JPS6117523A - 淋疾のための広域スペクトルワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は淋菌感染に対してヒトを免疫する方法に関する
ものである。更に詳しくは、広範なスペクトルの淋菌４
株からヒトを保護する上で有用なワクチンに関するもの
である。

技術的背景 淋病は性交によって伝播され％泌尿生殖器管粘膜および
眼粘膜の急性化膿、次いで慢性の感染症および・線維症
を発現する。この疾患は１球菌ナイセリアーゴ／　Ｏｘ
　７　ｘ　（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　　ｇｏｎｏｒｒｈｏ
ｅｑ＜淋菌）のグラム陰性群の菌によって引き起こされ
る。１人の宿主（患者〕の特定の部位から、この稲の１
菌株が単層される。従って、・それぞれが線毛と関連し
た、固有の抗原決定基を持っている複数のＮ、ゴノロエ
アエ菌株が存在しており、この事が１診断および免疫付
与の両者を困難にしている。淋病患の発現率は１９５５
年以来、著しく増大しており、さらに、１９７６年に初
めて報告された、β−ラクタマーゼをコードしているプ
ラスミドを含有するペニシリン耐性菌株の出現により、
事態はより複雑化してきた。病原微生物の感染力は極め
て高く、感染患者とのただ一回の性交によって疾病に罹
患する確率は２０−３０％である。

治療せずに放置しておくと、再感染に対する耐性は得ら
れないと思われるので、再発が予測される。

疾病の発症経路には１ｍ菌による粘膜のコロニー化（コ
ロニ−性変種）　、ｍチ、　：ｌ　ロ＝−１ｔ、Ｌ得る
細胞が、その細胞壁のフィラメント（線維■構造（線毛
と呼称）を介し、膜表面に付着（結合）する過程が含ま
れる。付着後、淋菌は上皮組織を通過して粘膜上組織に
至り、そこで炎症および線維症を引き起こす。淋菌の上
皮表面に対する付着は、抗−線毛抗体によって阻害する
ことができる。

線毛タンパク質に対する抗体は、細胞の伺着阻止作用の
みならず、オプンニン作用、即ち、侵入細菌に対する血
中の食細胞の食作用を媒介する作用をも有する。しかし
ながら、線毛免疫原のワクチンとしての使用は、それが
菌株間の交差反応活性を欠いていることから、未だ実用
化されていないＯ 様々な菌株の線毛に対して若起された抗体が絶対的に交
差反応性を欠くわけではない、ということがわかった〔
プリン）　ン、　Ｃ０Ｃ，Ｊｒ、ら（Ｂｒｉｎ−ｔｏｎ
、　Ｃ，Ｃ，Ｊｒ、）　、イムノバイオロジー・オブ・
ナイセリアーゴノロエエ（Ｉｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　
　ｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａ　　Ｇｏｎｏｒｒｈｏａｅ　
）　（ｌ　９７８）アメリカンンサエテイ・フォー・マ
イクロバイオロジイ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　　ｆｏｒ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）、ワ
シントン、　Ｄ、Ｑｐｌ　５５　：］。更に、線毛タン
パク質の性質についても研究されている。この線状部分
は。

単量体ポリペプチド（ピリン）の重合したものからなり
、ＭＳＩＩ株の透明なコロニー性変種（Ｔｒ）から単離
されたピリンの完全なアミノ酸配列、および、　ＲＩ　
Ｑ　（Ｔｒ）ピリンの部分配列が決定された〔スクール
ニク、　Ｇ、に、（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ、Ｇ、に、）ら
、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデインン
（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）（１９８４）１５９　’
１３５１）。また、これらの２菌株のいずれかが有する
ピリンを臭化シアンで処理すると、分子の免疫学的に異
なる２つの部分を表わしていると思われる２つの重要な
フラグメント％ＣＮＢｒ−２（ｉ基９−９２）およびＣ
ＮＢｒ　−３（残基９３−１５９）が得られ、これらは
免疫学的に異なる分子部分であると思われる。ＣＮＢｒ
、−３は明らかに抗原的に可変部分であって免疫優性で
あり；　ＣＮＢｒ　−２は明らかに保存的な受容体−結
合領域を有し、免疫劣性である〔スクールニク、　Ｇ、
に、ら、プログ・アラ−シイ（Ｐｒｏｇ−Ａｒｇ・）（
１９８３）３１３１４１゜先行技術のどれも、Ｎ、ゴノ
ロエアエの全菌株に対して有効なワクチンとして作用し
得る物質を得ていない。前記の付着阻止作用および／ま
たは食細胞に対する促進作用により、あらゆる菌株に対
して反応し得る抗体を産生ずることができる免疫源の形
の抗原決定基が得られたならば、淋菌感染から保護する
ことができるであろう。本発明により、この目的が達成
された。

発明の開示 線毛タンパク質のアミノ酸配列中のある部分を免疫原と
して用いると、広範なスペクトル域の淋菌線毛に対抗し
て作用するだけでなく、これらの菌株が上皮細胞に付着
することを阻止し、かつ／または食細胞によるこれら菌
株の破壊作用を促進する様に作用し得る抗体が生成され
ることを見出した。その様なペプチド配列の内、幾つか
はピリンの保存的領域の免疫劣性な受容体結合部分と関
連しており、ＣＮＢｒ−２７ラグメント内に存在してい
る。その他のペプチドはＣＮ’ＢＴ　３部分に存在して
いる。これらの抗原的な反応性を有するペプチド配列を
担体タンパク質と結合させて免疫原性を付与する様にす
れば、これをワクチンとして人に注射するか、その他の
方法で投与し、淋病から保護することができる。人間の
みが淋病に感染し、他の哺乳類動物は感染しないと思わ
れるので、該疾患の動物モデルはなく、また、該疾患か
ら動物を保護するためのワクチンも必要でない。

即ち、本発明は、ヒトにおける淋病感染症に有効なワク
チンであって、抗原的に中性な担体タンハク質と結合し
ている％Ｎ、コリロエアエＭＳｌｌ（Ｔ　ｒ　）の残基
２１−３５．４１−５０，４８−６０、　６９−８４．
１　０７−１２１．１３５−１５１または１５１　１５
９て表されるアミノ酸配列と実質上同等な、抗原性の保
存配列であるペプチドの保護有効はを含有しているワク
チンを提供するものである。

また本発明は、担体タンパク質と正しい方向で容易に結
合し得る様に、カルボキシ末端に残基を付加されたこれ
らのアミノ酸配列、並びにその結合の結果得られた結合
産物を提供するものである。

更にまた本発明は、実質上純粋な形の上記ペプチド配列
を提供するものであり、また本発明のワクチンを用いて
淋病患から人間を保護する方法を提供するものである。

図面の解説 第１図はＮ−メチル（フェニルアラ）　Ｍ　Ｓ　１１ピ
リンのアミノ酸配列および本発明のタンパク質を表す領
域のアミノ酸配列を示す模式図である。

発明を実施するための方法 Ａ、定義 本明細書中、ペプチド配列の特徴付けに用いる５実質上
同等な′という語句は、実質上当量の物質が引用された
配列と同じ抗原機能を現わし、免疫機能を媒介すること
ができる。ということを意味する。一般に、実質上同等
なペプチドのアミノ酸配列と引用されたペプチドのアミ
ノ酸配列は同一である力ζ得られたポリペプチドの機能
にはさして影響を及ぼさない程度に、少数の残基の置換
または修飾を施し得ることは理解されるであろう。

個々のアミノ酸残基を、直接的にまたは暗号配列を変化
させることにより、欠失、付加または修飾する方法は当
該分野で仰られており、同等の機能を有するポリペプチ
ドが得られるこの様な修飾によりＪ実質上同等な′ペプ
チドを得ることができる。

１ペプチド′、′ポリペプチド′およびゞタンパク質′
なる語句は相互変換的に用いられ、これらは様々な長さ
の、中性（非荷電〕または塩の形の、さらには、グリコ
ジル化、側鎖の酸化、またはリン酸化等により修飾され
ていないか、あるいは修飾されている。アミノ酸配列を
意味する。当業者には容易に理解されることであるが、
これらのアミノ酸配列中には酸性基と塩基性基とが含ま
れており、このペプチドの特定のイオン状態は。

溶液状態にあるタンパク質の場合には、その周囲の溶媒
のｐＨに、そして固体状態にあるタンパク質の場合には
、それが得られた媒質のｐＨに依存する。また、アミノ
酸側鎖に、グリコジル単位。

脂質、またはホスフェート類の如き無機イオン等の付加
的置換基が付加して修飾されたタンパク質。

およびメルカプト基の酸化の如く化学的変換によって修
飾されたタンパク質も本発明の定義に含まれる。この様
に、′ペプチド′またはそれと同等の語句は、前記の如
き、その機能を破壊しない様な修飾に委ねられる適当な
アミノ酸配列を含ムモのとする。

ゞ実質上、抗原的に中性な担体′という語句は。

本発明のペプチドと結合することによって該ペプチドに
免疫原性を付与する物質であって、それ自体は宿主にと
って有害な、または本発明のペプチドの抗原機能を妨害
する様な抗原性部位を持った抗体の産生を惹起すること
のない物質を指す。以下に挙げる例では抗体の供給源と
してウサギを使用しているが、ウシの血清γルブミン（
ＢＳＡ）を用いてもよい。しかしながら、ヒトに対して
用いるためには、この担体はヒトが日常的にかつ非病原
的にでくわす物質に対して抗体を惹起しないようなタン
パク質に限定−される。例えば、淋菌自身の体細胞１プ
ロテイン■′および破傷風のトキソイドタンパク質を用
いることができる。他の担体の使用も除外されるわけで
はないが、これらのタンパク質が血液学的に最も鳥く適
合し得る形であり、今Ｈ１このクラスのものの中では、
最も使用に都合の良い物質である。

Ｂ、一般的な記述 Ｂ、１．淋菌の線毛、および抗原性領域の配列Ｎ、ゴノ
ロエアエ株ＭＳ１１（Ｔｒ）から単離した線毛は１５９
アミノ酸からなるペプチドであって、１２１および１５
１位にシスティン残基を含有しており、これらがジスル
フィド結合を介して結合することにより、ペプチド鎖中
の両位置間にループ構造が形成されている（第１図参照
）。第７および第９２位にメチオニン残基が存在してい
るので、臭化シアン処理により３つの７ラグメント、即
ちＣＮＢｒ−１←残基１−７　）、　ＣＮＢｒ　−２（
残基８−９２）およびＣＮＢｒ−３（Ｑ基９３−１５９
）が得られ、これらの内、２フラグメントは広範な免疫
学的研究に使用されている。ＣＮＢｒ−２のアミノ酸配
列中には、約４１−５０および約６９−８４位の２箇所
に親水性の領域が含まれており、その配列のコンピュー
ター分析によるとβ一回転が存在することから、タンパ
ク質表面への接近性が示唆されている。これらの領域の
アミノ酸配列が付着阻止作用を有する抗体を生成させ。

る本発明ワクチンの２つの免疫原性部分である。

これらの部分に応答して生成される抗体はオプンニン作
用をも有する。さらに、４８−６０位および１３５−１
５１位と機能的に実質上同等なペプチドは、担体と結合
すると高力価のオプソニック杭体（オプンニン作用を有
する抗体〕を、２１−３５゜１０７−１２１および１５
１−１５９位と実質上同等なペプチドは、やや力価の低
いオプソニック抗体を惹起し得る免疫原である。これら
、オプソニック抗体を惹起し得る７つのペプチドを第１
図に示す。

Ｂ、２．　りフカ−類 上記のペプチド配列は免疫原としてはあまりにも小さい
と思われるので担体物質に結合させてその性質を付与し
た。

その様な結合を得るためには、当該技術分野で知られて
いるあらゆる方法を用いることができる。

結合は様々な方法で行うことができる。例えば。

１つの官能基末端にジスルフィド結合を生成させ。

他の位置にペプチド結合を生成させる様な外来性の二機
能性試薬は多数知られており、それらを広範囲に用いる
ことができる。これらの内、最モ一般的なものはＮ−サ
クシドイミジル−３−，（２−ピリジルジチオ）プロプ
リオネート（ＳＰＤＰ）である。この試薬は、それ自身
と、あるタンパク質のシスティン残基との間にジスルフ
ィド結合を生成させ、リジン上のεアミノ基または他の
残基上の遊離のアミ７基によりアミド結合を生成させる
。そのＷｔｆｌジスルフィド／アミド結合を形成する種
々の試薬が知られている〔イムノロジカル・レビューズ
（１ｍｎｕｎ、　Ｒｅｖ、）（１９８２）６２　：１８
５参照）。その他の二機能性カップリング試薬はジスル
フィド結合ではなくチオエーテルを形成する。

数多くのチオエーテル形成性試薬が市販されており、そ
れらの中には６−マレイミドカプロン酸。

２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸および４−（Ｎ−マレ
イミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等の
反応性のエステル化合物が含まれる。

カルボキシル基は、サクシンイミドまたはｌ−ヒドロキ
シ−２−二トロー４−スルホン酸・ナトリウム塩と混合
することによって活性化され得る。

本発明方法にとって特に好ましいカップリング剤は、サ
クシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）〔ピアス
・カンパ＝　−（Ｐｉ’ｅｒｃｅＣｏｍｐａｎｙ）ロッ
クフォード、イリノイスから入手可能〕である。前記の
化合物リストは完壁なものでなく１例示した化合物に修
飾を施したものも使用し得ることは明らかである。

本発明の抗原性ペプチドは数多くある常法に従って製造
することができる。本発明ペプチドの配列は短かいので
、標準的手法によって化学合成することができる。特に
好ましい方法は固相法である〔エリツク７　ン、　Ｂ、
Ｗ、、（Ｅｒ１ｋｓｏｎ、　Ｂ、Ｗ、　）ら。

ザ・プｏテインズ（Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）　（
１９７６）ｌｉ’ｒ２巻、アカデミツク・プレス、ニュ
ーヨークＰ２５５参照）。自動同相合成装置（オートメ
−ティラド・ソリッド・フェーズ・シンセサイザー）お
よびそれに用いる試薬はいずれも市販品から入手可能で
ある。それにより、ＭＳ１１ビリンの所望の部分のアミ
ノ酸配列の模擬物を得ることができるだけでなく、適当
な残基を置換、付加または削除して該配列を修飾するこ
とも容易である。

特に好適な修飾例として、前述のグロく、カルボキシ末
端にシスティン残基を付加することでメルカプト基を付
与し、担体タンパク質との結合上の便宜を図ったものが
ある。あるいは、追加のグリシン残基の如きスペーサー
・エレメントを゛Ｃ−末端の結合アミノ酸とペプチドの
残余部分との配列間に挿入してもよい。

また、所望の配列は比較的短いので、これらのペプチド
の製造に組換え技術を使用することは特に興味深い。こ
の程度の長さのペプチドの暗号配列は１例えばマチュー
シイ（Ｍａｔｉｅｕｃｃｉ）　、Ｍ。

らのホスホトリエステル法〔ジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ　Ａｍ　ＣｈｅｍＳｏ
ｃ）（１９８１）１０３：３１８５）により。

容易に化学合成することができる。暗号配列を化学合成
することにより、天然のペプチド配列を暗号化している
塩基を適当な塩基で置換するだけで。

どの様な所望の修飾をも施すことができる。２次いでこ
の暗号配列に適当なリンカ−を付加し、今日、当該技術
分野で普通に入手可能な発現ベクター中にライゲートシ
、このベクターを用いて適当な宿主を形質転換すること
により、所望のタンパク質を生産させることができる。

今日、その様なベクターおよび適当な宿主系は。

多数入手するこ゛とができる。例えば、細菌性宿主に適
合し得るプロモーター配列を、所望の暗号配列の挿入に
好都合な制限サイトを含有しているプラスミドに供給す
る。その様なプラスミドの代表例としては、メツシング
、Ｊ、（ミネソタ大学〕から入手可能なｐＵＣ８および
ｐＵＣ１３（メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、ヌクレ
イツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　）（１９８１）９：３０９参照
〕またはニューイングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　カラ入手可能
なｐＢＲ３２２がある。適当なプロモーターには。

例えばβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およ、びラ
クトース（Ｉａｃ　）プロモーター系〔チャン（Ｃｈａ
ｎｇ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９７７）
１９８：１０５６）およびトリプトファン（ｃｒｐ）プ
ロモーター系〔ゲラデル、　Ｄ、　　（Ｇｏｅｄｄｅｌ
　、Ｄ、）ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（１
９８０）ｓ：４ｏｓｒ〕が含まれる。得られた発現ベク
タ−を、　−ｒ−ｘン、　Ｓ、Ｎ（Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、
Ｎ、）らの塩化カルシウム法〔プロシーディンゲス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイ
ズ（’Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｊ　　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　）Ｕ
ＳＡ（１９７２）６９　２１１０）に従って適当な細菌
宿主に導入（トランスフオーム〕する。成功した形質転
換体は、通常天然の線毛を産生ずる菌株よりも高レベル
で所望のポリペプチドフラグメントを生産する。勿論、
適当なベクター並びにコントロール配列を用いて、酵母
または哺乳類細胞を宿主として使用することもできる。

あるいは、天然のピリンを単離し、得られたペプチドを
加水分解することによってもこれらの配偶を得ることが
できる。しかしながら、どの方法は、元の標品から大陸
の、所望としないタンパク質を排除しなければならない
ので、最も非実用的な方法である。

次いで、結合に°適する様に修飾された抗原性ペプチド
配列を、前記の様々な結合剤を用いて適当な、抗原的に
は中性である担体に支持させる。適当な担体には前記の
プロティン■や破傷風トキソイドが含まれる。これらと
抗原性ペプチドとを。

例えばチオエーテルまたはジスルフィド結合（リンク）
と、アミド結合とを与え得る。二機能性リンカ−を介し
て結合させる。その様な結合の条件は、当然、使用する
リンカ−の性質に左右されるが、当該技術者の熟知する
ところである。

活性成分としてペプチド配列を含有するワクチン製剤も
当業者にはよく知られている。一般に、その様なワクチ
ン類は溶液または懸濁液のプロき注射用の剤形に製剤化
されているが、注射に際して溶液または懸濁液を調製す
るのに適した固形状に製剤化されていてもよい。製剤は
乳剤であってもよい。活性な免疫原成分を、薬学的に許
容し得ると共に該活性成分と適合し得る賦形剤と混合す
ることが多い。適当な賦形剤の例として、水、食塩水、
デキストロース、グリセリンまたはエタノール、あるい
はこれらの混合物を挙げることができる。更に、所望に
より、ワクチンには湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等
の補助物質、あるいは該ワクチンの効果を高めるための
アジュバント類を少量含有させてもよい。このワクチン
は注射１例えば皮下または筋肉内注射により、非経口的
に投与することが好ましい。その他の投与方法に適した
剤形には、坐薬並びに１時には経口用製剤が含まれる。

坐薬は１例えばポリアルカレンゲリコール類やトリグリ
セライド類の如き通常の結合剤および担体を含有してい
る。その様な坐薬は、活性成分を０．５〜ｌＯ％、好ま
しくは１〜２％の割合で含む混合物から製造される。経
口用製剤は５通常使用される賦形剤５例えば製薬等級の
マンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシ
ウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび戻酸マ
グネシウム等を含有する。これらの組成物は液剤、懸濁
剤１錠剤、乳剤、カプセル剤、徐放性製剤または粉剤等
の剤形であり、活性成分を１０〜９５％、好ましくは２
５〜７０襲含有している。

本発明のタンパク質は中性または塩の形でワクチンに製
剤化される。薬学的に許容し得る塩としては、酸付加塩
（ペプチドの遊離アミン基との間に形成される）１例え
ば、塩酸またはりん酸等の無機酸、あるいは酢酸、しゆ
う酸、酒石酸およびマンデル酸等の有機酸によって形成
される塩がある。遊離のカルボン酸との塩は１例えばナ
トリウーム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまた
は水酸化鉄の如き無機塩基、あるいはイソプロピルアミ
ン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、
ヒスチジンまたはプロカイン等の有機塩基から導かれる
。

本発明のワクチンは投与剤形に適した方法により、その
治療上を効かつ免疫原的に有効な置を投与される。投装
置は処置対象、対象者の免疫系の抗体産生能力、並びに
必要とされる保護の度合により、左右される。活性成分
の正確な投与要求量は医師の判断に委ねられており、各
人に特有の値となる。しかしながら、適当な用量域は、
１人当りの活性成分量が数百μｇ程度の範囲内であろう
。

種々の適当な、初回投与と促進投与（ブースター・ショ
ット）の投与計画をたて得るが、初回投与から１〜２週
間の間隔をあけて次の注射または他の方法での投与を行
うのが一般的である。

Ｃ０実施例 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実
施例は制限的なものではない。

ｃ、ｉ、活性成分の製造 ４１−５０位と実質的に等価なペプチド、Ｇｌｕ−Ｇｌ
　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−ＡＩ　ａ−Ｖａｌ　
−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｙｒを、市販のベックマン・モ
デル９９０Ｂペプチド合成装置（Ｂｅｃｋｍａｎ　　Ｍ
ｏｄｇｌ　　ｇｇ□Ｂ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　５ｙｎｔｈ
ｅｓｉｚｅｒ）中で、同じく市販のアミノ酸ポリスチレ
ン樹脂および以下の側鎖保護基により保護されたｔ−Ｂ
ｏｃ保護アミノ酸を用いて合成した：　Ａｓｐ、　Ｇｌ
　ｕ、ＴｈｒオヨヒＳｅ　ｒには０−ベンジルエステル
基；　ＡｒｇおよびＨｉｓにはトシル基逼Ｃｙｓにはｐ
−メトキシベンジル基；　ＬｙｓにはＯ−クロロベンジ
ルレオキシ力ルホニル基ｉ並びにＴｙｒには２，６−ジ
クロロベンジル基〔ペニンスラ・ラボラトリイズ（Ｐｅ
ｎｉｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）、ベルモ
ント、カリフォルニア〕。

カップリング反応は、樹脂に結合したアミノ酸に。

２．５モル過剰層のｔ−Ｂｏｃアミノ酸およびジシクロ
へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を作用させることに
より１行った。ＡｓｎとＧｉｎ　　の場合は。

２．５モル過ｆｌＪＩ＆のアミノ酸、ＤＣＣおよびＮ−
ヒドロキシトリアゾールを用いた。ニンヒドリンを用い
て反応樹脂を調べたところ、カップリング反応の完成率
は全てについて９９％以上であった。

アニソール、ジメチルサルファイド ールの存在下、無水ＨＦで処理し、ペプチドを脱保護す
ると同時に樹脂から除去した。このペプチドを、エーテ
ル抽出によって様々な有機副生成物から分離し，また５
％酢酸を用いて樹脂から単離し、次いで凍結乾燥した。

この粗生成物の純度を。

Ｃ−１８逆相カラム〔メルク（　Ｍｃｒｃｋ）　、ダル
ムス５　ツｌ−　（　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ　）　Ｆ４　
７　）　ニよるＨＰＬＣ測定法およびアミノ酸分析法に
より，求めた。このペプチドは純度９０％以上であると
決定された。

同様の方法で以下のペプチドを合成した。

４１−５０位のペプチドの追加ペプチド：Ｇｌ　ｕ−Ｇ
Ｊ　ｙ−Ｇ１　ｎ−Ｌｙ　ｓ　−Ｓ　ｅ　ｒ−ＡＪ　ａ
−Ｖａ　１　−Ｔｈ　ｒ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｙ　ｒ−Ｃｙ　
ｓ　；および Ｇｌ　ｕ−ＧＪ　ｙ−ＧＪ　ｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＡＪ
　ａ−ＶａＪ　−Ｔｈｒ−ＧＪ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｙ
−Ｃｙ　ｓ　。

２１−３５位のペプチド：　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌ　ａ
−Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−ＡＪ　
ａ−Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−ＧＪ　ｎ−Ｖａ　Ｊ　−Ｓｅｒ
−Ｇｌ　ｕ　；Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｊ　ａ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌ　ｎ−Ａｓｐ−Ｔｙ　ｒ−Ｔｈｒ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ
−Ａｌ　ａ−ＧＪｎ−ＶａＪ−Ｓｅｒ−ＧＪｕ−Ｃｙｓ
；およびＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌ　ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｎ
−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌ　ａ→ｂｇ−Ａｌａ−
Ｇｌ　ｎ−Ｖａｊ　−Ｓｅｒ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｃ
ｙｓ　。

４８−６０位ノベプチ）−　：　Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉ　ｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｌ
ｙ　ｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｕ−Ａｓｎ　；Ｔｈｒ
−Ｇｌ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉ　
ｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙ　ｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＧＪ　ｕ−
Ａｓｎ−Ｃｙｓ　；−およびＴｈｒ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｙｒ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｊ（ｉ　ｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｌ
ｙ　ｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌ　ｙ−
Ｃｙｓ　。

６９−８４位のペプチド：　Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−
Ｖａｊ　−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｕ−Ｖａｌ　−Ｇｌ　ｕ−Ｖ
ａ　ｌ　−Ｌｙｓ　；Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅ　ｔ−Ａｓ
ｐ−１１　ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙ　ｓ−Ｔｙｒ−
Ｖａｌ　−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｕ−Ｖａｌ−Ｇｌ　ｕ−Ｖａ
ｌ　−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ　；およびＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
　ｒ−Ａｓｐ−１　１　ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙ　
ｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ　−Ｌｙ　ｓ−Ｇｌ　ｕ−Ｖａｌ　
−Ｇｌ　ｕ−ＶａＩ　−Ｊ，ｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｃｙｓ　
。

１０７−１２１位のペプチド：　Ｓｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒ
ｐ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｕ−Ａｓｎ−Ｇ
ｌ　ｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ　−Ｌｙ　ｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ
−Ｃｙｓ　。

１３５−１５１位のペプチド：　Ａｓｐ−Ａｌ　ａ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｕ−１　１　
ｅ−Ａｓｐ−”ｎ１ｒ−Ｌｙｓ−）１ｊ　ｓ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−Ｓｅ　ｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　０１５１−１５９
位のペプチド＋　Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−、
イー・崖ａ−Ｓｅ　ｒ−Ａｓｐ−Ａｌ　ａ−Ｌｙ　ｓ　
；Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌ　ａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
−Ａｌ　ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙ　月およびＡｒｇ−Ａｓｐ−
Ｌｙ　ｓ−Ａｌ　ａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌ　ａ−Ｌｙ
ｓ４１：ｙ−Ｃｙｓ　。

Ｃ．２．担体タンパク質との結合 Ｃ−Ｎ−末端にＣｙｓ残基を有するＣ．１．節に示シタ
ヘプチトヲ，ヨシクキ、　Ｓ　、（Ｙｏｓｈｉｃａｋｉ
　、Ｓ）らの方法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリイ（　ＥＩＩｒ　Ｊ，　Ｂｉｏｃｈｅ
ｒｎ，　）（１９７９）ｘｏｘ：３９ｓ）に従い、サク
シンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル〕シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）Ｃピアス、ロ
ックフォード、イリノイス）を使用し、ウシ血清アルブ
ミンと結合させた。簡単に述べると，ＢＳＡｌｏｍｇを
りん酸緩衝食塩水（　ＰＢ　Ｓ　）　（　ｐＨ７．４）
２ゴに溶カシ、ジメチルホルムアミド０．　５　ｔｅｌ
中のＳＭＣＣ５〜と混合した。室温で１時間経過した後
、０．ＩＭりん酸（ＰＨ６，０）中でＧ−２５を用いて
ゲルρ過し、未反応のＳＭＣＣから複合物（ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅｄ）を分離した。

ペプチド：　Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｉｒｌ−Ｌｙｓ−８ｅ
ｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
　　を０．１Ｍホウ酸（ＰＨ９，１）に溶かし、ＮａＢ
Ｈ４（Ｑ、　Ｉ　Ｍ　ストック溶液０．１’ｃｌ）で還
元した。５分後にこのホウ酸溶液のｐＩ（をＩＭＩ−Ｉ
Ｃ４により１まで下げて過剰伍のＮ　ａ　ＢＨ４°を除
いた後。

１ＭＮａＯＨを用いてｐＨ５とし、リンカー−ＢＳＡ複
合物と混合した。室温で１時間インキュベー゛トした後
、ｏ：１ＭＮＨ４ＨＣＯ３中でＧ−２５カラムにかけ、
ペプチド−リンカー−ＢＳＡ複合物を脱塩処理した。結
合（コンデュゲーション）の程度は。

ペプチドとの反応の前後におけるＢＳＡのアミノ酸組成
を比較して定量した。この複合物は、ＢＳＡ分子当り約
１５−２５ペプチドを含有していた。

同様にして、（：、１０節に示した。他のＣ−末端Ｃｙ
ｓ含宵ペプチドをＢＳＡと結合させた。

４１−５０位および６９−８４位のペプチドを有する。

ペプチド複合物が淋菌線毛に対する抗体と特異的に結合
し得ることを確認するために数種類の方法を用いた。被
検抗体をＲ−１０またはＭＳｌｌから導かれた精製全線
毛、またはそのＣＮＢｒ２　およびＣＮＢｒ３フラグメ
ントに対して惹起させた。標準的な方法により、ウサギ
内で抗体を惹起させたので、ポリクローナルな標品が得
られた。抗体の評価は、ＲＩＡ、ＥＲＩＳＡ法の使用、
並びにペプチド−担体−セファロース複合物に対する吸
着法を用いて行った。

ＲＩＡおよびＥＬＩ　ＳＡ法では、９６個のウェルを有
するプレートを試験すべきペプチドＢＳＡ複合物ｌＯ〜
で覆い、洗浄後、順番に薄めた抗血清で処理し、洗浄し
た後、試薬を適用した。ＲＩＡのための試薬は１２５１
プロテインＡ〔アマー乃ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　、
アーリントンハイツ、イリノイス〕であるｃ、ＥＬＩＳ
Ａ用の試薬としては、ヤギ抗ウサギアルカリ性ホスファ
ターゼ複合物〔カペル（ＣａｐｅＩ　）％ウェストチェ
スター、ＰＡ、ｌとＰ−二トロフェニル・ホスフェート
とを順次用いた。

ＲＩＡては、放射活性を示すウェルをプレートから切り
取って計数した。他方、ＥＬＩＳＡでは。

４０５　ｎｍにおけるウェルの吸光度を測定した。

セファロース吸着分析の場合には、ポーラス。

Ｊ、（Ｐｏｒａｔｈ、　Ｊ、）　ラ（７）方法〔メ７７
ス−４ン・：ｒ−：／ｆイーＥ：Ｏシイ（Ｍｅｃｈ　　
Ｅｎｚｙｍｏｌ　）　（１９７４）３４：１３）に従い
、ペプチド−ＵＳＡ複合物とＣＮＢｒ　活性化セファロ
ース〔ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　、　　
ビスキャラタウエイ（Ｐｉｓｃａｒａｗａｙ）。

ＮＪＩとを反応させた。抗体含有血清（１ｍｌ）に対し
てペプチド−担体−セファロ−７’０．１ｒｔｔｌを室
温で２時間さらし、混合物を遠心分離した。次いで、標
準的な固相結合分析法によって上澄液中の存在を分析し
た。

以上の分析（測定）結果は複雑な応答を示した。

Ｃ０２０節で調製したペプチド複合物は、ＭＳＩＩまた
はＲＩＯのＣＮＪｌｒ２フラグメントに対して惹起され
た抗血清のみと結合した。タンパク質４１−５０および
６９−８４と実質上同様な抗原性ペプチドを含有する複
合物はいずれも抗−Ｒ１０−ＣＮＢｒ２　　と結合し１
６９−８４複合物のみが抗−ＭＳ　ｌ　１−ＣＮｊ３ｒ
　２　と充分な結合を示した。どれも全線毛に対する抗
体とは反応しなかった。

以上の結果はこれらの抗原決定基の免疫劣性性と一致し
ている。実際、高い交差反応性を示す抗体を生成させ得
る抗原決定基は、高い株特異性の抗体を生成する決定基
種との関係では劣性であると思われる。

本発明の複合ペプチドに対して惹起された抗体の、標的
細胞に対する付着阻害能力をインビトロでの分析法によ
り、調べた。

標的細胞を得るために、ヒト子宮内膜細胞から得゛たＬ
皮細胞をカバースリップ上で増殖させ単層組織培養した
。

線毛化（ｐｉｌｉａｔｅｄ　）　淋菌株Ｆ６２の接種物
を種々の血清希釈液とプレーインキユベートシ、培養細
胞の入った容器内に移した。３０分間インキュベーショ
ンした後、洗浄を繰返して行うことにより非結合細菌を
除去した。Ｇｉ　ｅｍｓ　ａ　を用いてカバースリップ
を染色し、付着した細菌数を数えた。

その結果を表■に示す。表中、′前ＰＯという表示は対
照血清、即ち、指示ペプチドによる免疫処理がなされて
いない血清を指す。′後＃Ｉ−′という表示は免疫処理
した動物からの血清であることを意味する。

ゞ後書≠“　免疫血清を得るには、被検ペプチドを担体
と結合させ％以下の妬くにして完全フロインドアジュバ
ント中でワクチンを調製した；りん酸緩衝食塩水（ＰＢ
Ｓ）に入れた複合物５００μｇを同容量のアジュバント
で乳化した。このワクチンを７　ｋｇの、ニューシーラ
ント系シロウサギに、筋肉内または皮下注射法により、
接種した。同様のワクチンを用いて６週間後に促進投与
し、その後１０日間飼育した後１分析用の血清試料を採
取した。

表■の結果から％ＭＳＩＩビリンの６９−８４位と実質
上向等なペプチド複合物に対して惹起された免疫血清は
、試験された全ての希釈率（最少１　：　１００）の濃
度において上皮細胞への付着阻害作用を有し、ビリンの
４１−５０位に対する抗血清も同様に有効であることが
分った。４８−６０位に対応するペプチド複合物を用い
た対照は、結合阻害能力を全く現わさなかった。

要するに％ＭＳＩＩ線毛の４１−５０位または６９−８
４位と実質上向等なペプチドの複合物から調製したワク
チンは広範なスペクトルの淋菌４株から得られた淋菌線
毛の付着を阻止し得る抗体を生成させることができるの
で、これらの菌による感染に対して保護作用を有する。

Ｃ９４，で述べた如くにして複合物をウサギに注射する
ことにより、抗体を惹起させた。得られた抗血清のオプ
ンニン作用をコーン、Ｚ、八、（Ｃｏｈｎ　。

Ｚ、Ａ、）らの方法〔ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジソｙ　（Ｊ、　ＥｘｐｏＭｅｄ、Ｘ１９５
９）１１０１１９）の改良法により、調べた。

ヘパリン化した血清試料１０ｒｉｒｌからヒト−多形核
白血球（ＰＭＮＳ）を調製した。５％デキストランを含
有するりん酸緩衝食塩水中で赤血球を沈降させて白血球
に富む上澄液を取り、ヘパリン−食塩水を用いて何度も
遠心することにより、洗浄した。次いで濃縮された白血
球をゼラチン−／ＸＸツク塩溶液（ｌ１ａｎｋｓ　　５
ａｌｔ　　５ｏｌｔｉｏｎ　）に懸濁し、７　　′ 血球計で計数し、濃度を１−２１−２ｘｉＯＰ／露ｌに
調節した。

線毛化相変異型（Ｐｉｌｉａｔｅｄ　　Ｐｈａｓｅ　　
Ｖａｒｉａｎｔ　）淋菌である。ヘテロローガスなＦ６
２株を固型のり（ヒンゾ（ｔｙｐｉｎｇ　Ｎ地中、５．
６％Ｃ０２および空気の存在下、３６．５℃で１８時間
増殖さ、眸だ後−餅がったガラス棒で細菌を収穫し、／
１ンクの塩溶液＋ゼラチン混合物中に入れ、比濁計を用
いて細胞濃度を微生物が、１−２Ｘ１０７／ｍｊ含まれ
る様。

調節した。

複合物に対して調製した抗血清の連続希釈液を熱−不活
化（５６℃×４５分間）し、バンクの塩溶液子ゼラチン
で連続的に希釈した後、等容量のＰＭＮＳ　および細菌
と一緒にした。連続的に回転（４回転／分つさせながら
、３７℃で反応させた。

１５分のインキュベーション時間の後、反応混合物を２
℃にすることによって瞬間的に食作用を中止させた。こ
の細菌−細胞懸濁液をハングの溶液＋ゼラチン中で遠心
して洗浄し、得られた細胞ペレットをバンクの溶液＋１
０％血清中に再懸濁し、この反応混合物を３７℃でイン
キュベートした。

０．３０．６０．９０および１２０分後に１部を取り、
氷冷−ハングの溶液を加えて細胞内溶菌（ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕＪａｒ　　ｋｉｌｌｉｎｇ　）反応を止めた。

次いでＰＭＮを遠心分離して集め、０．１％Ｂ５Ａ１有
水冷蒸留有水前蒸留水解させた。食塩水で連続的な１０
倍希釈液を得、観察し得る細菌の数を測定した。

１２０分後の細菌の生存率を、プレー免疫抗血清を含有
する対照試料との比較に基いて表わし。

その結果を表２に示した。

以上の結果は、４１−５０％４８−６０．６９−８４お
よび１３５−１５１位の配列と実質上同等のペプチドの
複合物に対して惹起された抗血清は高力価のオプソニン
作用を有し１２１−３５゜１０７−１２１および１５１
−１５９位と実質上同等のペプチドの複合物に対して惹
起された抗血清は低力価であるがオプンニン作用を有し
；１２１−１３４位と実質上同等のペプチドの複合物に
対して惹起された抗血清は殆んどオプソニン作用を有し
ていないことを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図はＮ−メチル（フェニルアラ）ＭＳＩＩピリンの
アミノ酸配列を示す模式図である。 特許出願人　ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オヴ
・ザ・レランド・スタン フォード・ジュニア・ユニヴア− シティ 代　理　人　弁理士　青　山　　葆（外１名〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトを淋疾から保護するためのワクチンであって、
   実質上抗原的に中性な担体と結合した、ナイセリア・ゴ
   ノロエアエＭＳ１１（Ｔｒ）ピリンの残基２１−３５、
   ４１−５０、４８−６０、６９−８４、１０７−１２１
   、１３５−１５１または１５１−１５９（これらの数値
   を含む）と実質上同等なアミノ酸配列を有するペプチド
   の保護有効量を含有するワクチン。 ２、残基２１−３５、４１−５０、４８−６０または６
   ９−８４、あるいはＮ末端のＣｙｓ残基が欠失され、Ｃ
   末端にＣｙｓ残基が付加されている１５１−１５９残基
   に対応するペプチドを含有する第１項記載のワクチン。 ３、残基２１−３５、４１−５０、４８−６０または６
   ９−８４、あるいはＮ末端のＣｙｓ残基が欠失され、Ｃ
   末端にＧｌｙ−Ｃｙｓジペプチドが付加されている１５
   １〜１５９残基に対応するペプチドを含有する第１項記
   載のワクチン。 ４、ヒトを淋疾から保護するためのワクチンであって、
   実質上、抗原的に中性な担体と結合している以下の配列
   ： （ａ）【遺伝子配列があります】； （ｂ）【遺伝子配列があります】； （ｃ）【遺伝子配列があります】； （ｄ）【遺伝子配列があります】； （ｅ）【遺伝子配列があります】； （ｆ）【遺伝子配列があります】；または （ｇ）【遺伝子配列があります】 で示されるペプチド群から選択されるペプチドの保護有
   効量を含有してなるワクチン。 が欠失され、Ｃ末端にＣｙｓ残基 ５、配列（ａ）−（ｄ）、あるいは、Ｎ末端のＣｙｓ残
   基が欠失され、Ｃ末端にＣｙｓ残基またはＧｌｙ−Ｃｙ
   ｓ残基が付加されている配列（ｇ）の　いずれかを含有
   する第４項記載のワクチン。 ６、配列： （ａ）【遺伝子配列があります】； （ｂ）【遺伝子配列があります】； （ｃ）【遺伝子配列があります】； （ｄ）【遺伝子配列があります】； （ｅ）【遺伝子配列があります】； （ｆ）【遺伝子配列があります】；または （ｇ）【遺伝子配列があります】； で示されるペプチド群から選択される実質上純粋なペプ
   チド。 ７、配列（ａ）−（ｄ）あるいはＮ末端のＣｙｓ残基が
   欠失され、Ｃ末端にＣｙｓ残基またはＧｌｙ−Ｃｙｓ残
   基が付加されている配列（ｇ）のいずれかである第６項
   記載のペプチド。