JPH11512618A

JPH11512618A - グルタミン酸デヒドロゲナーゼのα−およびβ−サブユニットに関連した新規のポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにその利用法

Info

Publication number: JPH11512618A
Application number: JP9514449A
Authority: JP
Inventors: ロバートアール．シュミッド; フィリップミラー
Original assignee: ユニバーシティーオブフロリダ
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-03
Publication date: 1999-11-02
Also published as: WO1997012983A1; EA199800273A1; EP0859849A1; EP0859849B1; NZ319920A; CN1198777A; DE69636392T2; US5985634A; ATE334205T1; US5879941A; BR9610861A; AU715640B2; CA2232542A1; AU7255696A; ES2268711T3; CA2232542C; DE69636392D1

Abstract

(57)【要約】グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）酵素に関連した、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列について開示する。本明細書に記載されているGDH酵素は、藻類のクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）から、７種類の異なる誘導可能なアイソザイムの形で発見された。これらのアイソザイムは、アルファ-およびベータ-サブユニットを含む、クロロプラストに局在する六量体として、藻類に見られる。この酵素のアルファ-またはベータ-サブユニットをコードするヌクレオチド配列で形質転換された植物は、例えば、成長が促進されたり、ストレス耐性が向上するなど、形質の向上を示す。α-およびβ-サブユニットの両方を有するヘテロ六量体は、α-ホモ六量体またはβ-ホモ六量体よりも高い、アミノ反応：脱アミノ反応活性比を有しうる。

Description

【発明の詳細な説明】グルタミン酸デヒドロゲナーゼのα-およびβ-サブユニットに関連した新規のポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにその利用法本発明は、USDA（米国農務省）競合的助成金番号87-CRCR-1-2476の下、政府の支援を受けて成された。本発明において、政府は一定の権利を有する。関連出願の相互参照本出願は、1995年10月6日に申請された、同時係属中の出願第08/541,033号の一部継続出願である。発明の背景植物によって得られる無機窒素は、有機窒素代謝において同化される前に、最終的にアンモニアに変換される。同化作用に関係すると考えられる酵素は、微生物から高等植物および動物までの、ほとんど全ての生物に存在する普遍的な酵素群であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）である（スリバスタバH.S.、R.P .シン（Srivastava,H.S.，R.P．Singh）［1987］Phytochem．26: 597-610）。GD Hは、還元型β-ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（NADH）または還元型 β-ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドホスファターゼ（NADPH）を補助因子として利用する還元的なアミノ反応によって、α-ケトグルタル酸からグルタミン酸への可逆的な変化を触媒する。高等植物におけるアンモニウム同化にとって有益と考えられているグルタミンシンテターゼ／グルタミン酸シンテターゼ（ GS/GOGAT）経路が発見されて以来、アミノ酸へのアンモニウム同化における植物 GDHの役割が問題になっている（ミフリン、B.J.、P.J.リー（Miflin，B.J.，P.J .Lea）[1976]Phytochem．15: 873-885）。 GDHが植物の窒素代謝において主要な役割を果たしているとすることの主な問題点は、アンモニウムに対するGDHの親和性が低いために、同化的に作用するためには高い細胞内アンモニウム濃度が必要となることである。初期の証拠は、GD Hが、グルタミン酸合成における部分的な同化作用によってのみ、グルタミン酸の脱アミノ反応を触媒する触媒酵素であることを示していた（ウォールグローブ、J.C.、N.P.ホール、A.C.ケンドール（Wallgrove，J.C.，N.P．Hall，A.C．Ken dall）[1987]Plant Physiol．83:155-158）。さまざまな植物の組織やオルガネラに存在する大量のGDHの生理学的な役割は未解明であり、また炭素および窒素代謝においてGDHが重要な役割を果たすことができる条件も、まだ解明されていない。現在までに特徴が分かっている植物GDHの大多数は、ミトコンドリアに局在している。しかし、いくつかの特性（例えば、補助因子特異性、K_m値、オルガネラ局在、温度安定性など）が異なるGDH種が、単細胞の緑藻類クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）のクロロプラストから特徴付けされている。クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）の細胞は、構成的で、ミトコンドリア性の四量体のNAD特異的GDH（本明細書において、以降「NAD-GDH」と名付ける）（メレディス、M.J.、R.M.グロノスタフスキー、R.R.シュミット（Mere dith，M.J.,R.M．Gronostajski，R.R．Schmidt）[1978]Plant Physiol．61:967- 974）を一つと、アンモニアによって誘導されクロロプラストに局在するホモ-およびヘテロ-六量体のNADP特異的GDHアイソザイム（本明細書において、以降「NA DP-GDH」と名付ける）（プルンカード、D.E.、N.F.バスコーム、R.W.ロビンソン、R.R.シュミット（Prunkard，D.E.、N.F.Bascomb，R.W．Robinson，R.R．Schmi dt）[1986]Plant Physiol．81:349-355; バスコーム、 N.F.、 R.R.シュミット（ Bascomb，N.F.，R.R．Smidt）[1987]Plant Physiol．83:75-84）を７つ有することが分かっている。この７つのクロロプラストNADP-GDHアイソザイムは、非変性-PAGEでは、電気泳動で異なる挙動を示すことが分かっているが、これは、 α-およびβ-サブユニット（それぞれ、53.5キロダルトンと52.3キロダルトン）が異なる比率で含まれるホモ-およびヘテロ-六量体が形成される結果生じる可能性がある。１〜２mMのアンモニア培地で培養されたクロレラ細胞では、α-ホモ六量体のみが蓄積する（バスコームとシュミット（ Bascomb and Schmidt）前掲）。硝酸培養細胞に、より高いアンモニア濃度（3.4から29 mM）を与えると、NADP-GDHホロ酵素において、α-およびβ-サブユニットの両方が蓄積される（プルンカードら（Prunkard）前掲；バスコームとシュミット（ Bascomb and Schmidt）前掲；．バスコーム、N.F.、 D.E.プルンカード、 R.R.シュミット（ Bascomb， N.F ．D.E． Prunkard，R.R.Schmidt）[1987]Plant Physiol．83:85-91）。プルンカードら（Prunkard，D.E.、N.F.Bascomb，W.T．Molin，R.R.．Schmidt）[1986]Pl ant Physiol．81:413-422）は、NADP-GDHのサブユニットの比率およびアイソザイムパターンが、細胞を培養する光条件だけでなく、炭素源と窒素源との両方によっても影譬されることを明らかにした。クロレラの細胞から精製されたα-およびβ- NADP-GDHホモ六量体は、大きく異なるアンモニアK_m値を有するが、それらの別の基質に対するK_m値は、非常に類似している。グルタミン酸の生合成を触媒するα-ホモ六量体（６個の同じα-サブユニットからなる）は、NADPHによってアロステリックに制御されており、アンモニアに対し、NADPHの濃度によって0.02 mMから3.5 mMという、異常に低いK_m の範囲を有する（バスコームとシュミット（Bascomb and Schmidt）前掲）。α- ホモ六量体のアンモニアに対するK_m値は、今までに特徴が分かっている植物GDH に関して報告されているアンモニアのK_mの中で最も低いものである。これに対し、β-ホモ六量体（異化型）は、約75 mMというアンモニアK_mを有する非アロステリック酵素である。精製酵素に関するこれらの研究から、今までは、ヘテロ六量体は、α-六量体とβ-ホモ六量体のK_m値の間で、アンモニアに対し、さまざまな親和性の程度を有すると考えられてきた。しかし、驚くべきことに、本発明者らは、ヘテロ六量体には、α-六量体とβ-ホモ六量体のどちらよりも、大きなアミノ反応：脱アミノ反応活性比を有するものがあることを発見した。 α-およびβ-サブユニットは、インビボで異なった代謝回転率を有し（バスコームら（Bascomb）前掲）、相当するホモ六量体は、顕著に異なるアンモニアK_m 値を有するが、α-およびβ-サブユニットは、ほとんど同じ大きさの前駆体蛋白質（約58,000ダルトン）に由来し、非常によく似たペプチドマップを有することが分かった（プルンカードら（Prunkard）前掲；バスコームとシュミット（ Bas comb and Schmidt）前掲）。さらに、β-ホモ六量体に対して作製されたポリクローナル抗体は、すべてのNADP-GDHアイソザイムを沈降させることができる（イエン、A.T.、K.J.ターナー、 N.F.バスコーム、 R.R.シュミット（Yeung，A.T. ，K.J．Turner，N.F．Bascomb,R.R．Schmidt）[1981]Anal．Biochem．10:216-22 8; バスコームら（Bascomb）前掲）が、ミトコンドリアのNAD-GDHとは交差反応しない。さらに、本実験室における以前の研究により、クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）のゲノムが、単一のNADP-GDH構造遺伝子を有することを示す、ゲノムクローニングおよびサザンブロットの証拠が提供された（コック、J.M. 、K.D. キム、P.W.ミラー、R.G.ハッソン、R.R.シュミット（Cock，J.M.、K.D.Kim、P.W .Miller、R.G.Hutson、R.R.Schmidt）[1991]Plant Mol.Biol．17:17-27）。クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）の核にコードされるクロロプラストNADP-GDHのアイソザイムは、植物から単離され特徴が分かっている、クロロプラストに局在する唯一のGDH配列である。クロレラGDHのアイソザイムは、以前に特徴が調べられたが、本発明において、単一の核遺伝子に由来する前駆mRNAの選択的スプライシングによって形成される２つのmRNAがコードする２つの類似蛋白質前駆体の特異的なプロセッシングによって、２種の成熟サブユニットができることが発見されている。さらに、成熟した機能的なGDHサブユニットの切断部位およびアミノ末端ペプチド配列の同定は、本発明以前には行われていなかった。発明の簡単な概要本発明は、単細胞緑藻クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）から単離されたmRNAに由来する、２種類の全長cDNAの単離および特徴づけを提供する。この２つのcDNAは、活性のあるNADP-GDH六量体アイソザイムを構成する成熟 α-およびβ-サブユニット（それぞれ、53.5 kD；52.3 kD）となるようにプロセッシングされる前駆体蛋白質（α-前駆体、56.3 kD；β-前駆体、57.85 kD）をコードしている。本発明は、２つの異なるクロロプラスト前駆体蛋白質をコードする２つのmRNAとなるように選択的にスプライシングされる単一のNADP-GDH遺伝子に関する。これらの前駆体蛋白質は、次に、NADP-GDHアイソザイムの成熟α- およびβ-サブユニットにプロセッシングされ得る。また、開示された活性または有用性を有するヌクレオチドおよびアミノ酸配列の有用な断片または変異体についても記載している。例えば、本明細書で提供されているアミノ酸配列のある断片は、一定の細胞分画の中に移動したりそこに残存したりする能力を蛋白質に付与するトランジットペプチドとして有用かもしれない。本明細書に記載しているヌクレオチド配列およびこれらのヌクレオチド配列の断片は、例えば、増幅処理におけるプライマーとして、または興味の対象となっている相補鎖とハイブリダイズさせるためのプローブとして役立つかもしれない。また、本明細書において説明されているヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびにその断片は、分子量マーカーとして、またはNADP-GDHに属する他のヌクレオチド配列、ポリペプチド、もしくはアイソザイムとの関係を同定したり確認する上で有用でありうる。本発明は、さらに、クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）からGDHを発現させるか、または別の生物から単離されたGDHを発現させることによって、無機窒素を有機窒素へと代謝する高等植物の同化作用を改変することができる方法を提供する。窒素同化を改変することにより、当技術分野においてよく理解されているように、例えば炭水化物の蓄積など、炭素代謝に対する逆の効果を通じて植物の組成に影響を及ぼしうる窒素同化を上昇させる効果が示されうる。本発明はまた、記載されている方法で用いるためのDNA構築物に関する。本発明には、例えば、クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）のクロロプラストに見られる天然の六量体NADP-GDHなどの、NADP-GDHのアイソザイムを形成するために組み立てることができるα-およびβ-サブユニットのアミノ末端の配列を同定することが含まれる。この正確な分子情報を用いて、クロレラ・ソロキニアナ（C．sor okiniana）のクロロプラストα-およびβ-NADP-GDHホモ六量体に独特な動力学的特性を有する、NADP-GDHを発現させることができる。本発明はまた、例えばトランスジェニック作物または植物のように、記載されているポリヌクレオチド配列の遺伝子を、それに相当するポリペプチドを産生させるよう発現させることによって、生産力を上昇させ、アンモニア毒性に対する耐性を有利に増強させることができるようアンモニア同化特性を向上させ、浸透圧ストレス耐性を向上させ、また、作物または植物の組成を改良させた組換え細胞または生物を提供する。図面の簡単な説明図１は、連続光の中、29 mMアンモニア培地で、240分間培養した同調クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）細胞のホモジネートにおけるNADP-GDH活性のパターンを示している。さまざまな時間間隔で採集した細胞から得られた、清澄化したホモジネートの一部を用い、NADP-GDHのアミノ反応活性（●）および脱アミノ反応活性（○）の両方を分光光度測定によって解析した。図２は、29 mMアンモニア培地で240分間培養し光照射した細胞における、NADP -GDH抗原の蓄積パターンを示している。０時間で、同調させたクロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）の嬢細胞にアンモニアを加えて、培養液を照射した。 240分間の誘導期間を通したNADP-GDHのα-サブユニット（●）およびβ-サブユニット（○）の相対的レベルを測定するために、レーザーデンシトメーターによってウェスタンブロットのオートラジオグラフィーを解析した。配列の簡単な説明配列番号：１は、NADP-GDH特異的なグルタミン酸デヒドロゲナーゼのα-サブユニットの前駆体蛋白質に対するcDNAである。配列番号：２は、配列番号：１のポリヌクレオチドの推定アミノ酸配列である。配列番号：３は、NADP-GDH特異的なグルタミン酸デヒドロゲナーゼのβ-サブユニットの前駆体蛋白質に対するcDNAである。配列番号：４は、配列番号：３のポリヌクレオチドの推定アミノ酸配列である。配列番号：５は、NADP-GDHのα-サブユニットに関するN末端配列である。配列番号：６は、NADP-GDHのβ-サブユニットに関するN末端配列である。配列番号：７は、pBGDc53と命名されたクローンの中のcDNA配列である。配列番号：８は、NADP-GDHのmRNAの保存領域とハイブリダイズするプライマーである。配列番号：９は、本発明によってアダプタープライマーとして用いられるポリ (dT)ポリヌクレオチドである。配列番号：１０は、本発明によってプライマーとして用いられるポリヌクレオチドである。配列番号：１１は、本発明によってプライマーとして用いられるポリヌクレオチドである。配列番号：１２は、本発明によってアダプタープライマーとして用いられるポリヌクレオチドである。配列番号：１３は、pRGDc60と命名されたクローンに挿入されたポリヌクレオチドである。配列番号：１４は、pRGDc61と命名されたクローンに挿入されたポリヌクレオチドである。配列番号：１５は、本発明によってプライマーとして用いられるポリヌクレオチドである。配列番号：１６は、pGDc63と命名されたクローンに挿入されたポリヌクレオチドである。配列番号：１７は、pGDc64と命名されたクローンに挿入されたポリヌクレオチドである。配列番号：１８は、pBGDc53と命名されたクローンおよびpBGDc63と名付けられたクローンの挿入配列の断片を精製してライゲーションしたものから得られたポリヌクレオチドである。配列番号：１９は、pGDc64と命名されたクローンおよびpBGDc53と命名されたクローンの挿入配列を精製してライゲーションしたものから得られたポリヌクレオチドである。配列番号：２０は、本発明によってプライマーとして用いられるポリヌクレオチドである。配列番号：２１は、本発明によって、鋳型DNAの3'末端とハイブリダイズするプライマーとして用いられるポリヌクレオチドである。配列番号：２２は、本発明によってプライマーとして用いられるポリヌクレオチドである。配列番号：２３は、プロセッシングされた成熟NADP-GDHのα-サブユニットのポリヌクレオチド配列（cDNA）である。配列番号：２４は、プロセッシングされた成熟NADP-GDHのα-サブユニットのアミノ酸配列である。配列番号：２５は、プロセッシングされた成熟NADP-GDHのβ-サブユニットのポリヌクレオチド配列（cDNA）である。配列番号：２６は、プロセッシングされた成熟NADP-GDHのβ-サブユニットのアミノ酸配列である。発明の詳細な開示本発明は、例えば、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）に由来する、アンモニアによって誘導され、クロロプラストに局在するNADP特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（本明細書においては、以後、NADP-GDH）のα-および β-サブユニットの前駆体蛋白質に対するcDNAなど、これまでに開示されていないポリヌクレオチド配列を提供する。NADP-GDHを形成するα-およびβ-サブユニットの前駆体蛋白質に対する塩基配列を、それぞれ、配列番号：１および配列番号：３に示す。クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）に由来するN ADP-GDH酵素のα-およびβ-サブユニットの前駆体蛋白質に対する推定アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：２および配列番号：４に示す。本cDNA挿入配列を含む大腸菌（E．coli）宿主は、米国基準培養株コレクション（ATCC）、米国メリーランド州20852、ロックビル、パークローン12301に寄託された。培養株は、寄託所によって、以下の寄託番号を付与された。培養株寄託番号寄託日大腸菌DH5α ATCC69925 1995年10月6日 α-NADP-GDH 配列番号:1（+42 bp）大腸菌DH5α ATCC69926 1995年10月6日 β-NADP-GDH 配列番号:1（-42 bp）本培養株は、37 CFR 1.14および 35 USC 122の下、特許および商標庁長官によって、それに対する権限があると決定されたところへの本特許出願の係属中は、培養株の利用ができることを保証するという条件の下で寄託されている。本出願に対応する出願、またはその後続出願が提出された国の外国特許法によって要求されているときには、この寄託物を利用することができる。しかし、寄託物の利用可能性は、行政行為によって許可される特許権を犠牲にして、本発明を実施するための認可には含まれないと理解されるべきである。さらに、本培養寄託株は、微生物の寄託に関するブタペスト条約の条項、すなわち、寄託物の試料の供給が最後に要求されてから少なくとも５年間、また、いかなる場合にも、寄託した日付から少なくとも30年間、または培養株の開示について記載している特許を実施する期間中は、微生物を生存可能で汚染されていない状態に保つのに必要なあらゆる注意を払って保存するという条項に従って、保存され、また、一般に利用できるようにされる。寄託者は、寄託物の状態によって、請求されたときに試料を供給することができるという寄託物を入れ替える義務を認められている。本培養寄託物を公的に利用することに対する制約はすべて、それらを開示する特許が認められたときには、取り除かれ、これは取り消すことができない。自動アミノ酸分析器によって、α-およびβ-サブユニットのそれぞれについて、アミノ末端の20アミノ酸残基と10アミノ酸残基を同定した。α-およびβ-サブユニットのペプチドのアラインメントは、大きな方のα-サブユニットで、11アミノ酸残基長くなっていることを除けば、２つのサブユニットは同一であることを示している。α-サブユニットに対して作製されたモノクローナル抗体が、β- サブユニットを認識することが示され、このことから、この２つのサブユニットがほとんど同一であるとの証拠が提供される。前駆体蛋白質の中にある独自のα -およびβ-サブユニットのプロセッシング部位の同定によって、α-およびβ-NA DP-GDHホモ六量体アイソザイムの異なった動力学的特性を説明するための分子メカニズムが提示される。前述のデータから、炭素および窒素代謝の両方に影響するような好ましい動力学的特性を有する特異的GDHを有する、遺伝子工学的に改良された植物に応用できる情報が提供される。グアニン／シトシン含量が高いことから、このcDNAは非常に、高等植物での異種発現をさせやすい。本来のクロロプラスト標的配列または異種の植物システムにおける別のオルガネラの標的配列を有するサブユニットの片方または両方を導入することにより、窒素同化を向上させ、炭素／窒素バランスに影響を与えることができる。クロロプラストへの局在は、α-またはβ-前駆体蛋白質のN末端に関連し、また、これに依存することが発見されている。前駆体のN末端を切断すると、成熟蛋白質が生じる。したがって、クロロプラストトランジットペプチドは、前駆体から切断されるN末端を形成しているか、またはその活性断片であるペプチドを含む。アミノ酸配列が類似しているかもしくは等しいペプチド、またはこれらの切断されたペプチドに類似した三次構造もしくは立体構造を有するペプチドもまた、トランジットペプチドとして機能しうる。クロロプラストトランジットペプチドは、α-前駆体（40重合体）またはβ-前駆体（37重合体）から切断されるN 末端ペプチドの活性断片を含む。クロロプラストトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、当業者は、本明細書で説明されているペプチドまたは当技術分野において既知の別のペプチドとともに用いられる、クロロプラストトランジットペプチドを産生することができる。例えば、GDH酵素などの蛋白質に関連したクロロプラストトランジットペプチドの付加、除去、または置換を用いて、当技術分野において周知の方法によって、必要に応じて蛋白質に局在させることができる。例えば、クロロプラストトランジットペプチドを、このようなトランジットペプチドをもたないアミノ酸配列上に挿入することによって、酵素を細胞のクロロプラストに局在させることができる。所望の種のクロロプラストへの挿入を最適化するために、種特異的なクロロプラストトランジットペプチドを付加するか、または現にあるトランジットペプチドと置換することができる。さらに、発現される蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列で、プラスチドを直接形質転換させることによって、クロロプラストの中で発現される蛋白質をクロロプラストの中に局在させることができる。同様に、クロロプラストトランジットペプチドの除去、またはこのペプチドをもたない組換え蛋白質の産生を利用して、蛋白質を、クロロプラスト以外の細胞分画の中に隔離することができる。 α-ホモ六量体を発現する形質転換植物は、浸透圧保護剤であるプロリンの前駆体をグルタミン酸に供給することによって、アンモニア毒性に対する耐性がより強くなり、より効率的にアンモニアを同化し、一時的に塩分を含む土壌の中でかかる浸透圧ストレスに、より迅速に反応することができる。例えば、β-ホモ六量体またはGDHヘテロ六量体の発現を用いて、窒素同化の比率を変更することができ、それによって、果実およびその他の貯蔵器官における炭水化物の同化が向上する。予想外にも、少なくとも一つのα-サブユニットと少なくとも１つのβ-サブユニットとを含む六量体、すなわちヘテロ六量体が、有利な活性を有しうることが発見された。具体的には、クロロプラストNADP-GDHアイソザイムのアミノ反応：脱アミノ反応活性比（すなわち、グルタミン酸合成のための生合成能力）は、α -のみまたはβ-のみのサブユニットを含むホモ六量体を用いるよりも、α-および β-の両サブユニットを六量体蛋白質の中に取り込ませることによって向上させることができる。本発明の一つの態様において、ヘテロ六量体で、α-およびβ- サブユニットの特定の比率が得られるよう、両方のタイプのサブユニットをコードするcDNAを、異なる比率／レベルで、同じ植物の中で同時に発現させることが有用でありうる。例えば、本発明者らは、β型サブユニットの少なくとも一つを有するNADP-GDHヘテロ六量体は、アミノ反応：脱アミノ反応活性比を向上させるために好ましいことを発見した。より好ましいヘテロ六量体は、２〜５個のβ- サブユニットを有する。２つのcDNAの異なる発現比率を実現させるためには、これらのcDNAを、異なる強度を有する植物のプロモーターの制御下に置くか、または異なる発現レベルになるよう改変された同一のプロモーターの下に置く。植物のバイオテクノロジーにおいて、藻類のこのNADP-GDHアイソザイムシステムを使用することは、バクテリアなど、単一の酵素型しか持たない（すなわち、アイソザイムがない）生物に由来するNADP-GDHを用いるよりも利点がある。トランスジェニック植物における、ある組換え蛋白質の発現レベルは、安定したmRNA転写産物の発現を増加させることによって向上させることができるが、逆にいうと、これらの安定したRNA転写産物の検出を利用して、翻訳産物（蛋白質）の発現を測定することができる。植物における、蛋白質をコードするRNAの発現の低さ、すなわち、蛋白質発現の低さは、遺伝子が由来する生物の所望の蛋白質を特定する、改良された合成遺伝子を用いることによって、解決することができる。このように、本発明の一つの態様において、バクテリアおよび植物を遺伝子工学的に改良して、農業上の価値またはそれ以外では商業上の価値を有する新規の蛋白質を、望ましい発現レベルに到達させることができる。植物における発現が向上した遺伝子を提供するために、高度に発現する植物遺伝子によって選択されるコドンを含み、植物で実質的に見られる塩基組成におけるA+T含量を有し、また、好ましくは植物のプロモーター配列を形成し、RNAの不安定化、不適切なポリアデニル化、分解、および終結の原因となる配列を除き、ヘアピン二次構造およびRNAスプライシング部位を構成する配列を回避するように、この遺伝子のDNA 配列を改変することができる。例えば、合成遺伝子において、所定のアミノ酸を特定するために用いるコドンを、高度に発現される植物遺伝子で、そのアミノ酸を特定するために利用されているコドン使用の分布頻度に関連させて選択することができる。当業者によって認識されているように、合成遺伝子において用いられるコドン使用の分布頻度が、発現レベルの決定因子である。本発明の目的にとって、「好ましいコドンの使用頻度」とは、あるアミノ酸を特定するために塩基コドンを使用する場合に、特異的な宿主細胞によって示される選択性を意味する。ある遺伝子における特定のコドン使用頻度を判定するには、その遺伝子での該コドンの存在数を、その遺伝子において、同一のアミノ酸を指定しているすべてのコドンの存在数で割る。同様に、宿主細胞によって示される好ましいコドンの使用頻度は、その宿主細胞によって発現される大量の遺伝子における好ましいコドンの使用頻度の平均をとることによって計算することができる。この解析は、宿主細胞によって高度に発現されている遺伝子に限定することが好ましい。宿主細胞における発現を向上させるよう遺伝子を合成する場合は、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくよう、遺伝子を設計することが望ましい。合成遺伝子にとって好ましいコドン使用頻度と宿主細胞によるコドン使用頻度との偏りの割合は、最初に、ある単一のコドンの使用頻度における宿主細胞のコドン使用頻度との偏りの割合を決定し、次に、すべてのコドンについて、偏りの平均を得ることによって計算する。本明細書で定義されているように、この計算には、一つしかないコドン（例えば、ATGおよびTGG）も含まれる。一般的な用語においては、宿主細胞のコドン使用からの、合成遺伝子のコドン使用の全体的な平均偏差は、等式を用いて計算される。式中、X_n＝宿主細胞におけるコドンnの使用頻度、Y_n＝合成遺伝子におけるコドンnの使用頻度。ここで、nは、ひとつのアミノ酸を特定する個別のコドンを示し、コドンの総数はZである。すべてのアミノ酸に関するコドン使用頻度の全偏差Aは、好ましくは約25％未満となるべきで、より好ましくは約1 0％未満となるべきである。従って、遺伝子のコドンの使用頻度における偏差が、高度に発現している植物遺伝子の使用頻度から、好ましくは25％以上とならないよう、より好ましくは10％以上とならないように、遺伝子を設計する。さらに、縮退した第三塩基のG+C含量の割合が考慮される（単子葉類は、この部位でG+C になりやすいと考えられるが、双子葉類ではそのようなことはない）。XCG（ここで、Xは、A、T、C、またはG）ヌクレオチドは、双子葉類では最も選択されにくいコドンであるが、XTAコドンは、単子葉類でも双子葉類でも回避されることも認識されている。また、本発明に係る合成遺伝子は、好ましくは、選択された宿主植物のCGおよびTAの二つの回避指数に非常に近い指数を有する。より好ましくは、これらの指数と、宿主の指数との偏差は、約10〜15％以下である。本発明に係るNADP-GDH遺伝子の組み立ては、当技術分野において既知の技術を用いて行うことができる。特異的な態様の植物において、発現が増強されるように設計された構造遺伝子は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドニ本鎖セグメントから、DNAベクターの中で酵素的に組み立てることができる。そして、当技術分野において既知の方法によって、この遺伝子を植物宿主細胞の中に導入して、発現させることができる。好ましくは、植物中で合成遺伝子の発現によって産生される蛋白質は、天然の蛋白質に匹敵するまたは改良されたアミノ反応／脱アミノ反応活性を有するという点で、天然の蛋白質と機能的に同等である。本発明において、機能的に同等であるとは、機能の同一性または準同一性を意味する。その活性または機能に関連する少なくとも一つの特性を有する合成遺伝子産物は、天然の蛋白質と同一であるかまたは類似していれば、それと機能的に同等であるとみなされる。宿主細胞に、天然の高度に発現される蛋白質の遺伝子に通常見られる塩基組成を反映させるよう、合成遺伝子のDNA塩基組成のA+T含量を変更することにより、コード領域のヌクレオチド配列を改変することができる。好ましくは、合成遺伝子のA+T含量は、高度に発現される蛋白質の該遺伝子のA+T含量に実質的に等しい。高度に発現される植物の蛋白質をコードする遺伝子において、A+T含量は、およそ55％である。合成遺伝子は、この値に近いが、RNAを不安定化させ、それにより蛋白質発現レベルが低下する原因となるほどには高くないA+ T含量を有することが好ましい。より好ましくは、A+T含量は約60％よりも高くなく、最も好ましくは約55％である。また、植物において最大の発現を得るために、合成遺伝子のヌクレオチド配列は、好ましくは、コード領域の5'末端で、植物の開始配列を形成するように改変することができる。さらに、好ましくは、合成遺伝子を構築する際、オリゴヌクレオチドセグメントが効率的に組み立られて、その後のヌクレオチド改変が容易になるように、一つしかない制限部位を機能的位置に置くことに特別の注意が払われる。本来の遺伝子のコード領域における、これらの改変の結果、天然の構造遺伝子で観察されるレベルと比較して高いレベルで、好ましい合成遺伝子が植物の中で発現される。単子葉類と双子葉類とでは、同義的なコドンの相対的な使用が異なることが知られている。一般的に、単子葉類と双子葉類におけるコドン使用のパターンを区別する上で重要な要素は、縮退した第三塩基のG+C含量の割合である。単子葉類においては、18アミノ酸中16アミノ酸が、この位置でG+Cとなりやすいが、双子葉類においては、18アミノ酸中7アミノ酸だけがG+Cとなりやすい。ダイズとトウモロコシとでは、トウモロコシのコドン使用パターンは一般に、単子葉類のコドン使用パターンに似ており、ダイズのコドン使用パターンは、一般的な双子葉類のパターンとほぼ同一である。植物で発現させるための合成遺伝子の設計において、遺伝子発現の効果を阻害するような配列は除去することが好ましい。発現レベルを向上させるという目的に加えて、これ以外の目的のために、合成遺伝子を合成してもよい。例えば、本発明に従い、NADP-GDHのα-サブユニットまたはβ-サブユニットをコードする塩基配列の一つを、一方のサブユニットの発現が有利になるよう、産物が差異をもって発現されるように改変することができる。このような差異的な発現の結果生じるのは、一方よりも、もう一方のサブユニットを多く含むヘテロ六量体である。改変には、合成遺伝子の構築に用いられるオリゴヌクレオチドセグメントの全部ではないが、１個以上を、天然の配列の対応する領域に置換することを含む。好ましくは、NADP-GDHポリペプチドのα -およびβ-サブユニットをコードする塩基配列の差異的な発現を用いて、少なくとも一つのβ-サブユニット、より好ましくは２個から５個のβ-サブユニット、最も好ましくは３個のβ-サブユニットを有するヘテロ六量体を産生することができる。本発明に係る塩基配列を含む組換えDNA分子を、当業者に既知の方法のいずれかを用いて、植物組織中に導入することができる。ある特定の植物種または植物組織に特異的なタイプに対して用いられる技術は、これまでに成功している技術による。外来遺伝子を植物細胞中に安定的に挿入し、改変した細胞を操作するための新しい方法が開発されているため、当業者は、望ましい結果を実現させるために、既知の方法から選択することができる。植物組織の中に、組換えDNAを導入するための方法には、直接的なDNAの取り込み（パスコフスキーら（Paszkowsk i，J.）（1984）EMBO J．3:2717）、エレクトロポレーション（フロムら（Fromm ，M.）(1985)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:5824）、マイクロインジェクション（クロスウェイら（Crossway，A.）(1986)Mol．Gen．Genet．202:179）、またはT-DNAが介在する、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium t umefaiens）から植物組織への導入が含まれるが、これらに限定はされない。T-D NA形質転換には、アグロバクテリウムの天然宿主範囲に対する基本的な制約はないと考えられる。T-DNAが介在する形質転換が成功したことは、単子葉類（フーイカース-バンスログテレンら(Hooykaas-Van Slogteren，G．)（1984）Nature 3 11:763）、裸子植物（ダンデカールら(Dandekar，A.)(1987)Biotechnology 5:58 7）、および藻類（オージッヒら(Ausich，R.)欧州特許出願第108,580号）で報告されている。代表的なT-DNAベクターシステムが、以下の参考文献で述べられている。アンら（An，G．）(1985)EMBO J．4:277;ヘレラ-エストレラら（Herrera- Estrella，L．）(1983)Nature 303:209; ヘレラ-エストレラら（Herrera-Estrel la，L．）(1983)EMBO J．2:987; ヘレラ-エストレラら（Herrera-Estrella，L．）(1985)植物遺伝子工学、ニューヨーク、ケンブリッジ大学出版会、p．63）。植物組織に導入したら、構造遺伝子の発現は、当技術分野において既知の方法によって測定することができ、また、発現は、転写されたmRNAまたは合成された蛋白質として測定することができる。植物組織のインビトロ培養に関する技術は周知であり、多くの場合、完全な植物体に再生される。導入された発現複合体を、商業上有用な栽培品種に移入させるための処理手順は、当業者には周知である。好ましい態様の一つにおいて、本明細書で開示されている発明は、植物細胞において植物で発現可能なプロモーターの制御下でNADP-GDH遺伝子を発現させる、すなわち、植物で発現可能なプロモーターの制御下でT-DNAの中に遺伝子を挿入し、既知の方法を用いてこのT-DNAを含む挿入配列を植物細胞の中に導入することによって、植物細胞の中でNADP-GDH遺伝子を発現させることを含む。植物で発現可能なプロモーターの制御下で遺伝子を発現する植物細胞が得られたら、当技術分野において周知の方法および技術を用いて、植物組織と完全な植物体とをそれから再生させることができる。そして、従来の方法によって、再生した植物体を繁殖させたり、導入した遺伝子を、従来の植物育種技術によって、別の系統および栽培品種に移入することができる。 NADP-GDH遺伝子の導入および発現を用いて、例えば作物の収量を増加させるなどの改良を行うことができる。本発明の別の使用法として、植物種に導入された遺伝子の特性を利用することが、当業者には、容易に明らかであると思われる。植物の核遺伝子とクロロプラストとの間にも、コドンの選択には差異がある。クロロプラストは、30個のtRNA種しかコードしていないという点で、高等植物とは異なっている。クロロプラストでは、tRNA遺伝子が制限されているため、タンパク質をコードするクロロプラストによる好ましいコドンの使用は、より極端に見える。しかし、所定のアミノ酸に関してイソ受容するtRNAのレベルと、このコドンがクロロプラストゲノムで用いられる頻度との間には、正の相関関係がある（フィツィンガーら( Pfitzinger（1987）Nucl．Acids Res．15:1377-1386）。一般的に、クロロプラストのコドンのプロフィールは、縮退した第三塩基において、A+Tを使用する傾向が強いという点で、単細胞生物のコドンのプロフィールにより類似している。以下は、本発明を実施するための、最良の形態を含む処理手順を例示する実施例である。これらの実施例は、本発明を制限するものではない。すべての割合は重量によるものであり、溶液の混合比はすべて、別途注記されない限り容量による。実施例実施例１−クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）クロロプラストのグルタミン酸デヒドロゲナーゼの動力学以下の実験で用いられたクロロプラストグルタミン酸デヒドロゲナーゼのα- およびβ-アイソザイムは、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）と特徴づけられた生物によって、天然に産生される。クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）の培養条件。アミノ反応と脱アミノ反応の両方向における、動力学的な特徴を調べるために、ホモ六量体GDHアイソザイムの形態のみを蓄積している細胞からα-およびβ-ホロ酵素を精製した。クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）細胞（UTEX-1230、テキサス大学藻類培養株コレクション；3B2NA、ロバート・R・シュミット（Robert R．Schmid t）、フロリダ大学、微生物細胞科学部門）は、プルンカードら（Prunkard）前掲によって前述しているところに従って、改変基本塩培地中で、無機栄養的に培養した。改変培地には以下が含まれる：mM濃度で、CaCl₂、0.34；K₂SO₄、6.0；K H₂PO₄、18.4；MgCl₂、1.5；μM濃度で、CoCl₂、0.189；CuCl₂、0.352；EDTA、72 ；FeCl₃、71.6；H₃BO₃、38.8；MnCl₂、10.1；NH₄VO₄、0.20；(NH₄)₆MO₇O₂₄、4.1 9；NiCl₂、0.19；SnCl₂、0.19；ZnCl₂、0.734。実験条件に応じて、この培地に、1 mM NH₄Cl、29 mM NH₄Cl、または29 mM KNO₃を窒素源として添加した。NH₄Cl を含む培地を、pH 7.4に調整し、KNO₃を含む培地は、オートクレーブ後に、KOH でpH 6.8に調整した。細胞には、2％（V/V）のCO₂混合気体と、細胞分裂して４つの後代になるのに十分な光を供給した。 NADP-GDH アイソザイムの精製。グルタミン酸デヒドロゲナーゼのα-アイソザイムを精製するため、前述の説明に従って、30 lのプレキシグラスチャンバー（ Plexiglas chamber）の中、29 mMのアンモニア培地中で、クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）細胞を培養した（Baker，A.L.，R.R．Schmidt［1963］Bio chem．Biophys．Acta 74:75-83）。4.0 OD₆₄₀で、シャープレス（Sharples）遠心分離機によって、30,000 rpmで遠心して、細胞を回収し、10 mM Tris（4℃でp H 8.5）で２回洗浄した。沈澱した細胞（130 g）を、250 mLの遠心管に入れて、使用時まで-20℃で保存した。ヨーンら（Yeung）、前掲の処理手順を改変したものを用いてNADP-GDHの精製を行った。方法手順の改変には、セファデックス（Se phadex）G-200ゲル（ファルマシア社（Pharmacia））の代わりにG-150ゲル濾過カラムを使用すること、およびゲル濾過バッファーと、その後のすべての保存用バッファーに、最終濃度0.1 mMとなるように、NADP+を安定剤として加えることが含まれた。最終的な改変として、NADP+親和性樹脂の段階は省いて、代わりに、予備的に非変性PAGE段階を行った（ミラー、ダン、シュミット（Miller，P.W.，W.D．D unn，R.R．Schmidt）［1994］バイオラドUS/EG会報(BioRad US/EG Bulletin)(18 97)）。 GDH脱アミノ反応酵素アッセイ用溶液は、44 mM Tris、20.4 mM グルタミン酸、および1.02 mM NADP+、pH 8.8から成る。アミノ反応アッセイ用溶液は、50 mM Tris、25 mM α-ケトグルタル酸、0.357 mM NADPH、0.356 mM (NH₄)₂SO₄、 pH 7.4から成る。１ユニットの酵素活性とは、1.0μmolのNADP+またはNADPHを、 38.5℃で１分間に還元または酸化するのに必要とされるNADP-GDHの量をいう。 NADP-GDH活性を有するセファデックス（Sephadex）G-200カラム画分を集めて、ダイアフロー（Diaflow）濾過によって濃縮した。DTTを最終濃度10 mMになるように加えることにより、可溶性酵素（68 mg）の酸化を防ぎ、28.8 mM Tris、 192 mM グリシン、2 mM DTT（pH 8.4）に対して、30分間透析した。透析物は、2 0,000 gで10分間４℃で遠心して清澄化し、3 mLの40％（w/v）スクロースおよび 1 mLの0.02％ブロモフェノールブルーを加えた。予備的な非変性PAGEのために、3 cmの高さの7％アクリルアミド（w/v、28アクリルアミド：0.735ビスアクリルアミド、pH 8.8）分析ゲル、および2 cmの高さの2％アクリルアミド（w/v、1.6アクリルアミド：0.4ビスアクリルアミド、pH 6 .6）スタッキングゲルを、モデル491プレップセル（Prep Cell）の28 mm IDゲルチューブの中に作製した。アクリルアミド貯蔵液はすべて、電気泳動中のインビトロでのN-アシル化を防止するために、AG501-X8混合ベッドレジンで前処理して、混入したアクリル酸残留物を除去した。蛋白質試料は、15 mAの定常電流で、2 0分間電気泳動し、さらに、30 mAの定常電流で3.5時間電気泳動した。6ミリリットルの画分を集めて、NADP-GDH脱アミノ反応活性を測定し、GDHを含む画分を集めた。10 mMのKPO₄(pH 6.2)、0.1 mM NADP+中に集めた画分中の酵素を、ダイアフロー（Diaflow）限外濾過によって、BSAを標準として用いたブラッドフォード（Bradford）法で決定した1 mg/mLまで濃縮した。濃縮された酵素調製物を、-20 ℃に保存した。この調製物の純度を、10％（w/v）トリス-トリシンSDS-PAGEによって分析された蛋白質を可視化するための銀染色によって決定した（シャガー、フォンジャゴー（Schagger，H.，G．von Jagow）[1987]Anal．Biochem．166:368-379）。バスコームとシュミット（Bascomb and Schmidt）、前掲にしたがって、1 mM アンモニア培地（14 g）で240分間、1 mMアンモニア培地（6 g）で90分間、そして、29 mMアンモニア培地（1 g/時点）で20、40、60、および80分間培養した細胞混合液から、NADP-GDH β-アイソザイムを精製した。ヨーンら（Yeung）、前掲の処理手順を改変し、スケールを小さくして用いた方法により、NADP-GDHβ- アイソザイムを部分精製した。DEAEセファセルイオン交換カラム（pH 7.4および pH 6）を、40 mLのカラム容量にまでスケールを小さくし、400 mLの直線KCl勾配（0から0.4 Mまで）を用いて、3 mL画分にタンパク質を溶出した。NADP-GDHを含む、pH 6のDEAEイオン交換カラム画分を組み合わせて、NADP-GDH活性ピークの前半部と後半部に相当する２つのプールにした。２つに分けたプール画分を、10 m MのKPO₄(pH 6.2)、2 mM DTTに対して16時間透析し、前述の説明にしたがい（バスコームとシュミット（Bascomb and Schmidt）、前掲）、タイプ３のNADP+親和性ゲル（ファルマシア社（Pharmacia））を用いて、アフィニティー精製した。収集した画分におけるNADP-GDHを、ブラッドフォード（Bradford）法（ブラッドフォード（Bradford，M.M.）[1976]Anal．Biochem．72:248-254）で決定したところにより、ダイアフロー（Diaflow）限外濾過で2 mg/mLまで濃縮し、さらに使用する時まで4℃で保存した。8％（w/v）トリス-トリシンSDS-PAGEによって蛋白質を分析した後、銀染色によって、この調製物の純度を判定した。表１は、α-およびβ-の両ホモ六量体アイソザイムのアミノ反応について決定されたK_m値を要約したものである。 *シャティロフ、クレトビッチ（Shatilov，V.R.，W.L．Kretovich（1977）Mol． Cell Biochem．15:201-212）による。表２は、α-およびβ-の両ホモ六量体アイソザイムの脱アミノ反応について決定されたK_m値を要約したものである。 α-、β-ヘテロ六量体の活性。天然のNADP-GDHアイソザイムの混合物（さまざまな比率のα-およびβ-サブユニットからなるヘテロ六量体）のアミノ反応、および脱アミノ反応活性も、240分間の誘導時間を通した基質の飽和レベルによって測定した（図１）。アミノ反応、および脱アミノ反応活性は、最初の誘導から、それぞれ、20分から40分の遅延を示した。アミノ反応活性は、最初の100分間で速やかに上昇し、100分から140分の間で急速に減少し、140分から200分の間で、再び急速に上昇した。これに対して、脱アミノ反応活性は、最初の誘導遅延の後は、誘導時間中、ほぼ直線的に上昇した。 29 mMのアンモニア培地中での240分間の誘導時間中、アイソザイムにおける、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）のNADP-GDHα-およびβ-サブユニットの蓄積パターンも、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の後に、ウエスタンブロット免疫検出法を用いて調べた（図２参照）。T₀で、NADP-GDHのβ-サブユニットが検出され、最初の40分間は上昇し、その後、残りの誘導時間中、次第に減少した。α-サブユニットは、20分目に最初に検出された。このサブユニットは、最初の80分間は、ゆっくりと蓄積し、80分から100分の間で顕著な増加を示し、その後の残りの誘導時間中は、ゆっくりとした速度で、直線的に蓄積した。β-サブユニットが主な分子種になっているものから、α-サブユニットが主になるものへの遷移は、60分から80分で起こる。 NADP-GDHアイソザイムの混合液におけるサブユニット比の変化が、誘導時間の時間経過の間で予想されるアミノ反応：脱アミノ反応活性比と相関するか否かを判定するために、アミノ反応：脱アミノ反応活性比、およびα：βサブユニット比を計算した（表３）。驚くべきことに、β-サブユニットが主要なNADP-GDH抗原であった60分目に、最も高いアミノ反応：脱アミノ反応比が観察された一方で、アミノ反応：脱アミノ反応活性比が最も低いときには、α-サブユニットが主要であった。後者の結果は、予め予測されていなかった。この発見、すなわち、精製されたα-およびβ-ホモ六量体の基質の動力学的研究の以前から、α-ホモ六量体は、（β-ホモ六量体と比較して）アンモニアに対して非常に高い親和性をもっているため、最も高いアミノ反応活性（すなわち、グルタミン酸合成に関する生合成能力）を有するアイソザイム型であると推定されていた。その結果、各サブユニットは、そのホモおよびヘテロ六量体における動力学的特性に関して、独立に作用することが示唆された。 29 mMのアンモニア培地の中での240分間の誘導時間を通して、アミノ反応：脱アミノ反応活性比を、α：β-サブユニット比と較べると、これらの比の最大値の間に、予期せぬ相関関係が明らかになった（表３）。表３。クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）細胞における、アンモニア誘導期間中の、NADP-GDHのアミノ反応：脱アミノ反応活性比およびα-サブユニット：β-サブユニット比アミノ反応：脱アミノ反応比における最大値は、60分目に見られたが、この時、β-サブユニットが主要であったが、限定的な抗原ではなかった。一方、アミノ反応：脱アミノ反応比が最小のときには、α-サブユニットが主要であった。興味深いことに、両方のサブユニットが存在するときに、アミノ反応活性が最も高かったが、このことは、α-およびβ-サブユニットの組み合せによって形成されるヘテロ六量体の方が、ホモ六量体よりも高いアミノ反応活性をもち得ることが示唆している。精製α-ホモ六量体のアンモニアに対するK_mが、β-ホモ六量体よりもずっと低いことから、α-ホモ六量体が、２種のサブユニットからなるヘテロ六量体よりもずっと高いアミノ反応活性を有することが、以前から推定されていた（バスコームとシュミット（Bascomb and Schmidt）、1987）。実施例２−ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列決定成熟したサブユニットのアミノ末端配列決定。NADP-GDHの精製α-サブユニットの調製物の等量液（120 pmol）ならびに部分精製したNADP-GDHのα-サブユニット（80 pmol）およびβ-サブユニット（50 pmol）の調製物を、8％（w/v）トリス-トリシンSDS-PAGEで解析し、プラウら（Plough，M.，A.L．Jensen，V．Bar kholt［1989］Anal．Biochem．181:33-39）が説明しているところにしたがって、PVDFメンブレン（イモビロン-P^SQ（Immobilon-P^SQ）、ミリポア社（Millipore ））に電気ブロットした。インビトロでの蛋白質のアミノ末端残基のアシル化を防ぐために、PAGEで用いるポリアクリルアミド溶液はすべて、アクリル酸の混入を除去するために、AG501-X8混合ベッドレジンで処理した。アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems,Inc.）のモデル470A気相シークエンサーを、自動エドマン分解アミノ酸配列解析に用いた。RP-HPLCによって、PTH-aa誘導体を同定した。電気ブロットした蛋白質の蛋白質配列解析は、フロリダ大学のバイオテクノロジー研究学際センターの蛋白質化学コア施設によって提供された。次のN-末端配列は、α-サブユニットについて決定されたものである：AVSLEEQ ISAMDATTGDFTA（配列番号：５）。次のN-末端配列は、β-サブユニットについて決定されたものである：DATTGDFTAL（配列番号：６）。これらの配列は、２つの NADP-GDHのcDNAで同定されたORFと一致しており、クロロプラストを標的とするペプチド配列を除去するために利用される内部の切断部位の位置を示している。クロロプラストを標的とするペプチド配列（またはクロロプラストトランジットペプチド）は、これらのアミノ酸配列、および他のアミノ酸配列とともに、細胞分画へ局在させるために有用でありうる。クロロプラストトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチドは、クロロプラストトランジットペプチドをコードするために、別のポリヌクレオチドに用いることができる。 cDNA 単離と配列決定。-70℃で貯蔵されているクロレラ・ソロキニアナ（C．so rokiniana）の沈澱物を、RNA破砕バッファー：0.1 M Tris(pH 8.5)、0.4 M LiCl 、10mM EGTA、5 mM EDTA、100 ユニット/mLのヘパリンナトリウム（シグマ社（S igma）、100ユニット/mg）、および1 mMのアウリントリカルボン酸（aurintrica rboxylic acid）（シグマ社（Sigma））で、１から10（w/v）倍に懸濁した。細胞懸濁液を、7000 gで５分間、４℃で遠心分離して、上清を捨てた。細胞沈澱を、１から10（w/v）倍のRNA用破砕バッファーで再懸濁してから、20,000 psiでフレンチプレスセルに通して破砕した。細胞のホモジネートを、0.05倍容量の20％ SDS、0.05倍容量の0.5 M EDTA(PH 8)、200μg/mLのプロテイナーゼKが入った使い捨ての50 mLコニカルチューブに集めて、室温で15分間インキュベートした。T Eバッファー（Tris 10 mM: EDTA 1mM，pH 8.0）で平衡化した半分量のフェノールをホモジネートに加えて、３分間インキュベートした後、半分量のクロロフォルム：イソアミルアルコール（24:1，v/v）を加えて、10分間振盪機（wrist act ion shaker）で混合した。抽出されたホモジネートを、30 mLのシリコン処理した遠心管に移して、1000 gで10分間、４℃で遠心した。上部の水層を除いてから、等量のクロロフォルム：イソアミルアルコール（24:1，v/v）による上述の抽出を、水層の界面がきれいになるまで繰り返した。最後に抽出した後、水層を、等量の2×LiCl-尿素バッファー（4 M LiCl，4 M 尿素，2 mM EDTA，1 mMアウリントリカルボン酸（aurintricarboxylic acid）（シグマ社（Sigma））と混合し、16 時間４℃で氷上で、RNAを沈澱させた。RNA沈澱を、4000 gで20分間、４℃で遠心して、その結果できた沈澱を、1×LiCl-尿素バッファーで洗浄して、再び、RNA を沈澱させるために遠心分離した。このRNAの沈澱をTE（PH7.5）で可溶化して、等量液を260 nmで分光光度計によって定量した。定量後、オリゴ(dT)スピンカラムキットを用いて、全細胞RNAからmRNA画分を単離した。各調製物からのポリ(A) +RNA（50μg）を、市販製品の注文によるλユニザップXR（λUni-ZAP XR）クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）cDNAライブラリー（ストラタジーンクローニングシステムズ社（Stratagene Cloning Systems）、カリフォルニア州パロアルト）に組み合わせて、利用した。 2×10¹⁰pfu/mLを含む、増幅されたλザップ（λZAP）ライブラリーを、全部で 1×10⁶pfuスクリーニングするために、プレート毎に50,000 pfuの密度で150 mm のペトリ皿に塗布した。ファージプラークを、バイボンド-N（Hybond-N）の132 mmの円形のメンブレンに複写するために吸着させ、アマーシャム社（Amersham）のプラークブロッティング用プロトコール（1985，Amersham International plc ，Arlington Heights，IL）にしたがって処理した。メンブレンは、200 mLの2× ピペス（PIPES）（0.8 M NaCl，20 mM PIPES，pH 6.5)、50％（w/v）ホルムアミド、0.5％（w/v）SDS、100μg/mLの変性、せん断されたサケの精子DNAを入れた普通の容器の中で、40℃でプレハイブリダイズさせた。ブロックされたメンブレンは、10個の熱でシールできるバッグ（１つのバッグ中に、メンブレン４枚）の中に、1×10⁶cpm/メンブレンの³²P標識したNADP-GDHの242 bpのHCR cDNAプローブを含むプレハイブリダイゼーションバッファーを入れて、振とう器上で42℃でハイブリッド形成させた。200 mLの0.1×SSC、0.1％（w/v）SDSで、１回の洗浄あたり50℃で20分間、メンブレンを３回洗浄した。複写したメンブレンをプラスチック製のラップで包み、-70℃で28時間、コダック社（Kodak）のX-Omat ARフィルムに感光させた。複写したメンブレン上で検出されたNADP-GDH cDNAと推定されるプラークを、プレートから抜き取って、242 bpの保存領域プローブによる２次スクリーニングおよび３次スクリーニングによってプラーク精製した。１次スクリーニングで選択された、NADP-GDH cDNAと推定されるファージクローンを、5' 末端が最も完全なNADP-GDH cDNAクローンの5'末端から単離した、³²P標識した13 0 bpのEco RI/Bgl II cDNA断片と組み合わせて２次スクリーニングした。プラーク精製した10個のNADP-GDHクローンを、ピーブルースクリプトKS+（pBluescript KS+）（ストラタジーン社（Stratagene））にサブクローニングし、ストラタジーン社（Stratagene）から提供されたインビボ切り出しプロトコールによって、大腸菌DH5αF'（E．coli DH5αF'）（ベセスダリサーチラボラトリーズBRL（Bet hesda Research Laboratories，BRL））に形質転換した。プラスミド単離はすべて、クラフトら（Kraft）（Kraft，R.，J．Tardiff，K.S．Krauter，L.A．Leinw and［1988］Biotechniques 6:544-547）によって説明されているところに従って行われた。配列解析によって、10個のクローンはすべて、3'末端が一致しており、5'末端側での欠失の程度はさまざまに異なることが明らかになった。pBGDc53 と名付けられた、完全な3'末端を有する最も長いcDNAクローン（配列番号：７）は、どちらのサブユニットをコードするにも十分な長さではなかったので、RACE PCRによって、5'末端の配列を決定した。 NADP-GDH cDNAの5'末端の配列を、cDNAの末端を迅速に増幅するための改良アンカーPCR法（Frohman，M.A．[1990]，D.H．Gelford，J.J．Snincky，T．J．Whi te編、PCRプロトコールより、カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Academic Press）pp 28-38；Jain，R.，R.H．Gorner，J.J．Murtagh［199 2］Biotechniques 12:58-59）を用いてクローニングした。λザップ（λZAP）ライブラリーの合成に用いたポリ(A)+RNAの混合液を用いて、NADP-GDH mRNAの5'末端をクローニングした。100 ngのmRNA混合液を、NADP-GDH mRNAの保存領域とハイブリダイズするように設計した、10 ngの遺伝子特異的なプライマー（5'-CTCA AAGGCAAGGAACTTCATG-3'、配列番号：８）と結合させて、５分間加熱して、氷上で冷やした。供給業者のプロトコールにしたがって、スーパースクリプト（Supe rscript）（登録商標）逆転写酵素（BRL社）を用いて、第一鎖DNA合成を行った。逆転写反応を終えたら、37℃で20分間、95℃で５分間、１ユニットのリボヌクレアーゼH で処理し、さらに、クロロフォルム：イソアミルアルコール（24:1，v/v）で１回抽出した。ウルトラフリー-MC（Ultrafree-MC）濾過遠心チューブ（30,000 M Wでカットオフする。ミリポア社（Millipore））を通して2000 rpmで遠心して、余ったプライマーとdNTPを除去し、残った液を、サバントスピードバック（Sava nt Speedvac）で、10μlに濃縮した。第一鎖合成産物を、10μlのテーリング混合液（１×テーリングバッファー[プロメガ社（Promega Corp.）]、0.4 mM dATP ，10ユニットのターミナルデオキシトランスフェラーゼ）と混ぜて、37℃で10分間インキユベートした。反応混合液を、95℃で５分間加熱して、TE（PH 8）で0. 5 mLに希釈して、cDNAプールとして利用した。5μlのcDNAプール、5μlのベント（Vent）（登録商標）ポリメラーゼ10×バッファー（ニューイングランドバイオラブズ社（New England Biolabs））、200μMの各dNTP、25 pmolの遺伝子特異的なプライマー（配列番号：８）、5 pmolのポリ(dT)アダプタープライマー（5'-G GGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)₁₈-3'；配列番号：９）、0.2ユニットのパーフェクトマッチ（Perfectmatch）（登録商標）DNAポリメラーゼエンハンサー（ストラタジーン社（Stratagene））、および１ユニットのベント（Vent）（登録商標）ポリメラーゼ（NEB）の混合液50μLを、ジェインら（Jain）前掲にしたがって増幅した。ウルトラフリー-MC（Ultrafree-MC）ユニットによって、2,000 rpmで遠心して、PCR産物から余ったプライマーを除去して精製した。残留物を集めて、各段階について、遺伝子特異的な、新しいネスティドプライマー（それぞれ、5'-GGACGAGTACTGCACGC-3'、配列番号：10；5'-GATCTCGGTCAGCAGCTG-3'、配列番号：11）、およびアダプタープライマー（5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3' 、配列番号：12）を用いて、さらに２回増幅した。PCR増幅は、モデル480サーモサイクラー（パーキン-エルマーシータス社（Perkin-Elmer Cetus））を用いて行い、注文したオリゴヌクレオチドは全て、フロリダ大学のICBRのDNA合成施設によって合成された。標準的なPCR反応混合液は、100μlの反応容量中、10μlのベント（Vent）（登録商標）ポリメラーゼ10×バッファー、100μMの各dNTP、0. 4ユニットのパーフェクトマッチ（Perfectmatch）（登録商標）、50 pmolの各プライマー、１ユニットのベント（Vent）（登録商標）DNAポリメラーゼからなっていた。5'RACE-PCR産物は、ゲル精製し、pUC18のSma I部位にサブクローニングして、さらに特徴を調べるために、大腸菌DH5α（E．coli DH5α）に形質転換した。RACE-PCRによって、２つの5’cDNAクローンが同定されたが、これらは、以前同定されたpBGDc53クローンと重複し、pRGDc60（配列番号：13）と名付けられた一方のクローンには、4 2 ntの挿入が同定され、pRGDc61（配列番号：14）と名付けられた２つ目のcDNA にはこれが欠けている点で異なっていた。 RACE PCRポリリンカーを欠いているが、pRGDc60および61に相当する完全な5' 末端を有する、さらに別の２つのクローンを、上記の反応条件と、造伝子特異的なプライマー対（5'-CTTTCTGCTCGCCCTCTC-3'、配列番号：15、および上記の配列番号：11）を用いて、RT-PCR増幅によって、mRNAから構築した。この２つのPCR 産物を、ピーブルースクリプトSK+（pBluescript SK+）（ストラタジーン社（St ratagene））のSma I部位にクローニングして、さらに特徴を調べるために、大腸菌DH5α（E．coli DH5α）に形質転換した。42 ntの挿入を有するcDNAクローンをpGDc63（配列番号：16）と名付け、この挿入のないcDNAをpGDc64（配列番号：17）と名付けた。 pGDc63およびpGD64をEcoRI/ApaLIで制限酵素処理してから、この結果できた（それぞれ264bp、222bp）断片をゲル精製して、全長のNADP-GDH cDNAを構築した。ゲル精製した断片を、pBGDc53をApaLI/XhoIで制限酵素処理した断片を精製したものにライゲーションし、全長のライゲーション産物（配列番号：18；配列番号：19）をアガロースゲル精製して、次のPCR反応で使用した。大腸菌でのα-およびβ-ホモ六量体の発現。ゲル精製した産物（配列番号：18 ）を用いて、全長cDNAからクロロプラスト標的シグナルを除去し、特異的に、成熟したα-およびβ-サブユニットをコードするcDNAを回収するために、PCRによる突然変異誘発を行った。２つのプライマー対のセットが、α-およびβ-GDHサブユニット遺伝子を合成するために設計された。次のプライマーは、翻訳開始を可能にさせ、サブクローニングの目的で5'のNd e I部位を作出するために、プロセシングされた成熟α-NADP-GDHサブユニット（アラニン-41）のアミノ末端にメチオニンが付加されるように設計されたものである：5'-CATATGGCCGTCTCGCTGGAGGAG-3'（配列番号：20）。次の第二のプライマーは、鋳型DNAの3'末端のTAA終止コドンの20nt3'部位にハイブリダイズするように設計されたものである：5'-GTTGGATTGCCGGTGAGCC-3'（配列番号：21）。次のプライマーは、翻訳開始を可能にさせ、サブクローニングの目的で5'のNd e I部位を作出するために、プロセシングされた成熟β-サブユニット（アスパラギン酸-38）のアミノ末端にメチオニンが付加されるように設計されたものである：5'-CATATGGACGCCACCACCGGC-3'（配列番号：22）。PCR増幅において用いた第二の3'プライマーは、α-サブユニットの増幅に関して説明されている3'末端プライマー（配列番号：21）であった。 PCRのサイクル条件は、以下の通りである：95℃、50秒；64℃、１分；72℃、１分35秒（30サイクル）。プライマー、dNTP、ベント（Vent）ポリメラーゼ、およびその他の反応成分の濃度は、前述の通りである。1506 bpのα-NADP-GDHサブユニット遺伝子（配列番号：23）および1473 bpのβ-NADP-GDHサブユニット遺伝子（配列番号：25）のPCR産物をゲル精製し、精製した断片を、100μMのdATPおよびTaqポリメラーゼとともに、72℃で15分間インキュベートして、3'に突出したアデニンヌクレオチドを付加した。改変されたPCR産物を、PCRII T/Aクローニングベクター（インビトロジェン社（Invitrogen））にクローニングし、大腸菌のコンピテントセルに形質転換させた。挿入配列を有するクローンを、青白スクリーニングによって選択し、プラスミドを精製し、クローニングベクターの中で正しい方向に入ったものを選択するために、NdeI/BamHIで制限酵素消化した。選択されたプラスミドを、NdeIとBamHIで制限酵素消化して（BamHI部位は、ベクターによって提供された）、NdeI/BamHIで直鎖化された、バクテリア発現ベクター pET11aおよびpET15b（ノバジェン社（Novagen））のIPTGで誘導できるT7ポリメラーゼのプロモーターの制御下で、方向性を持たせてクローニングし、DH5αに形質転換した。形質転換体を、NdeI/BamHI制限酵素解析によってスクリーニングして、適正な方向に入ったα-およびβ-サブユニットcDNA（配列番号：23；配列番号：25）を有するクローンを選択し、プラスミド精製して、蛋白質を発現させる目的で大腸菌のBL21(DE3)の中に形質転換した。 pET11a-α-cDNAおよびpET11a-β-cDNA構築物で形質転換された大腸菌BL21(DE3 )細胞を、100 mM IPTGで１時間誘導した。誘導された細胞からの蛋白質抽出物を、NADP-GDH活性を見るための酵素解析によって試験し、変性した蛋白質をSDSゲル電気泳動によって解析し、クマシー染色によって可視化した。成熟したα-サブユニットcDNA（配列番号：23）およびβ-サブユニットcDNA（配列番号：25）によって発現された蛋白質は、配列番号：24（α-サブユニット）および配列番号：26（β-サブユニット）に示されたアミノ酸配列をもっている。組換えGDHサブユニットは、ウサギの抗クロレラNADP-GDH抗体との交叉反応性によって確認された。最大の誘導がかかるよう最適化されていない条件の下でも、α-およびβ-GDH cDNAを有する、IPTGで誘導された大腸菌は、誘導をかけないように制御されたものに比較して、NADP-GDHの活性が、それぞれ60倍および7,000倍の上昇を示した。動力学的特性および生化学的特性を明らかにするため、組換えα-およびβ-NA DP-GDHの解析が現在進行中である。クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）のクロロプラストGDHの活性酵素への過剰発現と組み立ては、PCRによって加工されたDNA構築物が転写され翻訳されて、真正の蛋白質となることの証拠となる。次に、前記の構築物を、遺伝子導入植物において、藻類のGDHをサイトゾルで発現させるために用いた。植物の形質転換。特異的なGDHの発現レベルが向上した、遺伝的に形質転換された植物を作出するための方法では、二本鎖の組換えDNA分子を、植物細胞の核ゲノムの中に導入する必要がある。このDNA分子は、(1)植物細胞の中に導入されているGDH酵素に対する構造遺伝子を含むこと、(2)植物において、RNAポリメラーゼ酵素によって、構成的または組織特異的にRNA配列が産生されるのを調節するように機能するプロモーターを有すること、および(3)転写終結が起き、また、RNAの3'端にポリアデニル化ヌクレオチドが付加されるよう機能する3'非翻訳領域を有することが必要である。この結果できた一次的なRNA分子は、引き続き、核の中でプロセシングされ、イントロンの配列を除去し、mRNAの3'端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加することを含む処理が行われる。本発明において、有用なプロモーターは、グルタミン酸の産生または異化が望ましい部位において、構成的にまたは組織特異的に転写を開始できるプロモーターである。構成的なプロモーターの有用な例は、組織に依存しない様式で、RNA の合成を誘発する、CmMVの強化された35Sプロモーターである。種子、茎、根、葉、またはこれらの組織中の特異的な細胞型で、特異的にGDHの産生をもたらすプロモーターが、本発明では有用である。例えば、種子特異的なファセオリン（Ph aseolin）プロモーターは、このような組織特異的なプロモーターの一つである。このように、構成的／組織特異的な態様で機能することが分かっている別種の生物に由来する異種性のプロモーターと同様に、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、およびイネの天然のプロモーターを得て、本発明で用いることができる。イントロン。一般的に、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に、イントロン配列が挿入されると、単子葉植物において最適な発現が得られる。このようなイントロン配列の例は、WO 93/19189で説明されているHSP70のイントロンである。ポリアデニル化シグナル。本発明に係るDNA構築物は、RNAの3'端にポリアデニル化ヌクレオチドが付加されるように機能する3'非翻訳領域を有することができる。適当な3'非翻訳領域の例は、アグロバクテリウム腫瘍を誘導するプラスミド、すなわち、ノパリン合成酵素（NOS）遺伝子のポリアデニル化シグナルである。プラスチドを標的とする配列。本発明に係るDNA構築物は、選択的に、プラスチドを標的とする配列を有することができる。プラスチドを標的とする配列は、プラスチドへの蛋白質の輸送を司り、輸送の間に除去される。プラスチドを標的とする配列は、前駆体蛋白質をコードする、クロレラ・ソロキニアナ（C．sorok iniana）のNADP-GDHの全長cDNAで同定されたクロロプラストを標的とする天然のペプチド（CTP）でもよいが、それに制限されない。選択されたプラスチドを標的とする配列と、成熟したα-およびβ-NADP-GDHのサブユニットの配列との融合は、標準的方法を用いて行うことができ、本発明において使用することができる。これらの標的配列を欠いたGDHサブユニットは、細胞の細胞質で典型的に見られる。このように、サイトゾルに局在する酵素は、細胞のサイトゾルの中で、分画を形成するアンモニア、またはグルタミン酸を捕捉する上で有用かもしれない。 GDH 遺伝子源。本発明に係るDNA構築において用いられるGDH遺伝子は、どのGDH 遺伝子であってもよい。上述した、クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）のGDH遺伝子は、好ましいが、これに制限されない。例えば、細菌、または真菌由来のGDH遺伝子を用いることができる。提供された実施例では、クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）のα-およびβ-GDH遺伝子を用いているが、いかなる意味でも、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。当業者は、本発明の意図と範囲とから逸脱することなく、本明細書において説明されている遺伝子および方法に対して、変更はもちろんのこと、さまざまな別の遺伝子を作製することができることを認識すると思われる。例えば、補助因子のNADPHによる制御を受けない突然変異体を作出するために、当技術分野において周知の技術によって、突然変異誘発と通常のスクリーニングを行うことができる。トウモロコシのプロトプラストにおける一過性発現。クロレラ・ソロキニアナ（C.sorokiniana）のGDHサブユニットの発現およびトウモロコシ細胞におけるそれらの活性酵素への組立を試験するために、CaMV E35Sプロモーター、成熟した α-サブユニット（pMON21904）、またはβ-サブユニット（pMON21905）をコードする配列、NOS3'の非翻訳ポリアデニル化領域、および大腸菌の選択に対しカナマイシン抵抗性を有するように、ベクターを構築した。α-およびβ-サブユニットの遺伝子は、それぞれ、pET11a-α-cDNAおよびpET11a-β-cDNAに由来するXbaI -EcoRI断片として単離された。pMON21904とpMON21905を作出するために、pMON22 072のXbaI-EcoRI E35Sプロモーター、NOS3'、カナマイシン抵抗性を担う領域中に、GDH遺伝子をライゲーションした。シーンら（Sheen）（植物細胞、第３巻、 225-245）の方法にしたがって、トウモロコシおよびコムギのプロトプラストの中に、DNA構築物をエレクトロポレーションした。形質転換されたトウモロコシのプロトプラストの解析。pMON21904（α-サブユニット）、pMON21905（β-サブユニット）、pMON21709（カナマイシン陰性対照D NA）、およびDNAがないものを、0.2 mLのGDH細胞破砕バッファー（ヨーンら（Ye ung）前掲）の中で、氷上で融解した。各懸濁液中の細胞を、30秒ずつ２回破砕して、氷上で冷し、14,000 rpmで10分間遠心して清澄化した。（ヨーンら（Yeun g）前掲にしたがって、細胞抽出物を、38.5℃で、脱アミノ反応の方向に測定した。製造業者のプロトコールにしたがって、バイオラド社(BioRad)の微量蛋白質測定法を用いて、細胞抽出物の全蛋白質含量を決定した。異なった調製物の間で比較するために、全蛋白質含量に対して、活性を平均化した。１ユニットのGDH 活性は、38.5℃で１分間当たり１μmolのNADPを還元するのに必要な酵素の量と定義されている。対照用ベクターのpMON21709（n=3）で形質転換されたプロトプラスト、または形質転換されていないプロトプラスト（n=3）は、検出可能なほどのNADP-GDH活性を持っていなかった。pMON21904（n=3）で形質転換されたプロトプラストは、 3.31ユニットmg-1蛋白質のGDH活性を発現したのに対し、pMON21905で形質転換されたプロトプラスト（n=3）は、1.96ユニットmg-1蛋白質のGDH活性を発現した。細胞質で発現されるクロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）のα-および β-NADP-GDH遺伝子で形質転換されたプロトプラストで観察された高レベルの活性は、GDHサブユニットが、異種の植物システムで発現されている証拠を提供している。さらに、発現レベルは、サブユニットが活性のある酵素に組み立てられることを示している。一般的に、説明された配列に付加された余計な配列、または本明細書で説明されている塩基配列、もしくはアミノ酸配列の断片は、特に本明細書で説明された配列と類似した、もしくは同等の機能を果たす、ポリヌクレオチド、またはアミノ酸配列となるので、本発明の一部とみなされるべきであることも、当業者には明らかであると思われる。これらは、当技術分野において周知の技術、例えば、時間を制御した、全長DNAの、Bal31エキソヌクレアーゼによる消化を行った後、この結果できた断片を発現させ、上記の実施例で説明されているようにして、発現産物を日常的にスクリーニングすれば、容易に、また、日常的に産生することができる。さらに、説明された配列の機能、特性、または有用性は、標準的な技術および処理手順によって、配列の中に突然変異を挿入することによって、無効にすることができることも、当業者には、容易に認識されると思われる。説明されたように、配列に固有の特性または機能を打ち消すのに効果的に役立つことが暗に示されいる、これらの突然変異は、明らかに本発明の一部として含まれる。例えば、クロレラ・ソロキニアナ（C．sorokiniana）のα- およびβ-サブユニットの間の明確な違いは、α-サブユニットにはN-末端の11アミノ酸のポリペプチド配列があるが、β-サブユニットにはないという点である。この配列が、アンモニア化合物の親和性、特異性、および酵素による改変に影響を与えうる。したがって、別のGDH遺伝子、またはその産物の一定の特徴の違いに影響を与えるような、適正な配列、またはそれに機能的に等価な配列の挿入（もし、存在しなければ）、または除去（もし、存在すれば）を容易に実行できることは当業者には明らかである。また、本明細書に記載されている実施例および態様は、例示目的のためだけのものであり、それらに照らせば、当業者にはさまざまな改変または変更が示唆され、またそれらも、本出願の目的および範囲、ならびに添付の請求の範囲に含まれると理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：24、および配列番号：26からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。２．配列番号：１、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22、配列番号：23、および配列番号：25 からなる群より選択される塩基配列、またはその断片もしくは変異配列を含むポリヌクレオチド。３．配列番号：１、配列番号：３、配列番号：23、および配列番号：25に示されている塩基配列からなる群より選択される塩基配列、またはその断片もしくは変異配列を含む、請求項２記載のポリヌクレオチド。４．植物細胞で発現することができるキメラ遺伝子で、ポリヌクレオチドに機能的に結合されている、植物で発現可能なプロモーターを含むキメラ遺伝子を形成する、請求項２記載のポリヌクレオチド。５．植物のポリアデニル化配列に機能的に結合されている、請求項２記載のポリヌクレオチド。６．NADP-GDHのα-サブユニットをコードする少なくとも一つの塩基配列と、NAD P-GDHのβ-サブユニットをコードする少なくとも一つの塩基配列とを含む、請求項２記載のポリヌクレオチド。７．NADP-GDHのα-サブユニットおよびNADP-GDHのβ-サブユニットをコードするポリヌクレオチドに対するプロモーターをさらに含む、請求項６記載のポリヌクレオチド。８．α-サブユニットおよびβ-サブユニットに対するプロモーターが異なる、請求項７記載のポリヌクレオチド。９．プロモーターが、α-およびβ-サブユニットに対して特異的な活性を有する、請求項７記載のポリヌクレオチド。１０．配列番号：１および配列番号：23からなる群より選択される塩基配列と、配列番号：３および配列番号：25からなる群より選択される塩基配列とを含む、請求項６記載のポリヌクレオチド。１１．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：24、および配列番号：26からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列をコードするポリヌクレオチドを含む、形質転換された宿主細胞。１２．ポリヌクレオチドが、配列番号：２および配列番号：24からなる群より選択されるアミノ酸配列と、配列番号：４および配列番号：26からなる群より選択されるアミノ酸配列とをコードする、請求項１１記載の形質転換された宿主細胞。１３．ポリヌクレオチドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：23、および配列番号：25に示されている塩基配列からなる群より選択される塩基配列を含む、請求項１１記載の形質転換された宿主細胞。１４．配列番号：１および配列番号：23からなる群より選択される塩基配列と、配列番号：３および配列番号：25からなる群より選択される塩基配列とを含む、請求項１３記載の形質転換された宿主細胞。１５．配列番号：１、配列番号：３、配列番号：23、および配列番号：25からなる群より選択される塩基配列、またはその断片もしくは変異配列を有するポリヌクレオチドを含むように植物細胞を形質転換することを含む、植物細胞における窒素代謝を改変するための方法。１６．ポリヌクレオチドが、少なくとも一つのNADP-GDHのα-サブユニットをコードする塩基配列と、少なくとも一つのNADP-GDHのβ-サブユニットをコードする塩基配列とを有する、請求項１５記載の方法。１７．ポリヌクレオチドが、配列番号：１および配列番号：23からなる群より選択される塩基配列と、配列番号：３および配列番号：25からなる群より選択される塩基配列とを含む、請求項１６記載の方法。１８．窒素改変が、無機窒素の有機窒素への同化を向上させることを含む、請求項１５記載の方法。１９．ポリヌクレオチドが、植物で発現可能なプロモーターに機能的に結合されている、請求項１５記載の方法。２０．ポリヌクレオチドが、植物のポリアデニル化配列に機能的に結合されている、請求項１５記載の方法。２１．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：24、および配列番号：26からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列をコードするポリヌクレオチドを、植物において発現させることを含む、植物の特性を改変するための方法。２２．ポリヌクレオチドが、配列番号：２および配列番号：24からなる群より選択されるアミノ酸配列と、配列番号：４および配列番号：26からなる群より選択されるアミノ酸配列とを含むポリペプチドをコードする、請求項２１記載の方法。２３．改変が、作物の収量を増加させること、アンモニア同化を改変すること、浸透圧ストレス耐性を改変すること、または植物の組成を改変することを含む、請求項２１記載の方法。２４．配列番号：５および配列番号：６からなる群より選択される、NADP-GDH六量体のサブユニットのアミノ末端配列を用いることを含む、NADP-GDH六量体の動力学的特性を有するGDHを発現させるための方法。２５．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号： 24、および配列番号：26からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列を含むポリペプチド。２６．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：24、および配列番号：26からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列を含む、請求項２５記載のポリペプチド。２７．配列番号：２のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列を含む、請求項２６記載のポリペプチド。２８．配列番号：４のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列を含む、請求項２６記載のポリペプチド。２９．配列番号：24のアミノ酸配列を含む、請求項２６記載のポリペプチド。３０．配列番号：26のアミノ酸配列を含む、請求項２６記載のポリペプチド。３１．配列番号：５および配列番号：６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ベータ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸-グルタミン酸デヒドロケナーゼのサブユニットのアミノ末端を形成する、請求項２５記載のポリペプチド。３２．ポリヌクレオチドが、少なくとも一つのNADP-GDHのα-サブユニットと、少なくとも一つのNADP-GDHのβ-サブユニットとを有する、複数のサブユニットを含むポリペプチド。３３．α-サブユニットが、配列番号：２および配列番号：24からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列を有するポリペプチドを含む、請求項３２記載のポリペプチド。３４．β-サブユニットが、配列番号：４および配列番号：26からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項３２記載のポリペプチド。３５．ヘテロ六量体である、請求項３２記載のポリペプチド。３６．少なくとも２個のβ-サブユニットを含む、請求項３５記載のポリペプチド。３７．２〜５個のβ-サブユニットを含む、請求項３６記載のポリペプチド。３８．３個のβ-サブユニットを含む、請求項３７記載のポリペプチド。３９．配列番号：２および配列番号：４からなる群より選択されるアミノ末端配列を含むアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異配列を有する、クロロプラストトランジットペプチド。４０．塩基配列が、配列番号：１および配列番号：３から選択される5'末端配列を含む、クロロプラストトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。