JPH11510056A - 根皮層に特異的な遺伝子プロモーター - Google Patents
根皮層に特異的な遺伝子プロモーターInfo
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- JPH11510056A JPH11510056A JP9507703A JP50770397A JPH11510056A JP H11510056 A JPH11510056 A JP H11510056A JP 9507703 A JP9507703 A JP 9507703A JP 50770397 A JP50770397 A JP 50770397A JP H11510056 A JPH11510056 A JP H11510056A
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Abstract
(57)【要約】
植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的な転写に関与するＤＮＡプロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ分子。ＤＮＡ構成物は、５'から３'の方向に、本発明のプロモーターと、該プロモーターから下流に位置し、かつ前記プロモーターと機能的に関連した異種ＤＮＡセグメントとを含む。タバコ植物など形質転換植物は、上述の発現カセットを含む異種ＤＮＡ構成物を含有する形質転換植物細胞を含む。
Description
【発明の詳細な説明】
根皮層に特異的な遺伝子プロモーター
本発明は、Ｎational Ｓcience Ｆoudationから助成金第ＭＣＢ-9206506を受け
、政府援助を得て行われた。政府は本発明に対してある一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、組織特異的な遺伝子プロモーターに関し、特に植物の根皮層で活性
のあるプロモーターに関する。
発明の背景
プロモーターは転写される遺伝子に隣接するＤＮＡ配列であり、その隣接した
遺伝子をメッセンジャーＲＮＡに転写する場合、このプロモーターにＲＮＡポリ
メラーゼが結合しなければならない。プロモーターは、異なる方式でプロモータ
ーと機能的に関連した構造遺伝子に影響を及ぼす多数の異なる調節要素から成る
と考えられる。たとえば、調節遺伝子は、関連した構造遺伝子の発現を増強また
は抑制したり、その遺伝子を発生的な調節下に置いたり、あるいはその遺伝子の
組織特異的な調節に寄与したりすることが可能である。組換えＤＮＡ手順を使用
して、プロモーターに修飾を加えると、任意の遺伝子発現パターンが可能になる
。たとえば、Ｏld and Ｐrimrose,Ｐrinciples of Ｇene Ｍanipulation(第４版
、1989年)を参照されたい。
植物プロモーターの１例は、ペチュニアのリブロース-1,5-ビスホスフェート
カルボキシラーゼの小サブユニットの遺伝子に隣接することが確認されたプロモ
ーターである。米国特許第４，９６２，０２８号を参照されたい。もう１つの例
は、小麦Ｅm遺伝子の５'側の隣接した領域を含むプロモーターである。ＥＰＯ出
願第３３５５２８号を参照されたい。また別の例は、ＥＰＯ出願第0 330 479号
に開示さ
れているストレス誘導性調節要素である。
植物の発育に重要な役割を果たしているにも拘わらず、根における遺伝子発現
の調節に関する研究は比較的少ない。この研究の不足は、ある程度は、遺伝子を
容易にクローニングして研究することが可能な、直ちに同定できる根特異的な生
化学的機能が少ないことに起因する。Ｅvans et al.,Ｍol.Ｇen.Ｇenet.214,153
-157(1988)は、エンドウ由来の根に特異的なcＤＮＡクローンの単離を試みたが
不成功に終わり、根に特異的なmＲＮＡ類（存在する場合）は、非常に低レベル
の存在量で根mＲＮＡ群に存在するにすぎないと結論づけた。Ｆuller et al.,Ｐr
oc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 80,2594〜2598（1983）は、多数の根粒に特異的な
遺伝子をクローニングして特性付けを行った。転写開始のＤＮＡ配列５'を比較
すると、試験した３種の遺伝子に存在する反復オクタヌクレオチドが明白である
。不運なことに、ほとんどのマメ科植物(Ｌeguminaceae)では、効率のよい形質
転換／再生システムがなかったため、このようなシス作用性配列の機能的分析が
妨げられた。Ｂogusz et al.,Ｎature 331,178-180(1988)は、非根粒形成植物の
根に特異的に発現されるヘモグロビン遺伝子を、密接に関連した根粒形成種のヘ
モグロビン遺伝子との相同性によって単離した。Ｋeller and Ｌamb,Ｇenes ＆
Ｄev.3,1939-1646(1989)は、側根開始中に発現される細胞壁ヒドロキシプロリン
に富む糖タンパク質をコードしている遺伝子を単離した。最近、Ｌerner and Ｒa
ikhel,Ｐlant Ｐhysiol.91,124-129(1989)は、オオムギ根に特異的なレクチンの
クローニングおよび特徴について報告した。
多くの植物病原体および害虫は植物根を損傷し、作物の重大な損害および損失
を引き起こす。損傷を受けることが最も多い根組織は、表皮の下にあって根の中
心柱を囲む貯蔵柔組織で主に構成される層である、根皮層である。根皮層はさら
に厚膜組織、分泌細胞、樹脂道および他の構造や細胞タイプを含む。根皮層の細
胞は空気中で生長する苗条の皮層細胞と形態学的類似および発生的類似を示す。
遺伝子工学技術を使用した外来遺伝子の発現によって有用な特性を植物に与え
るためには、新しい特性が適当な植物組織で選択的に発現される様々な組織に特
異的なプロモーターが必要である。本発明は、この問題と関連した我々の連続的
研究に基づくものである。
発明の概要
本発明は、関連した遺伝子の根皮層に特異的に発現に関与するタバコＲＤ2（
ＴobＲＤ2）プロモーターの同定に基づくものである。本発明の第１の態様は、
植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的な転写
に関与する単離されたＤＮＡ分子であって、（ａ）本願明細書に記載の配列番号
１〜９と、（ｂ）厳密な条件下で配列番号１〜９のいずれかにハイブリダイゼー
ションし、植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特
異的な転写に関与するＤＮＡ配列とから成る群から選択された配列を有する単離
されたＤＮＡ分子である。
本発明のさらなる態様は、Ｔobacco ＲＤ2プロモーターと、このプロモーター
から下流に位置し、かつこのプロモーターと機能的に関連した異種ＤＮＡセグメ
ントとを含む発現カセットである。
本発明のさらなる態様は、根皮層に特異的なプロモーターおよび異種ＤＮＡセ
グメント、本願明細書に記載の配列番号１〜９から選択された根皮層に特異的な
プロモーターの配列、厳密な条件下で配列番号１〜９のいずれかにハイブリダイ
ゼーションし、植物細胞において根皮層に特異的な転写に関与するＤＮＡ配列を
含む発現カセットである。
本発明のさらなる態様は、上述の発現カセットを含有する植物細胞、このよう
な植物細胞から形質転換植物を作成する方法、およびこのような形質転換植物細
胞を含む形質転換植物である。
図面の簡単な説明
図１Ａは、７日齢苗のタバコ根の横断面図におけるＴobacco ＲＤ2 転写産物
のin situにおける局在性を示す図である。
図１Ｂは、７日齢苗のタバコ根の縦断面図におけるＴobacco ＲＤ2 転写産物
のin situにおける局在性を示す図である。
図２は、ＴobＲＤ2の５'領域の２０１０塩基対配列（配列番号１）を示す図で
ある。
図３は、ＲＤ2プロモーターが根皮層に特異的な遺伝子発現に関与する能力の
試験に使用されたＴobＲＤ2プロモーター／グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）構造物
を示す略図である。
図４は、表１に示したキメラレポーター遺伝子構造物で形質転換された植物の
根（無地の棒）、葉（斑点をつけた棒）および茎（点線入り棒）のβ−グルクロ
ニダーゼ（ＧＵＳ）活性を要約した棒グラフである。グラフは、異なるプロモー
ター（ＣaＭＶ35Ｓ、Δ２．００、Δ１．５０、Δ１．４０、Δ１．２５、Δ０
．８０、Δ０．７０、Δ０．６０、Δ０．３０）を使用し、ベクターpＢＩ101.3
のみを対照実験として使用した遺伝子構造物で形質転換された植物の活性を示す
。ＧＵＳ活性は、pmolＭＵ／μgタンパク質／分で測定した。
図５Ａは、表１に示したように、異なるプロモーター（ＣaＭＶ35Ｓ、Δ２．
００、Δ１．５０、Δ１．４０、Δ１．２５、Δ０．８０、Δ０．７０、Δ０．
６０、Δ０．３０）を使用し、ベクターpＢＩ101.3のみを対照実験として使用し
て、キメラレポーター遺伝子構造物で形質転換されたタバコ植物の根と葉の相対
β−グルクロジナーゼ(ＧＵＳ)活性を要約した棒グラフである。ＧＵＳ活性は、
pmolＭＵ／μgタンパク質／分で測定し、表示した活性は根活性／葉活性である
。
図５Ｂは、表１に示したように、異なるプロモーター（ＣaＭＶ35Ｓ、Δ２．
００、Δ１．５０、Δ１．４０、Δ１．２５、Δ０．８０、Δ０．７０、Δ０．
６０、Δ０．３０）を使用し、ベクターpＢＩ101.3のみを対照実験として使用し
て、
キメラレポーター遺伝子構造物で形質転換された植物の根と茎の相対β−グルク
ロジナーゼ（ＧＵＳ）活性を要約した棒グラフである。ＧＵＳ活性は、pmolＭＵ
／μgタンパク質／分で測定し、表示した活性は根活性／茎活性である。
図６Ａは、Δ２．０プロモーターで推進されたレポーター遺伝子（ＧＵＳ）で
形質転換されたタバコ植物の根の横断面図におけるＧＵＳ活性の組織化学的局在
性を示す顕微鏡写真である。
図６Ｂは、Δ２．０プロモーターにより促進されたレポーター遺伝子（ＧＵＳ
）で形質転換されたタバコ植物の根端におけるＧＵＳ活性の組織化学的局在性を
示す顕微鏡写真である。
発明の詳細な説明
本願明細書では、ヌクレオチド配列を、１本鎖のみによって、５'から３'の方
向を、左から右に示す。本願明細書では、ヌクレオチド配列を、ＩＵＰＡＣ-Ｉ
ＵＢＢiochemical Ｎomenclature Ｃommisionが推奨する方式で示す。
特定の害虫や病原体を抑制または殺傷するペプチドを発現する形質転換植物は
、作物の損害や損失を減らす方法を提供する。たとえば、形質転換トウモロコシ
におけるバチルス・スリンギエンシス(Ｂacillus thuringiensis)タンパク質の
発現は、アワノメイガ（Ｅuropean corn bore）に対する抵抗性を提供する。し
かし、植物の全組識における導入遺伝子発現（構成的発現）は、非標的生物を形
質転換タンパク質に曝す可能性があり、さらに、形質転換タンパク質に対して抵
抗性の病原体や害虫が発生する選択的困難が増加する可能性があるため、不都合
である。植物全体に高レベルの導入遺伝子が発現することは、植物の成長および
収量に負の影響を及ぼす可能性もがある。代替戦法は、特定の害虫または病原体
に冒される器官または組織のみに有毒ペプチドを発現させることである。植物の
根を攻撃する害虫および病原体に対するこの戦法は、特徴的な根に特異的なプロ
モーターがないため、実行することができなかった。
遺伝子の転写は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素と遺伝子プロモーターの間に安定な
複合体が形成されたときに開始する。すべての転写ユニットの開始時に発生する
プロモーターは一般に長さ約１００塩基対であり、転写開始部位からすぐ上流に
位置する。たとえば、Ｍaniatis et al.,Ｓcience 236:1238(1987)を参照された
い。プロモーターは、その「強さ」、すなわち、転写を正確かつ効率よく開始す
る能力が異なる。ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素は、転写領域のすぐ上流の約５０
塩基に及ぶと考えられる。場合によっては、転写されるＤＮＡからすぐ上流にあ
るプロモーターの領域の直前に結合する補助タンパク質によって転写開始の強度
が増強されることがある。たとえば、Ｓinger ＆ Ｂerg,Ｇenes and Ｇenomes,1
40-145,Ｕniversity Ｓcience Ｂook,Ｍill Ｖalley,ＣＡ(1991)を参照されたい
。
本発明の根皮層に特異的なプロモーターの具体的な例は、配列番号１〜９に表
示されているいずれか１つに相当する配列を有するＤＮＡ分子であり、そのすべ
てを以下でさらに詳細に検討する。外来配列より長くても短くても、些少の付加
、欠失または置換が行われても、ＴobＲＤ2根皮層に特異的なプロモーターを担
持するＴobacco ＲＤ2の５'に隣接した領域の他の配列フラグメントを作製する
ことができ、そのすべてが本発明に含まれることが明白になるであろう。本発明
のさらなる態様は、他のタバコ遺伝子、あるいは下記のタバコ以外の植物から単
離されたプロモーターを含み、これは、タバコＲＤ2プロモーターと相同であり
、かつ植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的
な転写に関与することができる。
本願明細書で使用されるＴobＲＤ2プロモーターは、タバコＲＤ２遺伝子の５'
から転写領域にあるＤＮＡの連続セグメントと同じか、実質的に相同の配列を有
するＤＮＡ分子を指す。本願明細書に示す配列番号１は、ＴobＲＤ2遺伝子の５'
の隣から転写の開始までに存在する２kb領域の配列を提供する。ＴobＲＤ2プロ
モーターは、５'からＴobＲＤ2領域まで、少なくとも１００塩基対の領域、１５
０塩基対
の領域、あるいは好ましくは２００塩基対の領域を含み、根皮層に特異的な発現
に関与する。本願明細書で使用される、「実質的に相同な」領域は、少なくとも
７５％、さらに好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％までも相同であ
る。
本願明細書で使用されるように、根皮層に特異的なプロモーターは、葉組織ま
たは茎組織での発現に比して、根皮層組織において機能的に関連した遺伝子の発
現に優先的に関与するプロモーターである。
他の植物の根皮層に特異的なプロモーター配列は、転写されるＤＮＡ領域のす
ぐ上流のＴobaco ＲＤ2プロモーターの約１００塩基対のセグメントと少なくと
も約７５％相同（さらに好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％までも
相同である）であり、かつ植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメン
トの根皮層に特異的な転写に関与することができる配列を含む。他の植物の根皮
層に特異的なプロモーターは、配列番号１〜９によって、本願明細書に記載のＴ
obＲＤ2プロモーターの連続部分に少なくとも７５％相同（さらに好ましくは８
０％、８５％、９０％または９５％までも相同である）であり、植物細胞におい
て下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的な転写に関与すること
ができる配列を含む。
相同なＤＮＡ配列が本願明細書に記載されているようなＤＮＡ配列のいずれか
にハイブリダイゼーションすることが可能な非常に厳密なハイブリダイゼーショ
ン条件は、当業者に周知である。たとえば、本願明細書に開示されているＤＮＡ
へのこのような配列のハイブリダイゼーションは、２５％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＣ、５×デンハルド溶液中で、１００μｇの１本鎖ＤＮＡおよび４２℃の５％
硫酸デキストランを用いて、２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、４２℃の０．１
％ＳＤＳ、４２℃、１５分間の洗浄条件で実施することができ、約６０％相同の
配列のハイブリダイゼーションが可能である。さらに厳密な条件は、標準in sit
uハ
イブリダイゼーションアッセイを使用する６０℃または７０℃、０．３ＭのＮa
Ｃl、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳの厳密な洗浄条件で
表される。(Ｓambrook et al.,Ｍolecular Ｃloning,Ａ Ｌaboratory Ｍanual(
第２版、1989)（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory）を参照されたい)。一般
に、根皮層に特異的なプロモーターをコードし、本願明細書に開示されているタ
バコＲＤ2根皮層に特異的なプロモーターをコードしているＤＮＡ配列のいずれ
かにハイブリダイゼーションする植物ＤＮＡ配列は、本願明細書に開示されてい
るタバコＲＤ2根皮層に特異的なプロモーターをコードしているＤＮＡ配列と少
なくとも７５％、８０％、８５％、９０％あるいは９５％以上相同である。
本発明の根皮層に特異的なプロモーターは、形質転換植物での導入遺伝子の組
織特異的な発現に関与するのに有用である。このような組織特異的な発現は、植
物の根を攻撃する害虫や病原体によって生じる損害に対する抵抗性を提供するの
に有用である。さらに、根皮層は光合成産物貯蔵用シンク器官であるため、貯蔵
された炭水化物を変化させるように設計された導入遺伝子の発現は、このような
プロモーターによって調節され得る。根皮層に特異的な発現に関して特に関心の
ある外来遺伝子としては、重金属を結合するタンパク質（メタロチオネインなど
）、土壌害虫や病原体に対する抵抗性を与えるタンパク質、熱、塩（塩分）およ
び渇水に対する抵抗性を与えるタンパク質、脱塩用タンパク質、および植物貯蔵
化合物を別の好ましい生成物または形に代謝するタンパク質をコードするものな
どがある。
組織に特異的なプロモーターを使用して、選択された組織部位で殺虫剤前駆体
を活性型に変換することも可能である。Ｈsu et al.Ｐestic.Ｓci.,44,9(1995)
は、根で優先的に殺虫剤前駆体を活性型に変換するための、根に特異的なプロモ
ーターＴobＲＢ7およびβグルクロニダーゼ酵素遺伝子を含むキメラ遺伝子の使
用について報告している。不活性な殺虫剤前駆体（ヒドロキシメチロキサミルの
グルク
ロニド）を葉群に塗付すると植物篩部を通って根に輸送され、そこでグルクロニ
ダーゼによって活性な殺線虫型に変換された。
さらに、根に特異的なプロモーターは、組織学的目的のため、βグルクロニダ
ーゼなどのレポーター遺伝子を使用した根−皮層組織の同定または染色に有用で
ある。
本願明細書で使用される用語「機能的に関連した」は、そのの機能が他によっ
て影響を受けるように関連したＤＮＡ分子１個内に含まれるＤＮＡ配列を指す。
それ故、プロモーターがその遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる（すなわ
ち、遺伝子がプロモーターの転写調節下にある）とき、プロモーターはその遺伝
子と機能的に関連している。このプロモーターは、遺伝子から「上流に位置する
」といわれ、同様に、遺伝子はプロモーターから「下流に位置する」といわれる
。
本発明のＤＮＡ構成物、あるいは「発現カセット」は、転写の方向に５'〜３'
、本発明のプロモーター、プロモーターと機能的に関連した異種ＤＮＡセグメン
ト、および、選択により、終止シグナルやポリアデニル化領域など転写終止領域
および翻訳終止領域を含む。これらの調節領域はすべて、形質転換細胞で機能す
ることが可能でなければならない。３'終止領域は、転写開始領域と同じ遺伝子
または異なる遺伝子から誘導することが可能である。
植物は、葉緑素がないもの（真菌類など）と葉緑素を含有するもの（緑藻、蘇
類など）に分けることができ、さらに葉緑素を含有し、かつ維管束組織を有する
もの（羊歯、裸子植物、針葉樹、単子葉植物および双子葉植物など）に分けるこ
とができる。後者の植物群には、根、茎および葉が存在する植物が含まれる。本
願明細書で使用される用語「植物」は、上述の生物体すべてを含む。本願明細書
で使用される用語「天然植物ＤＮＡ」は、非遺伝学的に変化させた植物、あるい
は形質転換させていない植物（たとえば、選択的育種によって産生される植物変
種）から単離されたＤＮＡを意味する。
本願明細書で使用される用語である異種遺伝子または異種ＤＮＡセグメントは
、遺伝子工学技術で細胞を形質転換するのに使用され、細胞に自然発生しないと
考えられる遺伝子（またはＤＮＡセグメント）を意味する。構造遺伝子はタンパ
ク質、ポリペプチド、またはその一部をコードするＤＮＡセグメントを含む遺伝
子の一部であり、リボソーム結合部位および／または翻訳開始コドンを含むが、
プロモーターは欠如していると考えられる。この用語は、本来細胞内に認められ
るが、人工的に導入される構造遺伝子のコピーも指す。構造遺伝子は、遺伝子が
導入される植物細胞か、あるいは機能的に関連したプロモーターと組み合せられ
ている植物細胞で通常認められないタンパク質をコードしていてもよい。植物種
での発現のために本発明のプロモーターと機能的に関連しうる遺伝子は、染色体
遺伝子、cＤＮＡ、合成遺伝子、あるいはそれらの組合せから誘導することが可
能である。本願明細書で使用される用語である異種ＤＮＡセグメントは、リボザ
イムやアンチセンスＲＮＡなど、非タンパク質産物をコードするＤＮＡセグメン
トも含む。アンチセンスＲＮＡは周知である（たとえば、米国特許第４，８０１
，５４０号（Ｃalgene,Ｉnc.）を参照されたい）。
本発明と共に植物で使用される目的の遺伝子には、広く様々な表現型特性およ
び非表現型特性に影響を及ぼすものが含まれる。有数の表現型特性は、脱水（熱
、塩分または渇水に起因する）、除草剤、有毒金属、微量元素、害虫および病原
体によって生じるストレスを含め、様々な環境ストレスに対する抵抗性を提供す
る酵素などのタンパク質であるが、環境ストレスはこの限りではない。抵抗性は
標的部位の変化、宿主細胞の標的タンパク質の量の増大、宿主をストレスから保
護する生成物の生合成経路と関係のある１種以上の酵素量の増加等々に起因する
と考えられる。構造遺伝子は、原核生物、真核生物、細菌、真菌から、（たとえ
ば、酵母、ウイルス、植物、および哺乳類から）獲得することが可能であり、あ
るいは全体または一部を合成することが可能である。例示的遺伝子としては、グ
リホ
スフェート抵抗性3-エノールピルビルホスホシキネートシンターゼ遺伝子、ニト
リラーゼ、プロリンおよびグルタミン生合成経路の遺伝子およびメタロチオネイ
ン類などがある。
本発明のプロモーターと機能的に関連した構造遺伝子は、昆虫に有毒なＢacil
lus thuringiensis結晶タンパク質など、昆虫に対して有毒なタンパク質をコー
ドするものであってもよい。米国特許第４，８５３，３３１号には、鞘翅類に対
して有毒なＢ.thuringiensis毒素をコードしているＤＮＡ配列、およびコードし
た毒性を保持しているこの配列の変形物が開示されている（米国特許第４，９１
８，００６号および第４，９１０，１３６号も参照されたい）(本願明細書に引
用されるすべての米国特許参考文献の開示内容は、参照することにより本願明細
書に完全に組込まれる)。ＰＣＴ出願第ＷＯ 90/02804号には、鱗翅目(Ｌepidopt
era)に対して有毒な植物種を与えるＢ.thuringiensis由来の遺伝子配列が開示さ
れている。ＰＣＴ出願第ＷＯ 89/04868号には、Ｂ.thuringiensis結晶タンパク
質の発現を促進するベクターでトランスジェニック植物が開示されており、その
配列は本発明と関連させて使用することが可能である。ＰＣＴ出願第ＷＯ 90/06
999号には、鱗翅目（Ｌepidoptera）に対して活性なＢ.thuringiensis結晶タン
パク質性毒素をコードしているＤＮＡが開示されている。米国特許第４，９１８
，００６号には、殺虫性結晶タンパク質をコードしている別の遺伝子配列が開示
されている。他の昆虫に対する毒素をコードしている遺伝子配列の具体例は、米
国特許第４，９４０，８４０号やＰＣＴ出願第ＷＯ 90/07001号に開示されてい
る、キチナーゼ（たとえば、ＥＣ-3.2.1.14）をコードする遺伝子配列である。
米国特許出願第08/007,998号には、根線虫類に対して抵抗性のトランスジェニッ
ク植物を作成するのに有用な線虫類誘導性孔形成性タンパク質をコードする遺伝
子が開示されている。米国特許第４，９４８，７３４号および第５，０９３，１
２０号（Ｅdwards et al.）には、線虫類に対して活性なポリペプチド毒素を産
生するＢ.thuringiensisの菌株
が開示されている。
遺伝子発現産物が細胞質以外の細胞区画に存在する場合、特定のアミノ酸配列
をコードする領域を含むように構造遺伝子を構成することが可能であり、その結
果、その産物を細胞原形質膜などの特定の部位に移動させたり、細胞周辺腔また
は細胞の外部環境に分泌したりすることになる。文献には、ペプチド発現産物を
特定の部位に振り向けるための様々な分泌リーダー、膜貫通配列、および移動配
列が記載されている。たとえば、Ｃashmore et al.,Ｂiotechnology（1985）3:8
03-808、Ｗickner and Ｌodish,Ｓcience(1985)230:400-407を参照されたい。
少なくとも１種の複製システムも有するＤＮＡ構成物で、発現カセットを提供
することが可能である。便宜上、ＣolＥ1、pＳＣ101、pＡＣＹＣ184等々、大腸
菌(Ｅscherichia coli)で機能しうる複製システムを有することが一般的である
。この方式では、各操作後の各段階で、結果として得られる構成物をクローニン
グし、配列決定し、操作の正さを決定することが可能である。さらに、あるいは
大腸菌複製システムの代わりに、Ｐ-1不和合性プラスミドの複製システム、たと
えば、pＲＫ290などの複製システムのような、広宿主範囲複製システムを使用す
ることが可能である。複製システムのほかにも、１種以上の宿主に有用な少なく
とも１種のマーカーが存在する、すなわち、個々の宿主に異なるマーカーが存在
する。すなわち、原核生物宿主では選択に１つのマーカーを使用し、真核細胞宿
主、特に植物宿主では選択に別のマーカーを使用する。マーカーは、抗生物質な
どの殺生物剤、毒素、重金属等々に対する保護を提供し、栄養要求性宿主に原栄
養性を与えることによって相補性を提供したり、植物において新規化合物を産生
することにより、目でみることができる表現型を提供したりすることが可能であ
る。使用することが可能な遺伝子の具体例としては、ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ（ＮＰＴII）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰ
Ｔ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ニトリラ
ーゼ、および
ゲンタマイシン耐性遺伝子などがある。植物宿主選択に関しては、適当なマーカ
ーの非限定的例はβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（インジゴ生成物を提供する）
、ルシフェラーゼ（目に見える光生成物を提供する）、ＮＰＴII（カナマイシン
抵抗性またはＧ418抵抗性を提供する）、ＨＰＴ（ハイグロマイシン抵抗性を提
供する）、および突然変異aroＡ遺伝子（グルホセート抵抗性を提供する）であ
る。
適当な複製システムを制限酵素で切断すること、および特定の構成物またはフ
ラグメントを適当な部位に挿入することによって、様々な構成物、発現カセット
、マーカー等々を含む様々なフラグメントを連続的に利用部位に導入することが
可能である。連結反応およびクローニングの後、さらに操作するために、ＤＮＡ
構成物を単離することが可能である。これらの技術はすべて、文献に十分に例示
されている。たとえば、Ｍaniatis et al.,Ｍolecular Ｃloning: Ａ Ｌaborator y Ｍanual
,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎ.Ｙ.
(1982)を参照されたい。
ベクターは複製可能なＤＮＡ構成物である。本発明のＤＮＡ構成物で植物組織
を形質転換するのに使用することが可能なベクターとしては、アグロバクテリウ
ムベクターと発射注入用(ballistic)ベクターの両者、ならびにＤＮＡを介在し
た形質転換に適するベクターがある。ＤＮＡ構成物がＴiプラスミドを含むこと
を特徴とする本発明のＤＮＡ構成物を含有するアグロバクテリウム・チュメファ
シエンス(Ａgrobacterium tumefaciens)細胞は、形質転換植物を作成する方法に
有用である。植物細胞をＡgrobacterium tumefaciens に感染させると、形質転
換した植物細胞が作成されるので、この形質転換植物細胞から植物を再生させる
。
本発明の実行に有用な多数のアグロバクテリウムベクターが知られている。た
とえば、米国特許第４，４５９，３５５号には、双子葉植物を含め、影響を受け
易い植物を形質転換する方法が開示されており、アグロバクテリウム株はＴiプ
ラスミドを含有する。米国特許第４，７９５，８５５号には、アグロバクテリウ
ム
ベクターによる木本植物の形質転換が開示されている。さらに、Ｓchilperoort e
t al.に付与された米国特許第４，９４０，８３８号には、本発明の実行に有用
なバイナリーアグロバクテリウムベクター（すなわち、そのアグロバクテリウム
は、１つはＴiプラスミドのvir領域を有するがＴ−ＤＮＡ領域を有さない第一の
プラスミドと、Ｔ−ＤＮＡ領域を有するが、vir領域を含まない第二のプラスミ
ドを含むベクター）が開示されている。
植物細胞の発射注入による形質転換(ballistic transformation)に適する、本
発明のＤＮＡ構成物を担持する微粒子は、本発明の形質転換植物の作成にも有用
である。微粒子を植物細胞内に発射して形質転換細胞を作成し、この形質転換植
物細胞から植物を再生させた。適当な発射注入による細胞形質転換方法論および
その装置を本発明の実行に使用することができる。Ｓanford and Ｗolf、米国特
許第４，９４５，０５０号および「花粉が介在する植物形質転換(Ｐollen-media
ted Ｐlant Ｔransformation)」と題するＡgracetus欧州特許出願公告第0 270 3
56号には、例示的装置および手順が開示されている。発射注入による形質転換手
順を使用するとき、形質転換の対象である細胞で複製することができるプラスミ
ドに発現カセットを組込むことが可能である。このようなシステムで使用するの
に適した微粒子の例としては、１〜５μmの金球体などがある。沈殿など、任意
の適当な技術によってＤＮＡ構成物を微粒子に沈積させることが可能である。
形質転換宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を使用して、本願明細書に開示されて
いるＤＮＡ配列を含有する構成物で形質転換またはトランスフェクトされた細胞
である。当該技術で周知の手順による植物細胞プロトプラストのＤＮＡ介在形質
転換および後続のプロトプラストからの植物再生によって、本発明のＤＮＡ構成
物で植物等を形質転換することが可能である。
本願明細書に開示されているプロモーター配列を使用して、同プロモーターを
利用することができる任意の植物種（すなわち、そのＲＮＡポリメラーゼが本願
明細書に開示されているプロモーター配列に結合する任意の植物種）に異種ＤＮ
Ａ配列を発現することが可能である。単子葉植物も双子葉植物も本発明のＤＮＡ
構成物を用いた形質転換に適した植物種の例に含まれ、タバコ、大豆、ジャガイ
モ、綿、砂糖大根、ヒマワリ、ニンジン、セロリ、アマ、キャベツおよび他のア
ブラナ科植物、コショウ、トマト、カンキツ類の木、インゲンマメ、イチゴ、レ
タス、トウモロコシ、アルファルファ、カラスムギ、コムギ、コメ、オオムギ、
モロコシ属およびカノーラなどがあるが、この限りではない。それ故、本発明の
ＤＮＡ構成物で形質転換することが可能な植物の例証的カテゴリーは双子葉植物
であり、本発明のＤＮＡ構成物を使用して形質転換することが可能な植物のさら
に具体的なカテゴリーは、ナス科植物である。
器官形成であれ胚発生であれ、その後のクローン増殖が可能な任意の植物組織
を本発明のベクターで形質転換することが可能である。本願明細書で使用される
用語「器官形成」は、分裂組織中心から苗条および根が発生する過程を意味し、
本願明細書で使用される「胚発生」は、体細胞または生殖体から、（逐次ではな
く）一斉様式で苗条と根が一緒に発生する過程を意味する。選択された特定の組
織は、形質転換される特定の種に利用できるクローン増殖システム、あるいは形
質転換される特定の種に最も適したクローン増殖システムによって異なる。例示
的組織標的としては、葉ディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組
織、存在する分裂組織（たとえば、先端分裂組織、腋芽、および根分裂組織）、
および誘導された分裂組織（たとえば、子葉分裂組織や胚軸分裂組織）などがあ
る。
以下の実施例は本発明の様々な具体的な実施態様を例示するために示すもので
あって、本発明を限定するものと解釈してはならない。
例１
ゲノム根皮層に特異的なＲＤ2遺伝子の単離
タバコ苗から単離されるＤＮＡのタバコ（Ｎicotiana tabacum）ゲノムライブ
ラリーを、ＥＭＢＬ 3 ＳＰ6/Ｔ7 ラムダベクター（ＣlonＴech,Ｐalo Ａlto,Ｃ
Ａ）で構築した。ＴobＲＤ2 cＤＮＡ(Ｃonkling et al.,Ｐlant Ｐhys.93,1203(
1990))をプローブとして使用して、Ｔobacco ＲＤ2遺伝子を含有するゲノムクロ
ーンを一次ライブラリーから単離した。合計で１．２×１０7の組換えファージ
をＫ802細菌細胞でスクリーニングした。プラークをナイロン膜（Ｍagnagraph）
に載せ、ＤＮＡをオートクレーブ処理（１０分、重力サイクル）により固定した
。ハイブリダイゼーションは全て、水溶液中（５×ＳＳＣ［７５０mＭの塩化ナ
トリウム、７５mＭのクエン酸ナトリウム］、５×デンハルト（Ｄenhardt's）［
フィコール、ＢＳＡ、ポリビニルピロリドンを各０．１％］、０．５％ＳＤＳ、
１００mg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ）、６５℃で１６時間実施した。０．２×Ｓ
ＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中６０℃で、フィルターを洗浄した。
ＴobＲＤ2 cＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションした１３のゲノムクロ
ーンを、１．２×１０7の組換えファージをスクリーニングすることによって同
定した。これらのクローンを単離し、制限地図作成によって更に特徴付けを行っ
た。制限地図は、Ｒachwitz et al.,Ｇene,30:195(1984)の迅速地図作成手順に
よって作図した。ＴobＲＤ2 cＤＮＡに相同な１つのクローン全体の配列を決定
し、そのプロモーターを同定した。ＴobＲＤ2 cＤＮＡおよびゲノムクローンの
アラインメントを作成することにより、ゲノムクローン５'から転写される領域
までの領域を同定した。この未転写領域の配列を調査し、推定されるプロモータ
ーのＴＡＴＡＡボックスを同定した。植物プロモーターでは、ＴＡＴＡＡボック
スは一般に転写開始点から−３５〜−２９のヌクレオチドである。プライマー伸
長実験を使用して、転写の５'末端を同定した。
ＴobＲＤ2 cＤＮＡの転写される領域から上流の２０１０塩基対領域を図２（
配列番号1）に示す。この配列は、予測される転写領域の開始点（ヌクレオチド
２
０００）、およびプロモーターのＴＡＴＡＡボックス（ヌクレオチド１９７１〜
１９７５）を含む。
例２
核酸配列決定
単離されたゲノムクローン（例１）をブルースクリプト（pＢＳ ＫＳ II＋ま
たはpＢＳ ＳＫ II＋、Ｓtratgene,Ｌa Ｊoll,ＣＡ）ベクターにサブクローニン
グした。Ｅxonuclease IIIおよびＳ１ヌクレアーゼ消化(Ｈenikoff,Ｇene 28,35
1(1984))により、各クローンおよび両ＤＮＡ鎖の一方向性欠失シリーズを入手し
た。酵素Ｓequenase（Ｕ.Ｓ.Ｂiochamicals,Ｃleveland,ＯＨ）を使用し、ジデ
オキシ鎖末端法(Ｓanger et al.,Ｐroc Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,74,5463(1977
))によってＤＮＡ配列を決定した。あらゆる場合に、両ＤＮＡ鎖の配列が決定さ
れた。
例３
in situ ハイブリダイゼーション
根の様々な組織におけるＴobＲＤ2 mＲＮＡ転写産物の空間分布を決定するた
めに、形質転換していない植物でin situハイブリダイゼーションを実施した。
Ｍeyerowitz,Ｐlant Ｍol.Ｂiol.Ｒep.5,242(1987)およびＳmith et al.,Ｐlant
Ｍol.Ｂiol.Ｒep.5,237(1987)に記載された技術を用いて、根組織のＴobＲＤ2
のアンチセンス鎖によるＴobＲＤ2 mＲＮＡへのin situハイブリダイゼーション
を実施した。７日齢のタバコ（Ｎicotiana tabacum）苗の根をリン酸緩衝グルタ
ルアルデヒド中で固定し、Ｐaraplast Ｐlus(Ｍonoject Ｉnc.,Ｓt.Ｌouis,ＭＯ
)に包埋し、厚さ８mmに薄切して、横断面ならびに縦断面を入手した。35Ｓ-ＡＴ
Ｐの存在下、in vitroで合成されたアンチセンスＴobＲＤ2転写産物をプローブ
として使用した。使用前に、標識ＲＮＡをアルカリ処理で加水分解して平均長１
００〜２００塩基とした。
約５×１０6カウント／分（cpm）の標識ＲＮＡ／mlハイブリダイゼーション溶
液を用いて、５０％ホルムアルデヒド中、４２℃で１６時間、ハイブリダイゼー
ションを実施した。曝露後、スライドグラスを発色させ、明暗視野顕微鏡下で可
視化した。
図１Ａおよび１Ｂからわかるように、ハイブリダイゼーションシグナルは根の
皮層に局在している。同じ断面の明視野画像と暗視野画像を比較すると、ＴobＲ
Ｄ2転写産物は根皮層の柔組織細胞に局在していることがわかる。ハイブリダイ
ゼーションシグナルは、表皮または中心柱に全く見られなかった。
例４
キメラ遺伝子作成
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、プロモーター欠失シリーズを作成し
た。鋳型は、Ｅxonuclease III/Ｓ1ヌクレアーゼ消化によって生成しておいたＴ
obＲＤ2ゲノムクローン（例２）の５'隣接領域の様々な欠失であった。
鋳型はすべて、同一セットのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅さ
せた。１つのプライマーは、修飾バクテリオファージＭ13前進プライマー（たと
えば、Ｓanger et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,74,5463(1977)を参照）
であり、オリゴヌクレオチドの５'末端は、ＨindIII認識配列とともに、制限酵
素によってさらに効率よく切断することが可能な別の５'配列を含んでいた。も
う１つのプライマーは、その５'末端に（効率よく切断するための別のヌクレオ
チドとともに）ＢamＨＩ部位を有するように設計されており、５'からＡＴＧ開
始コドンまでの２２塩基にあるＴobＲＤ2の１６のヌクレオチド配列と相同であ
った。（すなわち、このプライマーは配列番号１の相同塩基1973〜1988であった
）。
ＰＣＲ増副反応は、鋳型プラスミドＤＮＡ（５〜１０ng）、反応緩衝液（５０
mＭのＫＣl、１０mＭのＴris-ＨＣl、pＨ９．０［２５℃］、０．１％のＴriton
Ｘ-100、１．５mＭのＭgＣl）、各々０．２５mＭのdＡＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ
、およびdＣＴＰ、各プライマー４０ng、Ｔag ＤＮＡポリメラーゼ(Ｐromega,Ｍ
adison,ＷＳ)1.25単位を含んでいた。
ＰＣＲサイクルは、鋳型を９４℃で１分間変成し、プライマーを４６℃で１分
間アニーリングし、鎖伸長を７２℃で５分間続行した。このサイクルを４０回繰
返し、最後の伸長サイクルを１０分延長した。ＰＣＲ増幅は、プログラム可能な
サーマルサイクラー（ＰＴＣ-100、Ｍ.Ｊ.Ｒesearch）にて行った。
増幅産物をＨind IIIおよびＢam ＨＩで消化し、アグロバクテリウムバイナリ
ーベクターpＢＩ 101.3のＨind III部位およびＢam ＨＩ部位にクローニングし
た（Ｒ.Ｊefferson et al.,ＥＭＢＯ Ｊ.6,3901-3907(1987)）。このベクターは
、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子およびＴ-ＤＮＡ境界配列
と隣接するntpII選択可能マーカーを含んでいた。
例５
植物の形質転換：方法
本質的にＡn et al.,in Ｓ.Ｂelvin and Ｒ.Ｓchilperoot.eds.,Ｐlant Ｍole cular Ｂiology Ｍanual
,Ｍartinus Ｎijhoff,Ｄordrecht,The Ｎetherlands,pp
Ａ3-1-19(1988)に記載されている通りに、Ｔ-ＤＮＡトランスファーおよび植物
ゲノムへの組込みに必要なvir機能を（トランスで）提供することができる非武
装Ｔi-プラスミド（ＬＢＡ4404）担持しているアグロバクテリウム宿主に、キメ
ラレポーター遺伝子構成物を導入した。当業者には周知の、三親交配または電気
有能でででで電気的にコンピテントな(electrocompetant)アグロバクテリウム細
胞のエレクトロポレーションにより、構成物を宿主に導入した。Ａn et al.,Ｐl
ant Ｐhysiol.81,301-305(1986)に記載の通りに、タバコ（ＳＲ1）の葉ディスク
形質転換および植物再生を実施した。さらに分析するため、カナマイシン耐性植
物を選択した。
例６
形質転換植物のＧＵＳ分析：方法
形質転換植物の切り取った根、茎および葉に組織化学的染色を実施した。基質
を暫く真空浸潤した後、１mＭの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-Ｂ-Ｄ-グルク
ロ
ニド(Ｘ-Ｇluc)、２５mＭのリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ ７．０)、０．５％Ｄ
ＭＳＯ中、３７℃で一晩、外植体組織をインキュベートした。ＧＵＳ活性を発現
する組織はこの基質を切断し、その結果、青色に着色する。
Ｊefferson et al.,ＥＭＢＯ Ｊ.6,3901-3907に記載の通りにＧＵＳ蛍光測定
法を実施し、ＧＵＳ発現レベルを定量した。１mＭの4-メチルウンベリフェリル-
Ｂ-Ｄ-グルクロニドの存在下、３７℃で、根、葉および茎の細胞抽出物をインキ
ュベートした。０、５、１０、１５および２０分間隔で試料を採取した。０．２
Ｍの炭酸ナトリウムを加えて酵素反応を停止させた。１０nＭのＭＵＧおよび１
００nＭのＭＵＧで蛍光計を較正した。Ｂradford,Ａnal.Ｂiochem.72,248（1976
）の方法に従って、試料中のタンパク質濃度を測定した。
例７
キメラ遺伝子構成物は組織に特異的な遺伝子発現に関与することができる
ＴobＲＤ2遺伝子の２０１０塩基対配列（配列番号１）が、本質的に根皮層の
柔組織細胞における特異的な発現に関与するプロモーター要素を含むかどうかを
決定するため、キメラ遺伝子を構成した。１９８８塩基対領域（配列番号２）を
ポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、（上述の通り）５'をＧＵＳレポーター遺伝子
にクローニングした。（上述の通り）キメラ遺伝子をタバコに導入し、（上述の
通り）トランスジェニック植物のＧＵＳ発現能を分析した。
９種の形質転換体（すなわち、各形質転換体は独立した形質転換による）の分
析結果を表１、２５〜３３行（形質転換体325II1〜325IV5）に示す。Δ２．０プ
ロモーター（配列番号２）は、高レベルの遺伝子発現（一般に「強力な」プロモ
ーターと呼ばれるＣaＭＶ35Ｓプロモーターの約４倍）に関与することが確認さ
れた（図４）。葉または茎で、対照よりも高いレベルでのレポーターの発現を検
出することはできなかった（表１から採用した平均活性を示す図４、５Ａおよび
５Ｂを参照されたい）。図６からわかるように、ＧＵＳ活性は本質的に根に限定
され、
特に根皮層に限定されていた。pＢＩ101.3のΔ２．０プロモーター促進ＧＵＳを
使用して図６に示す植物を形質転換した。
（複数の形質転換された個々の葉ディスクをペトリプレートに入れた。表１の
形質転換体の名称はプロモーター／番号をふってあるペトリプレート／独立した
形質転換体の数を示す。したがって、325II1は、Δ２．０プロモーターを使用し
、ペトリプレートIIで、葉ディスク１由来の形質転換体を指すが、101.I1はpＢ
Ｉ101.3（対照実験として使用したプロモーターのないＧＵＳ）を使用した形質
転換と、ペトリプレートＩでの形質転換体数とを指す。表１で、接頭辞１２１は
pＢＩ121（ＧＵＳを含むＣaＭＶ35Ｓプロモーター）の使用を指し、３２５はＧ
ＵＳを含むΔ２．０プロモーター（配列番号２）を指し、４８４はＧＵＳを含む
Δ１．４プロモーター（配列番号３）を指し、４２１はＧＵＳを含むΔ１．３プ
ロモーター（配列番号４）を指し、４２８はＧＵＳを含むΔ１．０プロモーター
（配列番号５）を指し、４９０はＧＵＳを含むΔ０．７プロモーター（配列番号
６）を指し、４９１はＧＵＳを含むΔ０．６プロモーター（配列番号７）を指し
、４９２はＧＵＳを含むΔ０．５プロモーター（配列番号８）を指し、４９５は
ＧＵＳを含むΔ０．２プロモーター(配列番号９)を指す。「Ｒ−ＧＵＳ」は根組
織のＧＵＳ活性を指し、「Ｌ-ＧＵＳ」は葉組織のＧＵＳ活性を指し、「Ｓ-ＧＵＳ
」は茎組織のＧＵＳ活性を指す。Ｒ/Ｌは根／葉の相対ＧＵＳ活性であり、Ｒ/Ｓ
は根／茎の相対ＧＵＳ活性である。ＧＵＳ活性はpmolＭＵ／μgタンパク質／分
である。
例８
５'プロモーター欠失がレポーター遺伝子活性の発現に及ぼす影響
隣接した領域のいかに様々な部分がＧＵＳの発現に影響を及ぼすかを調査する
ために、プロモーターとして使用するＴobＲＤ2の隣接した領域の長さを変えた
こと以外は、上述の例７に記載のものと本質的に同じ方法で以下の実験を実施し
た。
プロモーター配列として使用するために、２０１０塩基対ＴobＲＤ2配列（配
列番号１）上流領域で一連の７つのネストした(nested)５'欠失突然変異を発生
させた。これらの欠失突然変異体を図３にグラフで示し、Δ２．０（配列番号２
）、Δ１．４（配列番号３）、Δ１．３（配列番号４）、Δ１．０（配列番号５
）、Δ０．７（配列番号６）、Δ０．６（配列番号７）、Δ０．５（配列番号８
）、およびΔ０．２（配列番号９）として表示する。
例３に記載されており、かつΔ２．００プロモーター（配列番号２）または先
端の欠けたプロモーター（配列番号３〜９）を含有するキメラ遺伝子構成物を、
（例４に記載の通り）葉ディスクをアグロバクテリウムによる形質転換によりタ
バコに導入した。対照実験としてアグロバクテリウムベクターpＢＩ101.3を単独
で使用し、ＣaＭＶ35Ｓプロモーターを参照標準を提供するために使用した。再
生した植物の根、葉および茎のＧＵＳ活性を分析した（表１、図４）。
図４は、完全長のＴobＲＤ2プロモーター、プロモーター欠失シリーズ、カリ
フラワーモザイクイルス35Ｓ(ＣaＭＶ35Ｓ)プロモーター、およびベクターpＢＩ
101.3を対照として使用した、根、葉および茎のＧＵＳ活性をグラフで表示した
図である。図４からわかるように、試験したプロモーターのうち６個は、すなわ
ち、Δ２．００（配列番号２）、Δ１．４（配列番号３）、Δ１．３（配列番号
４）、Δ１．０（配列番号５）、Δ０．７（配列番号６）、Δ０．６（配列番号
７）は、高レベルの根皮質に特異的な発現を与えることが確認された。図４は、
平均した表１のデータを示す。
さらに図４からわかるように、長さ約５０塩基対の領域を失うと（Δ０．６（
配列番号７）およびΔ０．５（配列番号８）と比較されたい）、ＧＵＳ発現レベ
ルが徹底的に低下する。しかし、結果から、Δ０．５プロモーター（配列番号８
）によって提供される根組織のＧＵＳ発現のレベルは、ＣaＭＶ35Ｓプロモータ
ーによって誘導されるものと同等であったことがわかる。Δ０．２プロモーター
（配列番号９）によって提供される根皮層のＧＵＳ発現は、ＣaＭＶ35Ｓプロモ
ーターによって提供されるものの約半分であった。
図５Ａおよび図５Ｂはさらに、ＴobＲＤ2プロモーターを使用したレポーター
遺伝子発現の器官特異的な性質を示す。試験した全ての場合に、ＧＵＳ活性は厳
密に根に発現され、同一形質転換タバコ植物の茎または葉には、存在しても、無
視できる活性が検出されただけであった。Δ０．６０プロモーターおよびΔ０．
３０プロモーターで形質転換した根で測定されたＧＵＳ活性のレベルはＣaＭＶ3
5Ｓプロモーターによって提供されたものと同等またはそれ以下であった（図４
）が、Δ０．６０プロモーターおよびΔ０．３０プロモーターが関与する発現は
根に特異的であり、ＣaＭＶ35Ｓプロモーターが関与する発現とちがって、茎お
よび葉の活性は無視できることが、図５Ａおよび図５Ｂからわかる。
前述の実施例は本発明を例証するものであって、本発明を限定するものとして
構成されるものではない。本発明は下記の請求の範囲によって明確に定められ、
請求の範囲と同等のものはその中に含まれる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，
ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，Ｅ
Ｓ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ
，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，
ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ
Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ
，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，
ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 メンドゥ，ナンディニ
アメリカ合衆国、27707 ノース・キャロ
ライナ、ダーラム、チャペル・ヒル・ロー
ド 207、5639
(72)発明者 ソン，ウェン
アメリカ合衆国、27607 ノース・キャロ
ライナ、ローリー、ヴァンダービルト・ア
ヴェニュー 2702
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的 な転写に関与する単離されたＤＮＡ分子であって、 （ａ）本願明細書に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列 番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９と 、 （ｂ）６０℃にて、０．３ＭのＮaＣl、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウ ム、０．１％のＳＤＳという洗浄ストリンジェンシー（厳密性）で表される条件 で、上述の（ａ）のうちの一配列を有する単離されたＤＮＡにハイブリダイゼー ションし、かつ、植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮 層に特異的な転写に関与するＤＮＡ配列と から成る群から選択される配列を有する前記単離されたＤＮＡ分子。 ２．発現カセットを含むＤＮＡ構成物であって、５'から３'方向に、Ｔobacco ＲＤ2プロモーターと、前記プロモーターから下流に位置し、かつ前記プロモー ターと機能的に関連した異種ＤＮＡセグメントとを含む構成物。 ３．発現カセットを含むＤＮＡ構成物であって、前記構成物は５'から３'方向 に、根皮層に特異的なプロモーターと、前記プロモーターから下流に位置し、か つ前記プロモーターと機能的に関連した異種ＤＮＡセグメントとを含み、前記根 皮層に特異的なプロモーターが、 （ａ）本願明細書に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列 番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９と 、 （ｂ）６０℃にて、０．３ＭのＮaＣl、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウ ム、０．１％のＳＤＳという洗浄ストリンジェンシーで表される条件で、上述の （ａ）のうちの一配列を有する単離されたＤＮＡにハイブリダイゼーションし、 植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的な転写 に関与 するＤＮＡ配列と から成る群から選択される配列を有することを特徴とする構成物。 ４．前記構成物はプラスミドをさらに含む請求項３に記載のＤＮＡ構成物。 ５．前記異種ＤＮＡセグメントが、殺虫性タンパク質をコードする遺伝子であ る請求項３に記載のＤＮＡ構成物。 ６．前記異種ＤＮＡセグメントが、昆虫に有毒なバチルス・スリンギエンシス (Ｂacillus thuringiensis)結晶タンパク質をコードする遺伝子である請求項４ に記載のＤＮＡ構成物。 ７．請求項３に記載のＤＮＡ構成物を含有する植物細胞。 ８．請求項７に記載の植物細胞から植物を再生するステップを含む形質転換植 物を作成する方法。 ９．請求項３に記載のＤＮＡ構成物を含有するアグロバクテリウム・チュメフ ァシエンス(Ａgrobacterium tumefaciens)の細胞であって、前記ＤＮＡ構成物は Ｔiプラスミドをさらに含むことを特徴とするＡgrobacterium tumefaciensの細 胞。 １０．請求項９に記載のＡgrobacterium tumefaciensに植物細胞を感染させて 、形質転換した植物細胞を作成するステップと、その後、前記形質転換した植物 細胞から植物を再生させるステップとを含んでなる形質転換植物を作成する方法 。 １１．請求項３に記載のＤＮＡ構成物を担持する微粒子であって、植物細胞の 発射注入による形質転換に適する前記微粒子。 １２．請求項１１に記載の微粒子を植物細胞内に撃ち込んで、形質転換した植 物細胞を生成するステップと、その後、前記形質転換した植物細胞から植物を再 生させるステップとを含んでなる形質転換植物を作成する方法。 １３．請求項３に記載のＤＮＡ構成物を含有する植物細胞プロトプラスト。 １４．請求項１３に記載の植物細胞プロトプラストから植物を再生させるステ ップを含む形質転換植物を作成する方法。 １５．形質転換した植物細胞を含む形質転換植物であって、前記形質転換した 植物細胞は異種ＤＮＡ構成物を含み、前記ＤＮＡ構成物は５'から３'方向に根皮 層に特異的なプロモーターと、前記プロモーターから下流に位置し、かつ前記プ ロモーターと機能的に関連した異種ＤＮＡセグメントとを含み、前記プロモータ ーは前記異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的な転写に関与することを特徴と する形質転換植物。 １６．前記根皮層に特異的なプロモーターが、植物細胞において下流に位置す る異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的な転写に関与するＴobacco ＲＤ2プロ モーターである請求項１５に記載の形質転換植物。 １７．前記プロモーターが、 （ａ）本願明細書に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列 番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９と 、 （ｂ）６０℃にて、０．３ＭのＮaＣl、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウ ム、０．１％のＳＤＳという洗浄ストリンジェンシーで表される条件で、上述の （ａ）のうちの一配列を有する単離されたＤＮＡにハイブリダイゼーションし、 植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異的な転写 に関与するＤＮＡ配列と から成る群から選択される配列を有することを特徴とする請求項１５に記載の形 質転換植物。 １８．前記植物は双子葉植物である請求項１５に記載の形質転換植物。 １９．前記植物は単子葉植物である請求項１５に記載の形質転換植物。 ２０．前記植物はタバコ（Ｎicotiana tabacum）である請求項１５に記載の形 質転換植物。 ２１．植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡセグメントの根皮層に特異 的な転写に関与するプロモーターから実質的に成り、かつ本願明細書に記載の配 列番号１〜９から成る群から選択される配列を有する単離されたＤＮＡ分子。 ２２．発現カセットを含むＤＮＡ構成物であって、５'から３'の方向に、請求 項２１に記載のプロモーターと、前記プロモーターから下流に位置し、かつ前記 プロモーターと機能的に関連した異種ＤＮＡセグメントとを含むＤＮＡ構成物。 ２３．形質転換した植物細胞を含む形質転換植物であって、前記形質転換した 植物細胞は請求項２２に記載のＤＮＡ構成物を含有する形質転換植物。
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