JPS5920360B2 - ７−アミノセフアロスポラン酸および其の誘導体の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は７−アミノセファロスポラン酸および其の誘導
体の新規な製造法に関する。

さらに詳しくは、一般式 （式中Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、アセトキシル基
または求核性残基を示す）で表わされるセファロスポリ
ン誘導体および其の塩を水性媒体中で、バチルス属に属
する一菌株ＣＡ−７８又はアースロバフタ−属に属する
一菌株ＣＡ−２１８菌体または其の修飾体と接触させる
か、もしくは当該菌体から抽出した酵素または其の修飾
体と接触させることによる一般式 （式中、Ｒは前記と同じ基を示す）で表わされる７−ア
ミノセファロスポラン酸および其の誘導体もしくはそれ
らの塩の製造法に関する。

７−アミノセファロスポラン酸は、従来セファロスポリ
ンＣから化学的に脱アシル化され（英国％許１，０４１
，９８５ ）、更に別のアシル基と再アシル化すること
により種々の抗菌性物質を提供することのできる重要な
中間体である。

又、さらに７−アミノセファロスポラン酸の３位を各種
修飾することにより優れた抗菌性物質の中間体を提供す
ることが出来る。

一般式（１）のＲが水素原子である７−アミノ−３−メ
チルセファロスポラン酸は、セファレキシンの中間体と
して重要なものであり、このものはぺニジリン類の化学
的な環拡大により提供されるが、セファロスポリンＣ生
産菌の変異株により生産されるデスアセトキシセファロ
スポリンＣから化学的に脱アシル化して製造することも
出来る。

しかしながら酵素的手段により、セファロスポリンＣま
たはデスアセトキシセファロスポリンＣを脱アシル化す
る試みは、そのアシル基がＤ−α−アミノアジピル基で
あることから困難とされ、成功例はみられない。

本発明者らは、さきに与論島で採取した土壌中より分離
したグリオクラディウム属に属するＧＫ−３４０株（特
開出願５Ｏ−１４７４６７）が、またＩＦＯ−６６１７
（特開出願５０−１１３６０８ 。

が、Ｄ−α−アミノアジピル基を酸化的膜アミン化して
５′−ケトアジピル基に変換し、さら（こカタラーゼが
存在しない条件下でグリタリル基に変換することを見出
し、酵素的脱アシル化のために重要な中間体の製造法を
確立した。

要するに、セファロスポリンＣにグリオクラティラム属
が生産する酸化的膜アミン酵素を接触させることにより
、３−アセトキシメチル−７−（５−カルボキシ−５−
オキソペンタンアミド）セフ−３−エムー４−カルボン
酸を生成し、またカタラーゼ不在条件では３−アセトキ
シメチル−７−（４−カルボキシブタンアミド）セフ−
３−エムー４−カルボン酸を生成する知見を得たのであ
る。

本発明者らは、さきに得ていたこれらの知見に基く中間
体の中、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼによる最終生成物（
こ相当するグルタリルアミドセファロスポラン酸、即ち
３−アセトキシメチル−７−（４−カルボキシブタンア
ミド）セフ−３−エムー４−カルボン酸を酵素的（こ脱
アシル化し、 ７−アミンセファロスポラン酸または
其の誘導体を製造する目的で研究を進めた結果、福井県
東尋坊の土壌より分離したバチルス属（こ属する一菌株
（ＣＡ−７８）と大阪府豊中市の土壌より分離したアー
スロバフタ−属（こ属する一菌株（ＣＡ−２１８）が、
一般式（ＩＩ）で表わされる化合物を脱アシル化して、
７−アミノセファロスポラン酸およびその誘導体を生成
するアシラーゼ作用のあることを見出し、この発明をす
る（こ至った。

これら土壌分離株の菌学的性状は次の通りである。

上記の菌学的性質を有するＣＡ−７８菌株およびＣＡ−
２１８菌株について、分類学上の位置をザ・ジエナラ・
オブ・バクテリア（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ−ｒａ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉａ）第２版および、バーシーズ・マニ
ュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー第
８版を参照し、更（こ本菌株の近縁と認められるタイプ
カルチャーと比較検討した結果、種々の形態的および生
理的特性から、ＣＡ−７８菌株はバチルス・ファーマス
（Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）種と近縁で
あることがわかった。

しかしながら、本菌株ＣＡ−７８はカタラーゼの生成か
なく、硫化水素の生成があり、８％食塩に耐性であるこ
と、および一般式（ｎ）で表わされる化合物の酸アミド
結合を開裂する能力を有する点でバチルス°ファーマス
ＩＦＯ−３３３０とは差異力ある。

以上の結果から本菌種はバチルス・ファーマスに属する
新菌種と同定し、バチルス・ファーマスＣＡ−７８の名
称を与えた。

又ＣＡ−２１８菌株はアースロバフタ−・り狛ビフオー
ミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍ
ｉｓ）種と近縁であることがわかった。

しかしながら本菌株ＣＡ−２１８は一般式（ＩＩ）で表
イつされる化合物の酸アミド結合を開裂する能力を有す
る点でアースロバフタ−・グロビフオーミスＩＦＯ−３
０６２とは差異がある。

以上の結果から本菌種はアースロバフタ−・グロビフオ
ーミスに属する新菌種と同定し、アースロバフタ−・グ
ロビフオーミスＣＡ−２１８の名称を与えた。

尚、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に、微生
物受託番号「微工研菌寄第３４６６号Ｊ（ＣＡ−７８）
、［微工研菌寄第３４６７号Ｊ（ＣＡ−２１８）として
、寄託されている。

本菌株が生産する、一般式（ＩＩ）で表わされる化合物
の酸アミド結合を分解する酵素は、２菌株とも菌体内に
存在する。

従って酵素を利用するには、培養後のブースを遠心分離
して集菌するか、高分子凝集剤を加え濾過助剤（ダイカ
ライド等）の併用によりｆ別するか、もしくは固定化酵
素型に導く。

また超音波処理、細胞膜の化学変性処理などをこより、
酵素を抽出可溶化してから公知の利用型に導くことも出
来る。

これらの酵素生産菌株を培養するには、好気的条件が望
ましく液体通気培養が通例性なわれる。

培地組成としては通常のバクテリア用培地成分、例えば
窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、落花生
釉、綿実粕など、炭素源としてグルコース、グリセリン
、醋酸ナトリウム、糖蜜なと、無機塩類として食塩、塩
化第二鉄、燐酸塩、生育促進物質としてビオチン、パン
トテン酸カルシウム、ニコチン酸アミドなどを適宜含有
する栄養培地が使用される。

また、界面活性剤（ノニポール１００、アデカノールＬ
Ｇ−１２６など）、グルタル酸を培地に加えて酵素活性
を高めることが出来る。

望ましい培養条件としてはｐＨ７，５〜８．５、温度２
５〜３５℃、時間は通常２日〜５日間であるが、アシラ
ーゼ活性が最大を示す時点に培養を終了する０ アシラーゼ活性の測定 「アシラーゼ活性は、便宜上つぎのよう（こ定義した。

即ち、培養プロセスと同じ濃度の一定量の菌体が、１時
間当り１μｍｏｌｅの基質を脱アシル化し相当する７−
アミノセファロスポラン酸もしくはその誘導体を生産す
る能力を１単位とする。

実際Ｏこは、培養物の一定量を遠沈して集菌し、基質と
して３−アセトキシメチル−７−（４−カルボキシブタ
ンアミド）セフ−３−エムー４−カルボン酸を５■／−
含有する０、２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）に懸濁させ
、３７℃で１時間インキュベートした後、生成した７−
アミノセファロスポラン酸をマレリ法”（Ｍａｒｒｅｌ
ｌｉ）で測定した。

具体的（こは、インキュベート後に遠沈し其の上澄液２
ｒＩｌｌをとり、Ｏ，ｌ ｒｎｌの蟻酸と１−の２係ク
エン酸の０．８Ｎカセイソーダ醇液および０．５ ｒｎ
ｌの５％ニンヒドリンのメチルセロソルブ溶液を加え呈
色させた後、４１０ｎｍの吸光度を測定する。

７−アミノセファロスポラン酸量は、別に求めた検量線
より算出する。

」培養の停止は、培養中に上記の方法（こよりアシラー
ゼ活性を測定し最もアシラーゼ活性の高い時点で停止す
るのが好ましい。

このようにして得られた培養物は、そのまま若しくは通
常の手段により集菌する。

こＩ菌体は、何らかの処理を施すことなく基質との接触
により基質を脱アシル化することが出来、また集菌体を
一２０℃で凍結することにより長時間の保存に耐える。

更には菌体をアクリルアミドゲル内に固定化することに
より酵素の反覆利用を意図することも出来、あるいは細
胞内より酵素を通常の手段により抽出して使用できる。

このように調整された菌体、固定化菌体、抽出固定化酵
素などを用い所望の反応をさせる（こは、通常、水性媒
体中で行なわれる。

ここで言う水性媒体とは、一般式（ｎ）で表わされる化
合物の基質を適当な緩衝液に溶解したもの、若しくはセ
ファロスポリン類の培養ブロスにＤ−アミノ酸オキシダ
ーゼを作用させ不隘性物質を除去した一般式（ｎ）で表
わされる化合物を生成した反応液を示す。

アシラーゼ反応液のｐＨは６．５〜８．５で行なわれる
が、好ましくはｐＨ７，５〜８．０を維持するように反
応させる。

反応温度は２０〜４０℃で行なうことができるが、好ま
しくは３５〜３７℃で行なわれる。

酵素使用量は、アシラーゼ活性により左右されるが、一
般（こ其の利用型式に関係なく培養ブロスと同じ濃度な
いし２〜３倍量の濃度を基準とする。

基質の量もアシラーゼ活性により決定されるが通常ｏ、
ｉ〜３％、反応時間は２〜ＩＯ時間である。

一般式（ｎ）で表わされる化合物は、セファロスポリン
Ｃおよびその３位の修飾化合物（こＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼを作用させることにより製造される。

このＤ−アミノ酸オキシダーゼは、さきに本発明者らが
グリオクラディウム属に属する菌株に存在することを見
出し発明を完成した（特開出願番号５Ｏ−１４７４６７
）。

一般式帽）で表わされる化合物のＲ１が Ｃ０Ｃ０ＯＨである化合物は、セファロスポリンＣを含
有する水性媒体中でグリオクラディウム属に属する菌株
ＧＫ−３４０またはＩＦＯ−６６１７の生産酵素と、ｐ
Ｈ７，５〜８．０、好気的条件下で接触することにより
製造される。

また、Ｒ□が（”’ＯＯＨである化合物は、セファロス
ポリンＣを含有する水性媒体中で前記グリオクラディウ
ム属に属する菌株とカタラーゼ阻害剤（例えばアジ化ナ
トリウム、アスコルビン酸）の存在下で好気的に接触す
ることをこより製造されるか、もしくはグリオクラディ
ウム属に属する菌株のカタラーゼを予め失活させた菌と
好気的Ｑこ接触させること（こより、製造される。

ここで言うセファロスポリンＣを含有する水性媒体とは
、具体的にはセファロスポリンＣを適当な緩衝液に溶解
したもの、若しくはセファロスポリンＣの培養ブロス（
反応阻害物質の除去処理済）を示す。

生成した一般式（ｎ）の化合物はオキシダーゼ反応の系
から単離することなく、バチルス属またはアースロバフ
タ−属に属する菌株が生産する酵素と接触させ、７−ア
ミノセファロスポラン酸もしくは７−アミノセファロス
ポラン酸の３位誘導体を得ることが出来る。

上記アシラーゼ反応系から７−アミノセファロスポラン
酸および其の誘導体を単離するためには、等電点沈澱法
、カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂法などに
よる既知の方法によって単離される。

さらに詳しくは反応液から菌体もしくは不溶性物質を遠
心分離またはｆ過により除去した後その上澄液を必要な
らば濃縮し、その後その濃縮液ｐＨを７−アミノセファ
ロスポラン酸およびその誘導体が有する固有の等電点に
すれば、目的とする７−アミノセファロスポラン酸およ
び其の誘導体が結晶として析出する。

あるいは遠沈上澄液のｐＨを６．０から６．５に修正し
、陰イオン交換樹脂（例えばアンバーライトＩＲＡ−４
０１、ダイヤイオンＰＡ−３０６、ダイヤイオン５Ａ−
２０などの醋酸型〕に吸着させ、適当な溶出剤（例えば
塩化アンモニウム、醋酸アンモニウムなど）で鼎出させ
、その溶出液を必要ならば濃縮し、固有の等電点にする
ことによって結晶として析出させることが出来る。

次に実施例によって本発明を具体的に説明するが、これ
により本発明を限定するものではない。

実施例 １ グルコース１％、醋酸ナトリウム２％、綿実粕１．６％
、食塩０．５％、Ｋ２ＨＰ０，０．３％、ＫＣｌ０１０
５％、ＦｅＣｌ３”６Ｈ２００，０５％からなる組成の
培地６０ｍ７１！を５００ｒｎｌフラスコ５本に分注し
、１１５℃で３０分滅菌後、ｐＨ７，４＆こ修正し、ア
ースロバクターＣＡ−２１８菌株を接種、２８℃で５日
間振盪培養を行なった。

培養後、その培養液３００ｍＡを５．００ Ｏｒ、 ｐ
、 ｒｎで遠心分離し、菌体懸濁液３５ｍ７！！を得た
。

この懸濁液の酵素活性は０．３０７単位であった。

３−アセトキシメチル−７−（４−カルボキシブタンア
ミド）セフ−３−エム−４−カルボン酸２３５■を０．
２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）３５−に醇解し、上記の
酵素液３５ｒｎｌを加え、３７℃で１０時間インキュベ
ートを行なった。

反応後、その反応液を７．００ Ｏｒ、 ｐ、 ｍで遠
心分離して不溶物を除き、上澄液の７−アミノセファロ
スポラン酸量をマレリ法＊で測定したところ１０３■（
６２％）であった。

この上澄液を強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライ１
−ＩＲＡ−４０１の醋酸タイプ３０ｒｎｌカラムＯこ５
Ｖ−３で通液して７−アミノセファロスポラン酸を吸着
させ、次いで蒸溜水２００ｍ１で水洗後、０．２Ｍｕ化
アンモニウム尋液で磐出した。

啓出液４０ｍ１を集めて１０ｒｒ１１まで濃縮した。

その濃縮液はｐＨ３，７とし生じた沈澱を集めて減圧乾
燥し、７−アミノセファロスポラン酸８７．３■（収率
５２．７％）を得た。

このものをＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４（メ
ルク社製）を用い薄層クロマトグラフィーを行ない、ｎ
−ブタノール・醋酸・水（３：ｌ：ｌ）で展開後、ニン
ヒドリンおよび’［ＪＶ吸収（こよりスポットを確認し
た。

Ｒｆ値は０．３４であった。このＲｆ値は、標準品の７
−アミノセファロスポラン酸と一致した。

また、次のようにペーパークロマトグラフィーによるバ
イオオートグラフィーにより目的物の生成を確認した。

即ち、反応液の遠心上澄液を東洋Ｐ紙洟２にスポットし
て溶媒系：ｎ−ブタノール・醋酸・水（３：１：１）で
展開、フェニルアセチルクロライドのアセトン溶液を噴
霧して活性化後、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ６６３
３で微生物検定した。

このとき、基質の３−アセトキシメチル−７−（４−カ
ルボキシブタンアミド）セフ−３−エム−４−カルボン
酸のＲｆ値は０７５０．７−アミノセファロスポラン酸
のＲｆ値は０．５２５であった。

実施例 ２ ３−ヒドロキシメチル−７−（４−カルボキシブタンア
ミド）セフ−３−エムー４−カルボン酸１５０■を０．
２ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）２５−に溶解し、実施
例１と同じ培養方法で得たＣＡ−２１８菌株の菌体懸濁
液２５ｙｄと合わせ、３７℃で６時間インキュベートを
行なった。

反応後、その反応液を７，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で遠心分
離して小心物を除き、その上澄液をマレリ法＊で測定し
たところ４３．９〜（収率４４ ％ ）の３−ヒト加千
ジメチル−７−アミツセフー３−エム−４−カルボン酸
か生成した。

このものを実施例１と同じ方法でＴＬＣを行なったとこ
ろＲｆ値は０．２５であり標準品のＲｆ値と一致した。

実施例 ３ ３−メチル−７−（４−カルボキシブタンアミド）セフ
−３−エム−４−カルボン酸１５０■を０．２Ｍ燐酸緩
衝液（ｐＨ７，４） ２５−に酢解し、実施例１と同じ
培養方法で得たＣＡ−２１８菌株の菌体懸濁液２５ｍ１
．と合わせ、３７℃６時間インキュベートを行なった。

反応後、その反応液を７．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で遠心分
離して小心物を除き、その上澄液をマレリ法本で測定し
たところ４４ｍｇ（収率４５％）の３−メチル−７−ア
ミノセフ−３−エム−４−カルボン酸を生成した。

このものを実施例１と同じ方法でＴＬＣを行なったとこ
ろＲｆ値は０．３３であり標準品のＲｆ値と一致した。

実施例 ４ ７−（４−カルボキシブタンアミド）−３−（１，２，
３−トリアゾール−４−イルチオメチル）セフ−３−エ
ムー４−カルボン酸１５０ＷＩＩ！を０．２Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ７，４）２５ｙｄＧこ溶解し、実施例１と同じ
培養方法で得たＣＡ−２１８菌株の菌体懸濁液２５ｄと
合わせ、３７℃で６時間インキュベートを行なった。

反応後、その反応液を７．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で遠心分
離して不溶物を除き、その上澄液をマレリ法１で測定し
たところ４２．２■（収率３８．４％）の７−アミノ−
３−（Ｌ２，３−トリアゾール−４−イルチオメチル）
セフ−３−エムー４−カルボン酸を生成した。

このものを実施例１と同じ方法でＴＬＣを行なったとこ
ろ、Ｒｆ値は０．３７であり標準品のＲｆ値と一致した
。

実施例 ５ ７−（４−カルボキシブタンアミド）−３−（ｌ−カル
ボキシメチルテトラゾール−５〜イル−チオメチル）セ
フ−３−エムー４−カルボン酸１５０■を０．２Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７，４）２５−にｍ解し、実施例１と回じ
培養方法で得たＣＡ−２１８菌株の菌体懸濁液２５ｄと
合わせ、３７℃で６時間インキュベー１・を行なった。

反応後、その反応液を７．００ Ｏｒ、ｐ、ｍ、で遠心
分離して不溶物を除き、その上澄液をマレリ法本で測定
したところ５５．５■（収率４８．３％）の７−アミノ
−３−（１〜カルボキシメチルテトラゾール−５−イル
−チオメチル）セフ−３−エム−４−カルホン酸を生成
した。

このものを実施例１と同じ方法でＴ Ｌ Ｃを行なった
ところ、Ｒ，ｆ値は０．１７であり標準品のＲｆ値と一
致した。

実施例 ６ セファロスポリンＣの培養ブロスＩＡ（セファロスポリ
ンＣとして８７５ｖ含有）に、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を
含有するグリオクラディウム属に属するＧＫ−３４０菌
株の活性化された培養菌体の圧搾物８３７とアジ化ナト
リウム１．５７および３５％過酸化水素水４．２ｍｌを
加え、ｐｌｉを８．０〜８．３に維持しながら、３３℃
で通気下２時間反応させた。

反応後、反応液のｐＨを６，０に修正してｆ過し、３−
アセトキシメチル−７−（４−カルボキシブタンアミド
）セフ−３−エムー４−カルボン酸を含有するフロス１
．１５ｔを得た。

この反応ブロスは次に述べるＵ■測定法（こより３−ア
セトキシメチル−７−（４−カルボキシブタンアミド）
セフ−３−エム−４−カルボン酸６．１７ｆ（収率７６
楚）を含有することを認めた。

即ち、反応ブロス中の３−アセトキシメチル−７−（４
−カルボキシブタンアミド）セフ−３−エム−４−カル
ボン酸の含廿；は、一定量の反応ブロスを酸性で溶媒抽
出し、更にアルカリ性で水に逆転的させ、その水層のＵ
Ｖ吸収量を測定することによって求めた。

更（こ詳しくは、反応ブロス１−をとりｐＨ２，０に下
げた後、醋酸エチル８−で５分間振盪して抽出する。

その醋酸エチル層５ｒｎｌを採り、４Ｎ重曹溶液５ｒｎ
ｌを加え再び５分間振盪して重曹層に逆転的する。

その重曹浴液３ｒｎｌを採り２Ｎ塩酸１ｒｎｌを加え、
２６０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線から反応ブロス
中の３−アセトキシメチル−７−（４−カルボキシブタ
ンアミド）セフ−３−エムー４−カルボン酸量を算出し
た。

この酸化反応の反応液のｐＨを７．５に再び修正し、Ｃ
Ａ−２１８の菌体懸濁液６００−を加え、３７℃で１０
時間反応させた。

反応後、その反応液を７．００ Ｏｒ、ｐ、ｍ、で遠心
分離し上澄液１．６２ｔを得た。

この上澄液をマレリ法＊で測定すると、７−アミノセフ
ァロスポラン酸２．５２ｆ（収率５８％）を生成してい
た。

この上澄液を強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライＩ
−ＩＲＡ−４０１の醋酸タイプ５００−カラムに通液し
、水２ｔで洗った後０．５Ｍ塩化ア塩化アンモニウム酢
液した。

溶出液４５０−を５０ｙｄまで濃縮し、そのｐＨ３，７
とすれば７−アミノセファロスポラン酸が析出した。

析出した結晶を集めて減圧乾燥し、７−アミノセファロ
スポラン酸２．０９ｆ（収率４８．１％つを得た。

このものの確認は、実施例１（こ準じて行ない同一の結
晶を得た。

実施例 ７ 実施例１と同じ方法により培養したＣＡ−２１８菌株の
培養ブロス３５０ＴＩｌを５．００Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で遠心分離して菌体を集め、０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ
７，４） ２５ ｍｌｌこ再懸濁した。

この菌体懸濁液（こアクリルアミド３７５１とＮ、Ｎ’
−メチレンビスアクリルアミド０．２５ｆを加えて溶解
後、水冷中で５％β−ジメチルアミノプロピオニＩ−Ｉ
Ｊル尋液液２５ｒｎｌと２．５％過過硫酸カリウム液液
２５ ｍｌを加え、２０分間放置してゲル化させ、３６
．１ｆｔの菌体含有アクリルアミドゲルを得た。

３−アセトキシメチル−７−（４−カルボキシブタンア
ミド）セフ−３−エム−４−カルボン酸５００Ｒ？を０
．２Ｍ燐酸緩衝液１００ｒｎｌｔこ溶解し、上記ゲルを
加え３７℃で１０時間インキュベートした後、反応液を
ｆ過し、ｆ液中の７−アミンセファロスポラン酸をマレ
リ法＊で測定し、７−アミノセファロスポラン酸１８３
〜（収率５２％）を生成した。

実施例 ８ 実施例７と同じ方法で得た菌体含有アクリルアミドゲル
２５４グを０２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）の５０７に
懸濁させ、例筒管つきカラム（ｌ×３５ｃｍ）に詰め、
例筒管に３７℃の温水を循環、平衡化させた。

このカラム上端より５ｏＴＩｇの３−アセトキシメチル
−７−（４−カルボキシブタンアミド）セフ−３−エム
−４−カルボン酸を含む０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，
４） ５０ｍｉ！を毎分０．２ｒｒＩｌの流速で通過さ
せて酵素反応を行った。

通過液は５−づつ分取し、マレリ法＊で生成した７−ア
ミノセファロスポラン酸を測定した。

その結果、７−アミノセファロスポラン酸１９．５■（
収率５５．３％）が生成していることが判った。

実施例 ９ 実施例１と同じ方法で培養したＣＡ−２１８菌株の培養
ブロス１ｔを東洋沢紙＆ １０１でｆ過し、そのｆ液を
５．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離して集菌した。

この菌体を磁製乳鉢に入れてドライアイス５０グと共に
粉砕し、完全に粉末化した時点で乳鉢を３７℃の温水に
つけてドライアイスを急速に気化させることＱこより菌
体を溶解させた。

この凍結融解操作を３回行ない、最後に０．２ Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７，４） ２０ｙｄを加え、５℃で一夜放
置した。

その後、この凍結融解液を７，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ。で遠
心分離して上澄液を採り、史（こｓ、ｏｏ。

ｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離し無細胞抽出液２０ｒｎｌを得
た。

この無細胞抽出液に９０■の３−アセトキシメチル−７
−（４−カルボキシブタンアミド）セフ−３−エムー４
−カルホン酸を含む０．２Ｍ燐酸緩衝液６０−を加え、
３７℃で５時間反応させた。

反応後、マレリ法＊で測定すると４６．３■（収率７３
％）の７−アミノセファロスポラン酸が生成された。

実施例 ＩＯ グリセリン２％、醋酸ナトリウム２％、乾燥酵母０．９
％、食塩０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，３％、ＫＣｌ０９
０５％、Ｆ ｅ Ｃｌ ３ ” ６Ｈ２０，０，０５％
、ビオチンｌＯｍＩ？／ｌからなる組成の培地にグルタ
ル酸０．５％とノニポール０．０１％を加え、滅菌後、
バチルスＣＡ−７８菌株を接種し、２８℃で６日間培養
した。

培養後、そのブロスを５，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ。で遠心分
離して集菌した。

この菌体懸濁液２０ｒｒ１１に４０■の３−アセトキシ
メチル−７−（４−カルボキシブタンアミド）セフ−３
−エムー４−カルボン酸を含む０．２Ｍ燐酸緩衝液２０
−を加え、３７℃で６時間インキュベートし、マレリ法
“で測定したところ１４．９ＴｎｆＩ（収率５３％）の
７−アミンセファロスポラン酸を認めた。

参照文献”Ｌ 、Ｐ 、Ｍａｒｒｅｌｌｉ。

Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｓｃｉ、、 ５７，２１７
２ （１９６８）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、アセトキシル基
   または求核性残基を示す）で表わされる化合物およびそ
   の塩を水性媒体中で、バチルス属およびアース喝くフタ
   −属に属し、脱アシル化能を有する微生物菌体または其
   の修飾体と接触させるか、もしくは当該菌体からの抽出
   酵素または其の修飾体と接触させることにより、一般式
   （式中Ｒは前記と同じ基を示す）で表わされる７−アミ
   ノセファロスポラン酸および其の誘導体もしくはそれら
   の塩の製造法。