JPS6363972A - 抗ＧＭ↓３（４−Ｏ−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）ガングリオシド抗血清 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はウサギ抗ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ
）抗血清に関するもので、主として臨床的診断において
糖鎖抗原の検出・測定等に役立てるものである。

〔従来の技術〕

近年、腫瘍関連抗原として、Ｃ＾１９−９．０ＦＡ−Ｔ
４゜Ｈ−Ｄ抗原（Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｎ　Ｄｅｉｃｈ
ｅｒ　ａｎｔｉｇｅｒ）等のシアル酸を含む１！鎖抗原
が注目されている。即ち、組織が癌化することにより普
段存在しないこれらの抗原が腫瘍組織に新たに現われ、
ある場合には癌患者血清中にも見い出されるようになる
。これらの腫瘍関連抗原の研究（特に測定及び検出）に
おいて、これらの抗原に対する抗体は非常に有用性が高
いが、現在のところ多くのものはモノクロナール抗体で
あり、一般的にポリクロナール抗体では特異性の高い抗
体の作製に多くの困難がある。

即ち、シアル酸含有ｖＭ鎖抗原として、種々のガングリ
オシドを動物に免疫しても得られる抗体は一般的に抗体
価、アフィニイティが低（、特異性も高いものは得られ
にくい。これは、ガングリオシドはそのシアル酸残基の
ため一般的に免疫原性が弱く、また中性ｐＨ条件下でも
次第にシアル酸を遊離しアシアロ体を生成するため、ガ
ングリオシドを免疫しても得られた抗血清は、このアシ
アロ体とも反応するものが少なくないからである。

ところで、ヒト腫瘍関連抗原の一つであるＨ−Ｄ抗原は
、ニワトリで比較的特異性の高いポリクローナル抗体が
得られているものである。Ｈ−Ｄ抗原とはＮ−グリコリ
ルノイラミン酸をもつ糖蛋白質及び糖脂質等の複合等積
を指すが、これらの抗体としてはＨ−Ｄ抗原の一つであ
る０Ｍ３（ＮｅｕＧｃ）をニワトリに免疫して得られた
抗血清が用いられている。

そのニワトリ抗ＧＭ３　（ＮｅｕＧｃ）抗体の主要な認
識部位はシアル酸残基のＮ−グリコリル基であるため、
この抗体はＮ−アセチルノイラミン酸をもつＧＭＩ（Ｎ
ｅｕＡｃ）及びこれらのアシアロ体であるＬａｃ−Ｃｅ
ｒとは殆んど反応せず、０Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）の他、
ＧＭｚ　（ＮｅｕＧｃ）　＋ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）、　
０Ｍ３（４−０−ａｃｅｔｙｌ−ＮｅｕＧｃ）等のＮ−
グリコリルノイラミン酸をもつ殆んど全てのガングリオ
シドと反応する。

最近、ニワトリ抗ＧＭ３　（ＮｅｕＧｃ）抗体を用いた
酵素免疫法によりヒト腫ｍ　Ｍｉ　織から）Ｉ−Ｄ抗原
の一つである０Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）誘導体、即ち、シ
アル酸残基の４位にアセチル基がさらにエステル結合し
たガングリオシド、０Ｍ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧ
ｃ）が発見され、この物質が腫瘍関連抗原として新たに
注目を集めるようになった（Ｈ，Ｈｉｇａｓｈｉ、ｅｔ
　ａｌ、ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ。

４５、　ｐ３７９６−３８０２．　（１９８５）　）。

この抗原はウマの赤血ＥＸ　１１９にのみ、その存在が
確認されていたガングリオシドであるが、その特異抗体
の作製はニワトリＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）
を免疫することにより試みられていた。しかし、ここで
得られたニワトリ抗ＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ
）抗血清は、免疫物質、即ち０Ｍ３（４−０−Ａｃ−Ｎ
ｅｕＧｃ）の他に、０Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）にも交差反
応を示した。そこで、そのニワトリ抗血清のＩｇＧ画分
を、０Ｍ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）を固定化した
アフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製を
行ない、さらに残存した抗ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）抗体を
ＧＭ：ｌ　（ＮｅｕＧｃ）ガングリオシド固定化カラム
で吸着除去して初めて特異抗体を得るものである（Ｍｉ
ｙｏｓｈｉ　Ｉ　ｅｔａ＋、、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　　ｌａ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、２３＋　　ｐ、
６３１−６３８゜（１９８６））　　。

それ故、ニワトリに０Ｍ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ
）を免疫するとその免疫物質のシアル酸残基の４位のア
セチル基を認識する抗体、部ちＧＭｓ（４−０−Ａｃ−
ＮｅｕＧｃ）には反応するがＧＭ、（ＮｅｕＧｃ）には
反応しない抗体の他に、免疫物質及びＧＭ！　（Ｎｅｕ
Ｇｃ）のシアル酸残基の４位のアセチル基及び水酸基を
認識しない抗体、即ち０Ｍ３　（４−０−Ａｃ−Ｎｅｕ
Ｇｃ）にも０Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）にも反応する抗体、
それに０Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）のシアル酸残基の４位の
水酸基を認識する抗体、即ち０Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）に
は反応するが免疫物質には反応しない抗体の三種類の抗
体が産生される結果になる。

この様に、ニワトリにＧＭ、　（４−０−Ａｃ−Ｎｅｕ
Ｇｃ）を免疫して特異性の低い抗血清しか得られない原
因としては、０Ｍ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）のシ
アル酸残基の４位のアセチル基が比較的不安定で、室温
、中性ｐＨ条件下でも次第に脱アセチル化を起こしＧＭ
、　（ＮｅｕＧｃ）となり、これが新たな免疫原となる
ことによると考えられる。このことは当然、免疫動物を
ニワトリから他の動物に変えた場合にも、同様な結果が
起こり得ることを予測させるものである。ましてや、０
Ｍ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）特異抗体の作製に
おいて、ウサギを免疫動物として選択してみることなど
は全く意想外なことである。なぜならば、ウサギに０Ｍ
３　（ＮｅｕＧｃ）を免疫しても、ニワトリ抗ＧＭ３（
ＮｅｕＧｃ）抗血清と同等な特異性を持つと考えられる
高力価のウサギ抗ＧＭ３　（ＮｅｕＧｃ）抗血清が得ら
れることが知られているからである（Ｒｏｇｅｒ　Ａ、
、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

ＣｈｅＩＩ＋、、　Ｖｏｌ、２４９．　ｐ４４６０−４
４６６（１９７４））　、即ち、ウサギにおいてもニワ
トリと同様、０Ｍ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）を
免疫しても特異性の低い抗血清しか得られない、即ち０
Ｍ３（ＮｅｕＧｃ）とも反応する抗血清が得られると考
えられており、従って、あえてウサギに０Ｍ３　（４−
０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）を免疫するなどの試みはなされ
なかったのである。

（注〕 １）　０Ｍ３（ＮｅｕＧｃ）：　Ｇａｌβ１　→４Ｇ１
ｃβ１−＝　Ｃｅｒ↑３ ＮｅｕＧｃ　α２ ２）　０Ｍ３（ＮｅｕＡｃ）：　Ｇａｌβｌ　＝　４Ｇ
ｌｃβ１→Ｃｅｒ↑３ ＮｅｕＡｃ　α２ ３）Ｌａｃ−Ｃｅｒ：　　ＧａｌβＬ　　−４Ｇ１ｃβ
ｌ−Ｃｅｒ４）ＧＭｚ（ＮｅｕＧｃ）： Ｇａ１ＮＡｃβ１　−＝４Ｇａｌβ１　→　Ｇｌｃβ１
　→Ｃｅｒ↑３ ＮｅｕＧｃ　ｃｘ　２ ５）ＧＤｚ（ＮｅｕＧｃ）：　　Ｇａｌβｌ　　−＝　
　Ｇｌｃβ１　−ＣｅｒＮｅｕＧｃα２−８ＮｅｕＧｃ
ｃｙ２ ↑３ ４−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−ＮｅｕＧｃｃｒ２＊Ｇｌｃニゲ
ルコース Ｇａｌ　　ニガラクトース ＧｌｃＮＡｃ　：　Ｎ−アセチルグルコサミンＧ１ｃＮ
Ａｃ　：　Ｎ−アセチルガラクトサミンＮｅｕＡｃ　　
：　Ｎ−アセチルノイラミン酸ＮｅｕＧｃ　　：　Ｎ−
グリコリルノイラミン酸Ｃｅｒ　　：　　セラミド 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明者らは、前記のような従来技術の問題点に対して
、ＧＭ３　（４−０−＾ｃ−ＮｅｕＧｃ）ガングリオシ
ドのシアル酸残基の４位の０−アセチル基と５位のＮ−
グリコリル基を、ともに認識する抗ＧＭ３　（４−０−
Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）特異抗体及びこの特異抗体を主成分
とする抗血清を作成する目的で、鋭意研究を重ねた結果
、意外にもＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）を免
疫する動物にウサギを選択することによって、特異性が
高く、効率、収量の非常に優れた抗ＧＭ＋　（４−０−
Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）抗体を得ることが可能なことを見い
出し、本発明を完成するに至った。

〔問題を解決するための手段〕

本発明は、下記式に示されるＧＭ、　（４−０−Ａｃ−
ＮｅｕＧｃ）ガングリオシドを抗原として、これをウサ
ギに免疫することによりその血液より取得され、該ガン
グリオシドに特異的な反応性を有する抗体を主成分とし
て含有することを特徴とする抗ＧＦＩｓ　（４−０−Ａ
ｃ−ＮｅｕＧｃ）ガングリオシド抗血清である。

Ｇａｌβ１−４４Ｇｌｃβ１　→Ｃｅｒ↑コ ４−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−ＮｅｎＧｃ　ｃｘ２本発明で用
いるＧＭ、　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）ガングリオ
シド抗原は、馬券血球膜より調製したもの、あるいは化
学合成品を用いることができる。この抗原を用いて抗血
清を得るには、従来から一般的に用いられている方法で
行なう。例えば、■抗原をそのままウサギに皮下性、筋
注又は静注する■ミョウバン・アジュバントなどに抗原
を接合させてウサギに静注する■抗原懸濁液をフロイン
ト・コンプリート・アジュバントと乳化し、ウサギに皮
下注又は筋注する、などの方法で行なうことができるが
、抗原であるＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）は
分子量約１　、０００のハブテンなので■の方法で行な
うことが望ましい。■の方法で行なう場合には、抗原と
適当なキャリ、ヤーと混合して抗原懸濁液とし、これを
フロイント・コンプリート・アジュバントとともに乳化
し、この乳化液を少量ずつ皮下注又は筋注することによ
り免疫する。この免疫操作を１〜３週間隔で２〜５回行
ない、最終免疫から２〜４週後に全採血し、抗血清を得
る。

キャリヤーとしては、ウシ血清アルブミン、メチル化ウ
シ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清グ
ロブリン画分等の蛋白質、あるいはラテックス、アルミ
ナ等の微粒子担体等、従来知られているもののいずれも
使用できる。

得られた抗血清より本発明の抗体を得る方法も従来知ら
れているウサギＩｇＧ精製法のいずれで行なってもよい
。即ち、抗血清は■硫酸ナトリウム又は硫酸アンモニウ
ム等を用いた塩析法■ＤＥＡＥ　−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
等のイオン交換ゲルを用いたカラムクロマトグラフィー
■５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００等のゲルろ適用ゲルを
用いたカラムクロマトグラフィー、等によりウサギＩｇ
Ｇ画分を精製して抗体を得ることができ、さらに必要な
場合には、抗原であるＧｌ’ｈ（４−０−Ａｃ−Ｎｅｕ
Ｇｃ）をゲルに結合したアフィティーカラムクロマトグ
ラフィーにより特異抗体を精製して得ることができる。

このようにして得られた抗ＧＭｚ　（４−０−Ａｃ−Ｎ
ｅｕＧｃ）ガングリオシド抗体は、次のような性質を有
するものである。

１）免疫グロブリンの種類：ウサギＩｇＧ２）分子ｉｔ
：　１５０　Ｘ１０３ｄａｌｔｏｎ３）分子吸光係数：
　Ｅ”＝１３．５〜１４．６４）特異認識部位：　ＧＭ
、（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）ガングリオシドのシア
ル酸残基の４位のＯ−アセチル基と５位のＮ−グリコリ
ル基とをともに特異的に認識する。

抗体の確認は、オフテロニー法、補体結合反応法、酵素
免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、リポソーム凝集法、赤血
球凝集反応等、従来より抗糖脂質抗体の検出又は測定法
として用いられている方法によって行なうことができる
。

℃実施例〕 以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれによって何ら限定されるものではない。

（１１試薬の調製 ■ＦＣＡ　：フロイント・コンプリート・アジュバント
〔ディフコ社製〕 ■ＢＳＡ　：牛血清アルブミンフラクション■〔アーマ
−社製〕 ■ＣＯＡ　：ニワトリ卵白アルブミン５回結晶〔生化学
工業〕 ■ＰＢＳ　ニリン酸等強化緩？ｊｉ液 塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、リン酸−
水素二ナトリウム・１２水塩２．８８ｇ、リン酸二水素
−カリウム０．２ｇを精製水で溶解し、１１とした。

■ｐｖｐ　：ポリビニルピロリドンに−３０（平井化学
社製〕 ■ペルオキシダーゼ基質液Ａニドリスアミノメタン１２
、ｔｇ、フェノール１．８８ｇに精製水を加えて溶解し
、ｌＮｌＩＣ１でｐ　Ｈ８，０として精製水で全量ＩＲ
とし、この溶液１０−に対し０．１Ｍ４−アミノアンチ
ピリン０．１−１０．３％過酸化水素０．０４ｄを加え
て基質液とした。

■ペルレオキシダーゼ基質ン夜Ｂ：４−りｏｏ−１−ナ
フトールの３■／ｄメタノール溶液１−に対して、ＰＢ
Ｓ　５　ｍＺと０．３％過酸化水素水０．０２４−を加
えて基質液とした。

■Ｉ（ＲＰ標識抗うサギＩｇ：ベルオキシダーゼ標識抗
ウサギイムノグロブリンＣｏｄｅ、Ｎ９３４０　ｌｏｔ
　５■レソルシノール塩酸試薬：　０．２　ｇのレソル
シノールを水１０＠ｌに溶解し、これに８０−の濃塩酸
と０．２５−のＱ、１Ｍ硫酸銅を加え水で１００−とし
た。

（２）免疫用抗原の調製 ■ＧＭ３（４−０−＾（−ＮｅｕＧｃ）及び０Ｍ３　（
ＮｅｕＧｃ）ガングリオシドの調製 ＥＤＴＡを添加したウマ（サラブレッド）血液１０１よ
り赤血球を分離し、１％酢酸水溶液により溶血させてウ
マ赤血球膜ゴーストを得た。

このウマ赤血球膜ゴーストより、クロロホルム−メタノ
ール混液により総膜質画分を抽出し、常法に従いアセト
ン沈澱ＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｄｅｘＡ−２５カラムクロ
マトグラフイー、イヤトロビーズカラムクロマトグラフ
ィーによりＧ？ｈ（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）標品約
３００　ｍｇ、ＧＭ、　（ＮｅｕＧｃ）画分及び次式に
示す部分精製ＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＡｃ）を得
た。

〔本頁以下余白〕

０Ｍ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＡｃ）　　：Ｇａｌβ１
　−４Ｇｌｃβ１　　→Ｃｅｒ↑３ ４−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−ＮｅｕＡｃα２ＧＭ３　（Ｎｅ
ｕＧｃ）画分は、さらに斎寝らの方法（Ｊ、Ｌｉｐｉｄ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２，２５７．（１９７１））を
用いて精製し、０Ｍ３（ＮｅｕＧｃ）標品約７００■を
得た。

■キャリヤー（ウサギグロブリン画分）の調製正常ウサ
ギ血清１０−に、アンモニアでｐＨ中性とした飽和硫酸
アンモニウム水溶液１０ｍ＃を加え、室温で３０分間撹
拌した後、４℃で１０．００Ｏｒｐｍ　（ＲＡ−３（ク
ボタ）〕で遠心し、上澄を除いて沈澱に精製水１０１１
１＃を加えて溶解し、これに飽和硫酸アンモニウム水溶
液１０−を加えて室温で３０分間攪拌した後、再び４℃
で１０．００Ｏｒｐｍ遠心し、沈澱に５ｍｌの精製水を
加えて再び溶解し、飽和硫酸アンモニウム水溶液５−を
加えて、再び４℃で１０．　ＯＯＯｒｐｍ遠心し、得ら
れた沈澱を少量の精製水で溶解して、ＰＢＳに対して透
析し、４℃で１２．００Ｏｒｐｍで遠心して沈澱物を除
き、ウサギグロブリン画分とした。得られたウサギグロ
ブリン画分をローリイ法によりウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）に対する蛋白質を測定すると４９．３■／ｒｎＩ
であった。

■　抗原とキャリヤーの結合 ■で調製したＧＭｘ（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）　　
１　■に、■で調製したウサギグロブリン画分１■相当
（２０μｌ）と、ＰＢＳ　Ｏ，５ｒｎｌを加えて溶解後
、フロイント、コンプリート・アジュバント（ＦＣＡ）
　０．７５−を加えて乳化し、免疫用抗原乳化液とした
。

（３）抗体の調製 ■　免疫及び抗血清 （２）で得た免疫用抗原乳化液を、ウサギ（オス、体重
約２．５　ｋｇ）のフットパット皮下数ケ所及び背部皮
下数十ケ所に少量ずつ注射し免疫した。初回の免疫から
３週間後に、再び前述と同様に免疫し、３週間後に全採
血し、血清分離してウサギ抗ＧＭ３（４−０−Ａｃ−Ｎ
ｅｕＧｃ）抗血清を得た。

■　抗ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）抗体の精
製ウサギ抗ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）抗血
清ｌ　５　ｒｎｌに３６％硫酸ナトリウム１５ｍ／を加
え、室温で３０分間攪拌した後、１１，０００ｒｐｍ　
（ＲＡ−３（クボタ）〕。

２５℃、３０分間遠心し、上澄を除いて得られた沈澱に
少量の精製水を加えて沈澱を溶解し、約１０００倍量の
０．９％塩化ナトリウムに対して２回、１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ：　８．０）に対して２回透析し
、再び、１２．００Ｏｒｐｍ　（ＲＡ−２（クボタ）〕
、４℃、３０分間遠心して沈澱物を除いて、ウサギ抗［
；Ｍ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）抗血清１８％硫酸
ナトリウム沈澱画分約７．５　ｍＺを得た。

このウサギ抗ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）抗
血清１８％硫酸ナトリウム沈澱画分の内約７−を１０１
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ：８．０）に対して平衡化
したＤＥＡＥ−セルロース（１７Ｘ　２３５ｍｍ）にか
けて１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ：　８．０）
を流して素通りに溶出されてくる蛋白質画分を集めて、
ウサギ抗ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）　Ｉｇ
Ｇ画分約１１ｖｌを得た。

このウサギ抗ＧＭ３（４−０−＾ｃ−ＮｅｕＧｃ）　Ｉ
ｇＧ画分の内約１０．５ａｆをＰＢＳに対して平衡化し
たＧ？ｈ（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）結合オクチルセ
ファロース１カラム（７Ｘ５１ｍｍ）にかけ、０．０５
％ＮａＪ　Ｐｕｓで洗浄した後Ｉ　Ｍ　Ｎａ５ＣＮ−Ｐ
ＢＳ２５−を用いてウサギ抗ＧＭｆｆ（４−Ｑ−Ａｃ−
ＮｅｕＧｃ）特異抗体を溶出した。

この特異抗体画分を集めて、０．９χＮａＣｊ！３１に
対して３回、ＰＢＳＩｌに対して２回透析し、ウサギ抗
ＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）特異抗体画分約１
１．５ａｆを得た。

各操作段階での抗血清を１００％とした場合のウサギ抗
Ｇｌ’＋３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）特異抗体の
回収率は１８％硫酸ナトリウム沈澱法で約９０％、ＤＥ
ＡＲ−セルロースカラムクロマトグラフィーで約５５％
、ＧＭ３（４−０−＾ｃ−ＮｅｕＧｃ）結合オクチルセ
ファロースカラムクロマトグラフィーで約２８％であっ
た。また、前記のＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマト
グラフィーにおいて、１０＋ａＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ＝８．０）で抗体活性が素通りに溶出されたこと
により、この抗ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）
抗体は、主にＩｇＧであることが判明した〔生物化学実
験法１５（免疫学実験入門）　、　ｐ６２−６３．学会
出版センター。

（１９８１）　）。

傘ＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）結合オクチルセ
ファロース 平林らの方法（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ　Ｙ、、　ｅｔ
　ａｔ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　（Ｔｏｋｙｏ）Ｖｏｌ、９４．ｐ、３
２７−３３０　（１９８３））に準じて調製した。

０、ＩＭＫＣｌ・／　９）　−／ｌ／水（１：１　、　
Ｖ／Ｖ）溶液３−に、ＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧ
ｃ）　３．１４ｍｆを約８０℃水浴にて加熱溶解し、同
溶媒で平衡化したオクチルセファロースＣＬ−４Ｂゲル
約６−（ゲルとして約３−）に加え、激しく攪拌し室温
で時々攪拌しながら５．３０分間放置後、ゲルを５−の
ＰＢＳで５回洗浄した。このゲルに約６−の２％ニワト
リ卯白アルブミンーＰＢＳを加えて攪拌後、室温で一夜
放置した後約５ｍＺのＰＢＳで３回洗浄して調製した。

（４）　　ウサギ抗ＧＭ！　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧ
ｃ）抗血清のＥＬＩＳ＾法による特異性の検討 ９６六マイクロプレート　（ポリ塩化ビニル製エリザ用
マイクロプレートＥ住友化学）にＧＭ３　（４−０−Ａ
ｃ−ＮｅｕＧｃ）　＋　ＧＭ、（ＮｅｕＧｃ）及びウシ
赤血球膜より上記（２）−■と同様にして調製したＬａ
ｃ−Ｃｅｒの５　ｕｇ／ＷｋＩＯ，０５％ＮａＮｎ−Ｐ
ＢＳ懸濁液及び０．０５％ＮａＮ５−ＰＢＳの４種の溶
液を、各穴５０μ！、２４穴ずつ加えた。これを室温で
一昼夜放置して、２４穴ずつ上記３種の糖脂質を疎水結
合させた。各穴中の溶液をぬきとった後、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを加えてぬき取る方法で７回洗浄
し、各穴に１％ＢＳＡ−０．０５χＮａＮ５−ＰＢＳ　
３００　ｐ　ｌを加え、３７℃で３時間放置した後、前
述の方法で３回各穴を洗浄した。前記（３）−■で得た
ウサギ抗ＧＭ！　（４−０−＾ｃ−ＮｅｕＧｃ）抗血清
を、１％ＢＳＡ−０，０５％ＮａＮ、−ＰＢＳで１／１
００から１／１００Ｘ　２−”倍まで１２段階の倍々希
釈液を調製し、これをマイクロプレートの３種の糖脂質
を疎水結合させた各穴及び対照として糖脂質を結合させ
てない穴の４種の穴、２穴ずつ合計８穴ずつ同一希釈倍
率のウサギ抗ＧＭ３（４−０−ＡＣ−Ｇｃ）抗血清希釈
液を５０μｌずつそれぞれ加えた。

このマイクロプレートを３７℃で１時間反応させた後、
前述の方法で各穴５回ずつ洗浄した。このマイクロプレ
ートの各穴に、ＩＩＲＰ標識抗ウサギ１．を３％ＰＶＰ
−ＰＢＳ　テ１　：　２００に希釈した溶液を４０μβ
ずつ加えた。３７℃で１時間反応させた後、前述の方法
で各穴を５回洗浄した。各穴にペルオキシダーゼ基質液
Ａを２００μｌずつ加え３７℃１５分間と、室温１０分
間反応後、マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３２（
コロナ）〕で、波長４９２　ｎｍと６３０ｎｍの吸光度
差を測定した。

その結果を第１図に示した。第１図よりウサギ抗ＧＭ３
　（４−０−ＡＣ−ＧＣ）抗血清は、ＧＭ３　（４−０
−ＡＣ−ＧＣ）には反応するが、ＧＭ３　（ＮｅｕＧｃ
）及びＬａｃ−Ｃｅｒには反応しないことが判明した。

抗ＧＭｓ　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）抗体について
も、上記と同様の方法（但し、ＢＳ八をＣＯＡ　、希釈
倍率１／１００から１／１００　Ｘ　２−”を１７２５
からｔ／２５ｘ２−目に代えた）で行なった。その結果
を第２図に示す。

第２図で明らかなとおり抗血清と同様な結果が得られた
。

（５）ウサギ抗ＧＭ３（４−０−＾ｃ−ＮｅｕＧｃ）抗
血清の酵素免疫染色法による特異性の検討 シリカゲル薄層板〔プラスチック製ポリグラムシルＧ　
（アンヘリ−・ナーゲル）　）　１０１０Ｘ１０の原点
に第３図の様に左から順にＧＭ！　（４−０−ＡＣ−Ｎ
ｅｕＧｃ）溶液、部分精製ＧＭ、　（４−０−Ａｃ−Ｎ
ｅｕＡｃ）溶液、ＧＭ、　（ＮｅｕＡｃ）溶液を左右２
Ｍｉにスポットし、展開溶媒クロロホルム−メタノール
−２，５Ｎアンモニア（６０：３５：８）で展開し、乾
燥した後、第３図のように中央で切り離し右側はレゾル
シノール塩酸試薬を用いて常法によりシアル酸の発色を
行なった。

左側は、−夜室温で乾燥した後、ウサギ抗ＧＭ３（４−
０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）抗血清を用いて酵素免疫染色法
によりこの抗血清と反応する抗原を染色した。

操作法は、以下に示すが、東らの方法（Ｙ、旧ｇａ−ｓ
ｈｉ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（Ｔｏｋｙｏ
）、　ｐ、１５１７−１５２０（１９８０）　）に準じ
て行なった。

乾燥した左側の薄層板を１％Ｃ０Ａ−１％ｐｖｐ−ｏ。

０５％ＮａＮ＝　ＰＢＳにつけ、室温で１時間放置した
後、薄層板を取り出し、ＰＢＳで洗浄した。この薄層板
をビニール袋に入れ、同時にウサギ抗ＧＭ３（４−０−
Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）抗血清を１％Ｃ０Ａ−１％ｐｖｐ−
ｏ、ｏｓ％ＮａＮ５　ＰＢＳで１：２００に希釈した溶
液５−を加え、室温にて振とうしながら２時間反応させ
た。次いで薄層板を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、再びビ
ニール袋にいれ、同時にＨＲＰ標識抗ウサつｔｇを３％
ＰＶＰ−ＰＢＳ　テｌ　：　２００　ニ希釈した溶液５
−を加え、室温にて振とうしながら２時間反応させた。

薄層板を取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダ
ーゼ基質液Ｂにっけ、３７℃で２０分間反応した。薄層
板を取り出し、精製水で洗浄してドライヤーで乾燥した
。結果は第３図に示した。

第３図より、ウサギ抗ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−Ｎｅｕ
Ｇｃ）抗血清は、ＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）
とＧＭ３　（ｄｉ−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）　”には反
応するが、ＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＡｃ）及びＧ
Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）とは反応しないことが判明した。

このことより、ウサギ抗ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−Ｎｅ
ｕＧｃ）抗血清は、ＧＭ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧ
ｃ）のシアル酸残基の４位のアセチル基と５位のＮ−グ
リコリル基をともに認識する抗ＧＭＩ　（４−０−Ａｃ
−ＮｅｕＧｃ）特異抗体を主成分とすることが明らかと
なった。

”　ＧＭｚ（ｄｉ−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）　：　ＧＭ
＋（ＮｅｕＧｃ）の２つの水酸基にアセチル基がエステ
ル結合したガングリオシドである。構造は明らかではな
いが、次式に示す構造であると推定される。

（推定構造） Ｇａｌ　β１−４Ｇ１ｃβ１−＝Ｃｅｒ↑３ ４−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−（９−０−ａｃｅｔｙｌ）　Ｎ
ｅｕＧｃ　ｃｘ２〔発明の効果〕 以上詳述したように、本発明により、ＧＭ３（ＮｅｕＧ
ｃ）に反応せず、ＧＭ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）
のシアル酸残基の４位のアセチル基と５位のＮ−グリコ
リル基をともに認識する抗体を主成分として含有する新
規な抗血清が提供される。そして、この抗血清は患者の
癌化された組織に現われるＧＭ３　（４−０−Ａｃ−Ｎ
ｅｕＧｃ）抗原を測定・検出することができるので、癌
の新規かつ有用な診断薬として期待できるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、実施例（４）における抗血清の希
釈率とその吸光度の関係を示し、第３図は実施例（５）
における各抗原の酵素免疫染色とレソルシノール塩酸発
色を示したものである。 出願人　株式会社ジノテスト研究所 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 第１図 ｉｔ　　１０　９　８　７　　６　５　４　３　２　　
１　　０抗血清の希釈率 第２図 アフィニティー精製抗体希釈率

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記式に示されるＧＭ＿３（４−０−Ａｃ−Ｎｅｕ
   Ｇｃ）ガングリオシドを抗原として、これをウサギに免
   疫することによりその血液より取得され、該ガングリオ
   シドに特異的な反応性を有する抗体を主成分として含有
   することを特徴とする抗ＧＭ＿３（４−０−Ａｃ−Ｎｅ
   ｕＧｃ）ガングリオシド抗血清。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、抗体の認識部位が、抗ＧＭ＿３（４−０−Ａｃ−Ｎ
   ｅｕＧｃ）ガングリオシドのシアル酸残基の４位の０−
   アセチル基と５位のＮ−グリコリル基をともに認識する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗ＧＭ＿
   ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）ガングリオシド抗血清
   。