち、未反応８−アジドアデノシン）が 存在しないことが示された。該溶液をＡＤＰリボシル化活性についても アッセイし、元のレベルの４％しか有していないことが知見された。 実施例１ （スクシンイミドプロパノイルリンカーを介した） ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ−ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲ複合体 （１）（Ｎε−マレイミドプロパノイル）−ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ：ＰｙｒｏＧ ｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−（Ｎε−マレイミドプロパノイル）− Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ2の調製： ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ（１０ｍｍｏｌ，１２．５ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホ ルムアミド（０．５ｍｌ／ｇ）に溶解し、ＤＩＥＡ（５０ｍｍｏｌ，９μｌ）を 加えた。混合物をしばらくの間室温で攪拌し、β−マレイミドプロピオン酸Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ；２０ｍｍｏｌ，５．２ｍｇ）を一 度に導入した。３０分間反応させた後、反応混合物に１０μｌのＴＦＡを加え、 溶媒を真空除去した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ８；１０ｍｌ／分；１０〜２５％Ｂ，０〜３０分→２５％Ｂ，３０〜３５分；λ ＝２３０ｎｍ）にかけて精製した。ＦＡＢ−ＭＳ（陽イオン，ＮＢＡマトリック ス）計算値：Ｍ＋１＝１４０５．５６；実測値：Ｍ＋１＝１４０５．６。 （２）（Ｎε−マレイミドプロパノイル）−ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨとＮＬｙｓ− ＰＥ４３８ＱＱＲとの結合 隔膜を備えた１５ｍｌ容の滅菌ポリエチレン沈殿管に、ＰＢＳ中のＮＬｙｓ− ＰＥ３８ＱＱＲ（０．２２μｍｏｌ，３０ｍｌ，２．８ｍｇ／ｍｌ）を加えた。 該溶液に３５０μｌの１．０Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．０）を加えてｐＨを１ ０．８に調整した。ジチオトレイトール（１１．０μｍｏｌ，１．７ｍｇ）及び ＥＤＴＡ−２Ｎａ（２２．１μｍｏｌ，８．２ｍｇ）を加え、全ての固体が溶解 するまでタンパク質混合物を振り混ぜた。Ｎ−アセチルホモシステインチオラク トン（２２．１μｍｏｌ，３．５ｍｇ）を一度に導入し、溶液を脱気し、窒素で パージした（脱気／パージを５回繰り返した）。混合物を窒素箱中室温で６．５ 時間熟成させ、次いで、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ２透析チューブに装入し、室温で 、（１）１０ｍｇのＥＤＴＡ− ２Ｎａ及び０．２５ｍｇのＤＴＴを含む脱気し窒素を分散させた０．１Ｍリン酸 塩緩衝液（ｐＨ８．０）４Ｌに対して１６時間、（２）脱気し窒素を分散させた 、１０ｍｇのＥＤＴＡ−２Ｎａ及び０．２５ｍｇＤＴＴを含む０．００１Ｍ リ ン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）４Ｌに対して６時間透析した。次いで、チオール化 エクソトキシンを１５ｍｌ容の滅菌ポリエチレン沈殿管（３．９０ｍｌ）に移し た。該物質３２５ｍｌをＥｌｌｍａｎアッセイにかけると、合計０．３５０μｍ ｏｌのＳＨが存在することが示された。残留チオール化物質（０．３２１ｍｍｏ ｌのＳＨ、３．５７ｍｌの溶液）に、（Ｎε−マレイミドプロピオニル）−ＤＬ ｙｓ6−ＧｎＲＨ（１．６０μｍｏｌ，２．２５ｍｇ）を加えた。次いで、反応 混合物をしばらくの間振り混ぜ、Ｎ2箱中室温で１時間熟成させた。毒素混合物 をＳｐｅｃｔｒｏｐｏｒ２透析チューブに装入し、（１）４Ｌの０．０１Ｍ リ ン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１８時間、（２）４Ｌの０．０１Ｍ リン 酸塩緩衝液に対して４６時間、及び（３）４Ｌの脱イオン水に対して７時間透析 した。複合体を遠心し、懸濁していない物質をペレット化し、滅菌フィルター（ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０．２２μ た。該複合体は、結合しなかったＮＬｙｓ−ＰＥ３８ＱＱＲとは異なるＨＰＬＣ 特性を有していた。 Ｌｙｓ−ＰＥ３８Ｍ ＲＰ−ＨＰＬＣ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ４；１．５ｍｌ／分；３６−４１％のＢ，０−３０分；λ＝２１５ｎｍ）；保 持時間＝１８．１６分。 実施例２ （ジチオプロパノイルリンカーを介した） ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ−ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲ複合体 ＤＬｙｓ6−ＧｎＲＨ（１５ｍｇ，１２μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍｌ）に 溶解し、ＤＩＥＡ（２μｌ，１２μｍｏｌ）を加えた。ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシン イミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート，４．１ｍｇ，１３μｍ ｏｌ）を一度に加え、反応混合物を一晩（１８時間）窒素雰囲気下に室温で撹拌 した。反応混合物を真空濃 縮し、残留物をＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅ ｌｔａ Ｐａｋ Ｃ１８，ＲＣＭ２５×１０，１０ｍｌ／分，３０分間の１５→ ４５％ＣＨ3ＣＮ勾配）にかけて精製した。所望生成物を含む画分を合わせ、凍 結乾燥して、白色粉末として［ＤＬｙｓ6−Ｎ−（３−ジチオピリジル）プロパ ノイル］−ＧｎＲＨを得た。 Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝１４５０．３。 ［ＤＬｙｓ6−Ｎ−（３−ジチオピリジル）プロパノイル］−ＧｎＲＨ（１． ２ｍｇ，０．８６μｍｏｌ）を還元ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲ（５ｍｌ，０．２ ８５μｍｏｌ）に加え、反応混合物を振り混ぜ、一晩（１５時間）４℃〜室温で 攪拌した。反応混合物を透析チューブに移し、室温で、窒素を分散させた４Ｌの ０．０１Ｍ リン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に対して７時間、及び１８Ｌの０． ９％水性ＮａＣｌに対して２０時間透析した。溶液を濾過（０．２２μｍ Ｍｉ ｌｌｅｘ ＧＶ滅菌フィルター）した。ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲの既知標準液 に対するＨＰＬＣ分析により、得られた複合体のタンパク質濃度が１． ２ｍｇ／ｍｌであることが判明した。 複合体のＨＰＬＣ：（Ｖｙｄａｃ，Ｃ４，４．７×２５０ｍｍ，１．５ｍｌ／分 ，３５→４５％ ＣＨ3ＣＮ，２０分の勾配）；保持時間＝１６．２７分。 実施例３ ［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ−ＫＧＧＳＧＧＫ− ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲ複合体 （１）Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ ｙ−Ｌｙｓ−ＯＨ（線状骨格）の調製 ： 予備添加したＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＷＡＮＧ樹脂及び単一のアミノ酸カップリン グを用い、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｆｍｏｃ化学）で線状骨 格を調製した。ペプチドを樹脂ＴＦＡ／チオアニソール／エテンジチオール／ア ニソール（９０：５：３：２）から切り離し、勾配ＲＰ−ＨＰＬＣにかけて精製 した。Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒ ａｙ ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＝８８２．０）。 （２）Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｋ（ＮεＨＢｒＡｃ）ＧＧＳＧＧＫ（ＮεＨＢｒ Ａｃ）ＯＨ（ビス−ブロモアセチル化線状骨格）の調製 ： 無水の（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｕｒｅ−Ｓｅａｌ）ジクロロメタン（２ｍｌ）中 でブロモ酢酸（３１．５ｍｇ，０．２２６ｍｍｏｌ，３．９６当量）とＤＣＣ（ ２３．４ｍｇ，０．１１３ｍｍｏｌ，１．９８当量）とを室温で１時間反応させ てブロモ酢酸無水物を調製した。この混合物をステップ１由来の線状骨格ペプチ ド（５０．０ｍｇ，０．０５７ｍｍｏｌ）の溶液中にそのまま濾過（焼結漏斗、 Ｎ2圧力下）し、無水（４Åふるい）脱気ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解した。Ｎ2下に 室温で反応を進めた。３０分後、反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ18 ，４．７×２５０ｍｍ，１．５ｍｌ／分，１０→６０％ ＣＨ3ＣＮ，２０分 ）にかけて分析すると、出発物質が全て消費されたことが示され（線状骨格の保 持時間＝１３．２７分）、新たな生成物ピーク（保持時間＝１６．４８分）が認 められた。合計４５分間の反応時間後、混合物を真空濃縮し、生成物をＲＰ−Ｈ ＰＬＣ（ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ18，ＲＣＭ ２５×１０，１０ｍｌ／分，２５→５５％ ＣＨ3ＣＮ，３０分）にかけて精製 した。所望物質を含む画分を合わせ、一晩凍結乾燥して、白色粉末としてビス− ブロモアセチル化線状骨格（３１．２ｍｇ，０．０２７ｍｍｏ，４９％）を得た 。 （３）Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｋ（ＮεＨＣＯＣＨ2Ｓ〜［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲ Ｈ）−ＧＧＳＧＧＫ（ＮεＨＣＯＣＨ2Ｓ〜［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ）−ＯＨ− （骨格支持［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ）の調製 ： ステップ２由来のビス−ブロモアセチル化線状骨格（３１．２ｍｇ，０．０２ ７ｍｍｏｌ）を脱気した０．１０Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（５ｍｌ）に 溶解し、アセトニトリル（２５０μｌ）を加えた。ｐＨ計は、該溶液のｐＨが８ ．１であることを示していた。次いで、［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ（６８．１ｍ ｇ，０．０５５ｍｍｏｌ，２．０４当量）を水（２ｍｌ）に溶解し、アセトニト リルを数滴加え、該溶液を清澄化した。反応混合物に希水酸化アンモニウムを加 えてｐＨを７．８〜８．１に維持しながら、ビス−ブロモアセチル化骨格に［Ｄ Ｃｙｓ6］−ＧｎＲＨ溶液を滴加（３５〜４０分かけてゆっくり滴加）した。 反応混合物の最終ｐＨは８．０であった。反応混合物を室温で１０分間攪拌し、 次いで、２０分間超音波処理すると、混合物は曇り溶液となった。再び合計２時 間室温で攪拌した。反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ分析（Ｖｙｄａｃ Ｃ18，４． ７×２５０ｍｍ，１．５ｍｌ／分，１０−６０％ＣＨ3ＣＮ，２０分）にかける と、出発物質が全て消費され、新たな生成物ピーク（保持時間＝１４．３４分） が認められることが示された。反応混合物を真空濃縮し、残留物を６Ｍ グアニ ジンヒドロクロリドに入れ、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ18，ＲＣＭ ２５×１０，１０ｍｌ／分，２０−５０％ＣＨ3ＣＮ，３０分）にかけて精製 した。所望物質を含む画分を合わせ、一晩凍結乾燥して、白色粉末として骨格支 持［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ（５１ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ，４９％）を得た 。Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝３４１９。 （４）マレイミドプロパノイル−β−Ａｌａ−Ｋ（ＮＨＣＯＣＨ2Ｓ〜［ＤＣｙ ｓ6］−ＧｎＲＨ）ＧＧＳＧＧＫ（ＮεＨＣＯＣＨ2Ｓ〜［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲ Ｈ）−ＯＨ−（マレイミド化骨格支持［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ）の調製 ： （ａ）Ｆｍｏｃの切断： ステップ３由来の骨格支持［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ （１１．４ｍｇ，０．００３３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（４Åふるい）（３ｍｌ ）中２０％ピペリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。溶液を室温で４５分間攪 拌し、次いで真空濃縮した。残留物を〜１５％水性ＣＨ3ＣＮに入れ、アリコー トを取り出して、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析にかけた。ＨＰＬＣ分析により、約８３： １７比の生成物及び出発物質が示された（Ｖｙｄａｃ Ｃ18，４．７×２５０ｍ ｍ，１．５ｍｌ／分，１０→６０％ＣＨ3ＣＮ，２０分；脱保護ペプチド生成物 の保持時間＝１１．２８分，Ｆｍｏｃを保護したペプチド出発物質の保持時間＝ １４．７２分）。残留物質を一晩凍結乾燥して、白色のふわふわした固体として 脱保護ペプチドを得、これをそのままマレイミド化ステップに用いた。 （ｂ）脱保護骨格支持［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨのマレイミド化： 脱保護ペプ チド（０．００３３ｍｍｏｌ）を 無水（４Åふるい）脱気ＤＭＦ（２．５ｍｌ）及びＤＩＥＡ（１０μｌ）に加え た。混合物を室温で撹拌し、ＭＰＳ（１．８ｍｇ）を一度に加えた。３０分後、 アリコートを取り出してＲＰ−ＨＰＬＣ分析にかけた。ＨＰＬＣ分析（Ｖｙｄａ ｃ Ｃ１８，４．７×２５０ｍｍ，１．５ｍｌ／分，１０−６０％ＣＨ3ＣＮ， ２０分；脱保護ペプチド出発物質の保持時間＝１１．２８分，マレイミド化ペプ チド生成物の保持時間＝１２．１３分）により、新たに２種の生成物と少量の出 発物質が出現したことが示された。Ｔ＝４５分の反応時間後、ＴＦＡ（１０μｌ ）を加えて反応混合物をクエンチし、真空濃縮した。残留物を１０％水性ＣＨ3 ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）に入れ、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ18，Ｒ ＣＭ ２５×１０，１０ｍｌ／分，２０→４０％ＣＨ3Ｎｃ，３０分）にかけて 精製した。所望物質を含む画分を合わせ、一晩凍結乾燥し、白色粉末としてマレ イミド化骨格支持［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ（６．９ｍｇ，０．００２１ｍｍｏ ｌ，６２％）を得た。Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ＭＳは、該生成物が所望の分 子量（Ｍ＋Ｈ＝３３４８）を有することを示した。 （５）担体タンパク質ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲのチオ ール化 ： 担体タンパク質（ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲ，１．２８ｍｇ／ｍｌ，２０ｍｌ ，２５．６ｍｇ，０．６６μｍｏｌ）を５０ｍｌ容の滅菌プラスチック沈殿管に 入れ、ｐＨ１１のホウ酸緩衝塩（８３２ｍｇ，４１．６ｍ／ｍｌを加えてｐＨ１ １のホウ酸塩緩衝液の０．１Ｍ溶液を得る）を加え、混合物にキャップをし、全 ての固体が溶解するまで（５分間）振り混ぜた。反応混合物にＥＤＴＡ（１００ ｍｇ）及びＤＴＴ（１０ｍｇ，０．０６５ｍｍｏｌ）を加え、全ての固体が溶解 するまで溶液を再び振り混ぜた。該沈殿管をＮ2を充填した箱に移し、キャップ をゴム膜（septum）に取り代えた。沈殿管をしばらくの間空にし、Ｎ2でパージ した（これを５回繰り返した）。Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（１ ００ｍｇ，０．６２９ｍｍｏｌ）を一度に加え、全ての固体が溶解するまで混合 物を振り混ぜ、沈殿管を再度空にし、Ｎ2でパージした（これを５回繰り返した ）。沈殿管にキャップをし、Ｎ2充填箱中で一晩（２０時間）室温で熟成させた 。反応混合物を透析バッグに移し、（ａ）Ｎ2分散下に４Ｌの０．１Ｍ リン酸 塩緩衝液（ｐＨ８．０）に対して１９時間、 （ｂ）Ｎ2分散下に１００ｍｇのＥＤＴＡを含む４Ｌの０．０１Ｍ リン酸塩緩 衝液（ｐＨ８．０）に対して８時間、及び（ｃ）Ｎ2分散下に１００ｍｇのＥＤ ＴＡを含む４Ｌの０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２０時間透 析した。約２４ｍｌ容量のチオール化タンパク質を（Ｎ2箱中の）５０ｍｌ容プ ラスチック沈殿管に移した。２００μｌアリコートを取り出し、Ｅｌｌｍａｎの 分析（ＯＤ412＝０．１５５，総容量１．５ｍｌ）にかけると、該タンパク質溶 液のチオール価が溶液１ｍｌ当たり０．０８３μｍｏｌのＳＨであることが知見 された。 （６）チオール化ＮＬｙｓ ＰＥ３８ＱＱＲとマレイミド化骨格支持［ＤＣｙｓ 6］−ＧｎＲＨの結合 ： ステップ４のマレイミド化ペプチド（５．０ｍｇ，１．４９μｍｏｌ）を水（ ０．１％ＴＦＡ）に溶解し、５０ｍｌ容の滅菌プラスチック沈殿管に入れ、一晩 凍結乾燥した。該凍結乾燥ペプチドに、ステップ５のチオール化タンパク質（タ ンパク質１ｍｌ当たり０．０８３μｍｏｌのＳＨ，１６．９ｍｌ，１．４０μｍ ｏｌ）を加え、沈殿管にキャップをし、しばらく振り混ぜた。沈殿管をパラフィ ルムで密閉し、Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ章動装置（nutator） 上に置き、４℃で一晩（１７時間）回転させた。反応混合物を透析バッグ（Ｓｐ ｅｃｔｒｏｐｏｒ ２）に移し、４℃で、（ａ）４Ｌの０．０１Ｍ リン酸塩緩 衝液（ｐＨ７．０）に対して８時間、（ｂ）４Ｌのダルベッコのリン酸緩衝塩水 （ＰＢＳ，ｐＨ７．０）に対して７２時間、及び（ｃ）４Ｌのダルベッコのリン 酸緩衝塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．０）に対して２４時間透析した。可視沈降物は存 在しなかった。該複合体を滅菌濾過（５０ｍｌ容の滅菌コーニングカップフィル ター，０．２２μＭ）して、約１５ｍｌの生成物を得た。該複合生成物をＣＺＥ 及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけて特性決定した。該生成物の濃度がＴＰ４ ０〔Ｎ末端のトランスフォーミング成長因子α及びシュードモナスエクソトキシ ンの４０ｋＤａセグメント誘導体（ＰＥ４０ｄｅｕｔａｃｙｓ）を含むキメラタ ンパク質〕の既知標準液に対して１．１ｍｇ／ｍｌであり、ＮＬｙｓ ＰＥ３８ ＱＱＲであることが証明された（ＣＺＥ）。 実施例４ 実施例３の複合体の光不活化 ４．１６ｍｇの８−アジドアデノシンを含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）９．５ ｍｌに実施例１の複合体（０．５ｍ ｌ）を加えて、０．２９ｍＭの複合体及び１．３５ｍＭのアジドアデノシンを含 む溶液を得た。該溶液を、氷水を汲み上げる冷却ジャケットを備えたＰｙｒｅｘ 光反応器に装入した。次いで、該溶液を６インチ離れて配置された４５０ＷのＨ ａｎｏｖｉａランプで６分間照射した。次いで、該溶液を、４ＬのＰＢＳに対し て１６時間透析した。ＴＳＫ ２０００ ＨＰＳＥＣにより、得られた溶液には 低分子物質が存在しないことが示された。該物質のＡＤＰリボシル化活性はコム ギ胚芽アッセイにより、元の活性の２０％に過ぎないことが示された。 実施例５ ［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ−ＫＧＧＳＧＧＫ−光不活化 シュードモナスエクソトキシン（ホロ毒素）複合体 （１）光不活化ＰＥホロ毒素のチオール化： １ｍｌの水にホウ酸緩衝塩（４３ｍｇ［１２．７ｍｍｏｌ／ｍｌの最終溶液に 等しい］を加え、該溶液に１０ｍｇのＥＤＴＡと２．２ｍｇのＤＴＴを加えた。 このチオール化基質を９．５ｍｌの光不活化ＰＥ毒素溶液に加えた。Ｎ−アセチ ルホモシステインチオラクトン（１１．３ｍｇ）を加え、溶液を脱気し、空気を 窒素に取り代え、窒素箱中 で１６時間熟成させた。次いで、該溶液を４℃で、４ＬのＰＢＳに対して７．５ 時間、新たに調製したＰＢＳ４Ｌに対して６５時間透析した。透析溶液全体に窒 素を分散させた。Ｅｌｌｍａｎアッセイにかけると、６５ｎｍｏｌｅ／ｍｌのチ オールが示された。 （２）チオール化光不活化シュードモナスエクソトキシンとマレイミド化骨格支 持［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨの結合 実施例４のステップ４のマレイミド化骨格支持［ＤＣｙｓ6］−ＧｎＲＨ（１ ．８８ｍｇ，４５０ｎｍｏｌｅ）を水１００μｌに溶解し、該溶液から９５μｌ を取り、ステップで調製したチオール化光不活化ＰＥホロ毒素４ｍｌに加えた。 これを脱気し、１６時間熟成した後、ＴＳＫ２０００ ＨＰＳＥＣにかけると、 かなりの低分子物質が残留していることが示される。次いで、該溶液を４℃で、 ４ＬのＰＢＳに対して７時間、次いで新たに調製した４ＬのＰＢＳに対して１７ ８時間透析した。ＨＰＳＥＣアッセイにかけると、低分子物質が残留していない ことが示される。アミノ酸分析により、９０μｇの骨格／ｍｌ（β−アラニン含 量）及び５１７μｇのＰＥ毒素／ｍｌの存在が示 される。 実施例６ ワクチンの調製及び力価のスクリーニング ２０ｃｃ容のガラス製ルエルーロク注射器（Ｐｏｐｐｅｒ ＆ Ｓｏｎｓ）中 で以下にリストした割合でペプチド溶液と０．９％塩化ナトリウム注射液ＵＳＰ （Ｂａｘｔｅｒ，Ｌｏｔ Ｃ２５５０７５）及び不完全フロイントアジュバント （Ｓｉｇｍａ，Ｆ５５０６，Ｌｏｔ ０６２ｈ−８８０２）を合わせてワクチン を調製した。混合物を２０ゲージの二重ハブ式ホモジナイゼーション針（Ｐｏｐ ｐｅｒ ＆ Ｓｏｎｓ）を介して２つの２０ｃｃ容ガラス製注射器の間を通して 難流動性となるまでホモジナイゼーションを行った。 * 括弧内の数字は実施例３の複合体の濃度を表す。 さらに、６ｍｌの実施例３の免疫複合体（食塩水中０． １１７ｍｇ／ｍｌ）、１ｍｌの食塩水及び７ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ １． ３％（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ ａ／ｓ，Ｂａｔｃｈ １９８３ ）を混合して５０μｇ／ｍｌの抗原最終濃度を得ることによりアラムアジュバン トを加えたワクチンも調製した（ワクチンＮｏ．５）。予防接種 ： ２７匹の１０週齢の去勢雄ブタを６つのグループ：上記の各ワクチン製剤を与 える５匹の動物からなる５グループと、２匹の対照動物からなる１グループに分 けた。頸静脈穿刺により予備処理血液試料（１０ｍｌ）を採取し、各ブタに２ｍ ｌの新たに調製したワクチンを接種した（１ｍｌを頸の両側に筋肉内投与）。４ 週間後、全ての動物から再度血液（１０ｍｌ）を採取し、該動物に新たに調製し たワクチンを先に記載のように再接種した。２週間後、全ての動物から約１時間 間隔で３回出血させた。採取した全ての血液試料を遠心し、全ての血清を同じ抗 体価及びＬＨ分析でアッセイし得るように、出血が完了するまで血清を−２０℃ で凍結した。抗体価の分析 ： １パケットのＢｕｐＨ調整したダルベッコのリン酸緩衝塩水ミックス（Ｐｉｅ ｒｃｅ，Ｎｏ．２８３７４，Ｌｏｔ９２０５２１０８４）を４００ｍｌの脱イオ ン水に溶解し、２ｇのウシアルブミン画分Ｖ（Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．８１０−１０ １８ＩＬ，Ｌｏｔ ７６Ｐ９６２３）及び５ｍｌの１％ｗ／ｖチメロサール溶液 （Ｓｉｇｍａ，Ｔ−５１２５，Ｌｏｔ ２３Ｈ０５２６）を加えてＰＢＳ−ＢＳ Ａを調整した。ＢＳＡが溶解した後、脱イオン水を５００ｍｌの最終容量まで加 えた。 ２．５ｇの活性炭（Ｓｉｇｍａ，Ｃ−５３８５，Ｌｏｔ１０２Ｈ０３３６）を 脱イオン水で複数回洗浄して微粉を除去し、デキストランでコーティングした活 性炭懸濁液を調製した。２パケットのＢｕｐＨ調整したダルベッコのリン酸緩衝 塩水ミックス（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｎｏ．２８３７４，Ｌｏｔ ９２０５２１０８４ ）を１，０００ｍｌの脱イオン水に溶解してＰＢＳを調製した。０．２５ｇのデ キストラン、７０，０００ｍｗ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ１３９０，Ｌｏｔ １２２Ｈ０ ３４９）を５００ｍｌのＰＢＳに溶解した。 該溶液に洗浄した活性炭を加えた。１０ｍｌの１％ｗ／ｖチメロサール溶液（Ｓ ｉｇｍａ，Ｔ−５１２５，Ｌｏｔ ２３Ｈ０５２６）及び追加の５００ｍｌのＰＢＳを加え、活性炭懸濁液を４℃で ３日間攪拌した。 全ての血清試料を解凍した。４９５μｌのＰＢＳ−ＢＳＡに５μｌの血清を加 えて血清の１００倍稀釈液を調製した。４５０μｌのＰＢＳ−ＢＳＡに該１００ 倍稀釈液５０μｌを加えて血清の１０００倍稀釈液を調製した。同じようにして 、１０，０００倍及び１００，０００倍稀釈液を調製した。全ての血清稀釈液か ら５０μｌずつのアリコートを２個ずつの１２×７５ホウケイ酸塩ガラス管（Ｆ ｉｓｈｅｒ）に加えた（稀釈液１種当たりガラス管２個）。各管に、４００，０ ００ｃｐｍ／ｍｌの125Ｉ標識ＧｎＲＨ（ＮＥＮ，ＮＥＸ−１６３，Ｌｏｔ Ｃ Ｆ９１６４０）を含む５０μｌのＰＢＳ−ＢＳＡを加えた。管を４℃で一晩イン キュベートした。次いで、１００μｌのデキストランコーテッド活性炭懸濁液を 加え、管を室温で１５分間混合した。次いで、管をＳｏｒｖａｌ ＲＣ−３Ｂ遠 心器に入れ、Ｈ６０００ Ａローター中２，５００ｒｐｍでスピンした。１００ μｌの上清アリコートを回収し、Ｐａｃｋａｒｄ ＡｕｔｏＧａｍｍａ ８００ ガンマカウンターで放射能を測定した。結果を、（５０μｌの125Ｉ標識Ｇｎ ＲＨ溶液を１５０μｌのＰＢＳ−ＢＳＡに加え、遠心し、１００μｌを計数して 測定した）総投入放射能結合率（％）として表した。 抗体価の結果は以下の通りであった： 値は、ニート血清である予備処理液を除き、血清の１／１０００稀釈液に結合 した投入125Ｉ標識ペプチドの平均百分率として表す。 血清のＬＨ測定 血清試料を、ラジオイムノアッセイによる血清のＬＨ測定のために、Ｇｅｏｒ ｇｅ Ｒａｍｐａｃｅｋ博士の監督下にＡｔｈｅｎｅｓ，ＧＡのＵＳＤＡラボに 提出した。該アッセイは、ブタＬＨを認識する125Ｉ標識ブタＬＨ及び抗ウシＬ Ｈ抗血清を用いる標準ラジオイムノアッセイである。該アッセイは、Ｒ．Ｋｒａ ｅｌｉｎｇらにより、Ｊ． Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．（１９８２）５４：１２１２に記載されている。以下の結果 は各グループの平均値である。６週目のものは、プールした３回の出血の平均値 である。結果はＬＨ／ｍｌ（ｎｇ）で表わされている。０．１５ｎｇのＬＨ／ｍ ｌの血清は該アッセイでの検出下限であり、従って、該検出レベル以下の全ての 値には０．１５ｎｇ／ｍｌの値を割り当てた。 実施例８ ＳＴＰを含むワクチン組成物 １．ＳＴＰ（リン酸緩衝塩水［ＰＢＳ］中５％スクアラン：０．２％Ｔｗeｅｎ ８０：２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１）の調製： スクアラン（５００ｍｇ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１〔２５０ｍｇ；ポリエ チレンオキシドとポリプロピレンオ キシドのブロックコポリマー（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）〕及びＴｗｅｅｎ ８０ （２０ｍｇ）を１５ｍｌ容のダウンス組織ホモジナイザーチューブに計量装入す る。次いで、これを９．２５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で被覆し、得られた混 合物を約１０ストロークでホモジナイズする。次いで、溶液をバイアルに移し、 小型の磁気攪拌棒を加える。この混合物から約３ｍｌを取り、Ａｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕ 移し、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘの出口チューブを、バイアル中の残留液の表面下に 没するように配置する。バイアルを氷浴中で冷却し、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘに２ ０回通して液体を磁気撹拌する。この方法で９．５ｍｌのＳＴＰを得る。 ２．ＳＴＰ中の実施例３の複合体の配合 実施例３の複合体の溶液１３０μｌ（総免疫原の１μｇ／μｌ＝合計１３０μ ｇ）を磁気撹拌下に６．４ｍｌの上記ＳＴＰエマルションに加え、得られた混合 物をＳＴＰの １０回通す。これにより、２０μｇ／ｍｌの濃度でＳＴＰに配合された複合体約 ６ｍｌを得る。（ＰＢＳ中の）等量の複合体を、ステップ１のダウンスホモジナ イザー中のス クアラン：Ｔｗｅｅｎ ８０：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１混合物に加え、４成分 混合物を微粒子流動化装置に４回通すことによっても同じ生成物を得ることがで きる。 ３．ＳＴＰ中の実施例３の複合体とデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ） の配合： 磁気攪拌下に、１３０μｌの実施例１の複合体溶液（総免疫原の１μｇ／μｌ ＝合計１３０μｇ）をステップ１で調製したＳＴＰエマルション６．２ｍｌに加 える。エタノール中のＤＨＥＡ（１０μｇ／μｌ）の溶液を調製し、この溶液の １９５μｌ（１．９５ｍｇ）をＳＴＰ中の攪拌複合体溶液に加える。次いで、こ の混合物をＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ装置に１０回通し、ＤＨＥＡを含むＳＴＰ中の 複合体約６ｍｌを得る。 ステップ２及び３の一般手順に従って、ＳＴＰ及びＳＴＰ＋ＤＨＥＡ中の［Ｄ Ｌｙｓ6］−ＧｎＲＨ−ＮＬｙｓＰＥ３８ＱＱＲワクチンを得た。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONTitle of invention Pseudomonas exotoxin as an immunogenic carrier for synthetic combination vaccinesBackground of the Invention   The present invention provides an anti-gonadotropin-releasing hormone (GnRH) response in animals. The present invention relates to a method of inducing a body, comprising the steps of: administering GnRH and Pseudomonas to an animal; Administering an immunogenic carrier system comprising a xotoxin or a variant thereof. Departure The Ming method is an effective and preferred method of animal sterilization (sterility). The method comprises It can also be used to suppress the development of idhormone-stimulated tumors.   The issue of animal sterilization is of great interest. This is veterinary and Animal and livestock stakeholders, especially dogs, cats, cattle, sheep, horses, pigs, etc. Of particular interest among those involved in livestock sterilization. Sterilization (sterility) is a male attack Suppression of undesirable gonadal steroid hormone-induced behaviors such as sexual and female estrous behavior For feed efficiency and pig And improve the carcass quality of edible animals such as cattle and bovine carcass Traces (boar taint) can be eliminated.   Various sterilization methods have been developed in the last few years. For example, in the case of bulls, sexual or The most widely used method to eliminate aggressive behavior problems is by castration surgery It is a sterile. This can be done in a variety of ways, for example by holding the testes in the annulus Break the spermatic cord or use a rubber band wrapped around the scrotal neck And the testes are separated. However, these “mechanical” castration methods are not It has proven to be undesirable. For example, the method comprises (1) traumatic, (2) D) risk of anesthesia, (3) may cause infection, and (4) mature Requires a trainer. In addition, all such mechanical castrations completely remove the testes. Dysfunction, inevitably produced by the testes, Completely eliminates the anabolic effects of all steroids acting as stimulants for accumulation Means to do it.   In view of these deficiencies, various alternative sterilization methods have been developed, such as the use of chemical sterilants. Was issued. One method of chemical sterilization Is a cytotoxic substance bound to a molecule that binds to the GnRH receptor on the gonad surface. Including use. When the GnRH-cytotoxin complex is taken up into cells, a cytotoxic substance Is released, and the substance kills the target cell.   The GnRH-cytotoxic method is disclosed in WO 90/09799, which patent , 2-iminothiolane, SPDP (N-succinimidyl-3- (2-pyridyl) Dithio) propionate), bis-diazabenzidine and glutaraldehyde. Specific fragments, including GnRH analogs, attached to various toxins via any optional linking group Teaching seeds. WO 93/15751 further discloses GnRH or similar Disclosed are chimeric molecules of the body and cytotoxins. The chimera according to this disclosure is GnRH Peptide is a molecule that is directly linked to a Pseudomonas exotoxin molecule. Only a single GnRH peptide binds to each toxin molecule binding site of the peptide . Upon administration of such a chimeric molecule, GnRH receptor-bearing cells in the pituitary gland Is destroyed and the secretion of sex hormones is reduced. The effectiveness of this method is Depending on the rate of endocytosis of the protein and the rate of intracellular processing of gonadotropes. Is determined. The end result of this method is Chemical sterilization and reduced growth of steroid-stimulated tumors.   UK Application No. 2,282,812 discloses GnRH as a MAP (multiple antigen peptide). Or a cyclic skeleton containing multiple lysine units called lysinetree Method of binding and binding the scaffold to a cytotoxin such as Pseudomonas exotoxin Is taught. By using multiple lysine scaffolds, one cytotoxin binding site It can bind to one or more GnRHs. However, the MAP method is not always advantageous. Because the MAP complex is usually poorly soluble in both hydrophobic and hydrophilic solvents. Therefore, the compounding becomes more difficult.   Thus, GnRH bound to Pseudomonas exotoxin has already been reported. However, these complexes are associated with cytosolic expression of cells that express the GnRH receptor. Used to transport the toxin into the toxin. GnRH-Pseudomonas exoto It is not possible to elicit anti-GnRH antibodies using xin as a vaccine. did not exist.   Another animal sterilization method involves the use of GnRH vaccines, ie, immunological sterilization. Typical In order to enhance the immunogenicity of GnRH, GnRH molecules with extremely weak immunogenicity The protein And an immunogenic polymer such as Alternatively, for this purpose, GnRH and A fusion protein comprising the immunogenic peptide may be constructed. Immune complex or fusion Animals receiving the combined protein produce anti-GnRH antibodies, which are Down regulates the action of H, thereby causing a sharp decrease in sex hormones, Androgen-dependent organs atrophy. Many G suitable for use as a vaccine nRH immune complexes or fusion proteins have been described.   Currently in Australia, Arthur Webster & Co Pty   Ltd., the product name Vaxstr (See, for example, RM Hoskinson et al.,Aust. J. Biotechno l . , 1990, 4: 166). GnRH bound to ovalbumin This vaccine, which is described as having a very low immunogenicity, is described in US Pat. The vaccine is DE Formulated in AE dextran, causing severe injection site reactions.   No. 4,975,420 states that amino acids 1, 6 or 10 are substituted with cysteine. Disclose an immunospecies comprising a GnRH analog bound to a carrier protein. .   WO88 / 05308 discloses a pentapeptide, hexapeptide of natural GnRH Or an immunity comprising a peptide peptide and an immunogenic protein bound to the peptide. A castration composition is disclosed.   WO 93/08290 contains GnRH and leukotoxin polypeptide A fusion protein is described. Leukotoxin is responsible for enhancing the immunogenicity of the antigen. Acts as a body protein.   EP 578,293 discloses a part of the P-fimbrielle shaft of Escherichia coli and GnRH. Are described. This carrier system is extremely sensitive to GnRH. It can elicit a high immune response and when used in vaccines, complete / incomplete Freund's adjuvant Avoids the need to use aggressive adjuvants such as Bunt (CFA / IFA) Say   WO 92/19746 describes GnRH, at least one T cell epitope and And recombinant polypeptides containing purification sites.   WO 90/02187 discloses a fusion protein comprising a hepatitis B surface antigen and GnRH. Disclosure of quality. The construct eliminates the need for adjuvants and multiple injections Moderate immunity It is stated to have originality.   U.S. Pat. No. 5,324,512 binds to carrier proteins via N-terminal glutamine. The combined GnRH is taught. The conjugate can be used as an anti-fertility vaccine, It is also claimed to be useful in treating cancer.   WO 94/25060 describes GnRH and T cell epitopes and optional components. An immunogenic peptide comprising an invasion domain is disclosed. The peptide is contraceptive It is also useful as a vaccine for treatment and for the treatment of androgen-dependent cancer.   UK 2,228,262 describes [D-Lys6] GnRH [ie, natural GnR H in which amino acid 6 (glycine) is substituted with D-Lys] Discloses a complex linked to a carrier protein via the ε-amino group of The conjugate can be used to suppress fertility or treat prostate cancer.   The vaccines are generally used in large quantities as well as in potent vaccines to obtain an antibody response. Requires juvant. The most commonly used adjuvants are complete or Is incomplete Freund's adjuvant (CFA or IFA); Has various levels of chronic inflammatory reaction at the injection site And thus are generally unacceptable to vaccine regulatory authorities. You. These vaccines described elicit appropriate levels of anti-GnRH antibodies And cannot provide 100% efficacy to all animals in a given group.   As mentioned earlier, Pseudomonas exotoxin was conjugated to GnRH and The constructed construct was used for destruction of gonadostimulants. The GnRH of the construct converts the toxin to Gn It functions to carry the cells into RH receptor-bearing cells. Exerts its cytotoxic effect to kill cells. Using receptor binding ligands Methods for delivering Pseudomonas toxin into target cells involve many ligands other than GnRH. Along with many references.   Chaudhary et al., PNAS USA84: 4538-4542 (19 87) is a truncated mutant of PE-40, PE exotoxin A and transformation Hybrids formed from recombinant growth factor α and produced in bacteria using recombinant DNA technology Teaches a lid fusion protein, which comprises an epidermal growth factor receptor Binds to and kills human tumor cells with   Edwards et al., Mol. Cell. Biol.9: 2860-2867 ( 1989) is a modification that has been found to have efficacy in treating bladder tumor cells. A method for producing a TGF-α-PE-40 hybrid molecule is described.   Heimbrook et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA8 7 : 4697-4701 (1990) discloses a mouse containing a human tumor cell xenograft. Vivo efficacy of modified TGF-α-PE-40 to significantly prolong the survival of Is described.   U.S. Pat. No. 4,545,985Uses Pseudomonas exotoxin A as an antibody Alternatively, it teaches that it can be chemically coupled to epidermal growth factor. This patent further It also teaches that these complexes can be used to kill human tumor cells, but These chemically coupled toxins have been shown to have undesirable levels of non-specific activity Was.   Bailon, Biotechnology, 1326-1329 1 In January (1988), recombinant D was formed from PE-40 and interleukin 2. Teaches hybrid fusion proteins produced in bacteria using the NA method , The protein is an interleukin 2 receptor Binds to and kills the cells.   Use of Pseudomonas exotoxin to enhance hapten immunogenicity No. O92 / 12173, and the patent discloses Pseudomonas exotoki. It teaches fusion proteins of the syn and human P-glycoprotein specific regions. this These fusion proteins are used for the production of antibodies against P-glycoprotein. S tapylococcus aureus capsular polysaccharide and Pseudomonas exo A conjugate vaccine comprising a recombinant protein derived from Toxin A is Fattom et al. ,Inf. Immun., 1993, 61 (3) 1023-1032. ing.   European Patent Application No. 0261671 discloses all Pseudomonas exotoxins A protein (molecular weight 66,000) lacks the cell binding function, The translocation function and the ADP ribosylation function can produce a portion of the retained protein. Teaching that Out of all Pseudomonas exotoxin A proteins The part retaining the translocation function and ADP ribosylation function of PE is PE-40 (molecular weight 40). , 000). PE-40 is available from Gray et al., PNAS USA.8 1 : 2645-2649 Determined in 1984 As defined, the amino acids of the entire Pseudomonas exotoxin A protein Consists of residues 253-613. The patent application further discloses transforming and growing PE-40. Hybrid fusion that binds to factor α and is produced in bacteria using recombinant DNA technology Teach that synthetic proteins can be formed.Summary of the Invention   The present invention relates to Pseudomonas exo as an immunogenic carrier protein of GnRH. It relates to the use of toxins (PE). The GnRH-PE immunogenic carrier system is a chemical The GnRH-PE complex produced by the step is also produced using recombinant DNA methods. GnRH-PE chimeric hybrid protein. GnRH- The PE immunogenic carrier system is used in mammals or birds to Symptoms, physiology or anatomy, or sex steroids, for which reduction or elimination is desired It can be used to treat responsive tumors.Detailed description of the invention   The present invention provides, in one embodiment, an antibody, In particular, a method for inducing an anti-GnRH antibody is provided. The method preferably comprises the step of An animal is provided with Gn bound to Pseudomonas exotoxin or a mutant thereof. Administering an immunogenic carrier system comprising RH in an amount effective to elicit anti-GnRH antibodies. No. More specifically, the present invention provides a method of sterilizing an animal, said method comprising: GnRH bound to Pseudomonas exotoxin or a mutant thereof was added to the above animal. Comprising administering an effective amount of the immunogenic carrier system comprising performing the sterilization.   An immunogenic carrier system comprising GnRH conjugated to Pseudomonas exotoxin comprises: Pseudomonas ethoxy by the above-mentioned GnRH via a linker by chemical means GnRH-pseudomonas exotoxin complex bound to GnRH- It may be a Pseudomonas exotoxin hybrid protein.   Use the following abbreviations:    CZE capillary zone electrophoresis    DCC dicyclohexylcarbodiimide    DIEA diisopropylethylamine    DMF dimethylformamide    DTT dithiothreitol    EDTA ethylenediaminetetraacetic acid, disodium salt    EMOC 9-fluorenylmethoxycarbonyl    HOBt 1-hydroxybenzotriazole    HPSEC high performance size exclusion chromatography    MPS 3-Maleimidopropionic acid N-hydroxysuccin                     Imidoester    PE Pseudomonas exotoxin    PyBOP benzotriazol-1-yl-oxy-tris (pyro                     Lysino) phosphonium hexafluorophosphate    SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electricity                     Electrophoresis    TFA trifluoroacetic acid   The term "GnRH" as used in the present specification and claims is in accordance with the present invention. GnRH and analogs thereof that can elicit anti-GnRH antibodies when administered to a host Or derivatives. When the term refers to a particular GnRH molecule The amino acid sequence is specified.   Natural GnRH, also called luteinizing hormone releasing hormone (LHRH), Amino acid sequence [SEQ ID NO: 1]: (Where pGlu is pyroglutamate) Is a decapeptide having the formula: Many similarities to natural GnRH An analog or derivative is described, wherein the analog or derivative is an addition of natural GnRH, It can be obtained by deletion, substitution or other modifications. Suitable for use in the present invention. Non-limiting examples of possible GnRH analogs or derivatives include those described in the following references: What: UK Patent No. 2,228,262 (e.g., [D-Lys6] GnRH U.S. Pat. No. 4,975,420 (e.g., [D-Cys6] GnRH); U.S. Pat. No. 4,608,251 (eg, N-terminally modified nonapeptide or decape) European Patent Application No. 464,124 (e.g., two tandem types) GnRH); European Patent Application No. 293,530 (for example, C-terminal extended G nRH); PCT Application No. 88/05308 (eg truncated GnRH) US Pat. No. 5,324,512 (pG of native GnRH) lu is substituted with Gln).   For use in chemically bonded GnRH-PE conjugates, native GnRH is GnRH Contains an amino acid that serves as an intervening functional group capable of binding to Pseudomonas exotoxin. It is preferable to modify it so that Such amino acids may be at the N-terminus or C-terminus. Amino acids of natural GnRH which may be located 6 (Gly) may be substituted. The GnRH is a free amino or sulfhydryl group Is more preferable. The free amino group can be, for example, a Gl n or Gly of natural GnRH6By replacing Lys with Can be A free sulfhydryl group is a single amino acid, for example, 1, 6 or Can be obtained by replacing the amino acid at position 10 with cysteine, or The isolated amino group is treated with homocysteine thiolactone or mercaptopropanoic acid. It can also be freed to obtain a free sulfhydryl group.   In a preferred embodiment of the chemical binding complex, GnRH has the sequence [SEQ ID NO: 2 ]: [Where B is of the formula HS- (CHTwo)nA thiol-containing linker of Co-Q ;   p is 0 or 1;   n is 1-10;   Q is pGlu or Gln;   W is glycine, alanine, cysteine, homocysteine D- or L-amino acids selected from amino acids, ornithine and lysine;   T is Leu or Nle;   U is Pro or 4-hydroxy-Pro;   V is Gly-NHTwo, D-Ala-NHTwo, NH-Et, NH-Pr or Ar g-Gly-NHTwoIs;   Provided that at least one of Q and W has a free amino or sulfhydryl group ] Can be represented by   More preferred GnRH has the formula [SEQ ID NO: 3]: (Wherein Q and W are as defined above) It has.   In the case of hybrid proteins, GnRH is produced using recombinant DNA methods. The resulting natural GnRH or an analogue or derivative thereof, for example, two tandem heavens Of course, it is preferably a GnRH molecule or a GnRH analog containing a single natural amino acid. New   Pseudomonas exotoxin has three major domains And a protein consisting of 613 amino acids located in one 66,000). Preferred Pseudomonas exotoxins are toxic A variant thereof, for example, which has reduced binding or ADP ribosylation activity, By deletion or partial deletion, insertion or substitution of amino acids in the ribosylation domain Attenuated or inactivated, or the PE holotoxin is, for example, Inactivated Pseudomonas exotoxin segment. Immunogenicity The efficacy of PE as a body protein depends on the toxin activity of PE and therefore PE-G The nRH complex or hybrid protein is inactivated by, for example, photoinactivation. But still retains its immunogenicity. Pseudo with reduced toxin activity One example of a Monas exotoxin is amino acids 1-2 containing substantially all of the binding region. Amino acids 253-6, which lack 52 but include the translocation and toxin regions of the cell 13 is held. This Pseudomonas exotoxin fragment is a PE -40 [Hwang et al., Supra; Kondo et al.J. Biol. Chem. ,263, 9470-9475 (1988); Chaudha. ry et al., PNAS-USA,87  308 -312 (1990); and Pastan et al., US Pat. No. 4,892,827. No.).   Further amino acids 3 from Pseudomonas exotoxin fragment PE-40 Further modifications were made by removing 65-380 to give PE-38. PE-40 and And PE-38 add a lysine-containing oligopeptide fragment to its N-terminus Can be further modified. Peptide ANLAEEA consisting of 9 amino acids FK ("Lys" peptide) was added to the N-terminus of PE-40 and PE-38 to Pseudomonas identified as LysPE-40 and LysPE-38, respectively Produce exotoxins. Peptide LQGTKLM consisting of 10 amino acids AEE ("NLys" peptide) was added to add NLysPE-40 and Produces Pseudomonas exotoxin identified as NLysPE-38 .   The lysines at positions 590 and 606 of PE-38 were replaced with glutamine to give position 613. Lysine was replaced with arginine to identify a pseudo identified as PE-38QQR Produces monas exotoxin. Lys PE-38QQR and NLys P E-38QQR has "L" at its N-terminus. ys "and" NLys "peptides.   Various Pseudomonas exotoxin fragments have been used in biotechnology and Manufactured using recombinant DNA technology, Debinski and Pastan,Bi oconjug. Chem. , 1994, 5 (1): 40-46 and in the literature. It is described in the cited references.   The amino acid sequence of NLys PE-38QQR is represented by the following [SEQ ID NO: 4]. You. The four underlined amino acids represent the N-terminal amino acid of PE-38.   Other suitable Pseudomonas exotoxins include photoinactivated holotoxins and dioxins. The sulfide bond was reduced (Lys PE-38, NLys PE-38, P E-38QQR, Lys PE-38QQR and NLys PE-38QQR Including) PE-38.   A more preferred immunogenic carrier protein in the present invention is NLys PE-38 QQR.   An immunogenic carrier system comprising Pseudomonas exotoxin and GnRH comprises GnR H is chemically bonded to the PE carrier protein, or G It can be produced by producing an nRH-PE hybrid protein. Both The method is described below.   Methods for coupling peptides and macromolecules are well known in the art, and the Gn of the invention It can also be applied to the manufacture of RH-PE composites. In general, peptides and PE are SPDP (N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate), glue Talaldehyde, iminothiolane, N-acetyl-homocysteinethiolactone , Bromoalkanoic anhydride, maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succin Imidoester, 3-maleimidopropionic acid N-hydroxy The bond is made via a cross-linking reagent such as succinimide ester. On the reaction partner Any method of providing a nucleophile and an electrophile to a peptide is sufficient for peptide binding. Anti-coupling The preferred crosslinker of the present invention that is the counterpart of the corresponding electrophilic group is maleimidoylalkane Active esters of acids and bromoalkanoic anhydrides. A nucleophile for the binding reaction More preferred crosslinking partners are N-acetylhomocysteine thiolactone and iminothio. It is an lactone.   In addition to immunogenic carrier systems in which GnRH is directly linked to PE via a linker group, The invention further provides that the GnRH component is first attached to an oligopeptide backbone, -Includes systems where the scaffold assembly is attached to PE. The skeleton comprises one or more Gn Each binding site on a PE can be designed to include an RH binding site, so that may carry nRH. The crosslinking reagent described above binds GnRH to the skeleton and binds the skeleton to the skeleton. It is also applicable to the connection with PE. In either type of connection, ie, bone All unbound haptens, with or without case, are removed after the binding reaction. Need to leave.   Thus, within the above linker definition, the term "GnRH-Pseudomonas `` Complex '' with or without skeleton Regardless, all GnRH-PE conjugates are included.   The GnRH-backbone PE conjugate has the formula: (Where A is independently selected from Gly, Ser, Thr, β-Ala and Ala Wherein at least one A is Ser or Thr;   L1Is a linker optionally attached to an internal marker;   LTwoIs independently a linker;   X is GnRH;   Y1And YTwoIs independently Lys or Orn;   m is 0-3;   n is 1-10;   p is 0-1;   q is 1 or 2;   r is 1 to 10) Can be represented by   The term "skeleton" has the general formula shown below: (Where the variable component is as defined above) Can be represented by   The backbone has up to a total of 27 amino acids in the sequence, of which at least 2 Is a linear oligopeptide independently ornithine or lysine. Other amino acids Is a small non-Lys non-Orn amino acid in which at least one is a hydrophilic amino acid. Type amino acids. Examples of suitable small amino acids include alanine, β- Alanine, glycine, serine and threonine; Is hydrophilic. Preferably, the hydrophilic amino acid is serine or threonine, with a maximum of 5 Can be incorporated into the backbone. 5 to 1 skeletal oligopeptide 0 amino acids, of which one or two are Ser or Thr, preferable. Lysine / ornithine residues are linked to each other via at least one amino acid And the spacer between the lysine and ornithine residues is about 3-8 amino acids. Preferably, the acid is noonic acid.   Examples of the skeleton include Lys-An-Lys (where n is 4 to 7, more preferably 5 or 6, one of A is Ser or Thr, and the rest of A is Gly, Ala and β-Ala). More specific examples of the skeleton Includes [SEQ ID NO: 5] Lys-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ly s and [SEQ ID NO: 6] Lys-Gly-Gly-Thr-Gly-β-Ala- Gly-Lys.   The term “internal marker” refers to complex characterization and GnRH and carrier protein Means unnatural amino acids incorporated to facilitate calculation of the ratio of The ma Examples of markers include β-Ala and norleucine.   A “linker” for chemical bonding between GnRH and Pseudomonas exotoxin is: Arbitrary heterodivalent bridges with groups reactive towards amino and sulfhydryl groups It can be derived from a crosslinking agent. For example, SPDP (N-succinimidyl 3- (2- Pyridyldithio) propionate), glutaraldehyde, iminothiolane, Lomoalkanoic anhydride, maleimide-benzoyl-N-succinimide ester N-hydroxysuccinimide, 3-maleimidopropionic acid Esters and the like can be used. Preferred linkers have the formula (where the terminals N and S are linked Derived from the matching peptide): (Where R is C1-CFiveAlkylene, phenyl or CFive-C6With cycloalkylene Yes; s is 1 or 2) Having.   A chemically-linked immunogenic carrier system, ie, GnRH linked to PE via a linker, And two methods for constructing a GnRH-backbone attached to PE are shown in the scheme below.                                  Scheme 1 Is a bond, succinimidylmethyl or thiomethyl, corresponding to 0.   The first step is DLys6-GnRH and a heterobivalent linker, for example, Maleimidopropanoyl N-hydro Reaction with xysuccinimide (MPS), bromoacetic anhydride or SPDP . DLys6-GnRH is a known peptide synthesis method, preferably solid phase peptide synthesis. It is manufactured using a method. "NεHTwo"Is the ε-amino group of lysine.   The reaction is carried out by (a) N, N-diisopropylethylamine (DIE) in a polar solvent. A non-nucleophilic organic base such as A) or (b) sodium or potassium carbonate And a base selected from inorganic weak bases such as The polar solvent is N, N-di It may be methylformamide, water, acetonitrile or a mixture thereof. N, N -Dimethylformamide is preferred. The reaction is carried out at 0-25 ° C, preferably at room temperature. And generally completes in 10 to 90 minutes. The work-up of the reaction is carried out by first Neutralizing the group with an acid such as trifluoroacetic acid to bring the pH of the mixture to about 2-4. It is. The product is then isolated using methods known to those skilled in the art.   Linker-DLys6-GnRH2And one or more free sulfhydryl functional groups With a Pseudomonas exotoxin having a pH of 8 to 10 under nitrogen. Excess linker-DLys6Perform using -GnRH. Pseudomonas Exoto Usually for each equivalent of thiol substituent on the toxin Use 2-20 equivalents of GnRH reagent. The reaction is generally very rapid, It takes only 1 to 5 minutes to complete, but it is not harmful to age up to 2 hours. Was found. DLys using methods known to those skilled in the art.6-GnRH complex Isolate. Dialysis of the reaction mixture has proven to be a convenient method to remove unwanted products. Was seen. Generally, the complex product is administered by injection, so the resulting dialysis solution is It can be sterile filtered and used as is for transdermal administration.                                  Scheme 2 (Where the variable component is as defined above).   In Scheme 2, a skeleton having a protected internal marker, β-alanine, By reacting with bromoacetic anhydride,1And YTwoThe terminal amino group of the residue (Nε) Is bromoacetylated. The reaction is carried out under nitrogen, methylene chloride, dimethylform Run in an inert organic solvent such as an amide or a combination thereof, typically at ambient temperature. U. The bromoacetylated backbone is replaced with a GnRH having a free sulfhydryl group, for example, , [DCys6] GnRH or HSCHTwoCHTwoCO- [Gln1] Reaction with GnRH Thus, a skeletal support GnRH is obtained. The reaction is carried out at room temperature in aqueous acetonitrile. The pH of the reaction mixture is preferably maintained at about 8, generally between 7.5 and 8.5. . The Fmoc protecting group is removed, for example, using piperidine, and the deprotected peptide is Like dimethylformamide in the presence of a base such as isopropylethylamine Maleimidyl alkanoic acid activated ester such as MPS at room temperature in a simple inert organic solvent Reaction with ter to give a maleimidated skeleton-supported GnRH.                                  Scheme 3   In Scheme 3, a Pseudomonas exotoxin carrier having a free thiol The protein is reacted with the scaffold-supported GnRH product shown in Scheme 1 to form the desired complex. Get united. Free thiol may be bound to free cysteine, for example, Reduction of disulfide bonds in carrier protein using dithiothreitol Alternatively, the carrier protein may be N-alkanoyl homocysteine. It may be introduced into a carrier protein by reacting with a thiolating agent such as lactone. No. One or more free thiols may be present on the carrier protein, and thus one or more Upper skeleton support Gn RH can be added on the carrier protein.   The reaction sequence in the above scheme is only illustrative of the invention, and the sequence is Those of skill in the art can adapt or modify without undue experimentation to obtain other variants within the range. Please understand that it can change.   The immunogenic carrier system of the present invention comprises a GnRH and Pseudomonas exotoxin A. It may be a hybrid protein. Such a hybrid protein , Contiguous sequences of constituent proteins or peptides. The hybrid protein is Preferably, it is produced by expressing the recombinant DNA sequence.   DNA used in the practice of the present invention may be natural or synthetic. Recombinant DNA segment comprising a nucleotide sequence encoding an embodiment of the present invention Can be made according to the following general method: (A) cutting the desired DNA sequence from the plasmid into which it has been cloned; Out (or the sequence may be chemically synthesized); (B) cutting the second DNA sequence, which is the target DNA sequence, at a specific position; (C) Next, align the desired DNA sequence with the cut in the target DNA sequence, Are joined by standard ligation procedures. Put the obtained recombinant gene in the expression vector Downstream of the appropriate promoter.   DNA cleavage and ligation procedures as used in the present invention are generally known to those skilled in the art. It is well known and is described in Molecular Cloning, A Laboratory. ory Manual, (1989) J. Org. Sambrook et al., Cold Sp. described in the Ring Harbor Laboratory Press .   The promoter used in the present invention is expressed in a host used for gene expression. Any promoter may be used as long as it is appropriate for the promoter. The promoter is It can be produced enzymatically from a corresponding gene or can be chemically synthesized.   Conditions for use of all restriction enzymes are as specified by the manufacturer, including buffer and temperature instructions. Subject to the terms of use. The enzyme is available from New England Biolabs, Be. thesdaResearch Laboratories, Boehring from er Mannheim and Promega Available.   Ligation of the vector and the insert DNA was performed using T4 DNA ligase at 66 mM. Tris-HCl, 5 mM MgClTwo, 1 mM DTE, 1 mM ATP (p H7.5) at 15 ° C. for up to 24 hours. Generally, 1 to 200 ng of vector And a 3-5 fold excess of insert DNA.   To select for Escherichia coli containing the recombinant plasmid, the bacterium is transformed into an appropriate antibiotic-containing L. Streak culture on B-agar plate, or select if necessary in culture flask. LB solution containing an appropriate antibiotic (tryptone 10 g / L, yeast extract)   5 g / L, NaCl 10 g / L, pH 7.4). Selection The choice of antibiotic for selection depends on the tolerance present on a given plasmid or vector. Determined by sex marker. Vectors are preferably selected with ampicillin New   For the cultivation of E. coli, a shaking incubator at 250-300 rpm was used. E. coli is grown at 37 ° C in LB supplemented with appropriate selection antibiotics in an ear flask. Including breeding. Other temperatures (25-35 ° C.) may be used. Protein When growing cells for production, the cells Is induced at A560 = 1 with a final concentration of 0.4 mM IPTG. Or For induction, other cell densities may be selected in log phase growth.   Harvesting includes a step of collecting the E. coli cells by centrifugation. Produce protein When growing, cells are harvested 3 hours after induction, but other harvesting times may be selected. You may.   In the present invention, the vector is replicated in a prokaryotic or eukaryotic cell as a host. Any vector, such as a plasmid, may be used as long as it can.   The most preferred host cell is E. coli HB101. But many other E. coli Strains are also suitable. Use E. coli strain DH5a (BRL) for routine cloning Can be.   In the present invention, the hybrid protein is prepared by a known separation and purification method. It can be separated and purified in combination. These methods require the use of differences in solubility. Methods (eg salt precipitation method and solvent precipitation method), mainly using differences in molecular weight (Eg dialysis, ultrafiltration, gel filtration and SDS polyacrylamide gel electrophoresis Method), a method utilizing the difference in charge (eg, ion exchange column chromatography) -), Methods that utilize specific affinity (eg, affinity Chromatography), methods that utilize differences in hydrophobicity (eg, reversed-phase high-performance liquid chromatography). Chromatography), methods utilizing differences in isoelectric points (eg, isoelectric focusing) And methods using denaturation, reduction, regeneration and oxidation.   The immunogenic carrier system of the present invention is effective for human drugs as well as for livestock. this There are several important biological reasons for using castration and contraceptives in humans. Due to the fact that it exists. For example, breast cancer and prostate cancer are only two examples. However, it is a sex steroid-dependent tumor that responds to such hormonal manipulations. Human Another area of application for drugs is in the treatment of endometriosis. Pain in the peritoneum and pelvis of a woman This condition, which causes the growth of endometrial tissue with gut, also inhibits sex steroid synthesis respond. One skilled in the art will recognize that sex steroids can be achieved using the compounds disclosed herein. Partially reduce the secretion of It will also be appreciated that application related effects can be reduced or eliminated.   The immunogenic carrier system of the present invention reduces reproductive and / or reproductive hormone-induced behavior. Or veterinary drugs or kinetics for symptoms, physiology or anatomy for which elimination is desired It can also be used in animal husbandry. Sterilization of animals is mainly achieved by gonad removal surgery. It has been subjected. Surgery necessarily involves some pain, trauma and stress on the animal And may lead to infection and death. Undesirable behavior in food animals Or castration is used as a means to control meat characteristics, Production losses occur. For swine, uncastrated males are much higher than castrated males. Rate (about 18%). However, there is no Andro Stenones accumulate, thereby imparting undesirable odors and odors to the meat.   Accordingly, another aspect of the present invention provides a method of sterilizing an animal, the method comprising: Immunogenicity comprising GnRH bound to Pseudomonas exotoxin or a mutant thereof Administering the carrier system in an amount effective for sterilization. Using the immunogenic carrier system of the invention Vaccination eliminates the need for castration surgery. Therefore, the pain associated with castration surgery, Eliminate stress, trauma, infections, death, lost production and animal health issues. Forecast Desirable results of vaccination include transitional sterilization, unwanted gonadal steroid hormones Suppression of induced behavior (eg, male aggression and female estrus behavior), feed efficiency and edible behavior Carcass quality of products (eg, pigs and cattle) and boar carcass A method for eliminating male traces of non-castrated boars in Iraq.   The dosage / time adjustments involved in the use of these compounds will vary depending on the species of animal being treated, The specific GnRH and / or carrier used, adjuvant, age of the animal, It can vary widely depending on various factors, such as vaccination results. Generally, immunogenic The carrier system is subcutaneous or intramuscular at a rate of 1-1,000 μg of complex per dose. Administered to mammals by internal injection. The unit dosage of the immunogenic carrier system of the invention may be Sterilization in which the whole amount required for the seed may be used or multiple doses are administered at intervals of 1 to 6 weeks A plan may be used. Furthermore, the compound of the present invention is used as a seed disinfectant around adolescence. You can also delay the sterilization. This method allows for the timing of non-surgical sterilization. The advantages associated with the freedom to change are feed efficiency, meat production and / or quality. It is particularly useful in the field of animal and livestock which can advantageously contribute to   In the case of swine, boar-like growth efficiency and carcass not castrated using the immunogenic carrier system Eliminates unpleasant odors and tastes of non-castrated boar meat while maximizing scum quality Can be This can be done once or twice at various times during the growing season. This can be achieved by intramuscular or subcutaneous injection. One example of a convenient and effective plan is raising / working. Initial vaccination during the period of housing in the raising facility (9-16 weeks of age) Boosting during the growing season (18-22 weeks of age). All vaccinations are administered The dose is about 1 to about 1,000 μg, preferably about 10 to about 100 μg of immunogenicity. A carrier system is used. In the case of a single dosage regimen, the amount of immunogenic carrier system will generally be Levels that are higher than those used in the regimen.   Cattle in feedlots can be treated in a manner similar to that used for pigs, When entering the nursery and the desired effect (ie contraception in cows, maximum growth in bulls) Vaccination at another time as determined by). Cows are mixed for contraception Vaccinations must be completed before entering the breeding grounds, When entering the nursery, be sure to enter when entering the breeding ground to prevent estrus behavior. Vaccinations are given 4 to 12 weeks after. Bulls should be launched to maximize feed efficiency. As late as possible and well in time to prevent aggression and marble meat Vaccinations need to be given early.   GnRH vaccine for companion animals such as dogs and cats Can be administered by subcutaneous or intramuscular injection at the time of standard vaccination (6-21). At 6 weeks of age, booster once every 6 months and then once a year).   For castration of adult animals such as dogs, cats and horses, two doses are administered at 2 to 8 week intervals. And then a booster must be given each year in a sufficient amount for castration. Actual medication The amount and formulation may vary depending on the particular immunogenic carrier system used. But, The immunogenic carrier of the present invention formulated on alum and administered in a volume of 1-3 ml 1 to 2,000 μg, preferably about 500 μg, of the system is sufficient when administered as described above. Minutes can be effective.   For humans, treating sex steroid responsive tumors using the immunogenic carrier system of the present invention I can do it. 2 doses of 1 to 1,000 μg of immunogenic carrier system per vaccine dose Administered 2 to 8 weeks apart, tumor disappears or responds to hormone therapy Boosters can be boosted every 6 to 12 months until gone.   The immunogenic carrier system of the present invention can be used to create lesions at the site of injection or carcass meat animals. Intense adjuvant, such as complete Freund's adjuvant, which degrades quality It can be used for the above-mentioned purpose without using. Suitable adjuvant Can be used by those skilled in the art to administer to the immunogen without causing unacceptable adverse reactions. A substance that has been identified as a substance that enhances the immune response of an animal. Al (OH)Three, AlPOFour, AlTwo(SOFour)ThreeAlumini like Incomplete Freund in a suitable solvent such as urea compound, squalane or squalene Toadjuvant (IFA), Water-in-oil emma such as acetate solubilizer, saponin, muramyl dipeptide Rushon is included.   In a preferred embodiment, the immunocarrier system of the present invention comprises a metabolizable oil, Such as ropylene (POP) -polyoxyethylene (POE) block polymer Nonionic surfactants, emulsifiers and, optionally, Formula 1 中 where R1Is H, C2-8Alkenyl, C1-8Alkyl, benzyl, phenyl or Is CORFour[Where RFourIs H, C1-8Alkyl, C2-8Alkenyl, benzyl young Or Phenyl (where the phenyl moiety is hydroxy, carbohydrate having 1 to 4 carbon atoms) Xy, halo, C1-4Alkoxy, C1-4Alkyl and C2-4Selected from alkenyl ).ThreeM or POThreeM (where M is H or Sodium or potassium)];   RTwoIs H or OR1Is;   RThreeIs OR1Or RThreeAnd RFourTogether form oxo;   RFour, RFive, R6And R7Is independently H or methyl;   Where RThreeAnd RFourTogether form an oxo, RFive, R6, R7And RTwo Are each H; RTwoIs H, RFour, RFive, R6And R7Is hydrogen Yes, RThreeIs OR1Is Administered as an oil-in-water emulsion containing an immune response enhancer.   In a vaccine composition, the metabolizable oil is an oil having 6 to 30 carbon atoms. Examples of such oils include alkanes, alkenes, alkynes, and their counterparts. Includes acids and alcohols, their ethers and esters, and mixtures thereof. I will. The oil can be metabolized in the body of the patient to whom the adjuvant is administered and It may be any vegetable, fish, animal or synthetic oil that is non-toxic to it. Vegetable oil Examples include peanut oil, soybean oil, coconut oil, olive oil, safflower oil, cottonseed oil, castor oil Includes croissant oil, sesame oil and corn oil. Animal oils are usually solid at physiological temperatures. However, fatty acids are derived from animal fats to provide free fatty acids, It can be obtained by lyceride saponification. Most fish are easily recoverable metabolic oils Contains. For example, cod liver oil and shark liver oil are examples of fish oil. Like a wax Whale oil is also acceptable. Many branched chain oils contain CFiveBiochemistry as isoprene unit It is synthetically synthesized and is generally called a terpenoid. Shark liver oil, squalene And contains branched unsaturated terpenoids known as terpenoids. Squalene saturation The analogue squalane is a particularly preferred oil of the present invention. Ajuba of the present invention The oil component in the vaccine composition and vaccine is usually 1 to 10%, preferably 2.5 to 5%. It is present in an amount of%.   The term "polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer" Propylene oxide followed by ethylene oxide, a low molecular weight reactive compound, usually propylene Refers to a polymer formed by sequential addition to glycol. These block polymers Is described in U.S. Pat. No. 2,674,619 issued to Lunstead. Can be manufactured according to the methods described above and are trademarks of BASF-Wyandotte. The properties of the rock polymer are determined by the molecular weight of the POP core and the proportion of POE in the product. Is determined. The POP part gives the block polymer hydrophobicity, and the POE part is hydrophilic. Imparts properties. Followed by two or three Arabic numerals. Letter prefix (L, P or F) refers to the physical form (liquid, paste or exfoliating solid) of each polymer. The first one or two Arabic numbers code for the POP-based average molecular weight, The last Arabic numeral indicates the amount of POE. example 0 polyoxypropylene base and 10% polyoxy It is a liquid containing ethylene. Preferred block polymers have a temperature of about 15-40 ° C. It is a liquid over a temperature range. Furthermore, it is liquid within the above temperature range. , Liquid and paste, liquid and paste and flakes Polymer mixtures such as solids or mixtures of liquids and exfoliating solids are also effective in the present invention. Can be   A preferred block polymer is a PO having a molecular weight range of about 2,250 to 4,300. It has a P base and a POE in an amount of about 1-30%. More preferred bro The block copolymer has a POP with a molecular weight in the range of 3,250 to 4,000, The OE component constitutes 10 to 20%. And L122 are included within the definition. Most preferred is a molecular weight of 4,000 Having a POP of 0 and a POE in an amount of 10% or a POP with a molecular weight of 3,250 Block polymers having a POE in an amount of 10%, for example P It is. The block polymer is preferably 0.001-10%, most preferably Is used in an amount of 0.001 to 5%.   The term "emulsifier" refers to a non-toxic surfactant that can stabilize the emulsion . In medicinal chemistry, a considerable number of emulsifiers and suspending agents are generally used. To them Are gums, vegetable proteins, alginate, cellulose derivatives, phospholipids ( Natural or synthetic) and the like. You. Certain polymers having hydrophilic substituents on the polymer backbone, such as povidone , Polyvinyl alcohol and glycol ether based compounds have emulsifying activity ing. Compounds derived from long-chain fatty acids have a third substantial emulsification and It is a group of suspending agents. Any of the above emulsifiers may be used as long as they are non-toxic. Preference is given to emulsifiers based on glycol ethers. Preferred emulsifiers are nonionic surfactants Sexual agent. The surfactant includes polyethylene glycol (particularly, PEG 20 0, 300, 400, 600 and 90 c. , Wilmington, Del. Available from)), polyoxyethylene, Polyol fatty acid ester, polyoxyethylene ether, polyoxypropyl Fatty ether, bee wax derivative-containing polyoxyethylene, polyoxyethylene Lanolin derivatives, polyoxyethylene fatty glycerides, glycerol fatty acids Ter or other polyoxyethylene alcohols or 12 to 21 carbon atoms And ether derivatives of long-chain fatty acids having the formula: Preferred emulsifiers are (Polyso Luvate 80 or polyoxyethylene 20 Also known as sorbitan monooleate) T It should be understood that any of the above emulsifiers are suitable. Usually, the emulsifier is It is used in an amount of about 0.05 to about 0.5%, preferably about 0.2 to 1%.   The aqueous portion of the adjuvant composition of the present invention is a buffered isotonic saline solution. You. Swelling after administration due to the difference in ion concentration between the composition and the standard physiological solution or the composition To prevent rapid absorption, the tonicity should be substantially the same as the standard physiological solution. It is preferred to prepare these solutions. Maintain pH to meet standard physiological conditions It is also preferred to buffer the saline solution to achieve this. In certain cases, glycopeptides Maintain the pH at a certain level to ensure the stability of certain composition components such as May be necessary. Any physiologically acceptable buffer may be used in the present invention. However, it has been found that it is most convenient to use a phosphate buffer. Phosphate buffer Instead of an immersion fluid, any other acceptable such as acetate, tris, bicarbonate, carbonate etc. A buffer that can be used may be used. Phosphate buffered saline or a mixture of phosphate and acetate It is preferable to use saline buffered with the mixture.   Immune response enhancers of Formula 1 are compounds well known in the art (eg, dehydro Epiandrosterone) or R.I. M. U.S. Pat. No. 5,27 to Loria 7,907 or Neurocrine Biosciences WO95 / It may be manufactured according to the disclosure of No. 10527. Preferred vaccine compositions of the invention In certain embodiments, an immune enhancing amount of an immune response enhancer is included. Better Preferably, the immune response enhancer has the formulaa(Where R1, RTwo, RFive, R6And R7 Is H, RThreeAnd RFourTogether form an oxo group) And the compound is dehydroepiandrosterone or DHEA.   In the vaccine composition of the present invention, the immunogenic carrier system is any GnRH-PE It may be a complex or a GnRH-PE hybrid. Immunogenic carrier system of the invention Is a hybrid protein of GnRH and Pseudomonas exotoxin A There may be. Such hybrid proteins are constituent proteins / peptides In the proximity sequence. The hybrid protein expresses a recombinant DNA sequence It is preferable to manufacture it.   The DNA used in the practice of the present invention may be natural or synthetic. May be done. Containing a nucleotide sequence encoding an embodiment of the present invention. Recombinant DNA segments can be made according to the following general method: (A) cutting the desired DNA sequence from the plasmid into which it has been cloned; Out (or the sequence may be chemically synthesized); (B) cutting the second DNA sequence, which is the target DNA sequence, at a specific position; (C) Next, align the desired DNA sequence with the cut in the target DNA sequence, Are joined by standard ligation procedures. Put the obtained recombinant gene in the expression vector Downstream of the appropriate promoter.   The DNA cleavage and ligation procedures used in the present invention are generally well known to those skilled in the art. , Molecular Cloning, A Laboratory   Manual, (1989) J. Am. Sambrook et al., Cold Spring. g Described in Harbor Laboratory Press.   The promoter used in the present invention is expressed in a host used for gene expression. Any promoter as long as it is suitable for May be used. The promoter can be produced enzymatically from the corresponding gene. Yes, it can be chemically synthesized.   Conditions for use of all restriction enzymes are as specified by the manufacturer, including buffer and temperature instructions. Subject to the terms of use. The enzyme is available from New England Biolabs, Be. thesda Research Laboratories, Boehrin ger Mannheim and Promega.   The ligation of the inserter and the inserter DNA was performed using 66 mM of T4 DNA ligase. Tris-HCl, 5 mM MgClTwo, 1 mM DTE, 1 mM ATP (p H7.5) at 15 ° C. for up to 24 hours. Generally, 1 to 200 ng vector A 3-5 fold excess of insert DNA is preferred.   For selection of Escherichia coli containing the recombinant plasmid, the bacterium was transformed with the appropriate antibiotic-containing L. Streak culture on B-agar plate, or select if necessary in culture flask. LB solution containing an appropriate antibiotic (tryptone 10 g / L, yeast extract)   5 g / L, NaCl 10 g / L, pH 7.4). Selection Which antibiotic to choose Is determined by the resistance marker present on a given plasmid or vector . Preferably, the vector is selected by ampicillin.   For the cultivation of E. coli, a shaking incubator at 250-300 rpm was used. Grow E. coli at 37 ° C in LB supplemented with appropriate selection antibiotics in ear flasks Including Other temperatures (25-35 ° C.) may be used. Protein production When growing the cells for IPTG, the cells are treated with a final concentration of 0.4 mM IPTG. And A560 = 1. Alternatively, induction may involve other in log phase growth Cell density may be selected.   Harvesting includes a step of collecting the E. coli cells by centrifugation. Produce protein If harvesting, harvest cells 3 hours after induction, but choose another harvest time Is also good.   In the present invention, the vector is replicated in a prokaryotic or eukaryotic cell as a host. Any vector, such as a plasmid, may be used as long as it can.   The most preferred host cell is E. coli HB101. But many other E. coli Strains are also suitable. Use E. coli strain DH5a (BRL) for routine cloning obtain.   In the present invention, the hybrid protein is prepared by a known separation and purification method. It can be separated and purified in combination. These methods require the use of differences in solubility. Methods (eg salt precipitation method and solvent precipitation method), mainly using differences in molecular weight (Eg dialysis, ultrafiltration, gel filtration and SDS polyacrylamide gel electrophoresis Method), a method utilizing the difference in charge (eg, ion exchange column chromatography) -), A method using specific affinity (eg, affinity chromatography) -), Methods that utilize differences in hydrophobicity (eg, reversed-phase high-performance liquid chromatography) -), Methods that use differences in isoelectric points (eg, isoelectric focusing), denaturation, Methods utilizing reduction, regeneration and oxidation are included.   In a preferred embodiment of the vaccine composition of the present invention, an oil-in-water emulsion Include Squalane, Tween 80 and Pluronic L121. More preferably, the vaccine comprises DHEA as an immune response enhancer. Shi More preferably, the pseudomonas exotoxin is NLys PE38QQR. .   The oil-in-water emulsion adjuvant composition forms a uniform emulsion. Emulsified using a mixer You. Typically, the adjuvant composition is micronized before being added to the GnRH complex. Microfluidize the particles. The emulsion is passed through an ultra-fine particle fluidizer. And circulate about 2 to 20 times. The GnRH complex is then combined with the adjuvant composition. While mixing, the mixture may be recirculated through the ultrafine particle fluidizer. Exemption When a disease response enhancer, such as DHEA, is incorporated into the vaccine composition, The enhancer may be added to the adjuvant composition before microfluidization, The GnRH complex may be added after mixing with the adjuvant composition. In the latter case The ultrafine particle fluidization of the whole mixture again, generally 2 to 20 times Need to be circulated through. The oily particles in the emulsion are about 0.03-0 . It preferably has a particle size of 5 μm, and if the particle size is 0.05 to 0.2 μm More preferred.Preparation of GnRH Formulation 1. DLys6-GnRH: [SEQ ID NO: 7] pGlu-His-Trp-S er-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-Gly-NHTwo:   The peptide comprises an ABI model 431A synthesizer and a single (DCC / HOBT) Rink amide MBHA resin (0.25 mmol, Amino Tech). Reagent R (1 ml / 100 mg   Resin, TFA / thioanisole / ethanedithiol / anisole, 90: 5: The peptide was cleaved from the resin using 3: 2). Use diethyl ether and concentrate Peptides were precipitated from the condensed cleavage mixture and separated by preparative reverse phase HPLC (Waters Pr. epP B, 0-20 min; then 20-35% B, 20-40 min; λ = 230 nm) And purified. DLys6-GnRH: FAB-MS (positive ion, NBA matrix) calculated value : M + 1 = 1254.44; found: M + 1 = 1254.4. Formulation 2: [DCys6] GnRH: [SEQ ID NO: 8] pGlu-His-Trp- Ser-Tyr-DCys-Leu-Arg-Pro-Gly-NHTwo   Rink amide resin (521 mg) was sequentially added to Gly, Pro, Arg, Leu, It bound to D-Cys, Tyr, Ser, Trp, His, and pyroglutamic acid. Arg and G The ly residues were double coupled and the other residues were single coupled. Meta resin Washed three times with ethanol and dried under nitrogen (1.069 g resin = 0.539 g resin Increase).   The peptide was cleaved for 3 hours, the resin was filtered off, and the peptide was dried under vacuum. Remove the residue Triturate with ethyl ether, collect the precipitated peptide by suction filtration, and freeze-dry (431.7 mg).   Part of the peptide (195.5 mg) was added to 0.1% TFA, 10% acetonitrile (3 ml), filtered, RPHPLC (2 tandem 25 × 10 RCM   Delta Pak C1830-minute 15-45% acetonit using a column Lil). The second part of the peptide was repeatedly purified (190.5 m g). The peak fractions were collected, combined and lyophilized, and aliquots were collected by FAB-MS and And amino acid analysis. Confirm predicted mass (1229) and amino acid composition I accepted. Formulation 3.3- (Mercaptopropanoyl)-[Gln1] GnRH: [SEQ ID NO: 9] HSCHTwoCHTwoCOHN-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gl y-L eu-Arg-Pro-Gly-NHTwo   Unadded Rink Amide MBHA resin (Nova Biochem, 0 . 25 mmol) and an ABI 431A peptide synthesizer (Fmoc Gln1Peptides up to residues were prepared. First Gly residue on resin Double coupled. All other amino acids except Arg are single coupled. Was. Arg8For, a standard double coupling protocol was used. peptide From which the N-terminal Fmoc group is removed, and the resin is dried (NTwo)did. Resin, frit Peptide synthesis container with activated bottom (N for stirring)TwoUsed). Resin Suspend in DMF (5 ml) and activate PyBOP / HOBt (1 mmol PyB OP, 0.1 mmol HOBt) and 3-mercaptopropionic acid (1 mm ol) is manually coupled to the amino terminal, and the reaction is determined by the Kaiser test of the resin. N until complete (16-48 hours)TwoStir down. 20ml Degassed "Reagent R" (90: 5: 3: 2 TFA / thioanisole / ethanedithio- (Anisole) at room temperature for 3 hours. The mixture Filter and concentrate the filtrate in vacuo. Triturate the residue with ether, The precipitate was collected and dried (272.1 mg). RP-HPLC (Delta P ak C18, RCM2-50 × 10, 45 ml / min, 16 → 24% CHThreeCN , 30 minutes). Combine fractions containing desired product and overnight Lyophilization gave a peptide as a white powder (98 mg, 31%). Electr ospray MS showed the expected molecular weight (M + H = 1288). Formulation 4. [(3-mercaptopropanoyl) -Gln1, DAla6] -GnRH : [SEQ ID NO: 10] HSCHTwoCHTwoCONH-Gln-His-Trp-Ser -Tyr-DAla-Leu-Arg-Pro-Gly-NHTwo   Unadded Rink Amide MBHA resin (NovaBiochem, 0. 25 mmol) using an ABI 431A peptide synthesizer (Fmoc Gln on1Peptides up to residues were prepared. First Gly residue on resin Double coupled. All other amino acids except Arg are single coupled. Was. Arg8For, a standard double coupling protocol was used. peptide From which the N-terminal Fmoc group is removed (regular pi on ABI) Peridine cycle), drying the resin (NTwo)did. Resin with fritted bottom Manual peptide synthesis vessel (N for stirring)TwoUsed). Resin in DMF (5m l) and activate PyBOP / HoBt (1 mmol PyBOP, 0.1 with 3-mercaptopropionic acid (1 mmol) using 1 mmol of HOBt). The reaction was completed by manual coupling to the terminal and Kaiser test of the resin (16 to 48 hours) NTwoStir down. 20 ml of degassed “Reagent R (90: 5: 3: 2 TFA / thioanisole / ethanedithiol / anisoe To separate the peptide from the resin for 3 hours at room temperature. The mixture is filtered and the filtrate Was concentrated in vacuo. The residue was triturated with ether, the sediment was collected and dried (23 2.0 mg). RP-HPLC (Delta Pak C18, RCM2-50 × 10, 45 ml / min, 15 → 30% CHThreeCN, 30 minutes) Purified. The fractions containing the desired product are combined and lyophilized overnight to give a white powder. The peptide was obtained (112 mg, 35%). By Electrospray MS The expected molecular weight (M + H = 1303). Formulation 5. DLys6−DAlaTen-GnRH: [SEQ ID NO: 11] pGlu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-DAla- NHTwo:   ABI model 431A peptide synthesizer and single coupling (D CC / HOBT) and Rink Amide MBHA resin (0.25 mm ol, Amino Tech). "Reagent R" (2.0 m 1/100 mg resin, 90: 5: 3: 2 TFA / thioanisole / ethanedithi The peptide was cleaved from the resin using (all / anisole) (room temperature, 3 hours). Peptides were precipitated from the concentrated cleavage mixture using diethyl ether and separated Purified by LC. 6-D-Lys-10-D-Ala by FAB-MS -Characterization of GnRH (cation, NBA matrix) Calculated: (m + 1) = 1268.5; found: (m + 1) = 1267.5. Formulation 6. DLys6-Pro9-NHEt-GnRH: [SEQ ID NO: 12] pGlu -His-Trp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-NH Et:   ABI Model 431A synthesizer and single cup According to solid phase peptide synthesis method (Boc chemistry) using ring (DCC / HOBT) Peptides were synthesized on Merrifield resin. Using anhydrous ethylamine, The peptide was cleaved from the resin (24-72 hours, room temperature). Dilute the crude protected peptide Precipitate with ethyl ether, collect by suction filtration, and overnight (PTwoOFiveAt) dried. Presence of anisole (0.2-2 ml) and dimethyl phosphite (0.1-1 ml) Treat with anhydrous HF underneath (0 ° C, 0.5-2 hours, 5-30 ml) and dry pepti The protecting group was removed from the compound. Excess HF is removed in vacuo and the residue is diethyl ether Ground. The peptide was purified by preparative reverse phase HPLC. FAB-MS ( Characterization by (cation, NBA matrix): found: (m + 1) = 122 3.9. Formulation 7. DOrn6-GnRH: [SEQ ID NO: 13] pGlu-His-Trp- Ser-Tyr-DOrn-Leu-Arg-Pro-Gly-NHTwo:   ABI Model 431A synthesizer and single coupling (DCC / H OBT) and Rink Ami according to the solid phase peptide synthesis method (Fmoc chemistry). de MBH Peptides were synthesized on A resin (0.25 mmol, Amino Tech). Reagent R (2.0 ml / 100 mg resin, TFA / thioanisole / ethanedithio The peptide was cleaved from the resin using the following procedures: 90/5: 3: 2). (3 hours, room temperature). Precipitation of peptide from concentrated cleavage mixture using diethyl ether And purified by preparative reverse phase HPLC. FAB-MS (Positive ion, NBA Trix) to determine the characterization of 6-D-Orn-GnRH: Calculated: (m + 1) = 1239.4; found: (m + 1) = 1239.5. Formulation 8.3-Indolylpropionyl-6-DLys-GnRH: 3-indori Lepropionyl-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-Gly -NHTwo   ABI Model 431A synthesizer and single coupling (DCC / H OBT) and Rink Ami according to the solid phase peptide synthesis method (Fmoc chemistry). Peptide on de MBHA resin (0.25 mmol, Amino Tech) Was synthesized. Reagent R (2.0 ml / 100 mg resin, TFA / thioanisole / Ethanedithiol / aniso , 90: 5: 3: 2) to cleave the peptide from the resin (3 hours, room temperature) ). Precipitate the peptide from the enriched cleavage mixture using diethyl ether and separate Purified by HPLC. For FAB-MS (cation, NBA matrix) Characterization of 3-Indolylpropionyl-6-D-Lys-GnRH by Calculation: Value: (m + 1) = 990.2; Found: (m + 1) = 990.7. Formulation 9.3-Indolylpropionyl-6-DLys-9-Pro-NHEt- GnRH: 3-Indolylpropionyl-Ser-Tyr-DLys-Leu- Arg-Pro-NHEt   ABI Model 431A synthesizer and single coupling (DCC / H OBT) according to the solid phase peptide synthesis method (Boc chemistry). d Synthesize the peptide on the resin. The 3-indolylpropionyl moiety is N-formi Incorporated as ru-3-indolepropionic acid. Trees using anhydrous ethylamine Separate the peptide from the fat (2-72 hours, room temperature). Dilute crude protected peptide Precipitate with ether, collect by suction filtration and dry overnight (PTwo OFive). Anisole (0.2-2ml) and dimethyl phosphite (0.1-1ml) ) Treated with anhydrous HF in the presence of (0 ° C, 0.5-2 hours, 5-30 ml) and dried Remove the protecting group from the peptide. Excess HF is removed in vacuo and the residue is -Grind with a tel. The peptide was purified by preparative reverse phase HPLC and analyzed by FAB-MS. Is determined byPreparation of Pseudomonas exotoxin Formulation 10. NLys PE48QQR   Plasmid PJH4 [J. Hwang, "Cell" (1987, 48; 12). 9-136)] is PE1-613Contains the code sequence of Sambrook , French & Maniatis (Cold Spring Harbo) r Press)Molecular Cloning, Second Oligonucleotides described in the edition (1989) 15.51 to 15.73. Mutagenesis is used as a convenient way to create deletions / mutations in PE molecules I have been. Double digest NdeI / HindIII with PJH4 to linearize the construct And a 12 bp segment containing the ATG start codon of the PE coding sequence To run. Synthesize two complementary oligonucleotides And ligated to the NdeI / HindIII splice site. The The oligomer has the following nucleotide sequence: 1-5'TAT GCT GCA  GGG TAC CAA GCT TAT GGC CGA AGA 3 'and II-5 'AGC TTC TTC GGC CAT AAG CTT GGT ACC CTG CAG CA 3 '. The modified PE insert is an N-terminally constructed MLQGTKL It has a MAEE sequence. This plasmid is called PJH42.   The plasmid PJH42 is partially cut with AvaI. Isolate linear DNA And digested completely with HindIII and isolated the resulting 5.1 kb fragment. You. S1 nuclease treatment to ligate blunt ends, recircularize the plasmid, Called PJH43. This gives PE with amino acids 4-252 deleted.   The 553 bp SalI / BamH1 fragment of plasmid PJH43 was Clone to 13mp19. Structure 5'GGC GTC GCC GCT GTC  CGC CGG GCC GTT GGC CGC GCC GGC CTC GTC Synthesis of an oligonucleotide 50 nucleotides in length with GTT GC 3 ' Annealed with single-stranded M13 vector to Facilitates mutagenesis to create a deletion of the amino acid 365-380 (loop out And get the following sequence:   The 505 bp SalI / BamH1 fragment was converted to the M13 replicative mutant DN. A and excised from the 3.7 kb SalI / BamH1 plasmid of plasmid PJH43. Connect with lugments. This new plasmid is designated PJH44.   BamH1 / EcoR1 plasmid consisting of 460 nucleotides from PJH44 Cut out and cloned into M13mp19. This fragment Contains the nucleotide sequence of three lysines mutated at the carboxy terminus of the coding sequence In. Ricins 590 and 606 are mutated to glutamine, and ricin 613 is arginine. It is mutated to nin. Then, the following oligomers are used to continuously lyse each lysine. Perform a Rigo-induced mutation:   Cleavage of BamH1 / EcoR1 fragment from M13 replicative mutant DNA And 3.4 kb BamH1 / EcoR1 fragment of plasmid PJH44. Connect with The linearized plasmid was then recircularized and designated PJH45. Obtained from Bethesda Research Laboratories A repair identified as NLys PE38QQR from the resulting commercially available E. coli strain, HB101 Used to express decorative PE. NLys PE48QQR is a published WO 93/15751 (Merck & Co., Inc.) Also known as ysPE38M. Formulation 10. Reduced NLys PE38QQR   175 to 10 ml of toxin NLysPE38QQR solution containing 12.8 mg of toxin The pH was adjusted to 8 by adding mg of pH 8 buffer salt. EDTA disodium salt Add hydrate (372.24 mg) and dithiothreitol (154.25 mg). The mixture was then shaken overnight at room temperature under anhydrous nitrogen to give cysteine 265 in the toxin, The reduction of the disulfide bond at 287 was completed. Transfer solution to dialysis bag and buffer Liquid: dialyzed for about 8 hours at room temperature against 0.1 M phosphate (dispersed with nitrogen) . The reducing toxin solution was then chambered against 0.01 M phosphate buffer under nitrogen dispersion. Dialysis overnight at warm. After dialysis is completed, the reaction contents of the dialysis bag are sterilized with plastic. Into a centrifuge centrifuge tube and sample the contents for thiol content. The prepared reducing toxin dithiol was stored for subsequent reactions. Formulation 11. Photoinactivated PE holotoxin   Pseudomonas exotoxin A (10 mg, 0.152 mmol) (Sig ma Chemical Co. ) Was dissolved in 10 ml of water, and 8-A was added to the solution. Zidoadenosine (43 mg, 0.14 mmol) was added. It is completely dissolved Did not. A small amount of sediment is centrifuged, and the supernatant is charged into a Pyrex photoreactor, and then ice water It was cooled and irradiated with a 450 W Hanvia lamp for 8 minutes. The resulting solution is Dialyzed against PBS for 17.5 hours and then TSK2000 HPSEC When analyzed for low molecular weight substances (ie, unreacted 8-azidoadenosine) It was shown to be absent. The solution was also tested for ADP ribosylation activity. Assayed and found to have only 4% of the original level.                                 Example 1              (Via succinimide propanoyl linker)            DLys 6 -GnRH-NLys PE38QQR complex (1) (Nε-Maleimidopropanoyl) -DLys6-GnRH: PyroG lu-His-Trp-Ser-Tyr- (Nε-Maleimidopropanoyl)- D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NHTwoPreparation of:   DLys6-GnRH (10 mmol, 12.5 mg) was added to N, N-dimethylphos. Dissolve in LUMAMID (0.5 ml / g) and add DIEA (50 mmol, 9 μl) added. The mixture was stirred for a while at room temperature, and β-maleimidopropionic acid N- Hydroxysuccinimide ester (MPS; 20 mmol, 5.2 mg) Introduced every time. After reacting for 30 minutes, 10 μl of TFA was added to the reaction mixture, Solvent was removed in vacuo. The peptide was subjected to reverse phase HPLC (Waters 8; 10 ml / min; 10 to 25% B, 0 to 30 minutes → 25% B, 30 to 35 minutes; = 230 nm). FAB-MS (Positive ion, NBA Matric S) Calculated value: M + 1 = 1405.56; Actual value: M + 1 = 1405.6. (2) (Nε-maleimidopropanoyl) -DLys6-GnRH and NLys- Binding with PE438QQR   In a 15 ml sterile polyethylene precipitation tube equipped with a septum, NLys- PE38QQR (0.22 μmol, 30 ml, 2.8 mg / ml) was added. 350 μl of 1.0 M borate buffer (pH 11.0) was added to the solution to adjust the pH to 1 Adjusted to 0.8. Dithiothreitol (11.0 μmol, 1.7 mg) and EDTA-2Na (22.1 μmol, 8.2 mg) was added and all solids dissolved The protein mixture until shaken. N-acetylhomocysteine thiolac Ton (22.1 μmol, 3.5 mg) at once, degas the solution and add nitrogen Purged (degas / purge was repeated 5 times). The mixture was placed in a nitrogen box at room temperature for 6.5. Aging, then charged into Spectropor2 dialysis tubing and allowed to stand at room temperature , (1) 10 mg of EDTA- Degassed and nitrogen dispersed 0.1 M phosphoric acid containing 2Na and 0.25 mg DTT (2) Degassed and dispersed nitrogen in 4 L of salt buffer (pH 8.0) for 16 hours. 0.001 M solution containing 10 mg EDTA-2Na and 0.25 mg DTT Dialysis was performed for 6 hours against 4 L of phosphate buffer (pH 8.0). Then thiolation Transfer the exotoxin to a 15 ml sterile polyethylene precipitation tube (3.90 ml) Was. When 325 ml of the material is subjected to the Ellman assay, a total of 0.350 μm ol of SH was shown to be present. Residual thiolated substance (0.321 mmol l of SH, 3.57 ml of solution)ε-Maleimidopropionyl) -DL ys6-GnRH (1.60 μmol, 2.25 mg) was added. Then the reaction Shake the mixture for a while,TwoAged at room temperature in the box for 1 hour. Toxin mixture Into a Spectropor2 dialysis tube, and (1) 4 L of 0.01 M (2) 4 L of 0.01 M phosphoric acid against phosphate buffer (pH 7.0) for 18 hours 46 hours against phosphate buffer and (3) 7 hours against 4 L of deionized water did. The complex is centrifuged to pellet unsuspended material, and a sterile filter ( Millipore 0.22μ Was. The conjugate had a different HPLC than the unbound NLys-PE38QQR. Had properties. Lys-PE38M RP-HPLC (250 mm × 4.6 mm Vydac C4; 1.5 ml / min; 36-41% B, 0-30 min; λ = 215 nm); Holding time = 18.16 minutes.                                 Example 2                  (Via dithiopropanoyl linker)            DLys 6 -GnRH-NLys PE38QQR complex   DLys6-GnRH (15 mg, 12 μmol) in anhydrous DMF (3 ml) After dissolution, DIEA (2 μl, 12 μmol) was added. SPDP (N-succin Imidyl-3- [2-pyridyldithio] propionate, 4.1 mg, 13 μm ol) in one portion and the reaction mixture is stirred overnight (18 hours) under a nitrogen atmosphere at room temperature did. Concentrate the reaction mixture in vacuo And the residue is purified by HPLC (High Performance Liquid Chromatography; Waters De). lta Pak C18, RCM 25 × 10, 10 ml / min, 30 minutes 15 → 45% CHThree(CN gradient). Combine the fractions containing the desired product and freeze Dried and dried as a white powder [DLys6-N- (3-dithiopyridyl) propa Noyl] -GnRH was obtained. Electrospray MS [M + H] = 1450.3.   [DLys6-N- (3-dithiopyridyl) propanoyl] -GnRH (1. 2 mg, 0.86 μmol) was reduced NLys PE38QQR (5 ml, 0.2 85 μmol) and shake the reaction mixture, overnight (15 hours) at 4 ° C. to room temperature Stirred. The reaction mixture was transferred to dialysis tubing and, at room temperature, 4 L of nitrogen dispersed 7 hours against 0.01 M phosphate buffer (pH 8.0) and 18 L of 0. Dialysis was performed against 9% aqueous NaCl for 20 hours. Filter the solution (0.22 μm Mi lex GV sterile filter). Known standard solution of NLys PE38QQR As a result of HPLC analysis, the protein concentration of the obtained complex was 1. It was found to be 2 mg / ml. HPLC of the complex: (Vydac, C4, 4.7 × 250 mm, 1.5 ml / min. , 35 → 45% CHThreeCN, 20 min gradient); retention time = 16.27 min.                                 Example 3                 [DCys 6 ] -GnRH-KGGSGGK-                      NLys PE38QQR complex (1)Fmoc-β-Ala-Lys-Gly-Gly-Ser-Gly-Gl Preparation of y-Lys-OH (linear skeleton) :   Pre-loaded Fmoc-Lys-WANG resin and single amino acid coupling 431A peptide synthesizer (Fmoc chemistry) The case was prepared. The peptide was converted to resin TFA / thioanisole / ethenedithiol / A Dissociated from Nisole (90: 5: 3: 2) and purified by gradient RP-HPLC did. Electrospr ay MS (M + H = 882.0). (2)Fmoc-β-Ala-K (N ε HBrAc) GGSGGGK (N ε HBr Ac) Preparation of OH (Bis-bromoacetylated linear skeleton) :   In anhydrous (Aldrich Sure-Seal) dichloromethane (2 ml) With bromoacetic acid (31.5 mg, 0.226 mmol, 3.96 equivalents) and DCC ( 23.4 mg, 0.113 mmol, 1.98 equivalents) for 1 hour at room temperature. To prepare bromoacetic anhydride. This mixture is combined with the linear skeleton peptide from step 1. (50.0 mg, 0.057 mmol) as it is (filtration funnel, NTwoUnder pressure) and dissolved in anhydrous (4 sieve) degassed DMF (5 ml). NTwoUnder The reaction proceeded at room temperature. After 30 minutes, the reaction mixture was purified by RP-HPLC (Vydac C18 , 4.7 × 250mm, 1.5ml / min, 10 → 60% CHThreeCN, 20 minutes Analysis shows that all starting material has been consumed (preservation of linear skeleton). Retention time = 13.27 min), new product peak (retention time = 16.48 min) Was called. After a total reaction time of 45 minutes, the mixture was concentrated in vacuo and the product was washed with RP-H PLC (DeltaPak C18, RCM 25 × 10, 10 ml / min, 25 → 55% CHThree(CN, 30 minutes) did. The fractions containing the desired substance are combined and lyophilized overnight to give bis- A bromoacetylated linear skeleton (31.2 mg, 0.027 mmol, 49%) was obtained. . (3)Fmoc-β-Ala-K ( N ε HCOCH 2 S~ [DCys 6] -GnR H) -GGSGGK (N ε HCOCH 2 S~ [DCys 6] -GnRH) -OH-Preparation of (Skeletal Support [DCys 6 ] -GnRH) :   Bis-bromoacetylated linear skeleton from step 2 (31.2 mg, 0.02 7 mmol) in degassed 0.10 M phosphate buffer (pH 8.0) (5 ml). Dissolve and add acetonitrile (250 μl). The pH meter indicates that the pH of the solution is 8 . 1 was shown. Then, [DCys6] -GnRH (68.1 m g, 0.055 mmol, 2.04 equivalents) in water (2 ml). A few drops of ril were added and the solution was clarified. Dilute ammonium hydroxide was added to the reaction mixture. While maintaining the pH at 7.8 to 8.1, the bis-bromoacetylated skeleton has [D Cys6] -GnRH solution was added dropwise (slowly over 35-40 minutes). The final pH of the reaction mixture was 8.0. The reaction mixture was stirred at room temperature for 10 minutes, The mixture was then sonicated for 20 minutes, resulting in a cloudy solution. 2 o'clock again While stirring at room temperature. The reaction mixture was subjected to RP-HPLC analysis (Vydac C18, 4. 7 x 250 mm, 1.5 ml / min, 10-60% CHThreeCN, 20 minutes) And all of the starting material has been consumed and a new product peak (retention time = 14.34 min) Was observed. The reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was Zinc hydrochloride, RP-HPLC (DeltaPak C18, RCM   25 × 10, 10 ml / min, 20-50% CHThree(CN, 30 minutes) did. The fractions containing the desired substance are combined and lyophilized overnight to give a skeletal support as a white powder. [DCys6] -GnRH (51 mg, 0.015 mmol, 49%) was obtained. . Electrospray MS (M + H) = 3419. (4)Maleimidopropanoyl-β-Ala-K (NHCOCH 2 S to [DCy s 6] -GnRH) GGSGGK (N ε HCOCH 2 S~ [DCys 6] -GnRH) -OH- (maleimidated scaffolding Preparation of [DCys 6] -GnRH) : (A) Cleavage of Fmoc: scaffold support from step 3 [DCys6] -GnRH (11.4 mg, 0.0033 mmol) in anhydrous DMF (4 sieve) (3 ml) ) In 20% piperidine (Aldrich). The solution is stirred at room temperature for 45 minutes. Stir and then concentrate in vacuo. Residue is ~ 15% aqueous CHThreePut in CN, Aliko The sample was removed and subjected to RP-HPLC analysis. By HPLC analysis, about 83: Seventeen ratios of product and starting material were shown (Vydac C18, 4.7 × 250m m, 1.5 ml / min, 10 → 60% CHThreeCN, 20 minutes; Deprotected peptide product Retention time = 11.28 min, retention time of Fmoc protected peptide starting material = 14.72 minutes). Lyophilize the residual material overnight to give a white fluffy solid A deprotected peptide was obtained, which was used directly in the maleimidation step. (B) Deprotection skeleton support [DCys6] -Gimidation of GnRH: Deprotected Pep Tide (0.0033 mmol) Add to anhydrous (4 sieve) degassed DMF (2.5 ml) and DIEA (10 μl) Was. The mixture was stirred at room temperature and MPS (1.8 mg) was added in one portion. 30 minutes later, An aliquot was removed for RP-HPLC analysis. HPLC analysis (Vyda c C18, 4.7 × 250 mm, 1.5 ml / min, 10-60% CHThreeCN, 20 minutes; retention time of deprotected peptide starting material = 11.28 minutes, maleimidated peptide (Retention time of the tide product = 12.13 minutes). It was indicated that a substance had appeared. After a reaction time of T = 45 minutes, TFA (10 μl ) Was added to quench the reaction mixture and concentrated in vacuo. Residue in 10% aqueous CHThree In CN (0.1% TFA), RP-HPLC (DeltaPak C18, R CM 25 × 10, 10 ml / min, 20 → 40% CHThreeNc, 30 minutes) Purified. The fractions containing the desired substance are combined, lyophilized overnight, and Support for imidized skeleton [DCys6] -GnRH (6.9 mg, 0.0021 mmol) 1,62%). Electrospray MS indicates that the product (M + H = 3348). (5)Thio of carrier protein NLys PE38QQR Rule :   Carrier protein (NLys PE38QQR, 1.28 mg / ml, 20 ml , 25.6 mg, 0.66 μmol) in a 50 ml sterile plastic settling tube. And borate buffer salt of pH 11 (832 mg, 41.6 m / ml to add pH 1 1 to obtain a 0.1M solution of borate buffer), cap the mixture and add Shake until all solids dissolved (5 minutes). Add EDTA (100 mg) and DTT (10 mg, 0.065 mmol) to dissolve all solids The solution was shaken again until done. Place the sedimentation tube in NTwoTransfer to a box filled with Was replaced with a rubber membrane (septum). Empty the settling tube for a while,TwoPurge with (This was repeated 5 times). N-acetylhomocysteine thiolactone (1 00mg, 0.629mmol) at once and mix until all solids are dissolved Shake the material, empty the sedimentation tube again,Two(This was repeated 5 times. ). Cap the sedimentation tube and add NTwoAged overnight (20 hours) in a packed box at room temperature . The reaction mixture was transferred to a dialysis bag and (a) NTwo4 L of 0.1 M phosphoric acid under dispersion 19 hours against salt buffer (pH 8.0) (B) NTwo4 L of 0.01 M phosphate buffer containing 100 mg of EDTA under dispersion 8 hours against the buffer (pH 8.0), and (c) NTwo100 mg ED under dispersion Permeate to 4 L of 0.01 M phosphate buffer (pH 8.0) containing TA for 20 hours Was analyzed. About 24 ml of thiolated protein was added to (NTwo50ml bottle (in box) Transferred to a plastic settling tube. Remove a 200 μl aliquot and use Ellman's Analysis (OD412= 0.155, 1.5 ml total volume). It was found that the thiol value of the solution was 0.083 μmol SH per ml of the solution. Was done. (6)Thiolated NLys PE38QQR and maleimidated skeleton support [DCys 6 ] -GnRH binding :   The maleimidated peptide of Step 4 (5.0 mg, 1.49 μmol) was added to water ( 0.1% TFA) and place in a 50 ml sterile plastic sedimentation tube, overnight Lyophilized. The lyophilized peptide was added to the thiolated protein of step 5 ( 0.083 μmol SH per 1 ml protein, 16.9 ml, 1.40 μm ol), and the sedimentation tube was capped and shaken for a while. Paraffin settling tube Seal with Lum, Clay-Adams nutator Placed on top and spun at 4 ° C. overnight (17 hours). The reaction mixture was placed in a dialysis bag (Sp , and (a) 4 L of 0.01 M phosphate buffer at 4 ° C. (B) 4 L of Dulbecco's phosphate buffered saline for 8 hours against the buffer (pH 7.0) (PBS, pH 7.0) for 72 hours, and (c) 4 L of Dulbecco's phosphorus Dialysis was performed for 24 hours against acid buffered saline (PBS, pH 7.0). Visible sediment exists Did not exist. The complex is sterile filtered (50 ml sterile Corning cup fill). , 0.22 μM) to give about 15 ml of product. The composite product is CZE And SDS-PAGE electrophoresis. The concentration of the product is TP4 0 [N-terminal transforming growth factor α and Pseudomonas ethoxy Chimera containing a 40 kDa segment derivative of PEN (PE40 deutacys) 1.1 mg / ml with respect to a known standard solution of protein, NLys PE38 It was proved to be QQR (CZE).                                 Example 4                        Photoinactivation of the composite of Example 3   Phosphate buffered saline (PBS) 9.5 containing 4.16 mg of 8-azidoadenosine ml of the complex of Example 1 (0.5 m l) was added to contain 0.29 mM conjugate and 1.35 mM azidoadenosine. A solution was obtained. The solution was transferred to a Pyrex equipped with a cooling jacket for pumping ice water. Charged into photoreactor. The solution was then pumped to 450 W of H placed 6 inches apart. Irradiated with an anovia lamp for 6 minutes. The solution was then added to 4 L of PBS. For 16 hours. According to TSK 2000 HPSEC, the resulting solution The absence of low molecular weight material was indicated. The ADP ribosylation activity of the substance is The germ germ assay showed only 20% of the original activity.                                 Example 5             [DCys 6 ] -GnRH-KGGSGGK-Photoinactivation              Pseudomonas exotoxin (holotoxin) complex (1)Thiolation of photo-inactivated PE holotoxin:   Borate buffer salt (43 mg [12.7 mmol / ml in a final solution of 12.7 mmol / ml) was added to 1 ml of water. Equal] and 10 mg of EDTA and 2.2 mg of DTT were added to the solution. This thiolated substrate was added to 9.5 ml of the photoinactivated PE toxin solution. N-acetyl Luhomocysteine thiolactone (11.3 mg) was added, and the solution was degassed. Replace with nitrogen and in nitrogen box For 16 hours. The solution was then added to 4 L of PBS at 4 ° C. for 7.5 For 4 hours, dialyzed against 4 L of freshly prepared PBS for 65 hours. Nitrogen throughout the dialysis solution Element was dispersed. When subjected to the Ellman assay, a 65 nmole / ml solution was obtained. Oars showed. (2)Thiolated photoinactivated pseudomonas exotoxins and maleimidated scaffolds [DCys 6 ] -GnRH binding   Maleimidated skeleton support of step 4 of Example 4 [DCys6] -GnRH (1 . 88 mg, 450 nmole) in 100 μl of water. Was added to 4 ml of the thiolated photoinactivated PE holotoxin prepared in the step. After degassing this and aging it for 16 hours, apply it to TSK2000 HPSEC, Significant low molecular weight material is shown to remain. The solution is then brought to 4 ° C. 7 hours against 4L PBS, then 17 hours against freshly prepared 4L PBS. Dialysis was performed for 8 hours. No low-molecular-weight substances remain when subjected to HPSEC assay Is shown. By amino acid analysis, 90 μg of skeleton / ml (containing β-alanine) Amount) and the presence of 517 μg PE toxin / ml Is done.                                 Example 6                  Vaccine preparation and titer screening   In a 20cc glass Luerroque syringe (Popper & Sons) The peptide solution and 0.9% sodium chloride injection USP in the proportions listed below (Baxter, Lot C255075) and incomplete Freund's adjuvant (Sigma, F5506, Lot 062h-8802) Was prepared. Mix the mixture with a 20 gauge double hub homogenization needle (Pop per & Sons) between two 20 cc glass syringes Homogenization was performed until it became hard to flow. *  The numbers in parentheses indicate the concentration of the complex of Example 3.   In addition, 6 ml of the immune complex of Example 3 (0. 117 mg / ml), 1 ml of saline and 7 ml of Alhydrogel 3% (Superfos Biosector a / s, Batch 1983) ) To give a final antigen concentration of 50 μg / ml. Was also prepared (vaccine No. 5).vaccination :   Six groups of 27 10-week castrated boars receiving each of the above vaccine formulations Divided into five groups of five animals and one group of two control animals. I did. A pre-treated blood sample (10 ml) was collected by jugular vein puncture and 2 m One liter of the freshly prepared vaccine was inoculated (1 ml intramuscularly on both sides of the neck). 4 After a week, blood (10 ml) was again collected from all animals and freshly prepared in the animals. The vaccine was re-vaccinated as previously described. After 2 weeks, about 1 hour from all animals Three bleeds were taken at intervals. Centrifuge all the collected blood samples and use the same serum Serum at -20 ° C until bleeding is complete, as can be assayed by titer and LH analysis. Frozen.Analysis of antibody titer :   One packet of BupH adjusted Dulbecco's phosphate buffered saline mix (Pie rce, No. 28374, Lot9205210484) in 400 ml of deionized water 2 g of bovine albumin fraction V (Gibco No. 810-10). 18IL, Lot 76P9623) and 5 ml of a 1% w / v thimerosal solution (Sigma, T-5125, Lot 23H0526) and PBS-BS A was adjusted. After the BSA has dissolved, add deionized water to a final volume of 500 ml. I got it.   2.5 g of activated carbon (Sigma, C-5385, Lot102H0336) The powder was washed several times with deionized water to remove fines, and the dextran-coated A charcoal suspension was prepared. Dulbecco's phosphate buffer with 2 packets of BupH adjusted Salt water mix (Pierce, No. 28374, Lot 920521084) Was dissolved in 1,000 ml of deionized water to prepare PBS. 0.25g of de Kistran, 70,000 mw (Sigma, D1390, Lot 122H0) 349) was dissolved in 500 ml of PBS. Washed activated carbon was added to the solution. 10 ml of a 1% w / v thimerosal solution (S igma, T-5125, Lot 23H0526) and an additional 500 ml of PBS are added and the activated carbon suspension is added at 4 ° C. Stir for 3 days.   All serum samples were thawed. Add 5 μl of serum to 495 μl of PBS-BSA. First, a 100-fold dilution of serum was prepared. Add 100 parts of this to 450 μl of PBS-BSA. A 50-fold dilution was added to prepare a 1000-fold dilution of the serum. In the same way A 10,000-fold and 100,000-fold dilution was prepared. All serum dilutions Aliquots of 50 μl each into two 12 × 75 borosilicate glass tubes (F (2 glass tubes per dilution). 400,0 for each tube 00 cpm / ml125I-labeled GnRH (NEN, NEX-163, Lot C F91640) and 50 μl of PBS-BSA was added. Incubate tube at 4 ° C overnight Cubbed. Then, 100 μl of the dextran-coated activated carbon suspension was added. In addition, the tubes were mixed at room temperature for 15 minutes. The tube was then moved to a Sorval RC-3B tube. Placed in the heart and spun at 2,500 rpm in a H6000 A rotor. 100 An aliquot of the supernatant was collected and packed with Packard AutoGamma 800. Radioactivity was measured with a gamma counter. The results are expressed as (50 μl125I label Gn Add the RH solution to 150 μl PBS-BSA, centrifuge and count 100 μl (Measured) as expressed as the total input radioactivity binding (%).   The antibody titer results were as follows:   The values are based on binding to 1/1000 diluted serum, excluding the neat serum pretreatment solution. Input125Expressed as the average percentage of I-labeled peptide. LH measurement of serum   Serum samples were analyzed by Geor for LH determination of serum by radioimmunoassay. At the USDA lab in Athenes, GA under the supervision of Dr. Ge Rampasek submitted. The assay recognizes porcine LH125I-labeled pig LH and anti-bovine L Standard radioimmunoassay using H antiserum. The assay is based on R.C. Kra eling et al. Anim. Sci. (1982) 54: 1212. The following result Is the average value of each group. Week 6 averages 3 pooled bleeds It is. The results are expressed in LH / ml (ng). 0.15 ng LH / m 1 serum is the lower limit of detection in the assay, and therefore all the levels below the detection level The value was assigned a value of 0.15 ng / ml.                                 Example 8                        Vaccine composition containing STP 1. STP (5% squalane in phosphate buffered saline [PBS]: 0.2% Tween   Preparation of 80: 2.5% Pluronic 121):   Squalane (500 mg), Pluronic 121 [250 mg; Tylene oxide and polypropylene Oxide block copolymer (BASF Corp.)] and Tween 80 (20 mg) into a 15 ml dounce tissue homogenizer tube You. This was then coated with 9.25 ml of PBS (pH 7.4) and the resulting mixture The mixture is homogenized in about 10 strokes. The solution is then transferred to a vial, Add a small magnetic stir bar. Take about 3 ml from this mixture and add Avestin Emu Transfer and place the Emulsiflex outlet tube below the surface of the residual liquid in the vial. Arrange so that it sinks. Cool the vial in an ice bath and add 2 to the Emulsiflex Stir the liquid magnetically with 0 passes. In this way, 9.5 ml of STP are obtained. 2. Formulation of the composite of Example 3 in STP   130 μl of solution of the complex of Example 3 (1 μg / μl of total immunogen = 130 μ total) g) was added to 6.4 ml of the above STP emulsion under magnetic stirring and the resulting mixture The thing of STP Pass 10 times. As a result, the complex mixed with STP at a concentration of 20 μg / ml was prepared. Obtain 6 ml. Equal amounts of the complex (in PBS) were added to the dounce homogenizer from step 1. Iser Quaran: Tween 80: Pluronic 121 mixture plus 4 ingredients The same product can be obtained by passing the mixture four times through a particle fluidizer. Wear. 3. Complex of Example 3 in STP and Dehydroepiandrosterone (DHEA) Formula of:   Under magnetic stirring, 130 μl of the conjugate solution of Example 1 (1 μg / μl of total immunogen) = 130 μg in total) to 6.2 ml of the STP emulsion prepared in step 1. I can. Prepare a solution of DHEA (10 μg / μl) in ethanol and Add 195 μl (1.95 mg) to the stirred complex solution in STP. Then, Is passed through the Emulsiflex apparatus 10 times and the mixture in STP containing DHEA Obtain about 6 ml of the complex.   According to the general procedure of steps 2 and 3, [D in STP and STP + DHEA Lys6] -GnRH-NLysPE38QQR vaccine was obtained.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 51/00 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ (72)発明者 モーン，ケネス・エル アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126──────────────────────────────────────────────────の Continued on front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI // A61K 51/00 A61K 49/02 C (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KG, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, K, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Morne, Kenneth El United States of America, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 動物中で抗ＧｎＲＨ抗体を誘発させる方法であって、該動物に、シュード モナスエクソトキシン又はその変異体に結合したＧｎＲＨを含む免疫原性担体系 を抗ＧｎＲＨ抗体の誘発に有効な量投与することを含む方法。 ２． 動物を断種する方法であって、該動物にシュードモナスエクソトキシン又 はその変異体に結合したＧｎＲＨを含む免疫原性担体系を断種に有効な量投与す ることを含む方法。 ３． 前記免疫原性担体系がＧｎＲＨ−シュードモナス複合体を含む、請求項１ に記載の方法。 ４． 前記免疫原性担体系がＧｎＲＨ−シュードモナス複合体を含む、請求項２ に記載の方法。 ５． 抗ＧｎＲＨ抗体の誘発に有効な量の、シュードモナスエクソトキシン又は その変異体に結合したＧｎＲＨを含む免疫原性担体系と、該免疫原性担体系の免 疫原性を高め得るビヒクルとを含むワクチン組成物。 ６． 動物に請求項５に記載のワクチン組成物を投与することを含む、動物を断 種する方法。[Claims] 1. A method for eliciting an anti-GnRH antibody in an animal, the method comprising: Immunogenic carrier system comprising GnRH bound to Monas exotoxin or a variant thereof Is administered in an amount effective to induce anti-GnRH antibodies. 2. A method of sterilizing an animal, comprising providing the animal with a Pseudomonas exotoxin or Administers an immunogenic carrier system containing GnRH bound to the mutant in an amount effective for sterilization. A method that includes: 3. 2. The immunogenic carrier system comprises a GnRH-Pseudomonas complex. The method described in. 4. 3. The immunogenic carrier system comprises a GnRH-Pseudomonas complex. The method described in. 5. An amount of Pseudomonas exotoxin or an amount effective to induce anti-GnRH antibodies. An immunogenic carrier system comprising GnRH bound to the variant; A vehicle composition that can enhance epidemicity. 6. Treating an animal comprising administering the vaccine composition of claim 5 to the animal. How to seed.
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